JP2018511341A - 遺伝子配列決定および他の適用のためのバーコード化システムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、引用によりその内容を本願明細書に包含させるWeitzらの、2015年4月17日出願の、発明の名称“Barcoding Systems and Methods for Gene Sequencing and Other Applications”と題する米国仮特許出願第62/149,361号に基づく優先権の利益を主張する。
本発明は、米国国立科学財団による助成金番号DMR−1310266およびDMR−1420570、ならびに米国国立衛生研究所による助成金番号P01HL120839の政府助成を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、全体として、微小流体および標識された核酸に関する。
ハイスループット配列決定技術の開発により、研究者は、大量のゲノムデータおよびエピジェネティックデータを作製してきた。疾患関連遺伝子が患者から抽出され、配列情報が臨床診断および処置に使用されている。
本発明は、全体として、微小流体および標識された核酸に関する。本発明の方法は、ある場合において、相互に関連する複数の生産物、特定の問題に対する代替解決策、ならびに/または1以上のシステムおよび/もしくは物品(article)の複数の異なる用途を包含する。
本発明の非限定的な態様は、概略図であり、正確な縮尺率で描かれることを意図しない、添付の図面を参照して、例示により説明される。図面中、図示される各々同一のまたはほぼ同一の構成要素は、一般的に、1つの数字で表す。明確化のために、全ての図において全ての構成要素にラベルを付すわけではなく、当業者が本発明を理解するのを可能にするために説明する必要がないとき、本発明の各態様の全ての構成要素が示されるわけではない。
本発明は、全体として、微小流体および標識された核酸に関する。例えば、特定の側面は、一般的に、微小流体液滴内または他の区画内で、例えば細胞から得られる核酸を標識するためのシステムおよび方法に関する。ある複数の態様において、粒子は、例えば、該粒子の表面に結合する標的核酸を決定するために使用できるオリゴヌクレオチドを含んで調製され得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、核酸が共にプールされるか、または液滴から除去された後でさえ、液滴中の核酸を別の液滴中の核酸と区別するために使用できる、“バーコード”または特異的配列を含み得る。本発明の特定の態様は、一般的に、微小流体液滴内または他の区画内で、核酸に、付加配列または任意の配列、例えば、液滴内に存在することが予期される所望の配列を選択的に決定または増幅するために使用できる認識配列、を結合させるためのシステムおよび方法に関する。かかるシステムは、例えば、ハイスループット配列決定用途などの種々の用途における選択的増幅のために有用であり得る。
次の実施例は、ユニバーサルバーコードを用いて液滴内でハイスループット配列決定を行うめの種々のシステムおよび方法を記載する。
アンプリコンバーコードを含む一例の方法は以下の通りである。図1も参照のこと。
本実施例は、アンプリコンバーコードの他の方法を説明する。図2および3も参照のこと。先の実施例では、DNAバーコードをPCRにより目的のアンプリコンに加えた。本実施例において、PCRアンプリコンの一端を、例えばライゲーションなどによりバーコードビーズに連結することができる。本実施例において、液滴融合(drop merging)スキームにより、ライゲーション可能なアンプリコンが液滴中で産生され、次いで、これらの液滴が合して、ユニバーサル配列を有するDNAバーコードを担持するビーズのライブラリーを形成することもできる。
本実施例において、図1Aに示す方法を用いて、単一細胞標的遺伝子バーコード配列決定を示す。2個の細胞株を選択した。一方の細胞株は、EGFRエクソン21 L858R変異を有し、他方は、EGFRエクソン19を欠失していた。細胞混合物シリーズを、1:1、1:10、1:50および0:100の比で2個の細胞株を混合することにより調製した。微小流体液滴作製装置を用いて、単一細胞および溶解緩衝液を50μmの液滴に共封入した。次いで、微小流体液体注入器を用いて、両エクソン領域のプライマーを含むPCR混合物を添加し、続いて熱サイクルを行った。
Claims (96)
- 液滴の少なくとも約90%が1つの粒子を含むか、または粒子を含まず、該粒子がオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドが、実質的に各粒子が識別可能なバーコード配列を含むように、第1のバーコードの所定のプールから選択される第1のバーコードおよび第2のバーコードの所定のプールから選択される第2のバーコードであるバーコード配列を含むように、複数の粒子を含む複数の液滴を提供すること;および
該オリゴヌクレオチドに核酸配列を結合させること
を含む、方法。 - 粒子がヒドロゲル粒子である、請求項1に記載の方法。
- 複数の液滴が微小流体液滴を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 第1のバーコードの所定のプールが、少なくとも約300の識別可能なバーコードを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のバーコードの所定のプールが、少なくとも約1,000の識別可能なバーコードを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のバーコードの所定のプールが、少なくとも約3,000の識別可能なバーコードを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 第2のバーコードの所定のプールが、少なくとも約300の識別可能なバーコードを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 第2のバーコードの所定のプールが、少なくとも約1,000の識別可能なバーコードを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 第2のバーコードの所定のプールが、少なくとも約3,000の識別可能なバーコードを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 識別可能なバーコード配列が、少なくとも10,000の識別可能なバーコード配列を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 識別可能なバーコード配列が、少なくとも100,000の識別可能なバーコード配列を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸配列が、ゲノムDNAに結合して構成されている、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- ゲノムDNAがヒトゲノムDNAを含む、請求項12に記載の方法。
- 核酸配列が遺伝子に結合して構成されている、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、粒子の表面に結合される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、前記粒子に共有結合する、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、アクリルホスホロアミダイト結合により前記粒子に共有結合する、請求項16に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、アミノ結合により前記粒子に共有結合する、請求項16または17に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、ビオチン−ストレプトアビジン結合により前記粒子に共有結合する、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが開裂可能なリンカーを含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 開裂可能なリンカーが、光開裂可能なリンカーである、請求項20に記載の方法。
- 開裂可能なリンカーが、化学的に開裂可能なリンカーである、請求項20に記載の方法。
- 開裂可能なリンカーが、酵素的に開裂可能なリンカーである、請求項20に記載の方法。
- 前記粒子からオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかを遊離することをさらに含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液滴の少なくとも約95%が、1つのヒドロゲル粒子を含むか、またはヒドロゲル粒子を含まない、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、最大約1粒子/液滴で液滴内に含まれる、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、最大約0.1粒子/液滴で液滴内に含まれる、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、最大約0.01粒子/液滴で液滴内に含まれる、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の粒子が、最大約500マイクロメートルの平均直径を有する、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の粒子が、少なくとも約1マイクロメートルの平均直径を有する、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドに結合した核酸配列を、複数の細胞から得られる核酸に暴露することをさらに含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の細胞が、複数の液滴の少なくともいくつかに存在する、請求項31に記載の方法。
- 複数の細胞が、最大1細胞/液滴で複数の液滴中に存在する、請求項31または32に記載の方法。
- 複数の細胞が、最大0.1細胞/液滴で複数の液滴中に存在する、請求項31から33のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の細胞が、最大0.01細胞/液滴で複数の液滴中に存在する、請求項31から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液滴の少なくとも約90%が、1つの細胞を含むか、または細胞を含まない、請求項31から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液滴内の少なくとも一部の細胞を溶解することをさらに含む、請求項31から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液滴内の少なくとも一部の細胞を細胞溶解試薬を用いて溶解することを含む、請求項37に記載の方法。
- 少なくともいくつかの細胞がヒト細胞である、請求項31から38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸配列が、前記細胞から得られる少なくともいくつかの核酸を認識すると予期される、請求項31から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸配列が、前記細胞から得られる少なくともいくつかの核酸中に存在する遺伝子を認識すると予期される、請求項40に記載の方法。
- 核酸配列を前記オリゴヌクレオチドに結合させる工程が、
アダプター配列を、相補的アダプター配列およびプライマーを含む配列に曝露すること;
プライマーを該プライマーの標的を含む核酸配列に暴露すること;および
増幅させて、第1のバーコード、第2のバーコードおよび核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを作製すること、
を含む、請求項1から41のいずれか一項に記載の方法。 - 核酸配列を前記オリゴヌクレオチドに結合させる工程が、核酸配列を前記オリゴヌクレオチドに直接結合させることを含む、請求項1から42のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸配列を前記オリゴヌクレオチドに結合させる工程が、核酸配列を前記オリゴヌクレオチドに酵素的に結合させることを含む、請求項1から43のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸配列を前記オリゴヌクレオチドに結合させる工程が、核酸配列を前記オリゴヌクレオチドに連結させることを含む、請求項1から44のいずれか一項に記載の方法。
- 液滴の少なくとも約90%が1つの粒子を含むか、または粒子を含まず、該粒子がオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドが、実質的に各粒子が識別可能なバーコード配列を含むように、第1のバーコードの所定のプールから選択される第1のバーコード、第2のバーコードの所定のプールから選択される第2のバーコードであるバーコード配列およびアダプター配列を含むように、複数の粒子を含む複数の液滴を提供すること;
該アダプター配列を、相補的アダプター配列およびプライマーを含む配列に曝露すること;
プライマーを該プライマーの標的を含む核酸配列に暴露すること;および
増幅させて、第1のバーコード、第2のバーコードおよび核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを作製すること
を含む、方法。 - 液滴内で該核酸配列を増幅させることをさらに含む、請求項46に記載の方法。
- 増幅させて、第1のバーコード、第2のバーコードおよび核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを作製する前に、液滴内で核酸配列を増幅させることを含む、請求項47に記載の方法。
- アダプター配列が最大10個のヌクレオチドを含む、請求項46から48のいずれか一項に記載の方法。
- アダプター配列が少なくとも5個のヌクレオチドを含む、請求項46から49のいずれか一項に記載の方法。
- プライマーが遺伝子特異的プライマーを含む、請求項46から50のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸配列が、ゲノムDNAに結合して構成されている、請求項46から51のいずれか一項に記載の方法。
- ゲノムDNAがヒトゲノムDNAを含む、請求項52に記載の方法。
- 核酸配列が遺伝子に結合して構成されている、請求項46から53のいずれか一項に記載の方法。
- 粒子がヒドロゲル粒子を含む、請求項46から54のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の液滴が微小流体液滴を含む、請求項46から55のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のバーコードの所定のプールが、少なくとも約300の識別可能なバーコードを含む、請求項46から56のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のバーコードの所定のプールが、少なくとも約1,000の識別可能なバーコードを含む、請求項46から57のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のバーコードの所定のプールが、少なくとも約3,000の識別可能なバーコードを含む、請求項46から58のいずれか一項に記載の方法。
- 第2のバーコードの所定のプールが、少なくとも約300の識別可能なバーコードを含む、請求項46から59のいずれか一項に記載の方法。
- 第2のバーコードの所定のプールが、少なくとも約1,000の識別可能なバーコードを含む、請求項46から60のいずれか一項に記載の方法。
- 第2のバーコードの所定のプールが、少なくとも約3,000の識別可能なバーコードを含む、請求項46から61のいずれか一項に記載の方法。
- 識別可能なバーコード配列が、少なくとも10,000の識別可能なバーコード配列を含む、請求項46から62のいずれか一項に記載の方法。
- 識別可能なバーコード配列が、少なくとも100,000の識別可能なバーコード配列を含む、請求項46から63のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、粒子の表面に結合される、請求項46から64のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、前記粒子に共有結合されている、請求項46から65のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、アクリルホスホロアミダイト結合により前記粒子に共有結合されている、請求項66に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、アミノ結合により前記粒子に共有結合されている、請求項66または67に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して、前記粒子に共有結合されている、請求項46から68のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、開裂可能なリンカーを含む、請求項46から69のいずれか一項に記載の方法。
- 開裂可能なリンカーが光開裂可能なリンカーである、請求項70に記載の方法。
- 開裂可能なリンカーが、化学的に開裂可能なリンカーである、請求項70に記載の方法。
- 開裂可能なリンカーが、酵素的に開裂可能なリンカーである、請求項70に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかを、前記粒子から遊離させることをさらに含む、46から73のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも約95%の液滴が、1つのヒドロゲル粒子を含むか、またはヒドロゲル粒子を含まない、請求項46から74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、最大約1粒子/液滴で液滴内に含まれる、請求項46から75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、最大約0.1粒子/液滴で液滴内に含まれる、請求項46から76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、最大約0.01粒子/液滴で液滴内に含まれる、請求項46から77のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の粒子が、最大約500マイクロメートルの平均直径を有する、請求項46から78のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の粒子が、少なくとも約1マイクロメートルの平均直径を有する、請求項46から79のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドに結合した核酸配列を、複数の細胞から得られる核酸に暴露することをさらに含む、請求項46から80のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の細胞が、複数の液滴のうち少なくともいくつかの中に存在する、請求項81に記載の方法。
- 複数の細胞が、最大1細胞/液滴で複数の液滴中に存在する、請求項81または82に記載の方法。
- 複数の細胞が、最大0.1細胞/液滴で複数の液滴中に存在する、請求項81から83のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の細胞が、最大0.01細胞/液滴で複数の液滴中に存在する、請求項81から84のいずれか一項に記載の方法。
- 液滴の少なくとも約90%が、1つの細胞を含むか、または細胞を含まない、請求項81から85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液滴中で少なくとも一部の細胞を溶解させることをさらに含む、請求項81から86のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液滴内の少なくとも一部の細胞を細胞溶解試薬を用いて溶解することを含む、請求項87に記載の方法。
- 少なくとも一部の細胞がヒト細胞である、請求項81から88のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸配列が、前記細胞から得られる少なくともいくつかの核酸を認識すると予期される、請求項81から89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸配列が、前記細胞から得られる少なくともいくつかの核酸中に存在する遺伝子を認識すると予期される、請求項90に記載の方法。
- 第1のバーコードの所定のプールから選択される第1のバーコード、第2のバーコードの所定のプールから選択される第2のバーコード、およびアダプター配列を含む、オリゴヌクレオチドを付着させた複数の粒子を提供すること;および
該アダプター配列を介してオリゴヌクレオチドに核酸配列を結合させること
を含む、方法。 - 複数の微小流体液滴内に複数の細胞および複数の粒子を封入し、少なくとも10,000の液滴のそれぞれが、複数の液滴の他の液滴に含まれるオリゴヌクレオチドと識別可能な1以上のオリゴヌクレオチドを含むように、各粒子がオリゴヌクレオチドおよびそれに共有結合した核酸配列を実質的に含み;
液滴内で少なくともいくつかの細胞を溶解させて、該細胞から核酸を遊離させ、ここで、該核酸配列が、少なくともいくつかの遊離される核酸と相互作用することができる部分を含み;そして
遊離された核酸の部分を液滴内で選択的に増幅させて、増幅部分およびオリゴヌクレオチドを含む配列を作製すること
を含む、方法。 - 細胞を含む少なくとも10,000の微小流体液滴を提供し、該複数の液滴の少なくとも約90%が細胞を含むか、または細胞を含まず;
複数の微小流体液滴内で細胞を溶解させて、該細胞から核酸を遊離させ;そして
オリゴヌクレオチドに結合した該液滴内の選択的に増幅された核酸を産生すること、ここで、液滴の少なくとも約90%について、液滴内のオリゴヌクレオチドは、複数の液滴の他の液滴内のオリゴヌクレオチドと識別可能である
を含む、方法。 - 液滴の10%以下が2以上の細胞を含むように、複数の細胞を含む少なくとも約10,000の微小流体液滴を提供すること、
複数の液滴内の細胞を溶解して該細胞から核酸を遊離させること;および
遊離された核酸の部分を液滴内で選択的に増幅させて、増幅部分および液滴特異的バーコードを含む配列を作製すること
を含む、方法。 - 液滴の10%以下が2以上の細胞を含むように、複数の細胞を含む液滴を提供し;
複数の液滴内の細胞を溶解して該細胞から核酸を遊離させ;そして
遊離された核酸の部分を該液滴内で選択的に増幅させて、増幅部分および少なくとも10,000の識別可能なバーコードのプールから選択されたバーコードを含む配列を作製すること
を含む、方法。
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