CN106661763A - 用于微滴标记的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总的来说涉及微流体装置，包括用于在这样的装置内标记微滴的系统和方法。在一些方面，通过将微滴(或其它离散实体)暴露于多种不同条件来操作微滴。通过将多个核酸“标签”掺入微滴中并任选地将核酸连接在一起，微滴所暴露于的条件可由核酸标签编码。因此，即使暴露于不同条件的微滴混合在一起，每个微滴遇到的条件仍然可以例如通过对核酸进行测序来测定。

Description

用于微滴标记的系统和方法
相关申请
本申请要求Bernstein等于2014年4月17日提交的标题为“Systems and Methodsfor Droplet Tagging”的美国临时专利申请系列号61/981,123的权益，此专利申请通过引用并入本文。
政府资金
本发明是在由国立卫生研究院授予的基金号P01GM096971以及由国家科学基金会授予的基金号DMR-1006546和DMR-0820484下于政府支持下作出的。政府对本发明具有一定的权利。
领域
本发明总的来说涉及微流体装置，包括用于在这样的装置内标记微滴的系统和方法。
背景
存在用于在微流体系统内产生流体性微滴的各种技术，诸如在专利公开号WO2004/091763、WO 2004/002627、WO 2006/096571、WO 2005/021151、WO 2010/033200和WO2011/056546(其各自通过引用整体并入本文)中公开的那些技术。在一些情况下，可以产生相对大量的微滴，并且通常以相对高的速度，例如，可以以每秒至少约10个微滴的速率产生微滴。微滴中还可在其中含有多种物质。然而，可能难以精确地跟踪这样的微滴，特别是当产生大量微滴和/或以非常高的速率产生微滴时。另外，如果微滴暴露于各种不同的条件，包含不同的种类等，以使得微滴不是全部相同的，则这样的跟踪可能是复杂的。
概述
本发明总的来说涉及微流体装置，包括用于在这样的装置内标记微滴的系统和方法。在一些情况下，本发明的主题涉及相关产品，对特定问题的替代解决方案和/或一个或多个系统和/或物品的多个不同用途。
在一个方面，本发明总体上涉及一种方法。根据一组实施方案，方法包括将微滴暴露于第一条件并向微滴添加第一核酸的，其中第一核酸编码第一条件，将微滴暴露于第二条件并将第二核酸添加至微滴，其中第二核酸编码第二条件，以及将第一核酸和第二核酸连接在一起。
根据另一组实施方案，该方法包括以下行为：将包含在微滴内的细胞暴露于第一物质种类，并向所述微滴添加第一核酸，将所述细胞暴露于第二物质种类，并向所述微滴添加第二核酸，将所述第一核酸和所述第二核酸连接在一起，测定所述细胞的性质，和基于所述细胞的性质分选所述微滴。
另一组实施方案总体上涉及包括以下行为的方法：将多种细胞类型和多种核酸包封在多个微滴中，以使得基本上每个微滴包含仅一种细胞类型的一个或多个细胞和编码仅一种细胞类型的编码核酸。
在一组实施方案中，该方法包括以下行为：在多个微滴中提供多种细胞类型和多种核酸，以使得基本上每个微滴包含仅一种细胞类型的一个或多个细胞和编码仅一种细胞类型的编码核酸，裂解微滴内的细胞以从所述细胞释放细胞核酸，将所述编码核酸和所述细胞核酸连接在一起，和对连接的核酸进行测序。
在另一组实施方案中，该方法包括以下行为：在多个微滴中提供多种细胞类型和多种核酸，以使得基本上每个微滴包含仅一种细胞类型的一个或多个细胞和编码仅一种细胞类型的编码核酸；将所述多个微滴暴露于多种物质种类，以使得基本上每个微滴暴露于所述多种物质种类中的单一物质种类，并向其中添加编码所述单一物质种类的第一核酸；裂解微滴内的细胞以从所述细胞释放细胞核酸；将编码核酸、第一核酸和细胞核酸连接在一起；和对连接的核酸进行测序。
在另一方面，本发明总体上涉及多个微滴。在一些情况下，至少一些所述微滴含有编码所述至少一些微滴暴露于的多个条件的核酸。
根据另一方面，本发明总体上涉及包含多种细胞类型和多种核酸的微滴的文库。在一些实施方案中，基本上每种细胞类型由独特的核酸序列编码。
在另一方面，本发明包括制备本文所述的一个或多个实施方案的方法。在另一方面，本发明包括使用本文所述的一个或多个实施方案的方法。
当结合附图考虑时，根据本发明的各种非限制性实施方案的以下详细描述，本发明的其它优势和新颖特征将变得明显。在其中本说明书和通过引用并入的文件包括冲突和/或不一致的公开内容的情况下，以本说明书为准。如果通过引用并入的两个或更多个文件包括彼此相冲突和/或不一致的公开内容，则应以具有较晚生效日期的文件为准。
附图概述
将参考附图通过示例的方式来描述本发明的非限制性实施方案，附图是示意性的并且不旨在按比例绘制。在图中，所示的每个相同或几乎相同的部件通常由单个数字表示。为了清楚起见，当示出对于本领域普通技术人员理解本发明不是必需的时，并非每个部件都在每个图中标出，并且并非本发明的每个实施方案的每个部件被示出。在附图中：
图1A-1C示意性地举例说明根据本发明的各种实施方案的用于标记微滴的各种方法；和
图2A-2B示意性地举例说明在本发明的某些实施方案中将各种核酸标签连接在一起。
详述
本发明总的来说涉及微流体装置，包括用于在这样的装置内标记微滴的系统和方法。在一些方面，通过将微滴(或其它实体)暴露于多种不同条件来操作微滴。通过将多个“标签”例如核酸标签掺入微滴中并将标签连接在一起，可编码微滴所暴露于的条件。因此，即使将暴露于不同条件的微滴混合在一起，每个微滴遇到的条件仍然可以例如通过对核酸测序来确定。
最初，参考图1讨论某些非限制性实例。然而，在其它实施方案中，也可以使用其它配置。首先转到图1A，显示了暴露于各种条件(例如，物质种类诸如药物)的微滴，并且每次将微滴暴露于条件时，向微滴添加编码该条件的核酸。应当注意，条件不必是添加化学物质种类，而是还可以是物理条件，诸如对特定温度的暴露。还应当注意，尽管参考图1讨论了微滴，但这只是为了方便说明；在其它实施方案中，可使用其它离散实体来代替这些微滴，例如微孔板中的微孔。
如此实例中所示，微滴10首先遇到包含物质种类X和核酸1的微滴12，并与其融合。随后，微滴10遇到微滴13(含有物质种类Y和核酸2)和微滴14(含有物质种类Z和核酸3)并与它们融合。然后可以以某种方式将酶E引入微滴10中，例如，作为另一微滴融合事件的一部分(如此处利用微滴15所示的)，或酶可以最初存在于微滴10、12、13或14的任一个中。酶可用于将核酸1、2和3连接在一起，如对于连接的核酸1-2-3所示的。然后微滴可以被破裂以获取连接的核酸，并且可对核酸进行测序或以其它方式测定以确定微滴10的来历。
在一些实施方案中，可以以这样的方式处理两个或更多个微滴，如图1B中所示的。例如，可将两个或更多个微滴暴露于各种不同的条件，其中每次将微滴暴露于条件时，将编码该条件的核酸添加至微滴。然而，即使如在容器20中所示的，稍后将具有不同来历的这样的微滴组合(诸如，在混合物中)，每个微滴所暴露于的条件仍然可通过包含在每个微滴中的不同核酸来确定。即使微滴本身破裂和/或内容物被混合在一起，这也是真实的。例如，如图1B所示，通过测定核酸1-2-3、4-5-6和7-8-9，可以知道容器20中的至少一个微滴暴露于条件A、B和C，至少一个微滴暴露于条件I、J和K，并且至少一个微滴暴露于条件X、Y和Z。另外，还可以能够容器20中没有微滴暴露于其它条件组。例如，可以能够确定没有微滴暴露于条件X、Y和K，因为在容器20中不存在序列1-2-9。
如图1C所示，在本发明的某些实施方案中，还可发生微滴的测试和/或分选。如该图所示，暴露于不同条件(如由其中包含的核酸编码，由各种数字表示的)的多个微滴可以基于一些标准进行分选。例如，如果微滴还含有细胞，则可使用细胞的性质(例如，细胞是活的还是死的)将微滴分选成2个(或更多个)群体。然后可以诸如通过测定其中包含的核酸来单独分析每个群体，以确定哪些条件可能导致不同的群体。例如，在图1C中，可将微滴30的群体分选为第一组(A)和第二组(B)。然后可对每组中的核酸测序。因此，例如，可以确定组A的成员各自具有共同的条件2和3，而组B的成员没有共同的条件2和3(尽管条件2或3可以单独存在于一些B组微滴中)。因此，这些分选实验会证明条件2和3的组合对于发生某些效应是必要的(组A)，并且如果两者不存在，则不发生效应(组B)。
还值得注意的是，在图1C中，每个微滴所暴露于的条件的数量不一定相同；相反，条件可以变化，即有意地或由于实验误差或不确定性。例如，将微滴2-4暴露于条件2和4，而将微滴1-2-3-6暴露于条件1、2、3和6。此外，还应注意，由于在从微滴中除去核酸之前核酸的连接，即使微滴和/或核酸随后混合在一起，也可以单独保持和分析每个微滴暴露于的条件。因此，参考图1C，如果核酸未连接在一起，则组A和B中的每一个会看起来是相同的，因为在此举例说明性实例中每个组以完全相同的比例含有相同的数字(代表条件)。
因此，本发明的某些实施方案的一个令人惊奇的特征是连接的核酸允许容易确定更复杂的条件，例如单个条件或多个条件。这可以在不损失信息的情况下实现，即使微滴破裂或以其它方式组合在一起(例如为了便于处理或分析)。相比之下，在将各种标签单独引入微滴中的技术中，在没有将标签组合在一起的连接或其它方法的情况下，不能如此容易地分析条件；相反，必须小心地使每个微滴保持分离，因为意外组合(例如通过破裂或将不同微滴融合在一起)的任何标签将导致信息的丢失。
上述讨论不旨在是限制性的；本发明的其它实施方案也可以用于标记微滴，如现在将讨论的。例如，本发明的各个方面总的来说涉及用于在微流体装置内标记或鉴定微滴的系统和方法，例如使用可结合在一起的核酸和其它“标签”。通过将标签结合在一起，可以保留关于包含标签的微滴的信息，例如即使在标签与微滴分离和/或与其它不同的标签组合之后。因此，例如，可将来自不同微滴(例如，暴露于不同条件)的多个标签组合在一起并一起分析。
本发明的某些方面涉及多个微滴或其它离散实体(例如，其中实体的内容物不容易与其它实体的内容物混合)的用途。例如，离散实体可以是包含在载流体内的微滴、微孔板的微孔、载玻片或其它表面上的个体斑点等。如本文所讨论的，每个实体可以是可含有一个或多个标签或其它物质种类而不与其它实体意外混合的特定位置。在一些情况下，实体可以是相对小的，例如，每个实体可具有小于约1ml，小于约300微升，小于约100微升，小于约30微升，小于约10微升，小于约3微升，小于约1微升，小于约500nl，小于约300nl，小于约100nl，小于约50nl，小于约30nl或小于约10nl的体积。
在一些实施方案中，微滴或其它实体可以含有各种物质种类，例如细胞、化学物质等。本文讨论了物质种类的其它实例。例如，如果微滴或其它实体包含一个或多个细胞，则细胞可以是基本相同或不同的。例如，微滴或其它实体可包含不止一个细胞或其它物质种类，其中细胞(或其它物质种类)是相同的或不同的；不同微滴或实体中的细胞(或其它物质种类)也可以是相同或不同的。如果使用细胞，在一些实施方案中，细胞还可来自特定细胞群，诸如来自某一器官或组织(例如，心脏细胞、免疫细胞、肌肉细胞、癌细胞等)，来自特定个体或物种的细胞(例如，人细胞、小鼠细胞、细菌等)，来自不同生物体的细胞，来自天然存在的样品(例如，池塘水，土壤等)的细胞等。
因此，作为非限制性实例，可以研究一种或多种条件对特定类型的细胞(或多种特定类型的细胞)的影响。作为另一个实例，可研究某一特定条件(或多个条件)对合适的细胞群的影响。另外，应当注意，本发明不限于仅研究细胞。在其它实施方案中，例如，微滴或其它实体可包含其中待应用各种条件的物质种类。例如，物质种类可以是化学试剂，例如为生物或非生物、有机或无机等的化学试剂。例如，物质种类可以是聚合物、核酸、蛋白质、药物、小分子化合物(例如，具有小于约1000Da或小于约2000Da的分子量)、抗体、酶、肽等。物质种类的其它实例在下面更详细地讨论。
一个或多个标签可存在于微滴(或其它实体)内，其可被分析以确定微滴的身份和/或来历。在一些情况下，标签可被选择为相对于微滴或其它实体的其它组分是相对惰性的。标签可最初存在于微滴或其它实体中，和/或随后例如使用如下文所述的方法添加。例如，当将微滴或其它实体暴露于一种或多种条件(或即将进行这样的暴露)时，可以添加标签。在一些情况下，在微滴或其它实体中可以存在不止一种标签。
在本发明的某些实施方案中，可将微滴或其它实体内的标签连接在一起(例如化学地)，以产生连接的标签。可使用任何合适的技术例如在从微滴或实体移除之前将标签连接在一起。标签可使用任何合适的技术连接。诸如，标签可以使用酶、催化剂或反应物(其可以使用任何合适的技术来添加至微滴或其它实体中)连接在一起。例如，可将包含标签的微滴与包含化学剂的另一个微滴融合，或者可以例如使用移液或其它技术以及在一些情况下使用自动化技术将化学反应物添加或插入至微滴或其它实体中。
通过将微滴(或其它实体)中的标签连接在一起以产生连接的标签，可通过保持连接的标签来维持微滴的身份和/或来历，即使标签与微滴分离或来自不同微滴的标签混合在一起。例如，可将来自各种微滴或实体的连接的标签收集在一起并进行分析。在一些实施方案中，取决于各种性质，可将一系列微滴或其它实体分离成各种组，并且可将每组内的标签一起操作和/或用于鉴定具有这样的性质的这样的微滴或实体。
标签可以包括例如核酸，其可以使用能够将核酸连接在一起的合适的酶例如连接酶连接或结合在一起。连接酶的非限制性实例包括DNA连接酶，诸如DNA连接酶I、DNA连接酶II、DNA连接酶III、DNA连接酶IV、T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、T3DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶等。许多这样的连接酶可以商购获得。此外，在一些实施方案中，可使用退火或引物延伸法将两个或更多个核酸连接在一起。
如本文所讨论的，根据某些实施方案，核酸的各种序列可以用于编码微滴或其它实体可暴露于的特定条件，并且可向其中添加这样的核酸以指示对条件的这样的暴露。在一些情况下，可将微滴或其它实体内的核酸在移除(诸如，在微滴破裂后、在洗涤载玻片后等)之前连接在一起。可将来自不同微滴或实体的不同核酸混合在一起；然而，即使在这样的混合之后，可单独对每个核酸测序以确定相应的微滴或实体已暴露于的特定条件。
任何合适的系统可以用于编码。例如，在一组实施方案中，核酸标签可以包括核苷酸的编码区，和任选地连接区。编码区中的核苷酸可以对应于特定条件(或条件组)。任何合适数量的条件可以以这样的方式被任意编码，其中可由这样的编码区编码的条件的数量可由编码区中的核苷酸的数量确定。因此，例如，具有长度n的编码区可以编码多达4n个区域(基于四种类型的核苷酸)。例如，第一条件可以用A编码，第二条件可以用T编码(或如果核酸是RNA，用U编码)，第三条件可以用G编码，第四条件可以用C编码，等。作为更复杂的实例，含有3个核苷酸的编码区足以编码超过50种不同条件(因为43＝64)。可以使用一个或不止一个编码区。另外，在某些实施方案中，编码区还可包括用于错误检测和/或校正、冗余等的其它核苷酸。
在一些情况下，核酸标签还可包括一个或多个连接在一起的连接区域。例如，连接区可包括核酸的“粘性末端”或悬突，以使得只有特定的核酸可以适当地连接在一起。例如，如图2A所示，第一核酸标签21(编码第一条件)可包括与第二核酸标签22上的粘性末端基本上互补但不与第三核酸标签23上的粘性末端基本互补的第一粘性末端；类似地，第二核酸22(编码第二条件)可包括与第三核酸标签23(编码第三条件)上的粘性末端基本上互补但不与第一核酸21上的粘性末端基本上互补的粘性末端。因此，在暴露于合适的连接酶时，第一、第二和第三核酸可以以适于后续研究的顺序结合或连接在一起，而不存在以不正确的顺序(例如，第一核酸连接至另一第一核酸)错误地连接在一起的核酸。因此，通过对最终连接的核酸进行测序，可以确定该核酸处于暴露于第一、第二和第三条件的微滴或其它实体中。
然而，应当理解，在其它实施方案中，可能不需要确保核酸标签以某一构型或顺序连接在一起。诸如，如图2B所示，核酸21、22和23可以以任何合适的顺序连接在一起；并且可以分析所得的连接的核酸以确定核酸编码由核酸21、22和23编码的条件。
取决于应用，核酸标签还可具有任何合适的长度或核苷酸数目。例如，核酸标签可具有短于或长于10nt、30nt、50nt、100nt、300nt、500nt、1000nt、3000nt、5000nt或10000nt等的长度。在一些情况下，还可将核酸标签的其它部分用于其它目的，例如除了编码条件以外。例如，核酸标签的部分可用于增加核酸标签的体积(例如，使用特定序列或无义序列)，以便于处理(例如，标签可包括多聚A尾巴)，以增加结合的选择性(例如，如下所讨论的)，以促进被酶(例如，合适的连接酶)识别，以促进鉴定等。
如上所述，在本发明的某些方面，可使用这样的标签编码一种或多种条件，例如将标签添加至暴露于这样的条件的微滴或其它实体。因此，例如，可将微滴暴露于第一条件并将第一标签添加至微滴，然后可将微滴暴露于第二条件并将第二标签添加至微滴，然后可将微滴暴露于第三条件并将第三标签添加至微滴，然后可将微滴暴露于第四条件并将第四标签添加至微滴，等等。因此，可存在任何数量的条件，例如可将微滴或其它实体暴露于2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个条件。还可将标签组合在一起(例如，连接在一起)以产生编码微滴或实体的来历和/或身份的连接的标签，如前所述。
任何合适的条件可由标签编码。例如，在一组实施方案中，可使用一个或多个标签来编码微滴或其它实体的身份。例如，每个微滴或实体可以被分配独特的标签或标签的独特组合。作为另一个实例，条件可以是微滴或其它实体在内部和/或外部所暴露于的物质种类。多种物质种类中的任一种可由合适的标签编码。例如，物质种类可以是药物(或疑似药物)、细胞、聚合物、肽、蛋白质、酶、激素、抗生素、维生素、碳水化合物、糖、抗体、试剂、气体、染料、离子、病毒、细菌、pH水平(例如酸性或碱性条件)等。因此，例如，可使用独特的标签或标签的独特组合来编码多个细胞或多个细胞类型。取决于应用，可使用任何数量的标签来编码这样的条件。例如，可存在至少10种、至少30种、至少50种、至少100种、至少300种、至少500种、至少1,000种、至少3,000种、至少5,000种、至少10,000种、至少30,000种、至少50,000种、至少100,000种或更多种独特的标签，例如，其基本上编码相似数量的合适条件(诸如本文所述的那些条件中的任一个)。例如，作为第一条件，可编码包含多个细胞或细胞类型的微滴文库，以使得基本上每个微滴包含一个细胞或一种细胞类型，以及相关联的标签，诸如核酸。
另外，在一些情况下，条件还可以是外部物理条件。例如，可将微滴或其它实体暴露于外部物理条件，诸如某一或预定的温度、压力、电条件(例如，电流、电压等)等，并且可在暴露于外部物理条件之前、期间或之后，将合适的标签引入至微滴或实体中。作为另一个实例，条件可以是处理条件，例如过滤、沉降、离心等。
在一组实施方案中，条件可以是用于裂解可包含在微滴内的细胞的条件。例如，条件可以是暴露于裂解性化学物质(例如，纯水、表面活性剂诸如Triton-X或SDS，酶诸如溶菌酶、溶葡萄球菌素、麦芽糖糊精酶、纤维素酶、变溶菌素、聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶等)或物理条件(例如，超声、紫外光、机械搅拌等)。在一些情况下，裂解细胞将导致细胞释放其内容物，例如细胞核酸、蛋白质、酶、糖等。在一些实施方案中，还可将一些细胞核酸连接至微滴内包含的一个或多个核酸。例如，在一组实施方案中，可释放通常在细胞内产生的RNA转录物，然后将其与核酸标签连接。
还设想了这些和/或其它条件中的任何一种的组合。例如，如上所述，可将微滴暴露于由第一标签编码的第一条件、由第二标签编码的第二条件、由第三标签编码的第三条件等。条件可以是相同或不同的。另外，可将微滴或其它实体暴露于任何数量的条件(诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个等)，并且不同的微滴或实体不需要暴露于相同的条件或者相同数量的条件。另外，在一些实施方案中，可将多个微滴(或其它实体)随机暴露于多个条件，例如，以使得不是所有的微滴都暴露于所有条件。如上所述，当微滴或其它实体暴露于条件时，可将编码条件的核酸添加至微滴或实体，以使得微滴或实体的具体来历不需要预先确定，并且可以被随机确定。例如，可将多个初始的基本上相同的微滴(或其它实体)暴露于包含不同物质种类(和/或不同浓度的一种或多种物质种类)的多个第二微滴，以使得每个初始微滴随机地融合至一个或多个第二微滴。
另外，在一些实施方案中，取决于各种性质，可将微滴或其它实体分离或分选至各组中，并且可将每组内的标签一起操作和/或用于鉴定具有这样的性质的这样的微滴或实体。因此，作为非限制性实例，取决于是否在微滴内发生反应，可将微滴(或其它实体)分选至第一组或第二组中，可基于包含在微滴内的细胞或其它物质种类的性质分选液滴，等等。分选还可以发生在两个或更多个组中。
在一些情况下，可以例如使用其中包含的标签来分析微滴(或其它实体)的一些或全部组，以测定这些组内的微滴或实体的特性，和/或测定组内的将该组与其它组分开的微滴或实体的特性。例如，组的成员可共同具有将这些组成员与其它组成员分开的一个或多个标签和/或标签的一个或多个特定组合，例如，如上文参考图1C所解释的。这样的标签可用于例如鉴定或区分导致特定结果的一个或多个条件与不导致该结果的条件。
因此，在一组实施方案中，测定微滴或其它实体的性质，并且基于该性质对微滴或其它实体进行分选。该性质还可以是包含在微滴或实体内的物质种类(诸如细胞)的性质。该性质可以是可被测定的任何物理或化学性质。例如，可测定微滴或其它实体(或其中包含的物质种类)的性质，诸如荧光、透明度、密度、尺寸、体积等，并用于分选目的。在一些情况下，还可将一种或多种试剂加入到微滴或其它实体中，例如以起始或促进可被测定的反应，例如用于分选目的。
在一些情况下，微滴或其它实体可被破裂或破坏以获得标签。这可在任何合适的时间发生，例如，在将标签连接或结合在一起之前或之后。例如，可使用技术诸如机械破碎或超声破坏载流体中包含的微滴。类似地，表面上的实体可以使用暴露于化学试剂或表面活性剂来破坏，或对其进行洗涤或冲洗以收集标签。
然后可以测定标签以确定微滴(或其它实体)的身份和/或来历，例如，以确定微滴或其它实体所暴露于的条件。可使用任何合适的方法来测定标签，这取决于所使用的标签的类型。例如，可使用荧光测量来测定荧光颗粒，或者可使用多种技术和仪器对核酸进行测序，其中许多技术和仪器是商业上容易获得的。这些技术的实例包括但不限于链终止测序、通过杂交测序、Maxam-Gilbert测序、染料-终止子测序、链终止法、大规模平行签名测序(Lynx Therapeutics)、polony测序、焦磷酸测序、连接测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、单分子实时测序、纳米孔测序、微流体Sanger测序、数字RNA测序(“数字RNA-seq”)等。
另外，在一些情况下，一种或多种其它物质种类可以与标签缔合(诸如共价结合或连接至其)。例如，如前所述，在一些情况下，可将由裂解的细胞释放的核酸连接至一个或多个标签。这些可以包括例如染色体DNA、RNA转录物、tRNA、mRNA、线粒体DNA等。除了对标签本身进行测序之外，还可对这样的核酸进行测序，这可产生关于可与标签缔合的细胞的核酸谱或相应的微滴或细胞所暴露于的条件的信息。因此，作为非限制性实例，可将来自细胞的RNA转录物连接至一个或多个标签，可对其进行测序并使其与相应的微滴或细胞所暴露于的条件关联，以确定信息诸如凋亡基因标志、生长抑制标志、免疫标志、代谢基因集或赋予对其它已知药剂的敏感性或抗性的基因的表达等。
标签(诸如本文所述的那些)可以用于多种情形，例如作为高通量筛选技术用于筛选或生物勘探新药物或其它治疗，以研究各种暴露条件对细胞的影响等。另外，应当理解，本发明不仅限于细胞研究。例如，可将包含在微滴内的化学物质暴露于各种不同的条件(例如，潜在的反应物或催化剂、反应条件、引发剂等)和所述不同条件被标记以用于确定或优化所述化学物质能够参与的反应。在一些情况下，化学物质可以是生物活性化学物质(例如，药物、蛋白质、聚合物、碳水化合物等)，尽管在其它情况下，化学物质不需要是生物相关的。例如，化学物质可以是单体或聚合物、催化剂、半导体材料等。
作为非限制性实例，在一组实施方案中，可将多个基本相同的细胞任选地在各种物理条件(例如，各种温度)下暴露于各种物质(例如，其它细胞、化学化合物、土壤样品、天然存在的样品等)，以确定任何物质是否对细胞具有有益的或有害的作用。例如，基本上相同的细胞可以是针对一小组物质筛选(以鉴定单独或组合地具有抗癌或抗肿瘤性质的那些物质)的癌细胞，或基本上相同的细胞可以是免疫细胞或需要其某种活性的其它细胞。该小组可包括例如天然存在的化合物、合成化合物、来自文库的化合物、共有某些性质的化合物等。在一些情况下，化合物还可以以不止一种浓度存在。可以如本文所讨论地标记小组的每个成员，以使得在微滴(或其它实体)中的细胞暴露于小组成员后，添加适当的相应标签。还可将标签连接或以其它方式结合在一起。因此，例如，基本上相同的细胞可以暴露于各种组合的各种物质，随后从死细胞中分选活细胞；可如本文所讨论的，对来自含有活细胞(和/或死细胞)的微滴的标签进行分离和测序，以确定能够杀死细胞的那些条件或小组成员。另外，本发明不限于仅基本上相同的细胞。例如，在另一组实施方案中，可使用含有不同细胞(或其它物质种类，诸如化学物质)的微滴。
关于用于在微流体系统中操纵液滴的系统和方法的其它细节遵循例如用于测定液滴(或液滴内的物质)、分选液滴等。例如，用于筛选和/或分选液滴的各种系统和方法描述于由Link等人在2006年2月23日提交的题为“Electronic Control of FluidicSpecies”的美国专利申请系列号11/360,845，其在2007年1月4日公开为美国专利申请公开号2007/000342，其通过引用将全部内容并入本文。作为非限制性实例，通过施加(或移除)第一电场(或其一部分)，液滴可被引导到第一区域或通道；通过将第二电场施加(或移除)到装置(或其一部分)，可将液滴引导到第二区域或通道；通过将第三电场施加到装置(或其一部分)，液滴可以被引导到第三区域或通道；等等，其中电场可以以某种方式不同，例如在强度、方向、频率、持续时间等方面不同。
在本发明的某些实施方案中，提供传感器，其可以以允许确定流体液滴的一个或多个特性的方式感测和/或确定流体液滴的一个或多个特性，和/或包含流体液滴的流体系统的一部分(例如，围绕流体液滴的液体)的特性。本领域普通技术人员可以鉴定可相对于液滴确定并且可用于本发明的特性。这种特征的非限制性实例包括荧光、光谱学(例如光学，红外，紫外等)、放射性、质量、体积、密度、温度、粘度、pH、物质诸如生物物质(例如，蛋白质，核酸等)的浓度等等。
在一些情况下，传感器可以连接至处理器，处理器进而导致对流体液滴执行操作，例如通过对液滴进行分选、从液滴添加或去除电荷、使液滴与另一液滴融合、分割液滴、引起液滴内发生混合等，例如，如前所述的。例如，响应于流体液滴的传感器测量，处理器可以使流体液滴分割、与第二流体液滴合并等。
一个或多个传感器和/或处理器可以被定位成与流体液滴感测连通。如本文所使用的“感测连通”意味着传感器可以定位在任何地方，以使得可以以某种方式感测和/或确定流体系统内(例如，通道内)的流体液滴和/或包含流体液滴的流体系统的一部分。例如，传感器可以与流体液滴和/或包含流体液滴的流体系统的一部分流体地、光学地或视觉地、热地、气动地、电子地等感测连通。传感器可以定位在流体系统附近，例如嵌入在通道的壁内或一体地连接至通道的壁，或者与流体系统分开定位，但是与流体系统进行物理、电和/或光通信，以便能够感测和/或确定流体液滴和/或包含流体液滴的流体系统的一部分(例如，通道或微通道，包含流体液滴的液体等)。例如，传感器可以没有与包含液滴的通道的任何物理连接，但是可以定位成检测从液滴或流体系统产生的电磁辐射，例如红外线、紫外线或可见光。电磁辐射可以由液滴产生，和/或可以从流体系统的其它部分(或者流体系统的外部)产生，并且以例如通过吸收、反射、衍射、折射、荧光、磷光、极性变化、相变、相对于时间的变化等指示流体液滴的一个或多个特性的方式与流体液滴和/或包含流体液滴的流体系统的一部分相互作用。作为示例，激光可以指向流体液滴和/或围绕流体液滴的液体，并且可以确定流体液滴和/或周围的液体的荧光。如本文所使用的“感测连通”还可以是直接或间接的。作为示例，来自流体液滴的光可以被引导到传感器，或者在被引导到传感器之前首先被引导通过光纤系统、波导等。
可用于本发明的传感器的非限制性实例包括基于光学或电磁学的系统。例如，传感器可以是荧光传感器(例如，由激光激发)、显微镜系统(其可以包括相机或其它记录装置)等。作为另一示例，传感器可以是电子传感器，例如能够测定电场或其它电特性的传感器。例如，传感器可以检测流体液滴和/或包含流体液滴的流体系统的一部分的电容、电感等。
如本文所使用的，“处理器”或“微处理器”是能够从一个或多个传感器接收信号、存储信号和/或引导一个或多个响应(例如，如上所述)(例如，通过使用数学公式或电子或计算电路)的任何组件或设备。该信号可以是指示由传感器确定的环境因素的任何合适的信号，例如气动信号，电子信号，光信号，机械信号等。
在一组实施方案中，可以通过在液滴上产生电荷和/或电偶极子，并且使用施加的电场操纵液滴来引导流体液滴，施加的电场可以是AC场、DC场等。作为示例，可以根据需要选择性地施加和移除电场(或者可以施加不同的电场，例如，反向电场)以将流体液滴引导到特定区域。在一些实施方案中，可以根据需要选择性地施加和移除电场，而不实质上改变包含流体液滴的液体的流动。例如，液体可以在基本上稳态的基础上(即，包含流体液滴的液体的平均流速偏离稳态流动或者液体流动相对于时间的预期值的小于20％或小于15％，并且在一些情况下，平均流速可以偏离小于10％或小于5％)或在其它预定的基础上流动通过本发明的流体系统(例如，通过通道或微通道)，并且包含在液体内的流体液滴可以例如使用电场被引导到各个区域，而基本上不改变通过流体系统的液体的流动。
在一些实施方案中，可以通过改变包含液滴的液体的流动在本发明的流体系统内对流体液滴进行筛选或分选。例如，在一组实施方案中，可以通过将围绕流体液滴的液体引导到第一通道、第二通道等中来引导或分选流体液滴
在另一组实施方案中，可以控制流体系统内例如不同通道内或通道的不同部分内的压力，以引导流体液滴的流动。例如，液滴可以被引导朝向包括用于进一步的流动方向(例如，被引导朝向限定任选的下游流动通道的通道中的分支或分叉)的多个选件的通道接合部。可控制一个或多个任选的下游流动通道内的压力以将液滴选择性地引导到通道中的一个中，并且可以在连续的液滴到达接合部所需的时间量级上实现压力变化，以使得可以独立控制每个连续液滴的下游流动路径。在一种布置中，液体储存器的膨胀和/或收缩可以用于将流体液滴引导或分选到通道中，例如通过引起包含流体液滴的液体的定向运动。液体储存器可以定位成使得当被激活时，由激活的储存器引起的液体的运动导致液体沿优选方向流动，从而在该优选方向上携带流体液滴。例如，液体储存器的膨胀可以引起朝向储存器的液体流动，而液体储存器的收缩可以引起液体远离储存器流动。在一些情况下，液体储存器的膨胀和/或收缩可以与其它流动控制装置和方法(例如，如本文所述的)组合。能够引起液体储存器的膨胀和/或收缩的装置的非限制性实例包括活塞和压电部件。在一些情况下，压电部件可能是特别有用的，因为它们具有相对快速的响应时间，例如响应于电信号。在一些实施方案中，流体液滴可以被分选到多于两个通道中。
如上所述，某些实施方案总体上涉及用于分选液体中的流体液滴的系统和方法。例如，可以以某种方式(例如，如本文进一步描述的)感测和/或确定液滴的性质，然后可以将液滴引导朝向装置的特定区域，例如微流体通道，例如，用于分选目的。在一些情况下，使用本发明的某些系统和方法可以实现高分选速度。例如，在一些情况下，可以确定和/或分选至少约10个液滴/秒，并且在其它情况下，可以确定和/或分选至少约20个液滴/秒，至少约30个液滴/秒，至少约100个液滴/秒，至少约200个液滴/秒，至少约300个液滴/秒，至少约500个液滴/秒，至少约750个液滴/秒，至少约1,000个液滴/秒，至少约1,500个液滴/秒，至少约2,000个液滴/秒，至少约3,000个液滴/秒，至少约5,000个液滴/秒，至少约7,500个液滴/秒，至少约10,000个液滴/秒，至少约15,000个液滴/秒，至少约20,000个液滴/秒，至少约30,000个液滴/秒，至少约50,000个液滴/秒，至少约75,000个液滴/秒，至少约100,000个液滴/秒，至少约150,000个液滴/秒，至少约200,000个液滴/秒，至少约300,000个液滴/秒，至少约500,000个液滴/秒，至少约750,000个液滴/秒，至少约1,000,000个液滴/秒，至少约1,500,000个液滴/秒，至少约2,000,000或更多个液滴/秒，或至少约3,000,000或更多个液滴/秒。
在一些方面，可以使用相对小的液滴的群体。在某些实施方案中，作为非限制性实例，液滴的平均直径可以小于约1mm，小于约500微米，小于约300微米，小于约200微米，小于约100微米，小于约75微米，小于约50微米，小于约30微米，小于约25微米，小于约20微米，小于约15微米，小于约10微米，小于约5微米，小于约3微米微米，小于约2微米，小于约1微米，小于约500nm，小于约300nm，小于约100nm或小于约50nm。在某些情况下，液滴的平均直径也可以为至少约30nm，至少约50nm，至少约100nm，至少约300nm，至少约500nm，至少约1微米，至少约2微米，至少约3微米，至少约5微米，至少约10微米，至少约15微米或至少约20微米。液滴群体的“平均直径”是液滴直径的算术平均值。
在一些实施方案中，取决于具体应用，液滴可以具有基本上相同的形状和/或尺寸(即，“单分散”)或具有不同的形状和/或尺寸。在一些情况下，液滴可以具有横截面直径的均匀分布，即液滴可以具有这样的直径分布，以使得不超过约5％，不超过约2％或不超过约1％的液滴具有小于约90％(或小于约95％，或小于约99％)和/或大于约110％(或大于约105％，或大于约101％)的多个液滴的总平均直径的直径。用于产生液滴的横截面直径的均匀分布的一些技术公开于由Link等人于2004年4月9日提交的题为“Formation andControl of Fluidic Species”的国际专利申请号PCT/US2004/010903，其于2004年10月28日公开为WO 2004/091763，其通过引用并入本文。
本领域普通技术人员将能够例如使用激光散射或其它已知技术确定液滴群体的平均直径。如此形成的液滴可以是球形的，或在某些情况下是非球形的。在非球形液滴中的液滴的直径可以被认为是具有与非球形液滴相同的体积的完美数学球体的直径。
在一些实施方案中，可以通过在被液体包围的流体上产生电荷来在通道内产生一个或多个液滴，这可以使流体分离在液体内的个体液滴中。在一些实施方案中，可以向流体施加电场以使液滴形成发生。流体可以作为在液体内的一系列单独的带电和/或电诱导的液滴存在。可以使用任何合适的技术在液体内的流体中产生电荷，例如通过将流体置于电场(可以是AC、DC等)内，和/或通过引起使流体具有电荷的反应发生。
在一些实施方案中，电场从电场发生器(即，能够产生可施加到流体的电场的装置或系统)产生。电场发生器可以产生AC场(即，相对于时间周期性变化的场，例如正弦波、锯齿波、方波等)、DC场(即，相对于时间恒定的场)、脉冲场等。用于产生合适的电场(其可以是AC、DC等)的技术是本领域普通技术人员已知的。例如，在一个实施方案中，通过在一对电极上施加电压来产生电场，所述电极可以位于通道附近，以使得电场的至少一部分与通道相互作用。电极可以由本领域普通技术人员已知的任何合适的电极材料形成，所述材料包括但不限于银、金、铜、碳、铂、铜、钨、锡、镉、镍、铟锡氧化物(“ITO”)等，及其组合。
在另一组实施方案中，可以通过以能够引起流体形成个体液滴的方式改变通道尺寸来从由通道内的液体包围的流体产生流体液滴。通道可以例如是相对于流动方向变宽的通道，例如，以使得流体不粘附到通道壁而是形成个体液滴，或者相对于流动方向变窄的通道，例如，以使得流体被迫聚结成个体液滴。在一些情况下，通道尺寸可以以导致个体液滴的形成发生的方式相对于时间改变(例如，机械地或机电地，气动地等)。例如，通道可以机械地收缩(“挤压”)以引起液滴形成，或者流体流可以被机械地破坏(例如通过使用移动挡板、旋转叶片等)以引起液滴形成。
某些实施方案总体上涉及用于将液滴分割成两个或更多个液滴的系统和方法。例如，可以使用施加的电场来分割液滴。液滴可以具有比周围液体更大的电导率，并且在一些情况下，液滴可以是中性电荷的。在某些实施方案中，在施加的电场中，可以促使电荷从液滴的内部迁移至待分布在其上的表面，从而可以消除液滴内部中经历的电场。在一些实施方案中，液滴表面上的电荷也可能由于所施加的电场而经受力，这导致具有相反极性的电荷在相反的方向上迁移。在一些情况下，电荷迁移可导致液滴被拉开成两个单独的液滴。
本发明的一些实施方案总体上涉及用于将两个或更多个液滴融合或聚结成一个液滴的系统和方法，例如，当两个或更多个液滴例如由于组成、表面张力、液滴尺寸、表面活性剂的存在或不存在等而通常不能融合或聚结时。在某些情况下，相对于液滴尺寸，液滴的表面张力还可以防止发生液滴的融合或聚结。
作为非限制性实例，两个液滴可以被给予相反的电荷(即，正电荷和负电荷，不一定具有相同的量级)，这可以增加两个液滴的电相互作用，以使得液滴的融合或聚结由于它们相反的电荷而发生。例如，电场可以被施加到液滴，液滴可以通过电容器，化学反应可以使液滴变得带电等。在一些情况下，液滴可能不能够融合，即使施加表面活性剂以降低液滴的表面张力。然而，如果液滴以相反的电荷(其可以是但不一定是相同的量级)带电，则液滴可以能够融合或聚结。作为另一个实例，液滴可以不必须被给予相反的电荷(并且在一些情况下，可以不被给予任何电荷)，并且通过使用在液滴中诱导的导致液滴聚结的偶极子而融合。此外，允许聚结的两个或更多个液滴不一定需要满足“迎头相对的”。只要初始发生液滴的至少一些融合，则任何接触角度都是足够的。还参见例如由Ahn等人于2007年1月24日提交的题为“Fluidic Droplet Coalescence”的美国专利申请系列号11/698,298，其于2007年8月23日公开为美国专利申请公开号2007/0195127，通过引用将其全部内容并入本文。
在一组实施方案中，流体可以被注入到液滴中。在一些情况下，可以例如使用微针或其它这样的装置将流体微注射到液滴中。在其它情况下，当液滴与流体通道接触时，可以使用流体通道将流体直接注入到液滴中。流体注射的其它技术公开于例如由Weitz等人于2010年6月25日提交的题为“Fluid Injection”的国际专利申请号PCT/US2010/040006，其于2010年12月29日公开为WO 2010/151776；由Weitz等人于2009年12月18日提交的题为“Particle-Assisted Nucleic Acid Sequencing”的国际专利申请号PCT/US2009/006649，其于2010年7月15日公开为WO 2010/080134，这些专利申请通过引用整体并入本文。
根据本发明的某些方面，多种材料和方法可用于形成制品或组件(诸如本文所述的那些)，例如通道诸如微流体通道、腔室等。例如，各种制品或组件可以由固体材料形成，其中通道可以通过微加工、膜沉积工艺如旋涂和化学气相沉积、激光制造、光刻技术、蚀刻法包括湿化学或等离子体工艺等形成。参见，例如，Scientific American,248:44-55,1983(Angell等人)。
在一组实施方案中，本文所述制品的各种结构或组件可由聚合物形成，所述聚合物为例如弹性体聚合物，例如聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)，聚四氟乙烯(“PTFE”或)等。例如，根据一个实施方案，可以通过使用PDMS或其它软光刻技术单独制造流体系统来实现微流体通道(适合于此实施方案的软光刻技术的细节在Younan Xia和GeorgeM.Whitesides的题为“Soft Lithography”，公开于Annual Review of Material Science，1998，第28卷，第153-184页以及George M.Whitesides，Emanuele Ostuni，ShuichiTakayama，Xingyu Jiang和Donald E.Ingber的题为“Soft Lithography in Biology andBiochemistry”，公开于Annual Review of Biomedical Engineering，2001，第3卷，第335-373页的参考文献中讨论；这些参考文献中的每一个通过引用并入本文)。
潜在合适的聚合物的其它实例包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚氯乙烯，环烯烃共聚物(COC)，聚四氟乙烯，氟化聚合物，硅酮诸如聚二甲基硅氧烷，聚偏二氯乙烯，双苯并环丁烯(“BCB”)，聚酰亚胺，聚酰亚胺的氟化衍生物等。也设想了包括聚合物(包括上述的那些)的组合、共聚物或掺合物。装置还可以由复合材料(例如，聚合物和半导体材料的复合材料)形成。
在一些实施方案中，制品的各种结构或部件由聚合和/或柔性和/或弹性体材料制成，并且可以方便地由可硬化流体形成，从而便于经由模制(例如复制成型、注射成型、铸塑成型等等)制造。可硬化流体可以基本上是可以被诱导固化或自发固化成能够容纳和/或输送预期用于流体网络和与流体网络一起使用的流体的固体的任何流体。在一个实施方案中，可硬化流体包括聚合物液体或液体聚合物前体(即“预聚物”)。合适的聚合物液体可包括例如热塑性聚合物、热固性聚合物、蜡、金属或其在高于其熔点的温度下加热的混合物或复合物。作为另一个实例，合适的聚合物液体可以包括一种或多种聚合物在合适溶剂中的溶液，该溶液在除去溶剂(例如通过蒸发)后形成固体聚合物材料。可以例如从熔融状态固化或通过溶剂蒸发固化的这种聚合物材料是本领域普通技术人员公知的。对于其中一个或两个母模模具由弹性体材料组成的实施方案，各种聚合物材料(其中许多是弹性体的)是合适的，并且也适用于形成模具或母模模具。这种聚合物的实例的非限制性列表包括一般类别的硅酮聚合物、环氧聚合物和丙烯酸酯聚合物的聚合物。环氧聚合物的特征在于存在通常被称为环氧基团、1、2-环氧化物或环氧乙烷的三元环醚基团。例如，除了基于芳族胺、三嗪和脂环族主链的化合物之外，还可以使用双酚A的二缩水甘油醚。另一个实例包括公知的酚醛清漆聚合物。适用于根据本发明使用的硅酮弹性体的非限制性实例包括由包括氯硅烷如甲基氯硅烷、乙基氯硅烷、苯基氯硅烷、十二烷基三氯硅烷等的前体形成的那些。
在某些实施方案中使用硅酮聚合物，例如，硅酮弹性体聚二甲基硅氧烷。PDMS聚合物的非限制性实例包括由Dow Chemical Co.,Midland,MI以商品名Sylgard销售的那些，特别是Sylgard 182，Sylgard 184和Sylgard 186。包括PDMS的硅酮聚合物具有几种使本发明的各种结构的制造简化的有益性质。例如，这种材料便宜、容易获得，并且可以通过用热硬化而从预聚物液体固化。例如，PDMS通常通过将预聚物液体暴露于约例如约65℃至约75℃的温度进行例如约1小时的暴露时间而硬化。此外，硅酮聚合物例如PDMS可以是弹性体的，因此可用于形成具有相对高的纵横比的非常小的特征，这在本发明的某些实施方案中是必需的。在这方面，柔性(例如，弹性体)模具或母模可以是有利的。
由硅酮聚合物(例如PDMS)形成结构诸如微流体结构或通道的一个优点是这些聚合物被氧化的能力，例如通过暴露于含氧等离子体如空气等离子体，以使得氧化结构在其表面含有能够与其它氧化的硅酮聚合物表面或与各种其它聚合和非聚合材料的氧化表面交联的化学基团。因此，可以制造结构，然后氧化并且基本上不可逆地密封至其它硅酮聚合物表面，或者密封至与氧化的硅酮聚合物表面反应的其它基底的表面，而不需要单独的粘合剂或其它密包封置。在大多数情况下，可以简单地通过使氧化的硅酮表面与另一表面接触来完成密封，而不需要施加辅助压力以形成密封。也就是说，预氧化的硅酮表面用作针对合适的配合表面的接触粘合剂。具体地，除了不可逆地密封自身之外，氧化的硅酮例如氧化的PDMS还可以不可逆地密封至除了自身之外的一系列氧化材料，包括例如玻璃、硅、氧化硅、石英、氮化硅、聚乙烯、聚苯乙烯、玻璃碳和环氧聚合物，它们以与PDMS表面类似的方式氧化(例如，通过暴露于含氧等离子体)。在本发明的上下文中有用的氧化和密封方法以及整体模制技术描述于本领域中，例如描述于题为“Rapid Prototyping of MicrofluidicSystems and Polydimethylsiloxane”Anal.Chem.,70:474-480,1998(Duffy等人)的文章中，其通过引用并入本文。
因此，在某些实施方案中，制品的设计和/或制造可以相对简单，例如通过使用相对公知的软光刻和其它技术诸如本文所述的那些。另外，在一些实施方案中，制品的快速和/或定制设计(例如，在几何形状方面)是可能的。在一组实施方案中，制品可以被制成是一次性的，例如在制品与放射性、毒性、有毒、反应性、生物危害性等的物质一起使用的实施方案中，和/或当物质的性质(例如，毒理学性质、放射性性质等)是未知的时。从氧化的硅酮聚合物形成通道或其它结构(或内部、流体接触表面)的另一个优点是这些表面比典型的弹性体聚合物的表面亲水得多(当需要亲水的内表面时)。因此，与由典型的未氧化的弹性体聚合物或其它疏水性材料构成的结构相比，这种亲水性通道表面可以更容易地用水溶液填充和润湿。
为了所有目的，以下文献通过引用整体并入本文：Link等人的题为“Formationand Control of Fluidic Species”的国际专利申请公开号WO 2004/091763；Stone等人的题为“Method and Apparatus for Fluid Dispersion”的国际专利申请公开号WO 2004/002627；Weitz等人的题为“Method and Apparatus for Forming Multiple Emulsions”的国际专利申请公开号WO 2006/096571；Link等人的题为“Electronic Control of FluidicSpecies”的国际专利申请公开号WO 2005/021151；Weitz等人的题为“Droplet CreationTechniques”的国际专利申请公开号WO 2011/056546；Weitz等人的题为“Creation ofLibraries of Droplets and Related Species”的国际专利申请公开号WO 2010/033200；Weitz等人的题为“Fluid Injection”的美国专利申请公开号2012-0132288；Agresti等人的题为“Assay And Other Reactions Involving Droplets”国际专利申请公开号WO2008/109176；和Weitz等人的题为“Fluid Injection”的国际专利申请公开号WO 2010/151776。
还通过引用整体并入本文的是Bernstein等人于2014年4月17日提交的题为“Systems and Methods for Droplet Tagging”的美国临时专利申请系列号61/981,123。
虽然本文已经描述和示出了本发明的若干实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文描述的功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或多个优势的各种其它工具和/或结构，并且这些变化和/或修改中的每一个被认为在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和构造意在是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明的教导的具体应用。本领域技术人员将通过使用不超过常规实验而认识到或者能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。因此，应当理解，前述实施方案仅以举例的方式给出，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，本发明可以以不同于具体描述和请求保护的方式实施。本发明涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这些特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包括在本发明的范围。
本文定义和使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义术语的普通含义。
除非清楚地相反指示，否则本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个”和“一种”应当被理解为是指“至少一个/一种”。
如在本文中在说明书和权利要求中所用，短语“和/或”应当被理解为意指所连接的元素的“任一个或两者”，即元素在一些情况下结合地存在以及在其它情况下分离地存在。利用“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式来解释，即所连接的元素的“一个或多个”。除通过“和/或”从句明确确定的元素外，还可任选地存在其它元素，无论与明确确定的那些元素相关还是无关。因此，作为非限定性实例，对“A和/或B”的提及，当与开放性措辞诸如“包含/包括”结合使用时，在一个实施方案中可仅指A(任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中可仅指B(任选地包括除A外的元素)；在另一个实施方案中，可指A和B(任选地包括其它元素)；依此类推。
如本文中在说明书和权利要求中所用，“或”应当被理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当在列表中分开各项时，“或”或“和/或”应当被理解为是包含性的，即包含至少一个，但也包括许多个元素或一列元素中的多于一个，以及任选地，包括另外未列出的项。只有明确地指明相反的术语，例如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”或当用于权利要求中时的“由……组成”将指包含多个元素或一列元素中的正好一个元素。一般地，如本文中所用的术语“或”应当仅在冠有排他性的术语诸如“任一”、“……之一”、“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”时被解释为表示排他性选择(即“一个或另一个但非两个”)。“基本上由……组成”，当用于权利要求中时，应当具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如本文中在说明书和权利要求中所用，关于一列一个或多个元素的短语“至少一个”应当被理解为意指选自一列元素中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表内明确列出的每一个元素的至少一个并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许可任选地存在除短语“至少一个”所指的元素列表内明确确定的元素外的元素，无论与那些明确确定的元素相关还是不相关。因此，作为非限定性实例，“A和B的至少一个”(或，等同地，“A或B的至少一个”或，等同地“A和/或B的至少一个”)可在一个实施方案中指至少一个(任选地包括不止一个)A而无B存在(且任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中指至少一个(任选地包括不止一个)B而无A存在(且任选地包括除A外的元素)；在另一个实施方案中指至少一个(任选地包括不止一个)A和至少一个(任选地包括不止一个)B(且任选地包括其它元素)；依此类推。
还应当理解，除非明确地指明与之相反，否则在包括不止一个步骤或行为的本文请求保护的任何方法中，所述方法的步骤或行为的顺序不必须地限定于其中叙述所述方法的步骤或行为的顺序。
在权利要求中，以及在上述说明书中，所有过渡短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“拥有”、“牵涉”、“持有”、“由……组成”等被理解为开放性的，即意指包括但不限于。只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应当分别是封闭性的或半封闭性的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中所示的。

Claims (121)

1.一种方法，其包括：
将微滴暴露于第一条件并向所述微滴添加第一核酸，其中所述第一核酸编码所述第一条件；
将所述微滴暴露于第二条件并向所述微滴添加第二核酸，其中所述第二核酸编码所述第二条件；和
将所述第一核酸和所述第二核酸连接在一起。
2.权利要求1的方法，其中将微滴暴露于第一条件并向所述微滴添加第一核酸包括将所述微滴融合至包含所述第一核酸的第二微滴。
3.权利要求1或2的任一项的方法，其中将微滴暴露于第一条件包括将所述微滴暴露于分子物质种类。
4.权利要求3的方法，其中将所述微滴暴露于所述分子物质种类包括使所述微滴与包含所述分子物质种类的第二微滴融合。
5.权利要求4的方法，其中所述第二微滴还含有所述第一核酸，由此当所述第二微滴融合至所述微滴时，所述第一核酸被添加至所述微滴。
6.权利要求4或5的任一项的方法，其中所述第二微滴经由在所述微滴中诱导的偶极与所述微滴融合。
7.权利要求4或5的任一项的方法，其中所述第二微滴经由置于所述微滴上的相反电荷与所述微滴融合。
8.权利要求3-7的任一项的方法，其中将所述微滴暴露于所述分子物质种类包括用包含所述分子物质种类的流体注射所述微滴。
9.权利要求8的方法，其中所述包含所述分子物质种类的流体还包含所述第一核酸。
10.权利要求3-9的任一项的方法，其中所述分子物质种类和所述第一核酸被同时添加至所述微滴。
11.权利要求3-9的任一项的方法，其中在将所述第一核酸添加至所述微滴之前，将所述分子物质种类添加至所述微滴。
12.权利要求3-9的任一项的方法，其中在将所述第一核酸添加至所述微滴之后，将所述分子物质种类添加至所述微滴。
13.权利要求1-12的任一项的方法，其中将微滴暴露于第一条件包括将所述微滴暴露于外部物理条件。
14.权利要求13的方法，其中将所述微滴暴露于外部物理条件包括将所述微滴暴露于预定温度和/或预定压力。
15.权利要求1-14的任一项的方法，其中将微滴暴露于第一条件包括将所述微滴融合至pH小于7和/或pH大于7的第二微滴。
16.权利要求1-15的任一项的方法，其中所述微滴具有小于约1mm的平均横截面直径。
17.权利要求1-16的任一项的方法，其中所述微滴是具有这样的直径分布的多个微滴中的一个，以使得不超过约5％的微滴具有小于约90％或大于约110％的所述多个微滴的总平均直径的直径。
18.权利要求1-17的任一项的方法，其还包括将所述微滴暴露于第三条件并向所述微滴添加第三核酸，其中所述第三核酸编码所述第三条件。
19.权利要求18的方法，其还包括将所述第三核酸附着至所述第一核酸和所述第二核酸之一或两者。
20.权利要求1-19的任一项的方法，其中将所述第一核酸和所述第二核酸附着的行为发生在所述微滴内。
21.权利要求1-20的任一项的方法，其还包括测定所述微滴的性质。
22.权利要求21的方法，其还包括基于所述性质分选所述微滴。
23.权利要求21或22的任一项的方法，其中所述性质是荧光。
24.权利要求21或22的任一项的方法，其中所述性质是所述微滴的平均横截面直径。
25.权利要求21或22的任一项的方法，其中所述性质是光吸收。
26.权利要求21或22的任一项的方法，其中所述性质是包含在所述微滴内的试剂的浓度。
27.权利要求21或22的任一项的方法，其中所述性质是包含在所述微滴内的细胞的状况。
28.权利要求27的方法，其中所述性质是所述细胞是活的还是死的。
29.权利要求27的方法，其中所述性质是由所述细胞产生和/或消耗的试剂的浓度。
30.权利要求1-29的任一项的方法，其还包括从所述微滴中分离附着的第一核酸和第二核酸。
31.权利要求1-30的任一项的方法，其还包括破裂所述微滴。
32.权利要求31的方法，其中在附着所述第一核酸和所述第二核酸之后破裂所述微滴。
33.权利要求31或32的任一项的方法，其中通过将所述微滴暴露于超声来破裂所述微滴。
34.权利要求1-33的任一项的方法，其中所述微滴含有细胞。
35.权利要求34的方法，其中所述细胞是人细胞。
36.权利要求34或35的任一项的方法，其中所述细胞是癌细胞。
37.权利要求34-36的任一项的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
38.权利要求34的方法，其中所述细胞是细菌细胞。
39.权利要求34或38的任一项的方法，其中所述细胞是天然存在的细胞。
40.权利要求34-39的任一项的方法，其中所述第一条件是所述细胞的类型。
41.权利要求34-39的任一项的方法，其中所述第一条件是暴露于疑似能够与所述细胞相互作用的药物。
42.权利要求34-39的任一项的方法，其中所述第一条件是暴露于推定的细胞毒性药物。
43.权利要求1-42的任一项的方法，其还包括对连接的第一和第二核酸测序。
44.权利要求1-43的任一项的方法，其中所述微滴包含在微流体通道内。
45.一种方法，其包括：
将多个微滴暴露于多个条件，以使得基本上每个微滴顺序地暴露于至少两个不同的条件，其中当将微滴暴露于条件时，将编码所述条件的核酸添加至所述微滴。
46.权利要求45的方法，其还包括将包含在微滴内的至少一些核酸彼此附着。
47.权利要求45或46的任一项的方法，其还包括将包含在微滴内的至少一些核酸彼此连接。
48.权利要求47的方法，其中连接至少一些核酸包括将所述核酸暴露于能够将所述核酸彼此连接的酶。
49.权利要求45-48的任一项的方法，其中通过将微滴融合至包含核酸的第二微滴来将编码条件的核酸添加至微滴。
50.权利要求45-49的任一项的方法，其中通过将含有核酸的流体注射到微滴中来将编码条件的核酸添加至微滴。
51.权利要求45-50的任一项的方法，其中所述条件中的至少一个是暴露于外部物理条件。
52.权利要求45-51的任一项的方法，其中所述条件中的至少一个是暴露于预定温度和/或预定压力。
53.权利要求45-52的任一项的方法，其中所述条件中的至少一个是暴露于分子物质种类。
54.权利要求45-53的任一项的方法，其中至少一些所述微滴含有细胞。
55.权利要求54的方法，其中所述细胞是基本上相同的。
56.权利要求54或55的任一项的方法，其中所述细胞来自同一器官。
57.权利要求54-56的任一项的方法，其中所述细胞来自同一生物体。
58.权利要求54-56的任一项的方法，其中所述细胞来自不同的生物体。
59.权利要求54-57的任一项的方法，其中所述细胞来自相同的生物物种。
60.权利要求54-59的任一项的方法，其中所述细胞包括人细胞。
61.权利要求54-60的任一项的方法，其中所述条件中的至少一种是暴露于怀疑能够与至少一些所述细胞相互作用的药物。
62.权利要求45-61的任一项的方法，其包括将基本上每个微滴暴露于至少三个不同的条件。
63.权利要求45-62的任一项的方法，其还包括测定所述微滴的性质。
64.权利要求63的方法，其还包括基于所述性质分选至少一些所述微滴。
65.权利要求63或64的任一项的方法，其中所述性质是荧光。
66.权利要求63或64的任一项的方法，其中所述性质是包含在所述微滴内的试剂的浓度。
67.权利要求63或64的任一项的方法，其中所述性质是包含在所述微滴内的细胞的状况。
68.权利要求45-67的任一项的方法，其还包括从至少一些所述微滴中分离至少一些所述核酸。
69.权利要求45-68的任一项的方法，其还包括破裂至少一些所述微滴。
70.权利要求45-69的任一项的方法，其还包括对至少一些所述核酸进行测序。
71.一种制品，其包含：
多个微滴，至少一些所述微滴含有编码所述至少一些微滴暴露于的多个条件的核酸。
72.权利要求71的制品，其中所述核酸编码至少三个条件。
73.权利要求71或72的任一项的制品，其中至少一些所述核酸编码包含在至少一些所述微滴内的分子物质种类。
74.权利要求73的制品，其中至少一些所述微滴还包含由核酸编码的各自分子物质种类。
75.权利要求74的制品，其中基本上每个微滴包含至少两种分子物质种类和编码所述至少两种分子物质种类的核酸。
76.权利要求74或75的任一项的制品，其中基本上每个微滴包含至少三种分子物质种类和编码所述至少三种分子物质种类的核酸。
77.权利要求71-76的任一项的制品，其中至少一些所述微滴还包含细胞。
78.权利要求77的制品，其中所述细胞是基本上相同的。
79.权利要求71-78的任一项的制品，其中至少一些所述微滴还包含DNA连接酶。
80.一种方法，其包括：
将包含在微滴内的细胞暴露于第一物质种类，并向所述微滴添加第一核酸；
将所述细胞暴露于第二物质种类，并向所述微滴添加第二核酸；
将所述第一核酸和所述第二核酸连接在一起；
测定所述细胞的性质；和
基于所述细胞的性质分选所述微滴。
81.权利要求80的方法，其中连接所述第一核酸和所述第二核酸包括将所述第一核酸和所述第二核酸暴露于能够将所述第一核酸和所述第二核酸彼此连接的酶。
82.权利要求80或81的任一项的方法，其中向所述微滴添加第一核酸包括将所述微滴融合至包含所述第一核酸的第二微滴。
83.权利要求80-82的任一项的方法，其中将所述微滴暴露于第一分子物质种类包括使所述微滴与包含所述第一分子物质种类的第二微滴融合。
84.权利要求83的方法，其中所述第二微滴还包含所述第一核酸，由此当所述第二微滴融合至所述微滴时，所述第一核酸被添加至所述微滴。
85.权利要求80-84的任一项的方法，其中将所述微滴暴露于第一分子物质种类包括用包含所述第一分子物质种类的流体注射所述微滴。
86.权利要求85的方法，其中包含所述第一分子物质种类的流体还包含所述第一核酸。
87.权利要求85或86的任一项的方法，其还包括用包含所述第一核酸的第二流体注射所述微滴。
88.权利要求80-87的任一项的方法，其还包括将所述微滴暴露于第三分子物质种类并向所述微滴添加第三核酸。
89.权利要求88的方法，其还包括将所述第三核酸附着至所述第一核酸和所述第二核酸之一或两者。
90.权利要求80-89的任一项的方法，其中所述性质是所述细胞是活的还是死的。
91.权利要求80-90的任一项的方法，其中所述性质是由所述细胞产生或消耗的试剂的浓度。
92.权利要求80-91的任一项的方法，其还包括基于所述细胞的性质分选所述微滴。
93.权利要求92的方法，其还包括将所述细胞的性质与所述第一核酸和所述第二核酸相关联。
94.权利要求80-93的任一项的方法，其还包括从所述微滴中分离附着的第一核酸和第二核酸。
95.权利要求80-94的任一项的方法，其还包括破裂所述微滴。
96.权利要求80-95的任一项的方法，其还包括测定所述第一核酸和/或所述第二核酸。
97.权利要求80-96的任一项的方法，其还包括对连接的第一和第二核酸测序。
98.权利要求80-97的任一项的方法，其中所述行为以所述的顺序进行。
99.一种制品，其包含：
包含多种细胞类型和多种核酸的微滴文库，其中基本上每种细胞类型由独特的核酸序列编码。
100.权利要求99的制品，其中所述文库包含至少10种独特的细胞类型。
101.权利要求99或100的任一项的制品，其中所述文库包含至少100种独特的细胞类型。
102.权利要求99-101的任一项的制品，其中所述文库包含至少1000种独特的细胞类型。
103.一种方法，其包括：
将多种细胞类型和多种核酸包封在多个微滴中，以使得基本上每个微滴包含仅一种细胞类型的一个或多个细胞和编码仅一种细胞类型的编码核酸。
104.权利要求103的方法，其包括将至少10种独特的细胞类型和多种核酸包封在多个微滴中，以使得基本上每个微滴包含仅一种细胞类型的一个或多个细胞和编码仅一种细胞类型的编码核酸。
105.权利要求103或104的任一项的方法，其包括将至少100种独特的细胞类型和多种核酸包封在多个微滴中，以使得基本上每个微滴包含仅一种细胞类型的一个或多个细胞和编码仅一种细胞类型的编码核酸。
106.权利要求103-105的任一项的方法，其包括将至少1000种独特的细胞类型和多种核酸包封在多个微滴中，以使得基本上每个微滴包含仅一种细胞类型的一个或多个细胞和编码仅一种细胞类型的编码核酸。
107.权利要求103-106的任一项的方法，其还包括将所述多个微滴暴露于第一条件并向所述微滴添加第一核酸，以及将所述编码核酸和所述第一核酸连接在一起。
108.权利要求107的方法，其中所述第一条件是暴露于分子物质种类。
109.权利要求108的方法，其中所述分子物质种类是怀疑能够与至少一些所述细胞类型相互作用的药物。
110.权利要求108或109的方法，其中所述分子物质种类选自多种分子物质种类。
111.权利要求110的任一项的方法，其中所述分子物质种类选自至少10种的多种分子物质种类，以使得基本上每个微滴暴露于选自所述多种分子物质种类的分子物质种类之一。
112.权利要求110或111的任一项的方法，其中所述分子物质种类选自至少100种的多种分子物质种类，以使得基本上每个微滴暴露于选自所述多种分子物质种类的分子物质种类之一。
113.权利要求110-112的任一项的方法，其中所述分子物质种类选自至少1000种的多种分子物质种类，以使得基本上每个微滴暴露于选自所述多种分子物质种类的分子物质种类之一。
114.权利要求103-113的任一项的方法，其还包括裂解所述微滴内的细胞。
115.权利要求114的方法，其还包括将裂解细胞产生的核酸连接至所述微滴内的编码核酸。
116.权利要求115的方法，其包括将裂解细胞产生的RNA连接至所述微滴内的编码核酸。
117.权利要求116的方法，其中所述RNA是RNA转录物。
118.权利要求115-117的任一项的方法，对至少一些核酸进行测序。
119.权利要求118的方法，其包括使用数字RNA测序对至少一些核酸进行测序。
120.一种方法，其包括：
在多个微滴中提供多种细胞类型和多种核酸，以使得基本上每个微滴包含仅一种细胞类型的一个或多个细胞和编码仅一种细胞类型的编码核酸；
裂解微滴内的细胞以从所述细胞释放细胞核酸；
将所述编码核酸和所述细胞核酸连接在一起；和
对连接的核酸进行测序。
121.一种方法，其包括：
在多个微滴中提供多种细胞类型和多种核酸，以使得基本上每个微滴包含仅一种细胞类型的一个或多个细胞和编码仅一种细胞类型的编码核酸；
将所述多个微滴暴露于多种物质种类，以使得基本上每个微滴暴露于所述多种物质种类中的单一物质种类，并向其中添加编码所述单一物质种类的第一核酸；
裂解微滴内的细胞以从所述细胞释放细胞核酸；
将所述编码核酸、所述第一核酸和所述细胞核酸连接在一起；和对连接的核酸进行测序。
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