JP2017527313A - ハイスループットヌクレオチドライブラリーシークエンシング - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2014年9月15日に出願された米国仮出願第62/050,549号、および2014年9月17日に出願された米国仮出願第62/051,832号の優先権を主張し、その全体が、本明細書中に参照によって組み込まれる。
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、全ての目的で、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書で言及される、全ての刊行物および特許は、本明細書で記載される方法、キット、および組成物との関連で使用されうる、刊行物中で記載されているキット、組成物、および方法を記載および開示することを目的として、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で論じられる文献は、本出願の出願日以前のそれらの開示のためだけに提示されている。本明細書のいかなる内容も、本明細書で記載された発明者らが、先行発明のために、または他の任意の理由で、このような開示に先行する資格がないことの容認とはみなさないものとする。
ポリヌクレオチドを含有する任意の生物学的試料は、本明細書で記載される方法で使用することができる。例えば、試料は、RNAまたはDNAを含有する被験体に由来する生物学的試料でありうる。ポリヌクレオチドを、生物学的試料から抽出することもでき、試料を、ポリヌクレオチドの抽出または精製を伴わない方法に直接かけることもできる。試料は、抽出または単離されたDNAまたはRNAでありうる。試料はまた、生物学的検体から抽出された全RNAまたはDNAの場合もあり、cDNAライブラリー、ウイルスDNA、またはゲノムDNAの場合もある。一実施形態では、ポリヌクレオチドを、タンパク質、脂質、および非鋳型核酸など、他の様々な成分を含有する生物学的試料から単離する。核酸鋳型分子は、動物、植物、細菌、真菌、または他の任意の細胞生物から得られた、任意の細胞材料から得ることができる。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを、単一細胞から得る。ポリヌクレオチドは、生物から直接得ることもでき、生物から得られた生物学的試料から得ることもできる。任意の組織または体液検体を、本発明における使用のための核酸のための供給源として使用することができる。ポリヌクレオチドはまた、初代細胞培養物または細胞系など、培養細胞からも単離することができる。鋳型核酸が得られる細胞または組織には、ウイルスまたは他の細胞内病原体を感染させることができる。
場合によって、本明細書で提示される方法は、細胞に由来するポリヌクレオチド分子などの標的ポリヌクレオチド分子の増幅およびシークエンシングを対象とする。場合によって、本明細書で提示される方法は、標的ポリヌクレオチド分子の2つまたはそれ超の領域の増幅およびシークエンシングを対象とする。場合によって、本明細書で提示される方法は、2つまたはそれ超の標的ポリヌクレオチド分子の増幅およびシークエンシングを対象とする。一態様では、標的ポリヌクレオチドは、RNAである。一態様では、標的ポリヌクレオチドは、ゲノム核酸である。特定の生物の染色体内の遺伝子材料から導出されるDNAは、ゲノムDNAでありうる。好ましい実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生される抗体またはTCRの可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生される抗体の重鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生される抗体の軽鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生されるTCRのアルファ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生されるTCRのベータ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生されるTCRのガンマ鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生されるTCRのデルタ鎖の可変領域を含む配列を含む。
本発明は、ポリヌクレオチドのライブラリーを生成するために核酸を操作するステップを、シークエンシングのために活用する。一部の実施形態では、本発明は、組換えモノクローナル抗体を作製するために、核酸を操作するステップを活用する。一般的な意味において、本発明の一部の実施形態では、免疫細胞および/またはT細胞の遺伝子材料の増幅のために、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(逆転写PCR)が、免疫細胞の遺伝子材料のcDNA増幅を起こすために用いられる。抗体分子では、免疫グロブリン遺伝子は、免疫細胞またはT細胞のゲノムDNAまたはmRNAから得ることができる。RNAは、重鎖(V、D、Jセグメント)の場合もあり、軽鎖(V、Jセグメント)の場合もある。一部の実施形態では、出発材料は、抗体をコードし、定常領域を含有する、V、D、J遺伝子セグメントからなる、免疫細胞に由来するRNAである。
容器バーコードおよび分子バーコードにより、単一細胞にバーコードを付けるために、結果として得られる容器が、容器1つ当たり細胞1個またはそれ未満を含有するように、油中水エマルジョンなどの容器を創出することができる。結果として得られる容器がまた、容器1つ当たり1つの容器バーコードも含有するように、容器を創出することができる。結果として得られる容器がまた、容器1つ当たり1つの分子バーコード化ポリヌクレオチドも含有するように、容器を創出することができる。結果として得られる容器がまた、容器1つ当たり2つもしくはそれ超または複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドも含有するように、容器を創出することができる。細胞/容器は、本明細書で記載される、RNAまたはDNAの単一バーコード化プロトコールの下にあり、各容器の容器バーコードおよび1つまたは複数の分子バーコードを、細胞ポリヌクレオチドなど、目的の標的と融合させることができる。一部の実施形態では、マッチする容器バーコード化ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドと同じ容器内に存在する細胞構成要素と融合させることができる。シークエンシングに続き、容器バーコードおよび分子バーコードのデコンボリューションを使用して、どのRNA(またはDNA)が、どの細胞に由来するかを同定することができる。一部の実施形態では、結果として得られるエマルジョンが、エマルジョン1つ当たり細胞1個またはそれ超を含有するように、油中水エマルジョンなどの容器を創出することができる。一部の実施形態では、結果として得られるエマルジョンが、容器1つ当たり1つの容器バーコード化ポリヌクレオチドおよび2つまたはそれ超の分子バーコード化ポリヌクレオチドを含有するように、油中水エマルジョンを創出することができる。一部の実施形態では、結果として得られる容器が、容器1つ当たり1つ超の容器バーコード化ポリヌクレオチドおよび2つまたはそれ超の分子バーコード化ポリヌクレオチドを含有するように、容器を創出することができる。一部の実施形態では、容器バーコードおよび分子バーコードは、溶液中にある場合に、容器に導入することができる。一部の実施形態では、容器バーコードおよび分子バーコードは、ビーズなど、固体支持体に結合させていない場合に、容器に導入することができる。
本明細書で使用される「抗体発現ライブラリー」または「TCR発現ライブラリー」または「発現ライブラリー」とは、核酸またはタンパク質レベルにおける、分子のコレクション(すなわち、2つまたはそれ超の分子)を指す場合がある。したがって、この用語は、複数の抗体またはTCR分子をコードする発現ベクターのコレクション(すなわち、核酸レベルにおける)を指す場合もあり、それらを適切な発現系において発現させた後における、抗体またはTCR分子のコレクション(すなわち、タンパク質レベルにおける)を指す場合もある。代替的に、発現ベクター/発現ライブラリーは、それらを発現させうる適切な宿主細胞内に含有される場合もある。本発明の発現ライブラリー内でコードされるかまたは発現する抗体分子は、任意の適切なフォーマットであることが可能であり、例えば、全抗体またはTCR分子の場合もあり、抗体またはTCR断片、例えば、単鎖抗体(例えば、scFv抗体)、Fv抗体、Fab’抗体、(Fab’)2断片、ダイアボディなどの場合もある。特定の酵素を「コードする(encoding)」/「コードする(coding for)」核酸配列、またはそのDNAコード配列、またはそれを「コードする(encoding)」/「コードする(coding for)」ヌクレオチド配列である場合の、「コードすること(encoding)」および「コードすること(coding for)」という用語、ならびに他の同義の用語は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、酵素に転写および翻訳されるDNA配列を指す。「プロモーター配列」とは、細胞内のRNAポリメラーゼに結合し、下流の(3’方向の)コード配列の転写を開始することが可能な、DNA調節領域である。プロモーターは、DNA配列の一部である。この配列領域は、その3’末端において、開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するのに必要なエレメントを有する、最小数の塩基を含む。しかし、RNAポリメラーゼが配列に結合し、転写が、開始コドン(プロモーターを有する3’末端)において開始された後、転写は、下流において、3’方向に進行する。プロモーター配列内には、転写開始部位(ヌクレアーゼS1によるマッピングにより規定されるので好都合である)のほか、RNAポリメラーゼの結合の一因となるタンパク質結合性ドメイン(コンセンサス配列)も見出されるであろう。
バーコードは、分子バーコードまたは容器バーコードでありうる。一部の実施形態では、分子バーコードまたは容器バーコードなどのバーコードは、各々、2〜36ヌクレオチド、4〜36ヌクレオチド、または6〜30ヌクレオチド、または8〜20ヌクレオチド、2〜20ヌクレオチド、4〜20ヌクレオチド、または6〜20ヌクレオチドの範囲内の長さを有しうる。ある特定の態様では、セット内のバーコードの溶融温度は、互いから10℃以内、互いから5℃以内、または互いから2℃以内である。ある特定の態様では、セット内のバーコードの溶融温度は、互いから10℃以内、互いから5℃以内、または互いから2℃以内ではない。他の態様では、バーコードは、交差ハイブリダイズが最小限であるセットのメンバーである。例えば、このようなセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、メンバーが、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、他の任意のメンバーの相補体と安定的な二重鎖を形成しえないセットの他のあらゆるメンバーの配列と十分に異なりうる。一部の実施形態では、交差ハイブリダイズが最小限であるセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、他のあらゆるメンバーの配列と、少なくとも2つのヌクレオチド異なる。バーコード技術は、Winzelerら(1999年)、Science、285巻:901頁;Brenner(2000年)、Genome Biol.、1巻:1頁 Kumarら(2001年)、Nature Rev.、2巻:302頁;Giaeverら(2004年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、101巻:793頁;Easonら(2004年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、101巻:11046頁;およびBrenner(2004年)、Genome Biol.、5巻:240頁において記載されている。
複数の細胞の試料を、複数の細胞に由来する個別の細胞に由来するかまたはそれから導出されるポリヌクレオチドの分子および容器バーコード化とカップリングさせて、小反応容量に分けることにより、バイオマーカー配列などの配列のレパートリーのハイスループットシークエンシングを可能とすることができる。
一般に、液滴ライブラリーは、単一のコレクション内に併せてプールされている、いくつかのライブラリーエレメントから構成される。ライブラリーは、単一のライブラリーエレメント〜1×1015またはそれ超のライブラリーエレメントで、複雑性を変動させることができる。各ライブラリーエレメントは、一定の濃度における、1つまたは複数の所与の成分である。エレメントは、細胞、ビーズ、アミノ酸、タンパク質、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、または低分子化合物でありうるがこれらに限定されない。エレメントは、分子バーコード、容器バーコード、またはこれらの両方などの識別子を含有しうる。
場合によって、標的ポリヌクレオチドは、逆転写により、RNAから調製される。場合によって、標的ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼなどを使用して、プライマーの伸長により、DNAから調製される。
標的ポリヌクレオチドを含有する試料は、増幅されうるmRNA、またはその断片を含みうる。場合によって、mRNAまたはその断片の平均の長さは、約100、200、300、400、500、もしくは800塩基対未満、または約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、もしくは200ヌクレオチド未満、または約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100キロベース未満でありうる。場合によって、約40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100塩基である鋳型を含有する試料など、比較的短い鋳型に由来する標的配列を増幅する。
一般に、1つまたは複数のプライマー対を、増幅反応において使用することができ、プライマー対のうちの1つのプライマーは、フォワードプライマーであることが可能であり、プライマー対のうちの1つのプライマーは、リバースプライマーでありうる。
本明細書で記載される方法または方法ステップの1つまたは複数を実施した後、生成されたポリヌクレオチドのライブラリーをシークエンシングすることができる。
一部の実施形態では、方法は、被験体において、疾患、障害、症状、および/または状態を診断し、予後予測し、モニタリングし、処置し、改善し、かつ/または防止するステップをさらに含みうる。一部の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチドの存在、非存在、またはレベルに基づき、被験体において、疾患、障害、症状、および/または状態を診断し、予後予測し、モニタリングし、処置し、改善し、かつ/または防止するステップをさらに含みうる。一部の実施形態では、方法は、1つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在、非存在、またはレベルに基づき、被験体において、疾患、障害、症状、および/または状態を診断し、予後予測し、モニタリングし、処置し、改善し、かつ/または防止するステップをさらに含みうる。
本明細書で開示される方法およびキットは、1つまたは複数の酵素を含みうる。酵素の例は、リガーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼ、および制限ヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない。
本明細書で開示される方法およびキットは、1つまたは複数の試薬の使用を含みうる。試薬の例は、PCR試薬、ライゲーション試薬、逆転写試薬、酵素試薬、ハイブリダイゼーション試薬、試料調製試薬、親和性捕捉のための試薬、ビーズなどの固体支持体、ならびに核酸の精製および/または単離のための試薬を含むがこれらに限定されない。
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシークエンシングを実施するための細胞を調製するためのプロトコール
目的の細胞集団を得た。これらは、全PBMC、分取細胞、抗体により富化されたBもしくはT細胞、または他の細胞型を含んだ。細胞は、それらが、過剰量のmRNAを、周囲の培地へと漏出しないように、無傷の細胞膜を有した。細胞は、生細胞である必要はなかった。
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシークエンシングを実施するための固形組織を調製するためのプロトコール
固形組織(例えば、腫瘍または非腫瘍生検試料)を、コラゲナーゼIII(200U/mL)、DNアーゼI(200U/mL)およびトリプシン(5mg/mL)、およびNEDB(Invitrogen)を含む多様なプロテアーゼで処理して、個別の細胞と、1つ超の細胞を含有する凝集物との混合物をもたらした。略述すると、マウスから摘出された腫瘍を、低温の培養培地に添加し、周囲のマウス乳腺組織および脂肪を除去した。腫瘍を、2〜4mmの断片へとミンチにし、次いで、これを、適切な解離溶液または酵素と共に、37℃で30分間にわたりインキュベートした。チップを組織断片サイズに適合する直径に切断した1,000mLのマイクロピペットを使用して、腫瘍断片を、10分間ごとに、上下に混合した。各インキュベーション時間の後、40mmのナイロンメッシュによる細胞ストレイナーを介して、断片を濾過した。放出された細胞を、1200r.p.m.で2分間にわたり遠心分離し、30%のFCSを含む低温の培地中、4℃で保存した。未使用の解離溶液を、残りの組織断片に、30分間にわたり添加した。さらなる細胞が放出されなくなったら、解離を停止させた。断片を、篩を介して押し出し、全てのインキュベーション時間に由来する全ての細胞をプールし、カウントした。次いで、ストレイナー(例えば、10、20、30、40μm)を介して、細胞懸濁液を濾して、大型の凝集物を取り除いた。細胞を、細胞緩衝液:1倍濃度のダルベッコリン酸緩衝生理食塩液(PBS)中、2回の遠心分離(T細胞またはB細胞について、200gで10分間にわたる)により洗浄した。エマルジョンによる解析の前に、細胞集団を、染色、分取またはそれ以外の方法によって分離しなかった。
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシークエンシングを実施するためのエマルジョン反応混合物を調製するためのプロトコール
下記の表1中の試薬およびオリゴヌクレオチドを含有する、エマルジョン反応混合物を、PCR用クリーンフード中、室温で混合した。
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシークエンシングを実施するために、エマルジョンを生成するためのプロトコール
細胞および反応混合物を調製したら、エマルジョンを形成した。100μLのHamilton Microliterシリンジを使用して、約100μLずつの反応混合物の2回の注入により、100μLのPEEK試料ループにオーバーロードした。100μLのHamilton Gastightシリンジを使用して、約110μLの細胞懸濁液を、約100μLで、内径を0.2mmとするFEPチュービングループにロードした。ループを、1〜2秒間ごとに約1回、定常的に細胞ループを反転させて、細胞が定着して固まることを防止する機械的ローテーターに結合させた。内部にフルオロフィリックコーティングを施したDolomite 2試薬チップを介して、ジェット流の焦点を絞ることにより、エマルジョンを形成した。外側の油チャネルは、HFE7500(Novec 7500)フルオロカーボン油中に、0.5〜5.0%(w/v)のポリエチレングリコールベースの界面活性剤を含有した。エマルジョンジェットは、一定の流量(細胞相チャネル内と、反応物相チャネル内とで等しい)で走らせた。エマルジョンチップの出力は、低温ブロック内、およそ0℃に保たれたポリプロピレン製のPCRチューブへと滴下させることにより、12cmで、内径を0.5mmとするPEEKチューブを介して回収した。各々がエマルジョン中に50μLずつの水性材料を含有する、4つの画分を回収した(画分1つ当たりの試行時間を5分間とする)。定着した油の大半は、キャピラリーマイクロピペットにより、各チューブの底部から除去した。各エマルジョン画分は、40μLのオーバーレイ溶液:50mMのNa−EDTA、pH8.0、0.002%(w/v)のクレゾールレッドと共に、静かにオーバーレイした。エマルジョンは、以下のプログラム(分:秒):
1.30:00にわたり42.0℃(逆転写)、
2.05:00にわたり95.0℃(逆転写酵素およびDNA鋳型の変性)、
3.00:10にわたり95.0℃、
4.00:30にわたり65.0℃、
5.00:30にわたり72.0℃、
6.3に戻り合計55サイクル(容器バーコードを増幅し、cDNAと融合させる)、
7.無期限で4.0℃
により、サーマルサイクラー内でインキュベートした。
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシークエンシングを実施するために、エマルジョンを壊すためのプロトコール
キャピラリーマイクロピペットチップを使用して、エマルジョン材料を除去せずに、可能な限り多くのオーバーレイ溶液を除去した。各チューブに、12.5μLのQiagen Protease溶液および0.5MのNa−EDTA 2.5μL、pH8.0を添加した。1:1のFC−40:ペルフルオロオクタノール40μLを添加することにより、エマルジョンを壊し、約10回、静かに反転させた。
1.15:00にわたり50℃(プロテアーゼによる消化)、
2.10:00にわたり70℃で(プロテアーゼの不活化)、
3.03:00にわたり95℃(プロテアーゼの不活化およびDNAの変性)、
4.無期限で4.0℃
により、インキュベートした。
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシークエンシングを実施するために、ポリヌクレオチドを、エマルジョンから清浄化するためのプロトコール
0.25倍容量のNEBストレプトアビジンビーズを、2×BW(10mMのトリス−Cl、pH8.0、1mMのEDTA、2MのNaCl、0.2%のTween−20)中に添加し、室温で15分間にわたりインキュベートした。次いで、ビーズを、1×BWで洗浄し、0.001%のTween−20で3回洗浄し、0.25倍容量の0.001%のTween−20を添加し、3分間にわたり95℃に加熱することにより溶出させた。5倍容量のQiagen Buffer PBを添加し、Zyppyシリカカラムに適用した。次いで、ビーズを、0.7mLのZyppy洗浄緩衝液で洗浄し、5mMのトリス−Cl、pH8.8、0.1mMのEDTA、0.001%のTween−20 180μL中に溶出させた。
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシークエンシングを実施するために、次世代シークエンシングのための、ポリヌクレオチドに対する第1のPCR反応(PCR1)のためのプロトコール
163.2μLの精製cDNAを、PCR1のために使用した。第1のPCR反応のための例示的な設定を、下記の表2に示す。
1.01:00にわたり98℃、
2.00:10にわたり98℃、
3.00:20にわたり64℃、
4.00:20にわたり72℃、
5.2に戻り合計6サイクル
6.無期限で4℃
を試行した。
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシークエンシングを実施するために、次世代シークエンシングのための、ポリヌクレオチドに対する第2のPCR反応(PCR2)のためのプロトコール
20μLの精製PCR1産物を、各サブライブラリー(例えば、IgLまたはIgH鎖あるいはTCRαもしくはTCRβ鎖またはTCRγもしくはTCRδ鎖)のために使用した。第2のPCR反応のための例示的な設定を、下記の表3に示す。
1.01:00にわたり98℃、
2.00:10にわたり98℃、
3.00:20にわたり64℃、
4.00:20にわたり72℃、
5.2に戻り合計6サイクル、
6.無期限で4℃
を、サーモサイクラー内で試行した。
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシークエンシングを実施するために、次世代シークエンシングのための、ポリヌクレオチドに対する第3のPCR反応(PCR3)のためのプロトコール
8μLの精製PCR2産物を、最終的な増幅サイクル数を決定するqPCRのために使用した。第3のPCR反応のための設定を、下記の表4に示す。
1.01:00にわたり98℃、
2.00:10にわたり98℃、
3.00:20にわたり64℃、
4.00:20にわたり72℃、
5.プレートの読み取り、
6.2に戻り合計25サイクル、
7.無期限で4℃
を、qPCR装置内で試行した。
1.01:00にわたり98℃、
2.00:10にわたり98℃、
3.00:20にわたり64℃、
4.00:20にわたり72℃、
5.2に戻り決定された数のサイクル
6.無期限で4℃
を、サーモサイクラー内で試行した。
リードの加工およびアイソタイプの割り当て
pRESTOパッケージ1をもとにして構築されたカスタムパイプラインを使用して、mRNA分子および液滴の全長コンセンサス配列を生成するように、Illumina MiSeqリードを加工し、IgBLASTおよびIMGT/HighV−QUESTにより注釈付けし、カスタムスクリプトおよびChange−Oパッケージで加工して、統計量および図を生成した。Illuminaソフトウェアを使用して、MiSeqリードのマルチプレックス処理を解除した。Phredクォリティーが5未満の位置は、Nでマスキングした。アイソタイプ特異的プライマー、液滴バーコード(DB)、および分子バーコード(MB)を、アンプリコン内で同定し、pRESTO MaskPrimers−cutを使用し、最大のエラーを0.2として、トリミングした。リード1のコンセンサス配列およびリード2のコンセンサス配列は、DBとMBとを一緒に含む固有分子識別子(UMI)によって群分けされたリードから各mRNAにつき別々に生成されたものであり、このUMIは、同じ起源のmRNA分子から生じるPCR複製物である。UMIリード群は、MUSCLEによりアラインし、以下のパラメータ:maxdiv=0.1;bf PRIMER;prfreq=0.6;maxmiss=0.5;q=5;リード群について判定されたPCRプライマー配列の一致≧60%;最大のヌクレオチド多様性=0.1;インデル位置について多数決を使用すること;および事後(コンセンサス)クォリティーの低いアライメントカラムのマスキングにより、pRESTOを使用して、コンセンサス配列を構築した。次いで、ペアドエンドコンセンサス配列を、2ラウンドでスティッチングした。第1に、各リード対のコンセンサス配列末端の、ギャップを施さないアライメントを、Zスコア近似を使用して最適化し、以下のパラメータ:最小の長さ=8;アルファ1×10−5;および最大のエラー=0.3により、pRESTO AssemblePairs−alignにおいて実装される、二項検定のp値によりスコア付けした。この方式でスティッチングできないリード対については、pRESTOのAssemblePairs−referenceパラメータ:最小の同一性=0.5;e値1×10−5を使用する、スティッチングまたはギャップを施したリード結合の前に、各リードの足場を組むように、ヒトBCRおよびTCR生殖細胞系列のVエクソンを使用して、スティッチングを試みた。
V(D)Jセグメントの注釈付けおよびアイソタイプの確認
IgBLAST、Change−O、およびカスタムスクリプトを使用して、元の生殖細胞系列V(D)J遺伝子を同定し、mRNA配列を、V(D)J領域に照らしてトリミングし、CDR3領域を同定し、生殖細胞系列Vヌクレオチド配列からの変異を計算した。IgBLASTでは、Nをミスマッチとしてカウントするが、V領域におけるNが6つを超えるmRNA配列には、変異解析および交差画分対合についての精度解析のためにフィルターをかけた。Ig重鎖については、pRESTO MaskPrimers−scoreパラメータ:start=0;最大のエラー=0.2を使用して、非プライマーC領域(定常領域エクソン)を、期待される配列とマッチさせることにより、アイソタイプの同一性を確認した。プライマー/非プライマーC領域による判定が一致しないアンプリコンは、目視により、特異的なプライマークロストークイベントを解決した、2つのプライマー/非プライマーの組合せを除き、棄却した。
V(D)J配列の、クローン系統への群分け
重み付けされたクローン内距離による、単一連関クラスタリングを使用して、V(D)J配列を、クローンへと群分けした。クラスタリングは、Change−OパッケージのDefineClones−by−groupパラメータ:model=m1n;遺伝子=第1;dist=4.0;norm=なしにより実施した。第1に、同じ初期組換えイベントから生じた可能性がある配列が、併せてビニングされる(マッチが最良のIgVH遺伝子、マッチが最良のIgJH遺伝子、およびIMGT/HighV−QUESTにより同定される結合部の長さに基づき)ように、全ての機能的なIgVH鎖の液滴コンセンサス配列を、V−J結合部ビンへとビニングした。クローン内距離の閾値は、Change−OのshmパッケージのdistToNearest関数を使用して、各IgVHビン内の最近傍距離についてのヒストグラムを生成し、ヒストグラムを、自然距離カットオフ(二峰性のヒストグラムのトラフ内)について目視することにより選び出した。軽鎖のクローンクラスターは、同じ距離モデルおよび閾値を使用して規定した。
液滴のフィルタリング、対合忠実度の計算
重鎖−軽鎖対合の信頼度を2つの独立の方式で:液滴内のmRNA配列の一致と、複製物対間のmRNA配列一致とを使用して評価した。液滴内のmRNAの一致は、遺伝子座内のV(D)J配列についての、対応のあるヌクレオチド差異の平均値(Neiによるパイ<0.02)として規定した。mRNA配列は、IgBLASTによる注釈付けを使用して、V(D)Jヌクレオチドコード配列へとトリミングした。各液滴内で、全ての有効なmRNA配列を、V遺伝子座により群分けした。各群内では、デフォルトのパラメータを使用するpRESTO AlignSets内で実装されるMUSCLEを使用して、複数の配列をアラインした。液滴コンセンサス鎖は、pRESTOパラメータ:BuildConsensus.py;maximum div=0.2;maximum miss=0.5を使用して、遺伝子座1つ当たり複数のmRNAから構築した。ランダムにシャッフルされた液滴を使用して、多様性のカットオフであるパイ≦0.02を選択した。シャッフルされた液滴内で、重鎖遺伝子座の0.01%未満(軽鎖遺伝子座の<0.2%)がこの基準を満たした。複数の細胞または免疫受容体を含む液滴を、さらなる精度解析のために分離した。
HIV系統進化解析
HIVに対する新しい広域中和抗体(bNAb)は、本発明者らのハイスループットの抗体対の公知のbNAbとの類似性に関して加工された配列により、発見した。PGTドナーおよび他のドナーに由来する既知のbNAbを、文献から取り出した。エマルジョンから回収された、全てのHIV IgH mRNAを、公知のCDR3アミノ酸配列との類似性について、tblastx 10によりスコア付けした。健常ドナーに由来するIgH mRNA配列を使用して、配列類似性のバックグラウンドの分布を生成し、27のビットスコアカットオフを使用して、候補bNAb様CDR3を、さらなる解析のために区別した。デフォルトのパラメータによるMUSCLE 11を使用して、候補配列のV(D)J配列を、公知のbNAbに照らしてアラインしたが、特に、gapopen=−15を除き、デフォルトのパラメータを使用して、PGTドナー系統に照らしてアラインした。PhyMLのデフォルトのパラメータにより、系統樹を生成し、操作し、Newick UtilsおよびDendroscopeにより視覚化し、手作業で精査して、公知のbNAb配列と共に散在する免疫グロブリン重鎖配列を選択した。各液滴のコンセンサス配列は、任意の液滴内アミノ酸の不一致についてのアライメントに対する手作業による精査を、JALVIEWにおいて使用して、既に記載した通りに構築した。8つの重鎖配列およびこれらの天然で対合する軽鎖抗体配列を、合成、クローニング、発現、および中和アッセイのために選択した。
データ解析およびプロッティング
プロットは、dplyrおよびggplot2Rパッケージを使用して生成した。データは、散布図による視覚化だけを目的として、ランダムにダウンサンプリングし、かつ/またはRによるジッター付加を施した。ダウンサンプリングの最小は、アイソタイプ1つ当たり20,000の液滴であるか、または他の形で言及される通りであった。同じ一様な確率分布から取り出された、垂直方向および水平方向のノイズを添加することにより、mRNA単位については、最大≦0.2とし、変異については、最大≦0.6%として、データ点にジッター付加を施した。
Claims (525)
- (a)各々が、
(i)複数の細胞を含む試料に由来する単一細胞、
(ii)複数の分子バーコード化ポリヌクレオチド、および
(iii)容器バーコード化ポリヌクレオチド
を含む、複数の容器を形成するステップと;
(b)
(i)該単一細胞に由来する第1の細胞ポリヌクレオチドに相補的な第1の相補的ポリヌクレオチド、および
(ii)該単一細胞に由来する第2の細胞ポリヌクレオチドに相補的な第2の相補的ポリヌクレオチド
を作製するステップと;
(c)
(i)該複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドを、該第1の相補的ポリヌクレオチドに結合させ、
(ii)第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドを、該第2の相補的ポリヌクレオチドに結合させ、これにより、第1および第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと;
(d)該容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物を、
(i)該第1の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物、および
(ii)該第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物
に結合させ、これにより、第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列を形成するステップと
を含む、方法。 - (a)試料に由来する複数の免疫細胞から、重鎖免疫グロブリン(IgH)ポリヌクレオチドに由来する第1の相補的ポリヌクレオチドおよび軽鎖免疫グロブリン(IgL)ポリヌクレオチドに由来する第2の相補的ポリヌクレオチドを、
(i)該複数の免疫細胞に由来する該IgHポリヌクレオチドの同じ領域に相補的な領域を含む第1の標的プライマー;
(ii)該複数の免疫細胞に由来する該IgLポリヌクレオチドの同じ領域に相補的な領域を含む第2の標的プライマー;
(iii)非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素であって、3つまたはそれ超の同一な非鋳型ヌクレオチドが該第1および第2の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加される、逆転写酵素;
(iv)各々が、
(A)分子バーコード、
(B)容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的な5’末端領域、および
(C)該3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な3’末端領域
を含む、複数の分子バーコード化ポリヌクレオチド;ならびに
(v)容器バーコード化ポリヌクレオチド
により作製し、これにより、第1および第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと;
(b)該容器バーコード化ポリヌクレオチドを増幅し、これにより、第1および第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと;
(c)該第1および第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドを増幅し、これにより、該IgHもしくはIgLポリヌクレオチド、またはこれらの組合せの可変領域を含む配列のライブラリーを形成するステップと;
(d)該ライブラリーの該配列の1つまたは複数をシークエンシングするステップと
を含み、(a)は、複数の容器のうちの1つの容器内で実施され、該容器は、該複数の免疫細胞に由来する単一の免疫細胞を含む、方法。 - (a)試料に由来する複数の免疫細胞から、T細胞受容体アルファ(TCRα)ポリヌクレオチドに由来する第1の相補的ポリヌクレオチドおよびT細胞受容体ベータ(TCRβ)ポリヌクレオチドに由来する第2の相補的ポリヌクレオチドを、
(i)該複数の免疫細胞に由来する該TCRαポリヌクレオチドの同じ領域に相補的な領域を含む第1の標的プライマー;
(ii)該複数の免疫細胞に由来する該TCRβポリヌクレオチドの同じ領域に相補的な領域を含む第2の標的プライマー;
(iii)非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素であって、3つまたはそれ超の同一な非鋳型ヌクレオチドが該第1および第2の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加される、逆転写酵素;
(iv)各々が、
(A)分子バーコード、
(B)容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的な5’末端領域、および
(C)該3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な3’末端領域
を含む、複数の分子バーコード化ポリヌクレオチド;ならびに
(v)容器バーコード化ポリヌクレオチド
により作製し、これにより、第1および第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと;
(b)該容器バーコード化ポリヌクレオチドを増幅し、これにより、第1および第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと;
(c)該第1および第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドを増幅し、これにより、該TCRαもしくはTCRβポリヌクレオチド、またはこれらの組合せの可変領域を含む配列のライブラリーを形成するステップと;
(d)該ライブラリーの該配列の1つまたは複数をシークエンシングするステップと
を含み、(a)は、複数の容器のうちの1つの容器内で実施され、該容器は、該複数の免疫細胞に由来する単一の免疫細胞を含む、方法。 - (a)試料に由来する複数の免疫細胞から、T細胞受容体ガンマ(TCRγ)ポリヌクレオチドに由来する第1の相補的ポリヌクレオチドおよびT細胞受容体デルタ(TCRδ)ポリヌクレオチドに由来する第2の相補的ポリヌクレオチドを、
(i)該複数の免疫細胞に由来する該TCRγポリヌクレオチドの同じ領域に相補的な領域を含む第1の標的プライマー;
(ii)該複数の免疫細胞に由来する該TCRδポリヌクレオチドの同じ領域に相補的な領域を含む第2の標的プライマー;
(iii)非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素であって、3つまたはそれ超の同一な非鋳型ヌクレオチドが該第1および第2の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加される、逆転写酵素;
(iv)各々が、
(A)分子バーコード、
(B)容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的な5’末端領域、および
(C)該3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な3’末端領域
を含む、複数の分子バーコード化ポリヌクレオチド;ならびに
(v)容器バーコード化ポリヌクレオチド
により作製し、これにより、第1および第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと;
(b)該容器バーコード化ポリヌクレオチドを増幅し、これにより、第1および第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと;
(c)該第1および第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドを増幅し、これにより、該TCRγもしくはTCRδポリヌクレオチド、またはこれらの組合せの可変領域を含む配列のライブラリーを形成するステップと;
(d)該ライブラリーの該配列の1つまたは複数をシークエンシングするステップと
を含み、(a)は、複数の容器のうちの1つの容器内で実施され、該容器は、該複数の免疫細胞に由来する単一の免疫細胞を含む、方法。 - 前記ライブラリーが、前記試料の免疫状態を表す、請求項2から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列が、第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列のライブラリーである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、異なる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドが、異なる分子バーコードを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列が、異なる分子バーコードを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列が、同じ容器バーコードを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドが、増幅産物ではない、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、第2の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードと異なる、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの第2の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項13に記載の方法。
- 第1の容器および第2の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの第3の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項14または15に記載の方法。
- 前記第1の容器、前記第2の容器、および前記第3の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項16に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの任意の単一の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの任意の1つの容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、該複数の容器のうちの他の任意の1つの容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードと異なる、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、第2の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードと同じである、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、前記第1の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードと同じである、請求項1から5、8から12、14、16、19、または20のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、前記第2の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードと同じである、請求項21に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの容器バーコードが、該複数の容器のうちの第2の容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの容器バーコードと異なる、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの容器バーコードが、第1の同じ容器バーコードである、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの第2の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの容器バーコードが、第2の同じ容器バーコードである、請求項24に記載の方法。
- 前記第1の同じ容器バーコードが、前記第2の同じ容器バーコードと異なる、請求項24または25に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの単一の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの容器バーコードが、同じ容器バーコードを含む、請求項24から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの任意の単一の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドおよびそのアンプリコンの容器バーコードが、該複数の容器のうちの他の任意の単一の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドおよびそのアンプリコンの容器バーコードに固有である、請求項24から27のいずれか一項に記載の方法。
- (a)における前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、1つの容器内に、単一の分子として存在する、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- (a)における前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、前記複数の容器の各容器内に、単一の分子として存在する、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
- (a)における前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、前記複数の容器のうちの1つの容器内に、少なくとも単一の分子として存在する、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- (a)における前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、前記複数の容器の各容器内に、少なくとも単一の分子として存在する、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の第1の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列が、該第1の容器内の第2の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列と同じである、請求項1から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの前記第1の容器内の前記第1の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第2の共通容器配列が、該第1の容器内の第2の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第2の共通容器配列と同じである、請求項33に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの任意の単一の容器内の第1の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列が、該単一の容器内の第2の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列と同じである、請求項33または34に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの単一の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドが、同じ第1の共通容器配列を含む、請求項33から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの単一の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドが、同じ第2の共通容器配列を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の第1の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列が、該複数の容器のうちの第2の容器内の第2の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列と同じである、請求項1から37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第2の共通容器配列が、前記第2の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第2の共通容器配列と同じである、請求項38に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの任意の1つの容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンが、該複数の容器のうちの他の任意の1つの容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列と同じ配列を含む、第1の共通容器配列を含む、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの任意の1つの容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンが、該複数の容器のうちの他の任意の1つの容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第2の共通容器配列と同じ配列を含む、第2の共通容器配列を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列が、該第1の容器内の第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列と同じである、請求項1から41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの前記第1の容器内の前記第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第2の共通分子配列が、該第1の容器内の第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第2の共通分子配列と同じである、請求項42に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの任意の単一の容器内の第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列が、該単一の容器内の第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列と同じである、請求項42または43に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの単一の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドが、同じ第1の共通分子配列を含む、請求項42から44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの単一の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドが、同じ第2の共通分子配列を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列が、該複数の容器のうちの第2の容器内の第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列と同じである、請求項42から46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第2の共通分子配列が、前記第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第2の共通分子配列と同じである、請求項47に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの任意の1つの容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドが、該複数の容器のうちの他の任意の1つの容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列と同じ配列を含む、第1の共通分子配列を含む、請求項42から48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの任意の1つの容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドが、該複数の容器のうちの他の任意の1つの容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第2の共通分子配列と同じ配列を含む、第2の共通分子配列を含む、請求項49に記載の方法。
- 前記第1の共通容器配列が、前記第1の共通分子配列と同じ配列を含む配列を含む、請求項33から50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の共通容器配列が、前記第1の共通分子配列またはその相補体に相補的な配列を含む、請求項33から51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の共通分子配列が、前記第1の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加された、3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項51または52に記載の方法。
- 前記第1の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加された、3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な前記領域が、末端領域である、請求項53に記載の方法。
第1および第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドが、一緒に融合されない、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1および第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドが、一緒に融合されない、請求項1から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列が、一緒に融合されない、請求項1から55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の細胞ポリヌクレオチドが、DNAである、請求項1から56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の細胞ポリヌクレオチドが、DNAである、請求項57に記載の方法。
- 前記第1の細胞ポリヌクレオチドが、RNAである、請求項1から56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の細胞ポリヌクレオチドが、RNAである、請求項59に記載の方法。
- 前記RNAが、mRNAである、請求項59または60に記載の方法。
- (b)の前記第1の相補的ポリヌクレオチドが、cDNAである、請求項59から61のいずれか一項に記載の方法。
- (b)の前記第2の相補的ポリヌクレオチドが、cDNAである、請求項62に記載の方法。
- (b)が、前記第1の細胞ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせた第1の標的プライマーを伸長させることと、前記第2の細胞ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせた第2の標的プライマーを伸長させることとを含む、請求項1から63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記伸長させることが、前記第1の細胞ポリヌクレオチドを、第1の標的プライマーで逆転写することと、前記第2の細胞ポリヌクレオチドを、第2の標的プライマーで逆転写することとを含む、請求項64に記載の方法。
- 前記第1の標的プライマーが、前記第1の細胞ポリヌクレオチドの標的配列に相補的な配列を含む、請求項64または65に記載の方法。
- 前記第2の標的プライマーが、前記第2の細胞ポリヌクレオチドの標的配列に相補的な配列を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記第1の標的プライマーが、ポリ(T)配列を含む、請求項64から67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の標的プライマーが、ポリ(T)配列を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記第1の細胞ポリヌクレオチドの前記標的配列が、重鎖免疫グロブリン(IgH)配列、TCRα配列、TCRγ配列、またはこれらの組合せである、請求項66から69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の細胞ポリヌクレオチドの前記標的配列が、重鎖定常領域(CH)配列、TCRα定常領域(Cα)配列、TCRγ定常領域(Cγ)配列、またはこれらの組合せである、請求項66から70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の細胞ポリヌクレオチドの前記標的配列が、軽鎖免疫グロブリン(IgL)配列、TCRβ配列、TCRδ配列、またはこれらの組合せである、請求項70または71に記載の方法。
- 前記第2の細胞ポリヌクレオチドの前記標的配列が、軽鎖定常領域(CL)配列、TCRβ定常領域(Cβ)配列、TCRδ定常領域(Cδ)配列、またはこれらの組合せである、請求項70から72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の標的プライマーが、複数の第1の標的プライマーを含む、請求項64から73のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の標的プライマーが、複数の第2の標的プライマーを含む、請求項64から74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の第1の標的プライマーが、複数の重鎖免疫グロブリン(IgH)配列、TCRα配列、TCRγ配列、またはこれらの組合せに相補的な複数の配列を含む、請求項74または75に記載の方法。
- 前記複数の重鎖免疫グロブリン(IgH)配列、TCRα配列またはTCRγ配列が、複数の重鎖定常領域(CH)配列、TCRα定常領域(Cα)配列、TCRγ定常領域(Cγ)配列、またはこれらの組合せを含む、請求項76に記載の方法。
- 前記複数の重鎖定常領域(CH)配列が、IgM、IgD、IgA、IgE、IgG、およびこれらの組合せに由来する重鎖定常領域(CH)配列からなる群から選択される、2つまたはそれ超の配列を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記複数の第2の標的プライマーが、複数の軽鎖免疫グロブリン(IgL)配列、TCRβ配列、TCRδ配列、またはこれらの組合せに相補的な複数の配列を含む、請求項74から78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の軽鎖免疫グロブリン(IgL)配列、TCRβ配列、またはTCRδ配列が、複数の軽鎖定常領域(CL)配列、TCRβ定常領域(Cβ)配列、TCRδ定常領域(Cδ)配列、またはこれらの組合せを含む、請求項79に記載の方法。
- 前記複数の軽鎖定常領域(CL)配列が、Igκ、Igλ、およびこれらの組合せに由来する軽鎖定常領域(CL)配列からなる群から選択される、2つまたはそれ超の配列を含む、請求項80に記載の方法。
- (b)において、前記伸長させることが、非鋳型ターミナルトランスフェラーゼの使用を含み、ここで3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドが前記第1の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加される、請求項1から81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非鋳型ターミナルトランスフェラーゼが、逆転写酵素またはポリメラーゼである、請求項82に記載の方法。
- 前記非鋳型ターミナルトランスフェラーゼが、逆転写酵素であり、該逆転写酵素が、Superscipt II逆転写酵素、Maxima逆転写酵素、Protoscript II逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV−RT)、HighScriber逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を含む任意の逆転写酵素、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項82または83に記載の方法。
- 3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドが、前記第2の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加される、請求項82から84のいずれか一項に記載の方法。
- (c)において、前記結合させるステップが、第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの領域を、前記第1の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加された、前記3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、請求項82から85のいずれか一項に記載の方法。
- (c)において、前記結合させるステップが、第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの領域を、前記第2の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加された、前記3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、請求項86に記載の方法。
- (c)において、前記第1の相補的ポリヌクレオチドに結合させた第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドが、該第1の相補的ポリヌクレオチドの3’末端における、前記3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項82から87のいずれか一項に記載の方法。
- (c)において、前記第2の相補的ポリヌクレオチドに結合させた第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドが、前記第2の相補的ポリヌクレオチドの3’末端における、3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドが、同一である、請求項82から89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドの少なくとも1つが、該3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドの別のヌクレオチドと同一ではない、請求項82から89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の少なくとも1つのヌクレオチドが、該第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の別の核酸と同一ではない、請求項86から91のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の少なくとも1つのヌクレオチドが、該第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の別の核酸と同一ではない、請求項87から92のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項92または93に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、リボヌクレオチドまたはその類似体ではない、請求項92から94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、デオキシリボグアノシンである、請求項92から95のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、デオキシリボグアノシン類似体である、請求項92から95のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドである、請求項92から97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、リボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項92または93に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の末端ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項86から99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の末端ヌクレオチドが、リボヌクレオチドまたはその類似体ではない、請求項86から100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の末端ヌクレオチドが、デオキシリボグアノシンである、請求項86から101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の末端ヌクレオチドが、デオキシリボグアノシン類似体である、請求項86から101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の末端ヌクレオチドが、リボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項86から99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の少なくとも2つの非末端ヌクレオチドが、リボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項86から104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の少なくとも2つの非末端ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドまたはその類似体ではない、請求項86から105のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の少なくとも2つの非末端ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項86から104のいずれか一項に記載の方法。
- (c)が、前記結合させるステップの後で、前記第1の相補的ポリヌクレオチドおよび前記第2の相補的ポリヌクレオチドを伸長させることをさらに含む、請求項1から107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の相補的ポリヌクレオチドが、第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項1から108のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の相補的ポリヌクレオチドが、第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項109のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の相補的ポリヌクレオチドが、第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項109または110に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な前記第1の相補的ポリヌクレオチドの前記領域が、分子バーコード配列に相補的ではない、請求項111に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な前記第1の相補的ポリヌクレオチドの前記領域が、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の領域に相補的ではない、請求項111または112に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な、前記第1の相補的ポリヌクレオチドの前記領域が、該第1の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加された、3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドを含む、請求項109から113のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な前記第2の相補的ポリヌクレオチドの前記領域が、前記第2の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加された、3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドを含む、請求項114に記載の方法。
- 前記第1の相補的ポリヌクレオチドが、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドに相補的ではない、請求項1から115のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の相補的ポリヌクレオチドが、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドに相補的ではない、請求項116に記載の方法。
- 第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの相補体の領域が、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的である、請求項1から117のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの相補体の領域が、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的である、請求項118に記載の方法。
- 前記第1の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの領域が、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的である、請求項1から119のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの領域が、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的である、請求項120に記載の方法。
- 前記第1の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの領域が、前記第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドが相補的である、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドの前記領域に相補的である、請求項120または121に記載の方法。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドを、第1のプライマーセットにより増幅するステップをさらに含み、該増幅するステップは、該容器バーコード化ポリヌクレオチドを結合させるステップの前に、または該容器バーコード化ポリヌクレオチドを結合させるステップと同時に実施される、請求項1から122のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、前記容器バーコード化ポリヌクレオチド、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドの相補体、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドからの増幅産物、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、第1および第2の容器バーコード化ポリヌクレオチドを含む、請求項1から123のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドを結合させるステップが、
(i)該容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の領域を、前記第1の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの領域とハイブリダイズさせることと、
(ii)該容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の領域を、前記第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの領域とハイブリダイズさせることと
を含む、請求項1から124のいずれか一項に記載の方法。 - 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドを結合させるステップの後で、第1の単一細胞の単一バーコード化配列および第2の単一細胞の単一バーコード化配列のポリヌクレオチドを伸長させ、これにより、前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列を形成するステップをさらに含む、請求項1から125のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の単一細胞の二重バーコード化配列が、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項126に記載の方法。
- 前記第2の単一細胞の二重バーコード化配列が、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項127に記載の方法。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列の前記領域が、同じ配列である、請求項128に記載の方法。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な前記第1の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの前記領域が、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の領域に相補的ではない、請求項129に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの第1のプライマーが、第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの領域、前記第1の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの相補体、前記第1の単一細胞の二重バーコード化配列の相補体、またはこれらの任意の組合せに相補的である、請求項123から130のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの前記第1のプライマーが、第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの領域、前記第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの相補体、前記第2の単一細胞の二重バーコード化配列の相補体、またはこれらの任意の組合せに相補的である、請求項131に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの第1のプライマーが、前記第1の細胞ポリヌクレオチドまたはその相補体に相補的ではない、請求項123から132のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの前記第1のプライマーが、前記第2の細胞ポリヌクレオチドまたはその相補体に相補的ではない、請求項133に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの第1のプライマーが、前記分子バーコードの下流である、前記第1の単一細胞の単一バーコード化配列の相補体の領域に相補的である、請求項123から134のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの前記第1のプライマーが、前記分子バーコードの下流である、前記第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの相補体の領域に相補的である、請求項135に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの第1のプライマーが、前記容器バーコードの上流である、前記第1の単一細胞の二重バーコード化配列の相補体の領域に相補的である、請求項123から136のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの前記第1のプライマーが、前記容器バーコードの上流である、前記第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドの相補体の領域に相補的である、請求項137に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの第2のプライマーが、前記第1の細胞ポリヌクレオチドもしくはその相補体、前記第1の相補的ポリヌクレオチドもしくはその相補体、第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドもしくはその相補体、前記第1の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドもしくはその相補体、またはこれらの任意の組合せの領域に相補的ではない、請求項123から138のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの前記第2のプライマーが、前記第2の細胞ポリヌクレオチドもしくはその相補体、前記第2の相補的ポリヌクレオチドもしくはその相補体、第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドもしくはその相補体、前記第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドもしくはその相補体、またはこれらの任意の組合せの領域に相補的ではない、請求項139に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの第2のプライマーが、前記第1の単一細胞の二重バーコード化配列の領域に相補的である、請求項123から140のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの第2のプライマーが、前記第2の単一細胞の二重バーコード化配列の領域に相補的である、請求項141に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの第2のプライマーが、前記分子バーコードの上流である、前記第1の単一細胞の二重バーコード化配列の領域に相補的である、請求項123から142のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの前記第2のプライマーが、前記分子バーコードの上流である、前記第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的である、請求項143に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの第2のプライマーが、前記容器バーコードの上流である、前記第1の単一細胞の二重バーコード化配列の領域に相補的である、請求項123から144のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの前記第2のプライマーが、前記容器バーコードの上流である、前記第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的である、請求項145に記載の方法。
- 前記複数の容器のうちの2つまたはそれ超の容器を壊すステップをさらに含む、請求項1から146のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列を、前記2つまたはそれ超の壊された容器からプールするステップをさらに含む、請求項147に記載の方法。
- (e)前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列を増幅するステップをさらに含む、請求項1から148のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列を増幅するステップが、前記複数の容器のうちの1つの容器の外側で実施される、請求項149に記載の方法。
- (e)前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列を、第2のプライマーセットにより増幅するステップをさらに含む、請求項123から150のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの第1のプライマーが、前記第1の細胞ポリヌクレオチドもしくはその相補体、前記第1の相補的ポリヌクレオチドもしくはその相補体、第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドもしくはその相補体、前記第1の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドもしくはその相補体、またはこれらの任意の組合せの領域に相補的ではない、請求項150に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第1のプライマーが、前記第2の細胞ポリヌクレオチドもしくはその相補体、前記第2の相補的ポリヌクレオチドもしくはその相補体、第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドもしくはその相補体、前記第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドもしくはその相補体、またはこれらの任意の組合せの領域に相補的ではない、請求項152に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの第1のプライマーが、前記第1の単一細胞の二重バーコード化配列の領域に相補的である、請求項150から153のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第1のプライマーが、前記第2の単一細胞の二重バーコード化配列の領域に相補的である、請求項154に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの第1のプライマーが、前記分子バーコードの上流である、前記第1の単一細胞の二重バーコード化配列の領域に相補的である、請求項150から156のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第1のプライマーが、前記分子バーコードの上流である、前記第2の単一細胞の二重バーコード化配列の領域に相補的である、請求項156に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの第1のプライマーが、前記容器バーコードの上流である、前記第1の単一細胞の二重バーコード化配列の領域に相補的である、請求項150から157のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第1のプライマーが、前記容器バーコードの上流である、前記第2の単一細胞の二重バーコード化配列の領域に相補的である、請求項158に記載の方法。
- 前記第1のプライマーセットの前記第2のプライマーが、前記第2のプライマーセットの前記第1のプライマーである、請求項139から159のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの第2のプライマーが、前記第1および第2の細胞ポリヌクレオチド、前記第1および第2の相補的ポリヌクレオチドの相補体、前記第1および第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの相補体、前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化配列の相補体、またはこれらの任意の組合せの領域に相補的である、請求項150から160のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第2のプライマーが、ポリ(T)配列を含む、請求項161に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの第2のプライマーが、前記第1もしくは第2の細胞ポリヌクレオチド、前記第1もしくは第2の相補的ポリヌクレオチドの相補体、前記第1もしくは第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの相補体、前記第1もしくは第2の単一細胞の二重バーコード化配列の相補体、またはこれらの任意の組合せの領域に相補的である、請求項150から160のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第2のプライマーが、第1もしくは第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドもしくはそれらの相補体、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドもしくはその相補体、またはこれらの任意の組合せに相補的ではない、請求項163に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの第3のプライマーが、前記第2の細胞ポリヌクレオチド、前記第2の相補的ポリヌクレオチドの相補体、前記第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの相補体、前記第2の単一細胞の二重バーコード化配列の相補体、またはこれらの任意の組合せの領域に相補的である、請求項163または164に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第2のプライマーが、前記第1の細胞ポリヌクレオチド、前記第1の相補的ポリヌクレオチドの相補体、前記第1の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの相補体、前記第1の単一細胞の二重バーコード化配列の相補体、またはこれらの任意の組合せの領域に相補的である、請求項165に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第3のプライマーが、前記第1の細胞ポリヌクレオチド、前記第1の相補的ポリヌクレオチドの相補体、前記第1の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドの相補体、前記第1の単一細胞の二重バーコード化配列の相補体、またはこれらの任意の組合せの領域に相補的ではない、請求項165または166に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第3のプライマーが、第1もしくは第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドもしくはそれらの相補体、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドもしくはその相補体、またはこれらの任意の組合せに相補的ではない、請求項165から167のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第2のプライマーが、標的特異的配列を含む、請求項163から168のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第3のプライマーが、標的特異的配列を含む、請求項169に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第2のプライマーの前記標的特異的配列が、重鎖免疫グロブリン(IgH)配列、TCRα配列、TCRγ配列、またはこれらの組合せを標的化する、請求項169または170に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第2のプライマーの前記標的特異的配列が、重鎖定常領域配列(CH)、TCRα定常領域(Cα)配列、TCRγ定常領域(Cγ)配列、またはこれらの組合せを標的化する、請求項169から171のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーの前記標的特異的配列が、GGGTTGGGGCGGATGCAC、CATCCGGAGCCTTGGTGG、CCTTGGGGCTGGTCGGGG、CGGATGGGCTCTGTGTGG、CCGATGGGCCCTTGGTGG、GGATTTAGAGTCTCTCAGCTG、CACGGCAGGGTCAGGGTTCおよびGGGGAAACATCTGCATCAAGTからなる群から選択される、請求項169から172のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第3のプライマーの前記標的特異的配列が、軽鎖免疫グロブリン(IgL)配列、TCRβ配列、TCRδ配列、またはこれらの組合せを標的化する、請求項171から173のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第3のプライマーの前記標的特異的配列が、軽鎖定常領域配列(CL)、TCRβ定常領域(Cβ)配列、TCRδ定常領域(Cδ)配列、またはこれらの組合せを標的化する、請求項171から174のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第3のプライマーの前記標的特異的配列が、TTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGC、TTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTGG、TTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC、TTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGC、TTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGC、GAGGACGGTCACCTTGGTGCCA、TAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCC、GAGGACGGTCAGCTGGGTGCC、TAAAATGATCAGCTGGGTTCCTCCAC、TAGGACGGTGACCTTGGTCCCAG、GGGAGATCTCTGCTTCTGATG、CGACCTCGGGTGGGAACACおよびCGGATGGTTTGGTATGAGGCからなる群から選択される、請求項174または175に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第2のプライマーが、複数の第2のプライマーを含む、請求項163から175のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットの前記第3のプライマーが、複数の第3のプライマーを含む、請求項165から177のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の第2のプライマーの前記標的特異的配列が、複数の重鎖免疫グロブリン(IgH)配列、TCRα配列、TCRγ配列、またはこれらの組合せを標的化する、請求項177または178に記載の方法。
- 前記複数の重鎖免疫グロブリン(IgH)配列、TCRα配列、またはTCRγ配列が、複数の重鎖定常領域(CH)、TCRα定常領域(Cα)配列、TCRγ定常領域(Cγ)配列、またはこれらの組合せを含む、請求項179に記載の方法。
- 前記複数の重鎖定常領域(CH)配列が、IgM、IgD、IgA、IgE、IgG、およびこれらの組合せに由来する重鎖定常領域(CH)配列からなる群から選択される、2つまたはそれ超の配列を含む、請求項180に記載の方法。
- 前記複数の第3のプライマーの前記標的特異的配列が、複数の軽鎖免疫グロブリン(IgL)配列、TCRβ配列、TCRδ配列、またはこれらの組合せを標的化する、請求項178から181のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の軽鎖免疫グロブリン(IgL)配列、TCRβ配列、またはTCRδ配列が、複数の軽鎖定常領域(CL)配列、TCRβ定常領域(Cβ)配列、TCRδ定常領域(Cδ)配列、またはこれらの組合せを含む、請求項182に記載の方法。
- 前記複数の軽鎖定常領域(CL)配列が、Igκ、Igλ、およびこれらの組合せに由来する軽鎖定常領域(CL)配列からなる群から選択される、2つまたはそれ超の配列を含む、請求項183に記載の方法。
- 第1の標的プライマー、第2の標的プライマー、前記容器バーコード化ポリヌクレオチド、分子バーコード化ポリヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せが、固体支持体に結合されていない、請求項1から184のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の標的プライマー、第2の標的プライマー、前記第1のプライマーセットのプライマー、前記第2のプライマーセットのプライマー、またはこれらの任意の組合せが、分子バーコード、容器バーコード、バーコード、またはこれらの任意の組合せを含まない、請求項1から185のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の標的プライマー、第2の標的プライマー、前記第1のプライマーセットのプライマー、前記第2のプライマーセットのプライマー、またはこれらの任意の組合せが、突出領域を含まない、請求項1から186のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器の各容器が、固体支持体を含まない、請求項1から187のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合されている、請求項1から188のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、ビーズに結合されている、請求項1から189のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチド、分子バーコード化ポリヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せが、プライマーではない、請求項1から190のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチド、分子バーコード化ポリヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せを伸長させない、請求項1から191のいずれか一項に記載の方法。
- (a)〜(d)が、前記単一の容器内で実施される、請求項1から192のいずれか一項に記載の方法。
- (a)〜(d)が、単一の反応で実施される、請求項1から193のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単一細胞を溶解させるステップをさらに含む、請求項1から194のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶解させるステップが、前記単一細胞に由来する前記第1および第2の細胞ポリヌクレオチドを放出させる、請求項195に記載の方法。
- 前記単一細胞を、(a)の後で溶解させる、請求項195または196に記載の方法。
- 前記単一細胞を、(b)の前に溶解させる、請求項195から197のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単一細胞を、前記容器内で溶解させる、請求項195から198のいずれか一項に記載の方法。
前記溶解させるステップが、化学的溶解を含む、請求項195から199のいずれか一項に記載の方法。 - 前記溶解させるステップが、凍結融解を含む、請求項195から199のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコードを、(d)の前に増幅する、請求項1から200のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコードを、(d)と同時に増幅する、請求項1から201のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコードおよび前記第1の単一細胞バーコード化ポリヌクレオチドを、同時に増幅するかまたは伸長させる、請求項1から202のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコード、前記第1の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチド、および前記第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドを、同時に増幅するかまたは伸長させる、請求項1から203のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の単一細胞バーコード化ポリヌクレオチドおよび前記第2の単一細胞の単一バーコード化ポリヌクレオチドを、同時に増幅するかまたは伸長させる、請求項1から204のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドおよび前記第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドを、同時に増幅するかまたは伸長させる、請求項1から205のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器が、複数のウェルを含む、請求項1から206のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器が、複数のエマルジョンを含む、請求項1から206のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のエマルジョンの各エマルジョンが、約0.01ピコリットル〜10マイクロリットルの容量である、請求項208に記載の方法。
- 前記複数の容器が、複数のコンテナーを含む、請求項1から209のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の標的プライマー、第2の標的プライマー、前記第1のプライマーセットのプライマー、または前記第2のプライマーセットのプライマーが、試料バーコードを含む、請求項1から210のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチド、前記第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチド、およびこれらの増幅産物を、前記容器から回収するステップをさらに含む、請求項1から211のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチド、前記第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチド、これらの増幅産物、またはこれらの任意の組合せをシークエンシングするステップをさらに含む、請求項1から212のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチド、前記第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチド、これらの増幅産物、またはこれらの任意の組合せを、同時にシークエンシングする、請求項213に記載の方法。
- 前記第1の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチド、前記第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチド、これらの増幅産物、またはこれらの任意の組合せを、同じ反応においてシークエンシングする、請求項213に記載の方法。
- 前記第1の細胞ポリヌクレオチドおよび前記第2の細胞ポリヌクレオチドの細胞由来を、前記容器バーコードに基づき、同じであると決定するステップをさらに含む、請求項1から215のいずれか一項に記載の方法。
- 前記決定するステップが、前記第1の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の前記容器バーコードの配列を、前記第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の前記容器バーコードの配列とマッチさせることを含む、請求項216に記載の方法。
- 前記第1の細胞ポリヌクレオチド、前記第2の細胞ポリヌクレオチド、またはこれらの両方の配列を有するいくつかの出発分子を、前記分子バーコードに基づき決定するステップをさらに含む、請求項1から217のいずれか一項に記載の方法。
- 前記決定するステップが、同じ第1の分子バーコード、同じ第2の分子バーコード、またはこれらの両方を有する配列の数を決定することを含む、請求項216に記載の方法。
- 単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の第1の配列および単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の第2の配列が、同じ容器バーコードまたはその相補体を含有する場合、これらは同じ単一の容器または単一細胞に由来する、請求項1から219のいずれか一項に記載の方法。
- 単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の前記第1の配列および単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の前記第2の配列が、異なる分子バーコードまたはその相補体を含有する場合、これらは異なる細胞ポリヌクレオチド分子に由来する、請求項220に記載の方法。
- 単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の前記第1の配列および単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の前記第2の配列が、同じ分子バーコードまたはその相補体を含有する場合、これらは同じ細胞ポリヌクレオチド分子に由来する、請求項220または221に記載の方法。
- 単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の前記第1の配列および単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の前記第2の配列が、異なる容器バーコードまたはその相補体を含有する場合、これらは異なる単一の容器または単一細胞に由来する、請求項220から222のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単一細胞が、免疫細胞を含む、請求項1から223のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、複数の免疫細胞を含む、請求項1から224のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、リンパ球もしくはその亜型、B細胞もしくはその亜型、T細胞もしくはその亜型、またはこれらの組合せである、請求項224または225に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、メモリーB細胞、ナイーブB細胞、形質芽球性B細胞、ナイーブT細胞、形質芽球性T細胞、B細胞の任意の亜型、T細胞の任意の亜型、またはこれらの任意の組合せについて富化される、請求項225または226に記載の方法。
- 前記単一細胞が、がん細胞を含む、請求項1から223のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、複数のがん細胞を含む、請求項228に記載の方法。
- 前記がん細胞が、扁平細胞癌細胞、腺癌細胞、移行上皮癌細胞、骨肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、筋肉肉腫細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、神経膠腫細胞、またはこれらの任意の組合せである、請求項228または229に記載の方法。
- 前記複数のがん細胞が、循環がん細胞、内皮がん細胞、上皮がん細胞、希少がん細胞、またはがん細胞の任意の型もしくは亜型について富化される、請求項229または230に記載の方法。
- 前記試料が、生物学的試料である、請求項1から231のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、被験体に由来する、請求項232に記載の方法。
- 前記被験体を、疾患または状態を有すると診断するステップをさらに含む、請求項233に記載の方法。
- 前記被験体が、動物である、請求項233または234に記載の方法。
- 前記動物が、ヒトである、請求項235に記載の方法。
- 被験体が、対立遺伝子についてホモ接合性であるか、ヘテロ接合性であるかを決定するステップをさらに含む、請求項233から236のいずれか一項に記載の方法。
- 疾患または状態を有する被験体を診断、予後予測、または処置するステップをさらに含む、請求項233から237のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、血液試料である、請求項232から238のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2の細胞ポリヌクレオチドが、前記試料から単離される、請求項1から239のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2の細胞ポリヌクレオチドが、前記試料から単離されない、請求項1から239のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、第1の試料および第2の試料を含む複数の試料を含む、請求項1から241のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の試料が、少なくとも3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、もしくは100、またはそれ超の試料を含む、請求項242に記載の方法。
- 前記複数の試料が、少なくとも約100、200、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000またはそれ超の試料を含む、請求項242に記載の方法。
- 前記複数の試料が、少なくとも約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000の試料、9000もしくは10,000の試料、もしくは100,000の試料、もしくは1,000,000、またはそれ超の試料を含む、請求項242に記載の方法。
- 前記複数の試料が、少なくとも約10,000の試料を含む、請求項242に記載の方法。
- 前記第1の試料が、第1の被験体に由来し、前記第2の試料が、第2の被験体に由来する、請求項242から246のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の被験体が、疾患または状態を有する被験体である、請求項247に記載の方法。
- 前記第2の被験体が、疾患または状態を伴わない被験体である、請求項247または248に記載の方法。
- 前記第1または第2の細胞ポリヌクレオチドが、変異体配列を含む、請求項1から249のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異体配列が、変異、多型、欠失、または挿入を含む、請求項250に記載の方法。
- 前記多型が、一塩基多型である、請求項251に記載の方法。
- 前記第1または第2の細胞ポリヌクレオチドが、疾患または状態についてのバイオマーカーである、請求項1から252のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2の細胞ポリヌクレオチドが、病原体に由来する、請求項1から253のいずれか一項に記載の方法。
- 前記病原体が、ウイルス、細菌、または真菌である、請求項254に記載の方法。
- 被験体に由来する前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドのライブラリーの配列を、異なる時点における同じ被験体に由来する前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドのライブラリーと比較するステップをさらに含む、請求項1から255のいずれか一項に記載の方法。
- 疾患または状態を有する被験体に由来する前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドのライブラリーの配列を、疾患または状態を伴わない被験体に由来する前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドのライブラリーと比較するステップをさらに含む、請求項1から255のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の細胞ポリヌクレオチド、前記第2の細胞ポリヌクレオチド、またはこれらの両方の生殖細胞系列の配列を決定するステップであって、該第1の細胞ポリヌクレオチドが、IgHまたはVH配列を含み、該第2の細胞ポリヌクレオチドが、IgLもしくはVL配列、またはこれらの任意の組合せを含むステップをさらに含む、請求項1から257のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IgL、IgH、VH、VL、またはこれらの任意の組合せの配列の、前記生殖細胞系列の前記IgL、IgH、VH、VL、またはこれらの任意の組合せの配列からの変化を決定するステップをさらに含む、請求項258に記載の方法。
- (a)固有のIgH配列の総数;
(b)固有のIgL配列の総数;
(c)固有のIgHおよびIgL配列の総数;
(d)固有のIgL配列とIgH配列との対の総数;
(e)IgH配列もしくはIgL配列の頻度;または
(f)1つもしくは複数の他の配列に対する、IgH配列とIgL配列との組合せの頻度
の少なくとも1つを決定するステップをさらに含む、請求項258または259に記載の方法。 - 前記第1の細胞ポリヌクレオチド、前記第2の細胞ポリヌクレオチド、またはこれらの両方の生殖細胞系列の配列を決定するステップであって、該第1の細胞ポリヌクレオチドが、TCRαまたはVα配列を含み、該第2の細胞ポリヌクレオチドが、TCRβもしくはVβ配列、またはこれらの任意の組合せを含むステップをさらに含む、請求項1から257のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TCRα、TCRβ、Vα、Vβ、またはこれらの任意の組合せの配列の、前記生殖細胞系列のTCRα、TCRβ、Vα、Vβ、またはこれらの任意の組合せの配列からの変化を決定するステップをさらに含む、請求項261に記載の方法。
- (a)固有のTCRα配列の総数;
(b)固有のTCRβ配列の総数;
(c)固有のTCRαおよびTCRβ配列の総数;
(d)固有のTCRβ配列とTCRα配列との対の総数;
(e)TCRα配列もしくはTCRβ配列の頻度;または
(f)1つもしくは複数の他の配列に対する、TCRα配列とTCRβ配列との組合せの頻度
の少なくとも1つを決定するステップをさらに含む、請求項261または262に記載の方法。 - 前記第1の細胞ポリヌクレオチド、前記第2の細胞ポリヌクレオチド、またはこれらの両方の生殖細胞系列の配列を決定するステップであって、前記第1の細胞ポリヌクレオチドが、TCRγまたはVγ配列を含み、前記第2の細胞ポリヌクレオチドが、TCRδもしくはVδ配列、またはこれらの任意の組合せを含むステップをさらに含む、請求項1から257のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TCRγ、TCRδ、Vγ、Vδ、またはこれらの任意の組合せの配列の、前記生殖細胞系列のTCRγ、TCRδ、Vγ、Vδ、またはこれらの任意の組合せの配列からの変化を決定するステップをさらに含む、請求項264に記載の方法。
- (a)固有のTCRγ配列の総数;
(b)固有のTCRδ配列の総数;
(c)固有のTCRγおよびTCRδ配列の総数;
(d)固有のTCRδ配列とTCRγ配列との対の総数;
(e)TCRγ配列もしくはTCRδ配列の頻度;または
(f)1つもしくは複数の他の配列に対する、TCRγ配列とTCRδ配列との組合せの頻度
の少なくとも1つを決定するステップをさらに含む、請求項264または265に記載の方法。 - (a)第1の遺伝子に由来する配列の総数;
(b)第2の遺伝子に由来する配列の総数;
(c)第1の遺伝子に由来する固有の配列の総数;
(d)第2の遺伝子に由来する固有の配列の総数;または
(e)第1の遺伝子に由来する配列もしくは第2の遺伝子に由来する配列の頻度
の少なくとも1つを決定するステップをさらに含む、請求項1から266のいずれか一項に記載の方法。 - 抗体またはTCRを、個別に対合したIgLおよびIgH配列、またはTCRαおよびTCRβ配列、またはTCRγおよびTCRδ配列の1つまたは複数の対の総量、ならびに生殖細胞系列からの変化に基づき選択するステップをさらに含む、請求項258から267のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体またはTCRを、1つまたは複数のIgLもしくはIgH配列、TCRαおよびTCRβ配列、またはTCRγおよびTCRδ配列、および生殖細胞系列からの変化に基づき選択するステップをさらに含む、請求項258から268のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体またはTCRを、配列パターン、変化解析、動力学、または頻度の1つまたは複数に基づき選択するステップをさらに含む、請求項258から269のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体またはTCRを、頻度に基づき選択するステップをさらに含む、請求項270に記載の方法。
- 前記選択された抗体またはTCRが、約1×10−7、1×10−8、1×10−9、1×10−10、1×10−11、もしくは1×10−12M未満であるかまたはそれらと等しいKDで、エピトープに結合する、請求項268から271のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された抗体またはTCRが、ヒト治療用抗体またはTCRである、請求項268から272のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された抗体またはTCRが、中和抗体またはTCRである、請求項268から273のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された抗体またはTCRが結合する標的が、未知である、請求項268から274のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された抗体またはTCRが結合する標的が、前記選択された抗体またはTCRを選択する時点では未知である、請求項268から275のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された抗体またはTCRを、少なくとも1つのバイオマーカー候補と接触させて、バイオマーカーを発見するステップをさらに含む、請求項268から276のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオマーカー候補が、固体支持体上にある、請求項277のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが、溶液中にある、請求項277のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体またはTCRが、固体支持体上にある、請求項277から279のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体またはTCRが、溶液中にある、請求項277から279のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体が、アレイである、請求項278または280のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体が、ビーズである、請求項278または280のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の細胞ポリヌクレオチドを、ベクターに挿入するステップをさらに含む、請求項1から283のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の細胞ポリヌクレオチドを、前記ベクターに挿入するステップをさらに含む、請求項284に記載の方法。
- 前記ベクターが、クローニングベクターである、請求項284または285に記載の方法。
- 前記ベクターが、発現ベクターである、請求項284から286のいずれか一項に記載の方法。
- 配列を、同一な分子バーコードとマッチさせるステップをさらに含む、請求項1から287のいずれか一項に記載の方法。
- コンセンサス配列を、前記ライブラリーから形成するステップをさらに含む、請求項1から288のいずれか一項に記載の方法。
- シークエンシングエラーおよびPCRエラーが、最小化されているか、消失しているか、または0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%、0.000001%、もしくは0.0000001%未満である、請求項1から289のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅反応におけるサイクルの数が、1〜40サイクルのいずれかに限定される、請求項1から290のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から291のいずれか一項に記載の方法により同定される、単離され精製された、抗体またはTCR。
- 請求項1から291のいずれか一項に記載の方法により同定される、単離され精製された、抗体IgL、TCRβ、またはTCRδ。
- 請求項1から291のいずれか一項に記載の方法により同定される、単離され精製された、抗体IgH、TCRα、またはTCRγ。
- 請求項1から291のいずれか一項に記載の方法により同定される、単離され精製された、抗体またはTCRのFab断片。
- 請求項1から291のいずれか一項に記載の方法により同定される、単離され精製された、抗体またはTCRのFab2断片。
- 請求項1から291のいずれか一項に記載の方法により同定される、単離され精製された、抗体またはTCRのFv断片。
- 請求項1から291のいずれか一項に記載の方法により同定される、単離され精製された、抗体のScFv断片。
- 請求項268から298のいずれか一項に記載の選択された抗体もしくはTCR、またはそれらの断片を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、それを必要とする被験体を処置する方法。
- 前記抗体、TCR、またはそれらの断片が、それを必要とする前記被験体から同定される、請求項299に記載の方法。
- 前記抗体、TCR、またはそれらの断片が、それを必要とする前記被験体から同定されない、請求項299に記載の方法。
- 前記抗体、TCR、またはそれらの断片を必要とする前記被験体が、疾患の1つまたは複数の症状を呈示する、請求項299から301のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体、TCR、またはそれらの断片を必要とする前記被験体が、疾患を有する、請求項299から302のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患が、未知である、請求項302または303に記載の方法。
- 前記疾患が、既知である、請求項302または303に記載の方法。
- 前記試料が、第1の時点で被験体から採取された第1の試料および第2の時点で該被験体から採取された第2の試料を含む、請求項1から305のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の時点において採取された前記試料に由来する前記第1または第2の細胞ポリヌクレオチドの量の増大または減少を決定するステップをさらに含む、請求項306に記載の方法。
- 量の前記増大または減少が、少なくとも約0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.5倍、2倍、3倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、またはそれ超の範囲の増大または減少である、請求項307に記載の方法。
- 前記第1および第2の時点の間の時間が、約1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、4カ月間、5カ月間、6カ月間、7カ月間、8カ月間、9カ月間、10カ月間、11カ月間、12カ月間、もしくはこれより長い時間、または少なくともおよそこれらの時間である、請求項306から308のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シークエンシングするステップが、ハイスループットである、請求項1から309のいずれか一項に記載の方法。
- マルチプレックスプライマーおよび/または固体支持体に結合させたマルチプレックスプライマーを含まない、請求項1から310のいずれか一項に記載の方法。
- 単一の機能的VセグメントまたはVセグメントの小規模なファミリーに相補的な配列を含む、Vセグメントプライマーの多様性を用いない、請求項1から311のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2の細胞ポリヌクレオチドを単離するステップを援用しない、請求項1から312のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シークエンシングするステップが、大規模並列合成によりなされる、請求項1から313のいずれか一項に記載の方法。
- 配列リードを生殖細胞系列の配列と比較し、該配列リードの体細胞超変異の蓄積を決定するステップをさらに含む、請求項1から314のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体配列のアイソタイプの分布を決定し、特異的なアイソタイプを選択するステップをさらに含む、請求項1から315のいずれか一項に記載の方法。
- 選択された抗体が、特異的なIgアイソタイプを含む、請求項268から316のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Igアイソタイプが、IgA、IgG、IgM、IgD、またはIgEである、請求項317に記載の方法。
- IgHおよびIgL抗体配列またはTCRαおよびTCRβ配列の対のライブラリーを生成するステップをさらに含む、請求項1から318のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライブラリーが、データベースである、請求項319に記載の方法。
- 前記第1および第2の単一細胞の二重バーコード化ポリヌクレオチドが、抗体またはTCRのコード配列にわたる、CDR1、CDR2、CDR3、および/または超変異領域を含む、請求項1から320のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された抗体またはTCRを、表面ディスプレイ技術に直接クローニングするステップをさらに含む、請求項268から321のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された抗体またはTCRを、定向進化により進化させるステップをさらに含む、請求項268から322のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択された抗体またはTCRを、機能的な特異性、親和性、または中和能についてスクリーニングするステップをさらに含む、請求項268から323のいずれか一項に記載の方法。
- 体細胞変異が、99%またはそれ超の信頼度で決定される、請求項1から324のいずれか一項に記載の方法。
- 各ポリヌクレオチド分子に由来するV、D、およびJセグメントの各々が同定される、請求項1から325のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、少なくとも2個のヌクレオチドを含む、請求項1から326のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、少なくとも3、4、5、6、7、8、または9個のヌクレオチドを含む、請求項327に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、少なくとも10個のヌクレオチドを含む、請求項327に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、少なくとも15個のヌクレオチドを含む、請求項327に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、最大で50個のヌクレオチドを含む、請求項327に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、10〜30個のヌクレオチドを含む、請求項327に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、縮重配列を含む、請求項327から332のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、全長または部分縮重配列を含む、請求項327から333のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、配列NNNNNNNNNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸である、請求項327から334に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、配列NNNNNWNNNNNWNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、Wが、アデニンまたはチミンである、請求項327から334のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、配列NNNNNXNNNNNXNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、Xが、任意の既知のヌクレオチドである、請求項327から334のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、配列NNNNNNNNNNNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、該配列中の少なくとも1つまたは2つのNが、Wであり、Wが、アデニンまたはチミンである、請求項327から334のいずれか一項に記載の方法。
- 前記容器バーコードが、配列NNNNNNNNNNNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、該配列中の少なくとも1つまたは2つのNが、Xであり、Xが、任意の既知のヌクレオチドである、請求項327から334のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、少なくとも2個のヌクレオチドを含む、請求項1から339のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、少なくとも3、4、5、6、7、8、または9個のヌクレオチドを含む、請求項340に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、少なくとも10個のヌクレオチドを含む、請求項340に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、少なくとも15個のヌクレオチドを含む、請求項340に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、最大で50個のヌクレオチドを含む、請求項340に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、10〜30個のヌクレオチドを含む、請求項340に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、縮重配列を含む、請求項340から345のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、全長または部分縮重配列を含む、請求項340から346のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、配列NNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸である、請求項340から347に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、配列NNTNNANNを含み、Nが、任意の核酸である、請求項340から347のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、配列NNWNNWNNを含み、Nが、任意の核酸であり、Wが、アデニンまたはチミンである、請求項340から347のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、配列NNXNNXNNを含み、Nが、任意の核酸であり、Xが、任意の既知のヌクレオチドである、請求項340から347のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、配列NNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、該配列中の少なくとも1つまたは2つのNが、Wであり、Wが、アデニンまたはチミンである、請求項340から347のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分子バーコードが、配列NNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、該配列中の少なくとも1つまたは2つのNが、Xであり、Xが、任意の既知のヌクレオチドである、請求項340から347のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅エラーを補正するステップをさらに含む、請求項1から353のいずれか一項に記載の方法。
- シークエンシングエラーを補正するステップをさらに含む、請求項1から354のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同じ分子バーコードを含む配列をビニングまたは群分けするステップをさらに含む、請求項1から355のいずれか一項に記載の方法。
- コンピュータまたはアルゴリズムを使用して、前記同じ分子バーコードを含む配列をビニングまたは群分けするステップをさらに含む、請求項1から356のいずれか一項に記載の方法。
- コンピュータまたはアルゴリズムを使用して、前記同じ容器バーコードを含む配列をビニングまたは群分けするステップをさらに含む、請求項1から357のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも約90%、95%、または99%の配列相同性を有する配列をクラスタリングするステップをさらに含む、請求項1から358のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも約90%、95%、または99%の配列相同性を有する配列をアラインするステップをさらに含む、請求項1から359のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クラスタリングまたはアラインするステップが、コンピュータまたはアルゴリズムの助けを借りて実施される、請求項359または360に記載の方法。
- 前記同じ分子バーコードを含有する配列リードの数を決定するステップを含む、請求項1から361のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同じ分子バーコード、および少なくとも約90%、95%、または99%の配列相同性を有する同じ第1の細胞ポリヌクレオチド配列の両方を含有する配列リードの数を決定するステップを含む、請求項1から362のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同じ分子バーコード、および少なくとも約90%、95%、または99%の配列相同性を有する同じ第2の細胞ポリヌクレオチド配列の両方を含有する配列リードの数を決定するステップを含む、請求項363に記載の方法。
- 前記試料中の、第1または第2の細胞ポリヌクレオチドの量を決定するステップを含む、請求項1から364のいずれか一項に記載の方法。
- 2つまたはそれ超の配列、配列リード、アンプリコンの配列、ビニングされた配列、アラインされた配列、クラスタリングされた配列、または前記同じ分子バーコードもしくは容器バーコード、またはこれらの両方を含むアンプリコンのセットの配列に由来するコンセンサス配列を形成するステップを含む、請求項1から365のいずれか一項に記載の方法。
- 第1または第2の細胞ポリヌクレオチド配列を、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.99%、または100%の精度または信頼度で決定するステップを含む、請求項1から366のいずれか一項に記載の方法。
- シークエンシングエラーおよびPCRエラーが、最小化されているか、消失しているか、または0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%、0.000001%、もしくは0.0000001%未満である、請求項1から367のいずれか一項に記載の方法。
- シークエンシングのエラー率が、0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、もしくは0%未満であるかまたはそれらと等しい、請求項1から368のいずれか一項に記載の方法。
- シークエンシングの前記エラー率が、0ではない、請求項1から369のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、1000,000、500,000、または1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、または9×1012ポリヌクレオチドをシークエンシングする、請求項1から370のいずれか一項に記載の方法。
- 4週間、3週間、2週間、1週間、6日間、5日間、5日間、4日間、3日間、2日間、1日間、18時間、12時間、9時間、6時間、3時間、2時間、もしくは1時間未満またはそれらと等しい正の量の時間で実施される、請求項1から371のいずれか一項に記載の方法。
- 特定の信頼度または塩基判定の精度を達成するのに使用されるリードの数が、分子バーコード、容器バーコード、またはこれらの両方を使用しない類似の方法を使用した同じ、類似の、またはより高度な信頼度または塩基判定の精度を達成するのに使用されるリードの数の、少なくとも約1.1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000分の1である、請求項1から372のいずれか一項に記載の方法。
- 特定の信頼度または塩基判定の精度を達成するのに使用されるリードの数が、分子バーコード、容器バーコード、またはこれらの両方を使用しない類似の方法を使用した同じ、類似の、またはより高度な信頼度または塩基判定の精度を達成するのに使用されるリードの数より、少なくとも約1、2、3、4、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、または9×1012リード少ない、請求項1から373のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の容器が、少なくとも3、4、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、もしくは9×1012、またはそれ超の容器を含む、請求項1から374のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の細胞ポリヌクレオチドが、少なくとも3、4、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、もしくは9×1012、またはそれ超の細胞ポリヌクレオチドを含む、請求項1から375のいずれか一項に記載の方法。
- (a)各々が、
(i)複数の細胞を含む試料に由来する単一細胞、
(ii)複数の分子バーコード化ポリヌクレオチド、
(iii)容器バーコード化ポリヌクレオチド;
(iv)該単一細胞に由来する第1の細胞ポリヌクレオチドに相補的な第1の相補的ポリヌクレオチド、および
(v)該単一細胞に由来する第2の細胞ポリヌクレオチドに相補的な第2の相補的ポリヌクレオチド
を含む、複数の容器
を含み;
該第1の相補的ポリヌクレオチドが、該複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の分子バーコードと、該容器バーコード化ポリヌクレオチドの容器バーコードまたは該容器バーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物とを含み、
該第2の相補的ポリヌクレオチドが、該複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第2の分子バーコードと、該容器バーコード化ポリヌクレオチドの容器バーコードまたは該容器バーコード化ポリヌクレオチドの増幅産物とを含む、組成物。 - 第1および第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、異なる、請求項377に記載の組成物。
- 前記第1および第2の相補的ポリヌクレオチドが、異なる分子バーコードを含む、請求項377または378に記載の組成物。
- 前記第1および第2の相補的ポリヌクレオチドが、同じ容器バーコードを含む、請求項377から379のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドが、増幅産物ではない、請求項377から380のいずれか一項に記載の組成物。
- 第1の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、第2の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードと異なる、請求項377から380のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項377から380のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの第2の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項383に記載の組成物。
- 第1の容器および第2の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項377から384のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの第3の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項384または385に記載の組成物。
- 前記第1の容器、前記第2の容器、および前記第3の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項386に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの任意の単一の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、固有である、請求項377から387のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの任意の1つの容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、前記複数の容器のうちの他の任意の1つの容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードと異なる、請求項377から388のいずれか一項に記載の組成物。
- 第1の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、第2の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードと同じである、請求項377から389のいずれか一項に記載の組成物。
- 第1の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、前記第1の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードと同じである、請求項377から390のいずれか一項に記載の組成物。
- 第2の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードが、前記第2の容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードと同じである、請求項391に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの容器バーコードが、該複数の容器のうちの第2の容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの容器バーコードと異なる、請求項377から392のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの容器バーコードが、第1の同じ容器バーコードである、請求項377から393のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの第2の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの容器バーコードが、第2の同じ容器バーコードである、請求項394に記載の組成物。
- 前記第1の同じ容器バーコードが、前記第2の同じ容器バーコードと異なる、請求項394または395に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの単一の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの容器バーコードが、同じ容器バーコードを含む、請求項394から396のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの任意の単一の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドおよびそのアンプリコンの容器バーコードが、該複数の容器のうちの他の任意の単一の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドおよびそのアンプリコンの容器バーコードに固有である、請求項394から397のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、1つの容器内に、単一の分子として存在する、請求項377から398のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、前記複数の容器の各容器内に、単一の分子として存在する、請求項377から399のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、前記複数の容器のうちの1つの容器内に、少なくとも単一の分子として存在する、請求項377から400のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、前記複数の容器の各容器内に、少なくとも単一の分子として存在する、請求項377から401のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の第1の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列が、該第1の容器内の第2の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列と同じである、請求項377から402のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの前記第1の容器内の前記第1の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第2の共通容器配列が、該第1の容器内の第2の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第2の共通容器配列と同じである、請求項403に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの任意の単一の容器内の第1の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列が、該単一の容器内の第2の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列と同じである、請求項403または404に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの単一の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドが、同じ第1の共通容器配列を含む、請求項403から405のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの単一の容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドが、同じ第2の共通容器配列を含む、請求項406に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の第1の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列が、該複数の容器のうちの第2の容器内の第2の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列と同じである、請求項377から407のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第2の共通容器配列が、前記第2の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第2の共通容器配列と同じである、請求項408に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの任意の1つの容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンが、該複数の容器のうちの他の任意の1つの容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第1の共通容器配列と同じ配列を含む、第1の共通容器配列を含む、請求項377から409のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの任意の1つの容器内の各容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンが、該複数の容器のうちの他の任意の1つの容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの、第2の共通容器配列と同じ配列を含む、第2の共通容器配列を含む、請求項410に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列が、該第1の容器内の第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列と同じである、請求項377から411のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの前記第1の容器内の前記第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第2の共通分子配列が、該第1の容器内の第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第2の共通分子配列と同じである、請求項412に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの任意の単一の容器内の第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列が、該単一の容器内の第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列と同じである、請求項412または413に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの単一の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドが、同じ第1の共通分子配列を含む、請求項412から414のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの単一の容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドが、同じ第2の共通分子配列を含む、請求項415に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの第1の容器内の第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列が、該複数の容器のうちの第2の容器内の第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列と同じである、請求項412から416のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第2の共通分子配列が、前記第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第2の共通分子配列と同じである、請求項417に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの任意の1つの容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドが、該複数の容器のうちの他の任意の1つの容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第1の共通分子配列と同じ配列を含む、第1の共通分子配列を含む、請求項412から418のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器のうちの任意の1つの容器内の各分子バーコード化ポリヌクレオチドが、該複数の容器のうちの他の任意の1つの容器内の分子バーコード化ポリヌクレオチドの第2の共通分子配列と同じ配列を含む、第2の共通分子配列を含む、請求項49に記載の組成物。
- 前記第1の共通容器配列が、前記第1の共通分子配列と同じ配列を含む配列を含む、請求項403から420のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1の共通容器配列が、前記第1の共通分子配列またはその相補体に相補的な配列を含む、請求項403から421のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の共通分子配列が、前記第1の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加された、3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項421または422に記載の組成物。
- 前記第1の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加された、3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な前記領域が、末端領域である、請求項423に記載の組成物。
- 第1および第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドが、一緒に融合されない、請求項377から424のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1および第2の相補的ポリヌクレオチドが、一緒に融合されない、請求項377から424のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1の細胞ポリヌクレオチドが、DNAである、請求項377から426のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の細胞ポリヌクレオチドが、DNAである、請求項427に記載の組成物。
- 前記第1の細胞ポリヌクレオチドが、RNAである、請求項377から426のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の細胞ポリヌクレオチドが、RNAである、請求項429に記載の組成物。
- 前記RNAが、mRNAである、請求項429または430に記載の組成物。
- 前記第1の相補的ポリヌクレオチドが、cDNAである、請求項429から431のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の相補的ポリヌクレオチドが、cDNAである、請求項432に記載の組成物。
- 非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼ、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、請求項377から433のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1および/または第2の相補的ポリヌクレオチドが、3’末端に付加された、3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドを含む、請求項434に記載の組成物。
- 前記非鋳型ターミナルトランスフェラーゼが、逆転写酵素であり、該逆転写酵素が、Superscipt II逆転写酵素、Maxima逆転写酵素、Protoscript II逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV−RT)、HighScriber逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を含む任意の逆転写酵素、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項434または435に記載の組成物。
- 第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドが、前記第1の相補的ポリヌクレオチドの3’末端における、前記3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項434から436のいずれか一項に記載の組成物。
- 第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドが、前記第2の相補的ポリヌクレオチドの3’末端における、3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項437に記載の組成物。
- 前記3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドが、同一である、請求項435から438のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドの少なくとも1つが、該3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドの別のヌクレオチドと同一ではない、請求項435から438のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの前記相補的領域の少なくとも1つのヌクレオチドが、該第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの該相補的領域の別の核酸と同一ではない、請求項437から440のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの前記相補的領域の少なくとも1つのヌクレオチドが、該第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの該相補的領域の別の核酸と同一ではない、請求項437から441のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項441または442に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、リボヌクレオチドまたはその類似体ではない、請求項441から443のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、デオキシリボグアノシンである、請求項441から444のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、デオキシリボグアノシン類似体である、請求項441から444のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドである、請求項441から446のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの同一でないヌクレオチドが、リボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項441または442に記載の組成物。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの前記相補的領域の末端ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項437から448のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の末端ヌクレオチドが、リボヌクレオチドまたはその類似体ではない、請求項437から449のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の末端ヌクレオチドが、デオキシリボグアノシンである、請求項437から450のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の末端ヌクレオチドが、デオキシリボグアノシン類似体である、請求項437から450のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の末端ヌクレオチドが、リボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項43786から448のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の少なくとも2つの非末端ヌクレオチドが、リボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項437から453のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の少なくとも2つの非末端ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドまたはその類似体ではない、請求項437から454のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドのハイブリダイズさせた領域の少なくとも2つの非末端ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドまたはその類似体である、請求項437から455のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1の相補的ポリヌクレオチドが、第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項377から456のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の相補的ポリヌクレオチドが、第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項457に記載の組成物。
- 前記第1の相補的ポリヌクレオチドが、第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な領域を含む、請求項457または458のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な前記第1の相補的ポリヌクレオチドの前記領域が、分子バーコード配列に相補的ではない、請求項459に記載の組成物。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な前記第1の相補的ポリヌクレオチドの前記領域が、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドまたはその増幅産物の領域に相補的ではない、請求項459または460に記載の組成物。
- 前記第1または第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な、前記第1の相補的ポリヌクレオチドの該領域が、前記第1の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加された、3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドを含む、請求項457から461のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドに相補的な前記第2の相補的ポリヌクレオチドの前記領域が、該第2の相補的ポリヌクレオチドの3’末端に付加された、3つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドを含む、請求項462に記載の組成物。
- 前記第1の相補的ポリヌクレオチドが、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドに相補的ではない、請求項457から463のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第2の相補的ポリヌクレオチドが、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドに相補的ではない、請求項464に記載の組成物。
- 第1の分子バーコード化ポリヌクレオチドの相補体の領域が、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的である、請求項377から465のいずれか一項に記載の組成物。
- 第2の分子バーコード化ポリヌクレオチドの相補体の領域が、前記容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的である、請求項466に記載の組成物。
- 上記の方法に由来する任意の1つまたは複数のプライマーをさらに含む、請求項377のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器の各容器が、固体支持体を含まない、請求項377から468のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、固体支持体に結合されている、請求項377から469のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、ビーズに結合されている、請求項377から470のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチド、分子バーコード化ポリヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せが、プライマーではない、請求項377から471のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコード化ポリヌクレオチド、分子バーコード化ポリヌクレオチド、またはこれらの任意の組合せが、伸長させたポリヌクレオチドではない、請求項377から472のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞を、溶解させる、請求項377から473のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器が、複数のウェルを含む、請求項377から474のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の容器が、複数のエマルジョンを含む、請求項377から474のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数のエマルジョンの各エマルジョンが、約0.01ピコリットル〜10マイクロリットルの容量である、請求項476に記載の組成物。
- 前記単一細胞が、免疫細胞を含む、請求項377から477のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の細胞が、複数の免疫細胞を含む、請求項377から478のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記免疫細胞が、リンパ球もしくはその亜型、B細胞もしくはその亜型、T細胞もしくはその亜型、またはこれらの組合せである、請求項478または479に記載の組成物。
- 前記複数の細胞が、メモリーB細胞、ナイーブB細胞、形質芽球性B細胞、ナイーブT細胞、形質芽球性T細胞、B細胞の任意の亜型、T細胞の任意の亜型、またはこれらの任意の組合せについて富化される、請求項479または480に記載の組成物。
- 前記単一細胞が、がん細胞を含む、請求項377から477のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の細胞が、複数のがん細胞を含む、請求項482に記載の組成物。
- 前記がん細胞が、扁平細胞癌細胞、腺癌細胞、移行上皮癌細胞、骨肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、筋肉肉腫細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、神経膠腫細胞、またはこれらの任意の組合せである、請求項482または483に記載の組成物。
- 前記複数のがん細胞が、循環がん細胞、内皮がん細胞、上皮がん細胞、希少がん細胞、またはがん細胞の任意の型もしくは亜型について富化される、請求項483または484に記載の組成物。
- 前記第1または第2の細胞ポリヌクレオチドが、変異体配列を含む、請求項377から485のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記変異体配列が、変異、多型、欠失、または挿入を含む、請求項486に記載の組成物。
- 前記多型が、一塩基多型である、請求項487に記載の組成物。
- 前記第1または第2の細胞ポリヌクレオチドが、疾患または状態についてのバイオマーカーである、請求項377から488のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1または第2の細胞ポリヌクレオチドが、病原体に由来する、請求項377から488のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1および第2の相補的ポリヌクレオチドが、抗体またはTCRのコード配列にわたる、CDR1、CDR2、CDR3、および/または超変異領域を含む、請求項377から490のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、少なくとも2個のヌクレオチドを含む、請求項377から491のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、少なくとも3、4、5、6、7、8、または9個のヌクレオチドを含む、請求項492に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、少なくとも10個のヌクレオチドを含む、請求項492に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、少なくとも15個のヌクレオチドを含む、請求項492に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、最大で50個のヌクレオチドを含む、請求項492に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、10〜30個のヌクレオチドを含む、請求項492に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、縮重配列を含む、請求項492から497のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、全長または部分縮重配列を含む、請求項492から498のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、配列NNNNNNNNNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸である、請求項499に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、配列NNNNNWNNNNNWNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、Wが、アデニンまたはチミンである、請求項499に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、配列NNNNNXNNNNNXNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、Xが、任意の既知のヌクレオチドである、請求項499に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、配列NNNNNNNNNNNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、該配列中の少なくとも1つまたは2つのNが、Wであり、Wが、アデニンまたはチミンである、請求項499に記載の組成物。
- 前記容器バーコードが、配列NNNNNNNNNNNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、該配列中の少なくとも1つまたは2つのNが、Xであり、Xが、任意の既知のヌクレオチドである、請求項499に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、少なくとも2個のヌクレオチドを含む、請求項377から504のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、少なくとも3、4、5、6、7、8、または9個のヌクレオチドを含む、請求項505に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、少なくとも10個のヌクレオチドを含む、請求項505に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、少なくとも15個のヌクレオチドを含む、請求項505に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、最大で50個のヌクレオチドを含む、請求項505に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、10〜30個のヌクレオチドを含む、請求項505に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、縮重配列を含む、請求項505から510のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、全長または部分縮重配列を含む、請求項505から511のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、配列NNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸である、請求項512に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、配列NNTNNANNを含み、Nが、任意の核酸である、請求項512に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、配列NNWNNWNNを含み、Nが、任意の核酸であり、Wが、アデニンまたはチミンである、請求項512に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、配列NNXNNXNNを含み、Nが、任意の核酸であり、Xが、任意の既知のヌクレオチドである、請求項512に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、配列NNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、該配列中の少なくとも1つまたは2つのNが、Wであり、Wが、アデニンまたはチミンである、請求項512に記載の組成物。
- 前記分子バーコードが、配列NNNNNNNNを含み、Nが、任意の核酸であり、該配列中の少なくとも1つまたは2つのNが、Xであり、Xが、任意の既知のヌクレオチドである、請求項512に記載の組成物。
- 前記複数の容器が、少なくとも3、4、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、もしくは9×1012、またはそれ超の容器を含む、請求項377から518のいずれか一項に記載の組成物。
- 複数の細胞ポリヌクレオチドが、少なくとも3、4、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、もしくは9×1012、またはそれ超の細胞ポリヌクレオチドを含む、請求項377から519のいずれか一項に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドにバーコードを付ける方法であって、
(a)分子バーコード化ポリヌクレオチドを、単一細胞に由来する複数のポリヌクレオチドの各々とハイブリダイズさせるステップであり、ハイブリダイズさせた分子バーコード化ポリヌクレオチドが、該単一細胞を含む容器内の、複数の固有に分子バーコード化されたポリヌクレオチドに由来する、ステップと;
(b)分子バーコード化ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせた、該単一細胞に由来するポリヌクレオチドを伸長させて、分子バーコード化細胞ポリヌクレオチドを形成するステップと;
(c)容器バーコード化ポリヌクレオチドを、分子バーコード化細胞ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップであり、該容器バーコード化ポリヌクレオチドが、複数の容器のうちの単一の容器に固有である、ステップと;
(d)容器バーコード化ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせた分子バーコード化細胞ポリヌクレオチドを伸長させて、二重バーコード化細胞ポリヌクレオチドを形成するステップと;
(e)該二重バーコード化細胞ポリヌクレオチドをシークエンシングするステップと
を含む、方法。 - (a)におけるハイブリダイゼーションが、単一細胞に由来する前記ポリヌクレオチド上の自然発生の配列の塩基対合を介さない、請求項521に記載の方法。
- 前記分子バーコード化細胞ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせた前記容器バーコード化ポリヌクレオチドが、増幅産物である、請求項521または522に記載の方法。
- (c)におけるハイブリダイゼーションが、単一細胞に由来する前記ポリヌクレオチド上の自然発生の配列の相補体の塩基対合を介さない、請求項521から523のいずれか一項に記載の方法。
- (c)におけるハイブリダイゼーションが、(b)において伸長させた、前記単一細胞に由来する前記ポリヌクレオチドの領域との塩基対合を介する、請求項521から524のいずれか一項に記載の方法。
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