KR20170063726A - 고-처리량 뉴클레오티드 라이브러리 서열결정 - Google Patents

고-처리량 뉴클레오티드 라이브러리 서열결정 Download PDF

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KR20170063726A
KR20170063726A KR1020177010295A KR20177010295A KR20170063726A KR 20170063726 A KR20170063726 A KR 20170063726A KR 1020177010295 A KR1020177010295 A KR 1020177010295A KR 20177010295 A KR20177010295 A KR 20177010295A KR 20170063726 A KR20170063726 A KR 20170063726A
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브릭스 아드리안 랭엄
크리스토퍼 리안 클라우저
스티븐 제이콥 골드플레스
소니아 팀버레이크
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에이비비트로, 엘엘씨
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Abstract

본원에는 면역 레퍼토리 서열결정 및 단일세포 바코딩을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 방법 및 조성물은 단일 세포로부터 기원하는 임의의 두 서열, 예컨대 중쇄 및 경쇄 항체 서열, 알파 및 베타 사슬 T-세포 수용체 서열 또는 감마 및 델타 사슬 T-세포 수용체 서열을 항체 및 T-세포 수용체 발견, 질환 및 면역 진단 및 낮은 오류 서열결정을 위해 쌍을 이루는데 사용될 수 있다.

Description

고-처리량 뉴클레오티드 라이브러리 서열결정{HIGH-THROUGHPUT NUCLEOTIDE LIBRARY SEQUENCING}
본 출원은 2014년 9월 15일에 출원된 미국 임시 출원 번호 62/050,549 및 2014년 9월 17일에 출원된 미국 임시 출원 번호 62/051,832에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 각각은 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 면역 레퍼토리 서열결정 및 단일 세포 바코딩을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
현재의 항체 디스플레이 기술 (파지, 효모, 리보솜, 포유류 등)은 선택된 항체 후보들의 질이 그런 후보들이 생성되는 출발 라이브러리에 의해 제한되기 때문에 제한을 받는다. 접근법, 예컨대 조합 및 "우수한" 항체 디자인 접근법 및 하이브리도마 발견 접근법들은 자주 대규모 발현의 어려움, 환자에서의 면역원성의 고위험, 및 높은 결합 친화성 이외의 충분한 면역 기능의 결핍을 포함하여 후속 문제들을 제공하는 합성 항체들을 생산한다. 디스플레이 기술로부터 유도된 소수의 항체들만이 포지티브 전-임상 특징들을 증명한 때조차도, 지난 10년 동안 임상 실험을 성공적으로 통과하였다. 현재, 특정 항체 서열이 외래 표적에 대한 면역 반응을 인식하고 활성화하는 메커니즘을 예측하거나 이해하는 능력은 달성하기 어려운 채로 남아있다. 그러므로, 기술분야에는 높은 결합 친화성을 가지고, 대규모로 생성될 수 있으며, 충분한 면역 기능을 가지는 항체들을 발견하고 생성하는 방법에 대한 요구가 있다. 본원에서 기술되는 방법은 이런 요구를 충족하기 위하여 수백만년 동안의 면역 레퍼토리 진화를 사용하고 나아가 이들 개념 및 그 개념과 항체의 생성이 관련된 방식을 이해하는 것을 목표로 한다. 본원에서 기술되는 방법은 고품질 항체 후보들의 선택을 위한 항체 서열 및/또는 항체들의 라이브러리를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
인간 항체 라이브러리는 복잡성 및 크기에 있어 거의 무제한이다. 그 결과로서, 조합 라이브러리는 정확한 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL) 쌍을 거의 유발하지 않는 것으로 통계학적으로 증명되었다. 다른 것들은 상보성 결정 영역 (CDR)(예컨대 V3-23, V1-69 또는 매치하는 VH 용기 VL 빈도)의 가장 빈번하게 발현된 패밀리 중 유일한 것을 셔플링하는 것에 집중하였고, 따라서 관리 가능한 크기로의 레퍼토리 다양성이 제한되었다. 가장 빈번하게 발현된 패밀리는 면역 반응 동안에 더 빈번하게 선택되고 진화할 것으로 예상되었다. 놀랍게도, 인간 항체 레퍼토리의 면역 서열결정의 사용을 통해, 항체 프레임워크 발현 빈도와 면역 도전에 대한 반응으로 항체의 활성화 가능성 사이에 아무런 관계가 없다는 것이 발견되었다. 본원에 기술된 방법은 항체 발견 및 선택에 대한 이들 도전을 극복하기 위하여 비-제한적인 항체 라이브러리를 디자인 및/또는 생성하기 위해 사용될 수 있다. 자가면역, 암, 감염성 및 정상/건강한 도너 (donor) 라이브러리가 근본적인 충족되지 않은 생물학적 요구를 해결하기 위해 개인 맞춤형 의약에 대해 생성될 수 있다.
한 측면으로, 본원에는 각 용기 (vessel)가 복수의 세포를 포함하는 샘플로부터의 단일 세포, 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복수의 용기를 형성하는 단계; 단일 세포로부터의 제1 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드, 및 단일 세포로부터의 제2 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계; 복수의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 제1 상보성 폴리뉴클레오티드에 부착시키고, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 제2 상보성 폴리뉴클레오티드에 부착시킴으로써 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것의 증폭된 생성물을 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드에 부착시킴으로써, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 형성하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
한 측면으로, 본원에는 각 용기가 복수의 세포를 포함하는 샘플로부터의 단일 세포, 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복수의 용기; 단일 세포로부터의 제1 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드, 및 단일 세포로부터의 제2 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 제공되고; 여기서 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 분자 바코드 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 증폭된 생성물의 용기 바코드를 포함하며, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 분자 바코드 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 증폭된 생성물의 용기 바코드를 포함한다.
한 측면으로, 본원에는 (a) 각 용기가 복수의 세포를 포함하는 샘플로부터의 단일 세포, 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복수의 용기를 형성하는 단계; (b) 단일 세포로부터의 제1 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드, 및 단일 세포로부터의 제2 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계; (c) 복수의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 제1 상보성 폴리뉴클레오티드에 부착시키고, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 제2 상보성 폴리뉴클레오티드에 부착시킴으로써 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; 및 (d) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것의 증폭된 생성물을 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물, 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물에 부착시킴으로써, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 형성하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
한 측면으로, 본원에는 (a) 샘플의 복수의 면역 세포로부터의 중쇄 면역글로불린 (IgH) 폴리뉴클레오티드로부터 제1 상보성 폴리뉴클레오티드 및 경쇄 면역글로불린 (IgL) 폴리뉴클레오티드로부터 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를: 복수의 면역 세포로부터의 IgH 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 표적 프라이머; 복수의 면역 세포로부터의 IgL 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 표적 프라이머; 비-주형 말단 전달효소 활성을 포함하는 역 전사효소, 이때 3개 이상의 동일한 비-주형 뉴클레오티드가 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가되며; 각각이 분자 바코드, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 5' 단부 영역 및 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 3' 단부 영역을 포함하는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드; 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 제조하고, 그로써 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; (b) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; (c) 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 IgH 또는 IgL 폴리뉴클레오티드의 가변 영역, 또는 그것들의 조합을 포함하는 서열의 라이브러리를 형성하는 단계; 및 (d) 라이브러리의 하나 이상의 서열을 서열결정하는 단계를 포함하는 방법이 제공되고, 이때 (a)는 복수의 용기 중 한 용기에서 수행되며, 용기는 복수의 면역 세포로부터의 단일 면역 세포를 포함한다.
한 측면으로, 본원에는 (a) 샘플의 복수의 면역 세포로부터의 T-세포 수용체 알파 (TCRα) 폴리뉴클레오티드로부터 제1 상보성 폴리뉴클레오티드 및 T-세포 수용체 베타 (TCRβ) 폴리뉴클레오티드로부터 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를: 복수의 면역 세포로부터의 TCRα 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 표적 프라이머; 복수의 면역 세포로부터의 TCRβ 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 표적 프라이머; 비-주형 말단 전달효소 활성을 포함하는 역 전사효소, 이때 3개 이상의 동일한 비-주형 뉴클레오티드가 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가되며; 각각이 분자 바코드, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 5' 단부 영역 및 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 3' 단부 영역을 포함하는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드; 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 제조하고, 그로써 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; (b) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; (c) 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 TCRα 또는 TCRβ 폴리뉴클레오티드의 가변 영역, 또는 그것들의 조합을 포함하는 서열의 라이브러리를 형성하는 단계; 및 (d) 라이브러리의 하나 이상의 서열을 서열결정하는 단계를 포함하는 방법이 제공되고, 이때 (a)는 복수의 용기 중 한 용기에서 수행되며, 용기는 복수의 면역 세포로부터의 단일 면역 세포를 포함한다.
한 측면으로, 본원에는 (a) 샘플의 복수의 면역 세포로부터의 T-세포 수용체 감마 (TCRγ) 폴리뉴클레오티드로부터 제1 상보성 폴리뉴클레오티드 및 T-세포 수용체 델타 (TCRδ) 폴리뉴클레오티드로부터 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를: 복수의 면역 세포로부터의 TCRγ 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 표적 프라이머; 복수의 면역 세포로부터의 TCRδ 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 표적 프라이머; 비-주형 말단 전달효소 활성을 포함하는 역 전사효소, 이때 3개 이상의 동일한 비-주형 뉴클레오티드가 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가되며; 각각이 분자 바코드, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 5' 단부 영역 및 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 3' 단부 영역을 포함하는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드; 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 제조하고, 그로써 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; (b) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; (c) 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 TCRγ 또는 TCRδ 폴리뉴클레오티드의 가변 영역, 또는 그것들의 조합을 포함하는 서열의 라이브러리를 형성하는 단계; 및 (d) 라이브러리의 하나 이상의 서열을 서열결정하는 단계를 포함하는 방법이 제공되고, 이때 (a)는 복수의 용기 중 한 용기에서 수행되며, 용기는 복수의 면역 세포로부터의 단일 면역 세포를 포함한다.
일부 구체예에서, 라이브러리는 샘플의 면역 상태를 나타낸다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열은 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 라이브러리이다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 상이하다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 상이한 분자 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열은 상이한 분자 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열은 동일한 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 증폭된 생성물이 아니다. 일부 구체예에서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 상이하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제2 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 제1 용기 및 제2 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제3 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 제1 용기, 제2 용기 및 제3 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 상이하다. 일부 구체예에서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일하다. 일부 구체예에서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일하다. 일부 구체예에서, 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중의 제1 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 복수의 용기 중의 제2 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드와 상이하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중의 제1 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 제1 동일 용기 바코드이다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중의 제2 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 제2 동일 용기 바코드이다. 일부 구체예에서, 제1 동일 용기 바코드는 제2 동일 용기 바코드와 상이하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 동일 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 복수의 용기 중 임의의 다른 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 그것의 암플리콘의 용기 바코드에 대해 특유하다.
일부 구체예에서, (a)의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 용기에 단일 분자로서 존재한다. 일부 구체예에서, (a)의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기의 각각의 용기에서 단일 분자로서 존재한다. 일부 구체예에서, (a)의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기의 용기에서 적어도 단일 분자로서 존재한다. 일부 구체예에서, (a)의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기의 각각의 용기에서 적어도 단일 분자로서 존재한다.
일부 구체예에서, 복수의 용기 중의 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 제1 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중의 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열은 제1 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중의 임의의 단일 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 단일 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제1 공통 염기 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제2 공통 염기 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중의 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 복수의 용기 중의 제2 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열은 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘은 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일한 서열을 포함하는 제1 공통 용기 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘은 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일한 서열을 포함하는 제2 공통 용기 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 제1 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열은 제1 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 단일 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제1 공통 분자 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제2 공통 분자 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 복수의 용기 중 제2 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열은 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 제1 공통 분자 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 제2 공통 분자 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 공통 용기 서열은 제1 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 공통 용기 서열은 제1 공통 분자 서열 또는 그것의 상보물에 상보하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 공통 분자 서열은 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역은 말단 영역이다.
일부 구체예에서, 제1 및 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 함께 융합되지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 함께 융합되지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열은 함께 융합되지 않는다.
일부 구체예에서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 구체예에서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 구체예에서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 구체예에서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 구체예에서, RNA는 mRNA이다. 일부 구체예에서, (b)의 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 cDNA이다. 일부 구체예에서, (b)의 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 cDNA이다.
일부 구체예에서, (b)는 제1 세포 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 연장하는 제1 표적 프라이머 및 제2 세포 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 연장하는 제2 표적 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 연장은 제1 세포 폴리뉴클레오티드를 제1 표적 프라이머를 사용하여 역전사시키는 것과, 제2 세포 폴리뉴클레오티드를 제2 표적 프라이머를 사용하여 역전사시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 표적 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 상보하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 표적 프라이머는 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 상보하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 표적 프라이머는 폴리(T) 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 표적 프라이머는 폴리(T) 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열은 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열, TCRγ 서열 또는 그것들의 조합이다. 일부 구체예에서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열은 중쇄 불변 영역 (CH) 서열, TCRα 영역 불변 (Cα) 서열, TCRγ 불변 영역 (Cγ) 서열 또는 그것들의 조합이다. 일부 구체예에서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열은 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열, TCRδ 서열 또는 그것들의 조합이다. 일부 구체예에서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열은 경쇄 불변 영역 (CL) 서열, TCRβ 불변 영역 (Cβ) 서열, TCRδ 불변 영역 (Cδ) 서열 또는 그것들의 조합이다. 일부 구체예에서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열은 경쇄 불변 영역 (CL) 서열, TCRβ 불변 영역 (Cβ) 서열, TCRδ 불변 영역 (Cδ) 서열 또는 그것들의 조합이다. 일부 구체예에서, 제1 표적 프라이머는 복수의 제1 표적 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 표적 프라이머는 복수의 제2 표적 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 제1 표적 프라이머는 복수의 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열, TCRγ 서열 또는 그것들의 조합에 상보하는 복수의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열 또는 TCRγ 서열은 복수의 중쇄 불변 영역 (CH) 서열, TCRα 불변 영역 (Cα) 서열, TCRγ 불변 영역 (Cγ) 서열 또는 그것들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열은 IgM, IgD, IgA, IgE, IgG 및 그것들의 조합으로부터의 중쇄 불변 영역 (CH) 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 둘 이상의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 제2 표적 프라이머는 복수의 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열, TCRδ 서열 또는 그것들의 조합에 상보하는 복수의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열 또는 TCRδ 서열은 복수의 경쇄 불변 영역 (CL) 서열, TCRβ 불변 영역 (Cβ) 서열, TCRδ 불변 영역 (Cδ) 서열 또는 그것들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 경쇄 불변 영역 (CL) 서열은 Igκ, Igλ 및 그것들의 조합으로부터의 경쇄 불변 영역 (CL) 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 둘 이상의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, (b)에서 연장은 비-주형 말단 전달효소의 사용을 포함하고, 이때 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드가 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된다. 일부 구체예에서, 비-주형 말단 전달효소는 역전사효소 또는 중합효소이다. 일부 구체예에서, 비-주형 말단 전달효소는 역전사효소이고, 역전사효소는 슈퍼스크립트(Superscript) II 역전사효소, 막시마(Maxima) 역전사효소, 프로토스크립트(Protoscript) II 역전사효소, 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT), 하이스크라이버(HighScriber) 역전사효소, 조류 골수아세포증 바이러스 (AMV) 역전사효소, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전달효소 활성을 포함하고 있는 임의의 역전사효소 및 그것들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드가 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된다.
일부 구체예에서, (c)에서 부착은 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역을 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, (c)에서 부착은 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역을 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, (c)에서 제1 상보성 폴리뉴클레오티드에 부착된 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부의 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, (c)에서 제2 상보성 폴리뉴클레오티드에 부착된 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부의 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드는 동일하다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드의 다른 뉴클레오티드와 동일하지 않다. 일부 구체예에서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 다른 핵산과 동일하지 않다. 일부 구체예에서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 다른 핵산과 동일하지 않다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 동일하지 않은 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 동일하지 않은 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아니다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 동일하지 않은 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 동일하지 않은 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 유사체이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 동일하지 않은 뉴클레오티드는 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 말단 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 동일하지 않은 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아니다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신 유사체이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아니다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, (c)는 추가로 부착 후에 연장하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 분자 바코드 서열에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것으로부터 증폭된 생성물의 영역에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 부착된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 부착된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역은 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드가 상보하는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 방법은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 제1 프라이머 세트로 증폭시키는 단계를 더 포함하고, 증폭은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 부착하기 전에 또는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 부착하는 것과 동시에 수행된다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드로부터 증폭된 생성물, 및 그것들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 제1 및 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 부착시키는 것은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 영역을 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 혼성화시키는 단계, 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 영역을 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 혼성화시키는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 부착시킨 후에 제1 단일 세포 단일-바코딩된 서열 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 서열을 연장시키는 단계를 더 포함하고, 그로써 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 형성한다. 일부 구체예에서, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역은 동일한 서열이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역 또는 그것으로부터 증폭된 생성물에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 분자 바코드의 하류인 제1 단일 세포 단일-바코딩된 서열의 상보물의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 분자 바코드의 하류인 제2 단일 세포 단일-바코딩된 서열의 상보물의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 용기 바코드의 상류인 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 용기 바코드의 상류인 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 분자 바코드의 상류인 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 분자 바코드의 상류인 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 그것의 제2는 용기 바코드의 상류인 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 그것의 제2는 용기 바코드의 상류인 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보한다.
일부 구체예에서, 방법은 복수의 용기 중 둘 이상의 용기를 파괴하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 둘 이상의 파괴된 용기로부터 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 모으는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 증폭시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 증폭시키는 것은 복수의 용기의 용기 외부에서 수행된다. 일부 구체예에서, 방법은 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 제2 프라이머 세트를 사용하여 증폭시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 분자 바코드의 상류인 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 분자 바코드의 상류인 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 용기 바코드의 상류인 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 용기 바코드의 상류인 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머이다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 및 제2 세포 폴리뉴클레오티드, 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것의 임의의 조합의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 폴리 (T) 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드, 제1 또는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 또는 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 또는 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머는 제2 세포 폴리뉴클레오티드, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머는 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 표적 특이적 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머는 표적 특이적 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머의 표적 특이적 서열은 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열, TCRγ 서열, 또는 그것들의 조합을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머의 표적 특이적 서열은 중쇄 불변 영역 서열 (CH), TCRα 불변 영역 (Cα) 서열, TCRγ 불변 영역 (Cγ) 서열, 또는 그것들의 조합을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머의 표적 특이적 서열은 GGGTTGGGGCGGATGCAC, CATCCGGAGCCTTGGTGG, CCTTGGGGCTGGTCGGGG, CGGATGGGCTCTGTGTGG, CCGATGGGCCCTTGGTGG, GGATTTAGAGTCTCTCAGCTG, CACGGCAGGGTCAGGGTTC 및 GGGGAAACATCTGCATCAAGT로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머의 표적 특이적 서열은 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열, TCRδ 서열, 또는 그것들의 조합을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머의 표적 특이적 서열은 경쇄 불변 영역 서열 (CL), TCRβ 불변 영역 (Cβ) 서열, TCRδ 불변 영역 (Cδ) 서열, 또는 그것들의 조합을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 제3 프라이머의 표적 특이적 서열은 TTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGC, TTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTGG, TTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC, TTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGC, TTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGC, GAGGACGGTCACCTTGGTGCCA, TAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCC, GAGGACGGTCAGCTGGGTGCC, TAAAATGATCAGCTGGGTTCCTCCAC, TAGGACGGTGACCTTGGTCCCAG, GGGAGATCTCTGCTTCTGATG, CGACCTCGGGTGGGAACAC 및 CGGATGGTTTGGTATGAGGC로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 복수의 제2 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머는 복수의 제3 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 제2 프라이머의 표적 특이적 서열은 복수의 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열, TCRγ 서열, 또는 그것들의 조합을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 복수의 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열 또는 TCRγ 서열은 복수의 중쇄 불변 영역 (CH), TCRα 불변 영역 (Cα) 서열, TCRγ 불변 영역 (Cγ) 서열, 또는 그것들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 중쇄 불변 영역 (CH) 서열은 IgM, IgD, IgA, IgE, IgG 및 그것들의 조합으로부터의 중쇄 불변 영역 (CH) 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 둘 이상의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 제3 프라이머의 표적 특이적 서열은 복수의 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열, TCRδ 서열 또는 그것들의 조합을 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 복수의 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열 또는 TCRδ 서열은 복수의 경쇄 불변 영역 (CL) 서열, TCRβ 불변 영역 (Cβ) 서열, TCRδ 불변 영역 (Cδ) 서열, 또는 그것들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 경쇄 불변 영역 (CL) 서열은 Igκ, Igλ 및 그것들의 조합으로부터의 경쇄 불변 영역 (CL) 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 둘 이상의 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 표적 프라이머, 제2 표적 프라이머, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것들의 임의의 조합은 고체 지지체에 부착되지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 표적 프라이머, 제2 표적 프라이머, 제1 프라이머 세트의 프라이머, 제2 프라이머 세트의 프라이머, 또는 그것들의 임의의 조합은 분자 바코드, 용기 바코드, 바코드, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 표적 프라이머, 제2 표적 프라이머, 제1 프라이머 세트의 프라이머, 제2 프라이머 세트의 프라이머, 또는 그것들의 임의의 조합은 오버행 영역을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 복수의 용기의 각각의 용기는 고체 지지체를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체에 부착된다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 비드에 부착된다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것들의 임의의 조합은 프라이머가 아니다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것들의 임의의 조합은 연장되지 않는다.
일부 구체예에서, (a) 내지 (d)는 단일 용기에서 수행된다.
일부 구체예에서, (a) 내지 (d)는 단일 반응으로 수행된다.
일부 구체예에서, 방법은 단일 세포를 용해시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 용해는 단일 세포로부터 제1 및 제2 세포 폴리뉴클레오티드를 방출시킨다. 일부 구체예에서, 단일 세포는 (a) 후에 용해된다. 일부 구체예에서, 단일 세포는 (b) 전에 용해된다. 일부 구체예에서, 단일 세포는 용기에서 용해된다. 일부 구체예에서, 용해는 화학적 용해를 포함한다. 일부 구체예에서, 용해는 냉동-해동을 포함한다.
일부 구체예에서, 용기 바코드는 (d) 전에 증폭된다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 (d)와 동시에 증폭된다. 일부 구체예에서, 용기 바코드 및 제1 단일 세포 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동시에 증폭되거나 연장된다. 일부 구체예에서, 용기 바코드, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동시에 증폭되거나 연장된다. 일부 구체예에서, 제1 단일 세포 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동시에 증폭되거나 연장된다. 일부 구체예에서, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동시에 증폭되거나 연장된다. 일부 구체예에서, 복수의 용기는 복수의 웰을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기는 복수의 에멀션을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 에멀션의 각각의 에멀션은 부피로 약 0.01 피코리터 내지 10 마이크로리터이다. 일부 구체예에서, 복수의 용기는 복수의 컨테이너 (container)를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 표적 프라이머, 제2 표적 프라이머, 제1 프라이머 세트의 프라이머, 또는 제2 프라이머 세트의 프라이머는 샘플 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 그것들의 증폭된 생성물을 용기로부터 회수하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 그것들의 증폭된 생성물, 또는 그것들의 임의의 조합을 서열결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 그것들의 증폭된 생성물, 또는 그것들의 임의의 조합은 동시에 서열결정된다. 일부 구체예에서, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 그것들의 증폭된 생성물, 또는 그것들의 임의의 조합은 동일한 반응으로 서열결정된다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오티드 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 세포 기원을 용기 바코드를 기반으로 동일한 것으로 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 측정은 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 용기 바코드의 서열을 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 용기 바코드의 서열과 매치시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 둘 다의 서열을 가지는 출발 분자의 수를 분자 바코드를 기반으로 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 측정은 동일한 제1 분자 바코드, 동일한 제2 분자 바코드 또는 둘 다를 가지는 서열의 수를 측정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제1 서열 및 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제2 서열이 동일한 용기 바코드 또는 그것의 상보물을 함유할 때, 그것들은 동일한 단일 용기 또는 단일 세포로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제1 서열 및 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제2 서열이 상이한 분자 바코드 또는 그것의 상보물을 함유할 때, 그것들은 상이한 세포 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제1 서열 및 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제2 서열이 동일한 분자 바코드 또는 그것의 상보물을 함유할 때, 그것들은 동일한 세포 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제1 서열 및 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제2 서열이 상이한 용기 바코드 또는 그것의 상보물을 함유할 때, 그것들은 상이한 단일 용기 또는 단일 세포로부터 유래한다.
일부 구체예에서, 단일 세포는 면역 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 세포는 복수의 면역 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 세포는 림프구 또는 그것의 하위유형, B-세포 또는 그것의 하위유형, T-세포 또는 그것의 하위유형, 또는 그것들의 조합이다. 일부 구체예에서, 복수의 세포는 메모리 B-세포, 나이브 (naive) B-세포, 형질아세포 B-세포, 나이브 T-세포, 형질아세포 T-세포, B-세포의 임의의 하위유형, T-세포의 임의의 하위유형 또는 그것들의 임의의 조합에 대해 풍부해진다. 일부 구체예에서, 단일 세포는 암세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 세포는 복수의 암세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 암세포는 편평세포 암종 세포, 선암종 세포, 전이세포 암종 세포, 골육종 세포, 연골육종 세포, 근육 육종 세포, 백혈병 세포, 림프종 세포, 신경교종 세포, 또는 그것들의 임의의 조합이다. 일부 구체예에서, 복수의 암세포는 순환하는 암세포, 내피 암세포, 상피 암세포, 희귀 암세포, 또는 암세포의 임의의 유형 또는 하위유형에 대해 풍부해진다. 일부 구체예에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 대상으로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 방법은 대상을 질환 또는 상태를 가진 것으로 진단하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 대상은 동물이다. 일부 구체예에서, 동물은 인간이다. 일부 구체예에서, 방법은 대상이 대립유전자에 대해 동형접합성인지 또는 이형접합성인지를 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 질환 또는 상태를 가진 대상을 진단, 예측 또는 치료하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 혈액 샘플이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 샘플로부터 분리된다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 샘플로부터 분리되지 않는다.
일부 구체예에서, 샘플은 제1 샘플 및 제2 샘플을 포함하는 복수의 샘플을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 샘플은 적어도 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 또는 그 이상의 샘플을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 샘플은 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 또는 그 이상의 샘플을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 샘플은 적어도 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 샘플, 9000, 또는 10,000 샘플, 또는 100,000 샘플 또는 1,000,000 또는 그 이상의 샘플을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 샘플은 적어도 약 10,000 샘플을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 샘플은 제1 대상으로부터 유래하고 제2 샘플은 제2 대상으로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 제1 대상은 질환 또는 상태를 가진 대상이다. 일부 구체예에서, 제2 대상은 질환 또는 상태가 없는 대상이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 변이체 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 서열은 돌연변이, 다형태, 결실 또는 삽입을 포함한다. 일부 구체예에서, 다형태는 단일 뉴클레오티드 다형태이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 질환 또는 상태의 생체마커이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 병원체로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 병원체는 바이러스, 박테리아 또는 진균류이다.
일부 구체예에서, 방법은 대상으로부터의 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리의 서열을 상이한 시점에서의 동일한 대상으로부터의 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리와 비교하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 질환 또는 상태를 가진 대상으로부터의 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리의 서열을 질환 또는 상태가 없는 대상으로부터의 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리와 비교하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 둘 다의 생식계열 서열을 측정하는 단계를 더 포함하고, 이때 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 IgH 또는 VH 서열을 포함하며, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 IgL 또는 VL 서열, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 생식계열의 IgL, IgH, VH, VL의 서열, 또는 그것들의 서열로부터의 임의의 조합의 변이성을 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 다음 중 적어도 하나를 측정하는 단계를 더 포함한다: 특유한 IgH 서열의 총 수; 특유한 IgL 서열의 총 수; 특유한 IgH 및 IgL 서열의 총 수; 특유한 쌍을 이룬 IgL 및 IgH 서열의 총 수; IgH 서열 또는 IgL 서열의 빈도; 또는 하나 이상의 다른 것에 대한 IgH 서열 및 IgL 서열의 조합의 빈도. 일부 구체예에서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 둘 다의 생식계열 서열을 측정하는 단계를 더 포함하며, 이때 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 TCRα 또는 Vα 서열을 포함하고, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 TCRβ 또는 Vβ 서열, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 생식계열의 TCRα, TCRβ, Vα, Vβ의 서열, 또는 그것들의 서열로부터의 임의의 조합의 서열의 변이성을 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 다음 중 적어도 하나를 측정하는 단계를 더 포함한다: 특유한 TCRα 서열의 총 수; 특유한 TCRβ 서열의 총 수; 특유한 TCRα 및 TCRβ 서열의 총 수; 특유한 쌍을 이룬 TCRα 및 TCRβ 서열의 총 수; TCRα 서열 또는 TCRβ 서열의 빈도; 또는 하나 이상의 다른 것들에 대한 TCRα 서열 및 TCRβ 서열의 조합의 빈도. 일부 구체예에서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 둘 다의 생식계열 서열을 측정하는 단계를 더 포함하며, 이때 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 TCRγ 또는 Vγ 서열을 포함하고, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 TCRδ 또는 Vδ 서열, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 생식계열의 TCRγ, TCRδ, Vγ, Vδ 또는 그것들의 임의의 조합의 서열로부터 그것들의 서열의 변이성을 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 적어도 다음 중 하나를 측정하는 단계를 더 포함한다: 특유한 TCRγ 서열의 총 수; 특유한 TCRδ 서열의 총 수; 특유한 TCRγ 및 TCRδ 서열의 총 수; 특유한 쌍을 이룬 TCRγ 및 TCRδ 서열의 총 수; TCRγ 서열 또는 TCRδ 서열의 빈도; 또는 하나 이상의 다른 것들에 대한 TCRγ 서열 및 TCRδ 서열의 조합의 빈도. 일부 구체예에서, 방법은 적어도 다음 중 하나를 측정하는 단계를 더 포함한다: 제1 유전자로부터의 서열의 총 수; 제2 유전자로부터의 서열의 총 수; 제1 유전자로부터의 특유한 서열의 총 수; 제2 유전자로부터의 특유한 서열의 총 수; 또는 제1 유전자로부터의 서열 또는 제2 유전자로부터의 서열의 빈도. 일부 구체예에서, 방법은 생식계열로부터 개별적으로 쌍을 이룬 IgL 및 IgH 서열, 또는 TCRα 및 TCRβ 서열, 또는 TCRγ 및 TCRδ 서열, 및 변이체를 기반으로 하여 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 생식계열로부터 하나 이상의 IgL 및 IgH 서열, TCRα 및 TCRβ 서열, 또는 TCRγ 및 TCRδ 서열, 및 변이체를 기반으로 하여 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 하나 이상의 서열 패턴, 변이성 분석, 동역학 또는 빈도를 기반으로 하여 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 빈도를 기반으로 하여 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 선택된 항체 또는 TCR은 에피토프에 약 1x10-7, 1x10-8, 1x10-9, 1x10-10, 1x10-11 또는 1x10-12 M보다 작거나 같은 KD로 결합한다.
일부 구체예에서, 선택된 항체 또는 TCR은 인간 치료용 항체 또는 TCR이다. 일부 구체예에서, 선택된 항체 또는 TCR은 중화 항체 또는 TCR이다. 일부 구체예에서, 선택된 항체 또는 TCR이 결합하는 표적은 알려져 있지 않다. 일부 구체예에서, 선택된 항체 또는 TCR이 결합하는 항체는 선택된 항체 또는 TCR이 선택되는 시점에서는 알려져 있지 않다.
일부 구체예에서, 방법은 생체마커를 발견하기 위하여 선택된 항체 또는 TCR을 적어도 하나의 생체마커 후보와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 생체마커 후보는 고체 지지체 상에 있다. 일부 구체예에서, 생체마커는 용액으로 존재한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 TCR은 고체 지지체 상에 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 TCR은 용액으로 존재한다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 어레이이다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 비드이다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오티드를 벡터 안에 삽입하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제2 세포 폴리뉴클레오티드를 벡터 안에 삽입하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 벡터는 클로닝 벡터이다. 일부 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다.
일부 구체예에서, 방법은 서열을 동일한 분자 바코드와 매칭시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 라이브러리로부터 공통 서열을 형성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 서열결정 및 PCR 오류는 최소화되거나, 제거되거나, 또는 0.01%, 0.001%, 0.0001%, 0.00001%, 0.000001%, 또는 0.0000001%보다 적다. 일부 구체예에서, 증폭 반응에서 사이클의 수는 1 내지 40 사이클 중 임의의 수로 제한된다.
한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 방법들 중 어느 것에 의해 확인된 분리되고, 정제된 항체 또는 TCR이 제공된다. 한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 방법들 중 어느 것에 의해 확인된 분리되고, 정제된 항체 IgL, TCRβ, 또는 TCRδ가 제공된다. 한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 방법들 중 어느 것에 의해 확인된 분리되고, 정제된 항체 IgH, TCRα, 또는 TCRγ가 제공된다. 한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 방법들 중 어느 것에 의해 확인된 분리되고, 정제된 항체의 Fab 단편 또는 TCR이 제공된다. 한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 방법들 중 어느 것에 의해 확인된 분리되고, 정제된 항체의 Fab2 단편 또는 TCR이 제공된다. 한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 방법들 중 어느 것에 의해 확인된 분리되고, 정제된 항체의 Fv 단편 또는 TCR이 제공된다. 한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 방법들 중 어느 것에 의해 확인된 분리되고, 정제된 항체의 FcFv 단편 또는 TCR이 제공된다. 한 측면으로, 본원에는 선택된 항체 또는 TCR, 또는 그것들의 단편을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상의 치료 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 항체, TCR 또는 그것들의 단편은 그것들을 필요로 하는 대상으로부터 확인된다. 일부 구체예에서, 항체, TCR 또는 그것들의 단편은 그것들을 필요로 하는 대상으로부터 확인되지 않는다. 일부 구체예에서, 필요로 하는 대상은 질환의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 구체예에서, 필요로 하는 대상은 질환을 가지고 있다. 일부 구체예에서, 질환은 알려져 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 제1 시점에서 대상으로부터 취한 제1 샘플 및 제2 시점에서 대상으로부터 취한 제2 샘플을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제1 및 제2 시점에서 취한 샘플로부터의 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 양의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 양의 증가 또는 감소는 적어도 약 0.1배, 0.2배, 0.3배, 0.4배, 0.5배, 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.5배, 2배, 3배, 5배, 10배, 50배, 100배, 1,000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배, 또는 그 이상의 범위의 증가 또는 감소이다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 시점 사이의 시간은 약, 또는 적어도 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간 13 시간, 14 시간, 15 시간, 16 시간, 17 시간, 18 시간, 19 시간, 20 시간, 21 시간, 22 시간, 23 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 또는 그 이상이다.
일부 구체예에서, 서열결정은 고-처리량이다. 일부 구체예에서, 방법은 프라이머의 복합체 및/또는 고체 지지체에 부착된 프라이머의 복합체를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 방법은 단일 기능적 V 절편 또는 V 절편의 작은 패밀리에 상보하는 서열을 포함하는 V-절편 프라이머의 다양성을 사용하지 않는다. 일부 구체예에서, 방법은 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 사용하지 않는다. 일부 구체예에서, 서열결정은 대량의 병렬 합성에 의해 이루어진다.
일부 구체예에서, 방법은 생식계열 서열에 대한 서열 판독을 비교하고 서열 판독의 체세포성 과돌연변이 축적을 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 특이적인 아이소타입을 선택하기 위해 항체 서열의 아이소타입 분포를 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 선택된 항체는 특이적 Ig 아이소타입을 포함한다. 일부 구체예에서, Ig 아이소타입은 IgA, IgG, IgM, IgD, 또는 IgE이다.
일부 구체예에서, 방법은 쌍을 이룬 IgH 및 IgL 항체 서열 또는 TCRα 및 TCRβ 서열의 라이브러리를 생성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 데이터베이스이다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 CDR1, CDR2, CDR3, 및/또는 과돌연변이 영역 교차 항체 또는 TCR 코딩 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 선택된 항체 또는 TCR을 직접 표면-디스플레이 기술로 클로닝하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 선택된 항체 또는 TCR을 지시된 진화에 의해 진화시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 선택된 항체 또는 TCR을 기능적 특이성, 친화성 또는 중화 항체에 대해 스크리닝하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 체세포 돌연변이는 99% 또는 그 이상의 신뢰도로 측정된다. 일부 구체예에서, 각각의 폴리뉴클레오티드 분자로부터 각각의 V, D 및 J 절편이 확인된다.
일부 구체예에서, 용기 바코드는 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 최대 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 축퇴성 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 전체 또는 부분적인 축퇴성 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 서열 NNNNNWNNNNNWNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 W는 아데닌 또는 티민이다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 서열 NNNNNXNNNNNXNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이고 X는 임의의 공지 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 W이고, 이때 W는 아데닌 또는 티민이다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 X이고, 이때 X는 임의의 공지 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 최대 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자바코드는 축퇴성 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 전체 또는 부분적인 축퇴성 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNTNNANN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNWNNWNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 W는 아데닌 또는 티민이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNXNNXNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 X는 임의의 공지 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 W이고, 이때 W는 아데닌 또는 티민이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 X이고, 이때 X는 임의의 공지 뉴클레오티드이다.
일부 구체예에서, 방법은 증폭 오류를 교정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 서열결정 오류를 교정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 동일한 분자 바코드를 포함하는 서열을 비닝하거나(binning) 그룹화하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 컴퓨터 또는 알고리즘을 사용하여 동일한 분자 바코드를 포함하는 서열을 비닝하거나 그룹화하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 컴퓨터 또는 알고리즘을 사용하여 동일한 용기 바코드를 포함하는 서열을 비닝하거나 그룹화하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 적어도 약 90%, 95% 또는 99% 서열 상동성을 가지는 서열들을 클러스터링하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 적어도 약 90%, 95% 또는 99% 서열 상동성을 가지는 서열들을 배열하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 클러스터링 또는 배열하는 것은 컴퓨터 또는 알고리즘을 보조로 수행된다. 일부 구체예에서, 방법은 동일한 분자 바코드를 함유하는 서열 판독의 수를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 서열 상동성을 가지는 동일한 분자 바코드 및 동일한 제1 세포 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다를 함유하는 서열 판독의 수를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 서열 상동성을 가지는 동일한 분자 바코드 및 동일한 제2 세포 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다를 함유하는 서열 판독의 수를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 샘플 중의 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 동일한 분자 바코드 또는 용기 바코드, 또는 둘 다를 포함하고 있는 둘 이상의 서열, 서열 판독, 암플리콘 서열, 비닝된 서열, 배열된 서열, 클러스터링된 서열 또는 암플리콘 세트 서열로부터 공통 서열을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드 서열을 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%,86%, 87%, 88%, 89%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 99.99%, 또는 100%의 정확도 또는 신뢰도로 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 서열결정 및 PCR 오류는 최소화되거나, 제거되거나, 또는 0.01%, 0.001%, 0.0001%, 0.00001%, 0.000001%, 또는 0.0000001%보다 적다. 일부 구체예에서, 서열결정의 오류율은 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 또는 0%보다 적거나 같다. 일부 구체예에서, 서열결정의 오류율은 0이 아니다. 일부 구체예에서, 적어도 1000, 100000, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 또는 9x1012 폴리뉴클레오티드가 서열결정된다. 일부 구체예에서, 방법은 4 주, 3 주, 2 주, 1 주, 6 일, 5 일, 5 일, 4 일, 3 일, 2 일, 1 일, 18 시간, 12 시간, 9 시간, 6 시간, 3 시간, 2 시간, 또는 1 시간보다 적거나 같은 포지티브량의 시간에 수행된다. 일부 구체예에서, 특정 신뢰도 또는 베이스 콜링 정확도를 이루기 위해 사용된 판독의 수는 분자 바코드, 용기 바코드 또는 둘 다를 사용하지 않으면서 유사한 방법을 사용하여 동일한, 유사한, 또는 더 높은 신뢰도 또는 베이스 콜링 정확도를 이루기 위해 사용된 판독 수보다 적어도 약 1.1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000배 더 적다. 일부 구체예에서, 특정 신뢰도 또는 베이스 콜링 정확도를 이루기 위해 사용된 판독 수는 분자 바코드, 용기 바코드 또는 둘 다를 사용하지 않으면서 유사한 방법을 사용하여 동일한, 유사한, 또는 더 높은 신뢰도 또는 베이스 콜링 정 확 도를 이루기 위해 사용된 판독 수보다 적어도 약 1000, 100000, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 또는 9x1012의 판독이 더 적다. 일부 구체예에서, 복수의 용기는 적어도 1000, 100000, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 또는 9x1012 또는 그 이상의 용기를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 세포 폴리뉴클레오티드는 적어도 1000, 100000, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 또는 9x1012 또는 그 이상의 세포 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 측면으로, 본원에는 각 용기가 복수의 세포를 포함하는 샘플로부터의 단일 세포, 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복수의 용기; 단일 세포로부터의 제1 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드, 및 단일 세포로부터의 제2 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 제공되고; 여기서 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 분자 바코드 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 증폭된 생성물의 용기 바코드를 포함하며, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 분자 바코드 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 증폭된 생성물의 용기 바코드를 포함한다.
일부 구체예에서, 제1 및 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 상이하다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 상이한 분자 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 동일한 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 증폭된 생성물이 아니다. 일부 구체예에서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 상이하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제2 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 제1 용기 및 제2 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제3 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 제1 용기, 제2 용기 및 제3 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 상이하다. 일부 구체예에서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일하다. 일부 구체예에서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일하다. 일부 구체예에서, 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 복수의 용기 중 제2 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드와 상이하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기중 제1 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 제1 동일 용기 바코드이다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제2 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 제2 동일 용기 바코드이다. 일부 구체예에서, 제1 동일 용기 바코드는 제2 동일 용기 바코드와 상이하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 동일 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 복수의 용기 중 임의의 다른 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 그것의 암플리콘의 용기 바코드에 대해 특유하다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 단일 분자로서 용기에 존재한다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기의 각각의 용기에서 단일 분자로서 존재한다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기의 용기에서 적어도 단일 분자로서 존재한다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기의 각각의 용기에서 적어도 단일 분자로서 존재한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 제1 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열은 제1 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 단일 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기의 단일 용기에서 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제1 공통 용기 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기의 단일 용기에서 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제2 공통 용기 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 복수의 용기 중 제2 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열은 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘은 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일한 서열을 포함하는 제1 공통 용기 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘은 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일한 서열을 포함하는 제2 공통 용기 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 제1 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열은 제1 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 단일 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제1 공통 분자 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제2 공통 분자 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 복수의 용기 중 제2 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열은 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 복수의 용기의 임의의 한 용기에서 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기에서 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 제1 공통 분자 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기의 임의의 한 용기에서 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기에서 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 제2 공통 분자 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 공통 용기 서열은 제1 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 공통 용기 서열은 제1 공통 분자 서열 또는 그것의 상보물에 상보하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 공통 분자 서열은 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역은 말단 영역이다.
일부 구체예에서, 제1 및 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 함께 융합되지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 함께 융합되지 않는다.
일부 구체예에서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 구체예에서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 구체예에서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 구체예에서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 구체예에서, RNA는 mRNA이다. 일부 구체예에서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 cDNA이다. 일부 구체예에서, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 cDNA이다.
일부 구체예에서, 조성물은 비-주형 말단 전달효소, 역전사효소, 중합효소 또는 그것들의 임의의 조합을 더 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 비-주형 말단 전달효소는 역전사효소이고, 역전사효소는 슈퍼스크립트 II 역전사효소, 막시마 역전사효소, 프로토스크립트 II 역전사효소, 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT), 하이스크라이버 역전사효소, 조류 골수아세포증 바이러스 (AMV) 역전사효소, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전달효소 활성을 포함하고 있는 임의의 역전사효소 및 그것들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부 상의 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부 상의 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드는 동일하다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드 중 다른 뉴클레오티드와 동일하지 않다. 일부 구체예에서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보성 영역의 적어도 한 뉴클레오티드는 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보성 영역의 다른 핵산과 동일하지 않다. 일부 구체예에서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보성 영역의 적어도 한 뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보성 영역의 다른 핵산과와 동일하지 않다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아니다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신 유사체이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 말단 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보성 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아니다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신 유사체이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아니다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체이다. 일부 구체예에서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 분자 바코드 서열에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것으로부터 증폭된 생성물의 영역에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하지 않는다. 일부 구체예에서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보한다. 일부 구체예에서, 조성물은 상기 방법들로부터의 임의의 하나 이상의 프라이머를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기의 각각의 용기는 고체 지지체를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체에 부착된다. 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 비드에 부착된다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것들의 임의의 조합은 프라이머가 아니다. 일부 구체예에서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것들의 임의의 조합은 연장된 폴리뉴클레오티드가 아니다. 일부 구체예에서, 세포는 용해된다. 일부 구체예에서, 복수의 용기는 복수의 웰을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 용기는 복수의 에멀션을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 에멀션의 각각의 에멀션은 부피로 약 0.01 피코리터 내지 10 마이크로리터이다.
일부 구체예에서, 단일 세포는 면역 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 세포는 복수의 면역 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 세포는 림프구 또는 그것의 하위유형, B-세포 또는 그것의 하위유형, T-세포 또는 그것의 하위유형, 또는 그것들의 조합이다. 일부 구체예에서, 복수의 세포는 메모리 B-세포, 나이브 B-세포, 형질아세포 B-세포, 나이브 T-세포, 형질아세포 T-세포, B-세포의 임의의 하위유형, T-세포의 임의의 하위유형 또는 그것들의 임의의 조합에 대해 풍부해진다. 일부 구체예에서, 단일 세포는 암세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 세포는 복수의 암세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 암세포는 편평세포 암종 세포, 선암종 세포, 전이세포 암종 세포, 골육종 세포, 연골 육종 세포, 근육 육종 세포, 백혈병 세포, 림프종 세포, 신경교종 세포, 또는 그것들의 임의의 조합이다. 일부 구체예에서, 복수의 암세포는 순환하는 암세포, 내피 암세포, 상피 암세포, 희귀 암세포, 또는 암세포의 임의의 유형 또는 하위유형에 대해 풍부해진다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 변이체 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체 서열은 돌연변이, 다형태, 결실 또는 삽입을 포함한다. 일부 구체예에서, 다형태는 단일 뉴클레오티드 다형태이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 질환 또는 상태의 생체마커이다. 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 병원체로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 CDR1, CDR2, CDR3, 및/또는 과돌연변이 영역 교차 항체 또는 TCR 코딩 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 용기 바코드는 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 최대 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 축퇴성 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 전체 또는 부분적인 축퇴성 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 서열 NNNNNWNNNNNWNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 W는 아데닌 또는 티민이다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 서열 NNNNNXNNNNNXNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 X는 임의의 공지 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 W이고, 이때 W는 아데닌 또는 티민이다. 일부 구체예에서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 X이고, 이때 X는 임의의 공지 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 최대 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 축퇴성 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 전체 또는 부분적인 축퇴성 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNTNNANN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNWNNWNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 W는 아데닌 또는 티민이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNXNNXNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 X는 임의의 공지 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 W이고, 이때 W는 아데닌 또는 티민이다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 X이고, 이때 X는 임의의 공지 뉴클레오티드이다.
일부 구체예에서, 복수의 용기는 적어도 1000, 100000, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 또는 9x1012 또는 그 이상의 용기를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 세포 폴리뉴클레오티드는 적어도 1000, 100000, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 또는 9x1012 또는 그 이상의 세포 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 측면으로, 본원에는 (a) 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 단일 세포로부터의 복수의 폴리뉴클레오티드의 각각에 혼성화하는 단계, 여기서 혼성화된 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 단일 세포를 포함하는 용기 내의 복수의 특유하게 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드로부터 유래되고; (b) 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오티드를 연장시켜서 분자 바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 단계; (c) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 분자 바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계, 여기서 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 중 단일 용기에 대해 특유하며; (d) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 분자 바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드를 연장시켜서 이중-바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 단계; 및 (e) 이중-바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드를 서열결정하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드의 바코딩 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, (a)의 혼성화는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오티드 상의 자연적으로 발생하는 서열의 염기쌍 형성을 통하지 않는다. 일부 구체예에서, 분자 바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 증폭된 생성물이다. 일부 구체예에서, (c)의 혼성화는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오티드 상의 자연적으로 발생하는 서열의 상보물의 염기쌍 형성을 통하지 않는다. 일부 구체예에서, (c)의 혼성화는 (b)에서 연장된 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오티드의 영역에 대한 염기쌍 형성을 통한다. 일부 구체예에서, (a) 내지 (d)는 단일 용기에서 수행된다. 일부 구체예에서, (a) 내지 (d)는 단일 반응으로 수행된다.
참조에 의한 통합
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그것들의 전체 내용이 모든 목적에 대해, 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것과 같은 정도로 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 본원에 기술된 방법, 키트 및 조성물과 관련하여 사용될, 간행물에 기술된 키트, 조성물 및 방법론을 설명하고 개시할 목적에 대해 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다. 본원에서 논의된 문헌들은 본 발명의 출원일 전에 개시된 것에 대해서만 제공된다. 본원에 있는 어떤 것도 본원에 기술된 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 목적으로 그런 개시를 선행하는 것으로 권리를 부여받을 수 없는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 기술된 신규한 특징들은 특히 첨부된 청구범위로 설명된다. 본원에 기술된 특징들의 더 좋은 이해 및 특징들의 장점은 본원에 기술된 특징의 원리가 기술되는 예시적인 실시예를 설명하는 다음의 상세한 설명을 참조로 얻어질 것이다:
도 1a는 본원에 기술된 예시적인 방법의 바코딩 단계의 개략도를 도시한다. 도면은 예컨대 라이브러리 제조 및 면역 서열결정을 위해, 둘 이상의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 쌍을 이룬 가변 Ig (예컨대 VH 및 VL mRNA) 및 TCR 서열 (예컨대 Vα/Vβ 및 Vγ/Vδ mRNA)을 증폭시키고 바코딩하는 방법을 나타낸다. 용기 바코드 (DB); 분자 바코드 (MB). (상부) 단일 세포 및 다른 반응 성분들 (예컨대 효소, 완충액, 올리고뉴클레오티드)를 함유하고 있는 에멀션 중의 (복수의 방울의) 단일 방울. (중간) 세포 용해 및 용해된 세포 RNA의 역전사. (하부) 역전사 동안 단일 분자의 분자 바코드 (MB) 꼬리표표 붙이기 (tagging).
도 1b는 본원에 기술된 예시적인 방법의 증폭 단계의 개략도를 도시한다. 도면은 예컨대 라이브러리 제조 및 면역 서열결정을 위해, 둘 이상의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 쌍을 이룬 가변 Ig (예컨대 VH 및 VL mRNAs) 및 TCR 서열 (예컨대 Vα/Vβ 및 Vγ/Vδ mRNAs)을 증폭시키고 바코딩하는 방법을 나타낸다. (상부) 용기 바코드 (VB) 독립적인 증폭은 각 방울에서 동일한 VB의 복수의 복사물을 생성한다. cDNA-MB 분자는 증폭의 아닐링 및 연장 단계 동안 동시에 VB로 꼬리표표가 붙여진다. (중간) 증폭 사이클 동안의 이중 바코딩된 cDNA의 동시 증폭. (하부) 에멀션의 방울로부터 회수된 증폭 생성물.
도 2는 용기 바코드 (DB)의 서열 동일성이 각 RNA에 대한 세포 기원의 확인을 허용하는 것을 보여주는 개략도를 도시한다.
도 3은 동일한 분자 바코드 (MB)가 동일한 동일성 RNA 서열에 부착된 채로 발견된다면, 이 RNA-MB-DB 종은 아마도 PCR 복제의 결과인 것을 보여주는 개략도를 도시한다. 두 개의 상이한 MB가 동일한 동일성 RNA 서열에 부착된 것이 발견될 때, 이들 RNA1-MB1-DB 및 RNA1-MB2-DB는 PCR 복제 기원이 아니라 두 개의 독립적인 RNA 분자 기원의 실제 관찰이다.
도 4a는 본원에 기술된 예시적인 방법의 개략도를 도시한다. 도면은 라이브러리 제조 및 면역 서열결정을 위해 쌍을 이룬 가변 Ig (예컨대 VH 및 VL 서열) 및 TCR 서열 (예컨대 Vα/Vβ 및 Vγ/Vδ 서열)을 증폭하고 바코딩하는 방법을 나타낸다. 용기 바코드 (DB); 분자 바코드 (MB). 도시된 각각의 반응은 단일 에멀션 상에서 이루어지고 용이한 제조를 위해 별도로 도시된다.
도 4b는 본원에 기술된 예시적인 방법의 개략도를 도시한다. 도면은 라이브러리 제조 및 면역 서열결정을 위해 VH 및 VL 항체 mRNA를 증폭하고 바코딩하는 방법을 나타낸다.
도 4c는 본원에 기술된 예시적인 방법의 개략도를 도시한다. 도면은 라이브러리 제조 및 면역 서열결정을 위해 VH 및 VL 항체 mRNA를 증폭하고 바코딩하는 방법을 예시한다.
도 4d는 본원에 기술된 예시적인 방법의 개략도를 도시한다. 도면은 라이브러리 제조 및 면역 서열결정을 위해 쌍을 이룬 가변 Ig (예컨대 VH 및 VL 서열) 및 TCR 서열 (예컨대 Vα/Vβ 및 Vγ/Vδ 서열)을 증폭하고 바코딩하는 방법을 예시한다.
도 5는 용기 바코드 (DB)의 서열 동일성이 각 RNA에 대한 세포 기원의 확인을 허용하는 것을 보여주는 개략도를 도시한다. 방법은 단일 반응으로 이중 바코딩된 cDNA를 얻기 위하여 각각이 단일 세포를 함유하는 복수의 방울을 함유하는 에멀션으로 사용될 수 있다.
도 6은 동일한 분자 바코드 (MB)가 동일한 동일성 RNA 서열에 부착된 것으로 발견되면, 이 RNA-MB-DB 종은 아마도 PCR 복제의 결과인 것을 보여주는 개략도를 도시한다. 두 개의 상이한 MB가 동일한 동일성 RNA 서열에 부착된 것이 발견될 때, 이들 RNA1-MB1-DB 및 RNA1-MB2-DB는 PCR 복제 기원이 아니라 두 개의 독립적인 RNA 분자 기원의 실제 관찰이다.
도 7a는 본원에 기술된 예시적인 방법의 개략도를 도시한다. 도면은 청구범위에서의 용어에 대한 설명을 나타낸다.
도 7b는 본원에 기술된 예시적인 방법의 개략도를 도시한다. 도면은 라이브러리 제조 및 면역 서열결정에 대한 것과 같이, 둘 이상의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 쌍을 이룬 가변 Ig (예컨대 VH 및 VL mRNA) 및 TCR 서열 (예컨대 Vα/Vβ 및 Vγ/Vδ mRNA)을 증폭하고 바코딩하는 방법을 예시한다.
여러 측면이 예시를 위한 용도들을 본보기 용도에 대한 참조로 하기에서 기술된다. 많은 구체적인 상세한 설명, 관계 및 방법들이 본원에 기술된 특징들의 전체적인 이해를 제공하기 위해 설명된다. 그러나, 관련 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 사람이면 본원에 기술된 특징들이 하나 이상의 구체적인 상세한 설명 없이 또는 다른 방법으로 실시될 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다. 본원에 기술된 특징들은 예시된 작용의 일부가 상이한 순서로 및/또는 다른 작용 또는 사건과 동시에 일어날 수 있기 때문에, 작용 또는 사건의 예시된 순서에 의해 제한되지 않는다. 나아가, 모든 예시된 작용 또는 사건이 본원에 기술된 특징에 따르는 방법론을 실행하기 위해 필요한 것은 아니다.
본원에 사용된 용어는 단지 특정 경우를 설명할 목적에 대한 것이고 제한하려는 의도는 아니다. 본원에서 사용되는 단일 형태를 나타내는 표현들은 맥락이 분명하게 다른 것을 표시하지 않는 한, 복수의 형태 역시 포함하는 것으로 의도된다. 나아가, 용어 "포함하는", "포함한다", "가지는", "가진", "포함한" 또는 그것들의 변용이 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 정도로, 그런 용어들은 용어 "포함하는"에 유사한 방식으로 포함되는 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 측정되는 특엊 값에 대한 허용되는 오차 범위 내에 있는 것을 의미할 수 있고, 부분적으로는 그 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 기술분야에서의 실시에 따라, 1 또는 1 이상의 표준편차를 의미할 수 있다. 다르게는, "약"은 주어진 값의 20% 까지, 10% 까지, 5% 까지, 또는 1% 까지의 범위를 의미할 수 있다. 다르게는, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 이 용어는 값의 5-배, 보다 바람직하게는 2-배 이내의 자릿수 내에 있는 것을 의미할 수 있다. 특정 값이 용도 및 청구범위에서 바람직한 경우, 다르게 표시되지 않는 한 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위가 추정되어야 하는 범위 내에 있는 것을 의미한다.
T 세포 수용체 사슬쌍 및 항체 면역글로불린 사슬쌍은 면역 수용체의 두 유형이고 진화적으로 관련된다. 발명의 목적은 고-처리량 서열결정 및 진단을 위한 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 생성하는 것이다. 또한 발명의 목적은 명확한 공통 특성을 가지는 환자 또는 집단으로부터의 항체 및/또는 TCR 발견을 위해 인간 유도된 라이브러리 패널을 개발하는 것이다. 출발 물질은 말초혈이거나 조직 생검으로부터일 수 있고, 그것으로부터 면역 세포가 포괄적으로 분리되거나 필요하다면 나이브, 메모리 및 ASC에 대해 하위-분류된다. 개시된 발명은 쌍을 이룬 가변 서열, 예컨대 T-세포 수용체 사슬쌍 및 항체 면역글로불린 사슬쌍의 상이한 다중 유형에 적용될 수 있다.
분리된 세포, 예컨대 면역 세포는 용기, 예컨대 유중수 에멀션 (방울)에, 방울당 단일 면역 세포 또는 그것보다 적게 함유하는 개별적인 피코리터 구획을 생성하는 방식으로 캡슐화될 수 있다. 수백만 세포가 각 샘플, 예컨대 대상으로부터의 생물학적 샘플에 대해 처리될 수 있어서, 단일 세포 서열결정 기술에서 고 처리량이 가능해진다. 예컨대 비드와 같은 고체 지지체의 사용은 본원에 기술된 방법을 사용하여 피할 수 있다. 별도의 용기 집단을 제조해야 하는 필요성 또한 본원에 기술된 방법을 사용하여 피할 수 있다. 예를 들어, 서열의 라이브러리는 동일한 또는 단일 반응으로, 또는 단일한 복수의 용기 또는 집단으로 생성될 수 있다. 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 VH 및 VL 항체 사슬 및/또는 Vα/Vβ 및 Vγ/Vδ T-세포 수용체 (TCR) 사슬은 용기의 형성 동안에 도입된다. 용기 바코드를 은닉하는 폴리뉴클레오티드 또한 용기의 형성 동안에 도입될 수 있다. 이들 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 축퇴성 바코드를 운반할 수 있어서 용기 바코드를 함유하는 각각의 세포 폴리뉴클레오티드가 그것이 들어 있는 용기에 상응하는 특유한 동일성 코드를 함유한다. 분자 바코드를 은닉하는 복수의 폴리뉴클레오티드가 또한 용기의 형성 동안에 도입될 수 있다. 이들 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 축퇴성 바코드를 운반할 수 있어서 분자 바코드를 함유하는 각각의 세포 폴리뉴클레오티드 분자가 그것들이 유래하는 단일 세포 폴리뉴클레오티드 분자에 상응하는 특유한 동일성 코드를 함유한다. 수백만의 단일 면역 세포가 에멀션 및 세포 전사물, 예컨대 VH 및 VL 및/또는 Vα/Vβ 및/또는 Vγ/Vδ 사슬 전사물 내부에서 용해될 수 있고, 프라이머를 사용하여 역전사되거나 복사될 수 있으며, 이어서 용기 바코드 및 분자 바코드로 꼬리표표가 붙여지고 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭이 이어진다. 단일 면역 세포 (예컨대 B-세포 또는 T-세포)로부터 기원하는 VH 및 VL 및/또는 Vα/Vβ 및/또는 Vγ/Vδ 사슬은 실제로 동일한 용기 바코드 동일성으로 서로에 연결될 수 있다.
VH 및 VL 및/또는 Vα/Vβ 및/또는 Vγ/Vδ 사슬은 그런 다음 용기로부터 회수되고 차-세대 서열결정 (NSG) 꼬리표표를 첨가하기 위해 PCR 풍부화된다. 라이브러리는 고 처리량 서열결정 플랫폼을 사용하여 서열결정될 수 있고 이어서 레퍼토리 다양성의 분석, 항체 빈도, CDR3 특성화, 체세포성 과돌연변이 계통발생 분석 등이 이어진다. 정확하게 매치된 VH 및 VL 및/또는 Vα/Vβ 및/또는 Vγ/Vδ 쌍의 데이터베이스는 용기 및 분자 바코드 서열을 디콘볼루팅 (deconvoluting)함으로써 생성될 수 있다. 각각의 단일 면역 세포가 그것들의 각각의 용기로부터 분리되기 때문에, 두 번 관찰된 각 용기 바코드에 대해서, 전사물은 동일한 에멀션 방울로부터 및 따라서 특유한 단일 세포로부터 기원하여 서열결정되었다. 관찰된 각각의 상이한 분자 바코드에 대해, 동일한 용기 바코드를 함유하는 서열에 대해, 전사물은 단일 세포로부터의 상이한 전사물 분자로부터 기원하여 서열결정되었다. 관찰된 각각의 동일한 분자 바코드에 대해, 동일한 용기 바코드를 함유하는 서열에 대해, 전사물은 단일 세포로부터의 동일한 전사물 분자로부터 기원하여 서열결정되었다 (예컨대 PCR 복제물).
서열결정와 나란히, 용기로부터 회수된 VH 및 VL 및/또는 Vα/Vβ 및/또는 Vγ/Vδ 쌍의 라이브러리는 항체 발현 벡터에 클론되고 효모 디스플레이 스크리닝을 위해 공-트랜스펙션될 수 있다. 이런 동일한 라이브러리 푸울을 클로닝하는 것은, 일부 드문 면역 세포가 한 분석, 또는 다른 한 분석에서 유일하게 포획될 것이기 때문에, 시작할 때 생물학적 샘플을 스플릿팅하는 것과 비교하여 바람직한 방법이다. 인간 유도된 VH 및 VL 및/또는 Vα/Vβ 및/또는 Vγ/Vδ 사슬의 라이브러리는 고전적 디스플레이 분석과 같이 정확한 또는 부정확한 쌍 매칭과 관계없이 발현될 수 있다. 그런 다음 효모 디스플레이가 잠재적인 항체 후보에 대한 풍부화를 위해 하나 이상의 항원 표적에 대하여 수행될 수 있다.
효모 디스플레이와 같은 디스플레이 기술로부터 드러난 포지티브 후보 항체들은 매칭된 쌍의 바코드 데이터베이스에 대해 서열결정되고 의문이 제기될 수 있다. 각각의 효모 디스플레이된 VH 및/또는 Vα 및/또는 Vγ 사슬은 그것의 각각의 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 사슬에 다시 매치될 수 있다. 이들 정확하게 쌍을 이룬 후보는 유전자 합성되고 포유류 세포주에서 발현될 수 있으며 관심의 표적에 대해 기능적으로 입증될 수 있다. 이들 후보는 전체 인간 항체 및/또는 TCR일 수 있다.
"항체"는 천연의 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성적으로 제조되는 것에 관계없이 면역글로불린 (Ig)을 나타낸다. "T-세포 수용체" ("TCR")는 천연의 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성적으로 제조되는 것에 관계없이, 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 T 림프구 (T-세포)의 표면에서 발견되는 분자를 나타낸다. 항원-결합 도메인이거나 항원-결합 도메인에 상동하는 결합 도메인을 가지는 폴리펩티드 또는 단백질이 포함된다. 이 용어는 추가로 "항원-결합 단편" 및 하기에서 기술되는 것과 같이 유사한 결합 단편에 대한 다른 상호교환 가능한 용어를 포함한다. 상보성 결정 영역 (CDR) 이식 항체 및 TCR 및 다른 인간화된 항체 및 TCR (CDR 변형 및 프레임워크 영역 변형) 또한 이들 용어에 의해 고려된다. 참조는 면역글로불린 사슬 (예컨대 중쇄 및 경쇄)에 대해서만 이루어질 수 있는 한편, 개시된 발명은 쌍을 이룬 서열, 예컨대 T-세포 수용체 사슬 쌍 (TCRα 및 TCRβ 사슬 및 TCRγ 및 TCRδ 사슬)의 다중의 다른 상이한 유형에 적용될 수 있고, 면역글로불린에 제한되지 않는다.
천연 항체 및 천연 면역글로불린은 통상적으로 약 150,000 달톤의, 두 개의 동일한 경쇄 (L) 및 두 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 전형적으로 하나의 공유 이황화물 결합에 의해 중쇄에 연결되는 한편, 이황화물 연쇄의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄들 중에서 다르다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 공간배치된 사슬내 이황화물 가교를 가진다. 각각의 중쇄는 한 단부에 가변 도메인 (VH)과 이어서 많은 불변 도메인 (CH)을 가진다. 각각의 경쇄는 한 단부에 가변 도메인 (VL)과 다른 단부에 불변 도메인 (CL)을 가진다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 일렬 배열되고, 경-쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 일렬배열된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. 항체는 그것의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM을 포함하여 상이한 부류들로 배정될 수 있고, 이들 중 여럿은 추가로 하위부류 (아이소타입), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 나누어질 수 있다. 항체의 중쇄 (IgH)는 그것들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불리는 면역글로불린의 상이한 부류에 해당한다. 임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄 (IgL)는 그것들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 개의 분명하게 구별되는 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
T-세포가 다양한 암 또는 감염과 관련된 항원을 인식하는 능력은 그것의 TCR에 의해 부여되는데, 그것은 두 알파 (α) 및 베타 (β) 사슬 또는 감마 (γ) 및 델타 (δ) 사슬로 구성된다. 이들 사슬을 구성하는 단백질은 DNA에 의해 코드화되고, 그것은 TCR의 대단히 큰 다양성을 생성하기 위해 특유한 메커니즘을 사용한다. 이런 다중-하위유닛 면역 인식 수용체는 CD3 복합체와 회합하고 항원-제공 세포 (APC)의 표면에서 MHC 부류 I 및 II 단백질에 의해 제공된 펩티드에 결합한다. APC 상에서 항원성 펩티드에 대한 TCR의 결합은 T-세포 활성화의 중심 사건이고, T-세포와 APC 사이의 접촉 지점에서 면역학적 시냅스에서 일어난다.
각각의 TCR은 가변 상보성 결정 영역 (CDR), 뿐만 아니라 프레임워크 영역 (FR) 및 불변 영역을 함유한다. α 및 β 사슬 가변 도메인의 제3 상보성-결정 영역 (CDR3) 루프의 아미노산 서열은 크게 β 사슬 유전자좌의 가변 (Vβ), 다양성 (Dβ), 및 연합 (Jβ) 유전자 절편 사이, 및 α 사슬 유전자좌의 유사한 Vα 및 Jα 유전자 절편 사이의 각각의 재조합으로부터 발생하는 αβ T-세포의 서열 다양성을 결정한다. TCRα 및 β 사슬 유전자좌에서 복수의 그런 유전자 절편의 존재는 대복수의 구별되는 CDR3 서열이 코드화되는 것을 허용한다. TCR 유전자 재배열의 과정 동안 Vβ-Dβ, Dβ-Jβ, 및 Vα-Jα 접합부에서 뉴클레오티드의 독립적인 첨가 및 결실은 추가로 CDR3 서열 다양성을 증가시킨다. 이런 측면에서, 면역능력은 TCR의 다양성에서 반영된다.
γδ TCR은 그것이 선천적 면역 시스템과 밀접하게 상호작용하는 수용체를 코드화한다는 점에서 αβ TCR과 구별되다. 발달에서 조기에 발현되는 TCRγδ는 특수화된 해부학적 분포를 가지며, 특유한 병원체 및 작은-분자 특이성을 가지고, 선천적 및 후천적 세포 상호작용의 광범위한 스펙트럼을 가진다. 개체발생 초기에, TCRγδ 세포의 제한된 하위세트가 다양한 조직을 출생 전에 차지하기 때문에, TCRγ V 및 J 절편 발현의 편향된 패턴이 수립된다. 그러므로, 병원체 및 독성 분자에 대한 환경적 노출에 의한 자극에 이어지는 광범위한 말초적 연장은 성인 조직에서 많은 다양한 TCRγ 레퍼토리를 유발한다.
B-세포에 의해 발현된 Ig들은 H2L2구조를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬, 2개의 중쇄 (IgH) 및 두 개의 경쇄 (IgL)로 구성되는 단백질이다. IgH 및 IgL 사슬의 각 쌍은 VL 및 VH 영역으로 구성되는 초가변 도메인, 및 불변 도메인을 함유한다. Ig의 IgH 사슬은 여러 유형, μ, δ, γ, α 및 β가 있다. 개체 내에서 Ig의 다양성은 주로 초가변 도메인에 의해 결정된다. TCR과 유사하게, IgH 사슬의 V 도메인은 VH-DH, DH-JH, 및 VH-JH 유전자 절편의 조합 연합에 의해 생성된다. Ig 유전자 재배열 과정 동안 VH-DH, DH-JH, 및 VH-JH 접합부에서 뉴클레오티드의 독립적인 첨가 및 결실은 추가로 초가변 도메인 서열 다양성을 증가시킨다. 여기서, 면역능력은 Ig의 다양성에 반영된다.
항체 사슬, 예컨대 중쇄 및 경쇄, 또는 TCR 사슬, 예컨대 알파 (α) 및 베타 사슬 또는 감마 (γ) 및 델타 (δ) 사슬과 관련하여 "가변"은 항체 또는 TCR 중에서 서열이 상이하고 각각의 특정 항체 또는 TCR의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 참여하는 항체 또는 TCR 사슬의 부분을 나타낸다. 그런 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 또는 알파 및 베타 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역으로 불리는 3개의 절편에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 4개의 FR (각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함한다. 각 사슬의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 가깝게 함께 유지되며, 다른 사슬로부터의 초가변 영역은 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., 서열s of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669 참조). 불변 도메인은 항체 또는 TCR의 항원에 대한 결합에 직접 포함되지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체-의존성 세포 독성에 항체의 참여를 나타낸다.
"초가변 영역"은 항원-결합에 기여하는 항체 또는 TCR의 아미노산 잔기를 나타낸다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기들이다.
"항체 단편" 및 "TCR 단편"은 전체 길이 항체 또는 TCR의 부분, 일반적으로 그것의 항원 결합 또는 가변 도메인을 포함한다. 항체 및 TCR 단편의 실례로는, 제한하는 것은 아니지만, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 선형 항체 또는 TCR, 단일-사슬 항체 또는 TCR 분자, 디아바디, 및 항체 또는 TCR 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 또는 TCR을 포함한다.
"단클론성 항체"는 면역 세포의 단일 클론에 의해 합성된 항체 분자를 나타낸다. 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻어지는 대로의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 요구되는 제조로서 해서되지 않아야 한다. 그러므로, 단클론성 항체는 Kohler 및 Milstein (Nature 256:495 (1975); Eur. J. Immunol. 6:511 (1976))에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해, 재조합 DNA 기법에 의해 만들어질 수 있고, 또는 또한 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
"다클론성 항체"는 면역 세포의 집단에 의해 합성된 항체 분자의 집단을 나타낸다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인 또는 TCR의 가변 알파 또는 감마 사슬 (Vα 또는 Vγ) 및 가변 베타 또는 델타 사슬 (Vβ 또는 Vδ) 도메인을 포함하는 항체 또는 TCR 단편을 나타내고, 이때 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 추가로 scFv가 항원 결합에 대한 바람직한 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는 VH 및 VL 도메인 또는 Vα 및 Vβ 도메인 또는 Vγ 및 Vδ 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 포함한다.
"디아바디"는 두 개의 항원-결합 부위를 가진 작은 항체 및/또는 TCR 단편을 나타내고, 그 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL)에서 VL에 연결된 VH 또는 동일한 폴리펩티드 사슬 (Vα-Vβ)에서 Vβ에 연결된 Vα 또는 동일한 폴리펩티드 사슬 (Vγ-Vδ)에서 Vγ에 연결된 Vδ를 포함한다. 동일 사슬에 있는 두 개의 도메인 사이의 쌍을 이루는 것을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보하는 도메인과 쌍을 이루도록 강요되고 두 개의 항원-결합 부위를 생성한다. 예시적인 디아바디는 예를 들면 EP404097 및 WO93111161에 더 전체적으로 기술되어 있다.
"이중특이성 항체" 또는 "이중특이성 TCR"은 항원의 두 가지 상이한 유형에 대한 특이성을 나타내는 항체 또는 TCRDMF 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어는 구체적으로, 제한하는 것은 아니지만, 표적 항원에 대한 및 특정 조직에의 전달을 용이하게 하는 다른 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 항체 및 TCR을 포함한다. 유사하게, 다중-특이성 항체 및 TCR은 둘 이상의 결합 특이성을 가진다.
"선형 항체" 또는 "선형 TCR"은 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 탠덤 Fd 단편의 쌍 (예컨대 VH-CH1-VH-CH1 또는 Vα-Cα1-Vα-Cα1)을 나타낸다. 선형 항체 및 TCR은 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있고, 예를 들면 Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)에 기술된 바와 같다.
"항원-결합 도메인"은 항원에 대해 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 또는 TCR의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 그 용어에 포함된 항체 단편의 비-제한적 실례는, 제한하는 것은 아니지만, (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 일가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화물 가교에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 함유하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 함유하는 Fv 단편; (v) dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544 546); 및 (vi) 분리된 CDR을 포함한다. 이 정의에는 추가로 단일 알파 사슬 또는 단일 베타 사슬을 가진 단일 중쇄 및 단일 경쇄 또는 TCR을 포함하는 항체가 포함된다.
"F(ab')2" 및 "Fab" 모이어티는 Ig를 펩신 및 파파인과 같은 프로테아제로 처리함으로써 생성될 수 있고, 두 개의 중쇄 각각의 힌지 영역 사이에 이미 존재하는 이황화물 결합 가까이에서 면역글로불린을 소화함으로써 생성된 항체 단편을 포함한다. 예를 들어, 파파인은 두 개의 중쇄 각각의 힌지 영역 사이에 이미 존재하는 이황화물 결합의 상류에서 Ig를 절단하여 VL 및 CL로 구성된 경쇄 및 VH 및 CHγ1으로 구성된 중쇄 단편 (중쇄의 불변 영역의 γ1 영역)이 그것들의 C 말단 영역에서 이황화물 결합을 통해 연결되어 있는 두 개의 상동성 항체 단편을 생성한다. 이들 두 개의 상동성 항체 단편의 각각은 'Fab'로 불린다. 펩신은 또한 두 개의 중쇄의 각각의 힌지 영역 사이에 이미 존재하는 이황화물 결합의 하류에서 IgG를 절단하여 두 개의 상기-언급된 'Fab'가 힌지 영역에서 연결되어 있는 단편보다 약간 더 큰 항체 단편을 생성한다. 이 항체 단편은 F('ab')2로 불린다. Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. 'Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에서 소수의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 가지고 있는 Fab'에 대한 표시이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 힌지 시스테인을 Fab' 단편의 쌍 사이에 가지는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 항체 또는 TCR 단편을 나타낸다. 이 영역은 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인 또는 하나의 TCRα 사슬 및 하나의 TCRβ 사슬 또는 하나의 TCRγ 사슬 및 하나의 TCRδ 사슬의 딱 맞는, 비-공유 결합의 이량체로 구성된다. 이 배열에서 각각의 가변 도메인의 세 개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체 또는 Vα-Vβ 이량체 또는 Vγ-Vδ 이량체의 표면의 항원-결합 부위를 규정한다. 포괄적으로, VH 및 VL 사슬 또는 Vα-Vβ 사슬 또는 Vγ-Vδ 사슬의 각각으로부터의 하나 이상의 CDR의 조합은 항체 또는 TCR에 항원-결합 특이성을 부여한다. 예를 들어, 수령체 선택된 항체, TCR의 VH 및 VL 사슬 또는 Vα 및 Vβ 사슬 또는 Vγ-Vδ 사슬에 전달될 때, 또는 그것의 항원-결합 단편 및 CDR의 이 조합이 결합, 친화성 등에 대해 시험될 수 있을 때 예를 들어 CDRH3 및 CDRL3은 항체 또는 TCR에 대한 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있을 것으로 인지될 것이다. 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)조차도, 제2 가변 도메인과 조합될 때 더 낮은 친화성에서로 보이긴 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다. 나아가, 비록 Fv 단편의 두 개의 도메인 (VL 및 VH 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ)이 별도의 유전자에 의해 코드되긴 하지만, 그것들은 VL 및 VH 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 사슬 영역이 일가 분자 (단일 사슬 Fv (scFv)로서 알려져 있음)를 형성하기 위해 쌍을 이룬 단일 단백질 사슬로서 만들어지는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연합될 수 있다 (Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 및 Osbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778). 그런 scFv는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 안에 포함되는 거으로 의도된다. 특이적 scFv의 임의의 VH 및 VL 서열은, 완전한 Ig (예컨대 IgG) 분자 또는 다른 아이소타입을 코드화하는 발현 벡터를 생성하기 위해 Fc 영역 cDNA 또는 게놈 서열에 연결될 수 있다. VH 및 VL은 또한 단백질 화학 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 Ig의 Fab, Fv 또는 다른 단편들의 생성에 사용될 수 있다.
항원-결합 폴리펩티드는 또한 중쇄 이량체, 예컨대 예를 들면 카멜리드 및 상어로부터의 항체를 포함한다. 카멜리드 및 상어 항체들은 V-유사 및 C-유사 도메인 (둘 다 경쇄는 아님)의 두 개의 사슬의 동종이량체 쌍을 포함한다. 카멜리드에서 중쇄 이량체 IgG의 VH 영역이 경쇄와의 소수성 상호작용을 만들지 않기 때문에, 정상적으로 경쇄와 접촉하는 주쇄의 영역은 카멜리드에서 친수성 아미노산 잔기로 바뀐다. 중쇄 이량체 IgG의 VH 도메인은 VHH 도메인으로 불린다. 상어 Ig-NAR은 하나의 가변 도메인 (V-NAR 도메인으로 명명됨) 및 5개의 C-유사 불변 도메인 (C-NAR 도메인)의 동종이량체를 포함한다. 카멜리드에서, 항체 레퍼토리의 다양성은 VH 또는 VHH 영역의 CDR 1, 2 및 3에 의해 결정된다. 카멜 VHH 영역의 CDR3은 평균 16 아미노산의 상대적으로 긴 길이를 특징으로 한다 ((Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7(9):1129).
비-인간 항체 또는 TCR의 "인간화된" 형태는 비-인간 Ig 또는 TCR로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체 또는 TCR을 포함한다. 대부분, 인간화된 항체 또는 TCR은 수령체의 하나 이상의 CDR이 원하는 특이성, 친화성 및 결합 기능을 가지는 비-인간 종 항체 또는 TCR (도너 항체 또는 TCR), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류로부터의 CDR에 의해 대체되어 있는 인간 Ig 또는 TCR (수령체 항체 또는 TCR)이다. 일부 경우에, 인간 Ig 또는 TCR의 하나 이상의 FR 아미노산 잔기는 상응하는 비-인간 아미노산 잔기에 의해 대체된다. 나아가, 인간화된 항체 또는 TCR은 수령체 항체 또는 TCR에서, 또는 도너 항체 또는 TCR에서 발견되지 않는 잔기를 함유할 수 있다. 이들 변형은 필요하다면 항체 또는 TCR 성능을 정제하기 위해 만들어질 수 있다. 인간화된 항체 또는 TCR은 적어도 하나, 및 일부 경우에는 두 개의 가변 도메인을 실직적으로 모두 포함할 수 있고, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-인간 면역글로불린 또는 TCR의 그것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 또는 TCR 서열의 그것이다. 인간화된 항체 또는 TCR은 선택적으로 또한 면역글로불린 또는 TCR 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 적어도 인간 면역글로불린 또는 TCR의 그것을 포함한다. 예컨대 Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)를 참조한다.
"생식계열 서열"은 생식계열로부터의 유전자 서열을 나타낸다 (반수체 생식세포 및 그것이 형성되는 것으로부터의 이배체 세포). 생식계열 DNA는 단일 Ig 중쇄 또는 경쇄, 단일 TCRα 또는 TCRβ 사슬, 또는 사슬 TCRγ 또는 TCRδ 사슬을 코드화하는 다중 유전자 절편을 함유한다. 이들 유전자 절편은 생식 세포에서 운반되지만 그것들이 기능적 유전자로 배열될 때까지 전사 및 번역될 수 없다. 골수에서 B-세포 및 T-세포 분화가 일어나는 동안, 이들 유전자 절편은 108 이상의 특이성을 생성할 수 있는 역동적인 유전자 시스템에 의해 무작위로 셔플링될 수 있다. 이들 유전자 절편의 대부분은 생식계열 데이터베이스에 의해 공개되고 수집된다.
"친화성"은 두 제제의 가역적인 결합에 대한 평형 상수를 나타내고 KD로서 표시된다. 에피토프에 대한 항체의 친화성과 같이 리간드에 대한 결합 단백질의 친화성은 예를 들면 약 100 나노몰 (nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰 (pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 펨토몰 (fM)일 수 있다. 용어 "결합력"은 둘 이사으이 제제의 복합체의 희석 후 분해에 대한 저항을 나타낸다.
"에피토프"는 항체 또는 TCR의 가변 영역 결합 포켓과 결합 상호작용을 형성할 수 있는 항원 또는 다른 거대분자의 부분을 나타낸다. 그런 결합 상호작용은 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자간 접촉으로서 나타날 수 있다. 항원 결합은 예를 들면 CDR3, CDR3 쌍, 일부 경우에는, VH 및 VL 사슬의 6개까지의 모든 CDR의 상호작용을 포함할 수 있다. 에피토프는 선형 펩티드 서열 (즉 "연속적")이거나 비연속적인 아미노산 서열로 구성될 수 있다 (즉 "형태적" 또는 "비연속적"). 항체 또는 TCR은 하나 이상의 아미노산 서열을 인식할 수 있다; 그러므로 에피토프는 하나 이상의 구별되는 아미노산 서열을 규정할 수 있다. 항체 및 TCR에 의해 인식되는 에피토프는 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 펩티드 지도화 및 서열 분석 기법에 의해 측정될 수 있다. 결합 상호작용은 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자간 접촉으로서 나타난다.
"특이적"은 항체 또는 TCR이 그 항체 또는 TCR에 의해 인식된 에피토프를 함유하는 항원 이외의 분자에 어떠한 유의미한 결합을 나타내지 않을 상황을 나타낸다. 이 용어는 또한 예를 들면 항원 결합 도메인이 많은 항원에 의해 운반되는 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에도 적용될 수 있고, 이때 항원 결합 도메인을 운반하는 선택된 항체, TCR 또는 그것들의 항원-결합 단편은 에피토프를 운반하는 다양한 항원에 결합할 수 있다. 용어 "바람직하게 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체, TCR 또는 그것들의 단편이 그것이 관련이 없는 아미노산 서열에 결합하는 것보다 더 큰 친화성으로 에피토프에 결합하는 것을 의미하고, 에피토프를 함유하는 다른 폴리펩티드에 대한 교차-반응성은 그것들이 인간 용도로 투여되기 위해 제형되는 수준에서 독성이 아니어야 한다. 한 측면으로, 그런 친화성은 관련이 없는 아미노산 서열에 대한 항체, TCR 또는 그것들의 단편의 친화성보다 적어도 1-배 더 크거나, 적어도 2-배 더 크거나, 적어도 3-배 더 크거나, 적어도 4-배 더 크거나, 적어도 5-배 더 크거나, 적어도 6-배 더 크거나, 적어도 7-배 더 크거나, 적어도 8-배 더 크거나, 적어도 9-배 더 크거나, 10-배 더 크거나, 적어도 20-배 더 크거나, 적어도 30-배 더 크거나, 적어도 40-배 더 크거나, 적어도 50-배 더 크거나, 적어도 60-배 더 크거나, 적어도 70-배 더 크거나, 적어도 80-배 더 크거나, 적어도 90-배 더 크거나, 적어도 100-배 더 크거나, 또는 적어도 1000-배 더 크다. 용어 "결합"은 두 분자 사이의, 예를 들면 생리적 조건 하에서 공유, 정전기, 소수성 및 이온성 및/또는 수소-결합된 상호작용으로 인한 직접적인 회합을 나타내고, 염 가교 및 물 가교, 뿐만 아니라 임의의 다른 종래의 결합 수단과 같은 상호작용을 포함한다.
"약학적으로 허용되는"은 인간에게 투여될 때 생리적으로 허용되고 전형적으로 배탈, 졸음 등과 같은 알레르기 또는 유사한 부반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 나타낸다.
"단위 용량"은 치료 조성물과 관련하여 사용될 때 인간에 대한 일원화된 단위용량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며, 각각의 단위는 필요한 희석제; 즉 담체, 또는 비히클과 함께 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 정해진 양의 활성 물질을 함유한다.
"패키징 물질"은 키트의 성분들을 하우징하는 물리적 구조를 나타낸다. 패키징 물질은 성분을 멸균적으로 유지할 수 있고 통상적으로 그런 목적에 사용된 물질로 만들어질 수 있다 (예컨대 종이, 골판지, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플 등). 라벨 또는 패키징 삽입물은 적절한 서면 지침을 포함할 수 있다. 그러므로 키트는 추가적으로 발명의 임의의 방법에서 키트 성분들을 사용하기 위한 라벨 또는 지침을 포함할 수 있다. 키트는 본원에 기술된 방법으로 화합물을 투여하기 위해 지침과 함께 팩, 또는 디스펜서에 화합물을 포함할 수 있다.
"방지"는 단백질의 발현 수준과 결합된 또는 단백질 활성과 상관된 질환 또는 장애를 예방, 증상의 개시의 방비, 진행의 방지를 나타낸다.
"억제", "치료" 및 "치료하는"은 상호교환적으로 사용되고, 예를 들면 증상의 정체, 생존의 연장, 증상의 부분적인 또는 완전한 개선, 및 초과 수준의 단백질과 결합된 또는 단백질 활성과 상관된 상태, 질환 또는 장애의 부분적인 또는 완전한 근절을 나타낸다. 예를 들어, 암 치료는, 한정하는 것은 아니지만, 암성 성장 또는 종야의 정체, 부분적인 또는 총 제거를 포함한다. 치료 또는 부분적 제거는 예를 들면 약 2-배, 약 3-배, 약 4-배, 약 5-배, 약 10-배, 약 20-배, 약 50-배, 또는 그 사이의 임의의 배수 감소와 같이 성장 또는 종양 크기 및/또는 부피의 배수 감소를 포함한다. 유사하게, 치료 또는 부분적 제거는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 사이의 임의의 백분율 감소의 성장 또는 종양 크기 및/또는 부피의 퍼센트 감소를 포함할 수 있다.
"중화 항체" 또는 "중화 TCR"은 중화가 이루어지는 메커니즘에 관계없이 바이러스 또는 박테리아와 같은 병원체의 복제를 억제하는 임의의 항체 또는 TCR을 나타낸다.
"항체 레퍼토리" 또는 "TCR 레퍼토리"는 항체, TCR 또는 그것들의 단편의 집합체를 나타낸다. 항체 레퍼토리는 예를 들면, 특정 특성, 예컨대 결합 능력, 결합 특이성, 위장 수송 능력, 안정성, 친화성 등에 대한 특정 항체 또는 스크린의 선택에 사용될 수 있다. 이 용어는 구체적으로, 모든 형태의 조합 라이브러리, 예컨대 예를 들면 제한 없이, 나이브, 합성 및 반-합성 라이브러리를 포함하여, 임의의 공급원으로부터의 단일 사슬 Fv (scFv) 및 Fab 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여, 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여 항체 및 TCR 라이브러리를 포함한다.
"표적 핵산 분자", "표적 분자", "표적 폴리뉴클레오티드," "표적 폴리뉴클레오티드 분자"는 관심의 임의의 핵산을 나타낸다.
중합효소 사슬 반응 (PCR)은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 상보하는 가닥의 동시의 프라이머 연장에 의한 폴리뉴클레오티드의 시험관 내 증폭 반응을 나타낸다. PCR 반응은 프라이머 결합 부위가 양 옆에 있는 주형 폴리뉴클레오티드의 복사물을 생성한다. 두 개의 프라이머를 사용한 그 결과는, 각 사이클로 두 가닥이 복제되기 때문에 각 사이클을 사용한 두 가닥의 주형 폴리뉴클레오티드 복사 수의 지수적 증가이다. 폴리뉴클레오티드 듀플렉스는 사용된 프라이머의 단부에 상응하는 말단을 가진다. PCR은 주형 폴리뉴클레오티드 변성의 1회 이상의 반복, 프라이머 결합 부위에 대한 아닐링 프라이머, 및 뉴클레오티드의 존재하에 DNA 또는 RNA 중합효소에 의한 프라이머의 연장을 포함할 수 있다. 특정 온도, 각 단계에서의 기간, 및 단계들 사이의 변화율은 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있는 많은 인자들에 좌우된다 (McPherson et al., IRL Press, Oxford (1991 및 1995)). 예를 들어, Taq DNA 중합효소를 사용하는 종래의 PCR에서, 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 >90℃의 온도에서 변성될 수 있고, 프라이머는 50 내지 75℃의 범위의 온도에서 아닐링될 수 있으며, 프라이먼, 72 내지 78℃의 범위의 온도에서 연장될 수 있다. 일부 구체예에서, PCR은 역전사 PCR (RT-PCR), 실시간 PCR, 네스티드 (nested) PCR, 정량 PCR, 다중화된 PCR 등을 포함한다. 일부 구체예에서, PCR은 RT-PCR을 포함하지 않는다 (미국 특허 번호 5,168,038, 5,210,015, 6,174,670, 6,569,627, 및 5,925,517; Mackay et al., Nucleic Acids Research, 30:1292-1305 (2002)). RT-PCR은 역전사 반응이 선행되는 PCR 반응을 포함하고 그 결과의 cDNA는 증폭되며, 네스티드 PCR은 제1 세트의 프라이머를 사용한 제1 PCR 반응의 암플리콘이 제2 프라이머 세트를 사용하는 제2 PCR 반응에 대한 샘플이 되고, 그중 적어도 하나는 제1 PCR 반응의 암플리콘의 내부 위치에 결합하는 2-단계 PCR을 포함한다. 다중화된 PCR은 복수의 폴리뉴클레오티드 서열이 동일한 반응 혼합물에서 동시에 PCR 반응을 수행받는 PCR 반응을 포함한다. PCR 반응 부피는 어느 곳에서든지 0.2 pL 내지 1000 μL일 수 있다. 정량 PCR은 샘플의 하나 이상의 서열의 절대 또는 상대량, 풍부함, 또는 농도를 측정하기 위해 디자인된 PCR 반응을 포함한다. 정량적 측정은 관심의 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 하나 이상의 참조 서열 또는 표준을 비교하는 것을 포함한다. (Freeman et al., Biotechniques, 26:112-126 (1999); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17:9437-9447 (1989); Zimmerman et al., Biotechniques, 21:268-279 (1996); Diviacco et al., Gene, 122:3013-3020 (1992); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17:9437-9446 (1989)).
다른 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 키트 및 조성물은 지지체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법, 키트 및 조성물은 지지체를 포함하지 않는다. 전형적으로, 고체 지지체는 하나 이상의 단단한 또는 반-단단한 표면을 포함하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 일부 구체예에서, 지지체는 비-고체 지지체이다. 지지체 또는 기질은 멤브레인, 종이, 플라스틱, 코팅된 표면, 평평한 표면, 유리, 슬라이드, 칩 또는 그것의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지지체의 하나 이상의 표면은 실질적으로 평평하지만, 일부 구체예에서는 예를 들어 웰, 높은 영역, 핀, 날카로운 트렝티 등을 가진 상이한 화합물에 대해 합성 영역을 물리적으로 구별하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 비드, 수지, 겔, 마이크로스피어 또는 다른 기하학적 배열을 포함한다. 다르게는, 고체 지지체는 실리카 칩, 마이크로입자, 나노입자, 플레이트, 및 어레이를 포함할 수 있다. 고체 지지체는 마이크로웰에서 자체-조립되는 비드의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 Illumina's BeadArray Technology를 포함한다. 다르게는, 고체 지지체는 Abbott Molecular's Bead Array technology, 및 Applied Microarray's FlexiPlexTM 시스템을 포함한다. 다른 경우에, 고체 지지체는 플레이트이다. 플레이트의 실례로는, 제한하는 것은 아니지만, MSD 멀티-어레이 플레이트, MSD Multi-Spot® 플레이트, 마이크로플레이트, ProteOn 마이크로플레이트, 알파플레이트, DELFIA 플레이트, IsoPlate, 및 LumaPlate를 포함한다. 일부 구체예에서, 지지체는 복수의 비드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지지체는 어레이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지지체는유리 슬라이드를 포함할 수 있다. 방법, 기질 및 기법은 중합체에 적용할 수 있다 (미국 특허 번호 5,744,305, 5,143,854, 5,242,974, 5,252,743, 5,324,633, 5,384,261, 5,405,783, 5,424,186, 5,451,683, 5,482,867, 5,491,074, 5,527,681, 5,550,215, 5,571,639, 5,578,832, 5,593,839, 5,599,695, 5,624,711, 5,631,734, 5,795,716, 5,831,070, 5,837,832, 5,856,101, 5,858,659, 5,936,324, 5,968,740, 5,974,164, 5,981,185, 5,981,956, 6,025,601, 6,033,860, 6,040,193, 6,090,555, 6,136,269, 6,269,846 및 6,428,752; 미국 특허 공개공보 번호 20090149340, 20080038559, 20050074787; 및 PCT 공개 번호 WO 00/58516, WO 99/36760, 및 WO 01/58593). 지지체에 대한 폴리뉴클레오티드의 부착은 아민-티올 교차결합, 말레이미드 교차결합, N-하이드록시석신이미드 또는 N-하이드록시설포석신이미드, 제논 (Zenon) 또는 사이트클릭 (SiteClick)을 포함할 수 있다. 표지된 핵산을 지지체에 부착시키는 것은 복수의 폴리뉴클레오티드에 대한 비오틴의 부착 및 하나 이상의 비드를 스트렙트아비딘으로 코팅하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 비드이다. 비드의 실례는, 제한하는 것은 아니지만, 스트렙트아비딘 비드, 아가로오스 비드, 자기 비드, Dynabeads®, MACS® 마이크로비드, 항체 컨쥬게이트된 비드 (예컨대 항-면역글로불린 마이크로비드), 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 폴리뉴클레오티드 dT 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 마이크로비드, 항-플루오로크롬 마이크로비드, 및 BcMagTM 카르복시-달단 자기 비드를 포함한다. 비드의 직경은 약 5 μm, 10 μm, 20 μm, 25 μm, 30 μm, 35 μm, 40 μm, 45 μm 또는 50 μm일수 있다. 고체 지지체는 어레이 또는 마이크로어레이일 수 있다. 고체 지지체는 별개의 영역을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 어레이, 예컨대 다룰 수 있는 어레이일 수 있다.
본원에 사용된 "뉴클레오티드", "뉴클레오시드", "뉴클레오티드 잔기" 및 "뉴클레오시드 잔기"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 잔기, 또는 증폭 반응 (예컨대 PCR 반응)에서 사용하기에 적합한 프라이머의 성분으로서 작용할 수 있는 다른 유사한 뉴클레오시드 유사체를 의미할 수 있다. 그런 뉴클레오시드 및 그것의 유도체는 표시된 다른 경우를 제외하고, 본원에 기술된 프라이머의 빌딩 블록으로서 사용될 수 있다. 본 출원에서는 어느 것도 증폭 반응에서 안정성 또는 유용성을 증대시키기 위해 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 유도체 또는 염기의 활용을 제외시키는 것을 의미하지는 않고, 단 화학적 변형은 필요에 따라 중합효소에 의해 데옥시구아닌, 데옥시시토신, 데옥시티미딘 또는 데옥시아데닌으로서 인식하는 것을 간섭하지 않는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 유사체는 하이브리드 형성을 안정화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 유사체는 하이브리드 형성을 탈안정화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 유사체는 혼성화 특이성을 증대시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 유사체는 혼성화 특이성을 감소시킬 수 있다.
"핵산", 또는 문법적 동등물은 단일 뉴클레오티드 또는 함께 공유 연결된 적어도 두 개의 뉴클레오티드를 나타낸다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 문법적 동등물은 함께 공유 연결된 적어도 두 개의 뉴클레오티드를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 둘 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 분자를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 펩티드 핵산 (PNA) 중 어느 것이든, 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 뉴클레오티드 염기의 다른 천연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도체를 포함하는, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 골격은 당 및 포스페이트 기, 또는 변형된 또는 치환된 당 또는 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 방해될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 다른 분자, 예컨대 다른 혼성화된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 또는 둘 다의 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 비-제한적 실례는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 유전자간 DNA (제한 없이, 이종이량체 DNA), 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, 작은 간섭 RNA (siRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 서열의 분리된 DNA, 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 천연 공급원, 재조합체로부터 분리되거나 또는 인공적으로 합성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 특정 서열의 4가지 뉴클레오티드 염기: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 및 티민 (T) (폴리뉴클레오티드가 RNA일 때 티민 (T) 대신 우라실 (U))을 포함한다. 그러므로, 폴리뉴클레오티드 서열이 알파벳상 폴리뉴클레오티드 분자를 나타낸다; 다르게는, 이 용어는 폴리뉴클레오티드 자체에 적용될 수 있다. 이 알파벳상의 표시는 중심 프로세싱 장치를 가지는 컴퓨터에서 데이터베이스로 입력될 수 있고 기능적 유전체학, 상동성 연구, 서열 비닝, 서열 배열 및 공통 서열 측정과 같은 생체정보학 용도에 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 비가닥 뉴클레오티드, 예컨대 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 비가닥 뉴클레오티드는 하이브리드 형성을 안정화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 비가닥 뉴클레오티드는 하이브리드 형성을 탈안정화시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 비가닥 뉴클레오티드는 혼성화 특이성을 증대시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 비가닥 뉴클레오티드는 혼성화 특이성을 감소시킬 수 있다. 비가닥 뉴클레오티드 변형의 실례는 2' O-Me, 2' O-알릴, 2' O-프로파르길, 2' O-알킬, 2' 플루오로, 2' 아라비노, 2' 자일로, 2' 플루오로 아라비노, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로아미데이트, 2' 아미노, 5-알킬-치환된 피리미딘, 3' 데옥시구아노신, 5-할로-치환된 피리미딘, 알킬-치환된 퓨린, 할로-치환된 퓨린, 이중고리형 뉴클레오티드, 2'MOE, PNA 분자, LNA-분자, LNA-유사 분자, 다이아미노퓨린, S2T, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 다이하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-아이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸 구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-D46-아이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 위부톡소신 (wybutoxosine), 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시 아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w, 2,6-다이아미노퓨린, 및 그것들의 유도체를 포함한다.
"대상", "개체", "숙주" 또는 "환자"는 포유류와 같은 살아있는 유기체를 나타낸다. 대상 및 숙주의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 말, 소, 카멜, 양, 돼지, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니아 피그, 래트, 마우스 (예컨대 인간화된 마우스), 게르빌루스 쥐, 비-인간 영장류 (예컨대 마카크 원숭이), 인간 등, 비-포유류, 이를테면 예컨대 비-포유류 척추동물, 예컨대 조류 (예컨대 닭 또는 오리), 어류 (예컨대 상어) 또는 개구리류 (예컨대 제노푸스), 및 비-포유류 무척추동물, 뿐만 아니라 그것들의 유전자 도입 종들을 포함한다. 특정 측면으로, 대상은 단일 유기체 (예컨대 인간)를 나타낸다. 특정 측면으로, 또는 연구 및/또는 질환에 대한 공통 면역 인자를 가지는 작은 집단, 및/또는 질환이 없는 개체 집단 (예컨대 네거티브/정상 대조표준)을 구성하는 개체의 그룹이 제공된다. 샘플이 얻어지는 대상은 질환 및/또는 장애 (예컨대 하나 이상의 알레르기, 감염, 암 또는 자가면역 장애 등)로 피해를 입을 수 있고 질환에 의해 영향을 받지 않는 네거티브 대조 대상에 대해 비교될 수 있다.
"키트"는 본원에 개시된 방법을 수행하기 위한 물질 또는 시약을 전달하기 위한 전달 시스템을 나타낸다. 일부 구체예에서, 키트는 반응 시약 (예컨대 적절한 용기의 프로브, 효소 등) 및/또는 지지 물질 (예컨대 완충액, 분석을 수행하기 위한 서면 지침 등)을 한 위치에서 다른 위치로 보관, 수송 또는 전달을 허용하는 시스템을 포함한다. 예를 들어, 키트는 관련된 반응 시약 및/또는 지지 물질을 함유하는 하나 이상의 인클로저 (enclosure)를 포함한다. 그런 내용물은 의도된 수령체에 함께 또는 별도로 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 용기는 분석에 사용하기 위한 효소를 함유할 수 있는 한편, 제2 용기는 복수의 프라이머를 함유한다.
"폴리펩티드"는 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 분자를 나타낸다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 단일 펩티드로 구성된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 둘 이사으이 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 펩티드 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 실례로는, 제한하는 것은 아니지만, 아미노산 사슬, 단백질, 펩티드, 호르몬, 폴리펩티드 당류, 지질, 당지질, 인지질, 항체, 효소, 키나아제, 수용체, 전사 인자 및 리간드를 포함한다.
"샘플"은 생물학적, 환경적, 의학적, 대상의, 또는 환자의 샘플 또는 표적 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드를 함유하는 샘플을 나타낸다.
샘플
폴리뉴클레오티드를 함유하는 생물학적 샘플은 본원에 기술되는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 RNA 또는 DNA를 함유하는 대상으로부터의 생물학적 샘플일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 생물학적 샘플로부터 추출되거나, 또는 샘플은 폴리뉴클레오티드의 추출 또는 정제 없이 방법에 직접적인 대상이 될 수 있다. 샘플은 추출될 수 있거나 분리된 DNA 또는 RNA일 수 있다. 샘플은 또한 생물학적 시편으로부터 추출된 총 RNA 또는 DNA, cDNA 라이브러라. 바이러스 또는 게놈 DNA일 수 있다. 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 다양한 다른 성분, 예컨대 단백질, 지질 및 비-주형 핵산을 함유하는 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있다. 핵산 주형 분자는 동물, 식물, 박테리아, 진균 또는 임의의 다른 세포 유기체로부터 얻어지는 임의의 세포 물질로부터 얻어질 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단일 세포로부터 얻어진다. 폴리뉴클레오티드는 유기체로부터 직접 또는 유기체로부터 얻어진 생물학적 샘플로부터 얻어질 수 있다. 임의의 조직 또는 유체 시편은 발명에서 사용하기 위한 핵산에 대한 공급원으로서 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 배양된 세포, 예컨대 일차 세포 배양 또는 세포주로부터 분리될 수 있다. 주형 핵산이 얻어지는 세포 또는 조직은 바이러스 또는 다른 세포내 병원체로 감염될 수 있다.
특정 구체예에서, 항체 또는 TCR-생성 면역 세포는 잠재적인 임상적 중요성의 병원체-, 종양-, 및/또는 질환 특이적 항체 또는 TCR을 확인하기 위하여 대상 또는 숙주, 예컨대 인간 또는 다른 동물, 예컨대 면역화되어 있는 또는 감염, 암, 자가면역 상태, 또는 임의의 다른 질환에 걸려 있는 인간 또는 다른 동물의 혈액 또는 다른 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 인간은 질환으로 진단되거나, 질환의 증상을 나타내거나, 질환으로 진단되지 않거나, 또는 질환의 증상을 나타내지 않을 수 있다. 예를 들어, 인간은 감염제 (예컨대 바이러스, 박테리아, 기생충, 프리온 등), 항원, 또는 질환에 대해 노출되었거나 및/또는 그것들에 대해 유용한 항체 또는 TCR을 만들 수 있는 인간일 수 있다. 예를 들어, 동물은 감염제 (예컨대 바이러스, 박테리아, 기생충, 프리온 등), 항원, 또는 질환에 대해 노출되었거나 및/또는 그것들에 대해 유용한 항체 또는 TCR을 만들 수 있는 동물 수 있다. 면역화된 숙주로부터의 특정 면역 세포는 의문의 하나 이상의 표적 항원 및/또는 하나 이상의 미지의 항원에 대한 항체 또는 TCR을 만든다. 본 발명에서 림프구 푸울은 적합한 임의의 방법, 예컨대 형광-활성화 세포 분류 (FACS), 자기 활성화된 세포 분류 (MACS), 패닝 또는 샘플, 예컨대 면역 세포 라이브러리로부터 복수의 면역 세포를 생성하기 위한 다른 스크리닝 방법을 사용하는 세포의 스크리닝 및 분류에 의해, 항체 사슬이 서열결정되거나, 항체가 만들어지거나, 또는 발현 라이브러리(들)이 만들어지기 전에, 원하는 면역 세포에 대해 풍부해질 수 있다. 상이한 항체를 발현하는 단지 소수의 하위세트, 및 따라서 가변 도메인의 단지 소수의 자연적으로 발생하는 조합을 제공하는 선행 기술 풍부화 방법과 대조적으로, 본 발명의 면역 세포 라이브러리는 상이한 항체 또는 TCR을 발현하는 면역 세포의 적어도 2 하위세트 또는 개별적인 면역 세포를 함유한다. 예를 들어, 본 발명의 면역 세포 라이브러리는 상이한 항체 또는 TCR을 발현하는 면역 세포의 적어도 5, 10, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 10000, 25000, 50000, 75000, 10000, 250000, 500000, 750000, 1000000, 2500000, 5000000, 7500000, 또는 10000000 하위세트 또는 개별적인 면역 세포를 함유한다. 본 발명의 방법은 면역 세포 회수를 최대화하고, 매우 높은 다양성을 제공한다.
일부 구체예에서, 비-면역된 인간 또는 비-인간 도너로부터의 면역 세포가 활용된다. 동물의 나이브 레퍼토리 (항원 도전 전의 레퍼토리)는 중간 정도의 친화성 (약 1x10-6 내지 1x10-7 M의 KA)으로 본질적으로 임의의 비-자체 분자와 결합할 수 있는 항체 또는 TCR을 가진 동물을 제공한다. 항체 또는 TCR 결합 부위의 서열 다양성은 직접적으로 생식계열에 의해 코드화되지는 않지만 V 유전자 절편으로부터 조합적인 방식으로 조립된다. 면역화는 임의의 면역 세포가 면역원에 결합하여 증식시키고 (클론성 팽창) 상응하는 항체를 상기 주지된 바와 같이 분비하는 VH-VL 또는 Vα-Vβ 또는 Vγ-Vδ 조합을 만들도록 촉발시킨다. 그러나, 면역화되지 않은 대상으로부터의 비장 세포 및/또는 면역 세포 또는 다른 말초혈 림프구 (PBL)는 가능한 항체 또는 TCR 레퍼토리의 더 좋은 표현을 제공할 수 있고, 또한 임의의 동물 종을 사용하여 후속적인 B-세포 또는 T-세포 항체 또는 TCR 라이브러리의 제조를 허용한다.
일부 경우에, 시험하기에 충분한 핵산을 얻기 위해 적어도 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 mL의 혈액 부피가 채혈된다.
일부 경우에, 출발 물질은 말초혈이다. 말초혈 세포는 특정 세포 유형에 대해 풍부해질 수 있다 (예컨대 단핵 세포; 적혈구; CD4+ 세포; CD8+ 세포; 면역 세포; T 세포; NK 세포 등). 말초혈 세포는 또한 선택적으로 특정 세포 유형이 고갈될 수 있다 (예컨대 단핵 세포; 적혈구; CD4+ 세포; CD8+ 세포; 면역 세포; T 세포; NK 세포 등).
일부 경우에, 출발 물질은, 예를 들어 비-제한적으로 뇌, 간, 폐, 신장, 전립선, 난소, 비장, 림프절 (편도선을 포함함), 갑상선, 췌장, 심장, 골격근, 장, 후두, 식도 및 위를 포함한 고체 조직을 포함하여 조직 샘플일 수 있다. 다른 경우에, 출발 물질은 핵산, 면역 세포, 및 특히 B-세포 또는 T-세포를 함유하는 세포일 수 있다. 일부 경우에, 출발 물질은 임의의 유기체로부터의, 핵산을 함유하는 샘플일 수 있고, 그것으로부터 유전자 물질이 얻어질 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 유체, 예컨대 혈액, 타액, 림프액 또는 뇨일 수 있다.
샘플은 상태를 가진 대상으로부터 채취될 수 있다. 일부 경우에, 샘플이 취해지는 대상은 환자, 예를 들면 암환자 또는 암에 걸린 것으로 추정되는 환자일 수 있다. 대상은 포유류, 예컨대 인간일 수 있고, 남성 또는 여성일 수 있다. 일부 경우에, 여성은 임신중이다. 샘플은 종양 생검일 수 있다. 생검은 예를 들면, 건강 관리 제공자, 의사, 진료 보조 인력, 간호사, 수의사, 치과의사, 척추 지압사, 긴급 의료원, 피부과 전문의, 종양학자, 위장병학자 또는 외과의사에 의해 수행될 수 있다.
일부 경우에, 비-핵산 물질은 출발 물질로부터 효소적 처리 (예컨대 프로테아제 소화)를 사용하여 제거될 수 있다.
일부 경우에, 혈액은 제한하는 것은 아니지만, EDTA를 포함하여 마그네슘 킬레이터를 함유하는 장치로 수집될 수 있고, 4℃에서 보관된다. 선택적으로, 칼슘 킬레이터, 이를테면 한정하는 것은 아니지만 EGTA가 첨가될 수 있다. 다른 경우에, 세포 용해 억제제, 이를테면 한정하는 것은 아니지만 포름알데하이드, 포름알데하이드 유도체, 포르말린, 글루타르알데하이드, 글루타르알데하이드 유도체, 단백질 교차-링커, 핵산 교차-링커, 단백질 및 핵산 교차-링커, 일차 아민 반응성 교차링커, 설프하이드릴 반응성 교차링커, 설프하이드릴 첨가 또는 이황화물 환원, 탄수화물 반응성 교차링커, 카르복실 반응성 교차링커, 광반응성 교차링커 또는 절단 가능한 교차링커가 혈액에 첨가된다.
추출된 물질이 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 RNA 또는 DNA-RNA 하이브리드를 포함하는 일부 경우에, 이들 분자는 기술분야에 공지된 기법을 사용하여 이중-가닥 DNA로 전환될 수 있다. 예를 들어, 역전사효소가 RNA 분자로부터 DNA를 합성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, RNA의 DNA로의 전환은 링커 단편을 RNA에 결찰시키고, 그로써 역전사를 개시하기 위해 보편적인 프라이머의 사용을 허용하기 위해 사전 결찰 단계를 필요로 할 수 있다. 다른 경우에, 예를 들어 mRNA 분자의 폴리-A 꼬리표표가 역전사를 개시하기 위해 사용될 수 있다. DNA로의 전환에 이어서, 본원에 기술된 방법이, 일부 경우에 원하는 서열을 추가로 포획하고, 선택하고, 꼬리표표를 붙이고, 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다.
핵산 분자는 데옥시리보핵산 (DNA) 및/또는 리보핵산 (RNA)을 포함한다. 핵산 분자는 합성이거나 또는 자연적으로 발생하는 공급원으로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, 핵산 분자는 다양한 다른 성분들, 예컨대 단백질, 지질 및 비-주형 핵산을 함유하고 있는 생물학적 샘플로부터 분리된다. 핵산 주형 분자는 동물, 식물, 박테리아, 진균, 또는 임의의 다른 세포 유기체로부터 얻어진, 임의의 세포 물질로부터 얻어질 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산 분자는 단일 세포로부터 얻어진다. 본 발명에 사용하기 위한 생물학적 샘플은 바이러스 입자 또는 제제를 포함한다. 핵산 분자는 직접 유기체로부터 또는 유기체로부터 얻어진 생물학적 샘플, 예컨대 혈액, 뇨, 뇌척수액, 정액, 타액, 가래, 대변 및 조직으로부터 얻어질 수 있다. 임의의 조직 또는 체액 시편이 발명에 사용하기 위한 핵산에 대한 공급원으로서 사용될 수 있다. 핵산 분자는 또한 배양된 세포, 예컨대 일차 세포 배양 또는 세포주로부터 분리될 수 있다. 주형 핵산이 얻어지는 세포 또는 조직은 바이러스 또는 다른 세포내 병원체로 감염될 수 있다.
샘플은 또한 생물학적 시편으로부터 추출된 총 RNA, cDNA 라이브러리, 바이러스 또는 게놈 DNA일 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산 분자는 단백질, 효소, 기질, 항체, 결합제, 비드, 작은 분자, 펩티드 또는 다른 임의의 분자와 같은 다른 표적 분자에 결합된다. 일반적으로, 핵산은 생물학적 샘플로부터 Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제3 Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)에 기술된 것들과 같은 다양한 기법에 의해 추출될 수 있다. 핵산 분자는 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 단일-가닥 영역 (예를 들면 줄기- 및 루프-구조)을 가진 이중-가닥일 수 있다.
DNA 추출 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 고전적인 DNA 분리 프로토콜은 페놀과 클로로포름의 혼합물과 같은 유기 용매를 사용한 추출과, 이어서 에탄올을 사용한 침전을 기반으로 한다 (J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 1989, 2nd Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, N.Y.). 다른 방법을 다름을 포함한다: 탈염 DNA 추출 (P. Sunnucks et al., Genetics, 1996, 144:747-756; S. M. Aljanabi et al., Nucl. Acids Res. 1997, 25:4692-4693), 트라이메틸암모늄 브로마이드 염 DNA 추출 (S. Gustincich et al., BioTechniques, 1991, 11:298-302) 및 구아니디늄 티오시아네이트 DNA 추출 (J. B. W. Hammond et al., Biochemistry, 1996, 240:298-300). 다양한 키트가 생물학적 샘플로부터 DNA를 추출하는데 상업적으로 활용된다 (예컨대 BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA): Epicentre Technologies (Madison, WI); Gentra Systems, Inc. (Minneapolis, MN); MicroProbe Corp. (Bothell, WA); Organon Teknika (Durham, NC); 및 Qiagen Inc. (Valencia, CA)).
RNA 추출 방법 또한 기술분야에 잘 알려져 있고 (예컨대 J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 1989, 211d Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York) 신체 유체로부터의 RNA 추출을 위한 키트는 상업적으로 활용가능하다 (예컨대 Ambion, Inc. (Austin, TX); Amersham Biosciences (Piscataway, NJ); BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA); BioRad Laboratories (Hercules, CA); Dynal Biotech Inc. (Lake Success, NY); Epicentre Technologies (Madison, WI); Gentra Systems, Inc. (Minneapolis, MN); GIBCO BRL (Gaithersburg, MD); Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA); MicroProbe Corp. (Bothell, WA); Organon Teknika (Durham, NC); Promega, Inc. (Madison, WI); 및 Qiagen Inc. (Valencia, CA)).
하나 이상의 샘플은 하나 이상의 공급원으로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 샘플은 둘 이상의 공급원으로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 대상으로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 샘플은 둘 이상의 대상으로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 대상은 동일한 종으로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 대상은 상이한 종으로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 대상은 건강할 수 있다. 하나 이상의 대상은 질환, 장애 또는 상태에 영향을 받을 수 있다.
일부 구체예에서, 샘플은 유체, 예컨대 혈액, 타액, 림프액, 뇨, 뇌척수액, 정액, 가래, 대변 또는 조직 균등물이다.
샘플은 상태를 가진 대상으로부터 채취될 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플이 취해지는 대상은 환자, 예를 들면 암환자 또는 암에 걸린 것으로 추정되는 환자일 수 있다. 대상은 포유류, 예컨대 인간일 수 있고, 남성 또는 여성일 수 있다. 일부 구체예에서, 여성은 임신중이다. 샘플은 종양 생검일 수 있다. 생검은 예를 들면, 건강 관리 제공자, 의사, 진료 보조 인력, 간호사, 수의사, 치과의사, 척추 지압사, 긴급 의료원, 피부과 전문의, 종양학자, 위장병학자 또는 외과의사에 의해 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단백질, 효소, 기질, 항체, 결합제, 비드, 작은 분자, 펩티드 또는 임의의 다른 분자와 같은 다른 표적 분자에 결합된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체에 결합되지 않는다. 핵산은 생물학적 샘플로부터 다양한 기법 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제3 Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001))에 의해 추출될 수 있다.
일부 구체예에서, 샘플은 타액이다. 일부 구체예에서, 샘플은 전혈이다. 일부 구체예에서, 충분한 양의 시험용 폴리뉴클레오티드를 얻기 위하여, 적어도 약 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 mL의 혈액 부피가 채혈된다. 일부 구체예에서, 혈액은 제한하는 것은 아니지만, EDTA를 포함하는 마그네슘 킬레이터를 함유하는 장치로 수집될 수 있고, 4℃에서 보관된다. 선택적으로, 제한하는 것은 아니지만 EGTA를 포함하는, 칼슘 킬레이터가 첨가될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포 용해 억제제, 이를테면 한정하는 것은 아니지만 포름알데하이드, 포름알데하이드 유도체, 포르말린, 글루타르알데하이드, 글루타르알데하이드 유도체, 단백질 교차-링커, 핵산 교차-링커, 단백질 및 핵산 교차-링커, 일차 아민 반응성 교차링커, 설프하이드릴 반응성 교차링커, 설프하이드릴 첨가 또는 이황화물 환원, 탄수화물 반응성 교차링커, 카르복실 반응성 교차링커, 광반응성 교차링커 또는 절단 가능한 교차링커가 혈액에 첨가된다. 일부 구체예에서, 비-핵산 물질이 출발 물질로부터 효소적 처리 (예컨대 프로테아제 소화)를 사용하여 제거될 수 있다.
복수의 샘플은 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 또는 그 이상의 샘플을 포함할 수 있다. 복수의 샘플은 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 또는 그 이상의 샘플을 포함할 수 있다. 복수의 샘플은 적어도 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 샘플, 9000, 또는 10,000 샘플, 또는 100,000 샘플 또는 1,000,000 또는 그 이상의 샘플을 포함할 수 있다. 복수의 샘플은 적어도 약 10,000 샘플을 포함할 수 있다.
제1 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 제2 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드와 상이할 수 있다. 제1 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 복수의 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드와 상이할 수 있다. 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플 중의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만의 뉴클레오티드 또는 염기쌍이 상이할 수 있다. 복수의 샘플 중 하나 이상의 샘플의 복수의 폴리뉴클레오티드는 둘 이상의 동일한 서열을 포함할 수 있다. 복수의 샘플 중 하나 이상의 샘플의 총 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 동일한 서열을 포함할 수 있다. 복수의 샘플 중 하나 이상의 샘플의 복수의 폴리뉴클레오티드는 적어도 2개의 상이한 서열을 포함할 수 있다. 복수의 샘플 중 하나 이상의 샘플의 총 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 5%, 10 %, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%가 적어도 2개의 상이한 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 서로의 변이체이다. 예를 들어, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드 다형태 또는 다른 유형의 돌연변이를 함유할 수 있다. 다른 실례에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 스플라이스 변이체이다.
제1 샘플은 하나 이상의 세포를 포함할 수 있고 제2 샘플은 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 제1 샘플의 하나 이상의 세포는 제2 샘플의 하나 이상의 세포와 동일한 유형의 세포일 수 있다. 제1 샘플의 하나 이상의 세포는 복수의 샘플의 하나 이상의 상이한 세포와 상이한 유형의 세포일 수 있다.
복수의 샘플은 함께 얻어질 수 있다. 복수의 샘플은 동시에 얻어질 수 있다. 복수의 샘플은 순차적으로 얻어질 수 있다. 복수의 샘플은 수년의 과정으로, 예컨대 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 100년, 10년, 5년, 4년, 3년, 2년 또는 1년의 과정으로 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 약 1년 이내에 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 12 개월, 11 개월, 10 개월, 9 개월, 8 개월, 7 개월, 6 개월, 4 개월, 3 개월, 2 개월 또는 1 개월 내에 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 30 일, 28 일, 26 일, 24 일, 21 일, 20 일, 18 일, 17 일, 16 일, 15 일, 14 일, 13 일, 12 일, 11 일, 10 일, 9 일, 8 일, 7 일, 6 일, 5 일, 4 일, 3 일, 2 일 또는 1 일 내에 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 약 24 시간, 22 시간, 20 시간, 18 시간, 16 시간, 14 시간, 12 시간, 10 시간, 8 시간, 6 시간, 4 시간, 2 시간 또는 1 시간 내에 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 약 60 초, 45 초, 30 초, 20 초, 10 초, 5 초, 2 초 또는 1 초 내에 얻어질 수 있다. 하나 이상의 샘플은 하나 이상의 상이한 샘플을 얻는 1초 미만 내에 얻어질 수 있다.
샘플의 상이한 폴리뉴클레오티드는 상이한 농도 또는 양 (예컨대 상이한 수의 분자)으로 샘플에 존재할 수 있다. 예를 들어, 한 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양은 샘플 중의 다른 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양보다 클 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플 중의 적어도 한 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양은 그 샘플 중의 적어도 하나의 다른 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양보다 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000배, 또는 그 이상으로 더 크다. 다른 실례에서, 한 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양은 그 샘플 중의 다른 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양보다 적다. 샘플 중의 적어도 한 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양은 그 샘플 중의 적어도 하나의 다른 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양보다 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000배, 또는 그 이상 적다.
일부 구체예에서, 둘 이상의 샘플은 상이한 양 또는 농도의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 한 샘플 중의 한 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양은 상이한 샘플 중의 동일한 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양보다 클 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플은 뇨 샘플보다 더 높은 양의 특정 폴리뉴클레오티드를 함유할 것이다. 다르게는, 단일 샘플은 둘 이상의 하위샘플로 나누어질 수 있다. 하위샘플은 상이한 양 또는 농도의 동일 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 한 샘플 중의 적어도 한 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양은 다른 샘플 중의 동일 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양보다 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000배 또는 그 이상 더 클 수 있다. 다르게는, 한 샘플 중의 한 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양은 상이한 샘플 중의 동일 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양보다 적을 수 있다. 예를 들어, 한 샘플 중의 적어도 한 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양은 다른 샘플 중의 동일 폴리뉴클레오티드의 농도 또는 양보다 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000배 또는 그 이상 더 적을 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드
일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 표적 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 세포로부터의 폴리뉴클레오티드 분자의 증폭 및 서열결정에 대해 지시된다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 표적 폴리뉴클레오티드 분자의 둘 이상의 영역의 증폭 및 서열결정에 대해 지시된다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 둘 이상의 표적 폴리뉴클레오티드 분자의 증폭 및 서열결정에 대해 지시된다. 한 측면으로, 표적 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 한 측면으로, 표적 폴리뉴클레오티드는 게놈 핵산이다. 특정 유기체의 염색체의 유전자 물질로부터 유도된 DNA는 게놈 DNA이다. 바람직한 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 면역 세포에 의해 생성된 항체 또는 TCR의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 면역 세포에 의해 생성된 항체의 중쇄의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 면역 세포에 의해 생성된 항체의 경쇄의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 면역 세포에 의해 생성된 TCR의 알파 사슬의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 면역 세포에 의해 생성된 TCR의 베타 사슬의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 면역 세포에 의해 생성된 TCR의 감마 사슬의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 면역 세포에 의해 생성된 TCR의 델타 사슬의 가변 영역을 포함하는 서열을 포함한다.
표적 폴리뉴클레오티드는 실제로 임의의 공급원으로부터 얻어질 수 있고 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해, 제한 없이 유기체 또는 세포 (예컨대 면역 세포)로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 추출하는 것을 포함하여, 직접 증폭 없이 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 또한 역전사-PCR을 통하여 RNA (예컨대 mRNA)로부터 생성된 cDNA를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 mRNA 분자 또는 mRNA 분자로부터 제조된 cDNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 면역 세포로부터의 mRNA 분자, 또는 mRNA 분자로부터 제조된 cDNA이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 개별적인 면역 세포로부터의 mRNA 분자, 또는 mRNA 분자로부터 제조된 cDNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 면역 세포로부터의 항체 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 개별적인 면역 세포로부터의 중쇄 항체 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 면역 세포로부터의 중쇄 항체 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 개별적인 면역 세포로부터의 경쇄 항체 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 면역 세포로부터의 경쇄 항체 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 개별적인 면역 세포로부터의 항체 가변 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 면역 세포로부터의 가변 항체 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 개별적인 면역 세포로부터의 가변 경쇄 항체 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 면역 세포로부터의 가변 경쇄 항체 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 개별적인 면역 세포로부터의 가변 중쇄 항체 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 면역 세포로부터의 가변 중쇄 항체 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 세포-유리 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA일 수 있다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 개별적인 면역 세포로부터의 가변 알파, 베타, 감마 및/또는 델타 사슬 TCR 서열을 코드화하는 mRNA 분자이다.
본원에 기술된 방법은 서열결정을 위해 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 증폭 반응의 생성물이 아닌 관심의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 생물학적 샘플 중의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 PCR 반응의 생성물을 포함하지 않는다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 증폭 반응의 생성물을 생성하기 위해 사용된 폴리뉴클레오티드 주형을 포함할 수 있지만, 증폭 생성물 자체를 포함하지는 않는다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 역전사 반응 또는 프라이머 연장 반응의 생성물을 생성하기 위해 사용된 폴리뉴클레오티드 주형을 포함할 수 있고, 또한 역전사 반응 또는 프라이머 연장 반응 생성물 자체도 포함한다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 역전사 반응 또는 프라이머 연장 반응이 수행될 수 있는 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 RNA 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다. 일부 구체예에서, 표적 RNA 폴리뉴클레오티드는 폴리아데닐화된다. 일부 구체예에서, RNA 폴리뉴클레오티드는 폴리아데닐화되지 않는다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA 폴리뉴클레오티드이다. DNA 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA일 수 있다. DNA 폴리뉴클레오티드는 엑손, 인트론, 미번역 영역, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 라이브러리는 표적 폴리뉴클레오티드의 둘 이상의 영역으로부터 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 방법 라이브러리는 둘 이상의 표적 폴리뉴클레오티드로부터 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 염색체로부터 유도된 게놈 핵산 또는 DNA이다. 일부 표적 폴리뉴클레오티드는 변이체, 예컨대 다형태 또는 돌연변이를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA를 포함하고 RNA가 아니다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 RNA를 포함하고 DNA가 아니다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 mRNA 분자이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥이다.
표적 폴리뉴클레오티드는 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 임의의 생물학적 샘플로부터 얻어지고 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 증폭 없이 직접 분리된다. 직접 분리를 위한 방법은 기술분야에 공지이다. 비-제한적 실례는 생물학적 샘플, 유기체, 또는 세포로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 추출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드는 생물학적 샘플로부터 정제된다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 그것이 함유되어 있는 생물학적 샘플로부터 정제되지 않는다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 생물학적 샘플로부터 분리된다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 그것이 함유되어 있는 생물학적 샘플로부터 분리되지 않는다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 세포-유리 핵산일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 단편화된 핵산일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 전사된 핵산일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 변형된 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 비-변형 폴리뉴클레오티드이다.
일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 개별적인 세포로부터 유래한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 복수의 세포를 함유하는 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드이다.
일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 생체마커 서열을 코드화한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 둘 이상의 생체마커 서열을 코드화한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드는 생체마커 서열을 코드화한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드는 둘 이상의 생체마커 서열을 코드화한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 또는 그 이상의 생체마커 서열을 코드화한다.
일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드는 면역글로불린 서열의 패널을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드는 TCR 서열의 패널을 포함한다. 예를 들어, 면역글로불린 서열의 패널은 VH 및/또는 VL 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 또는 TCR 서열의 패널은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 면역글로불린 또는 TCR 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 또는 TCR 서열의 패널은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012 면역글로불린 또는 TCR 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 또는 TCR 서열의 패널은 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012 면역글로불린 또는 TCR 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 또는 TCR 서열의 패널은 약 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 10 내지 60, 10 내지 70, 10 내지 80, 10 내지 90, 10 내지 100, 50 내지 60, 50 내지 70, 50 내지 80, 50 내지 90, 50 내지 100, 100 내지 200, 100 내지 300, 100 내지 400, 100 내지 300, 100 내지 400, 100 내지 500, 100 내지 600, 100 내지 700, 100 내지 800, 100 내지 900, 100 내지 1000, 500 내지 600, 500 내지 700, 500 내지 800, 500 내지 900, 500 내지 1000, 1000 내지 2000, 1000 내지 3000, 1000 내지 4000, 1000 내지 3000, 1000 내지 4000, 1000 내지 5000, 1000 내지 6000, 1000 내지 7000, 1000 내지 8000, 1000 내지 9000, 1000 내지 10000, 5000 내지 6000, 5000 내지 7000, 5000 내지 8000, 5000 내지 9000, 5000 내지 10000, 1 내지 1x105, 1 내지 2x105, 1 내지 3x105, 1 내지 4x105, 1 내지 5x105, 1 내지 6x105, 1 내지 7x105, 1 내지 8x105, 9x105, 1 내지 1x106, 1 내지 2x106, 1 내지 3x106, 1 내지 4x106, 1 내지 5x106, 1 내지 6x106, 1 내지 7x106, 1 내지 8x106, 9x106, 1x107, 1 내지 2x107, 1 내지 3x107, 1 내지 4x107, 1 내지 5x107, 1 내지 6x107, 1 내지 7x107, 1 내지 8x107, 1 내지 9x107, 1 내지 1x108, 1 내지 2x108, 1 내지 3x108, 1 내지 4x108, 1 내지 5x108, 1 내지 6x108, 1 내지 7x108, 1 내지 8x108, 1 내지 9x108, 1 내지 1x109, 1 내지 2x109, 1 내지 3x109, 1 내지 4x109, 1 내지 5x109, 1 내지 6x109, 1 내지 7x109, 1 내지 8x109, 1 내지 9x109, 1 내지 1x1010, 1 내지 2x1010, 1 내지 3x1010, 1 내지 4x1010, 1 내지 5x1010, 1 내지 6x1010, 1 내지 7x1010, 1 내지 8x1010, 1 내지 9x1010, 1 내지 1x1011, 1 내지 2x1011, 1 내지 3x1011, 1 내지 4x1011, 1 내지 5x1011, 1 내지 6x1011, 1 내지 7x1011, 1 내지 8x1011, 1 내지 9x1011, 1 내지 1x1012, 1 내지 2x1012, 1 내지 3x1012, 1 내지 4x1012, 1 내지 5x1012, 1 내지 6x1012, 1 내지 7x1012, 1 내지 8x1012, 또는 1 내지 9x1012 면역글로불린 또는 TCR 서열을 함유한다.
일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 또는 20,000 염기 또는 염기쌍의 길이를 갖는다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 또는 20,000 염기 또는 염기쌍의 길이를 갖는다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 또는 20,000 염기 또는 염기쌍의 길이를 갖는다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 약 10 내지 20, 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 10 내지 60, 10 내지 70, 10 내지 80, 10 내지 90, 10 내지 100, 50 내지 60, 50 내지 70, 50 내지 80, 50 내지 90, 50 내지 100, 100 내지 200, 100 내지 300, 100 내지 400, 100 내지 300, 100 내지 400, 100 내지 500, 100 내지 600, 100 내지 700, 100 내지 800, 100 내지 900, 100 내지 1000, 500 내지 600, 500 내지 700, 500 내지 800, 500 내지 900, 500 내지 1000, 1000 내지 2000, 1000 내지 3000, 1000 내지 4000, 1000 내지 3000, 1000 내지 4000, 1000 내지 5000, 1000 내지 6000, 1000 내지 7000, 1000 내지 8000, 1000 내지 9000, 1000 내지 10000, 5000 내지 6000, 5000 내지 7000, 5000 내지 8000, 5000 내지 9000, 또는 5000 내지 10000 염기 또는 염기쌍의 길이를 갖는다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 단편의 평균 길이는 약 100, 200, 300, 400, 500, 또는 800 염기쌍 미만, 또는 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 뉴클레오티드 미만, 또는 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 킬로염기 미만이다. 일부 구체예에서, 상대적으로 짧은 주형, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 샘플로부터의 표적 서열은 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 염기이다. 특정 구체예에서, 서열결정 데이터는 질환 또는 상태와 관련된 서열 또는 면역글로불린 또는 TCR 서열을 함유하는 데이터베이스를 사용하여 공지의 또는 예상된 서열에 대해 배열된다.
면역 레퍼토리 서열결정
본 발명은 핵산이 서열결정을 위한 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성하기 위하여 조작되는 단계들을 사용한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 핵산이 재조합 단클론성 항체를 제조하기 위해 조작되는 단계들을 사용한다. 일반적인 의미로, 발명의 구체예에서, 면역 세포 및/또는 T 세포 유전자 물질의 증폭, 예컨대 역전사 중합효소 사슬 반응 (역전사-PCR)이 면역 세포 유전자 물질의 cDNA 증폭을 생성하기 위해 사용된다. 항체 분자에 대해, 면역글로불린 유전자는 게놈 DNA 또는 면역 세포 또는 T 세포의 mRNA로부터 얻어질 수 있다. RNA는 중쇄 (V, D, J 절편), 또는 경쇄 (V, J 절편)일 수 있다. 일부 구체예에서, 출발 물질은 항체를 코드화하고 불변 영역을 함유한 V, D, J 유전자 절편으로 구성된 면역 세포로부터의 RNA이다.
폴리뉴클레오티드 출발 물질, 예컨대 RNA는 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 푸울을 사용하여 cDNA로 역전사될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA의 영역, 예컨대 불변 영역에 또는 mRNA의 폴리-A 꼬리표표에 상보하는 부분을 포함할 수 있다. 사이에 끼워진 공지의 염기 위치가 있거나 없는 ~20 축퇴성 뉴클레오티드의 스트레치일 수 있는 용기 바코드, 예컨대 NNNNWNNNNWNNNNWNNNNW, 이때 W는 A 또는 T를 의미한다.
역전사로부터 유발되는 cDNA는 하나 이상의 바코드, 예를 들면 용기 바코드 및 분자 바코드로 꼬리표표가 붙여질 수 있다. 특정 디자인의 다양한 올리고뉴클레오티드가 꼬리표표 붙임에 사용될 수 있다. 역전사로부터 유발된 꼬리표표가 붙여진 cDNA는 1회 이상, 예컨대 PCR 증폭에 의해 증폭될 수 있다. 특정 디자인의 다양한 프라이머가 증폭에 사용될 수 있다. 제1 증폭 반응, 예컨대 PCR의 생성물은 제2 증폭 반응, 예컨대 제1 또는 제2 PCR 단계를 사용하여 증폭될 수 있다. 다양한 프라이머가 증폭 단계에 대해 사용될 수 있다. 증폭된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 본원에 기술된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 그 결과의 라이브러리는 적절한 분자 및 용기 바코드를 가진 전체 또는 부분적인 항체 또는 TCR 서열을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 라이브러리를 생성하기 위하여, 예컨대 면역 레퍼토리 서열결정을 위해 주형 스위칭 (switching)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 주형 스위칭은 역전사 동안에 사용되어 바코드를 은닉하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역이 역전사의 생성물 상에 생성된다. 주형 스위칭은 PCR 편향의 문제를 제거하기 위해 역전사 동안 사용될 수 있다. 이들 방법은 항체 서열결정을 위해, 예컨대 고-처리량 서열결정 플랫폼의 사용을 통해 사용될 수 있다.
출발 물질은 RNA 또는 DNA, 예컨대 항체를 코드화하는 V, D, J 유전자 절편을 포함하는 면역 세포 또는 T-세포로부터의 것일 수 있고, 불변 영역을 함유한다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 중쇄 절편 (V, D, J 절편), 및 경쇄 절편 (V, J 절편)을 포함한다.
표적 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴크레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 푸울을 사용하여 cDNA로 역전사될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드를 역전사시키기 위한 폴리뉴클레오티드의 푸울에서 프라이머의 실례는 표적 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 부분을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 부분은 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 mRNA의 불변 영역에 또는 폴리-A 꼬리표에 상보할 수 있다. 다중 올리고뉴클레오티드, 예컨대 프라이머는 하나 이상의 불변 영역을 아닐링하기 위해 사용될 수 있다. 역전사효소는 역전사 반응을 수행하기 위하여 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 역전사효소는 비-주형 말단 전달효소 활성을 포함할 수 있다. 비-주형 말단 전달효소 활성을 포함하는 역전사효소가 주형의 단부에 도달할 때, 3개 이상의 비-주형 잔기, 예컨대 3개 이상의 비-주형 시토신 잔기를 첨가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, Superscipt IITM 역전사효소가 이 목적에 사용된다. 일부 구체예에서, MaximaTM 역전사효소가 이 목적에 사용된다. 일부 구체예에서, Protoscript IITM 역전사효소가 이 목적에 사용된다. 일부 구체예에서, 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT)가 이 목적에 사용된다. 일부 구체예에서, HighScriberTM 역전사효소가 이 목적에 사용된다. 일부 구체예에서, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전달효소가 이 목적에 사용된다. 일부 구체예에서, 조류 골수아세포증 바이러스 (AMV) 역전사효소가 이 목적에 사용된다. 비-주형 말단 전달효소 활성을 가지는 RNA를 전사시킬 수 있는 임의의 역전사효소가 사용될 수 있다. 비-주형 말단 전달효소 활성을 가지는 RNA를 전사시킬 수 있는 임의의 역 중합효소가 사용될 수 있다. 비-주형 말단 전달효소 활성을 가지는 DNA를 전사시킬 수 있는 임의의 역 중합효소가 사용될 수 있다.
역전사 반응, 예컨대 상기 기술된 반응들은 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드의 존재하에 수행될 수 있다. 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 cDNA의 3' 단부에 핵산을 첨가시키기 위해 사용된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 cDNA의 3' 단부에 핵산을 첨가시키기 위해 주형으로서 사용된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 cDNA의 3' 단부에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 cDNA의 3' 단부에 혼성화하는, 3' 영역, 예컨대 3' 말단 영역을 함유하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 절편, 예컨대 3개 이상의 비-주형 잔기를 아닐링시키는 절편을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 분자 바코드 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 분자 바코드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 3 리보-구아닌 잔기 또는 그것의 유사체를 역전사효소에 의해 생성된 가닥에 상보하고 그것에 아닐링되는 3' 단부 (rGrGrG) (RNA 염기)에 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 구아닌 잔기는 리보-구아닌 대신 사용될 수 있다 (RNA 뉴클레오티드 대신 DNA 뉴클레오티드). 일부 구체예에서, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 3' 단부에 1 또는 2 리보-구아닌 잔기를 포함할 수 있고 데옥시리보-구아닌 잔기 또는 그것의 유사체를 역전사효소에 의해 생성된 가닥에 상보하고 그것에 아닐링되는 3' 단부 (rGrGG)에 포함할 수 있다.
3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드가 cDNA 가닥에 아닐링될 때, 역전사효소는 계속해서 cDNA를 꼬리표붙여지는 폴리뉴클레오티드로 연장시킬 수 있고, 그로서 분자 바코드 또는 그것의 상보물을, 반응에서 폴리뉴클레오티드의 표적 집단, 예컨대 cDNA에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 영역 5'를 함유하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 영역 5'는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 cDNA에 상보하지 않는 영역을 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 영역 5'는 분자 바코드를 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 영역 5'는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물에 상보하는 영역을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 주형 스위칭이 별도의 반응으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 역전사 반응 후에 첨가될 수 있고, 역전사효소 또는 중합효소와 같은 효소가 사용되어 꼬리표가 붙여진 폴리뉴클레오티드로 연장될 수 있다. 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드가 용기 중의 각 분자상에 특유한 축퇴성 분자 바코드를 은닉할 수 있기 때문에, 용기의 각 cDNA는 분자 바코드로 특유하게 꼬리표가 붙여질 수 있다. 일부 구체예에서, 주형 스위칭은 역전사 반응이 수행됨에 따라 동시에 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드, 예컨대 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 5' 영역, 예컨대 다른 바코드, 예컨대 용기 바코드를 함유하는 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물에 상보하는 5' 말단 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 분자 바코드 또는 그것의 상보물을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 꼬리표가 붙여진 cDNA 분자는 3' 영역, 예컨대 다른 바코드, 예컨대 용기 바코드를 함유하는 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물에 상보하는 3' 말단 영역을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드이다. 표적 폴리뉴클레오티드로부터 분자 바코드를 함유하는 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물을 생성할 때, 용기 바코드는 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드에 첨가될 수 있다. 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 핵산을 첨가하기 위해 사용된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 핵산을 첨가하기 위해 주형으로서 사용된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 핵산을 첨가하기 위해 주형으로서 사용된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는, 3' 말단 영역과 같은, 3' 영역을 함유하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는, 3' 말단 영역과 같은, 3' 영역을 포함할 수 있다.
분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드에 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드를 아닐링할 때, 역전사효소는 cDNA를 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드, 예컨대 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드로 계속해서 연장시킬 수 있고, 그로써 용기 바코드 또는 그것의 상보물을, 반응에서, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 표적 집단에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 영역 5'를 함유하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 영역 5'는 표적 폴리뉴클레오티드 또는 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드에 상보하지 않는 영역을 포함할 수 있다. 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 영역 5'는 용기 바코드를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 증폭된 생성물이다. 일부 구체예에서, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 단일 분자로부터 기원하는 증폭된 생성물이다. 일부 구체예에서, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 증폭된 생성물이다. 일부 구체예에서, 3' 꼬리표붙이기 폴리뉴클레오티드는 단일 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드로부터 기원하는 증폭된 생성물이다. 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 영역 5'는 프라이머 또는 그것의 상보물에 상보하는 영역을 포함할 수 있다. 분자 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 혼성화하는 3' 영역에 대한 영역 5'는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위해 사용된 프라이머 또는 그것의 상보물에 상보하는 영역을 포함할 수 있다.
이중 바코딩된 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 분자 바코드 및 용기 바코드를 함유한 cDNA는 그런 다음 예컨대 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 그런 다음 PCR은 예를 들면 프라이머 세트를 사용함으로써 수행될 수 있다. 상기 언급된 PCR 반응의 생성물은 다음에 1회 이상, 예컨대 하나 이상의 PCR 회기에 의해 증폭되거나, 또는 직접 서열결정될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 따라 제조된 라이브러리는 적절한 바코드, 예컨대 서열결정된 용기 바코드 및 분자 바코드를 가진 커다란 또는 전체 항체 또는 TCR 서열을 포함하는 라이브러리일 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 라이브러리는 서열결정에 대해 적절한 클러스터링 절편을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 동일한 분자 바코드의 많은 복사물이 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 동일한 분자 바코드를 함유하는 폴리뉴클레오티드의 많은 복사물이 각각의 출발하는 특유한 표적 폴리뉴클레오티드 분자에 대해 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 동일한 분자 바코드를 함유하는 폴리뉴클레오티드의 많은 복사물이 용기 바코드로 꼬리표가 붙여진 각각의 출발하는 특유한 표적 폴리뉴클레오티드 분자에 대해 생성될 수 있다.
서열결정시, 동일한 분자 바코드를 가진 서열이 매치되거나 쌍을 이룰 수 있다. 서열결정시, 동일한 용기 바코드를 가진 서열이 매치되거나 쌍을 이룰 수 있다. 서열결정시, 동일한 표적 서열을 가진 서열이 매치되거나 쌍을 이룰 수 있다. 일부 구체예에서, 서열결정 판독은 공통 서열로 붕괴될 수 있다. 매치된 또는 쌍을 이룬 서열결정 판독을 공통 서열로 붕괴시키는 것은 그로써 서열결정 및 PCR 오류를 감소시키거나 제거할 수 있다. 서열결정은 제1 판독에 대해 제1 프라이머 부위를 사용하여 수행될 수 있다. 서열결정은 제2 판독에 대해 제1 프라이머 부위를 사용하여 수행될 수 있다. 서열결정은 제2 판독에 대해 제2 프라이머 부위를 사용하여 수행될 수 있다.
동일한 용기 바코드를 함유하는 항체 중쇄 및 경쇄는 쌍을 이룰 수 있고, 일부 구체예에서, 포유류 벡터 시스템에서 클론될 수 있다. 항체 구성물은 다른 인간 또는 포유류 숙주 세포주에서 발현될 수 있다. 그런 다음 구성물은 관심의 발현된 항체 또는 TCR의 일시적 트랜스펙션 분석 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증될 수 있다.
RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 기술분야에 잘 알려져 있고 본 발명에 따라 불필요한 실험 없이, 본원에 제공된 교시 및 안내를 기반으로, 사용될 수 있다. 공지의 DNA 또는 RNA 증폭 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 중합효소 사슬 반응 (PCR) 및 관련된 증폭 과정 (예컨대 미국 특허 번호 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, to Mullis, et al.; 4,795,699 및 4,921,794 to Tabor, et al.; 5,142,033 to Innis; 5,122,464 to Wilson, et al.; 5,091,310 to Innis; 5,066,584 to Gyllensten, et al.; 4,889,818 to Gelfand, et al.; 4,994,370 to Silver, et al.; 4,766,067 to Biswas; 4,656,134 to Ringold 참조) 및 이중-가닥 DNA 합성에 대한 주형으로서 표적 서열에 대한 안티-센스 RNA를 사용하는 RNA 매개된 증폭 (미국 특허 번호 5,130,238 to Malek, et al., 상표명 NASBA)을 포함하고, 상기 참조문헌들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다 (예컨대 Ausubel, 상기 동일; 또는 Sambrook, 상기 동일).
편리하게도, 본원에 기술된 방법의 단계들, 예컨대 증폭, 서열결정 등은 복수의 기질, 예컨대 항원 등이 고정되는 고체 상, 예컨대 어레이를 사용하여 다중 분석 포맷에서 수행되거나 수행되지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 어레이는 단백질 바이오칩이다. 단백질 바이오칩을 사용하여, 수백 및 심지어 수천개의 항원이 스크리닝될 수 있다. 본원에서 사용되는, "어레이", "마이크로어레이" 또는 "바이오칩"은 흡착제가 부차되는 일반적으로 평평한 표면을 가지는 고체 기질을 나타낸다. 빈번하게, 바이오칩의 표면은 복수의 다룰 수 있는 위치를 포함하고, 각각의 그 위치는 거기에 결합된 흡착제를 가진다. 바이오칩은 프로브 계면에 맞물리도록 적응되고, 그러므로 프로브로서 기능한다. "단백질 바이오칩"은 폴리펩티드의 포획에 대해 적응된 바이오칩을 나타낸다. 많은 단백질 바이오칩은 기술분야에 기술되어 있다. 폴리펩티드 어레이를 제조하는 방법은 예컨대 De Wildt et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al., 1999, Anal. Biochem. 270:103-111; Ge, 2000, Nucleic Acids Res. 28, e3, 1-VH; MacBeath and Schreiber, 2000, Science 289:1760-1763; WO 01/40803 및 WO 99/51773A1에 기술되어 있다. 어레이의 사용은 많은 단계, 예컨대 스크리닝이 기계적으로 및/또는 고-처리량 방식으로 수행되는 것을 허용한다. 어레이에 대한 폴리펩티드는 고속으로, 예컨대 상업적으로 활용가능한 로봇 장치를 사용하여, 예컨대 Genetic MicroSystems 또는 BioRobotics로부터 스폿팅될 수 있다. 어레이는 또한 다공성 매트릭스, 예컨대 아크릴아미드, 아가로오스, 또는 다른 중합체를 포함할 수 있다. 바이오칩 상에 포획할 때, 분석물은 예를 들면 가스상 이온 분광학 방법, 광학 방법, 전기화학 방법, 원자력 현미경법 및 무선 주파수 방법으로부터 선택된 다양한 검출 방법에 의해 검출될 수 있다. 특히 관심이 있는 것은 질량 분광학의 사용이고, 특히 SELDI이다. 광학 방법은, 예를 들면 형광, 발광, 화학발광, 흡광도, 반사도, 투과도, 복굴절 또는 굴절률 (예컨대 표면 플라스몬 공명, 편광 해석법, 공진 반사 방법, 격자 결합기 도파관 방법 또는 간섭측정법)의 검출을 포함한다. 광학 방법은 현미경 (공초점 및 비공초점), 영상화 방법 및 비-영상화 방법을 포함한다. 다양한 포맷의 면역분석 (예컨대 ELISA)은 고체 상에 포획된 분석물의 검출을 위한 대중적인 방법이다. 전기화학적 방법은 전압전류법 및 전류법 방법을 포함한다. 무선 주파수 방법은 다극적 공명 분광학을 포함한다.
발명의 일부 구체예에서, 예컨대 단클론성 항체를 제조하기 위한 천연 다양성 접근법, 단일 세포로 작업하기 위해 수립된 기법이 사용된다. 한 기법은 단일 세포를 별도의 용기에 넣기 위하여 FACS에서 사용될 수 있는 특수한 부속품을 통합한다. 그런 부속품은 상업적으로 입수 가능하고 기술분야에 잘 알려져 있다. 그런 부속품은 단일 세포를, 예를 들면 표준 96 웰 미소적정 배양 플레이트의 선택된 구획에 제공하기에 유용하다. 다르게는, 세포는 단일 세포 데포지션을 보장하기 위하여 제한 희석으로 미소적정 플레이트로 데포짓될 수 있다.
제2 기법은 VH 및 VL 절편을 증폭시키기 위하여 단일 면역 세포 상에서 수행된 PCR이다. 천연 다양성 접근법에서, 단일 세포 PCR은 단일 세포에서 VL 및 VH의 천연적인 쌍을 보유하기 위해 사용된다. 항체의 특이성은 VL 영역 및 VH 영역 내에 있는 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 결정된다.
단일-세포 PCR을 수행하기 위한 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다 (예컨대 Larrick, J.W. et al., Bio/Technology 7:934 (1989)). 예를 들어, B 세포 라이브러리로부터의 항체-생성 B-세포 또는 T-세포 라이브러리로부터의 TCR-생성 T-세포는 고정 용액 또는 포름알데하이드, 글루타르알데하이드 등과 같은 화학물질을 함유한 용액으로 고정될 수 있다. 그런 다음 세포는 예를 들면 계면활성제를 포함하는 투과화 용액으로 투과된다. 고정 및 투과화 과정은 세포 구획 또는 그 안의 세포의 불필요한 파괴 없이 효소, 뉴클레오티드 및 다른 시약의 세포 안으로의 유입을 허용하기에 충분한 기공률을 제공해야 한다. 효소 및 뉴클레오티드의 첨가는 그런 다음 세포로 들어가 세포의 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ mRNA를, 예를 들면 상응하는 cDNA 서열로 역전사시킨다. 역전사는 단일 단계로 수행되거나 또는 선택적으로 PCR 과정과 함께, 역전사효소, 충분한 양의 4개의 dNTP, 및 중합반응을 개시하기 위해 역전사효소에 대한 3' 하이드록실기를 제공하는 mRNA에 결합하는 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. mRNA에 상보하는 임의의 프라이머가 사용될 수 있지만, 가변 영역 mRNA의 선택을 용이하게 하기 위해 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 분자의 3'-말단부에 상보하는 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다. 수많은 연구가 축퇴성 폴리뉴클레오티드가 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ에 대한 5'-단부 프라이머로서 작용하기 위해 제조될 수 있음을 ㄴ나타냈다. 표적화 분자를 제조하는 조합 라이브러리 방법은 그런 프라이머에 의존한다. 나아가, 수많은 실험이 PCR이 관심의 유전자 절편, 예컨대 VH 및 VL 또는 Vα 및 V 또는 Vγ 및 Vδ를 단일 세포로부터 증폭할 수 있음을 보여주었다. 심지어 단일 세포로도 작업할 수 있는 능력 때문에, 이 PCR 접근법은 관심의 면역 세포가 낮은 빈도로 일어나는 경우에도 항체를 생성할 수 있다.
매우 다양한 구체예에서, FACS 분류 후에, 면역 세포 라이브러리의 세포가 모아지고 역전사-PCR이 세포의 전체 푸울에 대해 수행된다. 항체의 클로닝 또는 TCR 목적에 대해 mRNA의 생성은 항체 또는 TCR의 제조 및 특성화에 대한 잘 알려져 있는 과정에 의해 쉽게 이루어진다 (예컨대 Antibodies: A Laboratory Manual, 1988; 본원에 참조로 포함됨). 예를 들어, B-세포 라이브러리로부터의 총 RNA는 기술분야에서 표준 및 종래의 적절한 방법에 의해 추출된다. 그런 다음 cDNA가 RNA로부터 적절한 방법에 의해, 예컨대 무작위 6량체 폴리뉴클레오티드, 또는 C-유전자 또는 C-유전자 패밀리-특이적 프라이머를 사용함으로써 합성된다. 다시 말하면 이것들은 상기에서 설명된 대로 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있는 과정이다. B-세포 또는 T-세포 라이브러리로부터 유도된 핵산 분자의 라이브러리, 예컨대 그런 B 또는 T 림프구로부터 유도된 RNA 또는 cDNA 분자의 라이브러리는 발현 벡터에 클론되어 발현 라이브러리가 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역 세포 라이브러리로부터 유도된 VH 또는 Vα 또는 Vγ 도메인만이 VH 또는 Vα 또는 Vγ 도메인의 라이브러리를 생성하기 위해 증폭된다. 다른 공급원으로부터의 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 라이브러리는 항체 또는 TCR을 생성하기 위하여 본원에 기술된 방법을 사용하여 VH 또는 Vα 또는 Vγ 라이브러리와 함께 사용된다. 항체 또는 TCR 단편의 라이브러리는 숙련된 기술자들에게 알려져 있는 많은 방법 중 임의의 방법으로 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 라이브러리를 함께 조합함으로써 구성될 수 있다. 예를 들어, 각각의 라이브러리는 상이한 벡터에서, 및 시험관 내에서 또는 생체 내에서 재조합된 벡터에서 생성될 수 있다. 다르게는, 라이브러리는 동일한 벡터로 계속해서 클론되거나, 또는 PCR에 의해 함께 조립된 후 클론될 수 있다. PCR 어셈블리가 또한 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코드화하는 DNA와 결합시켜서 본원의 다른 곳에서 기술되는 단일 사슬 Fv (scFv) 라이브러리를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 기법으로, 세포-내 PCR 어셈블리가 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 유전자를 림프구 내에서 PCR에 의해 조합한 후 연결된 유전자의 레퍼토리를 클론하기 위해 사용될 수 있다.
단일 세포 바코딩
용기 바코드 및 분자 바코드로 단일 세포 바코딩을 위해, 유중수 에멀션과 같은 용기가 결과적으로 용기가 용기당 1 세포 또는 그 미만을 함유하도록 생성될 수 있다. 용기는 결과적으로 용기가 또한 용기당 1 용기 바코드를 함유하도록 생성될 수 있다. 용기는 결과적으로 용기가 또한 용기당 1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 함유하도록 생성될 수 있다. 용기는 결과적으로 용기가 또한 용기당 둘 이상, 또는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 함유하도록 생성될 수 있다. 세포/용기는 본원에서 기술되는 RNA 또는 DNA 단일 바코딩 프로토콜이 수행될 수 있고, 각 용기의 용기 바코드 및 하나 이상의 분자 바코드는 관심의 표적, 예컨대 세포 폴리뉴클레오티드와 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, 매치하는 (matching) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일 용기에 하나 이상의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드로서 동일 용기에 존재하는 세포 성분에 융합될 수 있다. 서열결정에 이어서, 용기 바코드 및 분자 바코드 디콘볼루션 (deconvolution)이 어떤 세포로부터 RNA (또는 DNA)가 기원하는 지를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 유중수 에멀션과 같은 용기는 결과적으로 생성된 에멀션이 에멀션당 1 세포 또는 그 이상을 함유하도록 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 유중수 에멀션은 결과적으로 생성된 에멀션이 1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 둘 이상의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 용기당 함유하도록 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 용기는 결과적으로 생성된 용기가 용기당 1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 둘 이상의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 함유하도록 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 용기 바코드 및 분자 바코드는 용액으로 있을 때 용기 안으로 도입될 수 있다. 일부 구체예에서, 용기 바코드 및 분자 바코드는 고체 지지체, 예컨대 비드에 부착되지 않았을 대 용기 안으로 도입될 수 있다.
일부 측면으로, 구획으로서 작용할 수 있는 단일 세포가 에멀션 내부에서 분리될 수 있다. 세포는 용해될 수 있고 세포로부터의 전사물이 바코딩될 수 있다. 전사물의 각각은 분자 바코드 또는 용기 바코드와, 둘 이상의 RNA 전사물이 동일한 용기 바코드로 검출될 때, 동일한 출발 물질로부터 기원된 것을 갖는 것으로 측정될 수 있도록 융합될 수 있다. 이것은 많은 상이한 유형의 서열에 적용될 수 있다. 한 특정 적용은 항체 및 TCR 서열의 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 사슬을 연결시키는 것일 수 있다.
하나 이상의 단일 세포는 하나 이상의 에멀션에서, 용기 바코드 및 분자 바코드의 존재하에 분리될 수 있어서, 하나 이상의 에멀션의 한 방울이 최대 1 세포 또는 그 미만을 함유할 수 있다. 세포는 에멀션에 함유된 완충액에 의해 화학적으로 또는 냉동 해동에 의해 용해될 수 있고, 그로써 에멀션에서 세포의 내용물이 방출된다.
단일 세포의 RNA는 cDNA로 역전사될 수 있다. 역전사 반응은 상기에서 기술된 대로 약 3개의 시토신 잔기를 첨가시키는 비-주형 말단 전달효소 활성을 가지고 있는 역전사효소로 이루어질 수 있다. 모든 역전사 완충액, 효소 및 뉴클레오티드는 에멀션을 형성할 때 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 프라이머는 모든 mRNA를 표적화하기 위해 일반화될 수 있다 (예컨대 폴리 dT 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드). 일부 구체예에서, DNA가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 2보다 많은 RNA가 표적화될 수 있다.
일부 구체예에서, 용기 바코드는 역전사 동안에 RNA에 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 분자 바코드는 역전사 동안에 RNA에 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 용기 바코드 및 분자 바코드는 역전사 동안에 RNA에 연결될 수 있다.
역전사 반응은 3' 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드의 존재하에 수행될 수 있다. 3' 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드는 서열결정 프라이머를 아닐링하기 위해 사용될 수 있는 P7 절편을 포함할 수 있다. 3' 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드는 용기 바코드 또는 분자 바코드를 포함할 수 있다. 3' 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드는 역전사효소에 의해 생성된 가닥에 상보하고 그것에 아닐링될 수 있는 3' 단부 (rGrGrG) (RNA 염기) 상에 3 리보-구아닌 잔기를 포함할 수 있다. 그러므로, 용기 바코드 및 분자 바코드는 역전사효소에 의해 동일한 에멀션에서 cDNA의 말단부에 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, 구아닌 잔기가 리보-구아닌 대신 사용될 수 있다 (RNA 뉴클레오티드 대신 DNA 뉴클레오티드). 3' 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드가 cDNA 가닥의 CCC에 아닐링될 때, 역전사효소는 계속해서 cDNA를 3' 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드로 연장시키고, 그로써 분자 바코딩된 꼬리표를 반응에서 모든 cDNA에 생성시킨다. 3' 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드가 분자 바코딩된 cDNA의 영역에 아닐링될 때, 역전사효소 또는 중합효소는 계속해서 분자 바코딩된 cDNA를 다른 3' 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드로 연장시키고, 그로써 용기 바코딩된 꼬리표를 반응에서 모든 cDNA에 생성시킨다. 일부 구체예에서, 주형 스위칭이 역전사 반응이 수행될 수 있는 것과 동시에 시행되는 대신 별도의 반응에서 시행될 수 있다. 일부 구체예에서, 3' 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드는 역전사 반응 후에 첨가될 수 있고, 역전사효소 또는 중합효소와 같은 효소는 유사한 양상으로 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드로 연장시키기 위해 사용될 수 있다. 3' 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드가 각각의 단일 분자상에 특유한 축퇴성 분자 바코드를 은닉할 수 있기 때문에, 각각의 cDNA는 분자 바코드로 특유하게 꼬리표가 붙여질 수 있다. 3' 꼬리표 붙이기 폴리뉴클레오티드가 각각의 단일 분자상에 특유한 축퇴성 용기 바코드를 은닉할 수 있기 때문에, 각각의 cDNA는 용기에 특유한 용기 바코드로 꼬리표가 붙여질 수 있다.
B-세포 라이브러리 유전자 물질의 클로닝 및 발현
본원에서 사용되는 "항체 발현 라이브러리" 또는 "TCR 발현 라이브러리" 또는 "발현 라이브러리"는 핵산 또는 단백질 수준에서 분자들의 모듬 (즉 둘 이상의 분자)를 나타낼 수 있다. 그러므로, 이 용어는 복수의 항체 또는 TCR 분자를 코드화하는 (즉 핵산 수준에서) 발현 벡터의 모듬을 나타내거나 또는 항체 또는 TCR 분자가 적절한 발현 시스템에서 (즉 단백질 수준에서) 발현된 후 그것들의 모듬을 나타낼 수 있다. 다르게는 발현 벡터/발현 라이브러리는 그것들이 발현될 수 있는 적합한 숙주 세포에 함유될 수 있다. 발명의 발현 라이브러리에서 코드화되거나 발현되는 항체 분자는 임의의 적절한 포맷으로 존재할 수 있고, 예컨대 전(whole) 항체 또는 TCR 분자이거나 또는 항체 또는 TCR 단편, 예컨대 단일 사슬 항체 (예컨대 scFv 항체), Fv 항체, Fab' 항체, (Fab')2 단편, 디아바디 등일 수 있다. 핵산 서열을 "코드화하는"/"코딩하는" 또는 특정 효소를 "코드화하는"/"코딩하는" DNA 코딩 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 같이 용어 "코드화하는" 및 "코딩하는", 뿐만 아니라 다른 유사한 용어는 적절한 조절 서열의 제어하에 놓일 때 효소로 전사되고 번역되는 DNA 서열을 나타낸다. "프로모터 서열"은 세포에서 RNA 중합효소와 결합할 수 있고 하류 (3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터는 DNA 서열의 일부이다. 이 서열 영역은 그것의 3' 말단에서 출발 코돈을 가진다. 프로모터 서열은 바탕을 초과하여 검출 가능한 수준에서 전사를 개시하기 위해 필요한 요소들을 가진 최소수의 염기를 포함한다. 그러나, RNA 중합효소가 서열에 결합하고 출발 코돈 (프로모터가 있는 3' 말단)에서 전사가 개시된 후, 전사는 3' 방향으로 하류로 진행된다. 프로모터 서열 내에서는 전사 개시 부위 (편리하게도 뉴클레아제 S1을 사용한 지도화에 의해 규정됨)뿐 아니라 RNA 중합효소의 결합에 기여하는 단백질 결합 도메인 (공통 서열)이 발견될 것이다.
발명의 항체 또는 TCR 발현 라이브러리에 의해 확인된, 그것으로부터 유도된, 그것으로부터 선택된 또는 그것으로부터 얻을 수 있는 항체 또는 TCR 분자는 발명의 또 다른 추가의 측면을 형성한다. 다시 말해 이들 항체 또는 TCR 분자는 단백질 또는 항체 또는 TCR 분자를 코드화하는 핵산일 수 있고, 그 핵산은 계속해서 적절한 발현 베터로 통합되거나 및/또는 적합한 숙주 세포에 함유될 수 있다.
cDNA 푸울은 항체 또는 TCR 유전자의 VH 또는 Vα 또는 Vγ 사슬 영역의 5' 단부에 혼성화하는 항체 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 중쇄의 불변 영역에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 PCR 반응이 수행될 수 있다. cDNA 푸울은 항체 또는 TCR 서열을 포함하는 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 VH 또는 Vα 또는 Vγ 사슬 영역의 5' 단부에 대한 영역 5'에 혼성화하는 항체 또는 TCR 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 중쇄 또는 알파 또는 감마 사슬의 불변 영역에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 PCR 반응이 수행될 수 있다. PCR 반응은 또한 예컨대 카파 및 람다 부류의 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 사슬 푸울의 증폭에 대해 설정될 수 있다. cDNA 푸울은 항체 또는 TCR 유전자의 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 사슬 영역의 5' 단부에 혼성화하는 항체 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 경쇄의 불변 영역에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 PCR 반응이 수행될 수 있다. cDNA 푸울은 항체 또는 TCR 서열을 포함하는 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 사슬 영역의 5' 단부에 대한 영역 5'에 혼성화하는 항체 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 경쇄의 불변 영역에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 PCR 반응이 수행될 수 있다. 그런 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머는 공지의 및 대중적으로 입수 가능한 면역글로불린 또는 TCR 유전자 서열 데이터베이스 정보를 기반으로 디자인될 수 있다.
일부 구체예에서, VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열은 편리하게도 중쇄 또는 경쇄 유전자에 대해, 특히 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 둘 다의 말단 영역에 대해 특이적이지 않은 하나 이상의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, VH 및 VL 서열은 편리하게도 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, VH 및 VL 서열은 편리하게도 C-유전자 패밀리-특이적 프라이머 또는 C-유전자-특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, VH 및 VL 서열은 편리하게도 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 특이적인 제1 프라이머 및 C-유전자 패밀리-특이적 프라이머 또는 C-유전자-특이적 프라이머인 제2 프라이머 또는 복수의 제2 프라이머를 가진 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열은 편리하게도 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 특이적인 제1 프라이머 및 보편적 서열에 특이적인 제2 프라이머를 가진 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 라이브러리로부터 얻어질 수 있다.
일부 구체예에서, 역전사시, 결과적으로 생성된 cDNA 서열은 면역글로불린 유전자에 대해, 특히 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 둘 다의 말단 영역에 대해 특이적인 하나 이상의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 일부 구체예에서, VH 및 VL 서열은 V-유전자 패밀리-특이적 프라이머 또는 V-유전자-특이적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 라이브러리로부터 얻어지거나 (Nicholls et al., J. Immunol. Meth., 1993, 165:81; W093/12227) 또는 활용 가능한 서열 정보를 기반으로 기술분야에 공지된 표준 방법에 따라 디자인된다. (VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열은 통상적으로 개재하는 스페이서 서열 (예컨대 프레임-내 가요성 펩티드 스페이서를 코드화함)로 결찰되어 단일-사슬 항체를 코드화하는 카세트를 형성한다). V 영역 서열은 편리하게도 면역글로불린-발현 세포에 대한 cDNA 또는 PCR 증폭으로서 클론될 수 있다. VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 영역은 선택적으로, 본원에 기술된 방법으로 및 특히 주지된 특정 단계 후에 (예컨대 단일 세포 PCR 후에; 포유류 또는 다른 세포 표면 디스플레이 후에, FACS 스크리닝 후에 등등) 서열결정된다. 서열결정은 다른 이유들 중에서도, 허용되는 수준에서의 다양성의 수준을 증명하기 위하여 사용될 수 있다. 서열결정은 고-처리량 서열결정, 삼층 서열결정 (동일한 유전자가 서열의 차이를 확인하기 위하여 복수의 개별적인 샘플로부터 서열결정됨) 또는 이 두 가지의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 천연 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 조합을 본원에 기술된 방법을 사용하여 물리적으로 연결하는 것이 필요하다. 일부 구체예에서, cDNA, 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 PCR 증폭된 바코딩된 cDNA는 물리적으로 연결되지 않는다. 일부 구체예에서, cDNA, 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 PCR 증폭된 바코딩된 cDNA는 물리적으로 동일한 반응에서 또는 용기에서 연결되지 않는다.
일부 구체예에서, 천연 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 조합은 cDNA 프라이머에 더불어, VH 또는 Vα 또는 Vγ 유전자의 5' 단부에 대해 한 프라이머 또는 복수의 프라이머와 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 유전자의 5' 단부에 대한 다른 프라이머 또는 복수의 프라이머를 사용하여 물리적으로 연결된다. 이들 프라이머는 또한 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 유전자의 자체-조립을 허용하기 위하여, 엑스트라 서열의 상보하는 꼬리표를 함유할 수 있다. PCR 증폭 및 연결 후에, 혼합된 생성물, 다르게 표현하면 혼합된 가변 영역을 얻을 수 있는 기회는 증폭 및 연결 반응이 각 세포 내부에서 수행되었기 때문에 최소이다. 혼합의 위험은 추가로 V 영역 cDNA 쌍이 세포 구획 및 내부혼합물을 남기지 않지만, PCR 증폭 및 연결을 위해 세포 내부에 유지되는 것을 추가로 보장하기 위해 다이곡시게닌 표지된 뉴클레오티드와 같은 벌키한 시약을 활용함으로써 감소될 수 있다. 증폭된 서열은 상보하는 말단 서열의 혼성화에 의해 연결된다. 연결 후, 서열이 본원에 기술된 추가의 방법 단계에 사용하기 위해 세포로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 회수된 DNA는 필요하다면 말단 프라이머를 사용하여 PCR 증폭될 수 있고, 하기에서 상세하게 설명되는 것과 같이 플라스미드, 파지, 코스미드, 파지미드, 바이러스 벡터 또는 그것들의 조합일 수 있는 벡터에 클론될 수 있다. 편리한 제한 효소 부위는 클로닝을 용이하게 하기 위해 혼성화된 서열에 통합될 수 있다. 이들 벡터는 또한 추후 사용을 위해 연결된 가변 영역의 라이브러리로서 저장될 수 있다.
추가의 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 조합을 제공하기 위해 바람직한 일부 구체예에서, 발현 시스템이 이것을 용이하게 하기 위해 선택된다. 예를 들어, 박테리오파지 발현 시스템은 중쇄 및 경쇄 서열의 무작위 조합을 허용한다. 다른 적합한 발현 시스템은 기술분야의 숙련자들에게 알려져 있다.
비인간으로부터 유도된 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 서열의 경우에, 일부 구체예에서, 이들 서열을 전체 인간 Fc로 키메라화하는 것이 바람직할 수 있다. 본원에서 사용되는 "키메라화된"은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 영역이 인간 기원의 것이 아니고 중쇄 및 경쇄 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 사슬의 불변 영역이 인간 기원의 것이 면역글로불린 또는 TCR을 나타낸다. 이것은 가변 도메인을 인간 Fc에 증폭시키고 클로닝함으로써 이루어진다. 인간 Fc는 벡터의 부분이거나, 또는 별도의 분자에 있을 수 있고, Fc의 라이브러리가 또한 사용될 수 있을 것이다. 바람직한 구체예에서 키메라화된 분자는 CHO 세포와 같은 포유류 세포에서 성장되고, FACS로 2회 스크리닝되어 관심의 항체를 발현하느 세포에 대한 세포 집단이 풍부해진다. 키메라화된 항체 또는 TCR은 서열결정에 이어 기능적 특성화에 의해, 또는 직접적인 기능적 특성화 또는 동역학에 의해 특성화된다. 성장, 스크리닝 및 특성화는 아래에서 상세하게 기술된다.
상기 기술된 PCR 반응이 IgG 형태의 항체를 클로닝하기 위해 기술되는 것을 주지하는 것이 중요하다. 그것들은 일반적으로 보다 성숙한 면역 반응과 관련되고 일반적으로 IgM 항체보다 높은 친화성을 나타냄으로써, 특정 치료 및 진단 용도에 더 바람직하게 만들기 때문에 바람직하다. 그러나, 분명하게, 필요하거나 적절하다면 다른 형태의 면역글로불린 분자, 예컨대 IgM, IgA, IgE 및 IgD 중 하나 이상의 클로닝을 허용할 폴리뉴클레오티드가 디자인될 수 있다.
일단 항체 또는 TCR이 확인되고 상기 세포의 적절한 집단이 적절한 때에 분리되고 선택적으로 상기 기술된 것과 같이 풍부화되었다면, 항체 또는 TCR 발현 라이브러리는 즉시 생성될 필요가 없고, 단 세포에 함유된 유전자 물질은 무상으로 유지되어 나중에 라이브러리가 만들어지는 것을 가능하게 할 수 있다. 그러므로, 예를 들어 세포, 세포 용해물 또는 그것으로부터 유도된 핵산, 예컨대 RNA 또는 DNA는 적절한 방법에 의해, 예컨대 냉동에 의해 나중까지 보관될 수 있고, 발현 라이브러리가 필요한 때에 나중에 생성된다.
일단 발현 벡터의 라이브러리가 생성되면, 코드화된 항체 분자가 적절한 발현 시스템에서 발현될 수 있고 기술분야에 잘 알려져 있고 문서화되어 있는 적절한 기법을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 그러므로 상기 정의된 발명의 방법은 아래에서 한층 더 상세하게 설명되는 것과 같이, 적절한 발현 시스템에서 발현 벡터의 라이브러리를 발현시키는 단계 및 발현된 라이브러리를 원하는 특성을 가진 항체에 대해 스크리닝하는 추가의 단계들을 포함할 수 있다.
본원에서 나타낸 것과 같이, 항체 또는 TCR 서열을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발명의 방법에 의해 제조된 폴리뉴클레오티드는, 한정하는 것은 아니지만 항체 또는 TCR 단편의 아미노산 서열을 코드화하는 것들 자체, 전체 항체 또는 TCR 또는 그것의 일부에 대한 비코딩 서열, 추가의 비-코딩 서열, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만 비-코딩 5' 및 3' 서열, 예컨대 전사, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 (예를 들면 mRNA의 리보솜 결합 및 안정성)를 포함한 mRNA 프로세싱에서 역할을 담당하는 전사된, 비번역 서열과 함께, 상기 언급된 추가의 코딩 서열, 예컨대 적어도 하나의 인트론이 있거나 없는 항체 또는 TCR, 단편 또는 부분, 뿐만 아니라 추가의 서열에 대한 코딩 서열, 예컨대 적어도 하나의 신호 리더 또는 융합 펩티드의 코딩 서열; 추가의 아미노산을 코딩하는 추가의 코딩 서열, 예컨대 추가의 기능성을 제공하는 것들을 포함할 수 있다.
일차 PCR 생성물은 그런 다음 항체 또는 TCR 가변 도메인 VH, VL 카파 및 VL 람다 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ의 5' 및 3' 단부에 혼성화하는 새로운 폴리뉴클레오티드 세트로 선택적으로 제2 PCR 반응이 수행될 수 있다 (새로운 폴리뉴클레오티드 세트와 함께 사용된 일차 PCR 반응이 중쇄 또는 경쇄 항체 유전자 또는 Vα 또는 Vβ TCR 유전자 또는 Vγ 또는 Vδ TCR 유전자의 부분들을 증폭시키기 위해 디자인된 것인지에 따라 필요한 대로 수행됨). 이들 폴리뉴클레오티드는 유리하게도 후속 클로닝에 대한 제한 효소들의 규정된 세트 (즉 제한 효소 부위)에 특이적인 DNA 서열을 포함한다. 선택된 제한 효소는 인간 항체 또는 TCR V-유전자 절편 내에서 절단되지 않도록 선택되어야 한다. 그런 폴리뉴클레오티드는 공지된 및 대중적으로 입수 가능한 면역글로불린 또는 TCR 유전자 서열 및 제한 효소 데이터베이스 정보를 기반으로 디자인될 수 있다. 그러나, 포함되어야 할 바람직한 제한 효소 부위는 NcoI, Hind III, MluI 및 NotI이다. 그런 이차 PCR 반응의 생성물은 다양한 V-중쇄, V-경쇄 카파 및 V-경쇄 람다 항체 단편/도메인의 레퍼토리이다. 이런 유형의 이차 PCR 반응은 따라서 일반적으로 관심의 발현 라이브러리 포맷이 scFv 또는 Fv 포맷일 때 수행되고, 이때 항체 또는 TCR의 VH 및 VL 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ 도메인만이 존재한다.
PCR 생성물은 또한 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 단부에 혼성화하는 새로운 프라이머 세트로 PCR 반응이 수행될 수 있다. 이들 폴리뉴클레오티드는 유리하게도 후속 클로닝을 위한 제한 효소의 규정된 세트 (즉 제한 효소 부위)에 특이적인 DNA 서열을 포함할 수 있다. 선택된 제한 효소는 인간 항체 또는 TCR V-유전자 절편 내에서 절단되지 않도록 선택되어야 한다. 그런 폴리뉴클레오티드는 공지된 및 대중적으로 입수 가능한 면역글로불린 또는 TCR 유전자 서열 및 제한 효소 데이터베이스 정보를 기반으로 디자인될 수 있다. 그러나, 포함되어야 할 바람직한 제한 효소 부위는 NcoI, Hind III, MluI 및 NotI이다. 그런 이차 PCR 반응의 생성물은 다양한 VH, VL 카파 및 VL 람다 항체 단편/도메인 또는 Vα 및 Vβ 또는 Vγ 및 Vδ TCR 단편/도메인의 레퍼토리이다.
기술분야의 숙련자는 중쇄 또는 경쇄 또는 Vα 또는 Vβ 사슬 또는 Vγ 또는 Vδ 사슬 Fv 또는 Fab 단편, 또는 단일-사슬 항체 또는 TCR이 또한 이 시스템으로 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 중쇄 또는 경쇄 또는 Vα 또는 Vβ 사슬 또는 Vγ 또는 Vδ 사슬은 돌연변이될 수 있고 이어서 상보하는 사슬이 용액에 첨가될 수 있다. 그런 다음 두 개의 사슬은 조합되어 기능적 항체 단편을 형성하도록 허용된다. 무작위 비-특이적 경쇄 또는 중쇄 또는 Vα 또는 Vβ 사슬 또는 Vγ 또는 Vδ 사슬 서열의 첨가는 다양한 구성원의 라이브러리를 생성하기 위한 조합 시스템의 제조를 허용한다.
본원에 정의된 면역-도전된 숙주의 B 또는 T 림프구로부터 유도된 항체 또는 TCR 유전자의, 가변 중쇄 또는 Vα 사슬 또는 Vγ 사슬 영역, 또는 그것들의 단편, 및/또는 가변 경쇄 또는 Vβ 사슬 또는 Vδ 사슬 영역, 또는 그것들의 단편을 포함하는 클론된 단편들의 그런 레퍼토리의 라이브러리는 발명의 추가 측면을 형성한다. 클론된 가변 영역을 포함하는 이들 라이브러리는 선택적으로 발현 벡터에 삽입되어 발현 라이브러리를 형성할 수 있다.
일부 구체예에서, PCR 반응은 분리된 면역 세포 집단에 함유된 다양한 항체 또는 TCR 사슬의 불변 영역의 전부 또는 일부를 보유하기 위해 설정될 수 있다. 이것은 발현 라이브러리 포맷이 Fab 포맷이고, 이때 중쇄 또는 알파 또는 감마 사슬 성분이 VH 또는 Vα 또는 Vγ 및 CH 또는 Cα 또는 Cγ 도메인을 포함하고 경쇄 또는 Vβ 사슬 또는 Vδ 사슬 성분이 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 사슬 및 CL 또는 Cβ 또는 Cδ 도메인을 포함할 때 바람직하다. 다시 말하면, 항체 또는 TCR 사슬의 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 그런 클론된 단편들의 라이브러리는 발명의 추가의 측면을 형성한다.
이들 핵산은 편리하게도 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 더불어 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중-클로닝 부위는 폴리뉴클레오티드의 분리를 돕기 위하여 핵산으로 삽입될 수 있다. 또한, 번역 가능한 서열이 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오티드의 분리를 돕기 위하여 삽입될 수 있다. 예를 들어, 6-히스티딘 마커 서열이 본 발명의 단백질을 정제하기 위한 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한, 본 발명의 핵산은 선택적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터 또는 링커이다.
추가의 서열이 클로닝 및/또는 발현에서의 기능을 최적화하기 위하여, 폴리뉴클레오티드의 분리를 돕기 위하여, 또는 폴리뉴클레오티드의 세포 안으로의 도입을 개선하기 위하여 그런 클로닝 및/발현 서열에 첨가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 기술분야에 잘 알려져 있다 (예컨대 Ausubel, 상기 동일; 또는 Sambrook, 상기 동일 참조).
본원에 개시된 라이브러리는 다양한 용도에서 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 라이브러리는 복수의 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 복수의 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 라이브러리는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 암플리콘 또는 암플리콘 세트로부터의 복수의 서열 판독을 포함한다. 라이브러리는 보관될 수 있고 분석용 샘플을 생성하기 위해 여러 번 사용될 수 있다. 일부 용도는, 예를 들면 유전형 다형태, RNA 프로세싱의 연구, 및 본원에 기술된 방법에 따라 서열결정을 수행하기 위한 대표적인 클론의 선택을 포함한다. 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 라이브러리, 예컨대 서열결정 또는 증폭을 위한 프라이머 또는 라이브러리가 생성될 수 있고, 여기서 복수의 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000, 50,000,000, 100,000,000 또는 그 이상의 분자 바코드 또는 용기 바코드를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 복수의 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000, 50,000,000, 100,000,000 또는 그 이상의 특유한 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이때 각각의 특유한 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드를 포함한다.
바코드
바코드는 분자 바코드 또는 용기 바코드일 수 있다. 일부 구체예에서, 바코드, 예컨대 분자 바코드 또는 용기 바코드는 각각 2 내지 36 뉴클레오티드, 4 내지 36 뉴클레오티드, 또는 6 내지 30 뉴클레오티드, 또는 8 내지 20 뉴클레오티드, 2 내지 20 뉴클레오티드, 4 내지 20 뉴클레오티드, 또는 6 내지 20 뉴클레오티드의 범위의 길이를 가질 수 있다. 특정 측면으로, 세트 내의 바코드의 용융 온도는 서로의 10℃ 이내, 서로의 5℃ 이내, 또는 서로의 2℃ 이내에 있다. 특정 측면으로, 세트 내의 바코드의 용융 온도는 서로의 10℃ 이내, 서로의 5℃ 이내, 또는 서로의 2℃ 이내에 있지 않다. 다른 측면으로, 바코드는 최소한의 교차-혼성화 세트의 구성원이다. 예를 들어, 그런 세트의 각 구성원의 뉴클레오티드 서열은 구성원이 엄격한 혼성화 조건하에서 임의의 다른 구성원의 상보물과 안정한 듀플렉스를 형성할 수 없는 세트의 모든 다른 구성원의 뉴클레오티드 서열과 충분히 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, 최소한의 교차-혼성화 세트의 각 구성원의 뉴클레오티드 서열은 모든 다른 구성원의 뉴클레오티드 서열과 적어도 2개의 뉴클레오티드가 상이하다. 바코드 기술은 Winzeler et al. (1999) Science 285:901; Brenner (2000) Genome Biol.1:1 Kumar et al. (2001) Nature Rev. 2:302; Giaever et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:793; Eason et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:11046; 및 Brenner (2004) Genome Biol. 5:240에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 분자 바코드는 단일 세포로부터 또는 단일 용기로부터의 단일 분자에 특유한, 또는 둘 이상의 단일 세포로부터 또는 둘 이상의 단일 용기로부터의 복수의 분자 또는 라이브러리의 둘 이상의 분자에 특유한 정보를 포함한다. 본원에서 사용되는 용기 바코드는 상이한 단일 세포로부터 또는 상이한 단일 용기로부터의 폴리뉴클레오티드와 비교하여, 단일 세포로부터 또는 단일 용기로부터의 폴리뉴클레오티드에 특유한 정보를 포함한다. 일부 구체예에서 특유한 정보는 뉴클레오티드의 특유한 서열을 포함한다. 예를 들어, 분자 바코드 또는 용기 바코드의 서열은 그 분자 바코드 또는 용기 바코드를 포함하는 뉴클레오티드의 특유한 또는 무작위 서열의 동일성 및 순서를 측정함으로써 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 특유한 정보는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하기 위해 사용될 수 없다. 예를 들어, 분자 바코드는 한 표적 폴리뉴클레오티드에 부착될 수 있지만, 분자 바코드는 그것이 부착되는 표적 폴리뉴클레오티드를 측정하기 위해 사용될 수 없다. 일부 구체예에서, 특유한 정보는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열의 동일성에 연결된 공지 서열이 아니다. 예를 들어, 용기 바코드는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드에 부착될 수 있지만, 용기 바코드는 그것이 부착되는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 측정하기 위해 사용될 수 없다. 일부 구체예에서, 특유한 정보는 뉴클레오티드의 무작의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 특유한 정보는 폴리뉴클레오티드 상의 뉴클레오티드의 하나 이상의 특유한 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 특유한 정보는 축퇴성 뉴클레오티드 서열 또는 축퇴성 바코드를 포함한다. 축퇴성 바코드는 가변 뉴클레오티드 염기 조성 또는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 축퇴성 바코드는 무작위 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 분자 바코드 또는 용기 바코드의 상보물 서열은 또한 분자 바코드 또는 용기 바코드 서열이다.
분자 바코드 또는 용기 바코드는 임의의 길이의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어 분자 바코드 또는 용기 바코드는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자 바코드 또는 용기 바코드는 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 분자 바코드 또는 용기 바코드는 특정 길이의 뉴클레오티드를 가진다. 예를 들어, 분자 바코드 또는 용기 바코드는 길이로 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드에서 각각의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 적어도 약 2개의 뉴클레오티드를 가진다. 예를 들어, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드에서 각각의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드에서 각각의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 최대 약 1000 뉴클레오티드를 가진다. 예를 들어, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드에서 각각의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드에서 각각의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 동일한 길이의 뉴클레오티드를 가진다. 예를 들어, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드에서 각각의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드에서 하나 이상의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 상이한 길이의 뉴클레오티드를 가진다. 예를 들어 일부 구체예에서, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드에서 하나 이상의 제1 분자 바코드 또는 용기 바코드는 약, 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오티드를 가질 수 있고 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드에서 하나 이상의 제2 분자 바코드 또는 용기 바코드는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000 뉴클레오티드를 가질 수 있으며, 이때 하나 이상의 제1 분자 바코드 또는 용기 바코드의 뉴클레오티드의 수는 하나 이상의 제2 분자 바코드 또는 용기 바코드와 상이하다.
분자 바코드의 수는 복수의 용기에서 표지될 분자의 총 수를 초과할 수 있다. 용기 바코드의 수는 복수의 용기에서 표지될 분자의 총 수를 초과할 수 있다. 예를 들어, 분자 바코드 또는 용기 바코드의 수는 복수의 용기에서 표지될 분자의 총 수보다 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 클 수 있다.
상이한 분자 바코드의 수는 복수의 용기에서 표지될 분자의 총 수를 초과할 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 분자 바코드의 수는 복수의 용기에서 표지될 분자의 총 수보다 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 크다.
단일 용기에서 상이한 분자 바코드의 수는 단일 용기에서 표지될 상이한 분자의 수를 초과할 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 용기의 상이한 분자 바코드의 수는 단일 용기에서 표지될 상이한 분자의 수보다 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 크다.
상이한 용기 바코드의 수는 복수의 용기에서 표지될 분자의 총 수보다 적을 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 용기 바코드의 수는 복수의 용기에서 표지될 분자의 총 수보다 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 적다.
단일 용기에서 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 증폭된 생성물 분자의 수는 단일 용기에서 표지될 상이한 분자의 수를 초과할 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 용기에서 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 증폭된 생성물 분자의 수는 단일 용기에서 표지될 상이한 분자의 수보다 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 크다.
단일 용기에서 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 분자의 수는 단일 용기에서 표지될 상이한 분자의 수보다 적을 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 용기에서 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 분자의 수는 단일 용기에서 표지될 상이한 분자의 수보다 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 적다.
단일 용기에서 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 분자의 수는 한 분자일 수 있다. 단일 용기에서 증폭되지 않은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 분자의 수는 한 분자일 수 있다.
일부 구체예에서, 상이한 분자 바코드의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 100%가 동일한 농도를 가진다. 일부 구체예에서, 상이한 용기 바코드의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 100%가 동일한 농도를 가진다.
일부 구체예에서, 상이한 분자 바코드의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 100%가 상이한 농도를 가진다. 일부 구체예에서, 상이한 용기 바코드의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 100%가 상이한 농도를 가진다.
분자 바코드 또는 용기 바코드의 집단에서 분자 바코드 또는 용기 바코드는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 그 이상의 상이한 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 집단의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 적어도 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000 또는 그 이상의 상이한 서열을 가질 수 있다. 그러므로, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드로부터 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 그 이상의 상이한 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드로부터 적어도 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012 또는 그 이상의 상이한 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 복수의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012 또는 그 이상의 표적 폴리뉴클레오티드로부터 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012 또는 그 이상의 상이한 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각 빈 (bin)의 서열은 동일한 분자 바코드를 함유한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각 빈의 서열은 동일한 암플리콘 세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각 빈의 서열은 복수의 서열을 포함하고 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오티드는 증폭 반응에서 동일한 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도되었다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각 빈의 서열은 동일한 용기 바코드를 함유한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각 빈의 서열은 하나 이상의 암플리콘 세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각 빈의 서열은 복수의 서열을 포함하고 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오티드는 단일 용기 또는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오티드로부터 유도되었다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각 빈의 서열은 동일한 분자 바코드 및 용기 바코드를 함유한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각 빈의 서열은 하나 이상의 암플리콘 세트를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 여기서 각 빈의 서열은 복수의 서열을 포함하고 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오티드는 증폭 반응에서 동일한 폴리뉴클레오티드로부터 및 동일한 단일 세포 또는 용기로부터 유도되었다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 배열하기 위해 사용되지 않는다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 배열하기 위해 사용되지 않는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 배열하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 표적 특이적 영역이 서열을 배열하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 배열하기 위해 사용되지 않는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 배열하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 표적 특이적 영역이 서열을 배열하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 배열하기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 및 용기 바코드는 서열을 그룹화하거나 비닝하기 위해 사용되고, 표적 특이적 영역이 서열을 배열하기 위해 사용된다.
일부 구체예에서, 배열된 서열은 동일한 분자 바코드를 함유한다. 일부 구체예에서, 배열된 서열은 동일한 용기 바코드를 함유한다. 일부 구체예에서, 배열된 서열은 동일한 분자 바코드 및 용기 바코드를 함유한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 서열을 배열하기 위해 사용되고, 배열된 서열은 암플리콘 세트로부터의 둘 이상의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 서열을 배열하기 위해 사용되고, 배열된 서열은 복수의 서열을 포함하며 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오티드는 증폭 반응에서 동일한 폴리뉴클레오티드로부터 유도되었다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 분자 바코드 또는 용기 바코드는 서열을 배열하기 위해 사용되고, 배열된 서열은 복수의 서열을 포함하며 복수의 서열이 생성된 폴리뉴클레오티드는 단일 세포 또는 단일 용기로부터 유도되었다.
방울 생성
복수의 세포로부터의 개별적인 세포로부터의, 또는 그것으로부터 유도된 폴리뉴클레오티드의 분자 및 용기 바코딩과 커플된 복수의 세포의 샘플을 작은 반응 부피로 나누는 것은 생체마커 서열과 같은 서열의 레퍼토리의 고 처리량 서열결정을 가능하게 할 수 있다.
복수의 세포로부터의 개별적인 세포로부터의, 또는 그것으로부터 유도된 폴리뉴클레오티드의 분자 및 용기 바코딩과 커플된 복수의 세포의 샘플을 작은 반응 부피로 나누는 것은 서열, 예컨대 유기체의 전사체의 백분율을 나타내는 서열의 레퍼토리의 고 처리량 서열결정을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 서열의 레퍼토리는 적어도 약 0.00001%, 0.00005%, 0.00010%, 0.00050%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%의 유기체의 전사체를 나타내는 복수의 서열을 포함할 수 있다.
복수의 면역 세포로부터의 개별적인 세포로부터의, 또는 그것으로부터 유도된 폴리뉴클레오티드의 분자 및 용기 바코딩과 커플된 면역 세포의 샘플을 작은 반응 부피로 나누는 것은 중쇄 및 경쇄 서열의 레퍼토리의 고 처리량 서열결정을 가능하게 할 수 있다. 이들 방법은 또한 바코딩된 서열을 기반으로 한 서열결정 후에 중쇄 및 경쇄의 쌍형성을 허용할 수 있다. 샘플을 본원에 기술된 대로 작은 반응 부피로 나누는 것은 또한 감소된 양의 시약의 사용을 가능하게 할 수 있고, 그로써 분석의 물질 비용을 저하시킬 수 있다.
일부 경우에, 역전사 반응 및/또는 증폭 반응은 방울, 예컨대 방울 디지털 PCR로 수행된다. 특정 측면으로, 발명은 표적 물질의 전부 또는 일부를 함유하는 유체 구획을 제공한다. 일부 구체예에서, 구획은 방울이다. 명세서 전체를 통해 "방울"에 대한 참조가 이루어지는 한편, 그 용어는 다르게 표시되지 않는 한 유체 구획 및 유체 칸막이와 상호교환적으로 사용된다. 다르게 표시된 것을 제외하고, "방울"은 편리를 위해 사용되고 임의의 유체 칸막이 또는 구획이 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 방울은 미국 특허 번호 7,622,280에 기술된 것과 같이, 에멀션 조성물 (또는 둘 이상의 혼합할 수 없는 유체의 혼합물)을 포함할 수 있다. 방울은 WO/2010/036352에 기술된 장치에 의해 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 에멀션은 혼합할 수 없는 액체 (예컨대 오일과 물)이 혼합물을 나타낼 수 있다. 오일-상 및/또는 유-중-수 에멀션은 수성 방울 내에 반응 혼합물의 구분을 허용한다. 에멀션은 연속적인 오일상 내에 수성 방울을 포함할 수 있다. 본원에서 제시된 에멀션은 수-중-유 에멀션일 수 있고, 여기서 방울은 연속적인 수성 상 내에 있는 오일 방울이다. 본원에서 제시된 방울은 구획 사이의 혼합을 방지하도록 디자인되고, 이때 각 구획은 그것의 내용물을 증발로부터 및 다른 구획의 내용물과 합쳐지는 것으로부터 보호한다.
본원에서 기술되는 혼합물 또는 에멀션은 안정하거나 불안정할 수 있다. 에멀션은 상대적으로 안정하고 최소한의 연합 (coalescence)을 가진다. 연합은 작은 방울들이 조합하여 점진적으로 커지는 방울을 형성할 때 일어난다. 일부 경우에, 방울 발생기로부터 생성된 방울의 0.00001%, 0.00005%, 0.00010%, 0.00050%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%가 다른 방울들과 연합한다. 에멀션은 또한 그것에 의해 분산된 상이 현탁액 밖으로 박편으로 빠져나오는 과정인 한정된 응집을 가질 수 있다.
약, 적어도 약 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 200, 300, 400, 또는 500 마이크론, 또는 상기보다 미만의, 또는 상기보다 큰 평균 직경을 가진 방울들이 생성될 수 있다. 방울은 약 0.001 내지 약 500, 약 0.01 내지 약 500, 약 0.1 내지 약 500, 약 0.1 내지 약 100, 약 0.01 내지 약 100, 또는 약 1 내지 약 100 마이크론의 평균 직경을 가질 수 있다. 단일분산 또는 다중분산 에멀션을 제조하기 위해 미세채널 교차-흐름 집중 또는 물리적 교반을 사용하여 에멀션 방울을 제조하는 미세유체공학적 방법은 알려져 있다. 방울은 단일분산 방울일 수 있다. 방울은 방울의 크기가 방울의 평균 크기의 플러스 또는 마이너스 5%보다 크게 달라지지 않도록 생성될 수 있다. 일부 경우에, 방울은 방울의 크기가 방울의 평균 크기의 플러스 또는 마이너스 2%보다 크게 달라지지 않도록 생성된다. 방울 발생기는 단일 샘플로부터 방울의 집단을 생성할 수 있고, 이때 방울의 크기는 방울의 총 집단의 평균 크기의 플러스 또는 마이너스 약 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10%보다 크게 달라지지 않는다.
높은 기계적 안정성은 미세유체공학적 조작 및 고-전단 유체 프로세싱 (예컨대 미세유체공학적 모세관에서 또는 유체 통로에서 90도 회전, 예컨대 밸브를 통해)에 유용할 수 있다. 사전- 및 후-열적 처리된 방울 또는 캡슐은 표준 피펫 조작 및 원심분리에 대해 기계적으로 안정할 수 있다.
방울은 수성 샘플을 통해 오일상을 흐르게 함으로써 형성될 수 있다. 수성 상은 세포, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 프라이머, 주형 핵산 및 효소, 예컨대 DNA 중합효소, RNA 중합효소, 및/또는 역전사효소를 포함하여, 증폭 반응을 수행하기 위한 완충된 용액 및 시약을 포함할 수 있다.
수성상은 고체 표면, 예컨대 비드가 있거나 없이 증폭 반응을 수행하기 위한 완충된 용액 및 시약을 포함할 수 있다. 완충된 용액은 약 1, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 또는 200 mM, 또는 약 상기보다 많은, 또는 약 상기보다 적은 Tris를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 염화칼륨의 농도는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200 mM, 또는 약 상기보다 많거나, 또는 약 상기보다 적을 수 있다. 완충된 용액은 약 15 mM Tris 및 50 mM KCl을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP를 포함하여, 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 또는 700 μm 각각의, 또는 약 상기보다 많은, 또는 약 상기보다 적은 농도로 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에 dUTP는 수성상 내에서 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 또는 700, 800, 900, 또는 1000 μm, 또는 약 상기보다 많은, 또는 약 상기보다 적은 농도로 첨가된다. 일부 경우에, 염화 마그네슘 또는 아세트산 마그네슘 (MgCl2)이 약 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 또는 5.0 mM, 또는 약 상기보다 많은, 또는 약 상기보다 적은 농도로 수성 상에 첨가된다. MgCl2의 농도는 약 3.2 mM일 수 있다. 일부 경우에, 아세트산 마그네슘 또는 마그네슘이 사용된다. 일부 경우에, 황산 마그네슘이 사용된다.
BSA 또는 소의 표피로부터의 젤라틴과 같은 비-특이적 차단제가 사용될 수 있고, 이때 젤라틴 또는 BSA는 대략 0.1 내지 0.9% w/v의 농도 범위로 존재한다. 다른 가능한 차단제는 베타락토글로불린, 카제인, 분유, 또는 다른 통상적인 차단제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, BSA 및 젤라틴의 바람직한 농도는 약 0.1% w/v이다.
수성 상 내에서 증폭을 위한 프라이머는 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 또는 2.0 μm, 또는 약 상기보다 많은, 또는 약 상기보다 적은 농도를 가질 수 있다. 수성 상 내에서 프라이머 농도는 약 0.05 내지 약 2, 약 0.1 내지 약 1.0, 약 0.2 내지 약 1.0, 약 0.3 내지 약 1.0, 약 0.4 내지 약 1.0, 또는 약 0.5 내지 약 1.0 μm일 수 있다. 프라이머의 농도는 약 0.5 μm일 수 있다. PCR에서 표적 핵산 농도에 대한 처리 가능한 범위는, 한정하는 것은 아니지만 약 1 pg 내지 약 500 ng을 포함한다.
일부 경우에, 수성 상은 또한 한정하는 것은 아니지만, 비-특이적 바탕/차단 핵산 (예컨대 연어 정자 DNA), 생체보존제 (예컨대 나트륨 아지드), PCR 인핸서 (예컨대 베타인, 트레할로오스 등) 및 억제제 (예컨대 RNAse 억제제)를 포함하여, 첨가제를 포함할 수 있다. 다른 첨가제로는, 예컨대 다이메틸 설폭사이드 (DMSO), 글리세롤, 베타인 (1)수화물 (N,N,N-트라이메틸글리신 = [카록시-메틸] 트라이메틸암모늄), 트레할로오스, 7-데아자-2'-데옥시구아노신 트라이포스페이트 (dC7GTP 또는 7-데아자-2'-dGTP), BSA (우혈청 알부민), 포름아미드 (메탄아미드), 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC), 다른 테트라알킬암모늄 유도체 (예컨대 테트라에틸암모늄 클로라이드 (TEA-Cl) 및 테트라프로필암모늄 클로라이드 (TPrA-Cl), 비-이온성 계면활성제 (예컨대 Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40 (NP-40)), 또는 PREXCEL-Q를 들 수 있다. 일부 경우에, 수성 상은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 첨가제를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 수성 상은 적어도 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 첨가제를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 비-이온성 에틸렌 옥사이드/프로필렌 옥사이드 차단 공중합체는 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 또는 1.0%의 농도로 수성 상에 첨가될 수 있다. 통상적인 생체계면활성제는 플루로닉 F-68, 테트로닉스, 및 Zonyl FSN과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 플루로닉 F-68은 약 0.5% w/v의 농도로 존재할 수 있다.
일부 경우에 황산 마그네슘은 유사한 농도에서 염화 마그네슘에 대해 치환될 수 있다. 다양한 판매회사로부터의 광범위한 통상적인, 상업적 PCR 완충액이 완충된 용액에 대해 치환될 수 있다.
에멀션은 고체-유사 계면 필름을 가지는 미소캡슐 안으로 가열함으로써 변환될 수 있는 액체-유사 계면 필름을 가지는 고도로 단일분산 방울을 제조하기 위해 제형될 수 있고; 그런 미소캡슐은 PCR 증폭과 같은 반응 과정을 통해 내용물을 보유할 수 있는 생체반응기로서 행동할 수 있다. 미소캡슐 형태로의 변환은 가열시 일어날 수 있다. 예를 들어, 그런 변환은 약 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃, 또는 95℃보다 큰 온도에서 일어날 수 있다. 일부 경우에 이 가열은 써모사이클러 (thermocycler)를 사용하여 일어난다. 가열 과정 동안, 유체 또는 미네랄 오일 오버레이가 증발을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 과도한 연속상 오일은 가열 전에 제거될 수 있거나 제거될 수 없다. 생체적합성 캡슐은 광범위한 열적 및 기계적 프로세싱을 가로질러 연합 및/또는 응집에 대해 저항할 수 있다. 변환에 이어서, 캡슐은 약 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 또는 40℃, 또는 약 상기보다 큰, 또는 약 상기보다 작은 온도에서 보관될 수 있다. 이들 캡슐은 생화학적 용도에서, 예컨대 거대분자, 특히 핵산 또는 단백질의 믹스를 함유하는, 또는 둘 다 함께 함유하는 수성 생물학적 유체의 안정한, 디지털화된 캡슐화; 약물 및 백신 전달; 생체분자 라이브러리; 임상적 영상화 용도, 등에 유용할 수 있다.
미소캡슐은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있고 특히 고온에서 연합에 저항할 수 있다. 따라서, PCR 증폭 반응은 매우 높은 밀도 (예컨대 단위 부피당 반응의 수)에서 일어날 수 있다. 일부 경우에, 100,000, 500,000, 1,000,000, 1,500,000, 2,000,000, 2,500,000, 5,000,000, 또는 10,000,000보다 많은 별도의 반응이 ml당 일어날 수 있다. 일부 경우에, 반응은 단일 웰에서, 예컨대 미소적정 플레이트의 웰에서 반응 부피 사이의 내부-혼합 없이 일어난다. 미소캡슐은 또한 역전사, 프라이머 연장, 및/또는 PCR 반응이 일어나는 것을 가능하게 하기에 필요한 다른 성분들, 예컨대 프라이머, 프로브, dNTP, DNA 또는 RNA 중합효소 등을 함유할 수 있다. 이들 캡슐은 광범위한 열적 및 기계적 프로세싱에 걸쳐 연합 및 응집에 대한 저항을 나타낸다.
일부 경우에, 증폭 단계는 디지털 PCR, 예컨대 미세유체공학-기반 디지털 PCR 또는 방울 디지털 PCR을 수행함으로써 수행된다.
방울은 미세유체공학 시스템 또는 장치를 사용하여 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 "미소(미세)-" 접두어 (예를 들면 "미소채널" 또는 "미세유체공학적")는 일반적으로, 약 1 mm 미만, 일부 경우에는 약 100 마이크론 (마이크로미터) 미만의 폭 또는 직경을 가지는 요소 또는 물품을 나타낸다. 일부 경우에, 요소 또는 물품은 유체가 그것을 통해 흐를 수 있는 채널을 포함한다. 추가로, 본원에서 사용되는 "미세유체공학적"은 적어도 하나의 미소규모 채널을 포함하는 장치, 기기 또는 시스템을 나타낸다.
미세유체공학적 시스템 및 장치는 다양한 맥락에서, 전형적으로 소형화된 실험실 (예컨대 임상) 분석의 맥락에서 기술되었다. 다른 용도 역시 기술되어 있다. 예를 들면 국제 특허 출원 공개공보 번호 WO 01/89788; WO 2006/040551; WO 2006/040554; WO 2004/002627; WO 2008/063227; WO 2004/091763; WO 2005/021151; WO 2006/096571; WO 2007/089541; WO 2007/081385 및 WO 2008/063227.
방울은 일반적으로 제2 담체 유체에 제1 샘플 유체의 양을 포함한다. 방울을 형성하기 위한 기술분야에 공지되어 있는 임의의 기법이 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 표적 물질 (예컨대 면역 세포)을 함유하는 샘플 유체 스트림을 흐르게 하여 흐르는 담체 유체의 두 개의 반대되는 스트림과 상호작용하게 하는 단계를 포함한다. 담체 유체는 샘플 유체와 혼합할 수 없다. 샘플 유체와 흐르는 담체 유체의 두 개의 반대되는 스트림과의 교차는 샘플 유체의 표적 물질을 함유하는 개별적인 샘플 방울 안으로의 칸막이를 초래한다.
담체 유체는 샘플 유체와 혼합할 수 없는 임의의 유체일 수 있다. 예시적인 담체 유체는 오일이다. 특정 구체예에서, 담체 유체는 계면활성제를 포함한다.
동일한 방법이 중합효소 사슬 반응 (PCR)과 같은 증폭 반응, 또는 다중-가닥 대체 증폭과 같은 비-PCR 기반 증폭 반응, 또는 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있는 다른 방법을 위한 시약과 같은 다른 시약을 함유하는 개별적인 방울을 생성하는 데 적용될 수 있다. PCR-기반 증폭 반응을 수행하기에 적합한 시약은 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람들에게 알려져 있고, 한정하는 것은 아니지만, DNA 중합효소, 전방 및 역 프라이머, 데옥시뉴클레오티드 트라이포스페이트 (dNTP), 및 하나 이상의 완충액을 포함한다.
특정 구체예에서, 유체 구획은 표적 물질 (예컨대 면역 세포 및/또는 비드와 같은 고체 지지체)을 포함하는 제1 유체 파티션 (예컨대 방울) 및 제2 유체 (예컨대 유체 스트림으로서 또는 방울 내의)를 제공함으로써 형성된다. 제1 및 제2 유체는 침지되어 방울이 형성된다. 침지는 전기장을 두 유체에 인가함으로써 이루어질 수 있다. 특정 구체예에서, 제2 유체는 증폭 반응, 예컨대 중합효소 사슬 반응 또는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 함유한다.
특정 측면으로, 발명은 각각의 구성물이 특유한 N-량체 및 기능적 N-량체를 포함하는 복수의 핵산 구성물을 얻은 단계를 포함하는, 특유하게 바코딩된 중쇄 및 경쇄 항체 서열 및/또는 알파 및 베타 사슬 TCR 서열 및/또는 감마 및 델타 사슬 TCR 서열의 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다. 기능적 N-량체는 무작위 N-량체, PCR 프라이머, 보편적 프라이머, 항체, 달라붙는 단부, 또는 임의의 다른 서열일 수 있다. 방법은 각각이 특유한 구성물의 하나 이상의 복사물을 함유하고 있는 수 N의 유체 구획의 M 세트를 제조하는 단계를 포함한다. 방법은 세트의 각 구획에 추가의 구성물을 첨가하고, 그것을 각 세트에 대해 반복하여 각각이 특유한 쌍의 구성물을 함유하고 있는 NxM 구획을 제조함으로써 더 복잡한 바코드 라이브러리를 생성할 수 있다. 쌍은 새로운 구성물을 제조하기 위해 혼성화되거나 결찰될 수 있다. 바코드 라이브러리의 각 구성물에서, 각각의 특유한 N-량체는 서열결정, 프로브 혼성화, 다른 방법, 또는 방법들의 조합에 의한 확인을 위해 적응될 수 있다.
방울 라이브러리
일반적으로, 방울 라이브러리는 단일 모듬으로 함께 모아진 많은 라이브러리 요소로 제조된다. 라이브러리는 단일 라이브러리 요소 내지 1x1015 또는 그 이상의 라이브러리 요소까지 복잡성이 다를 수 있다. 각 라이브러리 요소는 고정된 농도에서 하나 이상의 주어진 성분이다. 요소는, 한정하는 것은 아니지만, 세포, 비드, 아미노산, 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 작은 분자 화학적 화합물일 수 있다. 요소는 분자 바코드, 용기 바코드 또는 둘 다와 같은 확인자를 함유할 수 있다.
세포 라이브러리 요소는 한정하는 것은 아니지만, 하이브리도마, B-세포, T-세포, 일차 세포, 배양된 세포주, 암세포, 줄기세포 또는 임의의 다른 세포 유형을 포함할 수 있다. 세포 라이브러리 요소는 1 내지 수천 분의 수십까지의 많은 세포를 개별적인 방울로 캡슐화함으로써 제조된다. 캡슐화된 세포의 수는 통상적으로 세포의 수 밀도 및 방울의 부피로부터 푸아송 통계학에 의해 주어진다. 그러나, 일부 경우에 수는 Edd et al., "Controlled encapsulation of single-cell into monodisperse picolitre drops." Lab Chip, 8(8):1262-1264, 2008에 기술된 것과 같이, 푸아송 통계학으로부터 편차가 있다. 세포의 신중한 본질은 라이브러리가 복수의 세포 변이체, 예컨대 한 항체 또는 TCR을 각각 생성하는 면역 세포와 함께 다량으로 제조되는 것을 허용하고, 이때 세포들은 단일 출발 배지에 존재하고 다음에 그 배지는 최대 한 세포를 함유하는 개별적인 방울 캡슐로 부서진다. 개별적인 방울 캡슐 내부의 세포는 그런 다음 용해되고, 용해된 세포로부터의 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오티드 및/또는 알파 및 베타 사슬 폴리뉴클레오티드 및/또는 감마 및 델타 사슬 폴리뉴클레오티드가 분자 바코드 및 용기 바코드로 바코딩되고 증폭된 후 조합되거나 모아져서 중쇄 및 경쇄 및/또는 알파 및 베타 사슬 및/또는 감마 및 델타 사슬 라이브러리 요소로 구성되는 라이브러리가 형성된다.
비드 기반 라이브러리 요소는 하나 이상의 비드를 함유하고, 또한 다른 시약, 예컨대 항체, 효소 또는 다른 단백질을 함유할 수 있다. 모든 라이브러리 요소가 상이한 유형의 비드를 함유하지만 둘러싼 배지가 동일한 경우에, 라이브러리 요소는 모두 단일 출발 유체로부터 제조되거나 또는 다양한 출발 유체를 가질 수 있다. 변이체의 모듬으로부터 다량으로 제조된 세포 라이브러리의 경우에, 라이브러리 요소는 다양한 출발 유체로부터 제조될 것이다. 방울당 정확하게 하나의 세포를 가지는 것이 바람직하며, 이때 복수의 세포로 출발할 때 하나 이상의 세포를 함유하는 방울은 소수일 뿐이다. 일부 경우에, 방울당 정확하게 하나의 세포를 가지는 방울이 더 많고 비어있는 방울 또는 하나 이상의 세포를 함유하는 방울은 예외적으로 소수가 되도록 방울의 증대된 로딩을 제공하기 위해 푸아송 통계학으로부터의 변이가 이루어질 수 있다.
일부 구체예에서, 방울당 정확하게 하나의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 가지는 것이 바람직하고, 복수의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드로 출발할 때 하나 이상의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 방울은 소수 뿐이다. 일부 경우에, 방울당 정확하게 하나의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 가지는 방울이 더 많고 비어있는 방울 또는 하나 이상의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 방울은 예외적으로 소수가 되도록 방울의 증대된 로딩을 제공하기 위해 푸아송 통계학으로부터의 변이가 이루어질 수 있다.
방울 라이브러리의 실례는 비드로부터, 세포, 작은 분자, DNA, 프라이머, 항체 및 바코딩된 폴리뉴클레오티드까지 상이한 내용물을 가지는 방울의 모듬이다. 방울 범위는 직경이 대략 0.5 마이크론 내지 500 마이크론의 크기이고, 그것은 약 1 피코리터 내지 1 나노리터에 상응한다. 그러나, 방울은 5 마이크론 정도로 작을 수 있고 500 마이크론 정도로 클 수 있다. 바람직하게, 방울은 직경으로 100 마이크론 미만, 약 1 마이크론 내지 약 100 마이크론이다. 가장 바람직한 크기는 직경으로 약 20 내지 40 마이크론이다 (10 내지 100 피코리터). 방울 라이브러리의 조사된 바람직한 특성은 삼투성 압력 균형, 균일한 크기 및 크기 범위이다.
본 발명에 의해 제공된 방울 라이브러리 내부에 포함된 방울은 바람직하게는 크기가 균일하다. 즉, 라이브러리 내부의 임의의 방울의 직경은 동일한 라이브러리 내부의 다른 방울의 직경과 비교할 때 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 미만으로 달라질 것이다. 라이브러리의 방울의 균일한 크기는 방울의 안정성 및 통합성을 유지하는 데 결정적일 수 있고 또한 본원에 기술된 다양한 생물학적 및 화학적 분석을 위한 라이브러리 내의 방울의 후속적 사용에 필수적일 수 있다.
발명은 혼합할 수 없는 유체 내에 복수의 수성 방울을 포함하는 방울 라이브러리를 제공하며, 여기서 각각의 방울은 바람직하게는 실질적으로 크기가 균일하고 상이한 라이브러리 요소를 포함한다. 발명은 상이한 라이브러리 요소를 포함하는 단일 수성 유체를 제공하는 단계, 혼합할 수 없는 유체 내의 수성 방울로 각각의 라이브러리 요소를 캡슐화하는 단계를 포함하는, 방울 라이브러리의 형성 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 상이한 유형의 요소들 (예컨대 세포 또는 비드)은 동일한 배지에 함유된 단일 공급원에 모아진다. 초기 모음 후에, 요소들은 방울로 캡슐화되어 상이한 유형의 비드 또는 세포를 가진 각 방울이 상이한 라이브러리 요소인 방울의 라이브러리가 생성된다. 초기 용액의 희석은 캡슐화 과정을 가능하게 한다. 일부 구체예에서, 형성된 방울은 라이브러리 요소의 다중 복사물을 함유할 것이다. 캡슐화되는 요소들은 일반적으로 유형의 변이체이다. 한 실례에서, 요소는 혈액 샘플의 면역 세포이고, 각각의 면역 세포는 면역 세포의 뉴클레오티드의 항체 서열을 증폭시키고 바코딩하기 위해 캡슐화된다.
예를 들어, 에멀션 라이브러리의 한 유형에는, 상이한 배지에 상이한 입자, 즉 세포 또는 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 가지고 모음 전에 캡슐화되는 라이브러리 요소가 있다. 한 실례에서, 라이브러리 요소의 특정 수, 즉 상이한 세포 또는 바코딩된 폴리뉴크레오티드의 수가 상이한 배지 내에 함유된다. 각각의 라이브러리 요소는 별도로 유화되고 모아지고, 그 시점에 각각의 n 수의 모아진 상이한 라이브러리 요소는 조합되고 단일 푸울로 모아진다. 그 결과의 푸울은 각각의 방울이 상이한 유형의 입자를 함유하고 있는, 복수의 유-중-수 에멀션 방울을 함유한다.
일부 구체예에서, 형성된 방울은 단일 라이브러리를 함유하거나 또는 아무것도 함유하지 않을 것이다, 즉 비어있을 것이다. 다른 구체예에서, 형성된 방울은 라이브러리 요소의 다중 복사물을 함유할 것이다. 비드의 내용물은 푸아송 분포를 따르는데, 만약 많은 사건이 공지의 평균 속도로 및 마지막 사건 이후 시간과 독립적으로 일어난다면 많은 사건이 고정된 시간 동안 발생하는 가능성을 나타내는 별개의 가능성 분포가 있다. 라이브러리를 생성하기 위해 사용된 오일 및 계면활성제는 방울 사이에서의 라이브러리의 내용물의 교환을 방지한다.
역전사
일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 RNA로부터 역전사에 의해 제조된다. 일부 경우에, 표적 폴리뉴클레오티드는 DNA로부터, 예컨대 중합효소를 사용하는 프라이머 연장에 의해 제조된다.
본원에 기술된 방법은 결합된 역전사-PCR (역전사-PCR)에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 역전사 및 PCR은 두 개의 구별되는 단계로 수행될 수 있다. 먼저 샘플 mRNA의 cDNA 복사물이 폴리뉴클레오티드 dT 프라이머, 서열 특이적 프라이머, 보편적 프라이머 또는 본원에 기술된 임의의 프라이머를 사용하여 합성될 수 있다.
역전사 및 PCR은 단일 폐쇄형 용기 반응으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 3개의 프라이머가 사용될 수 있는데, 역전사용으로 하나 및 PCR 용으로 2개가 사용된다. 역전사용 프라이머는 PCR 암플리콘의 위치에 대해 mRNA 3'에 결합할 수 있다. 비록 필수적인 것은 아니지만, 역전사 프라이머는 RNA 잔기 또는 예컨대 2'-O-메틸 RNA 염기와 같은 변형된 유사체를 포함할 수 있고, mRNA에 혼성화될 때 RNase H에 대한 기질을 형성하지 않을 것이다.
역전사 반응을 수행하기 위한 온도는 사용되는 역전사효소에 좌우된다. 일부 경우에, 열안정성 역전사효소가 사용되고 역전사 반응은 약 37℃ 내지 약 75℃, 약 37℃ 내지 약 50℃, 약 37℃ 내지 약 55℃, 약 37℃ 내지 약 60℃, 약 55℃ 내지 약 75℃, 약 55℃ 내지 약 60℃, 약 37℃, 또는 약 60℃에서 수행된다. 일부 경우에, 전사된 생성물의 단부에 3개 이상의 비-주형 말단 뉴클레오티드를 전달하는 역전사효소가 사용된다.
본원에 기술된 역전사 반응 및 PCR 반응은 기술분야에 알려져 있는 다양한 형태, 예컨대 튜브, 미세적정 플레이트, 미세유체공학적 장치, 또는 바람직하게는 방울로 수행될 수 있다.
역전사 반응은 5 μL 내지 100 μL의 범위의 부피로, 또는 10 μL 내지 20 μL의 반응 부피로 수행될 수 있다. 방울에서, 반응 부피는 1 pL 내지 100 nL, 또는 10 pL 내지 1 nL의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 역전사 반응은 약 1 nL 또는 그 미만인 부피를 가지는 방울에서 수행된다. 일부 경우에, PCR 반응은 1 pL 내지 100 nL, 바람직하게는 10 pL 내지 1 nL의 범위의 반응 부피를 가지는 방울에서 일어난다. 일부 경우에, PCR 반응은 약 1 nL 또는 그 미만인 부피를 가지는 방울에서 수행된다. 일부 경우에, 역전사 반응 및 PCR 반응은 1 pL 내지 100 nL, 또는 10 pL 내지 1 nL의 범위의 반응 부피를 가지는 동일한 방울에서 수행된다. 일부 경우에, 역전사 반응 및 PCR 반응은 약 1 nL 또는 그 미만인 부피 또는 약 1 pL 또는 그 미만인 부피를 가지는 방울에서 수행된다. 일부 경우에, 역전사 반응 및 PCR 반응은 상이한 방울에서 수행된다. 일부 경우에, 역전사 반응 및 PCR 반응은 각각이 1 pL 내지 100 nL 또는 10 pL 내지 1 nL의 범위의 반응 부피를 가지는 복수의 방울에서 수행된다. 일부 경우에, 역전사 반응 및 PCR 반응은 각각이 약 1 nL 또는 그 미만인 부피를 가지는 복수의 방울에서 수행된다.
일부 경우에, 제1 PCR 반응은 1 pL 내지 100 nL, 바람직하게는 10 pL 내지 1 nL의 범위의 반응 부피를 가지는 제1 방울에서 일어나고 제2 PCR 반응은 1 pL 내지 100 nL, 바람직하게는 10 pL 내지 1 nL의 범위의 반응 부피를 가지는 제2 방울에서 일어난다. 일부 경우에, 제1 PCR 반응은 약 1 nL 또는 그 미만인 부피를 가지는 제1 방울에서 일어나고 제2 PCR 반응은 약 1 nL 또는 그 미만인 부피를 가지는 제2 방울에서 일어난다.
일부 경우에, 제1 PCR 반응 및 제2 PCR 반응은 각각이 1 pL 내지 100 nL 또는 10 pL 내지 1 nL의 범위의 반응 부피를 가지는 복수의 방울에서 수행된다. 일부 경우에, 제1 PCR 반응 및 제2 PCR 반응은 각각이 약 1 nL 또는 그 미만인 부피를 가지는 복수의 방울에서 수행된다.
표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 RNA는 하나 이상의 역전사 프라이머를 사용하여 cDNA로 역전사될 수 있다. 하나 이상의 역전사 프라이머는 RNA의 영역, 예컨대 불변 영역 (예컨대 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 또는 mRNA의 폴리-A 꼬리표)에 상보하는 영역을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 역전사 프라이머는 제1 RNA의 불변 영역에 상보하는 영역을 가진 제1 역전사 프라이머 및 제2 RNA의 불변 영역에 상보하는 영역을 가진 제2 역전사 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 역전사 프라이머는 제1 RNA의 불변 영역에 상보하는 영역을 가진 제1 역전사 프라이머 및, 하나 이상의 RNA의 불변 영역에 각각 상보하는 영역을 가진 하나 이상의 역전사 프라이머를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 역전사 프라이머는 바코드를 포함하지 않는다.
역전사 프라이머는 RNA의 영역에 상보하지 않는 영역을 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보하지 않는 영역은 RNA에 상보하는 프라이머의 영역에 대해 5'이다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보하지 않는 영역은 RNA에 상보하는 프라이머의 영역에 대해 3'이다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보하지 않는 영역은 5' 오버행 영역이다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보하지 않는 영역은 증폭 및/또는 서열결정 반응에 대한 프라이밍 부위를 포함한다. 본원에 기술된 하나 이상의 프라이머를 사용함으로써, RNA 분자는 기술분야에 공지된 적합한 시약을 사용하여 역전사된다.
RNA 분자의 역전사 반응을 수행한 후에, 결과적으로 생성된 cDNA 분자는 분자 바코드 및 용기 바코드로 바코딩될 수 있고 하나 이상의 PCR 반응, 예컨대 제1 및/또는 제2 PCR 반응에 의해 증폭된다. 제1 및/또는 제2 PCR 반응은 한 쌍의 프라이머 또는 복수의 프라이머 세트를 활용할 수 있다. 제1 및/또는 제2 PCR 반응은 복수의 전방/역 프라이머 및 역 프라이머를 활용할 수 있다. 제1 및/또는 제2 PCR 반응은 복수의 전방/역 프라이머 및 전방 프라이머를 활용할 수 있다. 복수의 전방/역 프라이머의 제1 및/또는 제2 프라이머는 cDNA 분자 또는 바코딩된 cDNA 분자에 상보하는 영역을 함유하는 전방/역 프라이머일 수 있다. 복수의 전방/역 프라이머의 제1 및/또는 제2 프라이머는 바코딩된 cDNA 분자에 상보하는 영역을 함유하는 전방/역 프라이머일 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 전방/역 프라이머는 복수의 전방/역 프라이머의 각각의 전방/역 프라이머가 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 V 절편에 대한 하나 이상의 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 V 절편에 대한 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 전방/역 프라이머 및 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 V 절편에 대한 하나 이상의 다른 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 다른 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 V 절편에 대한 제1 및/또는 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 전방/역 프라이머 및 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 V 절편에 대한 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 V 절편에 대한 제1 및/또는 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 전방/역 프라이머, cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 V 절편에 대한 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 전방/역 프라이머 및 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 V 절편에 대한 제3 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제3 전방/역 프라이머, 등을 포함한다. 복수의 전방/역 프라이머의 프라이머는 샘플 중의 세포, 예컨대 면역 B-세포 또는 T-세포에 의해 발현된 모든 V 절편의 모든 가능한 상류 또는 하류 영역에 아닐링하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 전방/역 프라이머는 복수의 전방/역 프라이머의 각각의 전방/역 프라이머가 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 C 절편에 대한 하나 이상의 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 C 절편에 대한 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 전방/역 프라이머 및 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 C 절편에 대한 하나 이상의 다른 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 다른 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 C 절편에 대한 제1 및/또는 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 전방/역 프라이머 및 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 C 절편에 대한 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 C 절편에 대한 제1 및/또는 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 전방/역 프라이머, cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 C 절편에 대한 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 전방/역 프라이머 및 cDNA 또는 바코딩된 cDNA의 C 절편에 대한 제3 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제3 전방/역 프라이머, 등을 포함한다. 복수의 전방/역 프라이머의 프라이머는 샘플 중의 세포, 예컨대 면역 B-세포 또는 T-세포에 의해 발현된 모든 C 절편의 모든 가능한 상류 또는 하류 영역에 아닐링하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 전방/역 프라이머는 복수의 전방/역 프라이머의 각각의 전방/역 프라이머가 바코딩된 cDNA의 분자 바코드에 대한 하나 이상의 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 바코딩된 cDNA의 분자 바코드에 대한 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 전방/역 프라이머 및 바코딩된 cDNA의 분자 바코드에 대한 하나 이상의 다른 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 다른 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 바코딩된 cDNA의 분자 바코드에 대한 제1 및/또는 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 전방/역 프라이머 및 바코딩된 cDNA의 분자 바코드에 대한 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 바코딩된 cDNA의 분자 바코드에 대한 제1 및/또는 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 전방/역 프라이머, 바코딩된 cDNA의 분자 바코드에 대한 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 전방/역 프라이머 및 바코딩된 cDNA의 분자 바코드에 대한 제3 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제3 전방/역 프라이머, 등을 포함한다. 복수의 전방/역 프라이머의 프라이머는 샘플 중의 세포, 예컨대 면역 B-세포 또는 T-세포에 의해 발현된 모든 분자 바코드의 모든 가능한 상류 또는 하류 영역에 아닐링하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 전방/역 프라이머는 복수의 전방/역 프라이머의 각각의 전방/역 프라이머가 바코딩된 cDNA의 용기 바코드에 대한 하나 이상의 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 바코딩된 cDNA의 용기 바코드에 대한 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 전방/역 프라이머 및 바코딩된 cDNA의 용기 바코드에 대한 하나 이상의 다른 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 하나 이상의 다른 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 바코딩된 cDNA의 용기 바코드에 대한 제1 및/또는 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 전방/역 프라이머 및 바코딩된 cDNA의 용기 바코드에 대한 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 전방/역 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 복수의 전방/역 프라이머는 바코딩된 cDNA의 용기 바코드에 대한 제1 및/또는 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 및/또는 제2 전방/역 프라이머, 바코딩된 cDNA의 용기 바코드에 대한 제2 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 전방/역 프라이머 및 바코딩된 cDNA의 용기 바코드에 대한 제3 상류 또는 하류 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제3 전방/역 프라이머, 등을 포함한다. 복수의 전방/역 프라이머의 프라이머는 샘플 중의 세포, 예컨대 면역 B-세포 또는 T-세포에 의해 발현된 모든 용기 바코드의 모든 가능한 상류 또는 하류 영역에 아닐링하기 위해 사용될 수 있다.
복수의 전방/역 프라이머의 전방/역 프라이머는 RNA의 영역에 상보하지 않는 영역을 더 포함한다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보하지 않는 영역은 RNA에 상보하는 전방/역 프라이머의 영역에 대해 5'이다 (즉 V 절편의 상류 또는 하류 영역). 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보하지 않는 영역은 RNA에 상보하는 전방/역 프라이머의 영역에 대해 3'이다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보하지 않는 영역은 5' 오버행 영역이다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보하지 않는 영역은 증폭 및/또는 제2 서열결정 반응에 대한 프라이밍 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보하지 않는 영역은 증폭 및/또는 제3 서열결정 반응에 대한 프라이밍 부위를 포함한다. 일부 구체예에서, RNA의 영역에 상보하지 않는 영역은 제2 및 제3 서열결정 반응에 대한 프라이밍 부위를 포함한다. 본원에 기술된 하나 이상의 전방/역 프라이머 및 역 프라이머를 사용함으로써, cDNA 분자는 기술분야에 공지된 적합한 시약을 사용하여 증폭된다. 일부 구체예에서, 영역은 RNA의 영역, 예컨대 불변 영역 또는 mRNA의 폴리-A 꼬리표에 상보한다.
증폭
표적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 샘플은 증폭될 수 있는 mRNA 또는 그것의 단편을 포함할 수 있다. 일부 경우에, mRNA 또는 그것의 단편의 평균 길이는 약 100, 200, 300, 400, 500, 또는 800 염기쌍 미만, 또는 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 뉴클레오티드 미만, 또는 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 킬로염기 미만일 수 있다. 일부 경우에, 상대적으로 짧은 주형, 예컨대 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 염기인 주형을 함유하는 샘플로부터의 표적 서열이 증폭된다.
증폭 반응은 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 첨가제는 다이메틸 설폭사이드 (DMSO), 글리세롤, 베타인 (1)수화물 (N,N,N-트라이메틸글리신 = [카록시-메틸]트라이메틸암모늄), 트레할로오스, 7-데아자-2'-데옥시구아노신 트라이포스페이트 (dC7GTP 또는 7-데아자-2'-dGTP), BSA (우혈청 알부민), 포름아미드 (메탄아미드), 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC), 다른 테트라알킬암모늄 유도체 (예컨대 테트라에틸암모늄 클로라이드 (TEA-Cl) 및 테트라프로필암모늄 클로라이드 (TPrA-Cl), 비-이온성 계면활성제 (예컨대 Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40 (NP-40)), 또는 PREXCEL-Q이다. 일부 경우에, 증폭 반응은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 첨가제를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 증폭 반응은 적어도 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 첨가제를 포함할 수 있다.
열순환 반응은 반응 부피 (예컨대 방울)에 함유된 샘플에 대해 수행될 수 있다. 방울은 교반, 음파처리를 통해 또는 T-채널 접합을 통한 미세유체공학적으로 또는 기술분야에 친숙한 것들에 의한 다른 수단으로 생성된, 다중분산 또는 바람직하게는 단일분산일 수 있다. 밀도는 20,000 방울/40ul (1 nL 방울), 200,000 방울/40ul (100 pL 방울)를 초과할 수 있다. 방울은 열순환 동안 무상으로 유지될 수 있다. 방울은 열순환 동안 약 10,000 방울/μL, 100,000 방울/μL, 200,000 방울/μL, 300,000 방울/μL, 400,000 방울/μL, 500,000 방울/μL, 600,000 방울/μL, 700,000 방울/μL, 800,000 방울/μL, 900,000 방울/μL 또는 1,000,000 방울/μL보다 큰 밀도에서 무상으로 유지될 수 있다. 다른 경우에, 둘 이상의 방울은 열순환 동안 연합하지 않는다. 다른 경우에, 100보다 큰 또는 1,000보다 큰 방울이 열순환 동안 연합하지 않는다.
프라이머 연장을 촉매하는 임의의 DNA 중합효소, 이를테면 한정하는 것은 아니지만 대장균 DNA 중합효소, 대장균 DNA 중합효소 1의 클레노우 단편, T7 DNA 중합효소, T4 DNA 중합효소, Taq 중합효소, Pfu DNA 중합효소, 벤트 (Vent) DNA 중합효소, 박테리오파지 29, REDTaqTM, 게놈 DNA 중합효소 또는 서열결정제가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 열안정성 DNA 중합효소가 사용된다. 반응이 95℃에서 2분 동안 가열된 후 중합효소가 첨가되거나 중합효소가 사이클 1에서 제1 가열 단계까지 무상으로 유지될 수 있는 고온 출발 PCR이 또한 수행될 수 있다. 고온 출발 PCR은 비특이적 증폭을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 수, 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45 사이클, 또는 상기보다 많은, 또는 상기보다 적은 수의 PCR 사이클이 DNA를 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 증폭 사이클의 수는 약 1 내지 45, 10 내지 45, 20 내지 45, 30 내지 45, 35 내지 45, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 20 내지 35, 25 내지 35, 30 내지 35, 또는 35 내지 40일 수 있다.
표적 핵산의 증폭은 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 표적 핵산은 중합효소 사슬 반응 (PCR) 또는 등온 DNA 증폭에 의해 증폭될 수 있다. 사용될 수 있는 PCR 기법의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 정량 PCR, 정량 형광 PCR (QF-PCR), 복합 형광 PCR (MF-PCR), 실시간 PCR (역전사-PCR), 단일 세포 PCR, 제한 단편 길이 다형태 PCR (PCR-RFLP), PCR-RFLP/역전사-PCR-RFLP, 고온 출발 PCR, 네스티드 PCR, 인시튜 폴로니 PCR, 인시튜 롤링 써클 증폭 (RCA), 디지털 PCR (dPCR), 방울 디지털 PCR (ddPCR), 가교 PCR, 피코리터 PCR 및 에멀션 PCR이 있다. 다른 적합한 증폭 방법으로는 리가아제 사슬 반응 (LCR), 전사 증폭, 분자 반전 프로브 (MIP) PCR, 자가-지속성 서열 복제, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 선택적 증폭, 공통 서열 프라임된 중합효소 사슬 반응 (CP-PCR), 임의적으로 프라임된 중합효소 사슬 반응 (AP-PCR), 축퇴성 폴리뉴클레오티드-프라임된 PCR (DOP-PCR) 및 핵산 기반 서열 증폭 (NABSA)이 있다. 본원에서 사용될 수 있는 다른 증폭 방법은 미국 특허 번호 5,242,794; 5,494,810; 4,988,617; 및 6,582,938에 기술된 방법을 포함할 뿐 아니라, Q 베타 복제효소 매개된 RNA 증폭을 포함한다. 증폭은 등온 증폭, 예컨대 등온 선형 증폭일 수 있다.
일부 구체예에서, 증폭은 고체 지지체 상에서 일어나지 않는다. 일부 구체예에서, 증폭은 고체 지지체 상에서 방울에서 일어나지 않는다. 일부 구체예에서, 증폭은 증폭이 방울에서 일어나지 않을 때 고체 지지체 상에서 일어난다.
증폭 반응은 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 첨가제는 다이메틸 설폭사이드 (DMSO), 글리세롤, 베타인 (1)수화물 (N,N,N-트라이메틸글리신 = [카록시-메틸]트라이메틸암모늄), 트레할로오스, 7-데아자-2'-데옥시구아노신 트라이포스페이트 (dC7GTP 또는 7-데아자-2'-dGTP), BSA (우혈청 알부민), 포름아미드 (메탄아미드), 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC), 다른 테트라알킬암모늄 유도체 (예컨대 테트라에틸암모늄 클로라이드 (TEA-Cl) 및 테트라프로필암모늄 클로라이드 (TPrA-Cl), 비-이온성 계면활성제 (예컨대 Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40 (NP-40)), 또는 PREXCEL-Q이다. 일부 구체예에서, 증폭 반응은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 첨가제를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 증폭 반응은 적어도 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 첨가제를 포함할 수 있다.
프라이머
일반적으로, 하나 이상의 쌍의 프라이머가 증폭 반응에 사용될 수 있다; 프라이머 쌍의 한 프라이머는 전방 프라이머일 수 있고 프라이머 쌍의 한 프라이머는 역 프라이머일 수 있다.
일부 경우에, 제1 쌍의 프라이머가 증폭 반응에 사용될 수 있다; 제1 쌍의 한 프라이머는 제1 표적 폴리뉴클레오티드 분자의 서열에 상보하는 전방 프라이머일 수 있고 제1 쌍의 한 프라이머는 제1 표적 폴리뉴클레오티드 분자의 제2 서열에 상보할 수 있는 역 프라이머일 수 있으며, 제1 표적 유전자좌가 제1 서열과 제2 서열 사이에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 표적 유전자좌는 VH 또는 Vα 또는 Vγ 서열을 포함한다.
일부 경우에, 제2 쌍의 프라이머가 증폭 반응에 사용될 수 있다; 제2 쌍의 한 프라이머는 제2 표적 폴리뉴클레오티드 분자의 제1 서열에 상보하는 전방 프라이머일 수 있고 제2 쌍의 한 프라이머는 제2 표적 폴리뉴클레오티드 분자의 제2 서열에 상보하는 역 프라이머일 수 있으며, 제2 표적 유전자좌가 제1 서열과 제2 서열 사이에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 표적 유전자좌는 VL 또는 Vβ 또는 Vδ 서열을 포함한다.
일부 경우에, 제3 쌍의 프라이머가 증폭 반응에 사용될 수 있다; 제3 쌍의 한 프라이머는 제3 표적 폴리뉴클레오티드 분자의 제1 서열에 상보하는 전방 프라이머일 수 있고 제3 쌍의 한 프라이머는 제3 표적 폴리뉴클레오티드 분자의 제2 서열에 상보하는 역 프라이머일 수 있으며, 제3 표적 유전자좌가 제1 서열과 제2 서열 사이에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 제3 표적 유전자좌는 분자 바코드 또는 용기 바코드와 같은 바코드를 포함한다.
전방 프라이머 및 역 프라이머의 길이는 표적 폴리뉴클레오티드 및 표적 유전자좌의 서열에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 전방 프라이머 및 역 프라이머의 길이 및/또는 TM은 최적화될 수 있다. 일부 경우에, 프라이머는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60 뉴클레오티드, 또는 상기보다 큰, 또는 상기보다 적은 길이일 수 있다. 일부 경우에, 프라이머는 약 15 내지 약 20, 약 15 내지 약 25, 약 15 내지 약 30, 약 15 내지 약 40, 약 15 내지 약 45, 약 15 내지 약 50, 약 15 내지 약 55, 약 15 내지 약 60, 약 20 내지 약 25, 약 20 내지 약 30, 약 20 내지 약 35, 약 20 내지 약 40, 약 20 내지 약 45, 약 20 내지 약 50, 약 20 내지 약 55, 또는 약 20 내지 약 60 뉴클레오티드 길이이다.
프라이머는 주형 폴리뉴클레오티드에 결합하기 전에 단일-가닥 DNA일 수 있다. 일부 경우에, 프라이머는 초기에 이중-가닥 서열을 포함하낟. 프라이머의 적절한 길이는 프라이머의 의도된 용도에 좌우될 수 있지만 약 6 내지 약 50 뉴클레오티드, 또는 약 15 내지 약 35 뉴클레오티드의 범위일 수 있다. 짧은 프라이머 분자가 일반적으로 주형과 충분히 안정한 하이브리드 복합체를 형성하기 위해 더 낮은 온도를 필요로 할 수 있다. 일부 구체예에서, 프라이머는 주형 핵산의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만, 주형과 혼성화하기 위해 충분히 상보할 수 있다. 일부 경우에, 프라이머는 주형 폴리뉴클레오티드에 결합하기 전에 부분적으로 이중-가닥일 수 있다. 이중-가닥 서열을 가진 프라이머는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 염기, 또는 상기보다 많은, 또는 상기보다 적은 헤어핀 루프를 가질 수 있다.프라이머의 이중 가닥 부분은 약, 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 염기쌍, 또는 상기보다 많은, 또는 상기보다 적을 수 있다. 주어진 표적 서열의 증폭에 대한 적합한 프라이머의 디자인은 기술분야에 잘 알려져 있다.
프라이머는 프라이머의 검출 또는 고정을 허용하지만 프라이머의 기본적인 특성은 변경시키지 않는 추가의 특징을 통합할 수 있다 (예컨대 DNA 합성 개시지점으로서 작용함). 예를 들어, 프라이머는 표적 핵산에 혼성화하지 않는 5' 단부에서 추가의 핵산 서열을 함유할 수 있지만, 클로닝 또는 추가의 증폭, 또는 증폭된 생성물의 서열결정을 용이하게 한다. 예를 들어, 추가의 서열은 프라이머 결합 부위, 예컨대 보편적 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 혼성화하기 위한 주형에 충분히 상보하는 프라이머의 영역은 본원에서 혼성화 영역으로서 나타낼 수 있다.
다른 경우에, 본원에서 기술된 방법 및 조성물에서 활용된 프라이머는 하나 이상의 보편적 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 보편적 뉴클레오시드의 비-제한적 실례는 미국 출원 공개 번호 2009/0325169 및 2010/0167353에 기술된 것과 같이, 5-니트로인돌 및 이노신이다.
프라이머는 이차 구조 및 자가-혼성화를 피하기 위해 공지의 변수들에 따라 디자인될 수 있다. 상이한 프라이머 쌍은 약 동일한 온도에서, 예를 들면 다른 프라이머 쌍의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ 또는 10℃ 내에서 아닐링되고 용융될 수 있다. 일부 경우에, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 500, 1000, 5000, 10,000 또는 그 이상보다 큰 프라이머가 초기에 사용된다. 그런 프라이머는 본원에 기술된 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있다.
프라이머는 한정하는 것은 아니지만 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들을 사용하여 적절한 서열의 클로닝 및 직접적인 화학적 합성을 포함하여 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다 (Narang et al., Methods Enzymol. 68:90 (1979); Brown et al., Methods Enzymol. 68:109 (1979)). 프라이머는 또한 상업적 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 프라이머는 동일한 용융 온도를 가가질 수 있다. 프라이머의 길이는 5' 단부 또는 3' 단부에서 연장되거나 단축되어 원하는 용융 온도를 가지는 프라이머를 생성할 수 있다. 프라이머 쌍의 프라이머들 중 하나는 다른 프라이머보다 더 길 수 있다. 프라이머 쌍 내에서 프라이머들의 3' 아닐링 길이는 다를 수 있다. 또한, 각 프라이머 쌍의 아닐링 위치는 프라이머 쌍의 서열 및 길이가 원하는 용융 온도를 유발하도록 디자인될 수 있다. 25 염기쌍보다 작은 프라이머의 용융 온도를 측정하기 위한 방정식은 Wallace 규칙 (TM=2(A+T)+4(G+C))이다. 컴퓨터 프로그램 또한 프라이머를 디자인하기 위해 사용될 수 있다. 각 프라이머의 TM (용융 또는 아닐링 온도)은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산될 수 있다. 프라이머의 아닐링 온도는 임의의 증폭 사이클, 이를테면 한정하는 것은 아니지만 사이클 1, 2, 3, 4, 5, 사이클 6 내지 10, 사이클 10 내지 15, 사이클 15 내지 20, 사이클 20 내지 25, 사이클 25 내지 30, 사이클 30 내지 35, 또는 사이클 35 내지 40 후에 다시 계산되고 증가될 수 있다. 초기 증폭 사이클 후에, 프라이머의 5' 절반은 관심의 각 유전자좌로부터의 생성물에 통합될 수 있다; 그러므로 TM은 각 프라이머의 5' 절반 및 3' 절반의 서열 둘 다를 기반으로 다시 계산될 수 있다.
본원에 개시된 방법의 하나 이상의 반응을 수행하는 것은 하나 이상의 프라이머의 사용을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 프라이머는 이중-가닥, 단일-가닥 또는 주형 폴리뉴클레오티드에 혼성화하기 위해 충분히 상보하는 부분적으로 단일-가닥의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 프라이머는 주형 폴리뉴클레오티드에 결합하기 전에 단일-가닥의 DNA일 수 있다. 일부 구체예에서, 프라이머는 초기에 이중-가닥 서열을 포함한다. 프라이머 부위는 프라이머가 혼성화는 주형의 구역을 포함한다. 일부 구체예에서, 프라이머는 주형-지시된 핵산 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 4개의 상이한 뉴클레오티드 및 중합제 또는 효소, 예컨대 DNA 또는 RNA 중합효소 또는 역전사효소가 있을 때 주형-지시된 핵산 합성을 개시할 수 있다. 프라이머쌍은 2 프라이머를 포함한다: 주형 서열의 5' 단부와 혼성화하는 5' 상류 영역을 가지는 제1 프라이머, 및 주형 서열의 3' 단부의 상보물과 혼성화하는 3' 하류 영역을 가지는 제2 프라이머. 프라이머 세트는 둘 이상의 프라이머를 포함한다: 주형 서열 또는 복수의 주형 서열의 5' 단부와 혼성화하는 5' 상류 영역을 가지는 제1 프라이머 또는 제1 복수의 프라이머, 및 주형 서열 또는 복수의 주형 서열의 3' 단부의 상보물과 혼성화하는 3' 하류 영역을 가지는 제2 프라이머 또는 제2 복수의 프라이머. 일부 구체예에서, 프라이머는 표적 특이적 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 프라이머는 샘플 바코드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 프라이머는 보편적 프라이밍 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 프라이머는 PCR 프라이밍 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 프라이머는 폴리뉴클레오티드의 증폭을 개시하기 위해 사용된 PCR 프라이밍 서열을 포함한다. (Dieffenbach, PCR 프라이머: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Press, New York (2003)). 보편적 프라이머 결합 부위 또는 서열은 폴리뉴클레오티드 및/또는 암플리콘에 대한 보편적 프라이머의 부착을 허용한다. 보편적 프라이머는 기술분야에 잘 알려져 있고, 한정하는 것은 아니지만 -47F (M13F), ㅇ알파MF, AOX3', AOX5', BGHr, CMV-30, CMV-50, CVMf, LACrmt, 람다 gt10F, 람다 gt 10R, 람다 gt11F, 람다 gt11R, M13 rev, M13전방(-20), M13Reverse, male, p10SEQPpQE, pA-120, pet4, pGAP 전방, pGLRVpr3, pGLpr2R, pKLAC14, pQEFS, pQERS, pucU1, pucU2, reversA, seqIREStam, seqIRESzpet, seqori, seqPCR, seqpIRES-, seqpIRES+, seqpSecTag, seqpSecTag+, seqretro+PSI, SP6, T3-prom, T7-prom 및 T7-termInv를 포함한다. 본원에서 사용되는, 부착은 공유 상호작용 및 비공유 상호작용 둘 다 또는 어느 하나를 나타낼 수 있다. 보편적 프라이머의 보편적 프라이머 결합 부위에의 부착은 폴리뉴클레오티드 및/또는 암플리콘의 증폭, 검출, 및/또는 서열결정에 사용될 수 있다. 보편적 프라이머 결합 부위는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 포함할 수 있다. 다른 실례에서, 보편적 프라이머 결합 부위는 적어도 약 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 또는 10000 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 보편적 프라이머 결합 부위는 1 내지 10, 10 내지 20, 10 내지 30 또는 10 내지 100 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 보편적 프라이머 결합 부위는 약 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 2 내지 90, 2 내지 80, 2 내지 70, 2 내지 60, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 20, 2 내지 10, 1 내지 900, 1 내지 800, 1 내지 700, 1 내지 600, 1 내지 500, 1 내지 400, 1 내지 300, 1 내지 200, 1 내지 100, 2 내지 900, 2 내지 800, 2 내지 700, 2 내지 600, 2 내지 500, 2 내지 400, 2 내지 300, 2 내지 200, 2 내지 100, 5 내지 90, 5 내지 80, 5 내지 70, 5 내지 60, 5 내지 50, 5 내지 40, 5 내지 30, 5 내지 20, 5 내지 10, 10 내지 90, 10 내지 80, 10 내지 70, 10 내지 60, 10 내지 50, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 20, 10 내지 10, 5 내지 900, 5 내지 800, 5 내지 700, 5 내지 600, 5 내지 500, 5 내지 400, 5 내지 300, 5 내지 200, 5 내지 100, 10 내지 900, 10 내지 800, 10 내지 700, 10 내지 600, 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200, 10 내지 100, 25 내지 900, 25 내지 800, 25 내지 700, 25 내지 600, 25 내지 500, 25 내지 400, 25 내지 300, 25 내지 200, 25 내지 100, 100 내지 1000, 100 내지 900, 100 내지 800, 100 내지 700, 100 내지 600, 100 내지 500, 100 내지 400, 100 내지 300, 100 내지 200, 200 내지 1000, 200 내지 900, 200 내지 800, 200 내지 700, 200 내지 600, 200 내지 500, 200 내지 400, 200 내지 300, 300 내지 1000, 300 내지 900, 300 내지 800, 300 내지 700, 300 내지 600, 300 내지 500, 300 내지 400, 400 내지 1000, 400 내지 900, 400 내지 800, 400 내지 700, 400 내지 600, 400 내지 500, 500 내지 1000, 500 내지 900, 500 내지 800, 500 내지 700, 500 내지 600, 600 내지 1000, 600 내지 900, 600 내지 800, 600 내지 700, 700 내지 1000, 700 내지 900, 700 내지 800, 800 내지 1000, 800 내지 900, 또는 900 내지 1000 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 포함한다.
프라이머는 프라이머 연장 생성물의 합성에 사용하기에 적합한 길이를 가질 수 있다. 프라이머는 8 내지 200 뉴클레오티드 길이인 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머의 길이는 주형 폴리뉴클레오티드 및 주형 유전자좌의 서열에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 프라이머 또는 프라이머 세트의 길이 및/또는 용융 온도 (TM)는 최적화될 수 있다. 일부 경우에, 프라이머는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60, 또는 상기보다 많은, 또는 상기보다 적은 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구체예에서, 프라이머는 약 8 내지 100 뉴클레오티드 길이, 예를 들면 10 내지 75, 15 내지 60, 15 내지 40, 18 내지 30, 20 내지 40, 21 내지 50, 22 내지 45, 25 내지 40, 7 내지 9, 12 내지 15, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 15 내지 45, 15 내지 50, 15 내지 55, 15 내지 60, 20 내지 25, 20 내지 30, 20 내지 35, 20 내지 45, 20 내지 50, 20 내지 55, 또는 20 내지 60 뉴클레오티드 길이 및 그 사이의 임의의 길이이다. 일부 구체예에서, 프라이머는 최대 약 10, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 뉴클레오티드 길이이다.
일반적으로, 프라이머의 하나 이상의 쌍은 지수적 증폭 반응에 사용될 수 있다; 프라이머 쌍의 한 프라이머는 전방 프라이머일 수 있고 프라이머 쌍의 한 프라이머는 역 프라이머일 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 쌍의 프라이머는 지수적 증폭 반응에 사용될 수 있다; 제1 쌍의 한 프라이머는 제1 주형 폴리뉴클레오티드 분자의 서열에 상보하는 전방 프라이머일 수 있고 제1 쌍의 한 프라이머는 제1 주형 폴리뉴클레오티드 분자의 제2 서열에 상보하는 역 프라이머일 수 있으며, 제1 주형 유전자좌는 제1 서열과 제2 서열 사이에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 쌍의 프라이머는 증폭 반응에 사용될 수 있다; 제2 쌍의 한 프라이머는 제2 표적 폴리뉴클레오티드 분자의 제1 서열에 상보하는 전방 프라이머일 수 있고 제2 쌍의 한 프라이머는 제2 표적 폴리뉴클레오티드 분자의 제2 서열에 상보하는 역 프라이머일 수 있으며, 제2 표적 유전자좌는 제1 서열과 제2 서열 사이에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 제2 표적 유전자좌는 가변 경쇄 항체 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 제3 쌍의 프라이머는 증폭 반응에 사용될 수 있다; 제3 쌍의 한 프라이머는 제3 주형 폴리뉴클레오티드 분자의 제1 서열에 상보하는 전방 프라이머일 수 있고 제3 쌍의 한 프라이머는 제3 주형 폴리뉴클레오티드 분자의 제2 서열에 상보하는 역 프라이머일 수 있으며, 제3 주형 유전자좌는 제1 서열과 제2 서열 사이에 있을 수 있다.
하나 이상의 프라이머는 복수의 주형 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 아닐링될 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 복수의 주형 폴리뉴클레오티드의 3' 단부 및/또는 5' 단부에 아닐링될 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 복수의 주형 폴리뉴클레오티드의 내부 영역에 아닐링될 수 있다. 내부 영역은 복수의 주형 폴리뉴클레오티드의 3' 단부 또는 5' 단부로부터 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 또는 1000 뉴클레오티드일 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 프라이머의 고정된 패널을 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 맞춤 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 대조 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 적어도 하나 이상의 하우스키핑 유전자 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 보편적 프라이머를 포함할 수 있다. 보편적 프라이머는 보편적 프라이머 결합 부위에 아닐링될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 맞춤 프라이머는 SBC, 표적 특이적 영역, 그것의 상보물, 또는 그것의 임의의 조합에 아닐링된다. 하나 이상의 프라이머는 보편적 프라이머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 증폭하기 위하여 또는 프라이머 연장, 역전사, 선형 연장, 비-지수적 증폭, 지수적 증폭, PCR, 또는 하나 이상의 표적 또는 주형 폴리뉴클레오티드의 임의의 다른 증폭 방법을 수행하기 위하여 디자인될 수 있다.
표적 특이적 영역은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 또는 1000 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 포함할 수 있다. 다른 실례에서, 표적 특이적 영역은 적어도 약 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 또는 10000 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 특이적 영역은 약 5 내지 10, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 30, 15 내지 30, 10 내지 75, 15 내지 60, 15 내지 40, 18 내지 30, 20 내지 40, 21 내지 50, 22 내지 45, 25 내지 40, 7 내지 9, 12 내지 15, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 15 내지 45, 15 내지 50, 15 내지 55, 15 내지 60, 20 내지 25, 20 내지 30, 20 내지 35, 20 내지 45, 20 내지 50, 20 내지 55, 20 내지 60, 2 내지 900, 2 내지 800, 2 내지 700, 2 내지 600, 2 내지 500, 2 내지 400, 2 내지 300, 2 내지 200, 2 내지 100, 25 내지 900, 25 내지 800, 25 내지 700, 25 내지 600, 25 내지 500, 25 내지 400, 25 내지 300, 25 내지 200, 25 내지 100, 100 내지 1000, 100 내지 900, 100 내지 800, 100 내지 700, 100 내지 600, 100 내지 500, 100 내지 400, 100 내지 300, 100 내지 200, 200 내지 1000, 200 내지 900, 200 내지 800, 200 내지 700, 200 내지 600, 200 내지 500, 200 내지 400, 200 내지 300, 300 내지 1000, 300 내지 900, 300 내지 800, 300 내지 700, 300 내지 600, 300 내지 500, 300 내지 400, 400 내지 1000, 400 내지 900, 400 내지 800, 400 내지 700, 400 내지 600, 400 내지 500, 500 내지 1000, 500 내지 900, 500 내지 800, 500 내지 700, 500 내지 600, 600 내지 1000, 600 내지 900, 600 내지 800, 600 내지 700, 700 내지 1000, 700 내지 900, 700 내지 800, 800 내지 1000, 800 내지 900, 또는 900 내지 1000 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 포함한다.
프라이머는 이차 구조 및 자가-혼성화를 피하기 위하여 공지의 변수들에 따라 디자인될 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 프라이머 쌍은 거의 동일한 온도에서, 예를 들면 다른 프라이머 쌍의 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ 또는 10℃ 내에서 아닐링되고 용융될 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 프라이머의 하나 이상의 프라이머는 거의 동일한 온도에서, 예를 들면 복수의 프라이머 쌍의 또 다른 프라이머의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10℃ 내에서 아닐링되고 용융될 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 하나 이상의 프라이머는 복수의 프라이머의 다른 프라이머와 상이한 온도에서 아닐링되고 용융될 수 있다.
본원에 기술된 방법의 하나 이상의 단계에 대한 복수의 프라이머는 약, 최대 약, 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000, 50,000,000, 100,000,000의 상이한 프라이머를 포함하는 복수의 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 복수의 프라이머의 각각의 프라이머는 사이한 표적 또는 주형 특이적 영역 또는 서열을 포함할 수 있다.
서열결정
본원에 기술된 방법 또는 방법의 단계들의 하나 이상의 단계를 수행한 후에 새성된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 서열결정될 수 있다.
서열결정은 기술분야에 공지된 임의의 서열결정 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 서열결정은 고 처리량으로 수행될 수 있다. 적합한 차세대 서열결정 기술은 454 Life Sciences 플랫폼 (Roche, Branford, CT) (Margulies et al., Nature, 437, 376-380 (2005)); 일루미나 게놈 분석기, GoldenGate 메틸화 분석, 또는 인피늄 메틸화 분석, 즉 Infinium HumanMethylation 27K BeadArray 또는 VeraCode GoldenGate 메틸화 분석 (Illumina, San Diego, CA; Bibkova et al., Genome Res. 16, 383-393 (2006); 및 미국 특허 번호 6,306,597, 7,598,035, 7,232,656), 또는 결찰에 의한 DNA 서열결정, SOLiD 시스템 (Applied Biosystems/Life Technologies; 미국 특허 번호 6,797,470, 7,083,917, 7,166,434, 7,320,865, 7,332,285, 7,364,858 및 7,429,453); 또는 Helicos True 단일 분자 DNA 서열결정 기술 (Harris et al., Science, 320, 106-109 (2008); 및 미국 특허 번호 7,037,687, 7,645,596, 7,169,560 및 7,769,400), Pacific Biosciences의 단일 분자 실시간 (SMRTTm) 기술 및 서열결정 (Soni et al., Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007))를 포함한다. 이들 시스템은 샘플로부터 분리된 많은 폴리뉴클레오티드의 복합화된 병렬 서열결정을 허용한다 (Dear, Brief Funct. Genomic Proteomic, 1(4), 397-416 (2003) and McCaughan et al., J. Pathol., 220, 297-306 (2010)). 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 염료-변형 프로브의 결찰에 의한 서열결정, 피로서열결정 또는 단일-분자 서열결정에 의해 서열결정된다. 폴리뉴클레오티드의 서열을 측정하는 것은 HelioscopeTM 단일 분자 서열결정, 나노포어 DNA 서열결정, Lynx Therapeutics 대량 병렬 시그니처 서열결정 (MPSS), 454 피로서열결정, 단일 분자 실시간 (RNAP) 서열결정, Illumina (Solexa) 서열결정, SOLiD 서열결정, Ion TorrentTM, 이온 반도체 서열결정, 단일 분자 SMRT(TM) 서열결정, Polony 서열결정, DNA 나노볼 서열 및 VisiGen Biotechnologies 접근법과 같은 서열결정 방법에 의해 수행될 수 있다. 다르게는, 폴리뉴클레오티드의 서열을 측정하는 것은, 한정하는 것은 아니지만, Illumina에 의해 제공된 게놈 분석기 IIx, HiSeq, 및 MiSeq, 단일 분자 실시간 (SMRTTM) 기술, 예컨대 Pacific Biosciences (California)에 의해 제공된 PacBio RS 시스템 및 Solexa 서열결정기, 실제 단일 분자 서열결정 (tSMSTM) 기술, 예컨대 Helicos Inc. (Cambridge, MA)에 의해 제공된 HeliScopeTM 서열결정기를 포함하는, 서열결정 플랫폼을 사용할 수 있다. 서열결정은 MiSeq 서열결정을 포함할 수 있다. 서열결정은 HiSeq 서열결정을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드의 서열을 측정하는 것은 쌍의 단부 서열결정, 나노포어 서열결정, 고-처리량 서열결정, 숏건 (shotgun) 서열결정, 염료-터미네이터 서열결정, 다중-프라이머 DNA 서열결정, 프라이머 워킹, Sanger 디데옥시 서열결정, Maxim-Gilbert 서열결정, 피로서열결정, 실제 단일 분자 서열결정, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함한다. 다르게는, 폴리뉴클레오티드의 서열은 전자 현미경 또는 화학적-감응성 전계 효과 트랜지스터 (chemFET) 어레이에 의해 측정될 수 있다.
방법은 라이브러리에 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 서열결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 방법은 라이브러리의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열 판독, 암플리콘 서열 또는 암플리콘 세트 서열을 서로에 배열하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 배열은 시험 서열, 예컨대 서열 판독을 하나 이상의 다른 시험 서열, 참조 서열 또는 그것들의 조합에 비교하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 배열은 복수의 서열 또는 배열된 서열로부터 공통 서열을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 배열은 각각이 동일한 분자 바코드 또는 용기 바코드를 가지는 복수의 서열로부터 공통 서열을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 비교 목적으로 배열된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%이다. 둘 이상의 서열의 실제 비교는 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들면 수학적 알고리즘을 사용하여 이루어질 수 있다. 그런 수학적 알고리즘의 비-제한적 실례는 Karlin, S. and Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90- 5873-5877 (1993)에 기술된다. 그런 알고리즘은 Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)에 기술된 것과 같이 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)에 통합된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램 (예컨대 NBLAST)의 임의의 관련된 변수들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교에 대한 변수는 스코어= 100, 워드 길이= 12로 설정되거나, 또는 다를 수 있다 (예컨대 W=5 또는 W=20). 다른 실례는 Myers 및 Miller, CABIOS (1989), ADVANCE, ADAM, BLAT, 및 FASTA의 알고리즘을 포함한다. 일부 구체예에서, 두 개의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 예를 들면 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (Accelrys, Cambridge, UK)을 사용하여 이루어질 수 있다.
서열결정은 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 서열결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 서열결정은 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 서열결정하는 것을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 서열결정은 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 서열결정하는 것을 포함할 수 있다.
서열결정은 작업 (run)당 적어도 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 그 이상의 서열결정 판독을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는, 서열 판독은 서열결정 기법에 의해 생성된 서열 또는 데이터의 스트림으로부터 측정된 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 서열결정은 작업당 적어도 약 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 또는 그 이상의 서열결정 판독을 포함한다. 서열결정은 작업당 약 1,000,000,000, 또는 그것보다 많은, 또는 그것보다 적은 서열결정 판독을 포함할 수 있다. 서열결정은 작업당 약 200,000,000, 또는 그것보다 많은, 또는 그것보다 적은 서열결정 판독을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 공통 서열을 측정하기 위해 사용된 서열 판독의 수는 약 2 내지 1000 서열 판독이다. 예를 들어, 공통 서열을 측정하기 위해 사용된 서열 판독의 수는 약 2 내지 900, 2 내지 800, 2 내지 700, 2 내지 600, 2 내지 500, 2 내지 400, 2 내지 300, 2 내지 200, 2 내지 100, 25 내지 900, 25 내지 800, 25 내지 700, 25 내지 600, 25 내지 500, 25 내지 400, 25 내지 300, 25 내지 200, 25 내지 100, 100 내지 1000, 100 내지 900, 100 내지 800, 100 내지 700, 100 내지 600, 100 내지 500, 100 내지 400, 100 내지 300, 100 내지 200, 200 내지 1000, 200 내지 900, 200 내지 800, 200 내지 700, 200 내지 600, 200 내지 500, 200 내지 400, 200 내지 300, 300 내지 1000, 300 내지 900, 300 내지 800, 300 내지 700, 300 내지 600, 300 내지 500, 300 내지 400, 400 내지 1000, 400 내지 900, 400 내지 800, 400 내지 700, 400 내지 600, 400 내지 500, 500 내지 1000, 500 내지 900, 500 내지 800, 500 내지 700, 500 내지 600, 600 내지 1000, 600 내지 900, 600 내지 800, 600 내지 700, 700 내지 1000, 700 내지 900, 700 내지 800, 800 내지 1000, 800 내지 900, 또는 900 내지 1000 서열 판독일 수 있다. 일부 구체예에서, 공통 서열을 측정하기 위해 사용된 서열 판독의 수는 적어도 약 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 30,000,35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95000, 100,000, 150,000, 200,000, 250,000, 300,000, 350,000, 400,000, 450,000, 500,000, 550,000, 600,000, 650,000, 700,000, 750,000, 800,000, 850,000, 900,000, 950,000, 1,000,000, 50,000,000, 또는 100,000,000 판독이다. 일부 구체예에서, 공통 서열을 측정하기 위해 사용된 서열 판독의 수는 최대 약 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 25,000, 30,000,35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95000, 100,000, 150,000, 200,000, 250,000, 300,000, 350,000, 400,000, 450,000, 500,000, 550,000, 600,000, 650,000, 700,000, 750,000, 800,000, 850,000, 900,000, 950,000, 1,000,000, 50,000,000, 또는 100,000,000 판독이다.
방법은 서열결정 판독 오류 (mis-read)를 포함할 수 있다. 방법은, 예컨대 반응 조건을 측정하거나 또는 프라이머 서열을 디자인하기 위하여 판독 오류의 수를 측정하는 것을 포함한다. 하나 이상의 제1 조건 또는 조건의 세트하에서 생성된 판독 오류의 수를 비교하는 것은 바람직한 조건 또는 조건 세트를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 방법은 PCR 반응 동안 고염 농도에서 수행될 수 있고, 제2 방법은 PCR 반응 동안 저염 농도에서 수행될 수 있으며, 이때 제1 및 제2 방법은 염 농도 차이를 제외하고는 실질적으로 동일하게 수행된다. 제1 방법이 많은 수의 판독 오류, 예컨대 특정 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 프라이머에 대해 많은 수의 판독 오류를 초래한다면, 저염 반응 조건이 그 특정 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 프라이머에 대해서도 바람직한 것인지 측정될 수 있다.
진단
일부 구체예에서, 방법은 대상에서 질환, 장애, 증상 및/또는 조건을 진단, 예측, 모니터링, 치료, 개선 및/또는 방지하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 표적 폴리뉴클레오티드의 존재, 부재 또는 수준을 기반으로 대상에서 질환, 장애, 증상 및/또는 조건을 진단, 예측, 모니터링, 치료, 개선 및/또는 방지하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재, 부재 또는 수준을 기반으로 대상에서 질환, 장애, 증상 및/또는 조건을 진단, 예측, 모니터링, 치료, 개선 및/또는 방지하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 본원에 기술된 방법을 사용하여 얻어진 하나 이상의 서열의 존재, 부재, 수준 또는 서열을 기반으로 대상에서 질환, 장애, 증상 및/또는 조건을 진단, 예측, 모니터링, 치료, 개선 및/또는 방지하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 질환의 진단은 본원에 기술된 방법을 사용하여 얻어진 변이체 서열의 존재, 부재, 수준 또는 서열을 기반으로 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 본원에 기술된 방법을 사용하여 얻어진 하나 이상의 서열 판독의 존재, 부재, 수준 또는 서열을 기반으로 대상에서 질환, 장애, 증상 및/또는 조건을 진단, 예측, 모니터링, 치료, 개선 및/또는 방지하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 본원에 기술된 방법을 사용하여 얻어진 하나 이상의 공통 서열의 존재, 부재, 수준 또는 서열을 기반으로 대상에서 질환, 장애, 증상 및/또는 조건을 진단, 예측, 모니터링, 치료, 개선 및/또는 방지하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 샘플 중의 표적 폴리뉴클레오티드의 수준 (예컨대 양 또는 농도)의 측정을 기반으로 대상에서 질환, 장애, 증상 및/또는 조건을 진단, 예측, 모니터링, 치료, 개선 및/또는 방지하는 단계를 더 포함할 수 있다. 샘플 중의 표적 폴리뉴클레오티드의 수준은 하나 이상의 서열 판독, 서열, 공통 서열, 또는 그것들의 임의의 조합을 기반으로 측정될 수 있다. 샘플 중의 다스의 표적 폴리뉴클레오티드의 각각의 수준은 본원에 기술된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 샘플 중의 다스의 표적 폴리뉴클레오티드의 각각의 수준은 복수로 존재하는 표적 폴리뉴클레오티드의 각각의 서열 판독, 서열, 공통 서열, 또는 그것들의 임의의 조합의 수를 기반으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 제1 표적 폴리뉴클레오티드의 수준 및 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 수준은 본원에 기술된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 및 제2 표적 폴리뉴클레오티드는 동일하다. 예를 들어, 제1 표적 폴리뉴클레오티드는 mRNA 분자의 제1 복사물을 포함할 수 있고 제2 표적 폴리뉴클레오티드는 mRNA 분자의 제2 복사물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 및 제2 표적 폴리뉴클레오티드는 상이하다. 예를 들어, 제1 표적 폴리뉴클레오티드는 제1 mRNA 분자를 포함할 수 있고 제2 표적 폴리뉴클레오티드는 제1 mRNA 분자와 상이한 유전자로부터 전사된 제2 mRNA 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 표적 폴리뉴클레오티드는 제1 대립유전자를 포함할 수 있고 제2 표적 폴리뉴클레오티드는 제2 대립유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 표적 폴리뉴클레오티드는 야생형 서열을 포함할 수 있고 제2 표적 폴리뉴클레오티드는 변이체 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 질환, 장애, 증상 및/또는 조건을 가진 대상을 적어도 50%의 신뢰도로 진단 또는 예측하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 질환, 장애, 증상 및/또는 조건을 가진 대상의 진단 또는 예측은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%의 신뢰도로 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 질환, 장애, 증상 및/또는 조건을 가진 대상의 진단 또는 예측은 50% 내지 100% 신뢰도로 측정될 수 있다. 예를 들어, 질환, 장애, 증상 및/또는 조건을 가진 대상의 진단 또는 예측은 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 90% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 60% 내지 70%, 70% 내지 90%, 70% 내지 80%, 또는 80% 내지 90%의 신뢰도로 측정될 수 있다.
일부 구체예에서, 대상의 표적 폴리뉴클레오티드, 예컨대 생체 마커의 존재, 부재, 수준, 서열 또는 그것들의 임의의 조합은 적어도 50%의 신뢰도로 측정될 수 있다. 예를 들어, 대상의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재, 부재, 수준, 서열 또는 그것들의 임의의 조합은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 신뢰도로 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재, 부재, 수준, 서열 또는 그것들의 임의의 조합은 50% 내지 100% 신뢰도로 측정될 수 있다. 예를 들어, 대상의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재, 부재, 수준, 서열 또는 그것들의 임의의 조합은 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 90% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 60% 내지 70%, 70% 내지 90%, 70% 내지 80%, 또는 80% 내지 90%의 신뢰도로 측정될 수 있다.
효소
본원에 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 효소를 포함할 수 있다. 효소의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 리가아제, 역전사효소, 중합효소 및 제한 뉴클레아제를 들 수 있다.
일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드에 대한 어댑터의 부착은 하나 이상의 리가아제의 사용을 포함한다. 리가아제의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, DNA 리가아제 I, DNA 리가아제 III, DNA 리가아제 IV 및 T4 DNA 리가아제와 같은 DNA 리가아제, 및 T4 RNA 리가아제 I 및 T4 RNA 리가아제 II와 같은 RNA 리가아제가 있다.
본원에 개시된 방법 및 키트는 추가로 하나 이상의 역전사효소의 사용을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 역전사효소는 HIV-1 역전사효소, M-MLV 역전사효소, AMV 역전사효소 및 텔로머라제 역전사효소이다. 일부 구체예에서, 역전사효소는 M-MLV 역전사효소이다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 프로테아제의 사용을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 중합효소의 사용을 포함한다. 중합효소의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, DNA 중합효소 및 RNA 중합효소을 포함한다. 일부 구체예에서, DNA 중합효소는 DNA 중합효소 I, DNA 중합효소 II, DNA 중합효소 III 완전효소 (holoenzyme) 및 DNA 중합효소 IV이다. 상업적으로 ㅇ입수 가능한 DNA 중합효소로는, 한정하는 것은 아니지만, Bst 2.0 DNA 중합효소, Bst 2.0 WarmStartTM DNA 중합효소, Bst DNA 중합효소, Sulfolobus DNA 중합효소 IV, Taq DNA 중합효소, 9°NTMm DNA 중합효소, Deep VentRTM (exo-) DNA 중합효소, Deep VentRTM DNA 중합효소, Hemo KlenTaqTM, LongAmp® Taq DNA 중합효소, OneTaq® DNA 중합효소, Phusion® DNA 중합효소, Q5TM 고-신뢰도 DNA 중합효소, TherminatorTM III DNA 중합효소, TherminatorTM DNA 중합효소, TherminatorTM II DNA 중합효소, TherminatorTM III DNA 중합효소, VentR® DNA 중합효소, VentR® (엑소-) DNA 중합효소, Bsu DNA 중합효소, phi29 DNA 중합효소, T4 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, 말단 전달효소, 티타늄® Taq 중합효소, KAPA Taq DNA 중합효소 및 KAPA Taq 고온 출발 DNA 중합효소가 있다.
일부 구체예에서, 중합효소는 RNA 중합효소 I, RNA 중합효소 II, RNA 중합효소 III, 대장균 폴리(A) 중합효소, phi6 RNA 중합효소 (RdRP), 폴리(U) 중합효소, SP6 RNA 중합효소 및 T7 RNA 중합효소와 같은 RNA 중합효소이다.
추가의 시약들
본원에 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 시약의 사용을 포함할 수 있다. 시약의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, PCR 시약, 결찰 반응 시약, 역전사 반응 시약, 효소 시약, 혼성화 시약, 샘플 제조 시약, 친화성 포획 시약, 비드와 같은 고체 지지체, 및 핵산 정제 및/또는 분리를 위한 시약이 있다.
고체 지지체는 실제로 임의의 불용성 또는 고체 물질을 포함할 수 있고, 자주 물에 불용성인 고체 지지체 조성물이 선택된다. 예를 들어, 고체 지지체는 본질적으로 실리카겔, 유리 (예컨대 조절-기공 유리 (CPG)), 나일론, 세파젝스®, 세파로오스®, 셀룰로오스, 금속 표면 (예컨대 스틸, 금, 은, 알루미늄, 규소 및 구리), 자기 물질, 플라스틱 물질 (예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 (PVDF)) 등을 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다. 구체예들에 따라 사용하기 위한 비드의 실례는 비드가 핵산 분자와 상호작용하는 것을 허용하는 친화성 모이어티를 포함할 수 있다. 고체 상 (예컨대 비드)은 결합 쌍의 일원 (예컨대 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 그것들의 유도체)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 비드는 스트렙트아비딘-코팅된 비드일 수 있고 비드 상에서의 고정화를 위한 핵산 분자는 비오틴 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 각각의 폴리뉴클레오티드 분자는 폴리뉴클레오티드를 추가로 안정화시키기 위하여 두 개의 친화성 모이어티, 예컨대 비오틴을 포함할 수 있다. 비드는 고정화 핵산에 사용하기 위한 또는 하류 스크리닝 또는 선택 과정에 사용될 수 있는 추가의 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비드는 결합 모이어티, 형광 표지 또는 형광 퀀처 (quencher)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 비드는 자성 물질일 수 있다. 일부 경우에, 고체 지지체는 비드이다. 비드의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 스트렙트아비딘 비드, 아가로오스 비드, 자기 비드, Dynabeads®, MACS® 미소비드, 항체 컨쥬게이트된 비드 (예컨대 항-면역글로불린 미소비드), 단백질 A 컨쥬게이트된 비드, 단백질 G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 A/G 컨쥬게이트된 비드, 단백질 L 컨쥬게이트된 비드, 폴리뉴클레오티드-dT 컨쥬게이트된 비드, 실리카 비드, 실리카-유사 비드, 항-비오틴 미소비드, 항-플루오로크롬 미소비드 및 BcMagTM 카르복시-말단 자기 비드가 있다. 비드 또는 입자는 팽창 가능할 수 있고 (예컨대 Wang 수지와 같은 중합체 비드) 또는 팽창 가능하지 않은 것일 수 있다 (예컨대 CPG). 일부 구체예에서 고체 상은 실질적으로 친수성이다. 일부 구체예에서 고체 상 (비드)은 실질적으로 소수성이다. 일부 구체예에서 고체 상은 결합 쌍의 일원 (예컨대 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 그것들의 유도체)을 포함하고 실질적으로 소수성이거나 실질적으로 친수성이다. 일부 구체예에서, 고체 상은 결합 쌍의 일원 (예컨대 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 그것들의 유도체)을 포함하고 mg의 고체 지지체당 유리 포획제 (예컨대 유리 아비딘)의 약 1350 피코몰보다 큰 결합 용량을 가진다. 일부 구체예에서, 결합 쌍의 일원을 포함하는 고체 상의 결합 능력은 mg의 고체 지지체당 유리 포획제의 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1800, 2000 피코몰보다 크다. 발명에 적합한 비드의 다른 실례는 금 콜로이드 또는 폴리스티렌 비드 또는 실리카 비드와 같은 비드이다. 실질적으로 임의의 비드 반경이 사용될 수 있다. 비드의 실례는 150 나노미터 내지 10 마이크론의 범위의 반경을 가지는 비드를 포함할 수 있다. 다른 크기도 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 완충액의 사용을 포함할 수 있다. 완충액의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 세척 완충액, 결찰 완충액, 혼성화 완충액, 증폭 완충액 및 역전사 완충액이 있다. 일부 구체예에서, 혼성화 완충액은 상업적으로 입수 가능한 완충액, 예컨대 TMAC Hyb 용액, SSPE 혼성화 용액 및 ECONOTM 혼성화 완충액이다. 본원에서 개시된 완충액은 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 담체의 사용을 포함할 수 있다. 담체는 본원에 개시된 하나 이상의 반응 (예컨대 결찰 반응, 역전사, 증폭, 혼성화)의 효율을 증대시키거나 개선시킬 수 있다. 담체는 분자 또는 그것의 임의의 생성물 (예컨대 폴리뉴클레오티드 및/또는 암플리콘)의 비-특이적 손실을 감소시키거나 방지할 수 있다. 예를 들어, 담체는 표면에의 흡수를 통해 폴리뉴클레오티드의 비-특이적 손실을 감소시킬 수 있다. 담체는 표면 또는 기질 (예컨대 용기, 에펜도르프 튜브, 피펫 팁)에 대한 폴리뉴클레오티드의 친화성을 감소시킬 수 있다. 다르게는, 담체는 표면 또는 기질 (예컨대 비드, 어레이, 유리, 슬라이드, 칩)에 대한 폴리뉴클레오티드의 친화성을 증가시킬 수 있다. 담체는 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 보호할 수 있다. 예를 들어 담체는 RNA 분자를 리보뉴클레아제로부터 보호할 수 있다. 다르게는, 담체는 DNA를 DNase로부터 보호할 수 있다. 담체의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, DNA 및/또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. DNA 담체의 실례는 플라스미드, 벡터, 폴리아데닐화된 DNA 및 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. RNA 담체의 실례는 폴리아데닐화된 RNA, 파지 RNA, 파지 MS2 RNA, 대장균 RNA, 효모 RNA, 효모 tRNA, 포유류 RNA, 포유류 tRNA, 짧은 폴리아데닐화된 합성 리보뉴클레오티드 및 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. RNA 담체는 폴리아데닐화된 RNA일 수 있다. 다르게는, RNA 담체는 폴리아데닐화되지 않은 RNA일 수 있다. 일부 구체예에서, 담체는 박테리아, 효모 또는 바이러스로부터 유래한다. 예를 들어, 담체는 박테리아, 효모 또는 바이러스로부터 유도된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 담체는 바실러스 서브틸리스로부터의 단백질이다. 다른 실례에서, 담체는 대장균으로부터의 폴리뉴클레오티드이다. 다르게는, 담체는 포유류 (예컨대 인간, 마우스, 염소, 래트, 소, 양, 돼지, 개 또는 토끼), 조류, 양서류 또는 파충류로부터의 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드이다.
본원에 개시된 방법 및 키트는 하나 이상의 대조 제제의 사용을 포함할 수 있다. 대조 제제는 대조 폴리뉴클레오티드, 비활성 효소, 비-특이적 경쟁자를 포함할 수 있다. 다르게는, 대조 제제는 브라이트 (bright) 혼성화, 브라이트 프로브 대조표준, 핵산 주형, 스파이크-인 (spike-in) 대조표준, PCR 증폭 대조표준을 포함한다. PCR 증폭 대조표준은 포지티브 대조표준일 수 있다. 다른 경우에, PCR 증폭 대조표준은 네거티브 대조표준일 수 있다. 핵산 주형 대조표준은 공지의 농도의 것일 수 있다. 대조 제제는 하나 이상의 표지를 포함할 수 있다.
스파이크-인 대조표준은 반응 또는 샘플에 첨가된 주형일 수 있다. 예를 들어, 스파이크-인 주형은 증폭 반응에 첨가될 수 있다. 스파이크-인 주형은 제1 증폭 사이클 후 임의의 시점에 증폭 반응에 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, 스파이크-인 주형은 사이클 번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 후에 증폭 반응에 첨가된다. 스파이크-인 주형은 마지막 증폭 사이클 전 임의의 시점에 증폭 반응에 첨가될 수 있다. 스파이크-인 주형은 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 핵산 염기쌍을 포함할 수 있다. 스파이크-인 주형은 DNA, RNA 또는 그것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 스파이크-인 주형은 하나 이상의 표지를 포함할 수 있다.
본원에는 본원에 개시된 방법 및 조성물의 생성물에 대해 사용될 수 있는, 그것과 함께 사용될 수 있는, 그것의 제조에 사용될 수 있는, 또는 그것인 분자, 물질, 조성물 및 성분이 개시된다. 이들 물질의 조합, 하위세트, 상호작용, 그룹 등이 개시되고 한편으로 이들 분자 및 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 포괄적 조합 및 순열의 구체적인 참조가 분명하게 개시될 수 없을 때, 각각 본원에서 구체적으로 고려되고 기술된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 핵산이 개시되고 논의되며 뉴클레오티드 또는 핵산을 포함하는 많은 분자들에 대해 이루어질 수 있는 많은 변형이 논의된다면, 뉴클레오티드 또는 핵산의 각각 및 모든 조합 및 순열 및 가능한 변형들은 구체적으로 반대로 표시되지 않는 한 구체적으로 고려된다. 이런 개념은 한정하는 것은 아니지만, 개시된 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 단계들을 포함하여, 본 출원의 모든 측면에 적용된다. 그러므로, 만약 수행될 수 있는 다양한 추가 단계들이 있다면, 이들 추가 단계의 각각이 개시된 방법의 임의의 특정 구체예 또는 구체예들의 조합으로 수행될 수 있고, 각각의 그런 조합이 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주될 수 있을 것이라는 것이 이지된다.
본원에 기술된 일부 구체예가 본원에서 제시되었고 기술된 한편, 그런 구체예들은 단지 실례로만 제공된다. 많은 변화, 수정 및 치환이 본원에 제공된 개시로부터 벗어나지 않으면서 기술분야의 숙련자들에게 이제 일어날 것이다. 본원에 기술된 구체예들에 대한 다양한 대안이 본원에 기술된 방법을 실시할 때 사용될 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
다르게 설명되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본 개시가 속하는 기술분야에서 통상적인 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 다음의 참조는 본원에서 사용될 수 있는 방법 및 조성물의 구체예들을 포함한다: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-9119102); Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Mol. Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Robert A. Meyers (ed.), Mol. Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
본 개시의 표준 과정은 예컨대 다음에 기술되어 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); 또는 Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol. 152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl (eds.), Academic Press Inc., San Diego, USA (1987)). Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), and Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998).
실시예
실시예 1a - 에멀션 기반, 대량의 고 처리량 단일-세포 폴리뉴클레오티드 서열결정을 수행하기 위한 세포의 제조를 위한 프로토콜.
관심의 세포 집단을 얻었다. 이것들은 총 PBMC, 분류된 세포, 항체-풍부화된 B 또는 T 세포, 또는 다른 세포 유형을 포함하였다. 세포는 무상 원형질 막을 가져서 세포가 주변 배지로 과량의 mRNA를 누출하지 않았다. 세포는 생존성일 필요는 없다.
세포를 세포 완충액: 1x 둘베코 포스페이트-완충된 식염수 (PBS)에서 2회 원심분리 (10분 동안 T-세포 또는 B-세포에 대해 200 g)에 의해 세척하였다. 그런 다음 세포를 세포 완충액에 3.5x106/mL의 세포 농도로 희석하였다. 그런 다음 현탁액을 20 μm 세포 스트레이너를 통해 피펫팅하였다.
실시예 1b - 에멀션 기반, 대량의 고 처리량 단일-세포 폴리뉴클레오티드 서열결정을 수행하기 위한 고체 조직의 제조를 위한 프로토콜.
고체 조직 (예컨대 종양 또는 비-종양 생검 샘플)을 콜라게나제 III (200 U/mL), DNase I (200 U/mL) 및 트립신 (5 mg/mL), 및 NEDB (Invitrogen)을 포함한 다양한 프로테아제로 처리하여 개별적인 세포와 하나 이상의 세포를 함유하는 응집체의 혼합물을 얻었다. 간단하게 설명하면, 마우스로부터 제거한 종양을 저온 배양 배지에 첨가하고 주변의 마우스 유방 조직 및 지방을 제거하였다. 종양을 2 내지 4 mm 단편으로 갈은 후 적절한 해리 용액 또는 효소와 함께 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 종양 단편을 매 10분마다 조직 단편 크기로 적응된 직경으로 절단된 팁이 있는 1,000 mL 마이크로피펫을 사용하여 위아래로 혼합하였다. 각 인큐베이션 기간 후에, 단편을 40 mm 나일론 메쉬 세포 스트레이너를 통해 여과하였다. 방출된 세포를 1200 r.p.m.에서 2분 동안 원심분리하고 30% FCS를 포함한 저온 배지에 4℃에서 보관하였다. 신선한 해리 용액을 나머지 조직 단편에 30분 동안 첨가하였다. 첨가된 세포가 방출되지 않았을 때 해리를 중단시켰다. 단편을 체를 통해 눌렀고 모든 인큐베이션 기간으로부터의 모든 세포를 모으로 계수하였다. 그런 다음 세포 현탁액을 스트레이너 (예컨대 10, 20, 30, 40 μm)를 통해 걸러서 큰 응집체를 제거하였다. 세포를 세포 완충액: 1x 둘베코 포스페이트-완충된 식염수 (PBS)에서 2회 원심분리 (10분 동안 T-세포 또는 B-세포에 대해 200 g)에 의해 세척하였다. 세포 집단을 염색하지 않았고, 에멀션에 의해 분석하기 전에 분류하거나, 그렇지 않으면 분리하였다.
제거된 종양을 제조하기 위한 대체 방법을 또한 수행하였다. 제거된 종양을 1 mL의 해리 완충액 1 (RPMI + 10% FBS 중의 100 U/ml 콜라게나제 유형 IV 및 100 μg/mL DNase) 또는 해리 완충액 2 (5% FBS, 콜라게나제 유형 I (200 U/mL) 및 DNase I (100 μg/mL)이 첨가된 RPMI 배지)에 넣고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 만약 계속해서 골수성 세포가 분리되어야 했다면, 해리 완충액 2의 5% FBS 및 콜라게나제 유형 I을 10% FBS 및 콜라게나제 유형 IV (200 U/ml)로 각각 대체하였다. 종양 단편을 1,000 mL 마이크로피펫을 사용하여 위아래로 혼합하였다. 그런 다음 현탁액을 70 μm 필터를 통해 여과하였고 골수성 세포 분리를 위해 10% FBS가 첨가된 MAC 분리 완충액으로 3회 세척하였다. 매우 큰 종양 (>300 mm2)에 대해, 염증성 세포를 밀도 구배 원심분리 (Percoll 또는 Ficoll) 전에 사전-풍부화할 수 있다. 그런 다음 여과된 세포 현탁액을 400 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 10 mL의 MAC 완충액으로 세정하고 다시 동일한 설정으로 원심분리하였다.
실시예 2 - 에멀션-기반, 대량의 고 처리량 단일-세포 폴리뉴클레오티드 서열결정을 수행하기 위한 에멀션 반응 혼합물의 제조를 위한 프로토콜.
하기 표 1의 시약 및 올리고뉴클레오티드를 함유한 에멀션 반응 혼합물을 실온에서 PCR-클린 후드에서 혼합하였다.
시약 스톡 농도 (mM) 방울의 최종 농도 (mM) rxn 상의 최종
농도 ( mM ) 		200 μL 당
μL
Tris-Cl, pH 8.0 500.00 50.00 100.00 40.00
MgSO4 100.00 3.00 6.00 12.00
DTT 1,000.00 10.00 20.00 4.00
dNTPs 각각 10.00 0.50 1.00 20.00
5' 비오틴 올리고-dT 1.40x10-2 2.50x10-4 5.00x10-4 7.14
주형 스위치 올리고 0.1 1.00x10-3 2.00x10-3 4.00
DB 주형 분자/μL 1.00x106 1.75x104 3.50x104 7.00
DB 전방 프라이머 0.2 5.00x10-4 1.00x10-3 1.00
DB 역 프라이머 0.2 7.50x10-4 1.50x10-3 1.50
HALT 프로테아제 억제제 (X) 200 1.00 2.00 2.00
효소학 RNase 억제제 (U/μL) 40 0.40 0.80 4.00
MMLV RNaseH-역전사효소 10.00
Phusion HF DNA 중합효소 10.00
Triton X-100 (% v/v) 2.5 0.25 0.50 40.00
물 to 200
올리고뉴클레오티드 서열:
5'비오틴 올리고-dT 정착된
역전사 프라이머		 /5BiosG//iSp18/TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT T V N
방울 바코드 주형: ATCCATCCACGACTGACGGACGTATTAAANNNNWNNNNWNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACC
주형 스위치 올리고 AATACGTCCGTCAGTCGTGGATGNNTNNANNTrGrGG
용기 바코드 전방 CATCCACGACTGACGGACGTATT
용기 바코드 역 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT
/ 5Biosg / = 5' 비오틴 변형; / iSp18 / = 18-탄소 스페이서 ; V = A, C, 또는 G; N = 임의의 염기; rG = 리보구아노신 ; W = A 또는 T.
실시예 3 - 에멀션-기반, 대량의 고 처리량 단일-세포 폴리뉴클레오티드 서열결정을 수행하기 위한 에멀션의 제조를 위한 프로토콜.
일단 세포 및 반응 혼합물이 제조되면, 에멀션을 형성하였다. 100 μL Hamilton 마이크로리터 주사기를 사용하여 100 μL PEEK 샘플 루프를 각각의 반응 혼합물의 ~100 μL의 두 개의 주사액으로 오버로딩하였다. 100 μL Hamilton Gastight 주사기를 사용하여 세포 현탁액 ~110 μL를 ~100 μL의, 0.2 mm 내부 직경의 FEP 튜빙 루프에 로딩하였다. 루프를, 계속해서 매 1-2초마다 대략 1회씩 세포 루프를 반전시켜서 세포 정착 및 결집을 방지하는 기계식 회전기에 부착시켰다. 에멀션을, 내부가 친플루오르성 코팅되어 있는 돌로마이트 2-시약 칩을 통해 집중 흐름 분사에 의해 형성하였다. 외부 오일 채널은 HFE7500 (Novec 7500) 플루오로카본 오일 중의 0.5 내지 5.0% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜-기반 계면활성제를 함유하였다. 에멀션 분사는 일정한 유량으로 (세포 상 및 반응 상 채널에서 동일함) 작동시켰다. 에멀션 칩 출력을, 냉동된 블록에서 대략 0℃에서 유지된 폴리프로필렌 PCR 튜브로 방울방울 떨어뜨림으로써, 12 cm, 0.5 mm 내부 직경 PEEK 튜브를 통해 수집하였다. 4 분획을 수집하였고, 각각은 50 μL의 에멀션 중의 수성 물질을 함유하였다 (분획당 5분의 작동 시간). 정착된 오일의 대부분을 각 튜브의 바닥으로부터 모세관 마이크로피펫으로 제거하였다. 각 에멀션 분획 위에 40 μL의 오버레이 용액: 50 mM Na-EDTA, pH 8.0, 0.002% (w/v) 크레졸 레드를 부드럽게 놓았다. 에멀션을 써모사이클러에서 다음의 프로그램으로 인큐베이션하였다 (분:초):
1. 42.0℃, 30:00 (역전사)
2. 95.0℃, 05:00 (역전사효소 및 DNA 주형을 변성시킴)
3. 95.0℃, 00:10
4. 65.0℃, 00:30
5. 72.0℃, 00:30
6. 3으로 돌아감, 총 55 사이클 (용기 바코드를 증폭시키고 cDNA에 융합시킴)
7. 4.0℃, 시간 제한 없음.
에멀션을 4.0℃에서 밤새 유지하였다.
실시예 4 - 에멀션-기반, 대량의 고 처리량 단일-세포 폴리뉴클레오티드 서열결정을 수행하기 위한 에멀션의 파괴를 위한 프로토콜.
모세관 마이크로피펫 팁을 사용하여, 가능한 에멀션 물질을 제거하지 않으면서 오버레이 용액을 제거하였다. 각 튜브에 12.5 μL의 Qiagen 프로테아제 용액 및 2.5 μL의 0.5 M Na-EDTA, pH 8.0을 첨가하였다. 에멀션을, 40 μL의 1:1 FC-40:퍼플루오로옥탄올을 첨가하고 약 10회 부드럽게 반전시킴으로써 파괴하였다.
튜브의 내용물을 부드럽게 원심분리하고 써모사이클러에서 다음의 프로그램으로 인큐베이션하였다 (분:초):
1. 50℃, 15:00 (프로테아제 소화)
2. 70℃, 10:00 (프로테아제 비활성화)
3. 95℃, 03:00 (프로테아제 비활성화 및 DNA 변성)
4. 4.0℃, 시간 제한 없음
튜브를 원심분리하였고 상부 수성 상과 계면을 신선한 마이크로원심분리 튜브에 옮긴 후 15,000g에서 1분 동안 원심분리하였다. 상부 수성 상을 계면을 파괴하지 않으면서 새로운 튜브에 옮겼다.
실시예 5 - 에멀션-기반, 대량의 고 처리량 단일-세포 폴리뉴클레오티드 서열결정을 수행하기 위한 에멀션으로부터 폴리뉴클레오티드를 세정하기 위한 프로토콜.
0.25V의 NEB 스트렙트아비딘 비드를 2xBW (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.2% Tween-20)에 첨가하고 RT에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 비드를 BW로 1회 세척하고, 0.001% Tween-20으로 3회 세척한 후, 0.25V의 0.001% Tween-20을 첨가하고 95℃에서 3분 동안 가열함으로써 용출하였다. 거기에 5부피의 Qiagen 완충액 PB를 첨가하고 Zyppy 실리카 칼럼에 적용하였다. 그런 다음 비드를 0.7 mL의 Zyppy 세척 완충액으로 세척하고 180 μL의 5 mM Tris-Cl, pH 8.8, 0.1 mM EDTA, 0.001% Tween-20으로 용출하였다.
실시예 6 - 에멀션-기반, 대량의 고 처리량 단일-세포 폴리뉴클레오티드 서열결정을 수행하기 위한 차세대 서열결정을 위한 폴리뉴클레오티드의 제1 PCR 반응 (PCR1)을 위한 프로토콜.
163.2 μL의 정제된 cDNA를 PCR1에 사용하였다. 제1 PCR 반응에 대한 예시적인 설정을 하기 표 2에 나타낸다.
PCR1 라이브러리
시약 스톡 농도 최종 농도 20-μL rxn 60 μL rxn 240 μL rxn
Q5 완충액 5X 5.00 mM 1.00 μm 4.00 μL 12.00 μL 48.00 μL
각 dNTPs 10.00 mM 0.20 μm 0.40 μL 1.20 μL 4.80 μL
Q5 고온 출발 125.00 mM 1.00 μm 0.16 μL 0.48 μL 1.92 μL
633 프라이머 10 μm 0.16 μL 0.48 μL 1.92 μL
[IgH/TCRα]-[IgL/TCRβ]-[C] 프라이머 믹스 10 μm
(각각)		 0.16 μL 0.48 μL 1.92 μL
cDNA 13.60 μL 40.80 μL 163.20 μL
H2O 1.52 μL 4.56 μL 18.24 μL
[ IgH / TCRα / TCRγ ]-[ IgL / TCRβ / TCRδ ]-[C] 프라이머 믹스의 IgH / TCRα / TCRγ 프라이머 서열
IgM GGGTTGGGGCGGATGCAC
IgD CATCCGGAGCCTTGGTGG
IgA CCTTGGGGCTGGTCGGGG
IgE CGGATGGGCTCTGTGTGG
IgG CCGATGGGCCCTTGGTGG
TCRα1 GGATTTAGAGTCTCTCAGCTG
TCRα2 CACGGCAGGGTCAGGGTTC
TCRγ AAAATAGTGGGCTTGGGG
[ IgH / TCRα / TCRγ ]-[ IgL / TCRβ / TCRδ ]-[C] 프라이머 믹스의 IgL / TCRβ / TCRδ 프라이머 서열
IgKJ1 TTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGC
IgKJ2 TTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTGG
IgKJ3 TTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC
IgKJ4 TTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGC
IgKJ5 TTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGC
IgLJ1 GAGGACGGTCACCTTGGTGCCA
IgLJ2 TAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCC
IgLJ3 GAGGACGGTCAGCTGGGTGCC
IgLJ4 TAAAATGATCAGCTGGGTTCCTCCAC
IgLJ5 TAGGACGGTGACCTTGGTCCCAGT
TCRβ1 GGGAGATCTCTGCTTCTGATG
TCRβ2 CGACCTCGGGTGGGAACAC
TCRδ AGACAAGCGACATTTGTTCCA
[ IgH / TCRα / TCRγ ]-[ IgL / TCRβ / TCRδ ]-[C] 프라이머 믹스의 C- 프라이머 서열
633 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
4개의 60 μL 분획을 PCR 튜브에 부분표본화하였고 다음의 프로그램을 써모사이클러에서 작동시켰다:
1. 98℃, 01:00
2. 98℃, 00:10
3. 64℃, 00:20
4. 72℃, 00:20
5. 2로 돌아감, 총 6 사이클
6. 4℃, 시간 제한 없음.
PCR 생성물을 1.2 부피의 AMPure XP로 정제하고, 80% 에탄올로 세척한 후 60 μL의 희석 완충액 (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)으로 용출하였다.
실시예 7 - 에멀션-기반, 대량의 고 처리량 단일-세포 폴리뉴클레오티드 서열결정을 수행하기 위한 차세대 서열결정을 위한 폴리뉴클레오티드의 제2 PCR 반응 (PCR2)을 위한 프로토콜.
20 μL의 정제된 PCR1 생성물을 각각의 하위-라이브러리 (예컨대 IgL 또는 IgH 사슬 또는 TCRα 또는 TCRβ 사슬, 또는 TCRγ 또는 TCRδ 사슬)에 대해 사용하였다. 제2 PCR 반응에 대한 예시적인 설정을 하기 표 3에 나타낸다.
PCR2 라이브러리
시약 스톡 농도 최종 농도 20 μL rxn 50 μL rxn
Q5 완충액 5X 5.00 mM 1.00 μm 4.00 μL 10.00 μL
각 dNTPs 10.00 mM 0.20 μm 0.40 μL 1.00 μL
Q5 고온 출발 125.00 mM 1.00 μm 0.16 μL 0.40 μL
C7-인덱스-P7 프라이머 2 μm 1.60 μL 4.00 μL
[P5-IgH/TCRα/TCRγ]-[P5-IgL/TCRβ/TCRδ] 프라이머 믹스 1 μm
(각각)		 1.60 μL 4.00 μL
cDNA 8.00 μL 20.00 μL
H2O 4.24 μL 10.60 μL
P5- IgH/TCRα / TCRγ ( 중쇄 ) 믹스의 프라이머 서열
IgM ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGTTGGGGCGGATGCAC
IgD ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATCCGGAGCCTTGGTGG
IgA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTTGGGGCTGGTCGGGG
IgE ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGGATGGGCTCTGTGTGG
IgG ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCGATGGGCCCTTGGTGG
TCRα1 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGATTTAGAGTCTCTCAGCTG
TCRα2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCACGGCAGGGTCAGGGTTC
TCRγ ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGGAAACATCTGCATCAAGT
P5- IgL / TCRβ / TCRδ ( 경쇄 ) 믹스의 프라이머 서열
IgKJ1 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGC
IgKJ2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTGG
IgKJ3 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC
IgKJ4 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGC
IgKJ5 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGC
IgLJ1 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGAGGACGGTCACCTTGGTGCCA
IgLJ2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCC
IgLJ3 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGAGGACGGTCAGCTGGGTGCC
IgLJ4 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAAAATGATCAGCTGGGTTCCTCCAC
IgLJ5 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAGGACGGTGACCTTGGTCCCAGT
IgLJ6 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAGGACGGTCAGCTCGGTCCCC
TCRβ1 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGAGATCTCTGCTTCTGATG
TCRβ2 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGACCTCGGGTGGGAACAC
TCRδ ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGGATGGTTTGGTATGAGGC
Illumina C7, 6-염기 바코드 및 P7 서열: 5'　CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[NNNNNN]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3'의 연쇄를 포함하는 "P7-인덱스-C7" 프라이머를 사용하였다.
다음의 프로그램을 써모사이클러에서 작동시켰다;
1. 98℃, 01:00
2. 98℃, 00:10
3. 64℃, 00:20
4. 72℃, 00:20
5. 2로 되돌아감, 총 6 사이클
6. 4℃, 시간 제한 없음.
PCR 생성물을 1.2 부피의 AMPure로 정제하고 40 μL의 희석 완충액으로 용출하였다.
실시예 8 - 에멀션-기반, 대량의 고 처리량 단일-세포 폴리뉴클레오티드 서열결정을 수행하기 위한 차세대 서열결정을 위한 폴리뉴클레오티드의 제3 PCR 반응 (PCR3)을 위한 프로토콜.
8 μL의 정제된 PCR2 생성물을 qPCR에 대해 사용하여 증폭 사이클의 최종 수를 측정하였다. 제3 PCR 반응에 대한 설정을 하기 표 4에 나타낸다.
qPCR3a 라이브러리
시약 스톡 농도 최종 농도 20 μL rxn
Q5 완충액 5X 5.00 mM 1.00 μm 4.00 μL
각 dNTPs 10.00 mM 0.20 μm 0.40 μL
SYBR Green I 1:500 83.00 mM 1.00 μm 0.24 μL
Q5 고온 출발 125.00 mM 1.00 μm 0.16 μL
C5-P5 프라이머 10.00 μm 0.40 μm 0.80 μL
C7 프라이머 10.00 μm 0.40 μm 0.80 μL
cDNA 8.00 μL
H2O 5.60 μL
프라이머 서열
P5 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
C7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
다음의 프로그램을 qPCR 기계에서 작동시켰다:
1. 98℃, 01:00
2. 98℃, 00:10
3. 64℃, 00:20
4. 72℃, 00:20
5. 플레이트 판독
6. 2로 되돌아감, 총 25 사이클
7. 4℃, 시간 제한 없음.
qPCR 세기 플롯을 조사하여 형광 세기가 최대지만 DNA의 지수적 증폭이 아직 끝나지 않은 증폭 사이클을 측정하였다. 이것이 PCR3 종점에 대한 최종 사이클 수였다.
24.0 μL의 정제된 PCR2 생성물을 종점 PCR3에 대해 사용하였다. 제3 PCR의 종점의 사이클 수를 측정하기 위한 PCR 반응에 대한 예시적인 설정을 하기 표 5에 나타낸다.
qPCR3b 라이브러리
시약 스톡 농도 최종 농도 60 μL rxn
Q5 완충액 5X 5.00 mM 1.00 μm 12.00 μL
각 dNTPs 10.00 mM 0.20 μm 1.20 μL
H2O 83.00 mM 1.00 μm 0.72 μL
Q5 고온 출발 125.00 mM 1.00 μm 0.48 μL
C5-P5 프라이머 10.00 μm 0.40 μm 2.40 μL
C7 프라이머 10.00 μm 0.40 μm 2.40 μL
cDNA 24.00 μL
H2O 16.80 μL
다음의 프로그램을 써모사이클러에서 작동시켰다:
1. 98℃, 01:00
2. 98℃, 00:10
3. 64℃, 00:20
4. 72℃, 00:20
5. 2로 되돌아감, 측정된 수의 사이클
6. 4℃, 시간 제한 없음.
PCR 생성물을 1.2 부피의 AMPure로 정제하고 20 μL의 희석 완충액으로 용출하였다. 라이브러리를 서열결정에 대해 준비하였다. 오염시키는 절단된 암플리콘을 제거하기 위해 아가로오스 겔 정제가 있거나 없이, 라이브러리를 필요한 대로 모은 다음 차세대 서열결정 기술 플랫폼을 사용하여 서열결정하였다.
실시예 9 - 판독 프로세싱 및 아이소타입 배정.
Illumina MiSeq 판독을 pRESTO 패키지1 주변에 세워진 맞춤 파이프라인을 사용하여 처리하여 mRNA 분자 및 방울에 대한 전체 길이 공통 서열을 생성하고, IgBLAST 및 IMGT/HighV-QUEST로 주석을 단 후, 맞춤 스크립트 및 변화-O 패키지로 처리하여 통계학 및 수치를 생성하였다. MiSeq 판독을 Illumina 소프트웨어를 사용하여 복합성을 제거하였다. Phred 퀄리티 5보다 적은 위치를 N으로 감추었다. 아이소타입-특이적 프라이머, 방울 바코드 (DB) 및 분자 바코드 (MB)를 암플리콘에서 확인하고, 0.2의 최대 오류로 절단된 pRESTO 마스크프라이머를 사용하여 트리밍하였다. 판독 1 공통 서열 및 판독 2 공통 서열을 DB와 MB를 함께 포함하고 있는 특유한 분자 확인자 (UMI)에 의해 그룹이 정해진 판독으로부터의 각 mRNA에 대해 별도로 생성하였고, 그것은 동일한 원래의 mRNA 분자 기원으로부터 발생된 PCR 복제물이었다. UMI 판독 그룹을 MUSCLE와 배열하였고, pRESTO를 사용하여 다음의 변수를 가지는 공통 서열을 구성하였다: maxdiv = 0.1; bf 프라이머; prfreq = 0.6; maxmiss = 0.5; q = 5; ≥ 60%의 판독 그룹에 대한 PCR 프라이머 서열 협정; 최대 뉴클레오티드 다양성 = 0.1; indel 위치에 대한 주요 규칙을 사용함; 및 낮은 후방 (일치) 품질을 가지는 배열 칼럼의 은폐 (masking). 그런 다음 쌍을 이룬 단부 공통 서열을 2 회기로 봉합하였다. 먼저, 각 판독 쌍의 공통 서열 말단의 갭이 없는 배열을 Z-스코어 근사치를 사용하여 최적화하고 pRESTO AssemblePairs-배열에서 시행된 것과 같이 다음의 변수들로 이항식 p-값으로 스코어를 매겼다: 최소 길이 = 8; 알파 1x10-5; 및 최대 오류 = 0.3. 이 방법을 봉합하기 위한 판독 쌍 결점에 대해, 봉합을 인간 BCR 및 TCR 생식계열 V 엑손을 사용하여 시도하여 판독-연합을 봉합 또는 갭을 매우기 전에, pRESTO's AssemblePairs-참조 변수를 사용하여 각 판독을 설치하였다: 최소 동일성 = 0.5; e 값 1x10-5.
실시예 10 - V(D)J 절편 주석 및 아이소타입 확인.
IgBLAST, 변화-O 및 맞춤 스크립트를 사용하여 원래의 생식계열 V(D)J 유전자를 확인하고, V(D)J 영역에 대한 mRNA 서열을 정돈하며, CDR3 영역을 확인하고, 생식계열 V 뉴클레오티드 서열로부터의 돌연변이를 계산하였다. 6 이상의 V-영역을 가진 mRNA 서열 N을 제외한 미스매치로서의 IgBLAST 카운트 N을 돌연변이 분석 및 교차-분획 쌍 형성 정확도 분석을 위해 여과하였다. IG 중쇄에 대해, 아이소타입 동일성을 비-프라이머 C-영역 (불변 영역 엑손)을 pRESTO 마스크프라이머-스코어 변수: 출발 = 0; 최대 오류 = 0.2를 사용하여 예상된 서열에 매치시킴으로써 확인하였다. 부조화한 프라이머/비-프라이머 C-영역으로 판단된 암플리콘을 버렸는데, 특이적 프라이머 혼선 사건이 외관 검사에 의해 해결된 두 개의 프라이머/비-프라이머 조합은 제외하였다.
실시예 11 - V(D)J 서열의 클론 계통으로의 그룹 나누기.
V(D)J 서열을 단일-계통 클러스터링을 사용하여 편중된 클론내 거리를 가지는 클론들의 그룹으로 나누었다. 클러스터링을 그룹 변수에 의해 변화-O 패키지 DefineClones-으로 수행하였다: 모델 = m1n; 유전자 = 제1; 거리 = 4.0; norm = 없음. 먼저, 모든 기능적 Ig VH 사슬의 방울 공통 서열을 V-J 접합 상자에 버려서, 아마도 동일한 초기 재조합 사건으로부터 발생하는 서열이 함께 버려지게 하였다 (최상의 매칭 Ig VH 유전자, 최상의 매칭 Ig JH 유전자, 및 접합 길이를 기반으로 함, IMGT/HighV-QUEST에 의해 확인됨). 클론내 거리 한계값을, 변화-O shm 패키지의 distToNearest 함수를 사용하여 각각의 Ig VH 상자 내에서의 가장 가까운-이웃 거리의 히스토그램을 생성하고, 자연적인 거리 컷오프 (바이모달 히스토그램의 트로프 (trough)에서)에 대해 히스토그램을 육안으로 검사함으로써 선택하였다. 경쇄의 클론 클러스터를 동일한 거리 모델 및 한계값을 사용하여 규정하였다.
실시예 12 - 방울 여과, 쌍 형성 신뢰도 계산.
중쇄-경쇄 쌍 형성 신뢰도를 두 가지 독립적인 방법으로: 방울내 mRNA 서열 협정, 및 복제물-간 쌍 협정을 사용하여 평가하였다. 방울내 mRNA 협정은 유전자좌 내에 있는 V(D)J 서열의 평균 쌍방식 뉴클레오티드 차이 (Nei pi < 0.02)로서 규정되었다. mRNA 서열을 IgBLAST 주석을 사용하여 V(D)J 뉴클레오티드 코딩 서열로 하향 정돈하였다. 각 방울 내에서 모든 생산성 mRNA 서열을 V 유전자좌 그룹으로 나누었다. 각 방울 내에서, 다중 서열을 pRESTO AlignSet에서 시행된 것과 같이 디폴트 변수들을 사용하여 MUSCLE를 사용하여 배열하였다. 방울 공통 서열을 유전자좌당 다중 mRNA로부터 pRESTO 변수들을 사용하여 구성하였다: BuildConsensus.py; 최대 div = 0.2; 최대 miss = 0.5. 무작위로 셔플링된 방울을 사용하여 다양성 컷오프, pi가 ≤ 0.02인 것을 선택하였다. 셔플링된 방울에서, 0.01% 미만의 중쇄 유전자좌 (< 0.2%의 경쇄 유전자좌)가 이 기준을 충족하였다. 다중-세포 또는 면역-수용체 포함된 방울을 추가의 정확도 분석을 위해 분리하였다.
쌍 형성 정확도를, 단일 계통만을 함유하는 것으로 보이는, 즉 단일 V(D)J 및 VJ 재배열과 이어서 팽창으로부터 발생한 VDJ 클러스터에 집중하여, 다중 복제물을 가로질러 동일한 클론-쌍의 관찰을 기반으로 계산하였다 (별도의 에멀션 실험). 유사한 VDJ 재배열은 개별적으로 복수의 독립적인 횟수 내에서 일어날 수 있고, 동일한 중쇄 V(D)J 재배열이 자연적으로 다중의 상이한 경쇄 VJ 재배열과 쌍을 이루도록 유도한다. 드문 V(D)J 재배열이 본원에 기술된 방법에 의해 이루어진 기술적 정확도의 보다 정확한 척도를 제공할 것이기 때문에, 이 분석에 대한 촛점에 대한 긴 중쇄 CDR3 (CDR3H) (드문 V(D)J 재배열에 대한 대리로서). > 6N인 서열을 또한 제거하여 클론 협정 신뢰도를 증가시켰다. 클론들의 가장 긴 사분위수에 대해 96%를 넘는 CDR3H 길이에 따라 증가된 쌍 형성 정확도를 분획을 가로질러 관찰하였다 (접합 길이가 ≥ 54nt인 2,604 클론). 클론-쌍 협정의 가능성이 두 개의 독립적인 실험에서 실제 쌍의 연합 가능성이기 때문에, 쌍 형성 정확도를 복제물을 가로지르는 쌍 형성 협정의 제곱근으로서 산정하였고, 다음과 같이 계산하였다: 여기서
Figure pct00001
는 방울 바코드 d의 수이며, 이때 쌍을 이룬 중쇄 클론은 h이고 경쇄 클론은 l이며, 물리적 분획 f에서 발견된다. 각 실험에 대한 평균 (제곱) 쌍 형성 정확도는 중쇄 클론 h 및 분획의 모든 쌍 (f, g), 쌍을 이룬 경쇄 클론 (l, k)에 대한 평균화에 의해 산정된다:
Figure pct00002
그러므로 각 실험의 평균 정확도 (실험간 정확도의 편차 내에서에 대한)는 이 예시적인 실험에 따르면 96.1%였다.
실시예 13 - HIV 계통발생적 분석.
HIV에 대해 광범위하게 중화시키는 새로운 항체 (bNAb)를 공지의 bNAb에 대한 유사성에 대해 본 발명자들의 고-처리량 쌍을 이룬 항체 프로세싱된 서열을 발굴함으로써 발견하였다. PGT-도너 및 다른 도너들로부터 앞서 알려진 bNAb는 문헌으로부터 발굴된 것들이었다. 에멀션으로부터 회수한 모든 HIV IgH mRNA를 공지된 CDR3 아미노산 서열에 대한 유사성에 대해 tblastx 10을 통해 스코어를 매겼다. 서열 유사성의 바탕 분포를 생성하기 위하여 건강한 도너로부터의 IgH mRNA 서열을 사용하여, 27의 비트 스코어 컷오프를 사용하여 추후 분석을 위해 후보 bNAb-유사 CDR3을 분리하였다. 후보 서열의 V(D)J 서열을 디폴트 변수를 포함한 MUSCLE 11을 사용하여 공지의 bNAb와 배열하였고, 특히 갭오픈 = -15를 제외한 디폴트 변수를 사용하여 PGT-도너 계통과 배열하였다. PhyML 디폴트 변수로 계통나무를 생성하고, Newick 유틸리스 및 덴드로스코프로 조작하고 가시화하고 수동으로 검사하여 공지의 nNAb 서열이 사이에 끼여 있는 면역글로불린 중쇄 서열을 선택하였다. 각 방울에 대한 공통 서열을 앞서 기술한 것과 같이 JALVIEW을 사용하여 임의의 방울-내 아미노산 충돌의 배열에 대한 수동 검사로 구성하였다. 8개의 중쇄 서열 및 그것들의 자연적으로 쌍을 이룬 경쇄 항체 서열을 합성, 클로닝, 발현 및 중화 분석을 위해 선택하였다.
실시예 14 - 데이터 분석 및 도표화.
dplyr 및 ggplot2 R 패키지를 사용하여 도표를 생성하였다. 데이터를 산란 도표 도면에서만 가시화 목적으로 R로 무작위로 하향-샘플화 및/또는 조금씩 움직이게 하였다. 하향-샘플링 최소는 아이소타입당 20,000 방울이었고 또는 다른 방식으로 주지된 바와 같았다. 포인트를 동일한 균일 가능성 분포로부터 유도한 수직 및 수평 잡음을 첨가함으로써 조금씩 움직이게 하였고, 이때 mRNA 유닛에 대해서는 최대 ≤ 0.2였고 돌연변이에 대해서는 ≤ 0.6 %였다.
SEQUENCE LISTING <110> ABVITRO, INC. <120> HIGH-THROUGHPUT NUCLEOTIDE LIBRARY SEQUENCING <130> 44243-709.601 <140> PCT/US2015/050119 <141> 2015-09-15 <150> 62/051,832 <151> 2014-09-17 <150> 62/050,549 <151> 2014-09-15 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 gggttggggc ggatgcac 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 catccggagc cttggtgg 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 3 ccttggggct ggtcgggg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 4 cggatgggct ctgtgtgg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> 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Sequence: Synthetic primer" <400> 42 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttttgatc tccagcttgg tcccctgg 58 <210> 43 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 43 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttttgata tccactttgg tcccagggc 59 <210> 44 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 44 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttttgatt tccaccttgg tcccttggc 59 <210> 45 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 45 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttttaatc tccagtcgtg tcccttggc 59 <210> 46 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 46 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgaggacg gtcaccttgg tgcca 55 <210> 47 <211> 57 <212> DNA 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Claims (525)

  1. (a) 각 용기가
    (i) 복수의 세포를 포함하는 샘플로부터의 단일 세포,
    (ii) 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 및
    (iii) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복수의 용기를 형성하는 단계;
    (b) (i) 단일 세포로부터의 제1 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드, 및
    (ii) 단일 세포로부터의 제2 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계;
    (c) (i) 복수의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 제1 상보성 폴리뉴클레오티드에 부착시키고, 및
    (ii) 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 제2 상보성 폴리뉴클레오티드에 부착시키고,
    그로써 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; 및
    (d) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것의 증폭된 생성물을
    (i) 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물, 및
    (ii) 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물에 부착시킴으로써, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 형성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. (a) 샘플로부터 복수의 면역 세포로부터의 중쇄 면역글로불린 (IgH) 폴리뉴클레오티드로부터 제1 상보성 폴리뉴클레오티드 및 경쇄 면역글로불린 (IgL) 폴리뉴클레오티드로부터 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를:
    (i) 복수의 면역 세포로부터의 IgH 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 표적 프라이머;
    (ii) 복수의 면역 세포로부터의 IgL 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 표적 프라이머;
    (iii) 비-주형 말단 전달효소 활성을 포함하는 역 전사효소, 이때 3개 이상의 동일한 비-주형 뉴클레오티드가 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가되며;
    (iv) 각각이
    (A) 분자 바코드,
    (B) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 5' 단부 영역, 및
    (C) 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 3' 단부 영역을 포함하는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드; 및
    (v) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드
    를 사용하여 제조하고,
    그로써 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계;
    (b) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계;
    (c) 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 IgH 또는 IgL 폴리뉴클레오티드의 가변 영역, 또는 그것들의 조합을 포함하는 서열의 라이브러리를 형성하는 단계; 및
    (d) 라이브러리의 하나 이상의 서열을 서열결정하는 단계를 포함하고,
    (a)는 복수의 용기 중 한 용기에서 수행되며, 용기는 복수의 면역 세포로부터의 단일 면역 세포를 포함하는, 방법.
  3. (a) 샘플로부터의 복수의 면역 세포로부터의 T-세포 수용체 알파 (TCRα) 폴리뉴클레오티드로부터 제1 상보성 폴리뉴클레오티드 및 T-세포 수용체 베타 (TCRβ) 폴리뉴클레오티드로부터 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를:
    (i) 복수의 면역 세포로부터의 TCRα 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 표적 프라이머;
    (ii) 복수의 면역 세포로부터의 TCRβ 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 표적 프라이머;
    (iii) 비-주형 말단 전달효소 활성을 포함하는 역 전사효소, 이때 3개 이상의 동일한 비-주형 뉴클레오티드가 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가되며;
    (iv) 각각이
    (A) 분자 바코드,
    (B) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 5' 단부 영역 및
    (C) 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 3' 단부 영역
    을 포함하는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드; 및
    (v) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드
    를 사용하여 제조하고, 그로써 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계;
    (b) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계;
    (c) 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 TCRα 또는 TCRβ 폴리뉴클레오티드의 가변 영역, 또는 그것들의 조합을 포함하는 서열의 라이브러리를 형성하는 단계; 및
    (d) 라이브러리의 하나 이상의 서열을 서열결정하는 단계를 포함하고,
    (a)는 복수의 용기 중 한 용기에서 수행되며, 용기는 복수의 면역 세포로부터의 단일 면역 세포를 포함하는 방법.
  4. (a) 샘플로부터의 복수의 면역 세포로부터의 T-세포 수용체 감마 (TCRγ) 폴리뉴클레오티드로부터 제1 상보성 폴리뉴클레오티드 및 T-세포 수용체 델타 (TCRδ) 폴리뉴클레오티드로부터 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를:
    (i) 복수의 면역 세포로부터의 TCRγ 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제1 표적 프라이머;
    (ii) 복수의 면역 세포로부터의 TCRδ 폴리뉴클레오티드의 동일 영역에 상보하는 영역을 포함하는 제2 표적 프라이머;
    (iii) 비-주형 말단 전달효소 활성을 포함하는 역 전사효소, 이때 3개 이상의 동일한 비-주형 뉴클레오티드가 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가되며;
    (iv) 각각이
    (A) 분자 바코드,
    (B) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 5' 단부 영역 및
    (C) 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 3' 단부 영역
    을 포함하는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드; 및
    (v) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드
    를 사용하여 제조하고, 그로써 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계;
    (b) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계;
    (c) 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 TCRγ 또는 TCRδ 폴리뉴클레오티드의 가변 영역, 또는 그것들의 조합을 포함하는 서열의 라이브러리를 형성하는 단계; 및
    (d) 라이브러리의 하나 이상의 서열을 서열결정하는 단계를 포함하고,
    (a)는 복수의 용기 중 한 용기에서 수행되며, 용기는 복수의 면역 세포로부터의 단일 면역 세포를 포함하는 방법.
  5. 제2 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 라이브러리가 샘플의 면역상태를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열은 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 라이브러리인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드가 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 상이한 분자 바코드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열은 상이한 분자 바코드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열은 동일한 용기 바코드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 증폭된 생성물이 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13 항에 있어서, 복수의 용기 중 제2 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14 항 또는 제15 항에 있어서, 복수의 용기 중 제3 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16 항에 있어서, 제1 용기, 제2 용기 및 제3 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1 항 내지 제5 항, 제8 항 내지 제12 항, 제14 항, 제16 항, 제19 항 및 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 그 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21 항에 있어서, 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 그 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1 항 내지 제22 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 복수의 용기 중 제2 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드와 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 제1 동일 용기 바코드인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24 항에 있어서, 복수의 용기 중 제2 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 제2 동일 용기 바코드인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제24 항 또는 제25 항에 있어서, 제1 동일 용기 바코드는 제2 동일 용기 바코드와 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제24 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 동일한 용기 바코드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제24 항 내지 제27 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 복수의 용기 중 임의의 다른 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 그것의 암플리콘의 용기 바코드에 대해 특유한 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 용기에 단일 분자로서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1 항 내지 제29 항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기의 각각의 용기에 단일 분자로서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제1 항 내지 제30 항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 중의 용기에 적어도 단일 분자로서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기의 각각의 용기에 적어도 단일 분자로서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1 항 내지 제32 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 제1 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제33 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열은 제1 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제33 항 또는 제34 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 그 단일 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제33 항 내지 제35 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제1 공통 용기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제36 항에 있어서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제2 공통 용기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제1 항 내지 제37 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 복수의 용기 중 제2 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38 항에 있어서, 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열은 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제1 항 내지 제39 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘은 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일한 서열을 포함하는 제1 공통 용기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘은 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일한 서열을 포함하는 제2 공통 용기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제1 항 내지 제41 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 제1 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열은 제1 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제42 항 또는 제43 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 단일 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제42 항 내지 제44 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기의 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제1 공통 분자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제45 항에 있어서, 복수의 용기의 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제2 공통 분자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제42 항 내지 제46 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 복수의 용기 중 제2 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제47 항에 있어서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열은 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제42 항 내지 제48 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 제1 공통 분자 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제49 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 제2 공통 분자 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제33 항 내지 제50 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 공통 용기 서열은 제1 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제33 항 내지 제51 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 공통 용기 서열은 제1 공통 분자 서열 또는 그것의 상보물에 상보하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제51 항 또는 제52 항에 있어서, 제2 공통 분자 서열은 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제53 항에 있어서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역은 말단 영역이고, 제1 항 내지 제54 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 함께 융합되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제1 항 내지 제54 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 함께 융합되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제1 항 내지 제55 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열은 함께 융합되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제1 항 내지 제56 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제57 항에 있어서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제1 항 내지 제56 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제59 항에 있어서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제59 항 또는 제60 항에 있어서, RNA는 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제59 항 내지 제61 항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 cDNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제62 항에 있어서, (b)의 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 cDNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제1 항 내지 제63 항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 제1 세포 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 제1 표적 프라이머를 연장시키고, 제2 세포 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 제2 표적 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제64 항에 있어서, 연장은 제1 표적 프라이머로 제1 세포 폴리뉴클레오티드를 역전사시키고, 제2 표적 프라이머로 제2 세포 폴리뉴클레오티드를 역전사시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제64 항 또는 제65 항에 있어서, 제1 표적 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 상보하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제66 항에 있어서, 제2 표적 프라이머는 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 상보하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제64 항 내지 제67 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 프라이머는 폴리 (T) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제68 항에 있어서, 제2 표적 프라이머는 폴리 (T) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제66 항 내지 제69 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열은 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열, TCRγ 서열, 또는 그것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제66 항 내지 제70 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열은 중쇄 불변 영역 (CH) 서열, TCRα 불변 영역 (Cα) 서열, TCRγ 불변 영역 (Cγ) 서열, 또는 그것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제70 항 또는 제71 항에 있어서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열은 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열, TCRδ 서열, 또는 그것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제70 항 내지 제72 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 표적 서열은 경쇄 불변 영역 (CL) 서열, TCRβ 불변 영역 (Cβ) 서열, TCRδ 불변 영역 (Cδ) 서열, 또는 그것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제64 항 내지 제73 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 프라이머는 복수의 제1 표적 프라이머들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제64 항 내지 제74 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 표적 프라이머는 복수의 제2 표적 프라이머들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제74 항 또는 제75 항에 있어서, 제1 표적 프라이머는 복수의 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열, TCRγ 서열, 또는 그것들의 조합에 상보하는 복수의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제76 항에 있어서, 복수의 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열 또는 TCRγ 서열은 복수의 중쇄 불변 영역 (CH) 서열, TCRα 불변 영역 (Cα) 서열, TCRγ 불변 영역 (Cγ) 서열, 또는 그것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제77 항에 있어서, 복수의 중쇄 불변 영역 (CH) 서열은 IgM, IgD, IgA, IgE, IgG 및 그것들의 조합으로부터의 중쇄 불변 영역 (CH) 서열로 구성되는 군으로부터 선태된 둘 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제74 항 내지 제78 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제2 표적 프라이머는 복수의 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열, TCRδ 서열, 또는 그것들의 조합에 상보하는 복수의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제79 항에 있어서, 복수의 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열 또는 TCRδ 서열은 복수의 경쇄 불변 영역 (CL) 서열, TCRβ 불변 영역 (Cβ) 서열, TCRδ 불변 영역 (Cδ) 서열, 또는 그것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제80 항에 있어서, 복수의 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열은 Igκ, Igλ 및 그것들의 조합으로부터의 경쇄 불변 영역 (CL) 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 둘 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제1 항 내지 제81 항 중 어느 한 항에 있어서, (b)에서 연장은 비-주형 말단 전달효소의 사용을 포함하고, 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제82 항에 있어서, 비-주형 말단 전달효소는 역전사효소 또는 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제82 항 또는 제83 항에 있어서, 비-주형 말단 전달효소는 역전사효소이고, 역전사효소는 슈퍼스크립트 II 역전사효소, 막시마 역전사효소, 프로토스크립트 II 역전사효소, 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT), 하이스크라이버 역전사효소, 조류 골수아세포증 바이러스 (AMV) 역전사효소, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전달효소 활성을 포함하고 있는 임의의 역전사효소 및 그것들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제82 항 내지 제84 항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제82 항 내지 제85 항 중 어느 한 항에 있어서, (c)에서 부착은 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역을 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제86 항에 있어서, (c)에서 부착은 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역을 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제82 항 내지 제87 항 중 어느 한 항에 있어서, (c)에서 제1 상보성 폴리뉴클레오티드에 부착된 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부 상의 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제88 항에 있어서, (c)에서 제2 상보성 폴리뉴클레오티드에 부착된 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부 상의 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제82 항 내지 제89 항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드는 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제82 항 내지 제89 항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드의 다른 뉴클레오티드와 동일하지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제86 항 내지 제91 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 한 뉴클레오티드는 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 다른 핵산과 동일하지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제87 항 내지 제92 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 한 뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 다른 핵산과 동일하지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제92 항 또는 제93 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제92 항 내지 제94 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제92 항 내지 제95 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신인 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제92 항 내지 제95 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제92 항 내지 제97 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 말단 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제92 항 또는 제93 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제86 항 내지 제99 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제86 항 내지 제100 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 제86 항 내지 제101 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신인 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 제86 항 내지 제101 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 제86 항 내지 제99 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 제86 항 내지 제104 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 제86 항 내지 제105 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 제86 항 내지 제104 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  108. 제1 항 내지 제107 항 중 어느 한 항에 있어서, (c)는 부착 후에 제1 상보성 폴리뉴클레오티드 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드를 연장시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  109. 제1 항 내지 제108 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  110. 제109 항에 있어서, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  111. 제109 항 또는 제110 항에 있어서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  112. 제111 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 분자 바코드 서열에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  113. 제111 항 또는 제112 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것으로부터 증폭된 생성물의 영역에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  114. 제109 항 내지 제113 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  115. 제114 항에 있어서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  116. 제1 항 내지 제115 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  117. 제116 항에 있어서, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  118. 제1 항 내지 제117 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  119. 제118 항에 있어서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  120. 제1 항 내지 제119 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  121. 제120 항에 있어서, 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  122. 제120 항 또는 제121 항에 있어서, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역은 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드가 상보하는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  123. 제1 항 내지 제122 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 제1 프라이머 세트로 증폭시키는 단계를 더 포함하고, 여기서 증폭은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 부착시키기 전에 또는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 부착시키는 것과 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  124. 제1 항 내지 제123 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드로부터의 증폭된 생성물 및 그것들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 제1 및 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  125. 제1 항 내지 제124 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드가
    (i) 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 대한 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 혼성화 영역, 및
    (ii) 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 대한 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 혼성화 영역
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  126. 제1 항 내지 제125 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 부착 후에 제1 단일 세포 단일-바코딩된 서열 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 서열을 연장시킴으로써 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  127. 제126 항에 있어서, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열이 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  128. 제127 항에 있어서, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열이 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  129. 제128 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역이 동일한 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  130. 제129 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역이 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것으로부터 증폭된 생성물의 영역에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  131. 제123 항 내지 제130 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머가 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  132. 제131 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  133. 제123 항 내지 제132 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  134. 제133 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  135. 제123 항 내지 제134 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 분자 바코드의 하류에 있는 제1 단일 세포 단일-바코딩된 서열의 상보물의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  136. 제135 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 분자 바코드의 하류에 있는 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  137. 제123 항 내지 제136 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 용기 바코드의 상류에 있는 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  138. 제137 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제1 프라이머는 용기 바코드의 상류에 있는 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  139. 제123 항 내지 제138 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  140. 제139 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  141. 제123 항 내지 제140 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  142. 제141 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  143. 제123 항 내지 제142 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 분자 바코드의 상류에 있는 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  144. 제143 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 분자 바코드의 상류에 있는 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  145. 제123 항 내지 제144 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 용기 바코드의 상류에 있는 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  146. 제145 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 용기 바코드의 상류에 있는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  147. 제1 항 내지 제146 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 복수의 용기중 둘 이상의 용기를 파괴하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  148. 제147 항에 있어서, 방법이 둘 이상의 파괴된 용기로부터 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 모으는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  149. 제1 항 내지 제148 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이
    (e) 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 증폭시키는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  150. 제149 항에 있어서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 증폭이 복수의 용기 중 용기 외부에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  151. 제123 항 내지 제150 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이
    (e) 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열을 제2 프라이머 세트로 증폭시키는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  152. 제150 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  153. 제152 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  154. 제150 항 내지 제153 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  155. 제154 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  156. 제150 항 내지 제156 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 분자 바코드의 상류에 있는 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  157. 제156 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 분자 바코드의 상류에 있는 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  158. 제150 항 내지 제157 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 용기 바코드의 상류에 있는 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  159. 제158 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머는 용기 바코드의 상류에 있는 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  160. 제139 항 내지 제159 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제2 프라이머 세트의 제1 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
  161. 제150 항 내지 제160 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 및 제2 세포 폴리뉴클레오티드, 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  162. 제161 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 폴리 (T) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  163. 제150 항 내지 제160 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드, 제1 또는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 또는 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 또는 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  164. 제163 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  165. 제163 항 또는 제164 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머는 제2 세포 폴리뉴클레오티드, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  166. 제165 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  167. 제165 항 또는 제166 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머는 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 서열의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 방법.
  168. 제165 항 내지 제167 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머는 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리유클레오티드 또는 그것의 상보물, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 상보물, 또는 그것들의 임의의 조합에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  169. 제163 항 내지 제168 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 표적 특이적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  170. 제169 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머는 표적 특이적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  171. 제169 항 또는 제170 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머의 표적 특이적 서열은 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열, TCRγ 서열, 또는 그것들의 조합을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  172. 제169 항 내지 제171 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머의 표적 특이적 서열은 중쇄 불변 영역 서열 (CH), TCRα 불변 영역 (Cα) 서열, TCRγ 불변 영역 (Cγ) 서열, 또는 그것들의 조합을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  173. 제169 항 내지 제172 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머의 표적 특이적 서열은 GGGTTGGGGCGGATGCAC, CATCCGGAGCCTTGGTGG, CCTTGGGGCTGGTCGGGG, CGGATGGGCTCTGTGTGG, CCGATGGGCCCTTGGTGG, GGATTTAGAGTCTCTCAGCTG, CACGGCAGGGTCAGGGTTC 및 GGGGAAACATCTGCATCAAGT로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  174. 제171 항 내지 제173 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머의 표적 특이적 서열은 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열, TCRδ 서열, 또는 그것들의 조합을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  175. 제171 항 내지 제174 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머의 표적 특이적 서열은 경쇄 불변 영역 서열 (CL), TCRβ 불변 영역 (Cβ) 서열, TCRδ 불변 영역 (Cδ) 서열, 또는 그것들의 조합을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  176. 제174 항 또는 제175 항에 있어서, 제3 프라이머의 표적 특이적 서열은 TTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGC, TTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTGG, TTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC, TTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGC, TTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGC, GAGGACGGTCACCTTGGTGCCA, TAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCC, GAGGACGGTCAGCTGGGTGCC, TAAAATGATCAGCTGGGTTCCTCCAC, TAGGACGGTGACCTTGGTCCCAG, GGGAGATCTCTGCTTCTGATG, CGACCTCGGGTGGGAACAC 및 CGGATGGTTTGGTATGAGGC로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  177. 제163 항 내지 제175 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제2 프라이머는 복수의 제2 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  178. 제165 항 내지 제177 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트의 제3 프라이머는 복수의 제3 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  179. 제177 항 또는 제178 항에 있어서, 복수의 제2 프라이머의 표적 특이적 서열은 복수의 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열, TCRγ 서열, 또는 그것들의 조합을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  180. 제179 항에 있어서, 복수의 중쇄 면역글로불린 (IgH) 서열, TCRα 서열 또는 TCRγ 서열은 복수의 중쇄 불변 영역 (CH), TCRα 불변 영역 (Cα) 서열, TCRγ 불변 영역 (Cγ) 서열, 또는 그것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  181. 제180 항에 있어서, 복수의 중쇄 불변 영역 (CH) 서열은 IgM, IgD, IgA, IgE, IgG 및 그것들의 조합으로부터의 중쇄 불변 영역 (CH) 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 둘 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  182. 제178 항 내지 제181 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제3 프라이머의 표적 특이적 서열은 복수의 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열, TCRδ 서열 또는 그것들의 조합을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  183. 제182 항에 있어서, 복수의 경쇄 면역글로불린 (IgL) 서열, TCRβ 서열 또는 TCRδ 서열은 복수의 경쇄 불변 영역 (CL) 서열, TCRβ 불변 영역 (Cβ) 서열, TCRδ 불변 영역 (Cδ) 서열, 또는 그것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  184. 제183 항에 있어서, 복수의 경쇄 불변 영역 (CL) 서열은 Igκ, Igλ 및 그것들의 조합으로부터의 경쇄 불변 영역 (CL) 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 둘 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  185. 제1 항 내지 제184 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 프라이머, 제2 표적 프라이머, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것들의 임의의 조합은 고체 지지체에 부착되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  186. 제1 항 내지 제185 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 프라이머, 제2 표적 프라이머, 제1 프라이머 세트의 프라이머, 제2 프라이머 세트의 프라이머, 또는 그것들의 임의의 조합은 분자 바코드, 용기 바코드, 바코드, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  187. 제1 항 내지 제186 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 프라이머, 제2 표적 프라이머, 제1 프라이머 세트의 프라이머, 제2 프라이머 세트의 프라이머, 또는 그것들의 임의의 조합은 오버행 영역을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  188. 제1 항 내지 제187 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기의 각각의 용기는 고체 지지체를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  189. 제1 항 내지 제188 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  190. 제1 항 내지 제189 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 비드에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  191. 제1 항 내지 제190 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것들의 임의의 조합은 프라이머가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  192. 제1 항 내지 제191 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것들의 임의의 조합은 연장되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  193. 제1 항 내지 제192 항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 내지 (d)는 단일 용기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  194. 제1 항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 내지 (d)는 단일 반응으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  195. 제1 항 내지 제194 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 단일 세포를 용해시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  196. 제195 항에 있어서, 용해는 단일 세포로부터 제1 및 제2 세포 폴리뉴클레오티드를 방출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  197. 제195 항 또는 제196 항에 있어서, 단일 세포는 (a) 후에 용해되는 것을 특징으로 하는 방법.
  198. 제195 항 내지 제197 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포는 (b) 전에 용해되는 것을 특징으로 하는 방법.
  199. 제195 항 내지 제198 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포는 용기에서 용해되고, 제195 항 내지 제199 항 중 어느 한 항에 있어서, 용해는 화학적 용해를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  200. 제195 항 내지 제199 항 중 어느 한 항에 있어서, 용해는 냉동-해동을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  201. 제1 항 내지 제200 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 (d) 전에 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
  202. 제1 항 내지 제201 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 (d)와 동시에 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
  203. 제1 항 내지 제202 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드 및 제1 단일 세포 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동시에 증폭되거나 연장되는 것을 특징으로 하는 방법.
  204. 제1 항 내지 제203 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드, 제1 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동시에 증폭되거나 연장되는 것을 특징으로 하는 방법.
  205. 제1 항 내지 제204 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단일 세포 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 제2 단일 세포 단일-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동시에 증폭되거나 연장되는 것을 특징으로 하는 방법.
  206. 제1 항 내지 제205 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동시에 증폭되거나 연장되는 것을 특징으로 하는 방법.
  207. 제1 항 내지 제206 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기는 복수의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  208. 제1 항 내지 제206 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기는 복수의 에멀션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  209. 제208 항에 있어서, 복수의 에멀션의 각각의 에멀션은 약 0.01 피코리터 내지 10 마이크로리터의 부피인 것을 특징으로 하는 방법.
  210. 제1 항 내지 제209 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기는 복수의 컨테이너를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  211. 제1 항 내지 제210 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 프라이머, 제2 표적 프라이머, 제1 프라이머 세트의 프라이머, 또는 제2 프라이머 세트의 프라이머는 샘플 바코드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  212. 제1 항 내지 제211 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 그것들의 증폭된 생성물을 용기로부터 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  213. 제1 항 내지 제212 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 그것들의 증폭된 생성물, 또는 그것들의 임의의 조합을 서열결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  214. 제213 항에 있어서, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 그것들의 증폭된 생성물, 또는 그것들의 임의의 조합은 동시에 서열결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  215. 제213 항에 있어서, 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드, 그것들의 증폭된 생성물, 또는 그것들의 임의의 조합은 동일한 반응으로 서열결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  216. 제1 항 내지 제215 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 세포 기원을 용기 바코드를 기반으로 동일한 것으로 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  217. 제216 항에 있어서, 측정은 제1 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 용기 바코드의 서열을 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 용기 바코드의 서열과 매치시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  218. 제1 항 내지 제217 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 둘 다의 서열을 가지는 출발 분자의 수를 분자 바코드를 기반으로 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  219. 제216 항에 있어서, 측정은 동일한 제1 분자 바코드, 동일한 제2 분자 바코드 또는 둘 다를 가지는 서열의 수를 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  220. 제1 항 내지 제219 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제1 서열 및 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제2 서열이 동일한 용기 바코드 또는 그것의 상보물을 함유할 때, 그것들은 동일한 단일 용기 또는 단일 세포로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  221. 제220 항에 있어서, 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제1 서열 및 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제2 서열이 상이한 분자 바코드 또는 그것의 상보물을 함유할 때, 그것들은 상이한 세포 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  222. 제220 항 또는 제221 항에 있어서, 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제1 서열 및 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제2 서열이 동일한 분자 바코드 또는 그것의 상보물을 함유할 때, 그것들은 동일한 세포 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  223. 제220 항 내지 제222 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제1 서열 및 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 증폭된 생성물의 제2 서열이 상이한 용기 바코드 또는 그것의 상보물을 함유할 때, 그것들은 상이한 단일 용기 또는 단일 세포로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  224. 제1 항 내지 제223 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포는 면역 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  225. 제1 항 내지 제224 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 세포는 복수의 면역 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  226. 제224 항 또는 제225 항에 있어서, 면역 세포는 림프구 또는 그것의 하위유형, B-세포 또는 그것의 하위유형, T-세포 또는 그것의 하위유형, 또는 그것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  227. 제225 항 또는 제226 항에 있어서, 복수의 세포는 메모리 B-세포, 나이브 B-세포, 형질아세포 B-세포, 나이브 T-세포, 형질아세포 T-세포, B-세포의 임의의 하위유형, T-세포의 임의의 하위유형 또는 그것들의 임의의 조합에 대해 풍부해지는 것을 특징으로 하는 방법.
  228. 제1 항 내지 제223 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포는 암세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  229. 제228 항에 있어서, 복수의 세포는 복수의 암세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  230. 제228 항 또는 제229 항에 있어서, 암세포는 편평세포 암종 세포, 선암종 세포, 전이세포 암종 세포, 골육종 세포, 연골육종 세포, 근육 육종 세포, 백혈병 세포, 림프종 세포, 신경교종 세포, 또는 그것들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  231. 제229 항 또는 제230 항에 있어서, 복수의 암세포는 순환하는 암세포, 내피 암세포, 상피 암세포, 희귀 암세포, 또는 암세포의 임의의 유형 또는 하위유형에 대해 풍부해지는 것을 특징으로 하는 방법.
  232. 제1 항 내지 제231 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 생물학적 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  233. 제232 항에 있어서, 생물학적 샘플은 대상으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  234. 제233 항에 있어서, 방법은 대상을 질환 또는 상태를 가진 것으로 진단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  235. 제233 항 또는 제234 항에 있어서, 대상은 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  236. 제235 항에 있어서, 동물은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  237. 제233 항 내지 제236 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 대상이 대립유전자에 대해 동형접합성인지 또는 이형접합성인지를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  238. 제233 항 내지 제237 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 질환 또는 상태를 가진 대상을 진단, 예측 또는 치료하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  239. 제232 항 내지 제238 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈액 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  240. 제1 항 내지 제239 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 샘플로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  241. 제1 항 내지 제239 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 샘플로부터 분리되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  242. 제1 항 내지 제241 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 제1 샘플 및 제2 샘플을 포함하는 복수의 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  243. 제242 항에 있어서, 복수의 샘플은 적어도 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 또는 그 이상의 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  244. 제242 항에 있어서, 복수의 샘플은 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 또는 그 이상의 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  245. 제242 항에 있어서, 복수의 샘플은 적어도 약 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 샘플, 9000, 또는 10,000 샘플, 또는 100,000 샘플 또는 1,000,000 또는 그 이상의 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  246. 제242 항에 있어서, 복수의 샘플은 적어도 약 10,000 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  247. 제242 항 내지 제246 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 샘플은 제1 대상으로부터 유래되고 제2 샘플은 제2 대상으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  248. 제247 항에 있어서, 제1 대상은 질환 또는 상태를 가진 대상인 것을 특징으로 하는 방법.
  249. 제247 항 또는 제248 항에 있어서, 제2 대상은 질환 또는 상태가 없는 대상인 것을 특징으로 하는 방법.
  250. 제1 항 내지 제249 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 변이체 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  251. 제250 항에 있어서, 변이체 서열은 돌연변이, 다형태, 결실 또는 삽입을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  252. 제251 항에 있어서, 다형태는 단일 뉴클레오티드 다형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  253. 제1 항 내지 제252 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 질환 또는 상태의 생체마커인 것을 특징으로 하는 방법.
  254. 제1 항 내지 제253 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 병원체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  255. 제254 항에 있어서, 병원체는 바이러스, 박테리아 또는 진균류인 것을 특징으로 하는 방법.
  256. 제1 항 내지 제255 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 대상으로부터의 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리의 서열을 상이한 시점에서의 동일한 대상으로부터의 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리와 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  257. 제1 항 내지 제255 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 질환 또는 상태를 가진 대상으로부터의 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리의 서열을 질환 또는 상태가 없는 대상으로부터의 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리와 비교하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  258. 제1 항 내지 제257 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 둘 다의 생식계열 서열을 측정하는 단계를 더 포함하고, 이때 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 IgH 또는 VH 서열을 포함하며, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 IgL 또는 VL 서열, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  259. 제258 항에 있어서, 생식계열의 IgL, IgH, VH, VL의 서열, 또는 그것들의 서열로부터의 임의의 조합의 변이성을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  260. 제258 항 또는 제259 항에 있어서, 방법은 다음 중 적어도 하나를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 특유한 IgH 서열의 총 수;
    (b) 특유한 IgL 서열의 총 수;
    (c) 특유한 IgH 및 IgL 서열의 총 수;
    (d) 특유한 쌍을 이룬 IgL 및 IgH 서열의 총 수;
    (e) IgH 서열 또는 IgL 서열의 빈도; 또는
    (f) 하나 이상의 다른 것에 대한 IgH 서열 및 IgL 서열의 조합의 빈도.
  261. 제1 항 내지 제257 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 둘 다의 생식계열 서열을 측정하는 단계를 더 포함하며, 이때 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 TCRα 또는 Vα 서열을 포함하고, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 TCRβ 또는 Vβ 서열, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  262. 제261 항에 있어서, 생식계열의 TCRα, TCRβ, Vα, Vβ의 서열, 또는 그것들의 서열로부터의 임의의 조합의 서열의 변이성을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  263. 제261 항 또는 제262 항에 있어서, 방법은 다음 중 적어도 하나를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 특유한 TCRα 서열의 총 수;
    (b) 특유한 TCRβ 서열의 총 수;
    (c) 특유한 TCRα 및 TCRβ 서열의 총 수;
    (d) 특유한 쌍을 이룬 TCRα 및 TCRβ 서열의 총 수;
    (e) TCRα 서열 또는 TCRβ 서열의 빈도; 또는
    (f) 하나 이상의 다른 것들에 대한 TCRα 서열 및 TCRβ 서열의 조합의 빈도.
  264. 제1 항 내지 제257 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오티드, 제2 세포 폴리뉴클레오티드 또는 둘 다의 생식계열 서열을 측정하는 단계를 더 포함하며, 이때 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 TCRγ 또는 Vγ 서열을 포함하고, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 TCRδ 또는 Vδ 서열, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  265. 제264 항에 있어서, 생식계열의 TCRγ, TCRδ, Vγ, Vδ의 서열 또는 그것들의 서열로부터의 임의의 조합의 서열의 변이성을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  266. 제264 항 또는 제265 항에 있어서, 방법은 다음 중 적어도 하나를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 특유한 TCRγ 서열의 총 수;
    (b) 특유한 TCRδ 서열의 총 수;
    (c) 특유한 TCRγ 및 TCRδ 서열의 총 수;
    (d) 특유한 쌍을 이룬 TCRγ 및 TCRδ 서열의 총 수;
    (e) TCRγ 서열 또는 TCRδ 서열의 빈도; 또는
    (f) 하나 이상의 다른 것들에 대한 TCRγ 서열 및 TCRδ 서열의 조합의 빈도.
  267. 제1 항 내지 제266 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 다음 중 적어도 하나를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 제1 유전자로부터의 서열의 총 수;
    (b) 제2 유전자로부터의 서열의 총 수;
    (c) 제1 유전자로부터의 특유한 서열의 총 수;
    (d) 제2 유전자로부터의 특유한 서열의 총 수; 또는
    (e) 제1 유전자로부터의 서열 또는 제2 유전자로부터의 서열의 빈도.
  268. 제258 항 내지 제267 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 생식계열로부터의 개별적으로 쌍을 이룬 IgL 및 IgH 서열, 또는 TCRα 및 TCRγ 서열, 또는 TCRβ 및 TCRδ 서열, 및 변이체의 하나 이상의 쌍의 총량을 기반으로 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  269. 제258 항 내지 제268 항 중 어느 한 항에 있어서,방법은 생식계열로부터의 하나 이상의 IgL 또는 IgH 서열, TCRα 및 TCRβ 서열, 또는 TCRγ 및 TCRδ 서열, 및 변이체를 기반으로 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  270. 제258 항 내지 제269 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 서열 패턴, 변이체 분석, 동역학 또는 빈도 중 하나 이상을 기반으로 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  271. 제270 항에 있어서, 방법은 빈도를 기반으로 항체 또는 TCR을 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  272. 제268 항 내지 제271 항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 항체 또는 TCR은 에피토프에 약 1x10-7, 1x10-8, 1x10-9, 1x10-10, 1x10-11 또는 1x10-12 M보다 작거나 같은 KD로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  273. 제268 항 내지 제272 항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 항체 또는 TCR은 인간 치료용 항체 또는 TCR인 것을 특징으로 하는 방법.
  274. 제268 항 내지 제273 항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 항체 또는 TCR은 중화 항체 또는 TCR인 것을 특징으로 하는 방법.
  275. 제268 항 내지 제274 항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 항체 또는 TCR이 결합하는 표적은 알려져 있지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  276. 제268 항 내지 제275 항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 항체 또는 TCR이 결합하는 항체는 선택된 항체 또는 TCR이 선택되는 시점에서는 알려져 있지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  277. 제268 항 내지 제276 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 생체마커를 발견하기 위하여 선택된 항체 또는 TCR을 적어도 하나의 생체마커 후보와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  278. 제277 항에 있어서, 생체마커 후보는 고체 지지체 상에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  279. 제277 항에 있어서, 생체마커는 용액으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  280. 제277 항 내지 제279 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 TCR은 고체 지지체 상에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  281. 제277 항 내지 제279 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 TCR은 용액으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  282. 제278 항 또는 제280 항에 있어서, 고체 지지체는 어레이인 것을 특징으로 하는 방법.
  283. 제278 항 또는 제280 항에 있어서, 고체 지지체는 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
  284. 제1 항 내지 제283 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 제1 세포 폴리뉴클레오티드를 벡터 안에 삽입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  285. 제284 항에 있어서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드를 벡터 안에 삽입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  286. 제284 항 또는 제285 항에 있어서, 벡터는 클로닝 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  287. 제284 항 내지 제286 항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  288. 제1 항 내지 제287 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 서열을 동일한 분자 바코드와 매칭시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  289. 제1 항 내지 제288 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 라이브러리로부터 공통 서열을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  290. 제1 항 내지 제289 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열결정 및 PCR 오류는 최소화되거나, 제거되거나, 또는 0.01%, 0.001%, 0.0001%, 0.00001%, 0.000001%, 또는 0.0000001%보다 적은 것을 특징으로 하는 방법.
  291. 제1 항 내지 제290 항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭 반응에서 사이클의 수는 1 내지 40 사이클 중 임의의 수로 제한되는 것을 특징으로 하는 방법.
  292. 제1 항 내지 제291 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 분리된, 정제된, 항체 또는 TCR.
  293. 제1 항 내지 제291 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 분리된, 정제된, 항체 IgL, TCRβ 또는 TCRδ.
  294. 제1 항 내지 제291 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 분리된, 정제된, 항체 IgH, TCRα 또는 TCRγ.
  295. 제1 항 내지 제291 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 분리된, 정제된, 항체의 Fab 단편 또는 TCR.
  296. 제1 항 내지 제291 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 분리된, 정제된, 항체의 Fab2 단편 또는 TCR.
  297. 제1 항 내지 제291 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 분리된, 정제된, 항체의 Fv 단편 또는 TCR.
  298. 제1 항 내지 제291 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 분리된, 정제된, 항체의 scFv 단편.
  299. 제268 항 내지 제298 항 중 어느 한 항의 선택된 항체 또는 TCR, 또는 그것들의 단편을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요한 대상을 치료하는 방법.
  300. 제299 항에 있어서, 항체, TCR 또는 그것들의 단편은 그것을 필요로 하는 대상으로부터 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.
  301. 제299 항에 있어서, 항체, TCR 또는 그것들의 단편은 그것을 필요로 하는 대상으로부터 확인되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  302. 제299 항 내지 제301 항 중 어느 한 항에 있어서, 필요로 하는 대상은 질환의 하나 이상의 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  303. 제299 항 내지 제302 항 중 어느 한 항에 있어서, 필요로 하는 대상은 질환을 가진 것을 특징으로 하는 방법.
  304. 제302 항 또는 제303 항에 있어서, 질환은 알려져 있지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  305. 제302 항 또는 제303 항에 있어서, 질환은 알려져 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  306. 제1 항 내지 제305 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 제1 시점에서 대상으로부터 취한 제1 샘플 및 제2 시점에서 대상으로부터 취한 제2 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  307. 제306 항에 있어서, 제1 및 제2 시점에서 취한 샘플로부터의 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 양의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  308. 제307 항에 있어서, 양의 증가 또는 감소는 적어도 약 0.1배, 0.2배, 0.3배, 0.4배, 0.5배, 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.5배, 2배, 3배, 5배, 10배, 50배, 100배, 1,000배, 10,000배, 100,000배, 1,000,000배, 또는 그 이상의 범위의 증가 또는 감소인 것을 특징으로 하는 방법.
  309. 제306 항 내지 제308 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 시점 사이의 시간은 약, 또는 적어도 약 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간 13 시간, 14 시간, 15 시간, 16 시간, 17 시간, 18 시간, 19 시간, 20 시간, 21 시간, 22 시간, 23 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  310. 제1 항 내지 제309 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열결정은 고-처리량인 것을 특징으로 하는 방법.
  311. 제1 항 내지 제310 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 프라이머의 복합체 및/또는 고체 지지체에 부착된 프라이머의 복합체를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  312. 제1 항 내지 제311 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 단일 기능적 V 절편 또는 V 절편의 작은 패밀리에 상보하는 서열을 포함하는 V-절편 프라이머의 다양성을 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  313. 제1 항 내지 제312 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  314. 제1 항 내지 제313 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열결정은 대량의 병렬 합성에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  315. 제1 항 내지 제314 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 생식계열 서열에 대한 서열 판독을 비교하고 서열 판독의 체세포성 과돌연변이 축적을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  316. 제1 항 내지 제315 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 특이적인 아이소타입을 선택하기 위해 항체 서열의 아이소타입 분포를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  317. 제268 항 내지 제316 항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 항체는 특이적 Ig 아이소타입을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  318. 제317 항에 있어서, Ig 아이소타입은 IgA, IgG, IgM, IgD, 또는 IgE인 것을 특징으로 하는 방법.
  319. 제1 항 내지 제318 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 쌍을 이룬 IgH 및 IgL 항체 서열 또는 TCRα 및 TCRβ 서열의 라이브러리를 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  320. 제319 항에 있어서, 라이브러리는 데이터베이스인 것을 특징으로 하는 방법.
  321. 제1 항 내지 제320 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 단일 세포 이중-바코딩된 폴리뉴클레오티드는 CDR1, CDR2, CDR3, 및/또는 과돌연변이 영역 교차 항체 또는 TCR 코딩 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  322. 제268 항 내지 제321 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 선택된 항체 또는 TCR을 직접 표면-디스플레이 기술로 클로닝하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  323. 제268 항 내지 제322 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 선택된 항체 또는 TCR을 지시된 진화에 의해 진화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  324. 제268 항 내지 제323 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 선택된 항체 또는 TCR을 기능적 특이성, 친화성 또는 중화 항체에 대해 스크리닝하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  325. 제1 항 내지 제324 항 중 어느 한 항에 있어서, 체세포 돌연변이는 99% 또는 그 이상의 신뢰도로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  326. 제1 항 내지 제325 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리뉴클레오티드 분자로부터 각각의 V, D 및 J 절편이 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.
  327. 제1 항 내지 제326 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  328. 제327 항에 있어서, 용기 바코드는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  329. 제327 항에 있어서, 용기 바코드는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  330. 제327 항에 있어서, 용기 바코드는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  331. 제327 항에 있어서, 용기 바코드는 최대 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  332. 제327 항에 있어서, 용기 바코드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  333. 제327 항 내지 제332 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 축퇴성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  334. 제327 항 내지 제333 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 전체 또는 부분적인 축퇴성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  335. 제327 항 내지 제334 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  336. 제327 항 내지 제334 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 서열 NNNNNWNNNNNWNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 W는 아데닌 또는 티민인 것을 특징으로 하는 방법.
  337. 제327 항 내지 제334 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 서열 NNNNNXNNNNNXNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이고 X는 임의의 공지 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  338. 제327 항 내지 제334 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 W이고, 이때 W는 아데닌 또는 티민인 것을 특징으로 하는 방법.
  339. 제327 항 내지 제334 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 X이고, 이때 X는 임의의 공지 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  340. 제1 항 내지 제339 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 바코드는 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  341. 제340 항에 있어서, 분자 바코드는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 뉴클레오티드를 포함것을 특징으로 하는 방법.
  342. 제340 항에 있어서, 분자 바코드는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  343. 제340 항에 있어서, 분자 바코드는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  344. 제340 항에 있어서, 분자 바코드는 최대 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  345. 제340 항에 있어서, 분자 바코드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  346. 제340 항 내지 제345 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자바코드는 축퇴성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  347. 제340 항 내지 제346 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 바코드는 전체 또는 부분적인 축퇴성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  348. 제340 항 내지 제347 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  349. 제340 항 내지 제347 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNTNNANN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  350. 제340 항 내지 제347 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNWNNWNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 W는 아데닌 또는 티민인 것을 특징으로 하는 방법.
  351. 제340 항 내지 제347 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNXNNXNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 X는 임의의 공지 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  352. 제340 항 내지 제347 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 W이고, 이때 W는 아데닌 또는 티민인 것을 특징으로 하는 방법.
  353. 제340 항 내지 제347 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 X이고, 이때 X는 임의의 공지 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  354. 제1 항 내지 제353 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 증폭 오류를 교정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  355. 제1 항 내지 제354 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 서열결정 오류를 교정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  356. 제1 항 내지 제355 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 동일한 분자 바코드를 포함하는 서열을 비닝하거나 그룹화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  357. 제1 항 내지 제356 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 컴퓨터 또는 알고리즘을 사용하여 동일한 분자 바코드를 포함하는 서열을 비닝하거나 그룹화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  358. 제1 항 내지 제357 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 컴퓨터 또는 알고리즘을 사용하여 동일한 용기 바코드를 포함하는 서열을 비닝하거나 그룹화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  359. 제1 항 내지 제358 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 적어도 약 90%, 95% 또는 99% 서열 상동성을 가지는 서열들을 클러스터링하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  360. 제1 항 내지 제359 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 적어도 약 90%, 95% 또는 99% 서열 상동성을 가지는 서열들을 배열하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  361. 제359 항 또는 제360 항에 있어서, 클러스터링 또는 배열은 컴퓨터 또는 알고리즘을 보조로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  362. 제1 항 내지 제361 항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 분자 바코드를 함유하는 서열 판독의 수를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  363. 제1 항 내지 제362 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 서열 상동성을 가지는 동일한 분자 바코드 및 동일한 제1 세포 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다를 함유하는 서열 판독의 수를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  364. 제363 항에 있어서, 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 서열 상동성을 가지는 동일한 분자 바코드 및 동일한 제2 세포 폴리뉴클레오티드 서열 둘 다를 함유하는 서열 판독의 수를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  365. 제1 항 내지 제364 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 중의 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드의 양을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  366. 제1 항 내지 제365 항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 분자 바코드 또는 용기 바코드, 또는 둘 다를 포함하고 있는 둘 이상의 서열, 서열 판독, 암플리콘 서열, 비닝된 서열, 배열된 서열, 클러스터링된 서열 또는 암플리콘 세트 서열로부터 공통 서열을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  367. 제1 항 내지 제366 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드 서열을 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%,86%, 87%, 88%, 89%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 99.99%, 또는 100%의 정확도 또는 신뢰도로 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  368. 제1 항 내지 제367 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열결정 및 PCR 오류는 최소화되거나, 제거되거나, 또는 0.01%, 0.001%, 0.0001%, 0.00001%, 0.000001%, 또는 0.0000001%보다 적은 것을 특징으로 하는 방법.
  369. 제1 항 내지 제368 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열결정의 오류율은 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 또는 0%보다 적거나 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  370. 제1 항 내지 제369 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열결정의 오류율은 0이 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  371. 제1 항 내지 제370 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1,000, 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 1000,000, 500,000, 또는 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012개의 폴리뉴클레오티드가 서열결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  372. 제1 항 내지 제371 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 4 주, 3 주, 2 주, 1 주, 6 일, 5 일, 5 일, 4 일, 3 일, 2 일, 1 일, 18 시간, 12 시간, 9 시간, 6 시간, 3 시간, 2 시간, 또는 1 시간보다 적거나 같은 포지티브량의 시간에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  373. 제1 항 내지 제372 항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 신뢰도 또는 베이스 콜링 정확도를 이루기 위해 사용된 판독의 수는 분자 바코드, 용기 바코드 또는 둘 다를 사용하지 않으면서 유사한 방법을 사용하여 동일한, 유사한, 또는 더 높은 신뢰도 또는 베이스 콜링 정확도를 이루기 위해 사용된 판독 수보다 적어도 약 1.1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000배 더 적은 것을 특징으로 하는 방법.
  374. 제1 항 내지 제373 항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 신뢰도 또는 베이스 콜링 정확도를 이루기 위해 사용된 판독의 수는 분자 바코드, 용기 바코드 또는 둘 다를 사용하지 않으면서 유사한 방법을 사용하여 동일한, 유사한, 또는 더 높은 신뢰도 또는 베이스 콜링 정확도를 이루기 위해 사용된 판독 수보다 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012의 판독이 더 적은 것을 특징으로 하는 방법.
  375. 제1 항 내지 제374 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기는 적어도 3, 4, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012 또는 그 이상의 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  376. 제1 항 내지 제375 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 세포 폴리뉴클레오티드는 적어도 3, 4, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012 또는 그 이상의 세포 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  377. (a) 각 용기가
    (i) 복수의 세포를 포함하는 샘플로부터의 단일 세포,
    (ii) 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드,
    (iii) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드;
    (iv) 단일 세포로부터의 제1 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드, 및
    (v) 단일 세포로부터의 제2 세포 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 복수의 용기를 포함하는 조성물로서,
    제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 분자 바코드 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 증폭된 생성물의 용기 바코드를 포함하며,
    제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 분자 바코드 및 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 증폭된 생성물의 용기 바코드를 포함하는 조성물.
  378. 제377 항에 있어서, 제1 및 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
  379. 제377 항 또는 제378 항에 있어서, 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 상이한 분자 바코드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  380. 제377 항 내지 제379 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 동일한 용기 바코드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  381. 제377 항 내지 제380 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 증폭된 생성물이 아닌 것을 특징으로 하는 조성물.
  382. 제377 항 내지 제380 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
  383. 제377 항 내지 제380 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 조성물.
  384. 제383 항에 있어서, 복수의 용기 중 제2 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 조성물.
  385. 제377 항 내지 제384 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용기 및 제2 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 조성물.
  386. 제384 항 또는 제385 항에 있어서, 복수의 용기 중 제3 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 조성물.
  387. 제386 항에 있어서, 제1 용기, 제2 용기 및 제3 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 조성물.
  388. 제377 항 내지 제387 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 특유한 것을 특징으로 하는 조성물.
  389. 제377 항 내지 제388 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
  390. 제377 항 내지 제389 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  391. 제377 항 내지 제390 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제1 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  392. 제391 항에 있어서, 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드는 제2 용기의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 분자 바코드와 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  393. 제377 항 내지 제392 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 복수의 용기 중 제2 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드와 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
  394. 제377 항 내지 제393 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 제1 동일 용기 바코드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  395. 제394 항에 있어서, 복수의 용기 중 제2 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 제2 동일 용기 바코드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  396. 제394 항 또는 제 395항에 있어서, 제1 동일 용기 바코드는 제2 동일 용기 바코드와 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
  397. 제394 항 내지 제 396항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 동일한 용기 바코드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  398. 제394 항 내지 제 397항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 그것의 암플리콘의 용기 바코드는 복수의 용기 중 임의의 다른 단일 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 및 그것의 암플리콘의 용기 바코드에 대해 특유한 것을 특징으로 하는 조성물.
  399. 제377 항 내지 제 398항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 단일 분자로서 용기에 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  400. 제377 항 내지 제 399항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기의 각각의 용기에서 단일 분자로서 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  401. 제377 항 내지 제 400항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기의 용기에서 적어도 단일 분자로서 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  402. 제377 항 내지 제 401항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기의 각각의 용기에서 적어도 단일 분자로서 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  403. 제377 항 내지 제 402항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 제1 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  404. 제403 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열은 제1 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  405. 제403 항 또는 제404 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 단일 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  406. 제403 항 내지 제405 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기의 단일 용기에서 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제1 공통 용기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  407. 제406 항에 있어서, 복수의 용기의 단일 용기에서 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제2 공통 용기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  408. 제377 항 내지 제407 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열은 복수의 용기 중 제2 용기의 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  409. 제408 항에 있어서, 제1 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열은 제2 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  410. 제377 항 내지 제409 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘은 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제1 공통 용기 서열과 동일한 서열을 포함하는 제1 공통 용기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  411. 제410 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 한 용기의 각각의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘은 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기의 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 암플리콘의 제2 공통 용기 서열과 동일한 서열을 포함하는 제2 공통 용기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  412. 제377 항 내지 제411 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 제1 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  413. 제412 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열은 제1 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  414. 제412 항 또는 제413 항에 있어서, 복수의 용기 중 임의의 단일 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 단일 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  415. 제412 항 내지 제414 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제1 공통 분자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  416. 제415 항에 있어서, 복수의 용기 중 단일 용기의 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 동일한 제2 공통 분자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  417. 제412 항 내지 제416 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기 중 제1 용기의 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열은 복수의 용기 중 제2 용기의 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  418. 제417 항에 있어서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열은 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  419. 제412 항 내지 제418 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기의 임의의 한 용기에서 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기에서 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제1 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 제1 공통 분자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  420. 제419 항에 있어서, 복수의 용기의 임의의 한 용기에서 각각의 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 중 임의의 다른 한 용기에서 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 제2 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 제2 공통 분자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  421. 제403 항 내지 제420 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 공통 용기 서열은 제1 공통 분자 서열과 동일한 서열을 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  422. 제403 항 내지 제421 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 공통 용기 서열은 제1 공통 분자 서열 또는 그것의 상보물에 상보하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  423. 제421 항 또는 제422 항에 있어서, 제2 공통 분자 서열은 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  424. 제423 항에 있어서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역은 말단 영역인 것을 특징으로 하는 조성물.
  425. 제377 항 내지 제424 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 함께 융합되지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  426. 제377 항 내지 제424 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 함께 융합되지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  427. 제377 항 내지 제426 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  428. 제427 항에 있어서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  429. 제377 항 내지 제426 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  430. 제429 항에 있어서, 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  431. 제429 항 또는 제430 항에 있어서, RNA는 mRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  432. 제429 항 내지 제431 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 cDNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  433. 제432 항에 있어서, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 cDNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  434. 제377 항 내지 제433 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 비-주형 말단 전달효소, 역전사효소, 중합효소 또는 그것들의 임의의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  435. 제434 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  436. 제434 항 또는 제435 항에 있어서, 비-주형 말단 전달효소는 역전사효소이고, 역전사효소는 슈퍼스크립트 II 역전사효소, 막시마 역전사효소, 프로토스크립트 II 역전사효소, 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT), 하이스크라이버 역전사효소, 조류 골수아세포증 바이러스 (AMV) 역전사효소, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전달효소 활성을 포함하고 있는 임의의 역전사효소 및 그것들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  437. 제434 항 내지 제436 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부 상의 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  438. 제437 항에 있어서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부 상의 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  439. 제435 항 내지 제438 항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드는 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
  440. 제435 항 내지 제438 항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드 중 다른 뉴클레오티드와 동일하지 않은 것을 특징으로 하는 조성물.
  441. 제437 항 내지 제440 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보성 영역의 적어도 한 뉴클레오티드는 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보성 영역의 다른 핵산과 동일하지 않은 것을 특징으로 하는 조성물.
  442. 제437 항 내지 제441 항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보성 영역의 적어도 한 뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보성 영역의 다른 핵산과와 동일하지 않은 것을 특징으로 하는 조성물.
  443. 제441 항 또는 제442 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  444. 제441 항 내지 제443 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아닌 것을 특징으로 하는 조성물.
  445. 제441 항 내지 제444 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신인 것을 특징으로 하는 조성물.
  446. 제441 항 내지 제444 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  447. 제441 항 내지 제446 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 말단 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  448. 제441 항 또는 제442 항에 있어서, 적어도 하나의 비-동일 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  449. 제437 항 내지 제448 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보성 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  450. 제437 항 내지 제449 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아닌 것을 특징으로 하는 조성물.
  451. 제437 항 내지 제450 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신인 것을 특징으로 하는 조성물.
  452. 제437 항 내지 제450 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 데옥시리보구아노신 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  453. 제437 항 내지 제448 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  454. 제437 항 내지 제453 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  455. 제437 항 내지 제454 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체가 아닌 것을 특징으로 하는 조성물.
  456. 제437 항 내지 제455 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 혼성화된 영역의 적어도 2개의 비-말단 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그것의 유사체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  457. 제377 항 내지 제456 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  458. 제457 항에 있어서, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  459. 제457 항 또는 제458 항에 있어서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  460. 제459 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 분자 바코드 서열에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  461. 제459 항 또는 제460 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 그것으로부터 증폭된 생성물의 영역에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  462. 제457 항 내지 제461 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 제1 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  463. 제462 항에 있어서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하는 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 영역은 제2 상보성 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 첨가된 3개 이상의 비-주형 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  464. 제457 항 내지 제463 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 상보성 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  465. 제464 항에 있어서, 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 상보하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  466. 제377 항 내지 제465 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  467. 제466 항에 있어서, 제2 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 상보물의 영역은 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  468. 제377 항에 있어서, 조성물은 상기 방법들로부터의 임의의 하나 이상의 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  469. 제377 항 내지 제468 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기의 각각의 용기는 고체 지지체를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  470. 제377 항 내지 제469 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  471. 제377 항 내지 제470 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 비드에 부착되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  472. 제377 항 내지 제471 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것들의 임의의 조합은 프라이머가 아닌 것을 특징으로 하는 조성물.
  473. 제377 항 내지 제472 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드, 또는 그것들의 임의의 조합은 연장된 폴리뉴클레오티드가 아닌 것을 특징으로 하는 조성물.
  474. 제377 항 내지 제473 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 용해되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  475. 제377 항 내지 제474 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기는 복수의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  476. 제377 항 내지 제474 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기는 복수의 에멀션을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  477. 제476 항에 있어서, 복수의 에멀션의 각각의 에멀션은 약 0.01 피코리터 내지 10 마이크로리터의 부피인 것을 특징으로 하는 조성물.
  478. 제377 항 내지 제477 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포는 면역 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  479. 제377 항 내지 제478 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 세포는 복수의 면역 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  480. 제478 항 또는 제479 항에 있어서, 면역 세포는 림프구 또는 그것의 하위유형, B-세포 또는 그것의 하위유형, T-세포 또는 그것의 하위유형, 또는 그것들의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
  481. 제479 항 또는 제480 항에 있어서, 복수의 세포는 메모리 B-세포, 나이브 B-세포, 형질아세포 B-세포, 나이브 T-세포, 형질아세포 T-세포, B-세포의 임의의 하위유형, T-세포의 임의의 하위유형 또는 그것들의 임의의 조합에 대해 풍부해지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  482. 제377 항 내지 제477 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포는 암세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  483. 제482 항에 있어서, 복수의 세포는 복수의 암세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  484. 제482 항 또는 제483 항에 있어서, 암세포는 편평세포 암종 세포, 선암종 세포, 전이세포 암종 세포, 골육종 세포, 연골 육종 세포, 근육 육종 세포, 백혈병 세포, 림프종 세포, 신경교종 세포, 또는 그것들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
  485. 제483 항 또는 제484 항에 있어서, 복수의 암세포는 순환하는 암세포, 내피 암세포, 상피 암세포, 희귀 암세포, 또는 암세포의 임의의 유형 또는 하위유형에 대해 풍부해지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  486. 제377 항 내지 제485 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 변이체 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  487. 제486 항에 있어서, 변이체 서열은 돌연변이, 다형태, 결실 또는 삽입을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  488. 제487 항에 있어서, 다형태는 단일 뉴클레오티드 다형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  489. 제377 항 내지 제488 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 질환 또는 상태에 대한 생체마커인 것을 특징으로 하는 조성물.
  490. 제377 항 내지 제488 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 세포 폴리뉴클레오티드는 병원체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  491. 제377 항 내지 제490 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 상보성 폴리뉴클레오티드는 CDR1, CDR2, CDR3, 및/또는 과돌연변이 영역 교차 항체 또는 TCR 코딩 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  492. 제377 항 내지 제491 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  493. 제492 항에 있어서, 용기 바코드는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  494. 제492 항에 있어서, 용기 바코드는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  495. 제492 항에 있어서, 용기 바코드는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  496. 제492 항에 있어서, 용기 바코드는 최대 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  497. 제492 항에 있어서, 용기 바코드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  498. 제492 항 내지 제497 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 축퇴성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  499. 제492 항 내지 제498 항 중 어느 한 항에 있어서, 용기 바코드는 전체 또는 부분적인 축퇴성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  500. 제499 항에 있어서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  501. 제499 항에 있어서, 용기 바코드는 서열 NNNNNWNNNNNWNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 W는 아데닌 또는 티민인 것을 특징으로 하는 조성물.
  502. 제499 항에 있어서, 용기 바코드는 서열 NNNNNXNNNNNXNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 X는 임의의 공지 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  503. 제499 항에 있어서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 W이고, 이때 W는 아데닌 또는 티민인 것을 특징으로 하는 조성물.
  504. 제499 항에 있어서, 용기 바코드는 서열 NNNNNNNNNNNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 X이고, 이때 X는 임의의 공지 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  505. 제377 항 내지 제504 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 바코드는 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  506. 제505 항에 있어서, 분자 바코드는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  507. 제505 항에 있어서, 분자 바코드는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  508. 제505 항에 있어서, 분자 바코드는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  509. 제505 항에 있어서, 분자 바코드는 최대 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  510. 제505 항에 있어서, 분자 바코드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  511. 제505 항 내지 제510 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 바코드는 축퇴성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  512. 제505 항 내지 제511 항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 바코드는 전체 또는 부분적인 축퇴성 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  513. 제512 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  514. 제512 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNTNNANN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  515. 제512 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNWNNWNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 W는 아데닌 또는 티민인 것을 특징으로 하는 조성물.
  516. 제512 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNXNNXNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 X는 임의의 공지 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  517. 제512 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 W이고, 이때 W는 아데닌 또는 티민인 것을 특징으로 하는 조성물.
  518. 제512 항에 있어서, 분자 바코드는 서열 NNNNNNNN을 포함하고, 여기서 N은 임의의 핵산이며 서열에서 적어도 하나 또는 두 개의 N은 X이고, 이때 X는 임의의 공지 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  519. 제377 항 내지 제518 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 용기는 적어도 3, 4, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012 또는 그 이상의 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  520. 제377 항 내지 제519 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 세포 폴리뉴클레오티드는 적어도 3, 4, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012 또는 그 이상의 세포 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  521. (a) 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 단일 세포로부터의 복수의 폴리뉴클레오티드의 각각에 혼성화하는 단계, 여기서 혼성화된 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 단일 세포를 포함하는 용기 내의 복수의 특유하게 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드로부터 유래되고;
    (b) 분자 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오티드를 연장시켜서 분자 바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 단계;
    (c) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드를 분자 바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드에 혼성화시키는 단계, 여기서 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 복수의 용기 중 단일 용기에 대해 특유하며;
    (d) 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 분자 바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드를 연장시켜서 이중-바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드를 형성시키는 단계; 및
    (e) 이중-바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드를 서열결정하는 단계
    를 포함하는, 폴리뉴클레오티드의 바코딩 방법.
  522. 제521 항에 있어서, (a)의 혼성화는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오티드 상의 자연적으로 발생하는 서열의 염기쌍 형성을 통하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  523. 제521 항 또는 제522 항에 있어서, 분자 바코딩된 세포 폴리뉴클레오티드에 혼성화된 용기 바코딩된 폴리뉴클레오티드는 증폭된 생성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  524. 제521 항 내지 제523 항 중 어느 한 항에 있어서, (c)의 혼성화는 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오티드 상의 자연적으로 발생하는 서열의 상보물의 염기쌍 형성을 통하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  525. 제521 항 내지 제524 항 중 어느 한 항에 있어서, (c)의 혼성화는 (b)에서 연장된 단일 세포로부터의 폴리뉴클레오티드의 영역에 대한 염기쌍 형성을 통하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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