JP6894380B2 - 治療用薬剤および疾患特異的抗原をシーケンシング、判定、ペアリングおよび検証する方法 - Google Patents

治療用薬剤および疾患特異的抗原をシーケンシング、判定、ペアリングおよび検証する方法 Download PDF

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Description

本出願は、２０１５年４月２７日に出願された米国仮出願第６２／１５３，０４１に対する優先権を主張し、本明細書において、その全体が参照によって援用される。
免疫系は、個別の戦略を用いてＴ細胞およびＢ細胞抗原受容体のレパトアを生成する。これらの受容体の多様性から潜在的病原体の世界を十分見てとれる。Ｂリンパ球は成熟して、重（Ｈ）鎖ポリペプチドと軽（Ｌ）鎖ポリペプチドのヘテロ二量体として存在する抗体（免疫グロブリン、Ｉｇ）を発現し、その一方でＴリンパ球は、ヘテロ二量体のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。免疫系は、新生物が生き残るために回避しなければならない外因性腫瘍抑制因子としても作用する。しかし、腫瘍細胞は、免疫認識を免れるメカニズムを用いることができ、腫瘍増殖に至ることができる。これらのメカニズムには、高免疫原性の腫瘍抗原を発現する新生物細胞を除去する免疫編集、および免疫原性腫瘍抗原のダウンレギュレーションが含まれる。免疫系の腫瘍特異性欠如、腫瘍細胞による抗原変調、ならびにＭＨＣ分子および他の因子の異常発現は、腫瘍の検出を妨げる。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの免疫細胞によって例えば外因的にまたは内因的に発現される抗原結合分子、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）もしくはＴＣＲ、またはその結合部分の配列を決定するステップを含む方法が開示される。一部の態様では、抗原結合分子は、組織の抗原、例えば疾患特異的抗原、に対して高い親和性を有する。一部の態様で開示される方法は、組織上もしくは組織内で発現された抗原および／または組織の抗原、例えば疾患特異的抗原、に対して高い親和性を有するＴＩＬを疾患にかかった生体試料（ｄｉｓｅａｓｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）（例えば、疾患にかかった組織試料）から決定、検出および／または選択するために使用することができる。一部の態様で開示される方法は、完全長抗体の抗原結合部分を含む抗体、ＴＣＲ、治療標的、およびバイオマーカーを発見および／または識別するために使用することができる。開示される方法の中には、ハイスループットであり、正確であり、偏りが最小限であるシーケンシング方法を用いて、ポリヌクレオチド、例えば、リンパ球ポリヌクレオチド、例えばＩｇおよびＴＣＲポリヌクレオチドをシーケンシングするものがある。一部の態様における方法は、各々の内容が全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４１４４４９５、ＷＯ２０１２０４８３４０およびＷＯ２０１２０４８３４１、ならびに米国特許仮出願第６２／０５０５４９号、同第６２／０５１８３２号、同第６１／９３８２２７号および同第６２／０３１４０５号に記載されているものなどの正確なシーケンシング方法を用いる。開示される方法は、例えば、天然重鎖および軽鎖ならびに／またはアルファおよびベータＴＣＲ鎖またはガンマおよびデルタＴＣＲ鎖配列のペアリングのために、例えば、天然に存在する、例えば単一細胞中に存在するそのような鎖のペアおよび／または細胞表面に複合体で一緒に発現されるそのような鎖のペアの中に存在するそのような配列を識別するために、使用することができる。一部の実施形態で開示される方法は、罹患生物から得られる生体試料からのポリヌクレオチドをシーケンシングするステップを含む。生体試料は、罹患試料、例えば固形腫瘍試料であってもよい。一部の事例では、生体試料は、シーケンシングされることになるポリヌクレオチドを含有する複数のＴＩＬを含む。
方法は、一部の実施形態では、シーケンシングされたポリヌクレオチド、例えばＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド、例えば、ペアリングされた重鎖および軽鎖抗体ポリヌクレオチドまたはペアリングされたアルファおよびベータ鎖ＴＣＲポリヌクレオチドを含有するリンパ球の１つまたは複数のポリヌクレオチドを選択するステップをさらに含む。この選択は、上で説明したシーケンシングステップから得られるシーケンシングデータに基づく。方法は、一部の態様では、選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、例えば、選択されたポリヌクレオチドによってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを産生するステップをさらに含む。方法は、一部の実施形態では、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの抗原を、例えば、組換え発現されたまたは合成されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの使用により、識別するステップをさらに含む。
一部の態様では、開示される方法は、少なくとも１つの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞とを含む生体試料を提供するステップを含む。一部の態様では、開示される方法は、少なくとも１つのＴＩＬからのおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップを含む。一部の態様では、開示される方法は、少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞のうちのＴＩＬからのからのＩｇもしくはＴＣＲポリヌクレオチド配列を配列情報に基づいて選択するステップ、ならびに／または選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇもしくはＴＣＲポリペプチドを産生するステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの標的抗原を識別するステップをさらに含む。
一部の態様では、開示される方法は、対象からの生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび対象からの生体試料からの少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップと；得られた配列情報を、対応する正常隣接組織試料から得た配列情報と比較するステップと；少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞のうちのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を比較に基づいて選択するステップとを含む。一部の実施形態では、開示される方法は、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇもしくはＴＣＲポリペプチドを産生するステップ、および／または産生されたＩｇもしくはＴＣＲポリペプチドの標的抗原を識別するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、開示される方法は、ＴＩＬから産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの標的抗原を識別するステップを含む。一部の実施形態では、開示される方法は、対象からの生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび対象からの生体試料からの少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップと；得られた配列情報を、対応する正常隣接組織試料から得た配列情報と比較するステップと；少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞のうちのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を比較に基づいて選択するステップと；選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを産生するステップと；産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの標的抗原を識別するステップとを含む。
一部の態様では、開示される方法は、第１の対象からの生体試料を提供するステップであって、生体試料が、少なくとも１つの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞を含むステップと；少なくとも１つのＴＩＬからのおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップと；配列情報を、第２の対象からの生体試料から得た配列情報と比較するステップであって、第１および第２の対象が同じ疾患を有するステップと；少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞のうちのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を比較に基づいて選択するステップと；選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを産生するステップと；産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの標的抗原を識別するステップとを含む。
一部の態様では、少なくとも１つのＴＩＬの形態は未知である。一部の態様では、少なくとも１つのＴＩＬの形態は未知である。一部の態様では、少なくとも１つのＴＩＬの表現型は未知である。一部の態様では、少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の表現型は未知である。
一部の態様では、少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞は、生体試料中に１：１０，０００またはそれ未満の比で存在する。一部の態様では、ＴＩＬおよび非ＴＩＬ細胞は、生体試料中に１：１００，０００またはそれ未満の比で存在する。一部の態様では、ＴＩＬおよび非ＴＩＬ細胞は、生体試料中に１：１，０００，０００またはそれ未満の比で存在する。
一部の実施形態では、対象からの生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および対象からの生体試料からの少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、生体試料中に１：１０，０００もしくはそれ未満、１：１００，０００もしくはそれ未満、または１：１，０００，０００もしくはそれ未満の比で存在する。今般開示される方法の一部の実施形態では、対象からの生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および対象からの生体試料からの少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、シーケンシングステップ中に１：１０，０００もしくはそれ未満、１：１００，０００もしくはそれ未満、または１：１，０００，０００もしくはそれ未満の比で存在する。
一部の態様では、選択するステップは、配列情報のバイオインフォマティクス解析を行うことを含む。一部の態様では、選択するステップは、配列情報のポリヌクレオチドの発現レベルを決定することを含む。一部の態様では、選択するステップは、配列情報のポリヌクレオチド配列をアライメントすることを含む。一部の態様では、選択するステップは、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルに基づく。一部の態様では、選択するステップは、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生殖系列配列からの変異のパターンに基づく。一部の態様では、選択するステップは、配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生殖系列配列からの変異レベルに基づく。一部の態様では、選択するステップは、配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在、および正常細胞からの配列情報セットの中の選択されたポリヌクレオチド配列の非存在に基づく。一部の態様において、選択するステップは、配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの濃縮、および正常細胞からの第２の配列情報セットの中の選択されたポリヌクレオチド配列の非存在に基づく。一部の態様では、選択するステップは、配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのアイソタイププロファイルに基づく。一部の態様では、選択するステップは、配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの系統発生的クラスターに基づく。一部の態様では、選択するステップは、配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの系統発生的クラスターのサイズに基づく。一部の態様では、選択するステップは、配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列と、疾患にかかった生体試料からの別の配列情報セットの配列との類似性に基づく。
一部の態様では、疾患にかかった生体試料は、疾患を有する第１の対象からの疾患にかかった生体試料からの複数のリンパ球、および疾患を有する第２の対象からの疾患にかかった生体試料からの複数のリンパ球を含む。
一部の態様では、選択するステップは、配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列と、正常生体試料からの別の配列情報セットの配列との類似性の欠如に基づく。
一部の態様では、正常生体試料は、正常隣接組織試料である。一部の態様では、正常生体試料は、疾患を有さない第１の対象からの正常生体試料からの複数のリンパ球、および疾患を有さない第２の対象からの正常生体試料からの複数のリンパ球を含む。
一部の態様では、方法は、疾患にかかった組織または疾患にかかった生体試料または疾患にかかった細胞への産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの特異性を判定するステップを含む。一部の態様では、特異性を判定するステップは、疾患にかかった組織または疾患にかかった生体試料または疾患にかかった細胞に対する産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの親和性、および同じ組織型の対応する正常隣接組織または対応する正常細胞に対する産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの親和性を判定することを含む。
一部の態様では、方法は、疾患にかかった細胞を殺滅する、産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを識別するステップを含む。一部の態様では、識別された産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、疾患にかかった細胞と直接結合することによって疾患にかかった細胞を殺滅する。
一部の態様では、産生するステップは、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを合成すること、または組換え発現させることを含む。一部の態様では、少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞は、上皮細胞、リンパ球、がん細胞、またはこれらの組合せを含む。一部の態様では、少なくとも１つのＴＩＬは、少なくとも１つのＴ細胞、少なくとも１つのＢ細胞、またはこれらの組合せを含む。
一部の態様では、生体試料は、がん生検材料である。一部の態様では、生体試料は、正常組織生検材料である。一部の態様では、生体試料は、血管外組織を含む。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、組換えポリペプチドである。一部の態様では、標的分析物は、疾患にかかった生体試料に特異的である。一部の態様では、標的分析物は、生体試料の疾患にかかった細胞に特異的である。一部の態様では、標的分析物は、がん細胞に特異的である。
一部の態様では、シーケンシングするステップは、ハイスループットシーケンシングである。一部の態様では、シーケンシングするステップは、合成、ハイブリダイゼーションまたはライゲーションによるシーケンシングである。一部の態様では、シーケンシングするステップは、全免疫レパトアをシーケンシングすることを含まない。一部の態様では、シーケンシングするステップは、大規模並行シーケンシングである。
一部の態様では、方法は、多数のプライマーまたは固体支持体に付着している多数のプライマーの使用を含まない。一部の態様では、方法は、ＩｇまたはＴＣＲ可変ドメイン領域に相補的である配列を含む非常に多数のプライマーを用いない。一部の態様では、方法は、シーケンシングするステップの前に、少なくとも１つのＴＩＬまたは少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からポリヌクレオチドを単離するステップを用いない。
一部の態様では、生体試料は、血液ではない。一部の態様では、生体試料は、固形組織試料である。一部の態様では、生体試料は、臓器からのものである。一部の態様では、生体試料は、三次元構造を含む。一部の態様では、生体試料は、がん性細胞または前がん性細胞を含む。一部の態様では、生体試料は、対象の免疫系によって異常標的化される健常組織を含む。
一部の態様では、少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞は、１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２もしくはそれ超の非ＴＩＬ細胞を含む。
一部の態様では、少なくとも１つのＴＩＬは、１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２もしくはそれ超のＴＩＬを含む。
一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列は、１〜５００の固有のＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００の固有のＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を含む。
一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列は、Ｔ細胞からのＴＣＲポリヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列は、Ｂ細胞からのＩｇポリヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、生体試料の少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞は、シーケンシングするステップの前に細胞外細胞マーカーに基づいて選別されない。一部の態様では、生体試料の少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞は、シーケンシングするステップの前に細胞マーカーに基づいて選別されない。一部の態様では、生体試料の少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞は、シーケンシングするステップの前に選別されない。
一部の態様では、シーケンシングされるポリヌクレオチドは、Ｉｇ重鎖（ＩｇＨ）をコードするＩｇポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、方法は、ＩｇＨを同じＢ細胞からのＩｇ軽鎖（ＩｇＬ）とペアリングするステップをさらに含む。一部の態様では、シーケンシングされるポリヌクレオチドは、ＩｇＬをコードするＩｇポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、方法は、ＩｇＬを同じＢ細胞からのＩｇＨとペアリングするステップをさらに含む。一部の態様では、シーケンシングされるポリヌクレオチドは、ＩｇＨをコードするＩｇポリヌクレオチド、およびＩｇＬをコードするＩｇポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、ＩｇＬは、同じＢ細胞からのＩｇＨとペアリングされる。一部の態様では、方法は、ＩｇＬを同じＢ細胞からのＩｇＨとペアリングするステップをさらに含む。一部の態様では、シーケンシングされるポリヌクレオチドは、ＴＣＲα鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、方法は、ＴＣＲα鎖を同じＴ細胞からのＴＣＲβ鎖とペアリングするステップをさらに含む。一部の態様では、シーケンシングされるポリヌクレオチドは、ＴＣＲβ鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチドを含む。一部の態様では、方法は、ＴＣＲβ鎖を同じＴ細胞からのＴＣＲα鎖とペアリングするステップをさらに含む。一部の態様では、シーケンシングされるポリヌクレオチドは、ＴＣＲα鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチド、およびＴＣＲβ鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチドを含む。
一部の態様では、ＴＣＲα鎖は、同じＴ細胞からのＴＣＲβ鎖とペアリングされる。一部の態様では、方法は、ＴＣＲα鎖を同じＴ細胞からのＴＣＲβ鎖とペアリングするステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、ペアリングされたＩｇＬおよびＩｇＨのデータベースを生成するステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、ペアリングされたＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖のデータベースを生成するステップをさらに含む。
一部の態様では、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、可変領域を含む。一部の態様では、Ｉｇをコードするポリヌクレオチドは、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一部の態様では、Ｉｇをコードするポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の態様では、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドは、ＴＣＲα鎖可変領域を含む。一部の態様では、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドは、ＴＣＲβ鎖可変領域を含む。一部の態様では、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドは、ＴＣＲγ鎖可変領域を含む。一部の態様では、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドは、ＴＣＲδ鎖可変領域を含む。一部の態様では、可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、高頻度変異領域、またはこれらのいずれかの組合せを含む。一部の態様では、可変領域は、Ｖセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント、またはこれらのいずれかの組合せを含む。一部の態様では、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＴＣＲ定常ドメイン領域を含む。一部の態様では、ＴＣＲ定常ドメイン領域は、ＴＣＲα定常ドメイン、ＴＣＲβ定常ドメイン、またはこれらの組合せを含む。一部の態様では、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの領域は、Ｉｇ定常ドメイン領域を含む。一部の態様では、Ｉｇ定常ドメイン領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４からなる群から選択されるＩｇＨ定常ドメインを含む。
一部の態様では、Ｉｇ定常ドメイン領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４からなる群から選択される２つ、３つまたは４つのＩｇＨ定常ドメインを含む。一部の態様では、Ｉｇ定常ドメイン領域は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびこれらの組合せからなる群から選択されるＩｇアイソタイプからのＩｇＨ定常ドメインを含む。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列のＩｇアイソタイプは、ＩｇＧアイソタイプ配列である。一部の態様では、Ｉｇ定常ドメイン領域は、ＩｇＬ定常ドメイン（ＣＬ）を含む。一部の態様では、Ｉｇ定常ドメイン領域は、Ｉｇκ、Ｉｇλおよびこれらの組合せからなる群から選択されるＩｇＬアイソタイプからのＣＬを含む。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列のＩｇアイソタイプは、Ｉｇκである。
一部の態様では、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードポリヌクレオチドは、生殖系列フレームワーク配列を含むフレームワーク領域配列を含む。
一部の態様では、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、生殖系列ＶＨ配列を含むＶＨ配列、生殖系列ＶＬ配列を含むＶＬ配列、生殖系列ＴＣＲα可変領域配列を含むＴＣＲα可変領域配列、生殖系列ＴＣＲβ可変領域配列を含むＴＣＲβ可変領域配列、生殖系列ＴＣＲγ可変領域配列を含むＴＣＲγ可変領域配列、生殖系列ＴＣＲδ可変領域配列を含むＴＣＲδ可変領域配列、またはこれらの組合せを含む。
一部の態様では、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の変異フレームワーク残基を含むフレームワーク領域配列を含む。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの１つまたは複数の変異フレームワーク残基のうちの変異フレームワーク残基は、疾患を有する２つまたはそれ超の対象からの発現量上位５パーセントのＩｇＨ、ＩｇＬ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγまたはＴＣＲδポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数において見出される残基である。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、特異的Ｉｇアイソタイプを含む。一部の態様では、特異的Ｉｇアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥである。一部の態様では、特異的アイソタイプは、ＩｇＧである。
一部の態様では、配列情報は、少なくとも約１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２の固有のＩｇまたはＴＣＲ配列を含む。
一部の態様では、配列情報は、少なくとも約１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２の配列リードを含む。
一部の態様では、配列情報は、疾患関連タンパク質または疾患特異的タンパク質に関して約１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍまたはそれ未満のＫｄを有するＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする少なくとも１つのＴＩＬからの少なくとも１つのＩｇまたはＴＣＲ配列を含む。一部の態様では、配列情報は、疾患関連タンパク質または疾患特異的タンパク質に関して１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍまたはそれ未満のＫｄを有するＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇ配列もＴＣＲ配列も含まない。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、疾患関連タンパク質または疾患特異的タンパク質に関して約１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍまたはそれ未満のＫｄを有する。一部の態様では、産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする選択されたポリヌクレオチド配列は、疾患関連タンパク質または疾患特異的タンパク質に関して約１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍまたはそれ未満のＫｄを有するＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする。
一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列を含むＴＩＬは、生体試料の少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の総数に対して約１〜５００の量で存在する。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列を含むＴＩＬは、生体試料の少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の総数に対して約１、２、３、４または５の量で存在する。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＴＩＬのうちのＴＩＬは、生体試料中に、全免疫細胞の少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２当たり約１の量で存在する。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＴＩＬのうちのＴＩＬは、生体試料中に、全リンパ球の少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２当たり約１の量で存在する。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＴＩＬのうちのＴＩＬは、生体試料中に、少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２当たり約１の量で存在する。一部の態様では、少なくとも１つのＴＩＬは、生体試料中に、少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２当たり約１の量で存在する。一部の態様では、生体試料中の全リンパ球に対する疾患関連または疾患特異的リンパ球の比は、疾患関連リンパ球または疾患特異的リンパ球ではない生体試料中のリンパ球の少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２当たり約１である。
一部の態様では、シーケンシングするステップのエラー率は、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％もしくは０．０１％またはそれら未満である。
一部の態様では、シーケンシングするステップは、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９９％または１００％の精度または信頼度で配列を決定することを含む。
一部の態様では、増幅エラーは、最小化されるか、除去されるか、または０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％、０．０００００１％もしくは０．００００００１％未満である。
一部の態様では、シーケンシングするステップは、少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２の少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをシーケンシングすることを含む。
一部の態様では、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２のポリヌクレオチドがシーケンシングされる。
一部の態様では、方法は、４週間、３週間、２週間、１週間、６日、５日、５日、４日、３日、２日、１日、１８時間、１２時間、９時間、６時間、３時間、２時間もしくは１時間またはそれら未満である正の時間中に行われる。
一部の態様では、生体試料からのＩｇまたはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドは、ＩｇまたはＴＣＲをコードする少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２のポリヌクレオチドを含む。
一部の態様では、シーケンシングするステップの前に、方法は、生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬまたは少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の単一細胞、および単一の固体支持体を各々が含む、複数の第１の容器を形成するステップと；単一の固体支持体上に、単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第１のポリヌクレオチドの第１のコピーおよび単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第２のポリヌクレオチドの第２のコピーをコピーするステップと；複数の第１の容器からの単一の固体支持体、およびバーコード化ポリヌクレオチドを各々が含む、複数の第２の容器を形成するステップと；第１のコピー、第２のコピーおよびバーコードを、第１のプライマーセットおよび第２のプライマーセットを用いて増幅することによって、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬバーコード化配列のライブラリーを形成するステップであって、第１のセットのプラマーが第２のセットのプライマーに相補的である、ステップとを含む。
一部の態様では、複数の第１の容器は、単一の反応環境に収容される。一部の実施形態では、単一の反応環境とは、容器が物理的バリアによって互いに分離されていない、例えば、プレートの個々のウェルに分離されていないことを示す。
一部の態様では、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬバーコード化配列は、同じバーコードを含む。一部の態様では、方法は、第１の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬバーコード化配列と第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬバーコード化配列を融合させるステップをさらに含む。一部の態様では、第１の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬバーコード化配列と第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬバーコード化配列は、融合される。
一部の態様では、シーケンシングするステップの前に、方法は、生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬまたは少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からの単一細胞、および固体支持体を各々が含む、複数の第１の容器を形成するステップと；固体支持体上に、単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第１のポリヌクレオチドの第１のコピーであって、第１のバーコード化ポリヌクレオチドに付着している第１のコピー、および単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第２のポリヌクレオチドの第２のコピーであって、第２のバーコード化ポリヌクレオチドに付着している第２のコピーをコピーするステップと；第１のコピーおよび第１のバーコード、ならびに第２のコピーおよび第２のバーコードを、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて増幅することによって、単一細胞からの一意的にペアリングされたバーコード化配列のライブラリーを形成するステップと；複数の第１の容器からの単一の固体支持体を各々が含む、複数の第２の容器を形成するステップと；第２の容器内で、第１のフォワードバーコードプライマーおよび第１のリバースバーコードプライマーを用いて第１のバーコードを、第２のフォワードバーコードプライマーおよび第２のリバースバーコードプライマーを用いて第２のバーコードを増幅することによって、増幅された第１および第２のバーコードのライブラリーを形成するステップであって、第１のバーコードプライマーが、第２のバーコードプライマーと相補的であるか、または第１のバーコードプライマー配列が、第２のバーコードプライマー配列のパリンドロームである、ステップとをさらに含む。
一部の態様では、方法は、（ｅ）からの増幅された第１および第２のバーコードを融合させるステップをさらに含む。
一部の態様では、融合される増幅された第１および第２のバーコードは、第２の容器内で融合される。
一部の態様では、第１および第２のバーコードは、異なるバーコードを含む。
一部の態様では、異なるバーコードは、固有のものである。
一部の態様では、異なるバーコードは、固有バーコードペアである。
一部の態様では、第１および第２のバーコードは、同じバーコードを含む。
一部の態様では、第１および第２のバーコードの同じバーコードは、固有のものである。
一部の態様では、シーケンシングするステップの前に、方法は、生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬまたは少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からの単一細胞、複数の分子バーコード化ポリヌクレオチド、および容器バーコード化ポリヌクレオチドを各々が含む、複数の容器を形成するステップと；単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第１のポリヌクレオチドに相補的である第１の相補的ポリヌクレオチド、および単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第２のポリヌクレオチドに相補的である第２の相補的ポリヌクレオチドを産生するステップと；複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの第１の分子バーコード化ポリヌクレオチドを第１の相補的ポリヌクレオチドに、および第２の分子バーコード化ポリヌクレオチドを第２の相補的ポリヌクレオチドに付着させることによって、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと；容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物を、第１の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドに、および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドに付着させることによって、第１および第２の単一細胞二重バーコード化配列のライブラリーを形成するステップとをさらに含む。
一部の態様では、シーケンシングするステップの前に、方法は、生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬまたは少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＶＨまたはＴＣＲαまたはＴＣＲγをコードするポリヌクレオチドから第１の相補的ポリヌクレオチド、および生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬまたは少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＶＬまたはＴＣＲβまたはＴＣＲδをコードするポリヌクレオチドから第２の相補的ポリヌクレオチドを、生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬまたは少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの同じ領域に相補的な領域を含む第１のプライマー；ＩｇまたはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの同じ領域に相補的な領域を含む第２のプライマー；３つまたはそれ超の同一の非鋳型ヌクレオチドを第１および第２の相補的ポリヌクレオチドの３’末端に付加させる非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素；分子バーコード、容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的な５’末端領域、および３つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な３’末端領域を各々が含む、複数の分子バーコード化ポリヌクレオチド；ならびに容器バーコード化ポリヌクレオチドを用いて産生することにより、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと；容器バーコード化ポリヌクレオチドを増幅することにより、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ二重バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと；第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ二重バーコード化ポリヌクレオチドを増幅することにより、ＶＨ、ＶＬ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγまたはＴＣＲδポリヌクレオチドの可変領域を含む配列のライブラリーを形成するステップと；試料の免疫状態を表すライブラリーの配列の１つまたは複数をシーケンシングするステップとをさらに含み、産生するステップは、複数の容器うちの１つの容器で行われ、容器は、生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬまたは少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からの単一細胞を含む。一部の態様では、第１および第２の分子バーコード化ポリヌクレオチドの分子バーコードは、異なる。一部の態様では、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドは、異なる分子バーコードを含む。一部の態様では、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ二重バーコード化配列は、異なる分子バーコードを含む。一部の態様では、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ二重バーコード化配列は、同じ容器バーコードを含む。一部の態様では、複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドは、増幅産物ではない。
一部の態様では、少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞は、疾患を有する対象からの生体試料からのものである。一部の態様では、対象は動物である。一部の態様では、動物は哺乳動物である。一部の態様では、哺乳動物はヒトである。一部の態様では、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、生体試料から単離される。一部の態様では、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、生体試料から単離されない。
一部の態様では、疾患を有する対象からの生体試料は、疾患を有する２つまたはそれ超の対象からの複数の生体試料を含む。一部の態様では、複数の生体試料は、少なくとも３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，００００、１００，０００、または１，０００，０００もしくはそれ超の試料を含む。
一部の態様では、疾患は、自己免疫疾患である。一部の態様では、疾患は、がんである。一部の態様では、疾患は、前がん性疾患である。
一部の態様では、方法は、増幅エラーを補正するステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、シーケンシングエラーを補正するステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、同じバーコード配列を含む配列をビニングまたはグループ化するステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、コンピュータまたはアルゴリズムを使用して同じバーコード配列を含む配列をビニングまたはグループ化するステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、少なくとも約９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列をクラスター化するステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、少なくとも約９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列をアライメントするステップをさらに含む。一部の態様では、クラスター化またはアライメントは、コンピュータまたはアルゴリズムを活用して行われる。一部の態様では、方法は、配列リードを生殖系列配列と比較し、配列リードの体細胞高頻度変異蓄積を判定するステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、配列のアイソタイプ分布を判定するステップをさらに含む。
一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、正常隣接組織の細胞と実質的に相互作用しない。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、疾患を有さない対象における同じ組織からの細胞と実質的に結合しない。
一部の態様では、産生するステップは、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを発現させることを含む。一部の態様では、産生するステップは、選択されたポリヌクレオチド配列によって各々がコードされる、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、または５００もしくはそれ超の組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを発現させることを含む。一部の態様では、産生するステップは、選択されたポリヌクレオチド配列の配列をベクターにクローニングすることを含む。一部の態様では、ベクターは、クローニングベクターである。一部の態様では、ベクターは、発現ベクターである。一部の態様では、産生するステップは、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする選択されたポリヌクレオチド配列の配列を含むポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含む。一部の態様では、接触は、トランスフェクトすることを含む。一部の態様では、産生するステップは、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを細胞において発現させることを含む。一部の態様では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の態様では、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＨＥＫ２９３細胞である。一部の態様では、方法は、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる産生された組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを精製するステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる産生された組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを単離するステップをさらに含む。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、異種タグを含む。一部の態様では、異種タグは、精製タグである。一部の態様では、細胞は、細菌細胞または昆虫細胞である。
一部の態様では、識別するステップは、ＩｇまたはＴＣＲ配列を、ＩｇまたはＴＣＲ配列データを含むデータベースと比較することを含む。一部の態様では、識別するステップは、全ゲノムｓｉＲＮＡスクリーニングを行うことを含む。一部の態様では、識別するステップは、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドに関してタンパク質ディスプレイスクリーニングを行うことを含む。一部の態様では、タンパク質ディスプレイスクリーニングは、ファージディスプレイスクリーニングである。一部の態様では、タンパク質ディスプレイスクリーニングは、リボソームディスプレイスクリーニングである。一部の態様では、識別するステップは、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行うことを含む。一部の態様では、識別するステップは、２Ｄゲル電気泳動を行うことを含む。一部の態様では、識別するステップは、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを、タンパク質アレイでスクリーニングすることを含む。一部の態様では、タンパク質アレイは、ヒトプロテオームの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントもしくはそれ超のタンパク質を含む。一部の態様では、識別するステップは、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドに対してプロテオームスクリーニングを行うことを含む。一部の態様では、識別するステップは、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドに関して免疫沈降を行うことを含む。一部の態様では、識別するステップは、質量分析を行うことを含む。一部の態様では、識別するステップは、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドに関して抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを行うことを含む。一部の態様では、識別するステップは、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの特異性を判定することを含む。一部の態様では、識別するステップは、結合アッセイを行うことを含む。一部の態様では、識別するステップは、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを、少なくとも１つの標的分析物候補と接触させることを含む。
一部の態様では、標的分析物候補は、固体支持体上にある。一部の態様では、標的分析物候補は、溶液中である（例えば、リボソームディスプレイ）。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、固体支持体上にある。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、溶液中である。一部の態様では、固体支持体は、アレイである。一部の態様では、固体支持体は、ビーズである。
一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが結合する標的分析物は未知である。
一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが結合する標的分析物は、その選択されたポリヌクレオチド配列が選択される時点で未知である。一部の態様では、本明細書で開示される方法によって識別された標的分析物を含む標的分析物が説明される。一部の態様では、識別された標的分析物は、疾患関連または疾患特異的標的分析物である。一部の態様では、識別された標的分析物は、細胞外領域を有するポリペプチドである。一部の態様では、単離された、精製された、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが説明され、この単離された、精製された、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の態様では、単離された、精製された、ＩｇＬポリペプチドが説明され、この単離された、精製された、ＩｇＬポリペプチドは、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列のＩｇポリヌクレオチドによってコードされる。一部の態様では、単離された、精製された、ＩｇＨポリペプチドが説明され、この単離された、精製された、ＩｇＨポリペプチドは、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列のＩｇポリヌクレオチドによってコードされる。一部の態様では、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離された、精製された、抗体を含む、ＩｇＨおよびＩｇＬポリヌクレオチドによってコードされる単離された、精製された、抗体が説明される。一部の態様では、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇポリペプチドの、単離された、精製された、Ｆａｂ断片を含む、Ｉｇポリペプチドの、単離された、精製された、Ｆａｂ断片が説明される。一部の態様では、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇポリペプチドの、単離された、精製された、Ｆ（ａｂ）２断片を含む、Ｉｇポリペプチドの、単離された、精製された、Ｆ（ａｂ）２断片が説明される。一部の態様では、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇポリペプチドの、単離された、精製された、Ｆｖ断片を含む、Ｉｇポリペプチドの、単離された、精製された、Ｆｖ断片が説明される。一部の態様では、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇポリペプチドの、単離された、精製された、ＳｃＦｖ断片を含む、Ｉｇポリペプチドの、単離された、精製された、ＳｃＦｖ断片が説明される。一部の態様では、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲαポリペプチドの、単離された、精製された、断片を含む、ＴＣＲαポリペプチドの、単離された、精製された、断片が説明される。一部の態様では、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲβポリペプチドの、単離された、精製された、断片を含む、ＴＣＲβポリペプチドの、単離された、精製された、断片が説明される。一部の態様では、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲαおよびＴＣＲβポリペプチドの、単離された、精製された、断片を含む、ＴＣＲαおよびＴＣＲβポリペプチドの、単離された、精製された、断片が説明される。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの識別された標的分析物は、疾患のバイオマーカーである。
一部の態様では、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇもしくはＴＣＲポリペプチドまたはその断片を、疾患を有する対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象を処置する方法が説明される。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、ヒト治療用ポリペプチドである。一部の態様では、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドは、中和ポリペプチドである。一部の態様では、本明細書で説明される方法の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇもしくはＴＣＲポリペプチドまたはその断片の識別された標的分析物の阻害剤を、疾患を有する対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象を処置する方法が説明される。一部の態様では、阻害剤は、小分子、核酸、ポリペプチド、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の態様では、阻害剤はポリペプチド阻害剤であり、このポリペプチド阻害剤は、選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドである。一部の態様では、阻害剤は核酸阻害剤であり、この核酸阻害剤は、ｓｉＲＮＡ核酸である。一部の態様では、阻害剤は核酸阻害剤であり、この核酸阻害剤は、遺伝子療法に使用される。
参照による組み入れ
本明細書で言及するすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願各々が参照により組み入れられると具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、それら全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられる。
例えば、本明細書で言及されるすべての刊行物および特許は、本明細書で説明される方法、キットおよび組成物とともに使用される可能性がある、それらの刊行物に記載されているキット、組成物および方法論を説明および開示する目的で、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で論じられる文献は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてもっぱら提供される。先行発明を理由にまたは任意の他の理由のために、本明細書で説明される発明がそのような開示に先行する権利がないことを認めると解釈すべきものは、本明細書中に存在しない。
本明細書で説明される新規特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本明細書で説明される特徴の原理が用いられる実例を示す後続の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照することにより、本明細書で説明される特徴および特徴の利点についての理解を深められるであろう。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）対象からの生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記対象からの前記生体試料からの少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップ；
（ｂ）前記少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞のうちの１つのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を前記配列情報に基づいて選択するステップ
を含む方法。
（項目２）
（ａ）対象からの生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記対象からの前記生体試料からの少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップ；
（ｂ）前記配列情報を、対応する正常隣接組織試料から得た配列情報と比較するステップ；
（ｃ）前記少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞のうちの１つのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を前記比較に基づいて選択するステップ
を含む方法。
（項目３）
（ａ）対象からの生体試料からの少なくとも１つのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記対象からの前記生体試料からの少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップ；
（ｂ）前記配列情報を、第２の対象からの生体試料から得た配列情報と比較するステップであって、第１および第２の対象が同じ疾患を有するステップ；
（ｃ）前記少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞のうちの１つのＴＩＬからのＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を前記比較に基づいて選択するステップ
を含む方法。
（項目４）
前記生体試料が、組織試料である、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを産生するステップをさらに含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの標的抗原を識別するステップをさらに含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記少なくとも１つの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞とを含む組織試料を提供するステップを含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記少なくとも１つのＴＩＬの形態が未知である、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の形態が未知である、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記少なくとも１つのＴＩＬの表現型が未知である、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の表現型が未知である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記少なくとも１つのＴＩＬおよび前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞が、前記生体試料中に１：１０，０００またはそれ未満の比で存在する、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記少なくとも１つのＴＩＬおよび前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞が、前記生体試料中に１：１００，０００またはそれ未満の比で存在する、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記少なくとも１つのＴＩＬおよび前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞が、前記生体試料中に１：１，０００，０００またはそれ未満の比で存在する、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記少なくとも１つのＴＩＬからの前記ＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド、および前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からの前記ＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチドが、前記シーケンシングするステップ中に１：１０，０００またはそれ未満の比で存在する、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記少なくとも１つのＴＩＬからの前記ＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド、および前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からの前記ＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチドが、前記シーケンシングするステップ中に１：１００，０００またはそれ未満の比で存在する、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記少なくとも１つのＴＩＬからの前記ＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド、および前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からの前記ＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチドが、前記シーケンシングするステップ中に１：１，０００，０００またはそれ未満の比で存在する、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記選択するステップが、前記配列情報のバイオインフォマティクス解析を行うことを含む、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記選択するステップが、前記配列情報のポリヌクレオチドの発現レベルを決定することを含む、項目１〜１８に記載の方法。
（項目２０）
前記選択するステップが、前記配列情報のポリヌクレオチド配列をアライメントすることを含む、項目１〜１９に記載の方法。
（項目２１）
前記選択するステップが、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドの発現レベルに基づく、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記選択するステップが、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生殖系列配列からの変異のパターンに基づく、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記選択するステップが、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生殖系列配列からの変異レベルに基づく、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記選択するステップが、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在、および正常細胞からの配列情報セットの中の前記選択されたポリヌクレオチド配列の非存在に基づく、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記選択するステップが、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの濃縮、および正常細胞からの第２の配列情報セットの中の前記選択されたポリヌクレオチド配列の非存在に基づく、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記選択するステップが、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのアイソタイププロファイルに基づく、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記選択するステップが、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの系統発生的クラスターに基づく、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記選択するステップが、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの系統発生的クラスターのサイズに基づく、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記選択するステップが、
（ａ）前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列と、
（ｂ）疾患にかかった生体試料からの別の配列情報セットの配列と
の間の類似性に基づく、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記疾患にかかった生体試料が、
（ａ）前記疾患を有する第１の対象からの疾患にかかった生体試料からの複数のリンパ球、および
（ｂ）前記疾患を有する第２の対象からの疾患にかかった生体試料からの複数のリンパ球
を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記選択するステップが、
（ａ）前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列と、
（ｂ）正常生体試料からの別の配列情報セットの配列と
の間の類似性の欠如に基づく、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記正常生体試料が、正常隣接組織試料である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記正常生体試料が、
（ａ）前記疾患を有さない第１の対象からの正常生体試料からの複数のリンパ球、および
（ｂ）前記疾患を有さない第２の対象からの正常生体試料からの複数のリンパ球
を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの疾患にかかった生体試料または疾患にかかった細胞への特異性を判定するステップを含む、項目１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
特異性を判定する前記ステップが、前記疾患にかかった生体試料または前記疾患にかかった細胞に対する前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの親和性、および同じ組織型の、対応する正常隣接組織または対応する正常生体試料または対応する正常細胞に対する前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの親和性を判定することを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
疾患にかかった細胞を殺滅する前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを識別するステップを含む、項目１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記識別された産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、前記疾患にかかった細胞と直接結合することによって前記疾患にかかった細胞を殺滅する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記産生するステップが、前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを合成すること、または組換え発現させることを含む、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞が、上皮細胞、リンパ球、がん細胞、またはこれらの組合せを含む、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記少なくとも１つのＴＩＬが、少なくとも１つのＴ細胞、少なくとも１つのＢ細胞、またはこれらの組合せを含む、項目１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記生体試料が、がん生検材料である、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記生体試料が、正常組織生検材料である、項目１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記生体試料が、血管外組織を含む、項目１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、組換えポリペプチドである、項目１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
標的分析物が、疾患にかかった生体試料または疾患にかかった組織に特異的である、項目１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
標的分析物が、前記生体試料の疾患にかかった細胞に特異的である、項目１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
標的分析物が、がん細胞に特異的である、項目１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記シーケンシングするステップが、ハイスループットシーケンシングである、項目１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記シーケンシングするステップが、合成、ハイブリダイゼーションまたはライゲーションによるシーケンシングである、項目１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記シーケンシングするステップが、全免疫レパトアをシーケンシングすることを含まない、項目１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記シーケンシングするステップが、大規模並行シーケンシングである、項目１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
多数のプライマーまたは固体支持体に付着している多数のプライマーの使用を含まない、項目１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
ＩｇまたはＴＣＲ可変ドメイン領域に相補的である配列を含む非常に多数のプライマーを用いない、項目１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記シーケンシングするステップの前に、前記少なくとも１つのＴＩＬまたは前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からポリヌクレオチドを単離するステップを用いない、項目１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記生体試料が、血液ではない、項目１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記生体試料が、固形組織試料である、項目１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記生体試料が、臓器からのものである、項目１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記生体試料が、三次元構造を含む、項目１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記生体試料が、がん性細胞または前がん性細胞を含む、項目１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記生体試料が、前記対象の免疫系によって異常標的化される健常組織を含む、項目１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞が、１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ もしくはそれ超の非ＴＩＬ細胞を含む、項目１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記少なくとも１つのＴＩＬが、１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ もしくはそれ超のＴＩＬを含む、項目１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記選択されたポリヌクレオチド配列が、１〜５００の固有のＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を含む、項目１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記選択されたポリヌクレオチド配列が、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００の固有のＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を含む、項目１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記選択されたポリヌクレオチド配列が、Ｔ細胞からのＴＣＲポリヌクレオチド配列を含む、項目１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記選択されたポリヌクレオチド配列が、Ｂ細胞からのＩｇポリヌクレオチド配列を含む、項目１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記生体試料の前記少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞が、前記シーケンシングするステップの前に細胞外細胞マーカーに基づいて選別または分離または選択されない、項目１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記生体試料の前記少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞が、前記シーケンシングするステップの前に細胞マーカーに基づいて選別または分離または選択されない、項目１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記生体試料の前記少なくとも１つのＴＩＬおよび少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞が、前記シーケンシングするステップの前に選別または分離または選択されない、項目１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記シーケンシングされるポリヌクレオチドが、Ｉｇ重鎖（ＩｇＨ）をコードするＩｇポリヌクレオチドを含む、項目１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記ＩｇＨを同じＢ細胞からのＩｇ軽鎖（ＩｇＬ）とペアリングするステップをさらに含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記シーケンシングされるポリヌクレオチドが、ＩｇＬをコードするＩｇポリヌクレオチドを含む、項目１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記ＩｇＬを同じＢ細胞からのＩｇＨとペアリングするステップをさらに含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記シーケンシングされるポリヌクレオチドが、ＩｇＨをコードするＩｇポリヌクレオチド、およびＩｇＬをコードするＩｇポリヌクレオチドを含む、項目１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記ＩｇＬが、同じＢ細胞からの前記ＩｇＨとペアリングされる、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
ＩｇＬを同じＢ細胞からのＩｇＨとペアリングするステップをさらに含む、項目１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記シーケンシングされるポリヌクレオチドが、ＴＣＲα鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチドを含む、項目１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記ＴＣＲα鎖を同じＴ細胞からのＴＣＲβ鎖とペアリングするステップをさらに含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記シーケンシングされるポリヌクレオチドが、ＴＣＲβ鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチドを含む、項目１〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記ＴＣＲβ鎖を同じＴ細胞からのＴＣＲα鎖とペアリングするステップをさらに含む、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記シーケンシングされるポリヌクレオチドが、ＴＣＲα鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチド、およびＴＣＲβ鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチドを含む、項目１〜８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記ＴＣＲα鎖が、同じＴ細胞からの前記ＴＣＲβ鎖とペアリングされる、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
ＴＣＲα鎖を同じＴ細胞からのＴＣＲβ鎖とペアリングするステップをさらに含む、項目１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
ペアリングされたＩｇＬとＩｇＨのデータベースを生成するステップをさらに含む、項目１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
ペアリングされたＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖のデータベースを生成するステップをさらに含む、項目１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
ペアリングされたＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖のデータベースを生成するステップをさらに含む、項目１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記シーケンシングされるポリヌクレオチドが、ＴＣＲγ鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチドを含む、項目１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記ＴＣＲγ鎖を同じＴ細胞からのＴＣＲδ鎖とペアリングするステップをさらに含む、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記シーケンシングされるポリヌクレオチドが、ＴＣＲδ鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチドを含む、項目１〜８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記ＴＣＲδ鎖を同じＴ細胞からのＴＣＲγ鎖とペアリングするステップをさらに含む、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記シーケンシングされるポリヌクレオチドが、ＴＣＲγ鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチド、およびＴＣＲδ鎖をコードするＴＣＲポリヌクレオチドを含む、項目１〜９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記ＴＣＲγ鎖が、同じＴ細胞からの前記ＴＣＲδ鎖とペアリングされる、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
ＴＣＲγ鎖を同じＴ細胞からのＴＣＲδ鎖とペアリングするステップをさらに含む、項目１〜９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、可変領域を含む、項目１〜９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
Ｉｇをコードする前記ポリヌクレオチドが、重鎖可変領域（Ｖ Ｈ ）を含む、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
Ｉｇをコードする前記ポリヌクレオチドが、軽鎖可変領域（Ｖ Ｌ ）を含む、項目９４または９５に記載の方法。
（項目９７）
ＴＣＲをコードする前記ポリヌクレオチドが、ＴＣＲα鎖可変領域（Ｖα）を含む、項目９４に記載の方法。
（項目９８）
ＴＣＲをコードする前記ポリヌクレオチドが、ＴＣＲβ鎖可変領域（Ｖβ）を含む、項目９４または９７に記載の方法。
（項目９９）
ＴＣＲをコードする前記ポリヌクレオチドが、ＴＣＲγ鎖可変領域（Ｖγ）を含む、項目９４に記載の方法。
（項目１００）
ＴＣＲをコードする前記ポリヌクレオチドが、ＴＣＲδ鎖可変領域（Ｖδ）を含む、項目９４または９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記可変領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、高頻度変異領域、またはこれらのいずれかの組合せを含む、項目９４〜１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記可変領域が、Ｖセグメント、Ｄセグメント、Ｊセグメント、またはこれらのいずれかの組合せを含む、項目９４〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、ＴＣＲ定常ドメイン領域を含む、項目１〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記ＴＣＲ定常ドメイン領域が、ＴＣＲα定常ドメイン、ＴＣＲβ定常ドメイン、ＴＣＲγ定常ドメイン、ＴＣＲδ定常ドメイン、またはこれらの組合せを含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの前記領域が、Ｉｇ定常ドメイン領域を含む、項目１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記Ｉｇ定常ドメイン領域が、Ｃ Ｈ １、Ｃ Ｈ ２、Ｃ Ｈ ３およびＣ Ｈ ４からなる群から選択されるＩｇＨ定常ドメインを含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記Ｉｇ定常ドメイン領域が、Ｃ Ｈ １、Ｃ Ｈ ２、Ｃ Ｈ ３およびＣ Ｈ ４からなる群から選択される２つ、３つまたは４つのＩｇＨ定常ドメインを含む、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記Ｉｇ定常ドメイン領域が、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびこれらの組合せからなる群から選択されるＩｇアイソタイプからのＩｇＨ定常ドメインを含む、項目１０５〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記選択されたポリヌクレオチド配列の前記Ｉｇアイソタイプが、ＩｇＧアイソタイプ配列である、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記Ｉｇ定常ドメイン領域が、ＩｇＬ定常ドメイン（Ｃ Ｌ ）を含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１１１）
前記Ｉｇ定常ドメイン領域が、Ｉｇκ、Ｉｇλおよびこれらの組合せからなる群から選択されるＩｇＬアイソタイプからのＣ Ｌ を含む、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
前記選択されたポリヌクレオチド配列の前記Ｉｇアイソタイプが、Ｉｇκである、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、生殖系列フレームワーク配列を含むフレームワーク領域配列を含む、項目１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、生殖系列Ｖ Ｈ 配列を含むＶ Ｈ 配列、生殖系列Ｖ Ｌ 配列を含むＶ Ｌ 配列、生殖系列ＴＣＲα可変領域配列を含むＴＣＲα可変領域配列、生殖系列ＴＣＲβ可変領域配列を含むＴＣＲβ可変領域配列、生殖系列ＴＣＲγ可変領域配列を含むＴＣＲγ可変領域配列、生殖系列ＴＣＲδ可変領域配列を含むＴＣＲδ可変領域配列、またはこれらの組合せを含む、項目１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１５）
前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、１つまたは複数の変異フレームワーク残基を含むフレームワーク領域配列を含む、項目１〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの前記１つまたは複数の変異フレームワーク残基のうちの１つの変異フレームワーク残基が、疾患を有する２つまたはそれ超の対象からの発現量上位５パーセントのＩｇＨ、ＩｇＬ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγまたはＴＣＲδポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数において見出される残基である、項目１〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、特異的Ｉｇアイソタイプを含む、項目１〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記特異的Ｉｇアイソタイプが、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥである、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
特異的アイソタイプが、ＩｇＧである、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記配列情報が、少なくとも約１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ の固有のＩｇまたはＴＣＲ配列を含む、項目１〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
前記配列情報が、少なくとも約１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ の配列リードを含む、項目１〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
前記配列情報が、疾患関連タンパク質または疾患特異的タンパク質に関して約１×１０ −７ Ｍ、１×１０ −８ Ｍ、１×１０ −９ Ｍ、１×１０ −１０ Ｍ、１×１０ −１１ Ｍ、１×１０ −１２ Ｍまたはそれ未満のＫ ｄ を有するＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記少なくとも１つのＴＩＬからの少なくとも１つのＩｇまたはＴＣＲ配列を含む、項目１〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
前記配列情報が、疾患関連タンパク質または疾患特異的タンパク質に関して１×１０ −７ Ｍ、１×１０ −８ Ｍ、１×１０ −９ Ｍ、１×１０ −１０ Ｍ、１×１０ −１１ Ｍ、１×１０ −１２ Ｍまたはそれ未満のＫ Ｄ を有するＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇ配列もＴＣＲ配列も含まない、項目１〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、疾患関連タンパク質または疾患特異的タンパク質に関して約１×１０ −７ Ｍ、１×１０ −８ Ｍ、１×１０ −９ Ｍ、１×１０ −１０ Ｍ、１×１０ −１１ Ｍ、１×１０ −１２ Ｍまたはそれ未満のＫ Ｄ を有する、項目１〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２５）
前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記選択されたポリヌクレオチド配列が、疾患関連タンパク質または疾患特異的タンパク質に関して約１×１０ −７ Ｍ、１×１０ −８ Ｍ、１×１０ −９ Ｍ、１×１０ −１０ Ｍ、１×１０ −１１ Ｍ、１×１０ −１２ Ｍまたはそれ未満のＫ Ｄ を有するＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする、項目１〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
前記選択されたポリヌクレオチド配列を含むＴＩＬが、前記生体試料の前記少なくとも１つのＴＩＬおよび前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の総数に対して約１〜５００の量で存在する、項目１〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２７）
前記選択されたポリヌクレオチド配列を含むＴＩＬが、前記生体試料の前記少なくとも１つのＴＩＬおよび前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の総数に対して約１、２、３、４または５の量で存在する、項目１〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２８）
前記選択されたポリヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１つのＴＩＬのうちの１つのＴＩＬが、前記生体試料中に、全免疫細胞の少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ 当たり約１の量で存在する、項目１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記選択されたポリヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１つのＴＩＬのうちの１つのＴＩＬが、前記生体試料中に、全リンパ球の少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ 当たり約１の量で存在する、項目１〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
前記選択されたポリヌクレオチド配列を含む前記少なくとも１つのＴＩＬのうちの１つのＴＩＬが、前記生体試料中に、前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ 当たり約１の量で存在する、項目１〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３１）
前記少なくとも１つのＴＩＬが、前記生体試料中に、前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞の少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ 当たり約１の量で存在する、項目１〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３２）
前記生体試料中の全リンパ球に対する疾患関連リンパ球または疾患特異的リンパ球の比が、疾患関連リンパ球または疾患特異的リンパ球ではない前記生体試料中のリンパ球の少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ 当たり約１である、項目１〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３３）
前記シーケンシングするステップのエラー率が、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％もしくは０．０１％またはそれら未満である、項目１〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３４）
前記シーケンシングするステップが、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９９％または１００％の精度または信頼度で配列を決定することを含む、項目１〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３５）
増幅エラーが、最小化されるか、除去されるか、または０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％、０．０００００１％もしくは０．００００００１％未満である、項目１〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３６）
前記シーケンシングするステップが、少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ の前記少なくとも１つのＴＩＬおよび前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドをシーケンシングすることを含む、項目１〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ の前記ポリヌクレオチドがシーケンシングされる、項目１〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
４週間、３週間、２週間、１週間、６日、５日、５日、４日、３日、２日、１日、１８時間、１２時間、９時間、６時間、３時間、２時間もしくは１時間またはそれら未満である正の量の時間中に行われる、項目１〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３９）
前記生体試料からのＩｇまたはＴＣＲをコードする前記ポリヌクレオチドが、ＩｇまたはＴＣＲをコードする少なくとも１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、１０００，０００、５００，０００、または１×１０ ６ 、２×１０ ６ 、３×１０ ６ 、４×１０ ６ 、５×１０ ６ 、６×１０ ６ 、７×１０ ６ 、８×１０ ６ 、９×１０ ６ 、１×１０ ７ 、２×１０ ７ 、３×１０ ７ 、４×１０ ７ 、５×１０ ７ 、６×１０ ７ 、７×１０ ７ 、８×１０ ７ 、９×１０ ７ 、１×１０ ８ 、２×１０ ８ 、３×１０ ８ 、４×１０ ８ 、５×１０ ８ 、６×１０ ８ 、７×１０ ８ 、８×１０ ８ 、９×１０ ８ 、１×１０ ９ 、２×１０ ９ 、３×１０ ９ 、４×１０ ９ 、５×１０ ９ 、６×１０ ９ 、７×１０ ９ 、８×１０ ９ 、９×１０ ９ 、１×１０ １０ 、２×１０ １０ 、３×１０ １０ 、４×１０ １０ 、５×１０ １０ 、６×１０ １０ 、７×１０ １０ 、８×１０ １０ 、９×１０ １０ 、１×１０ １１ 、２×１０ １１ 、３×１０ １１ 、４×１０ １１ 、５×１０ １１ 、６×１０ １１ 、７×１０ １１ 、８×１０ １１ 、９×１０ １１ 、１×１０ １２ 、２×１０ １２ 、３×１０ １２ 、４×１０ １２ 、５×１０ １２ 、６×１０ １２ 、７×１０ １２ 、８×１０ １２ 、または９×１０ １２ のポリヌクレオチドを含む、項目１〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４０）
前記シーケンシングするステップの前に、
（ａ）（ｉ）前記生体試料からの前記少なくとも１つのＴＩＬまたは前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞のうちの単一細胞、および
（ｉｉ）単一の固体支持体
を各々が含む、複数の第１の容器を形成するステップと；
（ｂ）前記単一の固体支持体上に、
（ｉ）前記単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第１のポリヌクレオチドの第１のコピー、および
（ｉｉ）前記単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第２のポリヌクレオチドの第２のコピー
をコピーするステップと；
（ｃ）（ｉ）前記複数の第１の容器からの単一の固体支持体、および
（ｉｉ）バーコード化ポリヌクレオチド
を各々が含む、複数の第２の容器を形成するステップと；
（ｄ）前記第１のコピー、前記第２のコピーおよびバーコードを、
（ｉ）第１のプライマーセット、および
（ｉｉ）第２のプライマーセット
を用いて増幅することによって、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬバーコード化配列のライブラリーを形成するステップであって、前記第１のセットのプライマーが前記第２のセットのプライマーに相補的である、ステップと
を含む、項目１〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４１）
前記第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬバーコード化配列が、同じバーコードを含む、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
前記第１の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬバーコード化配列と第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬバーコード化配列を融合させるステップをさらに含む、項目１４０または１４１に記載の方法。
（項目１４３）
前記第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬバーコード化配列が、（ｄ）の後に融合される、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
前記シーケンシングするステップの前に、
（ａ）（ｉ）前記生体試料からの前記少なくとも１つのＴＩＬまたは前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からの単一細胞、および
（ｉｉ）固体支持体
を各々が含む、複数の第１の容器を形成するステップと；
（ｂ）前記固体支持体上に、
（ｉ）前記単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第１のポリヌクレオチドの第１のコピーであって、第１のバーコード化ポリヌクレオチドに付着している第１のコピー、および
（ｉｉ）前記単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第２のポリヌクレオチドの第２のコピーであって、第２のバーコード化ポリヌクレオチドに付着している第２のコピー
をコピーするステップと；
（ｃ）（ｉ）前記第１のコピーおよび第１のバーコード、ならびに
（ｉｉ）前記第２のコピーおよび第２のバーコードを、
（Ａ）フォワードプライマー、および
（Ｂ）リバースプライマー
を用いて増幅することにより、前記単一細胞からの一意的にペアリングされたバーコード化配列のライブラリーを形成するステップと；
（ｄ）前記複数の第１の容器からの単一の固体支持体を各々が含む、複数の第２の容器を形成するステップと；
（ｅ）前記第２の容器内で、
（ｉ）第１のフォワードバーコードプライマーおよび第１のリバースバーコードプライマーを用いて前記第１のバーコードを、
（ｉｉ）第２のフォワードバーコードプライマーおよび第２のリバースバーコードプライマーを用いて前記第２のバーコードを
増幅することによって、増幅された第１および第２のバーコードのライブラリーを形成するステップであって、第１のバーコードプライマーが、第２のバーコードプライマーと相補的であるか、または第１のバーコードプライマー配列が、第２のバーコードプライマー配列のパリンドロームである、ステップと
をさらに含む、項目１〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４５）
（ｅ）からの前記増幅された第１および第２のバーコードを融合させるステップをさらに含む、項目１４４に記載の方法。
（項目１４６）
融合される増幅された第１および第２のバーコードが、前記第２の容器内で融合される、項目１４５に記載の方法。
（項目１４７）
前記第１および第２のバーコードが、異なるバーコードを含む、項目１４４〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４８）
前記異なるバーコードが、固有のものである、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
前記異なるバーコードが、固有のバーコードペアである、項目１４７に記載の方法。
（項目１５０）
前記第１および第２のバーコードが、同じバーコードを含む、項目１４４〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５１）
前記第１および第２のバーコードの前記同じバーコードが、固有のものである、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
前記シーケンシングするステップの前に、
（ａ）（ｉ）前記生体試料からの前記少なくとも１つのＴＩＬまたは前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からの単一細胞、
（ｉｉ）複数の分子バーコード化ポリヌクレオチド、および
（ｉｉｉ）容器バーコード化ポリヌクレオチド
を各々が含む、複数の容器を形成するステップと；
（ｂ）（ｉ）前記単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第１のポリヌクレオチドに相補的である第１の相補的ポリヌクレオチド、および
（ｉｉ）前記単一細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第２のポリヌクレオチドに相補的である第２の相補的ポリヌクレオチド
を産生するステップと；
（ｃ）（ｉ）前記複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの１つの第１の分子バーコード化ポリヌクレオチドを前記第１の相補的ポリヌクレオチドに、および
（ｉｉ）第２の分子バーコード化ポリヌクレオチドを前記第２の相補的ポリヌクレオチドに
付着させることによって、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと；
（ｄ）前記容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物を、
（ｉ）前記第１の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドに、および
（ｉｉ）前記第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドに
付着させることによって、第１および第２の単一細胞二重バーコード化配列のライブラリーを形成するステップと
をさらに含む、項目１〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５３）
前記シーケンシングするステップの前に、
（ａ）（ｉ）前記生体試料からの前記少なくとも１つのＴＩＬまたは前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＶ Ｈ またはＴＣＲαをコードするポリヌクレオチドから第１の相補的ポリヌクレオチドを、および
（ｉｉ）前記生体試料からの前記少なくとも１つのＴＩＬまたは前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＶ Ｌ またはＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドから第２の相補的ポリヌクレオチドを、
（Ａ）前記生体試料からの前記少なくとも１つのＴＩＬまたは前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの同じ領域に相補的な領域を含む第１のプライマー、
（Ｂ）ＩｇまたはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの同じ領域に相補的な領域を含む第２のプライマー、
（Ｃ）３つまたはそれ超の同一の非鋳型ヌクレオチドを前記第１および第２の相補的ポリヌクレオチドの３’末端に付加させる非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素、
（Ｄ）（１）分子バーコード、
（２）容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に相補的な５’末端領域、および
（３）前記３つまたはそれ超の非鋳型ヌクレオチドに相補的な３’末端領域を各々が含む、複数の分子バーコード化ポリヌクレオチド、ならびに
（Ｅ）容器バーコード化ポリヌクレオチド
を用いて産生することにより、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと；
（ｂ）前記容器バーコード化ポリヌクレオチドを増幅することにより、第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ二重バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと；
（ｃ）前記第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ二重バーコード化ポリヌクレオチドを増幅することにより、前記Ｖ Ｈ 、Ｖ Ｌ 、ＴＣＲαまたはＴＣＲβポリヌクレオチドの可変領域を含む配列のライブラリーを形成するステップと；
（ｄ）前記試料の免疫状態を表す前記ライブラリーの前記配列のうちの１つまたは複数をシーケンシングするステップと
をさらに含み、（ａ）が、複数の容器のうちの１つの容器で行われ、前記容器が、前記生体試料からの前記少なくとも１つのＴＩＬまたは前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞からの単一細胞を含む、項目１〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５４）
前記第１および第２の分子バーコード化ポリヌクレオチドの前記分子バーコードが異なる、項目１５２または１５３に記載の方法。
（項目１５５）
前記第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドが、異なる分子バーコードを含む、項目１５２〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５６）
前記第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ二重バーコード化配列が、異なる分子バーコードを含む、項目１５２〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５７）
前記第１および第２の単一ＴＩＬまたは非ＴＩＬ二重バーコード化配列が、同じ容器バーコードを含む、項目１５２〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５８）
前記複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドが増幅産物ではない、項目１５２〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５９）
前記少なくとも１つのＴＩＬおよび前記少なくとも１つの非ＴＩＬ細胞が、疾患を有する対象からの生体試料からのものである、項目１〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６０）
前記対象が、動物である、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
前記動物が、哺乳動物である、項目１６０に記載の方法。
（項目１６２）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目１６１に記載の方法。
（項目１６３）
ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記生体試料から単離される、項目１５９〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６４）
ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記生体試料から単離されていない、項目１５９〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６５）
前記疾患を有する対象からの前記生体試料が、前記疾患を有する２つまたはそれ超の対象からの複数の生体試料を含む、項目１５９〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６６）
前記複数の生体試料が、少なくとも３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，００００、１００，０００、または１，０００，０００もしくはそれ超の試料を含む、項目１６５に記載の方法。
（項目１６７）
前記疾患が、自己免疫疾患である、項目１５９〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６８）
前記疾患が、がんである、項目１５９〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６９）
前記疾患が、前がん性疾患である、項目１５９〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７０）
増幅エラーを補正するステップをさらに含む、項目１〜１６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７１）
シーケンシングエラーを補正するステップをさらに含む、項目１〜１６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７２）
同じバーコード配列を含む配列をビニングまたはグループ化するステップをさらに含む、項目１〜１７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７３）
コンピュータまたはアルゴリズムを使用して同じバーコード配列を含む配列をビニングまたはグループ化するステップをさらに含む、項目１〜１７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７４）
少なくとも約９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列をクラスター化するステップをさらに含む、項目１〜１７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７５）
少なくとも約９０％、９５％または９９％の配列相同性を有する配列をアライメントするステップをさらに含む、項目１〜１７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７６）
前記クラスター化するステップまたはアライメントするステップが、コンピュータまたはアルゴリズムを活用して行われる、項目１７４または１７５に記載の方法。
（項目１７７）
配列リードを生殖系列配列と比較し、前記配列リードの体細胞高頻度変異蓄積を判定するステップをさらに含む、項目１〜１７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７８）
前記配列のアイソタイプ分布を判定するステップをさらに含む、項目１〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７９）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、正常隣接組織の細胞と実質的に相互作用しない、項目１〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８０）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、前記疾患を有さない対象における同じ組織からの細胞と実質的に結合しない、項目１〜１７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８１）
前記産生するステップが、前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを発現させることを含む、項目１〜１８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８２）
前記産生するステップが、選択されたポリヌクレオチド配列によって各々がコードされる、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、または５００もしくはそれ超の組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを発現させることを含む、項目１〜１８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８３）
前記産生するステップが、前記選択されたポリヌクレオチド配列の配列をベクターにクローニングすることを含む、項目１８１または１８２に記載の方法。
（項目１８４）
前記ベクターが、クローニングベクターである、項目１８３に記載の方法。
（項目１８５）
前記ベクターが、発現ベクターである、項目１８３または１８４に記載の方法。
（項目１８６）
前記産生するステップが、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする前記選択されたポリヌクレオチド配列の配列を含むポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含む、項目１８１〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８７）
前記接触が、トランスフェクトすることを含む、項目１８６に記載の方法。
（項目１８８）
前記産生するステップが、前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを細胞において発現させることを含む、項目１８１〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８９）
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目１８８に記載の方法。
（項目１９０）
前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、項目１８９に記載の方法。
（項目１９１）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記産生された組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを、精製するステップをさらに含む、項目１８１〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９２）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記産生された組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを、単離するステップをさらに含む、項目１８１〜１９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９３）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記組換えＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、異種タグを含む、項目１９１または１９２に記載の方法。
（項目１９４）
前記異種タグが、精製タグである、項目１９３に記載の方法。
（項目１９５）
前記細胞が、細菌細胞または昆虫細胞である、項目１８８に記載の方法。
（項目１９６）
前記識別するステップが、ＩｇまたはＴＣＲ配列を、ＩｇまたはＴＣＲ配列データを含むデータベースと比較することを含む、項目１〜１９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９７）
前記識別するステップが、全ゲノムｓｉＲＮＡスクリーニングを行うことを含む、項目１〜１９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９８）
前記識別するステップが、前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドに関してタンパク質ディスプレイスクリーニングを行うことを含む、項目１〜１９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９９）
前記タンパク質ディスプレイスクリーニングが、ファージディスプレイスクリーニングである、項目１９８に記載の方法。
（項目２００）
前記タンパク質ディスプレイスクリーニングが、リボソームディスプレイスクリーニングである、項目１９８に記載の方法。
（項目２０１）
前記識別するステップが、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行うことを含む、項目１〜２００のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０２）
前記識別するステップが、２Ｄゲル電気泳動を行うことを含む、項目１〜２０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０３）
前記識別するステップが、前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをタンパク質アレイでスクリーニングすることを含む、項目１〜２０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０４）
前記タンパク質アレイが、ヒトプロテオームの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントもしくはそれ超のタンパク質を含む、項目２０３に記載の方法。
（項目２０５）
前記識別するステップが、前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドに対してプロテオームスクリーニングを行うことを含む、項目１〜２０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０６）
前記識別するステップが、前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドに関して免疫沈降を行うことを含む、項目１〜２０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０７）
前記識別するステップが、質量分析を行うことを含む、項目１〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０８）
前記識別するステップが、前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドに関して抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを行うことを含む、項目１〜２０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０９）
前記識別するステップが、前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの特異性を判定することを含む、項目１〜２０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１０）
前記識別するステップが、結合アッセイを行うことを含む、項目１〜２０９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１１）
前記識別するステップが、前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを少なくとも１つの標的分析物候補と接触させることを含む、項目１〜２１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１２）
前記標的分析物候補が、固体支持体上にある、項目２１１に記載の方法。
（項目２１３）
前記標的分析物候補が、溶液中にある（例えば、リボソームディスプレイ）、項目２１１に記載の方法。
（項目２１４）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、固体支持体上にある、項目２１１〜２１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１５）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、溶液中にある、項目２１１〜２１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１６）
前記固体支持体が、アレイである、項目２１２または２１４に記載の方法。
（項目２１７）
前記固体支持体が、ビーズである、項目２１２または２１４に記載の方法。
（項目２１８）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが結合する前記標的分析物が未知である、項目１〜２１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１９）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが結合する前記標的分析物が、前記選択されたポリヌクレオチド配列が選択される時点で未知である、項目１〜２１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２０）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の方法によって識別された標的分析物。
（項目２２１）
前記識別された標的分析物が、疾患関連または疾患特異的標的分析物である、項目２２０に記載の標的分析物。
（項目２２２）
前記識別された標的分析物が、細胞外領域を有するポリペプチドである、項目２２０または２２１に記載の標的分析物。
（項目２２３）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離され、精製された、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチド。
（項目２２４）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列のＩｇポリヌクレオチドによってコードされる、単離され、精製された、ＩｇＬポリペプチド。
（項目２２５）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列のＩｇポリヌクレオチドによってコードされる、単離され、精製された、ＩｇＨポリペプチド。
（項目２２６）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列のＩｇＨおよびＩｇＬポリヌクレオチドによってコードされる、単離され、精製された、抗体。
（項目２２７）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチドによってコードされるＩｇポリペプチドの、単離され、精製された、Ｆａｂ断片。
（項目２２８）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇポリペプチドの、単離され、精製された、Ｆ（ａｂ） ２ 断片。
（項目２２９）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇポリペプチドの、単離され、精製された、Ｆｖ断片。
（項目２３０）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇポリペプチドの、単離され、精製された、ｓｃＦｖ断片。
（項目２３１）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離され、精製された、ＴＣＲγポリペプチド。
（項目２３２）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離され、精製された、ＴＣＲδポリペプチド。
（項目２３３）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離され、精製された、ＴＣＲγおよびＴＣＲδポリペプチド。
（項目２３４）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離され、精製された、ＴＣＲαポリペプチド。
（項目２３５）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離され、精製された、ＴＣＲβポリペプチド。
（項目２３６）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる、単離され、精製された、ＴＣＲαおよびＴＣＲβポリペプチド。
（項目２３７）
抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された細胞であって、前記抗原結合ドメインが、項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの抗原結合ドメインを含む、細胞。
（項目２３８）
抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された細胞であって、前記抗原結合ドメインが、項目１〜２１９のいずれか一項に記載の産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの識別された標的抗原のエピトープを認識する、細胞。
（項目２３９）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの抗原結合ドメインを発現する細胞。
（項目２４０）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを発現する細胞。
（項目２４１）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの前記識別された標的抗原のエピトープを認識する抗原結合ドメインを発現する細胞。
（項目２４２）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの標的抗原を認識する抗原結合ドメインを発現する細胞。
（項目２４３）
項目１〜２１９のいずれか一項に記載の選択されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを発現する細胞。
（項目２４４）
対象からのものではない、項目２３７〜２４３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２４５）
単離されている、項目２３７〜２４４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目２４６）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの前記識別された標的分析物が、前記疾患のバイオマーカーである、項目１〜２４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４７）
項目１〜２４６のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドまたはその断片を、疾患を有する対象に投与するステップを含む、処置を必要とする対象を処置する方法。
（項目２４８）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、ヒト治療用ポリペプチドである、項目１〜２４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４９）
前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、中和ポリペプチドである、項目１〜２４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５０）
項目１〜２４６のいずれか一項に記載の選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドまたはその断片の前記識別された標的分析物の阻害剤を、疾患を有する対象に投与するステップを含む、処置を必要とする対象を処置する方法。
（項目２５１）
前記阻害剤が、小分子、核酸、ポリペプチド、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目２５０に記載の方法。
（項目２５２）
前記阻害剤が、ポリペプチド阻害剤であり、前記ポリペプチド阻害剤が、前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドである、項目２５１に記載の方法。
（項目２５３）
前記阻害剤が、核酸阻害剤であり、前記核酸阻害剤が、ｓｉＲＮＡ核酸である、項目２５１に記載の方法。
（項目２５４）
前記阻害剤が、核酸阻害剤であり、前記核酸阻害剤が、遺伝子療法に使用される、項目２５１に記載の方法。
（項目２５５）
項目２３７〜２４５のいずれか一項に記載の細胞を、疾患を有する対象に投与するステップを含む、処置を必要とする対象を処置する方法。
図１Ａは、膵臓腫瘍試料が、正常試料と区別することができるそれらの抗体プロファイルの類似性を示すことが、抗体レパトアによって明示されることを示すグラフを例示する図である。
図１Ｂは、複数のＰＤＡＣ腫瘍試料の抗体プロファイルの相関のヒートマップを例示する図である。
図２Ａは、分析した前立腺導管腺癌（ＰＤＡＣ）試料の大部分において、ＩｇＧ抗体を発現するＢ細胞の存在が腫瘍切除組織の圧倒的多数を占めている（これは標的特異的免疫応答を示唆する）ことを実証するグラフを例示する図である。マッチした正常組織試料は、主要ＩｇＡ応答に関しては正常膵臓組織試料に類似している。これらのＩｇＧ抗体の発現規模は、有意なオリゴクローナル応答を表し、これは、通常は、強い特異的な免疫応答を示す。
図２Ｂは、多発性硬化症試料の脳生検材料における異常な応答および高頻度オリゴクローナル抗体を発現するＢ細胞の存在を示すグラフを例示する図である。
図３Ａは、２つのＰＤＡＣ腫瘍試料および対応する正常隣接組織試料の免疫シーケンシングのクローン順位に対する総ｍＲＮＡ数／クローンのグラフを例示する図である。結果は、ＰＤＡＣに対する総体的免疫応答の大半をＩｇＧアイソタイプが占めている一方で、正常隣接組織（ＮＡＴ）では免疫細胞の大半をＩｇＡアイソタイプが占めていることを実証する。
図３Ｂは、クローン順位に対する全ｍＲＮＡ数／クローンのグラフおよびｍＲＮＡクローンのＮＡＴ分率に対するｍＲＮＡクローンのＰＤＡＣ分率のグラフを例示する図である。結果は、腫瘍試料もまた、最も豊富に発現される抗体について、ＩｇＧを発現するＢ細胞の存在がほぼ排他的にその大半を占めていることを実証する。
図４は、免疫シーケンシング、抗体選択、抗体産生、抗体の検証、抗体の抗原の識別、および抗体の治療有効性の判定を含む、本明細書で開示される例示的方法のフローチャートを例示する図である。
図５は、本明細書で開示される例示的方法のステップのフローチャートを例示する図である。正常および腫瘍組織試料からの配列データを使用して、腫瘍特異的抗原への高い親和性および特異性を示す１つまたは複数の抗体を選択した。抗体を組換えで産生し、免疫蛍光アッセイに使用して、疾患にかかった組織を染色し、正常隣接組織の染色と比較することによって、選択された抗体を検証する。免疫蛍光アッセイによって検証された、選択された抗体を、次いでＦＦＰＥヒト組織の免疫組織化学的蛍光アッセイでアッセイする。この検証段階に合格する抗体を、本明細書で開示される方法において用いて、バイオマーカーまたは疾患特異的抗原を識別することができる。
図６Ａは、導管腺癌、腺扁平上皮癌および神経内分泌癌への強い結合を示すが正常膵臓組織への極わずかな染色しか示さない抗体での免疫染色を例示する図である。
図６Ｂは、ヒト組織のＦＦＰＥスライドへの抗体の結合を検出するために形成された例示的な免疫コンジュゲートの概略図を例示する図である。
図７Ａは、上皮細胞ＰＤＡＣ試料および間質細胞ＰＤＡＣ試料からの抗体Ａ１−２２での免疫染色を例示する図である。カンツズマブは、間質細胞の染色を示さず、上皮細胞だけを染色する。これは、間質抗原の標的化がＰＤＡＣに関して臨床的に有益であり得ることを示す。
図７Ｂは、正常肺組織と比べて強い特異的な染色を実証する、ＰＤＡＣと同様の表現型細胞進化を有する肺扁平上皮細胞癌試料からの抗体Ａ１−２２での免疫染色を例示する図である。カンツズマブは、どちらの組織の染色も示さない。
図８Ａは、正常肺組織と比べて強い特異的な染色を実証する、ＰＤＡＣと同様の表現型細胞進化を有する肺扁平上皮細胞癌試料からの抗体Ａ１−２２での免疫染色を例示する図である。カンツズマブは、どちらの組織の染色も示さない。
図８Ｂは、図８Ａに示されている試料を免疫蛍光染色することによって得た平均蛍光のグラフを例示する図である。
図９Ａは、慢性膵炎試料からの抗体Ａ１−９９での免疫染色を例示する図である。示されている正常組織のすべてにおいて強い染色が見られ、これは、疾患が自己免疫性であり得ることを示唆している。
図９Ｂは、ＰＤＡＣ試料からの抗体Ａ１−１０８での免疫染色を例示する図である。示されている正常組織のすべてにおいて極わずかな染色しか見られない。
図１０は、単一細胞を各々が含有する複数の液滴を含有するエマルジョンを生成するためのシステムの概略図を例示する図である。細胞をこれらの個々の区画内で溶解することができる。
図１１は、ポリヌクレオチドをハイスループット形式でシーケンシングする例示的方法であって、Ｂ細胞を生体試料から個々のエマルジョンの中に単離し、そのエマルジョン中で溶解し、シーケンシングする方法の概略図を例示する図である。
図１２は、ポリヌクレオチドをハイスループット形式でシーケンシングする例示的方法であって、個々の鎖のシーケンシング後に個々の細胞の重鎖と軽鎖をペアリングするために、液滴バーコードおよび分子バーコードの使用によってＢ細胞を生体試料から個々のエマルジョンに単離し、そのエマルジョン中で溶解し、シーケンシングする方法の概略図を例示する図である。
図１３は、ナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞および形質Ｂ細胞のペアリングについての本明細書で説明される方法を行った結果として得られる精度およびストリンジェンシーデータを例示する図である。
図１４は、高ストリンジェンシーペアの全ペアに対する比および示されている期間にわたってペアリングされると予想される高ストリンジェンシーペアと抗体ペアの総数の予想された増加を示す概略的なグラフを例示する図である。
図１５は、本明細書で開示される方法により提供される一部の例示的な利点および技術的解決法を公知の免疫レパトアシーケンシングおよび抗体ペアリング方法と比較する概略図を例示する図である。
図１６は、罹患試料の免疫シーケンシングから得られるＴＣＲ発現のランクアバンダンスのグラフを例示する図である。示されているＴ細胞クローンの順位に対してプロットした各クローンのＴＣＲαおよびＴＣＲβのｍＲＮＡ数。
図１７は、本明細書で開示される例示的な方法のステップのフローチャートを例示する図である。正常および腫瘍組織試料からの配列データを収集し、その後、その配列データのバイオインフォマティクス処理を行った。ＴＩＬの１つまたは複数の抗体またはＴＣＲを、例えばｍＲＮＡ存在量、クローン増殖および体細胞高頻度変異を含む、いくつかの基準に基づいて選択する。次いで、選択された抗体を組換えで産生する。次いで、疾患にかかった組織を染色し、正常隣接組織の染色と比較することによる免疫蛍光アッセイを使用して、組換え抗体またはＴＣＲを腫瘍特異的抗原への高い親和性および特異性について試験する。次いで、免疫蛍光アッセイによって検証された、選択された抗体を、ＦＦＰＥヒト組織の免疫組織化学的蛍光アッセイでアッセイする。次いで、この検証段階に合格する抗体を免疫沈降アッセイで用い、質量分析を使用してその抗体が標的化される抗原を決定する。
図１８Ａは、Ｂ細胞とＴ細胞を同時的にシーケンシングしたＴＩＬ（処理した試料は、正常上皮細胞、がん細胞およびＴＩＬを含有する）の単離を伴わない、約４００，０００の腫瘍解離細胞を含有する卵巣がん試料から得たシーケンシングデータからの示されている受容体鎖の組合せに対する液滴バーコード数のグラフを例示する図である。このグラフは、クロストークもコンタミネーションもない、正確なＢおよびＴ細胞受容体のペアリングを実証する。
図１８Ｂは、図１８Ａに記載の試料からの示されているＩｇアイソタイプに対する全Ｂ細胞のパーセンテージのグラフを例示する図である。腫瘍は、ＴＩＬが由来する活性化Ｉｇ浸潤物の有意な濃縮を示す。
図１８Ｃは、重鎖可変遺伝子変異パーセンテージに対する軽鎖可変遺伝子変異パーセンテージのパーセンテージならびに図１８Ａに記載の試料からの示されているペアリングされたアイソタイプの軽鎖の密度に対する示されているアイソタイプの重鎖の密度のグラフを例示する図である。腫瘍は、ＴＩＬが由来する重度に変異したＩｇ浸潤物の有意な濃縮を示す。
図１９Ａは、ＴＩＬを選択および順位付けするための基準として使用したＴＩＬ免疫レパトアシーケンシング分析からのクローン順位に対するｍＲＮＡ存在量のグラフを例示する図である。
図１９Ｂは、ＴＩＬを選択および順位付けするための基準として使用したＴＩＬ免疫レパトアシーケンシング分析からのクローン順位に対する増殖量（細胞数）のグラフを例示する図である。
図１９Ｃは、ＴＩＬを選択および順位付けするための基準として使用したＴＩＬ免疫レパトアシーケンシング分析からのクローン順位に対する体細胞高頻度変異率のグラフを例示する図である。
図２０は、ＴＩＬを選択および順位付けするための基準として使用したＴＩＬ免疫レパトアシーケンシング分析からの示されているＩｇアイソタイプの増殖量（細胞数）に対する体細胞高頻度変異率のグラフを例示する図である。
図２１Ａは、ＴＩＬ免疫レパトアシーケンシング分析からの示されているＩｇアイソタイプのＣＤ２１ｌｏクローンのｍＲＮＡ存在量に対する体細胞高頻度変異率のグラフを例示する図である。データは、ＣＤ２１ｌｏクローンが、分析した分析肺腫瘍試料において増殖されたことを実証する。データは、二次細胞マーカーをシーケンシングデータから識別することができ、ＴＩＬを選択するために使用することができることを実証する。
図２１Ｂは、図２１Ａに示されているクローンの平均ＣＤ２１発現に対する密度のグラフを例示する図である。
図２２は、選択されたＴＩＬの標的抗原を識別するための本明細書で開示される例示的方法のステップのフローチャートを例示する図である。選択されたＴＩＬから組換え抗体を産生し、質量分析と結合された免疫沈降アッセイにおいて使用する。
図２３は、対照抗体（ＣＨ５９）、パニツムマブ、またはプロテインＧ単独で免疫沈降したＭｉａ ＰａＣａ−２細胞可溶化物試料からのタンパク質が染色されたゲルを例示する図である。パニツムマブで免疫沈降した試料における１６０ｋＤａバンド（ＥＧＦＲ）の強度パーセントは、質量分析によって分析したとき、免疫沈降した全組成物の９８．５％であった。このデータは、選択されたＴＩＬの標的抗原を高い精度で識別することができることを実証する。
種々の態様を例証のための応用例に関連して下で説明する。本明細書で説明される特徴を十分に理解してもらうために非常に多くの具体的な詳細、関係および方法が示されることを理解されたい。しかし、具体的な詳細の１つもしくは複数がなくても、または他の方法を用いて、本明細書で説明される特徴を実施することができることは、関連分野の当業者には容易に分かるであろう。一部の動作は、異なる順序で、および／または他の動作もしくは事象と同時的に行うことができるため、本明細書で説明される特徴は、例証される動作または事象順序によって限定されない。さらに、例証される動作または事象のすべてが、本明細書で説明される特徴に従って方法論を実施するために必要とされるとは限らない。
本明細書において使用される用語法は、特定のケースの説明を目的にしたものに過ぎず、限定を意図したものではない。本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数形も含むことを意図する。さらに、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」またはそれらの異表記が、発明を実施するための形態および／または特許請求の範囲のどちらかで使用される限り、そのような用語は、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的であることを意図する。
用語「約」または「おおよそ」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内を意味し得、許容される誤差範囲は、その値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの制約に一部依存することになる。例えば、「約」は、当分野での実務に従って、１以内の標準偏差を意味することもあり、または１より大きい標準偏差を意味することもある。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、１０％まで、５％までまたは１％までの範囲を意味することがある。あるいは、特に生体系または生物学的プロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、５倍以内、およびより好ましくは２倍以内を意味することもある。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記述がない限り、特定の値について許容される誤差範囲内を意味する用語「約」を想定されたい。
定義
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子に言及するときの用語「候補」は、本明細書において開示される方法に関して説明されるようなシーケンシング情報に基づいて選択されるリンパ球からのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。
用語「浸潤」または「腫瘍浸潤」免疫細胞は、罹患または腫瘍組織試料などの生体試料からの免疫細胞の異種集団を指す。浸潤免疫細胞は、骨髄細胞系列の細胞（顆粒球、マクロファージ、および骨髄系由来サプレッサー細胞）およびリンパ球系列の細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）を含む。
用語「抗体」は、天然のものであるのか、または部分的にもしくは完全に合成により産生されたものであるのかを問わず、免疫グロブリン（Ｉｇ）を指す。用語「Ｔ細胞受容体」（「ＴＣＲ」）は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と結合する抗原を認識するＴリンパ球（Ｔ細胞）の表面で見つけられる分子を、天然のものであるのか、または部分的にもしくは完全に合成により産生されたものであるのかを問わず、指す。抗原結合ドメインであるまたは抗原結合ドメインと相同である結合ドメインを有する、ポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。この用語には、「抗原結合断片」、および下で説明するものなどの同様の結合断片についての他の置き換え可能な用語がさらに含まれる。相補性決定領域（ＣＤＲ）がグラフトされた抗体およびＴＣＲならびに他のヒト化抗体およびＴＣＲ（ＣＤＲ修飾およびフレームワーク領域修飾を含む）もまたこれらの用語によって企図される。
ネイティブ抗体およびネイティブ免疫グロブリンは、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成されている約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、典型的には、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、免疫グロブリンアイソタイプが異なれば重鎖のジスルフィド連結の数も変る。各重鎖および軽鎖は、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いていくつかの定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、もう一方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列しており、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン間の境界面を形成すると考えられる。
様々ながんまたは感染性生物に関連する抗原を認識するＴ細胞の能力は、そのＴＣＲによって付与され、このＴＣＲは、アルファ（α）鎖とベータ（β）鎖両方またはガンマ（γ）鎖とデルタ（δ）鎖両方で構成されている。これらの鎖を構成するタンパク質は、ＴＣＲのとてつもない多様性を生じさせるために固有のなメカニズムを用いるＤＮＡによってコードされる。このマルチサブユニット免疫認識受容体は、ＣＤ３複合体と会合し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面にＭＨＣクラスＩおよびＩＩタンパク質によって提示されるペプチドに結合する。ＡＰＣ上の抗原性ペプチドへのＴＣＲの結合は、Ｔ細胞とＡＰＣの間の接点の免疫学的シナプスで起こるＴ細胞活性化の中心事象である。
各ＴＣＲは、可変相補性決定領域（ＣＤＲ）はもちろん、フレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域も含有する。αおよびβ鎖可変ドメインの第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）ループのアミノ酸配列は、β鎖座位における可変（Ｖβ）、多様性（Ｄβ）および連結（Ｊβ）遺伝子セグメント間、ならびにα鎖座位における類似のＶαおよびＪα遺伝子セグメント間の組換えからそれぞれ生じるαβＴ細胞の配列多様性を大きく左右する。ＴＣＲαおよびβ鎖座位における複数のそのような遺伝子セグメントの存在により、多数の異なるＣＤＲ３配列をコードすることが可能になる。ＴＣＲ遺伝子再構成の過程でのＶβ−Ｄβ、Ｄβ−Ｊβ、およびＶα−Ｊα接合部におけるヌクレオチドの独立した付加および欠失は、ＣＤＲ３配列多様性をさらに増加させる。このことに関連して、免疫能は、ＴＣＲの多様性に反映される。
γδＴＣＲは、自然免疫系と密接に相互作用する受容体をコードする点でαβＴＣＲとは異なる。ＴＣＲγδは、発生の初期に発現され、特殊化された解剖学的分布を有し、固有の病原体および小分子特異性を有し、広い自然および適応性細胞相互作用範囲を有する。個体発生過程の初期、出生前に限定されたＴＣＲγδ細胞サブセットが様々な組織に存在するので、ＴＣＲγＶおよびＪセグメントの偏った発現パターンが確立される。したがって、病原体および毒性分子への環境的曝露による刺激後の末梢での大規模な増殖が、成体組織における多様なＴＣＲγレパトアの大部分を生じさせる。
Ｂ細胞によって発現されるＩｇは、４本のポリペプチド鎖、２本の重鎖（ＩｇＨ）および２本の軽鎖（ＩｇＬ）からなるタンパク質であり、これらはＨ２Ｌ２構造を形成している。ＩｇＨ鎖とＩｇＬ鎖の各々のペアは、ＶＬおよびＶＨ領域からなる超可変ドメインと、定常ドメインとを含有する。ＩｇのＩｇＨ鎖は、μ、δ、γ、αおよびβといった、いくつかのタイプのものである。個体内のＩｇの多様性は、主として、超可変ドメインによって決まる。ＴＣＲに類似して、ＩｇＨ鎖のＶドメインは、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの組合せ的連結によって生成される。Ｉｇ遺伝子再構成過程でのＶＨ−ＤＨ、ＤＨ−ＪＨ、およびＶＨ−ＪＨ連結部におけるヌクレオチドの独立した付加および欠失は、超可変ドメイン配列の多様性をさらに増大させる。ここで、免疫能がＩｇの多様性に反映される。
抗体鎖、例えば重鎖および軽鎖、またはＴＣＲ鎖、例えばアルファ（α）およびベータ鎖またはガンマ（γ）およびデルタ（δ）鎖に関連して、用語「可変」は、抗体またはＴＣＲ鎖の部分であって、配列が抗体またはＴＣＲ間で異なり、特定の抗体またはＴＣＲ各々のその特定の抗原に対する結合および特異性に関与する部分を指す。そのような可変性は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン両方またはアルファ可変ドメインとベータ可変ドメイン両方における超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインの、より高度に保存される部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブ重鎖および軽鎖の可変ドメイン各々が、３つの超可変領域によって接続された４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含む。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって互いに極近接して保持され、他の鎖の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.（１９９１年）、６４７〜６６９頁を参照されたい）。定常ドメインは、抗体またはＴＣＲの抗原への結合には直接関係しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害への抗体の関与を示す。
用語「超可変領域」は、抗原結合の原因となる抗体またはＴＣＲのアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む異なるクラスに割り当てることができ、これらのクラスのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよび、ＩｇＡ２にさらに分けることができる。
免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
あらゆる脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプの一方に割り当てることができる。
用語「モノクローナル抗体」は、免疫細胞の単一クローンによって合成された抗体分子を指す。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる場合の抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生を求めるものと見なすべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein、Nature ２５６巻：４９５頁（１９７５年）；Eur. J. Immunol.６巻：５１１頁（１９７６年）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって、もしくは組換えＤＮＡ技術によって作製することができ、またはファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
用語「ポリクローナル抗体」は、免疫細胞の集団によって合成された抗体分子の集団を指す。
「抗体断片」および「ＴＣＲ断片」は、完全長抗体またはＴＣＲの一部、一般にはそれらの抗原結合ドメインまたは可変ドメインを含む。抗体およびＴＣＲ断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖ断片、直鎖状抗体またはＴＣＲ、一本鎖抗体またはＴＣＲ分子、ダイアボディ、および抗体またはＴＣＲ断片から形成された多重特異性抗体またはＴＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体またはＴＣＲ断片であって、抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン、またはＴＣＲの可変アルファ鎖（Ｖα）および可変ベータ鎖（Ｖβ）ドメイン、またはＴＣＲの可変アルファ鎖（Ｖγ）および可変ベータ鎖（Ｖδ）ドメインを含み、これらのドメインが単一のペプチド鎖内に存在する、断片を指す。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインの間、またはＶαドメインとＶβドメインの間、またはＶγドメインとＶδドメインの間にさらに含む。
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体および／またはＴＣＲ断片であって、同じポリペプチド鎖内にＶＬに接続されたＶＨ（ＶＨ−ＶＬ）を含むか、または同じポリペプチド鎖内にＶβに接続されたＶα（Ｖα−Ｖβ）を含むか、または同じポリペプチド鎖内にＶδに接続されたＶγ（Ｖγ−Ｖδ）を含む断片を指す。短すぎて同じ鎖上での２つのドメイン間のペアリングを可能にすることができないリンカーを使用することにより、ドメインに強いて別の鎖の相補ドメインとペアリングさせ、２つの抗原結合部位を生じさせる。例示的なダイアボディは、より完全に、例えばＥＰ４０４０９７およびＷＯ９３１１１１６１に記載されている。
用語「二重特異性抗体」または「二重特異性ＴＣＲ」は、２つの異なる抗原型に対する特異性を示す抗体またはＴＣＲを指す。本明細書で使用されるこれらの用語は、具体的には、標的抗原に対する結合特異性および特定の組織への送達を助長する別の標的への結合特異性を示す抗体およびＴＣＲを、限定ではないが、含む。同様に、多重特異性抗体およびＴＣＲは、２つまたはそれ超の結合特異性を有する。
用語「直鎖状抗体」および直鎖状「ＴＣＲ」は、抗原結合領域のペアを形成するタンデムＦｄセグメントのペア（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１またはＶα−Ｃα１−Ｖα−Ｃα１）を指す。直鎖状抗体およびＴＣＲは、例えば、Zapataら、Protein Eng. ８巻（１０号）：１０５７〜１０６２頁（１９９５年）によって説明されているように、二重特異性であることもあり、または単一特異性であることもある。
用語「抗体ライブラリー」または「ＴＣＲライブラリー」は、抗体もしくはＴＣＲまたは抗体もしくはＴＣＲ断片の収集物を指す。抗体またはＴＣＲレパトアは、例えば、特定の抗体もしくはＴＣＲを選択するために使用することができ、または結合能力、結合特異性、胃腸輸送能力、安定性、親和性などのような特定の特性についてスクリーニングするために使用することができる。この用語には、具体的には、例えば、ナイーブ、合成および半合成ライブラリーを含む、任意の源からの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）およびＦａｂ抗体ならびにＴＣＲファージディスプレイライブラリーを限定ではないが含む抗体ファージディスプレイライブラリーなどの、あらゆる形態のコンビナトリアルライブラリーを含む、抗体およびＴＣＲライブラリーが含まれる。
用語「標的核酸分子」、「標的分子」、「標的ポリヌクレオチド」、「標的ポリヌクレオチド分子」は、目的のあらゆる核酸を指す。
用語「腫瘍浸潤リンパ球」（ＴＩＬ）は、がん結節の間質に浸潤するリンパ球を指す。
用語「合成ポリヌクレオチド」または「合成ポリペプチド」は、対応するポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列またはその一部分、あるいはアミノ酸配列またはその一部分が、同等の天然に存在する配列と比較して設計または新規合成または修飾された配列に由来することを指す。合成ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、これに限定されるものではないが核酸またはアミノ酸配列の化学合成を含む、当技術分野において公知の方法によって調製することができる。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体またはＴＣＲの１つまたは複数の断片を指す。そのような用語内に含まれる抗体断片の非限定的な例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含有する二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを含有するＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインを含有するｄＡｂ断片（Wardら、（１９８９年）Nature ３４１巻：５４４〜５４６頁）、ならびに（ｖｉ）単離されたＣＤＲが挙げられるが、これらに限定されない。この定義には、単一の重鎖および単一の軽鎖を含む抗体、または単一のアルファ鎖もしくは単一のベータ鎖を含むＴＣＲがさらに含まれる。
「Ｆ（ａｂ’）２」および「Ｆａｂ」部分構造は、ペプシンおよびパパインなどのプロテアーゼでＩｇを処置することによって産生される得るものであり、２本の重鎖の各々におけるヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合付近での免疫グロブリンの消化により生成された抗体断片を含む。例えば、パパインは、２本の重鎖の各々におけるヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の上流でＩｇＧを切断して、ＶＬおよびＣＬで構成されている軽鎖とＶＨおよびＣＨγ１（重鎖定常領域内のγ１領域）で構成されている重鎖断片とがそれらのＣ末端領域でジスルフィド結合によって接続されている、２つの相同な抗体断片を生成する。これらの２つの相同な抗体断片の各々はＦａｂ’と呼ばれる。ペプシンはまた、２本の重鎖の各々におけるヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合の下流でＩｇＧを切断して、２つの上述のＦａｂ’がヒンジ領域で接続されている断片よりわずかに大きい抗体断片を生成する。この抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる。
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン、および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における少数の残基の付加が、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、Ｆａｂ’断片のペアであって、それらの間にヒンジシステインを有するペアとして、最初は産生される。
「Ｆｖ」は、完全抗原認識および抗原結合部位を含有する、抗体またはＴＣＲ断片を指す。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインまたは１本のＴＣＲα鎖と１本のＴＣＲβ鎖が密接に非共有結合的に会合している二量体からなる。それは、各可変ドメインの３つのＣＤＲが、ＶＨ−ＶＬ二量体またはＶα−Ｖβ二量体またはＶγ−Ｖδ二量体の表面の抗原結合部位を規定するように相互作用している、この立体配置で存在する。まとめると、ＶＨおよびＶＬ鎖またはＶα−Ｖβ鎖またはＶγ−Ｖδ鎖の各々からのＣＤＲの１つまたは複数の組合せが、抗体またはＴＣＲに抗原結合特異性を付与する。例えば、例えば、レシピエント選択抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片のＶＨおよびＶＬ鎖またはＶαおよびＶβ鎖またはＶγおよびＶδ鎖への転移の際に抗体またはＴＣＲに抗原結合特異性を付与するのにＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３だけで十分であり得ること、ならびにＣＤＲのこの組合せを、結合、親和性などについて試験することができることは、理解されるであろう。たとえ単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、第２の可変ドメインと組み合わせた場合より低い親和性での可能性は高いが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ、またはＶαおよびＶβ、またはＶγおよびＶδ）は、別々の遺伝子によってコードされるが、それら２つのドメインを単一タンパク質鎖とすることを可能にする合成リンカーによる組換え法を使用して連結させることができ、この場合、ＶＬ領域とＶＨ領域、またはＶα領域とＶβ領域、またはＶδ領域とＶγ領域がペアになって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）を形成する（Birdら（１９８８年）Science ２４２巻：４２３〜４２６頁；Hustonら（１９８８年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５巻：５８７９〜５８８３頁；およびOsbournら（１９９８年）Nat. Biotechnol.１６巻：７７８頁）。そのようなｓｃＦｖもまた、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されることが意図される。特異的ｓｃＦｖのいずれのＶＨおよびＶＬ配列をＦｃ領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列と連結させて、完全Ｉｇ（例えば、ＩｇＧ）分子または他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成してもよい。ＶＨおよびＶＬは、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のどちらかを使用するＩｇのＦａｂ、Ｆｖまたは他の断片の生成に使用することもできる。
抗原結合ポリペプチドは、例えばラクダ科動物およびサメからの抗体などの重鎖二量体も含む。ラクダ科動物およびサメ抗体は、Ｖ様およびＣ様ドメイン（どちらも軽鎖を有さない）の２本の鎖のホモ二量体ペアを含む。ラクダ科動物における重鎖二量体ＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖と疎水性相互作用をする必要がないので、通常は軽鎖と接触する重鎖内の領域がラクダ科動物では親水性アミノ酸残基に変更されている。重鎖二量体ＩｇＧのＶＨドメインは、ＶＨＨドメインと呼ばれる。サメＩｇ−ＮＡＲは、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲドメインと称される）と５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲドメイン）のホモ二量体を含む。ラクダ科動物の場合、抗体レパトアの多様性は、ＶＨまたはＶＨＨ領域のＣＤＲ１、２および３によって決まる。ラクダＶＨＨ領域のＣＤＲ３は、平均すると１６アミノ酸になるその比較的長い長さを特徴とする（Muyldermansら、１９９４年、Protein Engineering ７巻（９号）：１１２９頁）。
非ヒト（例えば、マウス）抗体またはＴＣＲの「ヒト化」形態は、非ヒトＩｇまたはＴＣＲに由来する最小配列を含有するキメラ抗体またはＴＣＲを含む。大部分、ヒト化抗体またはＴＣＲは、レシピエントのＣＤＲの１つまたは複数が、所望の特異性、親和性および結合機能を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種の抗体またはＴＣＲ（ドナー抗体またはＴＣＲ）からのＣＤＲによって置換されている、ヒトＩｇまたはＴＣＲ（レシピエント抗体またはＴＣＲ）である。一部の事例では、ヒトＩｇまたはＴＣＲの１つまたは複数のＦＲアミノ酸残基は、対応する非ヒトアミノ酸残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体またはＴＣＲは、レシピエント抗体またはＴＣＲにおいても、ドナー抗体またはＴＣＲにおいても見つけられない残基を含有することがある。これらの修飾は、抗体またはＴＣＲの性能を洗練させるために必要に応じて行うことができる。ヒト化抗体またはＴＣＲは、超可変領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンまたはＴＣＲのものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンまたはＴＣＲ配列のものである、少なくとも１つおよび場合によっては２つの可変ドメインの、実質的にすべてを含むことができる。ヒト化抗体またはＴＣＲは、免疫グロブリンまたはＴＣＲ定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンまたはＴＣＲのものの少なくとも一部分も任意選択で含むことができる。例えば、Jonesら、Nature ３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Reichmannら、Nature ３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびPresta、Curr. Op. Struct. Biol.２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい。
用語「生殖系列配列」は、生殖系列（配偶子、およびそれらが形成される二倍体細胞）からの遺伝子配列を指す。生殖系列ＤＮＡは、単一のＩｇ重鎖もしくは軽鎖または単一のＴＣＲαもしくはＴＣＲβ鎖をコードする、複数の遺伝子セグメントを含有する。これらの遺伝子セグメントは、胚細胞の中に保有されているが、機能性遺伝子に構成されるまでは転写されることも翻訳されることもない。骨髄におけるＢ細胞およびＴ細胞の分化中に、これらの遺伝子セグメントは、１０８より大きい特異性を生じさせることができる動的遺伝子システムによってランダムにシャフリングされる。これらの遺伝子セグメントの大部分は公開されており、生殖系列データベースによって収集されている。
用語「親和性」は、２つの作用因子の可逆的結合についての平衡定数を指し、Ｋｄと表現される。結合タンパク質のリガンドへの親和性、例えば抗体のエピトープへの親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル（ｐＭ）、または約１００ｎＭ〜約１フェムトモル（ｆＭ）であり得る。用語「親和力」は、希釈後の２つまたはそれ超の作用因子の複合体の解離に対する抵抗力を指す。
用語「エピトープ」は、抗体またはＴＣＲの可変領域結合ポケットと結合相互作用を形成することができる、抗原または他の高分子の部分を指す。そのような結合相互作用は、１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数のアミノ酸残基との分子間接触として顕在化され得る。抗原結合には、例えば、ＣＤＲ３、ＣＤＲ３ペア、または場合によっては、最大でＶＨおよびＶＬ鎖の６つのＣＤＲすべての相互作用が関与し得る。エピトープは、直鎖状ペプチド配列（すなわち、「連続」）であってもよく、または非連続アミノ酸配列（すなわち、「立体構造」もしくは「不連続」）であってもよい。抗体またはＴＣＲは、１つまたは複数のアミノ酸配列を認識することができ、したがって、エピトープは、１つより多くの異なるアミノ酸配列を規定することができる。抗体およびＴＣＲによって認識されるエピトープは、当業者に周知のペプチドマッピングおよび配列分析技術によって決定することができる。結合相互作用は、ＣＤＲの１つまたは複数のアミノ酸残基との分子間接触として顕在化される。
用語「特異的」は、抗体またはＴＣＲが、該抗体またはＴＣＲによって認識されるエピトープを含有する抗原以外の分子とのいかなる有意な結合も示さない状況を指す。この用語は、例えば、抗原結合ドメインが、いくつかの抗原によって保有されている特定のエピトープに対して特異的である場合にも適用可能であり、この場合、抗原結合ドメインを保有する選択された抗体、ＴＣＲ、またはその抗原結合断片は、そのエピトープを保有する様々な抗原と結合することができることになる。用語「優先的に結合する」または「特異的に結合する」は、抗体、ＴＣＲまたはその断片が、無関係のアミノ酸配列に結合するより大きい親和性でエピトープと結合すること、およびエピトープを含有する他のポリペプチドと交差反応性である場合には、それらがヒトへの投与に使用するために配合されるレベルで毒性ではないことを意味する。一態様では、そのような親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体、ＴＣＲまたはその断片の親和性より、少なくとも１倍大きいか、少なくとも２倍大きいか、少なくとも３倍大きいか、少なくとも４倍大きいか、少なくとも５倍大きいか、少なくとも６倍大きいか、少なくとも７倍大きいか、少なくとも８倍大きいか、少なくとも９倍大きいか、１０倍大きいか、少なくとも２０倍大きいか、少なくとも３０倍大きいか、少なくとも４０倍大きいか、少なくとも５０倍大きいか、少なくとも６０倍大きいか、少なくとも７０倍大きいか、少なくとも８０倍大きいか、少なくとも９０倍大きいか、少なくとも１００倍大きいか、または少なくとも１０００倍大きい。用語「結合」は、例えば、生理条件下での共有結合性、静電、疎水性およびイオン性および／または水素結合相互作用に起因する、２分子間の直接会合を指し、塩架橋および水架橋などの相互作用、ならびに任意の他の従来の結合手段を含む。
用語「薬学的に許容される」は、ヒトに投与される場合、生理学的に許容され、通常、アレルギー反応または同様の望ましくない反応、例えば、急性胃蠕動、めまいなどを引き起こさない分子実体および組成物を指す。
用語「単位用量」は、治療用組成物に関連して使用されるとき、各々の単位が、必要希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと共同して望ましい治療効果を生じさせるように計算された活性物質の所定量を含有する、ヒトへの単位投薬量として好適な物理的に個別の単位を指す。
用語「包装材料」は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指す。包装材料は、構成要素を無菌で維持することができ、そのような目的で一般に使用される材料（例えば、紙、段ボール繊維、ガラス、プラスチック、箔、アンプルなど）で製造され得る。ラベルまたは添付文書は、適切な指示書を含むことができる。したがって、キットは、本発明のいずれかの方法でキット構成要素を使用するためのラベルまたは指示をさらに含むことができる。キットは、１パックの化合物、またはディスペンサーを、本明細書で説明される方法で化合物を投与するための指示とともに含むことができる。
用語「予防」は、発病予防、症状の発症の予防、過剰なタンパク質レベルに関連するまたはタンパク質活性と相関する疾患または障害の進行の予防を指す。
用語「阻害」、「処置」および「処置すること」は、同義語として使用され、例えば、症状の静止、生存期間の延長、症状の部分的または完全寛解、および過剰なタンパク質レベルに関連するまたはタンパク質活性と相関する状態、疾患または障害の部分的または完全根絶を指す。例えば、がんの処置は、癌性増殖または腫瘍の静止、部分的または完全除去を含むが、これらに限定されない。処置または部分的除去は、例えば、増殖または腫瘍のサイズおよび／または体積のある分数への低減、例えば、約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約１０分の１、約２０分の１、約５０分の１への低減、またはこれらの間の任意の分数への低減を含む。同様に、処置または部分的除去は、増殖または腫瘍のサイズおよび／または体積の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％のパーセント低減、またはこれらの間の任意のパーセンテージ低減を含み得る。
リンパ球の標的を識別する方法
健常な免疫前の対象において、疾患関連抗原を認識するＴ細胞は、排他的にではないが主としてナイーブＴ細胞区画内にある。無感作の人物における抗原特異的Ｔ細胞の出現頻度は、約１×１０−５であり、白血病のＴＩＬを利用する養子免疫治療（ＡＴＣＩ）には約１×１０９個のＴ細胞が必要とされる。したがって、抗原特異的ＡＴＣＩは、抗原特異的Ｔ細胞の大量増殖を必要とし、ヒトの場合、それをｅｘ ｖｉｖｏで行わなければならない。残念なことに、ほとんどのｅｘ ｖｉｖｏ増殖方法は、抗原刺激Ｔ細胞を疲弊させることになり、該Ｔ細胞は、テロメアが短縮され、機能的特質を失う。
進行黒色腫患者の５０％より多くがＡＴＣＩに応答した（Dudleyら、２００５年）。しかし、このアプローチの他のがんへの転換は、上で説明した理由のため、さらに単離できるＴＩＬの数が少ないため、困難であった。ｅｘ ｖｉｖｏ増殖の前に組織から単離することができるＴＩＬの総数は、約５０×１０８、２５×１０８、１０×１０８、５×１０８、１×１０８、５０×１０７、２５×１０７、１０×１０７、５×１０７、１×１０７、５０×１０６、２５×１０６、１０×１０６、５×１０６、１×１０６、５０×１０５、２５×１０５、１０×１０５、５×１０５、１×１０５未満またはそれ未満であり得る。組織から単離される細胞の総数のうち、ＴＩＬのパーセントは、約７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％未満またはそれ未満であり得る。固形腫瘍などの、罹患している組織に浸潤した異なるリンパ球サブタイプの数および比を決定もする現行の方法も、非効率的であり、困難である。固形腫瘍の場合、不正確な比は、疾患の誤った予後予測につながる。
Ｔ細胞発生中での胸腺選択のため、および多くの腫瘍抗原は自己抗原であるため、循環Ｔ細胞は、担がん患者の場合、既に大いに腫瘍抗原に曝露されている。循環Ｔ細胞上で発現される天然ＴＣＲは、一般に、自己抗原に対して低い親和性を有する（ＫＤ範囲１〜１００μＭ）。そのような循環Ｔ細胞は、自家がん細胞への応答性が低い。なぜなら、がん細胞は、一般に、それらの表面で少量のエピトープ／ＨＬＡ複合体を発現するからである。さらに、がん特異的抗原に対して高い親和性を有するＴＩＬの数は、そのような特異性を欠く免疫細胞の大きな数と比較して非常に小さい。がん特異的抗原に対して高い親和性を有するＴＩＬの、そのような特異性を欠く免疫細胞と比較したパーセントは、約５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％未満またはそれ未満であり得る。したがって、疾患特異的抗原に対して高い親和性を有する浸潤Ｔ細胞を、それより指数関数的に多い量の疾患特異的ではないＴ細胞および他の免疫細胞を含有する試料において、識別する方法に対する大きな需要が存在する。
Ｂ細胞およびＴ細胞の数の定量的特性解析は、かなりの数のそのようなリンパ球を容易に単離することができる生体試料、例えば、血液、リンパ液または他の生体液を使用する、機能的に再構成された免疫グロブリンおよびＴＣＲをコードする遺伝子の検出に基づいて果たすことができる。これらの試料中に、Ｂ細胞およびＴ細胞は、懸濁液中の粒子として存在する。しかし、Ｂ細胞およびＴ細胞を容易に単離することができない組織または臓器におけるリンパ球を定量するための現行のアプローチは、はるかに大きく制限される。例えば、固形組織および固形腫瘍試料においてリンパ球を検出するには、小さい非典型的試料における組織学的検出が必要とされる。これらの労働集約的で半定量的な技法は、固定または凍結された生検材料の切片に関する免疫組織化学的検査またはインサイチュハイブリダイゼーションを概して使用する。そのような時間のかかる労働集約的ステップは、取り扱い過程での試料の一部欠損または破壊のため、試料からのリンパ球の回収を妨げることがある。現行アプローチのこれらのおよび関連した制限により、得ることができる定量的データの質が損なわれる。
そのようなアプローチから意味のある定量的データを得る取り組みは、組織に浸潤している可能性のあるリンパ球の数に関しては大幅に制限される。例えば、データ収集が顕微鏡スライド上の有限数の小さい視野の観察により検出することができる事象の数に依存する場合、高い統計的有意性を達成することはできない。さらに、流動免疫細胞蛍光定量分析（flow immunocytofluorimetric analysis）に適している単一細胞懸濁液を生成するために、組織試料を機械的におよび／または酵素的に解離させなければならない。
腫瘍浸潤Ｔ細胞リンパ球は、一部のがん型（例えば、前立腺導管腺癌（ＰＤＡＣ））に関しては徹底的に研究されているが、腫瘍環境でのがん特異的Ｂ細胞の検出および特性解析は、今までのところ依然として実質的に知られていない。さらに、Ｔ細胞に適用される免疫組織化学的技法の制限は、主として後向き臨床研究からのものであり、異なるＴＩＬ集団の詳細な分析、および腫瘍微小環境におけるそれらの機能的特性の評価を妨げる。浸潤Ｔ細胞数の定量的分析は予後予測に使用されるが、疾患特異的Ｔ細胞のＴＣＲ配列を識別する方法に対する需要がなお存在する。
浸潤Ｂ細胞数の定量的分析もまた予後予測に使用されるが、疾患特異的Ｂ細胞のＩｇ配列を識別する方法に対する需要がなお存在する。腫瘍浸潤Ｂリンパ球のＩｇ配列を発見するための試みは最小限にしかなされていない。これらのリンパ球の標的を発見するためになされた試みは（Ｔ細胞とは対照的に）さらに少なく、どれも成功していない。他者による試みの不成功は、罹患試料と正常試料の両方に存在する疾患抗原への特異性のないＢ細胞の元々多い量のため該当する抗体を発見する統計的機会が低いことによって説明することができる。浸潤リンパ球を研究する現行のアプローチは、スループットの低いアプローチであり、生物における免疫レパトアの膨大な数量のため、治療用抗体の産生には効果的ではない。新規疾患関連抗原を識別するために、非常に長期にわたる遺伝子およびタンパク質機能研究が概して行われる。それ故、疾患特異的抗原に対して高い親和性を有する浸潤Ｂ細胞を、それより指数関数的に多い量の非疾患特異的Ｂ細胞および他の免疫細胞を含有する試料において、識別する方法に対する大きな需要が存在する。
疾患特異的ではない多くのリンパ球とリンパ球ではない他の細胞とを含有する複雑な生体試料において疾患特異的リンパ球を識別および選択するための方法に対する需要が明らかに存在する。さらに、疾患特異的リンパ球の標的を識別する方法に対する需要がある。今般説明する事例は、バイオインフォマティクスおよびプロテオミクスアプローチと組み合わせた、偏りのない免疫レパトアのハイスループットで精度の高いスクリーニングを利用して、これらの需要に対処し、他の関連した利点を提供する。
免疫シーケンシング
試料からの核酸を操作してスクリーニング用のポリヌクレオチドのライブラリーを生成する方法が提供される。一般的な意味では、免疫細胞および／またはＴ細胞遺伝物質の増幅、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（逆転写−ＰＣＲ）を用いて、ｃＤＮＡを生成し、リンパ球をはじめとする免疫細胞の遺伝物質を増幅する。一部の事例では、免疫グロブリン配列は、Ｂ細胞の核酸から得られる。一部の事例では、Ｔ細胞受容体配列は、Ｔ細胞の核酸から得られる。一部の事例では、核酸はＲＮＡである。一部の事例では、核酸は、ＩｇＨもしくはＴＣＲβ鎖もしくは（Ｖ、Ｄ、Ｊセグメント）核酸、ＩｇＬもしくはＴＣＲα鎖（Ｖ、Ｊセグメント）核酸、または両方を含む。一部の事例では、核酸は、ＴＣＲγ鎖核酸、ＴＣＲδ鎖核酸、または両方を含む。
試料
試料には、生体試料、環境試料、医学的試料、対象試料もしくは患者試料、またはポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを含有する試料が含まれるが、これらに限定されない。リンパ球を含有するあらゆる生体試料を、開示される方法で使用することができる。ポリヌクレオチドを含有するあらゆる生体試料を、開示される方法で使用することができる。例えば、試料は、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡを含むリンパ球を含有する対象からの生体試料であってもよい。ポリヌクレオチドを生体試料から抽出してもよく、またはポリヌクレオチドを抽出も生成もせずに試料を方法に直接供してもよい。試料は、抽出または単離されたＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。試料はまた、生体検体、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルスまたはゲノムＤＮＡから抽出された全ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。一事例では、ポリヌクレオチドは、タンパク質、脂質および非鋳型核酸などの、様々な他の成分を含有する生体試料から単離される。核酸鋳型分子は、動物、植物、細菌、真菌または任意の他の細胞性生物から得られる、いずれの細胞物質から得てもよい。ある特定の事例では、ポリヌクレオチドは、単一細胞から得られる。ポリヌクレオチドを生物から直接得てもよく、または生物から得た生体試料から得てもよい。開示される方法を使用するシーケンシングのための核酸の源として組織または体液検体を使用してもよい。ポリヌクレオチドを、培養細胞、例えば、初代細胞培養物または細胞株から単離してもよい。核酸が得られる細胞または組織は、罹患していることもあり、またはウイルスもしくは他の細胞内病原体に感染していることもある。
ある特定の事例では、ＴＩＬなどの免疫細胞を、免疫処置を受けたまたは感染症、がん、自己免疫状態もしくはいずれかの他の疾患に罹患している対象または宿主、例えばヒトまたは他の動物から単離して、臨床的意義のある可能性のある病原体特異的、腫瘍特異的および／または疾患特異的抗体を識別することができる。例えば、ヒトは、疾患と診断されることもあり、または疾患の症状を提示していることもある。例えば、ヒトは、感染病原体（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、プリオンなど）、抗原もしくは疾患に曝露される、および／またはそのような感染病原体、抗原もしくは疾患に対して有用なＩｇもしくはＴＣＲを生じさせることができる、ヒトであってもよい。例えば、動物は、感染病原体（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、プリオンなど）、抗原もしくは疾患に曝露される、および／またはそのような感染病原体、抗原もしくは疾患に対して有用な抗体もしくはＴＣＲを生じさせることができる、動物であってもよい。免疫処置を受けた宿主からのある特定の免疫細胞は、問題の１つまたは複数の抗原、例えば、１つまたは複数の未知の抗原に対するＩｇまたはＴＣＲを生じさせる。一部の事例では、ＩｇもしくはＴＣＲ鎖をシーケンシングする、ＩｇもしくはＴＣＲを生じさせる、または発現ライブラリーを作製する前に、免疫細胞ライブラリーなどの試料から複数の免疫細胞を生成するために、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、パニングまたは他のスクリーニング方法を使用する細胞のスクリーニングおよび選別などの任意の好適な方法によって、リンパ球プールを所望の免疫細胞に関して濃縮することができる。一部の事例では、本発明の免疫細胞ライブラリーは、異なる抗体またはＴＣＲを発現する免疫細胞の少なくとも２つのサブセットまたは個々の免疫細胞を含有する。例えば、免疫細胞ライブラリーは、異なるＩｇまたはＴＣＲを発現する免疫細胞の少なくとも５、１０、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１０，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００、１，０００，０００、２，５００，０００、５，０００，０００、７，５００，０００、または１０，０００，０００もしくはそれ超のサブセットまたは個々の免疫細胞を含有することがある。本発明の方法は、免疫細胞シーケンシングを最大にし、非常に高い多様性をもたらす。
一部の事例では、免疫処置を受けていないヒトまたは非ヒトドナーからの免疫細胞が用いられる。動物の無感作レパトア（抗原チャレンジ前のレパトア）は、中等度の親和性（約１×１０−６〜１×１０−７ＭのＫａ）で本質的にあらゆる非自己分子と結合することができる抗体をその動物にもたらす。抗体結合部位の配列多様性は、生殖系列には直接コードされていないが、Ｖ遺伝子セグメントから組合せ的な様式で構築される。免疫処置は、免疫原に結合するＶＨ−ＶＬの組合せ、Ｖα−Ｖβの組合せまたはＶγ−Ｖδの組合せを生じさせるあらゆる免疫細胞による増殖（クローン増殖）および上述の対応する抗体またはＴＣＲの分泌を誘発する。しかし、免疫処置を受けていない、もしくは罹患していない対象からの、または罹患している対象の正常隣接組織からの、脾細胞および／または免疫細胞もしくは他のリンパ球の使用は、対照抗体またはＴＣＲライブラリーの提示をもたらすことができる。これにより、本明細書で一部の事例に関して説明されるようなリンパ球を選択するための罹患ライブラリーと非罹患ライブラリーの比較も可能になる。これにより、任意の動物種を使用するその後のＢ細胞抗体ライブラリーまたはＴ細胞ＴＣＲライブラリーの構築も可能になり得る。
一部の事例では、出発物質は、末梢血である。末梢血細胞を特定の細胞型（例えば、単核細胞、赤血球、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）について濃縮することができる。末梢血細胞を特定の細胞型（例えば、単核細胞、赤血球、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）について選択的に枯渇させることもできる。
一部の事例では、出発物質は、非限定的な例として脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃腺を含む）、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道および胃を含む、血管外組織または固形組織を含む組織試料であってもよい。他の事例では、出発物質は、核酸を含有する細胞、および特に免疫細胞であってもよい。一部の事例では、出発物質は、遺伝物質を得ることができる任意の生物からの、核酸を含有する試料であってもよい。
一部の事例では、試料は、流体、例えば、血液、唾液、リンパ液または尿である。一部の事例では、試験するのに十分な核酸を得るために、少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍＬの血液量が採血される。一部の事例では、試料は、血液試料ではない。一部の事例では、試料は、流体試料ではない。一部の事例では、試料は、固体試料である。
ある状態を有する対象から試料を採取することができる。一部の事例では、試料が採取される対象は、患者、例えばがん患者またはがんを有することが疑われる患者であってもよい。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよく、男性であってもまたは女性であってもよい。一部の事例では、女性は妊娠している。試料は、腫瘍生検材料であってもよい。生検は、例えば、医師、医師助手、看護師、獣医、歯科医、カイロプラクター、救急医療隊員、皮膚科医、腫瘍学者、胃腸科医または外科医を含む、医療提供者によって行われ得る。
一部の事例では、非核酸材料は、酵素的処置（例えば、プロテアーゼ消化）を使用して出発物質から取り出すことができる。
核酸分子には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。核酸分子は、合成のものであってもよく、または天然に存在する源に由来するものであってもよい。一事例では、核酸分子は、タンパク質、脂質および非鋳型核酸などの、様々な他の成分を含有する生体試料から単離される。核酸鋳型分子は、動物、植物、細菌、真菌または任意の他の細胞性生物から得られる、いずれの細胞物質から得てもよい。ある特定の事例では、核酸分子は、単一細胞から得られる。核酸分子を生物から直接得てもよく、または生物から得た生体試料、例えば、血管外組織もしくは固形腫瘍生検材料から得てもよい。いずれの組織または体液検体を、本発明で使用するための核酸の源として使用してもよい。
試料は、生体検体、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルスまたはゲノムＤＮＡから抽出された全ＲＮＡを含み得る。ある特定の事例では、核酸分子は、他の分子、例えばタンパク質、酵素、基質、抗体、結合剤、ビーズ、小分子、ペプチドまたは任意の他の分子などに結合されている。一般に、核酸は、生体試料から、SambrookおよびRussell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring Harbor、N.Y.（２００１年）により記載されたものなどの様々な技法によって抽出することができる。核酸分子は、一本鎖のものであってもよく、二本鎖のものであってもよく、または一本鎖領域を有する二本鎖のもの（例えば、ステム構造およびループ構造）であってもよい。
１つまたは複数の試料は、１つまたは複数の源からのものであってもよい。試料の１つまたは複数は、２つまたはそれ超の源からのものであってもよい。試料の１つまたは複数は、１つまたは複数の対象からのものであってもよい。試料の１つまたは複数は、２つまたはそれ超の対象からのものであってもよい。試料の１つまたは複数は、同じ対象からのものであってもよい。１つまたは複数の対象は、同じ種からの対象であってもよい。１つまたは複数の対象は、異なる種からの対象であってもよい。１つまたは複数の対象は、健常であってもよい。１つまたは複数の対象は、疾患、障害または状態に冒されていてもよい。
ある状態を有する対象から試料を採取することができる。一部の事例では、試料が採取される対象は、患者、例えばがん患者またはがんを有することが疑われる患者であってもよい。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよく、男性であってもまたは女性であってもよい。一部の事例では、女性は妊娠している。試料は、腫瘍生検材料であってもよい。生検は、例えば、医師、医師助手、看護師、獣医、歯科医、カイロプラクター、救急医療隊員、皮膚科医、腫瘍学者、胃腸科医または外科医を含む、医療提供者によって行われ得る。
一部の事例では、ポリヌクレオチドは、他の分子、例えばタンパク質、酵素、基質、抗体、結合剤、ビーズ、小分子、ペプチドまたは任意の他の分子に結合している。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合していない。核酸は、生体試料から様々な技法によって抽出することができる（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring Harbor、N.Y.（２００１年））。
複数の試料は、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００もしくはそれ超の試料を含むことがある。複数の試料は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１，０００もしくはそれ超の試料を含むことがある。複数の試料は、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００またはそれ超の試料を含むことがある。例えば、複数の試料は、少なくとも約１０，０００の試料を含むことがある。
第１の試料が１つまたは複数の細胞を含むことがあり、第２の試料が１つまたは複数の細胞を含むことがある。第１の試料の１つまたは複数の細胞が、第２の試料の１つまたは複数の細胞と同じ細胞型のものであってもよい。第１の試料の１つまたは複数の細胞が、複数の試料の１つまたは複数の異なる細胞と異なる細胞型のものであってもよい。
複数の試料を同時的に得てもよい。複数の試料を同時に得てもよい。複数の試料を逐次的に得てもよい。複数の試料を、１つまたは複数の異なる試料を得てから数年、１００年、１０年、５年、４年、３年、２年または１年にわたって得てもよい。１つまたは複数の試料を、１つまたは複数の異なる試料を得てから約１年以内に得てもよい。１つまたは複数の試料を、１つまたは複数の異なる試料を得てから１２カ月、１１カ月、１０カ月、９カ月、８カ月、７カ月、６カ月、４カ月、３カ月、２カ月または１カ月以内に得てもよい。１つまたは複数の試料を、１つまたは複数の異なる試料を得てから３０日、２８日、２６日、２４日、２１日、２０日、１８日、１７日、１６日、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日または１日以内に得てもよい。１つまたは複数の試料を、１つまたは複数の異なる試料を得てから約２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間または１時間以内に得てもよい。１つまたは複数の試料を、１つまたは複数の異なる試料を得てから約６０秒、４５秒、３０秒、２０秒、１０秒、５秒、２秒または１秒以内に得てもよい。１つまたは複数の試料を、１つまたは複数の異なる試料を得てから約１秒未満以内に得てもよい。
シーケンシング用のポリヌクレオチド
開示される方法は、細胞からのポリヌクレオチド分子などのポリヌクレオチド分子の増幅およびシーケンシングを含む。一部の事例では、本明細書で提供される方法は、ポリヌクレオチド分子の２つまたはそれ超の領域の増幅およびシーケンシングを対象とする。一部の事例では、開示される方法は、２つまたはそれ超のポリヌクレオチド分子の増幅およびシーケンシングを含む。一態様では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一態様では、ポリヌクレオチドは、ゲノム核酸である。特定の生物の染色体内の遺伝物質に由来するＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであり得る。好ましい事例では、ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生された抗体の可変領域を含む配列を含む。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生された抗体の重鎖またはＴＣＲα鎖の可変領域を含む配列を含む。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、免疫細胞により産生された抗体の軽鎖またはＴＣＲβ鎖の可変領域を含む配列を含む。
ポリヌクレオチドを、事実上いかなる源から得てもよく、当技術分野において公知の方法を使用して調製してもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、限定ではないが、生物または細胞（例えば、免疫細胞）からゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの断片を抽出してポリヌクレオチドを得ることを含む、当技術分野において公知の方法を使用して、増幅なしで直接単離することができる。ポリヌクレオチドは、逆転写−ＰＣＲによってＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）から生成されたｃＤＮＡも包含し得る。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ分子であるか、またはｍＲＮＡ分子から産生されたｃＤＮＡである。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞からのｍＲＮＡ分子であるか、またはｍＲＮＡ分子から産生されたｃＤＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞からのｍＲＮＡ分子であるか、またはｍＲＮＡ分子から産生されたｃＤＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞からの抗体またはＴＣＲ配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞からの重鎖抗体またはＴＣＲα鎖配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞からの重鎖抗体またはＴＣＲα鎖配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞からの軽鎖抗体またはＴＣＲβ鎖配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞からの軽鎖抗体またはＴＣＲβ鎖配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞からの抗体またはＴＣＲ可変配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞からの可変抗体またはＴＣＲ配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞からの可変軽鎖抗体またはＴＣＲβ鎖配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞からの可変軽鎖抗体またはＴＣＲβ鎖配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、個々の免疫細胞からの可変重鎖抗体またはＴＣＲα鎖配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、単一の免疫細胞からの可変重鎖抗体またはＴＣＲα鎖配列をコードするｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、無細胞核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
一部の事例では、複数のＩｇおよび／またはＴＣＲポリヌクレオチドがシーケンシングされる。例えば、複数のＶＨおよび／またはＶＬおよび／またはＶαおよび／またはＶβおよび／またはＶγ−Ｖδポリヌクレオチドがシーケンシングされる。一部の事例では、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の免疫グロブリンまたはＴＣＲポリヌクレオチドがシーケンシングされる。一部の事例では、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２の免疫グロブリンまたはＴＣＲポリヌクレオチドがシーケンシングされる。一部の事例では、最大で約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２の免疫グロブリンまたはＴＣＲポリヌクレオチドがシーケンシングされる。一部の事例では、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、５０〜６０、５０〜７０、５０〜８０、５０〜９０、５０〜１００、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７００、１００〜８００、１００〜９００、１００〜１０００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、５００〜９００、５００〜１０００、１０００〜２０００、１０００〜３０００、１０００〜４０００、１０００〜３０００、１０００〜４０００、１０００〜５０００、１０００〜６０００、１０００〜７０００、１０００〜８０００、１０００〜９０００、１０００〜１００００、５０００〜６０００、５０００〜７０００、５０００〜８０００、５０００〜９０００、５０００〜１００００、１〜１×１０５、１〜２×１０５、１〜３×１０５、１〜４×１０５、１〜５×１０５、１〜６×１０５、１〜７×１０５、１〜８×１０５、９×１０５、１〜１×１０６、１〜２×１０６、１〜３×１０６、１〜４×１０６、１〜５×１０６、１〜６×１０６、１〜７×１０６、１〜８×１０６、９×１０６、１×１０７、１〜２×１０７、１〜３×１０７、１〜４×１０７、１〜５×１０７、１〜６×１０７、１〜７×１０７、１〜８×１０７、１〜９×１０７、１〜１×１０８、１〜２×１０８、１〜３×１０８、１〜４×１０８、１〜５×１０８、１〜６×１０８、１〜７×１０８、１〜８×１０８、１〜９×１０８、１〜１×１０９、１〜２×１０９、１〜３×１０９、１〜４×１０９、１〜５×１０９、１〜６×１０９、１〜７×１０９、１〜８×１０９、１〜９×１０９、１〜１×１０１０、１〜２×１０１０、１〜３×１０１０、１〜４×１０１０、１〜５×１０１０、１〜６×１０１０、１〜７×１０１０、１〜８×１０１０、１〜９×１０１０、１〜１×１０１１、１〜２×１０１１、１〜３×１０１１、１〜４×１０１１、１〜５×１０１１、１〜６×１０１１、１〜７×１０１１、１〜８×１０１１、１〜９×１０１１、１〜１×１０１２、１〜２×１０１２、１〜３×１０１２、１〜４×１０１２、１〜５×１０１２、１〜６×１０１２、１〜７×１０１２、１〜８×１０１２、または１〜９×１０１２の免疫グロブリンまたはＴＣＲポリヌクレオチドがシーケンシングされる。
一部の事例では、シーケンシングされる免疫グロブリンまたはＴＣＲポリヌクレオチドは、長さが約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００または２０，０００塩基または塩基対である。一部の事例では、シーケンシングされる免疫グロブリンまたはＴＣＲポリヌクレオチドは、長さが少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００または２０，０００塩基または塩基対である。一部の事例では、シーケンシングされる免疫グロブリンまたはＴＣＲポリヌクレオチドは、長さが最大で約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００または２０，０００塩基または塩基対である。一部の事例では、シーケンシングされる免疫グロブリンまたはＴＣＲポリヌクレオチドは、長さが約１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、５０〜６０、５０〜７０、５０〜８０、５０〜９０、５０〜１００、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７００、１００〜８００、１００〜９００、１００〜１０００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、５００〜９００、５００〜１，０００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜４，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜６，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜８，０００、１，０００〜９，０００、１，０００〜１０，０００、５，０００〜６，０００、５，０００〜７，０００、５，０００〜８，０００、５，０００〜９，０００、または５，０００〜１０，０００塩基または塩基対である。一部の事例では、シーケンシングされる免疫グロブリンもしくはＴＣＲポリヌクレオチド、またはその断片の平均長は、約１００、２００、３００、４００、５００、もしくは８００塩基対未満、または約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００ヌクレオチド未満、または約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００キロ塩基未満であり得る。一部の事例では、比較的短い鋳型からの、シーケンシングされる免疫グロブリンまたはＴＣＲポリヌクレオチドは、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００塩基である。ある特定の事例では、シーケンシングデータは、疾患または状態に関連する配列または免疫グロブリン配列を含有するデータベースを使用して既知または予想配列に対してアラインされる。
一態様では、免疫細胞からの複数のポリヌクレオチド、例えば配列のライブラリー、の各々についての配列を決定するステップを含む方法が開示される。一部の事例では、ポリヌクレオチドは、正常（すなわち、非罹患）試料（正常ライブラリー）の免疫細胞からのものである。一態様では、浸潤免疫細胞からの複数のポリヌクレオチドの各々についての配列を決定するステップを含む方法が開示される。ポリヌクレオチドは、罹患試料（罹患ライブラリー）からの免疫細胞であってもよい。
単一細胞バーコーディング
一部の事例では、方法は、罹患試料の複数のポリヌクレオチドの各々についての配列を決定するステップと、正常試料の複数のポリヌクレオチドの各々についての配列を決定するステップとを含むことがある。方法は、罹患試料からの配列情報を正常試料の配列情報と比較するステップを含むことがある。例えば、ライブラリーの中のポリヌクレオチドをバーコード化する方法と組み合わせたハイスループットシーケンシング技法を使用して、バイオインフォマティクスを使用して罹患試料の数百万〜数兆の配列リードを正常試料と比較することができる。
容器バーコードおよび／または分子バーコードでの単一細胞バーコーディング。油中水型エマルジョンなどの容器を、結果として得られる容器が容器１つ当たり１つまたはそれ未満の細胞を含有するように、作成することができる。容器を、結果として得られる容器が容器１つ当たり１つの容器バーコードを含有するように、作成することができる。容器を、結果として得られる容器が容器１つ当たり１つの分子バーコード化ポリヌクレオチドを含有するように、作成することができる。容器を、結果として得られる容器が容器１つ当たり２つもしくはそれ超の、または複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドを含有するように、作成することができる。細胞／容器を、本明細書で説明されるようなＲＮＡまたはＤＮＡ単一バーコーディングプロトコールに供すことができ、各容器の容器バーコードおよび１つまたは複数の分子バーコードを、目的の標的、例えば細胞ポリヌクレオチドと融合させることができる。一部の事例では、マッチする容器バーコード化ポリヌクレオチドを、１つまたは複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドと同じ容器内に存在する細胞成分に融合させることができる。シーケンシング後、容器バーコードおよび分子バーコード逆重畳積分を使用して、どのＲＮＡ（またはＤＮＡ）の起源がどの細胞であるのかを識別することができる。一部の事例では、油中水型エマルジョンなどの容器を、結果として得られるエマルジョンがエマルジョン１つ当たり１つまたは複数の細胞を含有するように、作成することができる。一部の事例では、油中水型エマルジョンを、結果として得られるエマルジョンが容器１つ当たり１つの容器バーコード化ポリヌクレオチドおよび２つまたはそれ超の分子バーコード化ポリヌクレオチドを含有するように、作成することができる。一部の事例では、容器を、結果として得られる容器が容器１つ当たり１つ超の容器バーコード化ポリヌクレオチドおよび２つまたはそれ超の分子バーコード化ポリヌクレオチドを含有するように、作成することができる。一部の事例では、容器バーコードおよび分子バーコードが溶液中にあるときに、それらを容器に導入することができる。一部の事例では、容器バーコードおよび分子バーコードを、ビーズなどの固体支持体に付着していないときに容器に導入することができる。
一部の態様では、単一細胞を、区画としての機能を果たすことができるエマルジョンの内部に単離することができる。細胞を溶解することができ、細胞からの転写物をバーコード化することができる。転写物の各々と分子バーコードまたは容器バーコードとを、２つまたはそれ超のＲＮＡ転写物が同じ容器バーコードで検出された場合にそれらの起源が同じ出発細胞であったと判定することができるように、融合させることができる。これを多くの異なるタイプの配列に応用することができる。１つの特定の応用は、抗体配列のＶＨ鎖とＶＬ鎖の連結であり得る。１つの特定の応用は、ＴＣＲ配列のＶα鎖とＶβ鎖の連結であり得る。１つの特定の応用は、ＴＣＲ配列のＶγ鎖とＶδ鎖の連結であり得る。
１つまたは複数の単一細胞を、容器バーコードおよび分子バーコードの存在下で１つまたは複数のエマルジョンの中に、該１つまたは複数のエマルジョンの１つの液滴が最大１つまたはそれ未満の細胞を含有し得るように単離することができる。細胞は、エマルジョンに含有されている緩衝液により化学的に溶解されるか、または凍結融解により溶解されることによって、エマルジョンの中の細胞の内容物を放出することができる。
単一細胞のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することができる。逆転写反応は、上で説明したような約３個のシトシン残基を付加させる非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を用いて行うことができる。逆転写緩衝液、酵素およびヌクレオチドのすべてが、エマルジョンの形成時に存在し得る。一部の事例では、プライマーは、すべてのｍＲＮＡを標的にするように一般化されることがある（例えば、ポリｄＴ配列を含むポリヌクレオチド）。一部の事例では、ＤＮＡを使用することができる。一部の事例では、２つより多くのＲＮＡを標的にすることができる。
一部の事例では、容器バーコードを逆転写中にＲＮＡに連結させることができる。一部の事例では、分子バーコードを逆転写中にＲＮＡに連結させることができる。一部の事例では、容器バーコードおよび分子バーコードを逆転写中にＲＮＡに連結させることができる。
逆転写反応を３’タギングポリヌクレオチドの存在下で行うことができる。３’タギングポリヌクレオチドは、シーケンシングプライマーのアニーリングに使用することができるＰ７セグメントを含むことができる。３’タギングポリヌクレオチドは、容器バーコードまたは分子バーコードを含むことができる。３’タギングポリヌクレオチドは、逆転写酵素によって産生される鎖に相補的であってその鎖にアニールされ得る３つのリボグアニン残基（ｒＧｒＧｒＧ）（ＲＮＡ塩基）を３’末端上に含むことができる。したがって、容器バーコードおよび分子バーコードをこの同じエマルジョンの中のｃＤＮＡの末端部に逆転写酵素により付加させることができる。一部の事例では、グアニン残基をリボグアニンの代わりに（ＤＮＡヌクレオチドをＲＮＡヌクレオチドの代わりに）使用することができる。３’タギングポリヌクレオチドをｃＤＮＡ鎖のＣＣＣにアニールすると、逆転写酵素がｃＤＮＡを３’タギングポリヌクレオチドの中に伸長させ続け、その結果、１反応ですべてのｃＤＮＡに対する分子バーコード化タグが作成される。３’タギングポリヌクレオチドを分子バーコード化ｃＤＮＡの領域にアニールすると、逆転写酵素またはポリメラーゼが分子バーコード化ｃＤＮＡを別の３’タギングポリヌクレオチドの中に伸長させ続け、その結果、１反応ですべてのｃＤＮＡに対する容器バーコード化タグが作成される。一部の事例では、逆転写反応を行うことができる同じ時点で鋳型乗り換えを行うのではなく別の反応で行うことができる。一部の事例では、３’タギングポリヌクレオチドを逆転写反応後に付加させることができ、逆転写酵素またはポリメラーゼなどの酵素を使用して同様にタギングポリヌクレオチドの中に伸長させることができる。３’タギングポリヌクレオチドは、各単一分子上に固有の縮重分子バーコードを有することができるため、各ｃＤＮＡに分子バーコードのタグを固有に付けることができる。３’タギングポリヌクレオチドは、単一容器からの各単一分子上に同じ縮重容器バーコードを有することができるため、各ｃＤＮＡに、その容器に固有の容器バーコードのタグを付けることができる。
バーコード
バーコードは、分子バーコードであってもよく、または容器バーコードであってもよい。一部の事例では、バーコード、例えば分子バーコードまたは容器バーコードは、各々、２〜３６ヌクレオチド、４〜３６ヌクレオチド、または６〜３０ヌクレオチド、または８〜２０ヌクレオチド、２〜２０ヌクレオチド、４〜２０ヌクレオチド、または６〜２０ヌクレオチドの範囲内の長さを有することができる。ある特定の態様では、１セットの中のバーコードの融解温度は、もう一方のものの１０℃以内、もう一方のものの５℃以内、またはもう一方のものの２℃以内である。ある特定の態様では、１セットの中のバーコードの融解温度は、もう一方のものの１０℃以内、もう一方のものの５℃以内、またはもう一方のものの２℃以内ではない。他の態様では、バーコードは、最小限にしか交差ハイブリダイズしないセットのメンバーである。例えば、そのようなセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で他のいずれかのメンバーの相補体と安定した二重鎖を形成できるメンバーがないように、そのセットの他のあらゆるメンバーの配列とも十分に異なっていてもよい。一部の事例では、最小限にしか交差ハイブリダイズしないセットの各メンバーのヌクレオチド配列は、あらゆる他のメンバーのものと少なくとも２ヌクレオチド異なる。バーコード技術は、Winzelerら（１９９９年）Science ２８５巻：９０１頁；Brenner（２０００年）Genome Biol.１巻：１頁；Kumarら（２００１年）Nature Rev. ２巻：３０２頁；Giaeverら（２００４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA １０１巻：７９３頁；Easonら（２００４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA １０１巻：１１０４６頁；およびBrenner（２００４年）Genome Biol.５巻：２４０頁に記載されている。
本明細書で使用される場合、分子バーコードは、単一細胞からのまたは単一容器からの単一分子に固有である情報、あるいは２つもしくはそれ超の単一細胞からのまたは２つもしくはそれ超の単一容器からの複数の分子または分子ライブラリーの２つまたはそれ超の分子に固有である情報を含む。本明細書で使用される場合、容器バーコードは、異なる単一細胞からのまたは異なる単一容器からのポリヌクレオチドと比較して、単一細胞からのまたは単一容器からのポリヌクレオチドに固有である情報を含む。一部の事例では、固有の情報は、ヌクレオチドの固有の配列を含む。例えば、分子バーコードまたは容器バーコードの配列は、該分子バーコードまたは容器バーコードを含むヌクレオチドの固有の配列またはランダム配列の同一性および順序を決定することにより決定することができる。一部の事例では、固有の情報は、ポリヌクレオチドの配列を識別するために使用することができない。例えば、分子バーコードを１つのポリヌクレオチドに付着させることができるが、その分子バーコードを使用して、それが付着しているポリヌクレオチドを決定することはできない。一部の事例では、固有の情報は、ポリヌクレオチドの配列の同一性に関連づけられる既知配列ではない。例えば、容器バーコードを１つまたは複数のポリヌクレオチドに付着させることができるが、容器バーコードを使用して、それが１つまたは複数のポリヌクレオチドのうちのどれに付着しているのかを決定することはできない。一部の事例では、固有の情報は、ヌクレオチドのランダム配列を含む。一部の事例では、固有の情報は、ポリヌクレオチド上のヌクレオチドの１つまたは複数の固有の配列を含む。一部の事例では、固有の情報は、縮重ヌクレオチド配列または縮重バーコードを含む。縮重バーコードは、様々なヌクレオチド塩基組成物または配列を含むことができる。例えば、縮重バーコードは、ランダム配列であってもよい。一部の事例では、分子バーコードまたは容器バーコードの相補配列もまた、分子バーコードまたは容器バーコード配列である。
分子バーコードまたは容器バーコードは、あらゆる長さのヌクレオチドを含むことができる。例えば、分子バーコードまたは容器バーコードは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドを含むことができる。例えば、分子バーコードまたは容器バーコードは、最大で約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドを含むことができる。一部の事例では、分子バーコードまたは容器バーコードは、特定の長さのヌクレオチドを有する。例えば、分子バーコードまたは容器バーコードは、長さが約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドであり得る。
一部の事例では、複数の分子バーコードまたは容器バーコード中の各分子バーコードまたは容器バーコードは、少なくとも約２ヌクレオチドを有する。例えば、複数の分子バーコードまたは容器バーコード中の各分子バーコードまたは容器バーコードは、長さが少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドであってもよい。一部の事例では、複数の分子バーコードまたは容器バーコード中の各分子バーコードまたは容器バーコードは、長さが最大で約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドであってもよい。一部の事例では、複数の分子バーコードまたは容器バーコード中の各分子バーコードまたは容器バーコードは、同じ長さのヌクレオチドを有する。例えば、複数の分子バーコードまたは容器バーコード中の各分子バーコードまたは容器バーコードは、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドであってもよい。一部の事例では、複数の分子バーコードまたは容器バーコード中の１つまたは複数の分子バーコードまたは容器バーコードは、異なる長さのヌクレオチドを有する。例えば、複数の分子バーコードまたは容器バーコード中の１つまたは複数の第１の分子バーコードまたは容器バーコードは、約、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドを有することがあり、複数の分子バーコードまたは容器バーコード中の１つまたは複数の第２の分子バーコードまたは容器バーコードは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドを有することがあり、１つまたは複数の第１の分子バーコードまたは容器バーコードのヌクレオチド数は、１つまたは複数の第２の分子バーコードまたは容器バーコードとは異なる。
分子バーコードの数は、複数の容器内の標識されることになる分子の総数を超えていてもよい。容器バーコードの数は、複数の容器内の標識されることになる分子の総数を超えていてもよい。例えば、分子バーコードまたは容器バーコードの数は、複数の容器内の標識されることになる分子の総数より少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍多くてもよい。異なる分子バーコードの数は、複数の容器内の標識されることになる分子の総数を超えていてもよい。一部の事例では、異なる分子バーコードの数は、複数の容器内の標識されることになる分子の総数より少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍多い。単一容器内の異なる分子バーコードの数は、その単一容器内の標識されることになる異なる分子の数を超えていてもよい。一部の事例では、単一容器内の異なる分子バーコードの数は、その単一容器内の標識されることになる異なる分子の数より少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍多い。
異なる容器バーコードの数は、複数の容器内の標識されることになる分子の総数未満であってもよい。一部の事例では、異なる容器バーコードの数は、複数の容器内の標識されることになる分子の総数の少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００分の１である。単一容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチド分子からの増幅産物分子の数は、その単一容器内の標識されることになる異なる分子の数を超えていてもよい。一部の事例では、単一容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチド分子からの増幅産物分子の数は、その単一容器内の標識されることになる異なる分子の数より少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍多い。単一容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、その単一容器内の標識されることになる異なる分子の数未満であってもよい。一部の事例では、単一容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、その単一容器内の標識されることになる異なる分子の数の少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００分の１である。単一容器内の容器バーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、１分子であってもよい。単一容器内の未増幅の容器バーコード化ポリヌクレオチド分子の数は、１分子であってもよい。
一部の事例では、異なる分子バーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％が同じ濃度を有する。一部の事例では、異なる容器バーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％が同じ濃度を有する。一部の事例では、異なる分子バーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％が異なる濃度を有する。一部の事例では、異なる容器バーコードの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％が異なる濃度を有する。
分子バーコードまたは容器バーコードの集団内の分子バーコードまたは容器バーコードは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ超の異なる配列を有することができる。例えば、集団内の分子バーコードまたは容器バーコードは、少なくとも２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００またはそれ超の異なる配列を有することができる。したがって、複数の分子バーコードまたは容器バーコードを使用して、ポリヌクレオチドなどの１つまたは複数のポリヌクレオチドから少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ超の異なる配列を生成することができる。例えば、複数の分子バーコードまたは容器バーコードを使用して、１つまたは複数のポリヌクレオチドから少なくとも２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２またはそれ超の異なる配列を生成することができる。例えば、複数の分子バーコードまたは容器バーコードを使用して少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２またはそれ超の異なる配列を、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２またはそれ超のポリヌクレオチドから生成することができる。
一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用される。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、各ビンの中の配列は、同じ分子バーコードを含有する。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードまたは容器バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、各ビンの中の配列は、アンプリコンセットを含む。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、各ビンの中の配列は複数の配列を含み、この複数の配列が生成されるポリヌクレオチドは、増幅反応において同じポリヌクレオチド分子から誘導される。
一部の事例では、１つまたは複数の容器バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用される。一部の事例では、１つまたは複数の容器バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、各ビンの中の配列は、同じ容器バーコードを含有する。一部の事例では、１つまたは複数の容器バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、各ビンの中の配列は、１つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の事例では、１つまたは複数の容器バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、各ビンの中の配列は複数の配列を含み、この複数の配列が生成されるポリヌクレオチドは、単一容器または単一細胞からのポリヌクレオチドに由来する。
一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードおよび容器バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用される。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードおよび容器バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、各ビンの中の配列は、同じ分子バーコードおよび同じ容器バーコードを含有する。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードおよび容器バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、各ビンの中の配列は、１つまたは複数のアンプリコンセットを含む。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードおよび容器バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、各ビンの中の配列は複数の配列を含み、この複数の配列が生成されるポリヌクレオチドは、増幅反応において同じポリヌクレオチドから誘導され、同じ単一細胞または容器からのポリヌクレオチドに由来する。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードおよび容器バーコードは、配列をアライメントするために使用されない。
一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードは、配列をアライメントするために使用されない。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードは、配列をアライメントするために使用される。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、標的特異的領域が、配列をアライメントするために使用される。一部の事例では、１つまたは複数の容器バーコードは、配列をアライメントするために使用されない。一部の事例では、１つまたは複数の容器バーコードは、配列をアライメントするために使用される。一部の事例では、１つまたは複数の容器バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、標的特異的領域が、配列をアライメントするために使用される。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードおよび容器バーコードは、配列をアライメントするために使用される。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードおよび容器バーコードは、配列をグループ化またはビニングするために使用され、標的特異的領域が、配列をアライメントするために使用される。
一部の事例では、アラインされた配列は、同じ分子バーコードを含有する。一部の事例では、アラインされた配列は、同じ容器バーコードを含有する。一部の事例では、アラインされた配列は、同じ分子バーコードおよび容器バーコードを含有する。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードまたは容器バーコードは、配列をアライメントするために使用され、アラインされた配列は、アンプリコンセットからの２つまたはそれ超の配列を含む。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードまたは容器バーコードは、配列をアライメントするために使用され、アラインされた配列は複数の配列を含み、この複数の配列が生成されるポリヌクレオチドは、増幅反応において同じポリヌクレオチド分子から誘導される。一部の事例では、１つまたは複数の分子バーコードまたは容器バーコードは、配列をアライメントするために使用され、アラインされた配列は複数の配列を含み、この複数の配列が生成されるポリヌクレオチドは、単一細胞または単一容器に由来する。
液滴生成
複数の細胞からの個々の細胞からのまたはそれに由来するポリヌクレオチドの分子および容器バーコーディングと組み合わせた、複数の細胞の試料の小さい反応容積への分割は、バイオマーカー配列などの配列レパトアのハイスループットシーケンシングを可能にすることができる。
複数の細胞からの個々の細胞からのまたはそれに由来するポリヌクレオチドの分子および容器バーコーディングと組み合わせた、複数の細胞の試料の小さい反応容積への分割は、生物のトランスクリプトームのあるパーセンテージに相当する配列などの、配列レパトアのハイスループットシーケンシングを可能にすることができる。例えば、配列のレパトアは、生物のトランスクリプトームの少なくとも約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１０％、０．０００５０％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％に相当する複数の配列を含むことができる。
複数の免疫細胞からの個々の免疫細胞からのまたはそれに由来するポリヌクレオチドの分子および容器バーコーディングと組み合わせた、免疫細胞の試料の小さい反応容積への分割は、重鎖および軽鎖配列またはＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖配列のライブラリーまたはレパトアのハイスループットシーケンシングを可能にすることができる。これらの方法は、バーコード化配列に基づくシーケンシング後の重鎖と軽鎖またはＴＣＲαとＴＣＲβ鎖のペアリングも可能にすることができる。本明細書で説明されるような小さい反応容積への試料の分割は、低減量の試薬の使用を可能にすることもでき、その結果、分析の材料費が低下する。
一部の事例では、逆転写反応および／または増幅反応（例えば、ＰＣＲ）が液滴中で、例えば液滴デジタルＰＣＲで行われる。ある特定の態様では、本発明は、標的材料のすべてまたは一部分を含有するための流体区画を提供する。一部の事例では、区画は液滴である。本明細書を通して「液滴」に言及しているが、この用語は、別段の指示がない限り、流体区画または容器および流体パーティションと同義語として使用されている。別段の指示がある場合を除き、便宜上「液滴」が使用され、あらゆる流体パーティションまたは区画を使用することができる。本明細書で使用される液滴は、米国特許第７，６２２，２８０号に記載されているものなどのエマルジョン組成物（または２つもしくはそれ超の不混和性流体の混合物）を含むことができる。液滴は、ＷＯ／２０１０／０３６３５２に記載されているデバイスによって生成することができる。用語エマルジョンは、本明細書で使用される場合、不混和性の液体（例えば、油と水）の混合物を指すことができる。油相および／または油中水型エマルジョンは、水性液滴の中での反応混合物の区画化を可能にする。エマルジョンは、連続油相の中に水性の液滴を含むことができる。本明細書で提供されるエマルジョンは、液滴が連続水性相の中の油滴である水中油型エマルジョンであり得る。本明細書で提供される液滴は、区画間での混合を防止するように設計されており、各区画が、その内容物を蒸発しないようにおよび他の区画の内容物と合体しないように保護する。
本明細書で説明される混合物またはエマルジョンは、安定性であることもあり、または不安定性であることもある。エマルジョンは、比較的安定性であり、極わずかな合体しか有さないことがある。合体は、小さい液滴が合わさり、漸進的により大きいものを形成すると起こる。一部の事例では、液滴生成器から生成された液滴の０．００００１％、０．００００５％、０．０００１０％、０．０００５０％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％未満が、他の液滴と合体する。エマルジョンはまた、分散相が懸濁液からフレークとして出現するプロセスである綿状沈殿を限定的にしか起こさない可能性がある。
約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００もしくは５００ミクロン、それら未満、またはそれら超、または少なくともそれら以上の平均直径を有する液滴を生成することができる。液滴は、約０．００１〜約５００、約０．０１〜約５００、約０．１〜約５００、約０．１〜約１００、約０．０１〜約１００、または約１〜約１００ミクロンの平均直径を有することができる。マイクロチャネルクロスフローフォーカシングまたは物理的撹拌を使用してエマルジョン液滴を生じさせるマイクロ流体法が単分散または多分散エマルジョンのどちらかを生じさせることは公知である。液滴は、単分散液滴であってもよい。液滴を、該液滴のサイズが該液滴の平均サイズのプラスまたはマイナス５％より大きく異ならないように、生成することができる。一部の事例では、液滴は、該液滴のサイズが該液滴の平均サイズのプラスまたはマイナス２％より大きく異ならないように生成される。液滴生成器は、いかなる液滴もサイズが全液滴集団の平均サイズのプラスまたはマイナス約０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％または１０％より大きく異ならない液滴の集団を、単一の試料から生成することができる。
より高い機械的安定性は、マイクロ流体操作およびより高せん断の流体加工（例えば、マイクロ流体毛管でのもの、または流路内の９０度回転、例えば弁によるもの）に有用であり得る。前および後熱処理された液滴またはカプセルは、標準ピペット操作および遠心分離に対して機械的安定性であり得る。
液滴は、水性試料を通して油相を流すことにより形成することができる。水性相は、緩衝溶液と増幅反応を行うための試薬とを含むことがあり、該試薬には、細胞、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子バーコード化ポリヌクレオチド、容器バーコード化ポリヌクレオチド、プライマー、鋳型核酸ならびに酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素が含まれる。
水性相は、緩衝溶液と、ビーズなどの固体表面を用いてまたは用いずに増幅反応を行うための試薬とを含むことがある。緩衝溶液は、約１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００もしくは２００ｍＭ、それら超、またはそれら未満のＴｒｉｓを含んでいてもよい。一部の事例では、塩化カリウムの濃度は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００ｍＭ、それら超、またはそれら未満であってもよい。緩衝溶液は、約１５ｍＭ Ｔｒｉｓおよび５０ｍＭ ＫＣｌを含んでいてもよい。ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含むデオキシリボヌクレオチド三リン酸分子を、各々、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００μＭ、それら超、またはそれら未満の濃度で含んでいてもよい。一部の事例では、ｄＵＴＰが約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００、８００、９００もしくは１０００μＭ、それら超、またはそれら未満の濃度まで水性相の中に添加される。一部の事例では、塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウム（ＭｇＣｌ２）が約１．０、２．０、３．０、４．０もしくは５．０ｍＭ、それら超、またはそれら未満の濃度で水性相に添加される。一部の事例では、酢酸マグネシウムまたはマグネシウムが使用される。一部の事例では、硫酸マグネシウムが使用される。
非特異的ブロッキング剤、例えば、ＢＳＡ、またはウシの皮膚からのゼラチンが使用されることがあり、その場合、ゼラチンまたはＢＳＡは、おおよそ０．１〜１％ｗ／ｖの濃度範囲で存在する。他の可能なブロッキング剤としては、ベータラクトグロブリン、カゼイン、粉乳、または他の一般的なブロッキング剤を挙げることができる。一部の事例では、ＢＳＡおよびゼラチンの好ましい濃度は、約０．１％ｗ／ｖである。
水性相の中での増幅のためのプライマーは、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７もしくは２．０μＭ、それら超、またはそれら未満の濃度を有してもよい。水性相中のプライマー濃度は、約０．０５〜約２、約０．１〜約１．０、約０．２〜約１．０、約０．３〜約１．０、約０．４〜約１．０、または約０．５〜約１．０μＭであってもよい。プライマーの濃度は、約０．５μＭであってもよい。ＰＣＲにおいて受け入れられる核酸濃度範囲は、約１ｐｇから約５００ｎｇまでを含むが、これに限定されない。
一部の事例では、水性相は添加剤も含むことがあり、該添加剤には、非特異的バックグラウンド／ブロッキング核酸（例えば、サケ精子ＤＮＡ）、バイオ保存料（例えば、アジ化ナトリウム）、ＰＣＲエンハンサー（例えば、ベタイン、トレハロースなど）および阻害剤（例えば、ＲＮアーゼ阻害剤）が含まれるが、これらに限定されない。他の添加剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ベタイン（一）水和物（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン＝［カルボキシ−メチル］トリメチルアンモニウム）、トレハロース、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン三リン酸（ｄＣ７ＧＴＰまたは７−デアザ−２’−ｄＧＴＰ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ホルムアミド（メタンアミド）、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、他のテトラアルキルアンモニウム誘導体（例えば、テトラエチルアンモニウムクロリド（tetraethyammonium chloride）（ＴＥＡ−Ｃｌ）およびテトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰｒＡ−Ｃｌ））、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０））、またはＰＲＥＸＣＥＬ−Ｑを挙げることができる。一部の事例では、水性相は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の異なる添加剤を含むことがある。他の事例では、水性相は、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の異なる添加剤を含むことがある。
一部の事例では、非イオン性エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマーを水性相に約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％または１．０％の濃度で添加してもよい。一般的なバイオ界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｚｏｎｙｌ ＦＳＮが挙げられる。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８は、約０．５％ｗ／ｖの濃度で存在してもよい。
一部の事例では、硫酸マグネシウムを塩化マグネシウムの代わりに同様の濃度で使用してもよい。様々な供給業者からの多種多様な一般的、商用ＰＣＲ緩衝液を、緩衝溶液の代わりに使用してもよい。
エマルジョンは、加熱によって固体様界面膜を有するマイクロカプセルに変換され得る、液体様界面膜を有する高単分散液滴を生じさせるように配合されることがあり、そのようなマイクロカプセルは、ＰＣＲ増幅などの反応工程を通してそれらの内容物を保持することができるバイオリアクターとして挙動することができる。マイクロカプセル形態への変換は、加熱すると起こり得る。例えば、そのような変換は、約５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃または９５℃より高い温度で起こり得る。一部の事例では、この加熱は、サーモサイクラーを使用して行われる。加熱工程中、流体または鉱油オーバーレイを使用して蒸発を防止することができる。過剰な連続相の油を加熱前に除去してもよく、またはしなくてもよい。生体適合性カプセルは、広範な熱および機械加工にわたって耐合体性および／または耐綿状沈殿性であることができる。変換後、カプセルを約３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃もしくは４０℃、それら超、またはそれら未満で保存してもよい。
マイクロカプセルは、１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有することができ、特に高温で、耐合体性があり得る。したがって、ＰＣＲ増幅反応を非常に高い密度（例えば、単位容積当たりの反応の数）で行うことができる。一部の事例では、１ｍｌ当たり１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、２，５００，０００、５，０００，０００または１０，０００，０００より多くの別々の反応を行うことができる。一部の事例では、反応は、反応容積間の混合のない単一ウェル、例えば、マイクロタイタープレートのウェルで行われる。マイクロカプセルは、逆転写、プライマー伸長および／またはＰＣＲ反応を行うことができるようにするために必要な他の成分、例えば、プライマー、プローブ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ、またはＲＮＡポリメラーゼなども含有することができる。これらのカプセルは、広範な熱および機械加工にわたって耐合体性および耐綿状沈殿性を示す。
一部の事例では、増幅ステップは、マイクロ流体ベースのデジタルＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲなどの、デジタルＰＣＲを行うことによって実行される。
液滴は、マイクロ流体システムまたはデバイスを使用して生成することができる。本明細書で使用される場合、「マイクロ」という接頭辞（例えば、「マイクロチャネル」または「マイクロ流体の」の場合のもの）は、一般に、約１ｍｍ未満、および場合によっては約１００ミクロン（マイクロメートル）未満の幅または直径を有する要素または物品を指す。一部の事例では、要素または物品は、流体が流れることができるチャネルを含む。加えて、「マイクロ流体の」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つのマイクロスケールのチャネルを含むデバイス、装置またはシステムを指す。
マイクロ流体システムおよびデバイスは、様々な関連で、典型的には小型化検査室（例えば、臨床）分析との関連で説明されている。他の使用も説明されている。例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２００１／８９７８８、ＷＯ２００６／０４０５５１、ＷＯ２００６／０４０５５４、ＷＯ２００４／００２６２７、ＷＯ２００８／０６３２２７、ＷＯ２００４／０９１７６３、ＷＯ２００５／０２１１５１、ＷＯ２００６／０９６５７１、ＷＯ２００７／０８９５４１、ＷＯ２００７／０８１３８５およびＷＯ２００８／０６３２２７。
液滴は、一般に、第２の分散媒中の第１の試料流体の量を含む。液滴を形成するための当技術分野において公知のいずれの技法を本発明の方法とともに使用してもよい。例示的な方法は、標的材料（例えば、免疫細胞）を含有する試料流体の流れを、流れている分散媒の２つの対向する流れを横断するように流すステップを含む。分散媒は、試料流体と不混和性である。試料流体と流れている分散媒の２つの対向する流れとの交差は、標的材料を含有する個々の試料液滴内に試料流体を分配する結果となる。
分散媒は、試料流体と不混和性であるいずれの流体であってもよい。例示的な分散媒は、油である。ある特定の事例では、分散媒は、界面活性剤を含む。
同じ方法を、他の試薬、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは非ＰＣＲベースの増幅反応、例えば複数鎖置換（multi-strand displacement）増幅、などの増幅反応のための試薬、または当業者に公知の他の方法のための試薬を含有する個々の液滴の作成に適用することができる。ＰＣＲベースの増幅反応を行うのに好適な試薬は当業者に公知であり、これらに限定されるものではないが、ＤＮＡポリメラーゼ、フォワードおよびリバースプライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）および１つまたは複数の緩衝液を含む。
ある特定の事例では、流体区画は、標的材料（例えば、免疫細胞および／または固体支持体、例えばビーズ）を含む第１の流体パーティション（例えば、液滴）および（例えば、流体流としての、または液滴内の）第２の流体の１つまたは複数を提供することによって形成される。第１および第２の流体が合流されて液滴を形成する。合流を、２つの流体への電場の印加によって果たしてもよい。ある特定の事例では、第２の流体は、ポリメラーゼ連鎖反応または増幅反応などの増幅反応を行うための試薬を含有する。
逆転写
一部の事例では、シーケンシング用のポリヌクレオチドは、ＲＮＡから逆転写によって調製される。一部の事例では、シーケンシング用のポリヌクレオチドは、ＤＮＡからプライマー伸長によって、例えばポリメラーゼを使用して調製される。
本明細書で説明される方法は、連結型逆転写−ＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）において使用することができる。例えば、逆転写およびＰＣＲを２つの異なるステップで行うことができる。例えば、試料ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーは、ポリヌクレオチドｄＴプライマー、配列特異的プライマー、ユニバーサルプライマー、または本明細書で説明されるいずれかのプライマーのうちのいずれかを使用して合成することができる。
逆転写およびＰＣＲを単一密閉容器反応で行うことができる。例えば、１つが逆転写用および２つがＰＣＲ用の、３つのプライマーを用いることができる。逆転写用のプライマーは、ＰＣＲアンプリコンの位置の３’側のｍＲＮＡと結合することができる。必要不可欠ではないが、逆転写プライマーは、ｍＲＮＡとハイブリダイズしたときにＲＮアーゼＨの基質にならないＲＮＡ残基または修飾類似体、例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基を含むことができる。
逆転写反応を行う温度は、使用される逆転写酵素に依存する。一部の事例では、熱安定性逆転写酵素が使用され、逆転写反応は、約３７℃〜約７５℃で、約３７℃〜約５０℃で、約３７℃〜約５５℃で、約３７℃〜約６０℃で、約５５℃〜約７５℃で、約５５℃〜約６０℃で、約３７℃で、または約６０℃で行われる。一部の事例では、３つまたはそれ超の非鋳型末端ヌクレオチドを転写産物の末端に移す逆転写酵素が使用される。
本明細書で説明される逆転写反応およびＰＣＲ反応は、当技術分野において公知の様々な形式、例えば、チューブ、マイクロタイタープレート、マイクロ流体デバイス、または好ましくは液滴内で行うことができる。
逆転写反応を５μＬ〜１００μＬにわたる容積で行ってもよく、または１０μＬ〜２０μＬ反応容積で行ってもよい。液滴の場合、反応容積は、１ｐＬ〜１００ｎＬ、または１０ｐＬ〜１ｎＬにわたり得る。一部の事例では、逆転写反応は、約１ｎＬまたはそれ未満である容積を有する液滴内で行われる。一部の事例では、ＰＣＲ反応は、１ｐＬ〜１００ｎＬ、好ましくは１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を有する液滴内でなされる。一部の事例では、ＰＣＲ反応は、約１ｎＬまたはそれ未満である容積を有する液滴内で行われる。一部の事例では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、１ｐＬ〜１００ｎＬまたは１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を有する同じ液滴内で行われる。一部の事例では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、約１ｎＬもしくはそれ未満である容積または約１ｐＬもしくはそれ未満である容積を有する液滴内で行われる。一部の事例では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、異なる液滴内で行われる。一部の事例では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、１ｐＬ〜１００ｎＬまたは１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を各々が有する複数の液滴内で行われる。一部の事例では、逆転写反応およびＰＣＲ反応は、約１ｎＬまたはそれ未満である容積を各々が有する複数の液滴内で行われる。
一部の事例では、第１のＰＣＲ反応は、１ｐＬ〜１００ｎＬ、好ましくは１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を有する第１の液滴内でなされ、第２のＰＣＲ反応は、１ｐＬ〜１００ｎＬ、好ましくは１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を有する第２の液滴内でなされる。一部の事例では、第１のＰＣＲ反応は、約１ｎＬまたはそれ未満である容積を有する第１の液滴内でなされ、第２のＰＣＲ反応は、約１ｎＬまたはそれ未満である容積を有する第２の液滴内でなされる。
一部の事例では、第１のＰＣＲ反応および第２のＰＣＲ反応は、１ｐＬ〜１００ｎＬまたは１０ｐＬ〜１ｎＬの反応容積範囲を各々が有する複数の液滴内で行われる。一部の事例では、第１のＰＣＲ反応および第２のＰＣＲ反応は、約１ｎＬまたはそれ未満である容積を各々が有する複数の液滴内で行われる。
ＲＮＡを、１つまたは複数の逆転写プライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写することができる。１つまたは複数の逆転写プライマーは、定常領域（例えば、ｍＲＮＡの重鎖もしくは軽鎖定常領域またはポリＡテール）などのＲＮＡの領域に相補的な領域を含むことがある。一部の事例では、逆転写プライマーは、第１のＲＮＡの定常領域に相補的な領域を有する第１の逆転写プライマー、および第２のＲＮＡの定常領域に相補的な領域を有する第２の逆転写プライマーを含むことがある。一部の事例では、逆転写プライマーは、第１のＲＮＡの定常領域に相補的な領域を有する第１の逆転写プライマー、および１つまたは複数のＲＮＡの定常領域に相補的な領域をそれぞれ有する１つまたは複数の逆転写プライマーを含むことがある。
一部の事例では、逆転写プライマーは、バーコードを含まない。一部の事例では、逆転写プライマーは、バーコードを含む。
逆転写プライマーは、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域をさらに含むことがある。一部の事例では、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域は、ＲＮＡに相補的であるプライマーの領域の５’側にある。一部の事例では、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域は、ＲＮＡに相補的であるプライマーの領域の３’側にある。一部の事例では、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域は、５’オーバーハング領域である。一部の事例では、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域は、増幅および／またはシーケンシング反応のプライミング部位を含む。一部の事例では、ｃＤＮＡ分子を分子バーコードおよび容器バーコードでバーコード化し、１つまたは複数のＰＣＲ反応、例えば、第１および／または第２のＰＣＲ反応により増幅させることができる。第１および／または第２のＰＣＲ反応は、１つのプライマーペアを用いることもあり、または複数のプライマーペアを用いることもある。第１および／または第２のＰＣＲ反応は、複数のフォワード／リバースプライマーおよび１つのリバースプライマーを用いることがある。第１および／または第２のＰＣＲ反応は、複数のフォワード／リバースプライマーおよび１つのフォワードプライマーを用いることがある。複数のフォワード／リバースプライマーの第１および／または第２のプライマーは、ｃＤＮＡ分子またはバーコード化ｃＤＮＡ分子に相補的な領域を含有するフォワード／リバースプライマーであってもよい。複数のフォワード／リバースプライマーの第１および／または第２のプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡ分子に相補的な領域を含有するフォワード／リバースプライマーであってもよい。
一部の事例では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、この場合、複数のフォワード／リバースプライマーの中のフォワード／リバースプライマーの各々は、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマーと、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーとを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマーと、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーとを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマーと、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーと、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＶセグメントの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマー、などを含む。複数のフォワード／リバースプライマーの中のプライマーは、試料中の細胞、例えば、免疫細胞、例えばＢ細胞およびＴ細胞によって発現されるすべてのＶセグメントのすべての可能な上流または下流領域へのアニーリングに使用することができる。
一部の事例では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、この場合、複数のフォワード／リバースプライマーの中のフォワード／リバースプライマーの各々は、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマーと、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーとを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマーと、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーとを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマーと、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーと、ｃＤＮＡまたはバーコード化ｃＤＮＡのＣセグメントの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマー、などを含む。複数のフォワード／リバースプライマーの中のプライマーは、試料中の細胞、例えば、免疫細胞、例えばＢ細胞によって発現されるすべてのＣセグメントのすべての可能な上流または下流領域へのアニーリングに使用することができる。
一部の事例では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、この場合、複数のフォワード／リバースプライマーの中のフォワード／リバースプライマーの各々は、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマーと、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーとを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマーと、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーとを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマーと、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーと、バーコード化ｃＤＮＡの分子バーコードの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマー、などを含む。複数のフォワード／リバースプライマーの中のプライマーは、試料中の細胞、例えば、免疫細胞、例えばＢ細胞およびＴ細胞によって発現されるすべての分子バーコードのすべての可能な上流または下流領域へのアニーリングに使用することができる。
一部の事例では、複数のフォワード／リバースプライマーは、１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーを含み、この場合、複数のフォワード／リバースプライマーの中のフォワード／リバースプライマーの各々は、バーコード化ｃＤＮＡの容器バーコードの１つまたは複数の上流または下流領域に相補的な領域を含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの容器バーコードの上流または下流領域に相補的な領域を含むフォワード／リバースプライマーと、バーコード化ｃＤＮＡの容器バーコードの１つまたは複数の他の上流または下流領域に相補的な領域を含む１つまたは複数の他のフォワード／リバースプライマーとを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの容器バーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマーと、バーコード化ｃＤＮＡの容器バーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーとを含む。例えば、複数のフォワード／リバースプライマーは、バーコード化ｃＤＮＡの容器バーコードの第１および／または第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第１および／または第２のフォワード／リバースプライマーと、バーコード化ｃＤＮＡの容器バーコードの第２の上流または下流領域に相補的な領域を含む第２のフォワード／リバースプライマーと、バーコード化ｃＤＮＡの容器バーコードの第３の上流または下流領域に相補的な領域を含む第３のフォワード／リバースプライマーなどを含む。複数のフォワード／リバースプライマーの中のプライマーは、試料中の細胞、例えば、免疫細胞、例えばＢ細胞およびＴ細胞によって発現されるすべての容器バーコードのすべての可能な上流または下流領域へのアニーリングに使用することができる。
複数のフォワード／リバースプライマーの中のフォワード／リバースプライマーは、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域をさらに含む。一部の事例では、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域は、ＲＮＡに相補的であるフォワード／リバースプライマーの領域（すなわち、Ｖセグメントの上流または下流領域）の５’側にある。一部の事例では、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域は、ＲＮＡに相補的であるフォワード／リバースプライマーの領域の３’側にある。一部の事例では、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域は、５’オーバーハング領域である。一部の事例では、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域は、増幅および／または第２のシーケンシング反応のプライミング部位を含む。一部の事例では、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域は、増幅および／または第３のシーケンシング反応のプライミング部位を含む。一部の事例では、ＲＮＡの領域に相補的ではない領域は、第２および第３のシーケンシング反応のプライミング部位を含む。一部の事例では、第２および第３のシーケンシング反応のプライミング部位の配列は同じである。本明細書で説明されるような１つまたは複数のフォワード／リバースプライマーおよび１つのリバースプライマーを使用して、当技術分野において公知の好適な試薬を使用してｃＤＮＡ分子が増幅される。一部の事例では、領域は、ＲＮＡの領域、例えば、ｍＲＮＡの定常領域またはポリＡテールに相補的である。
増幅
熱サイクリング反応を、反応容積（例えば、液滴）に含有されている試料で行うことができる。プライマー伸長を触媒するいずれのＤＮＡポリメラーゼを使用してもよく、そのようなＤＮＡポリメラーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）、ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシーケナーゼが含まれるが、これらに限定されない。一部の事例では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用される。反応がポリメラーゼ添加の前に２分間、９５℃に加熱される、またはポリメラーゼがサイクル１の第１の加熱ステップまで不活性のまま保持され得る、ホットスタートＰＣＲを行うこともできる。ホットスタートＰＣＲを使用して非特異的増幅を最小にすることができる。あらゆる数のＰＣＲサイクル、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４もしくは４５サイクル、それら超、またはそれら未満を使用して、ＤＮＡを増幅することができる。増幅サイクル数は、約１〜４５、１０〜４５、２０〜４５、３０〜４５、３５〜４５、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１５、２０〜３５、２５〜３５、３０〜３５、または３５〜４０であってもよい。
核酸の増幅は、当技術分野において公知のいずれの手段によって行ってもよい。核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅してもよく、または等温ＤＮＡ増幅によって増幅してもよい。使用することができるＰＣＲ技法の例としては、定量的ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／逆転写−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、インサイチュコロニーＰＣＲ（in situ polony PCR）、インサイチュローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲおよびエマルジョンＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、分子反転プローブ（ＭＩＰ）ＰＣＲ、自家持続配列複製法、ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、任意プライムドポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、縮重ポリヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）および核酸ベース配列増幅（ＮＡＢＳＡ）が挙げられる。本明細書で使用することができる他の増幅方法には、米国特許第５，２４２，７９４号、同第５，４９４，８１０号、同第４，９８８，６１７号および同第６，５８２，９３８号に記載されているものが含まれ、Ｑベータレプリカーゼ介在ＲＮＡ増幅も含まれる。増幅は、等温増幅、例えば、等温線形増幅であってもよい。
一部の事例では、増幅は、固体支持体上で行われない。一部の事例では、増幅は、液滴内では固体支持体上で行われない。一部の事例では、増幅は、液滴内で行われない場合、固体支持体上で行われる。
増幅反応は、１つまたは複数の添加剤を含むことがある。一部の事例では、１つまたは複数の添加剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ベタイン（一）水和物（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン＝［カルボキシ−メチル］トリメチルアンモニウム）、トレハロース、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン三リン酸（ｄＣ７ＧＴＰまたは７−デアザ−２’−ｄＧＴＰ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ホルムアミド（メタンアミド）、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、他のテトラアルキルアンモニウム誘導体（例えば、テトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡ−Ｃｌ）およびテトラプロピルアンモニウムクロリド（ＴＰｒＡ−Ｃｌ））、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０））、またはＰＲＥＸＣＥＬ−Ｑである。一部の事例では、増幅反応は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の異なる添加剤を含むことがある。他の事例では、増幅反応は、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の異なる添加剤を含むことがある。
プライマー
１つまたは複数のプライマーペアを増幅反応で使用することができ、プライマーペアの一方のプライマーはフォワードプライマーであってもよく、およびプライマーペアの一方のプライマーは、リバースプライマーであってもよい。
一部の事例では、第１のプライマーペアを増幅反応に使用することがあり、第１のペアの一方のプライマーは、第１のポリヌクレオチド分子の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、および第１のペアの一方のプライマーは、第１のポリヌクレオチド分子の第２の配列に相補的であり得るリバースプライマーであってもよく、および第１の座位が第１の配列と第２の配列の間に存在してもよい。一部の事例では、第１の座位は、ＶＨ配列を含む。一部の事例では、第２の座位は、Ｖα配列を含む。一部の事例では、第２の座位は、Ｖγ配列を含む。
一部の事例では、第２のプライマーペアを増幅反応に使用することがあり、第２のペアの一方のプライマーは、第２のポリヌクレオチド分子の第１の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、および第２のペアの一方のプライマーは、第２のポリヌクレオチド分子の第２の配列に相補的なリバースプライマーであってもよく、および第２の座位が第１の配列と第２の配列の間に存在してもよい。一部の事例では、第２の座位は、ＶＬ配列を含む。一部の事例では、第２の座位は、Ｖβ配列を含む。一部の事例では、第２の座位は、Ｖδ配列を含む。
一部の事例では、第３のプライマーペアを増幅反応に使用することがあり、第３のペアの一方のプライマーは、第３のポリヌクレオチド分子の第１の配列に相補的なフォワードプライマーであってもよく、および第３のペアの一方のプライマーは、第３のポリヌクレオチド分子の第２の配列に相補的なリバースプライマーであってもよく、および第３の座位が第１の配列と第２の配列の間に存在してもよい。一部の事例では、第３の座位は、分子バーコードまたは容器バーコードなどのバーコードを含む。
フォワードプライマーおよびリバースプライマーの長さは、ポリヌクレオチドの配列および座位に依存し得る。例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの長さおよび／またはＴＭを最適化することができる。場合により、プライマーは、長さが約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ヌクレオチド、それら超、またはそれら未満であってもよい。一部の事例では、プライマーは、長さが約１５〜約２０、約１５〜約２５、約１５〜約３０、約１５〜約４０、約１５〜約４５、約１５〜約５０、約１５〜約５５、約１５〜約６０、約２０〜約２５、約２０〜約３０、約２０〜約３５、約２０〜約４０、約２０〜約４５、約２０〜約５０、約２０〜約５５、または約２０〜約６０ヌクレオチドである。
プライマーは、ポリヌクレオチドに結合する前、一本鎖ＤＮＡであってもよい。一部の事例では、プライマーは、最初は二本鎖配列を含む。短いプライマー分子ほど、一般に、ポリヌクレオチドと十分に安定したハイブリッド複合体を形成するのに低い温度を必要とし得る。一部の事例では、プライマーは、ポリヌクレオチドの正確な配列を反映する必要はないが、ポリヌクレオチドとハイブリダイズするのに十分なほど相補的であり得る。一部の事例では、プライマーは、ポリヌクレオチドと結合する前、部分的に二本鎖のものであってもよい。二本鎖配列を有するプライマーは、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０塩基、それら超、またはそれら未満のヘアピンループを有してもよい。プライマーの二本鎖部分は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０塩基対、それら超、それら未満、または少なくともそれら以上であってもよい。所与のポリヌクレオチドの増幅に好適なプライマーの設計は、当技術分野において周知である。
プライマーは、該プライマーの検出または固定化を可能にするが、該プライマーの基本的特性（例えば、ＤＮＡ合成の開始点として作用する）を変化させない、さらなる特徴を取り入れることができる。例えば、プライマーは、核酸にハイブリダイズしないがクローニングもしくはさらなる増幅または増幅産物のシーケンシングを助長する追加の核酸配列を、５’末端に含有することができる。例えば、追加の配列は、ユニバーサルプライマー結合部位などの、プライマー結合部位を含むことがある。ポリヌクレオチドにハイブリダイズするのに十分なほど相補的であるプライマーの領域は、本明細書では、ハイブリダイジング領域と言われることがある。
別の場合、本明細書で説明される方法および組成物に用いられるプライマーは、１つまたは複数のユニバーサルヌクレオチドを含むことがある。ユニバーサルヌクレオチドの非限定的な例は、米国公開第２００９０３２５１６９号および同第２０１００１６７３５３号に記載されているような、５−ニトロインドールおよびイノシンである。
プライマーは、二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するための公知パラメータに従って設計することができる。異なるプライマーペアは、ほぼ同じ温度で、例えば、別のプライマーペアの１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃以内で、アニールおよび融解することができる。一部の事例では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１０，０００またはそれ超のプライマーが使用される。
プライマーは、当技術分野において周知の方法（Narangら、Methods Enzymol.６８巻：９０頁（１９７９年）；Brownら、Methods Enzymol.６８巻：１０９頁（１９７９年））を使用する、適切な配列のクローニングおよび直接化学合成が挙げられるが、これらに限定されない様々な方法によって調製することができる。プライマーを商業的供給源から入手してもよい。プライマーは、同一の融解温度を有してもよい。プライマーは、同一ではない融解温度を有してもよい。プライマーの長さを５’末端または３’末端で伸長または短縮して、所望の融解温度を有するプライマーを生成することができる。プライマーペアのプライマーの一方が他方のプライマーより長くてもよい。プライマーペアの中のプライマーの３’アニーリング長は、異なってもよい。また、プライマーペアの配列および長さが所望の融解温度を生じさせるように、各プライマーペアのアニーリング位置を設計することができる。２５塩基対より小さいプライマーの融解温度を決定するための式がウォレス則（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。コンピュータプログラムを使用してプライマーを設計することもできる。各プライマーのＴｍ（融解またはアニーリング温度）を、ソフトウェアプログラムを使用して計算することができる。サイクル１、２、３、４、５、サイクル６〜１０、サイクル１０〜１５、サイクル１５〜２０、サイクル２０〜２５、サイクル２５〜３０、サイクル３０〜３５、またはサイクル３５〜４０を含むがこれらに限定されない任意の増幅サイクル後、プライマーのアニーリング温度を再計算し、上昇させてもよい。最初の増幅サイクル後、プライマーの５’側半分を目的の各座位からの産物に組み込むことができ、こうしてＴｍを各プライマーの５’側半分の配列と３’側半分の配列の両方に基づいて再計算することができる。
本明細書で開示される方法の１つまたは複数の反応の遂行は、１つまたは複数のプライマーの使用を含むことがある。本明細書で使用される場合、プライマーは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズするのに十分なほど相補的である、二本鎖、一本鎖または部分的一本鎖ポリヌクレオチドを含む。プライマーは、ポリヌクレオチドに結合する前、一本鎖ＤＮＡであってもよい。一部の事例では、プライマーは、最初は二本鎖配列を含む。プライマー部位は、プライマーがハイブリダイズするポリヌクレオチドの領域を含む。一部の事例では、プライマーは、鋳型指示核酸合成の開始点として作用することができる。例えば、プライマーは、４つの異なるヌクレオチドおよび重合剤あるいは酵素、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素がある場合、鋳型指示核酸合成を開始することができる。プライマーペアは、２つのプライマーを含む：配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流領域を有する第１のプライマー、およびポリヌクレオチド配列の３’末端の補体とハイブリダイズする３’下流領域を有する第２のプライマー。プライマーセットは、２つまたはそれ超のプライマーを含む：ポリヌクレオチド配列または複数のポリヌクレオチド配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流領域を有する第１のプライマーまたは第１の複数のプライマー、およびポリヌクレオチド配列または複数のポリヌクレオチド配列の３’末端の補体とハイブリダイズする３’下流領域を有する第２のプライマーまたは第２の複数のプライマー。一部の事例では、プライマーは、標的特異的配列を含む。一部の事例では、プライマーは、試料バーコード配列を含む。一部の事例では、プライマーは、ユニバーサルプライミング配列を含む。一部の事例では、プライマーは、ＰＣＲプライミング配列を含む。一部の事例では、プライマーは、ポリヌクレオチドの増幅を開始させるために使用されるＰＣＲプライミング配列を含む。（Dieffenbach、PCR Primer: A Laboratory Manual、第２版（Cold Spring Harbor Press、New York（２００３年））。ユニバーサルプライマー結合部位または配列は、ユニバーサルプライマーのポリヌクレオチドおよび／またはアンプリコンへの付着を可能にする。ユニバーサルプライマーは当技術分野において周知であり、これらに限定されるものではないが、−４７Ｆ（Ｍ１３Ｆ）、アルファＭＦ、ＡＯＸ３’、ＡＯＸ５’、ＢＧＨｒ、ＣＭＶ−３０、ＣＭＶ−５０、ＣＶＭｆ、ＬＡＣｒｍｔ、ラムダｇｔ１０Ｆ、ラムダｇｔ１０Ｒ、ラムダｇｔ１１Ｆ、ラムダｇｔ１１Ｒ、Ｍ１３ ｒｅｖ、Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（−２０）、Ｍ１３Ｒｅｖｅｒｓｅ、ｍａｌｅ、ｐ１０ＳＥＱＰｐＱＥ、ｐＡ−１２０、ｐｅｔ４、ｐＧＡＰ Ｆｏｒｗａｒｄ、ｐＧＬＲＶｐｒ３、ｐＧＬｐｒ２Ｒ、ｐＫＬＡＣ１４、ｐＱＥＦＳ、ｐＱＥＲＳ、ｐｕｃＵ１、ｐｕｃＵ２、ｒｅｖｅｒｓＡ、ｓｅｑＩＲＥＳｔａｍ、ｓｅｑＩＲＥＳｚｐｅｔ、ｓｅｑｏｒｉ、ｓｅｑＰＣＲ、ｓｅｑｐＩＲＥＳ−、ｓｅｑｐＩＲＥＳ＋、ｓｅｑｐＳｅｃＴａｇ、ｓｅｑｐＳｅｃＴａｇ＋、ｓｅｑｒｅｔｒｏ＋ＰＳＩ、ＳＰ６、Ｔ３−ｐｒｏｍ、Ｔ７−ｐｒｏｍおよびＴ７−ｔｅｒｍＩｎｖを含む。本明細書で使用される場合、付着するは、共有結合性相互作用と非共有結合性相互作用の両方またはいずれかを指すことができる。ユニバーサルプライマーのユニバーサルプライマー結合部位への付着は、ポリヌクレオチドおよび／またはアンプリコンの増幅、検出および／またはシーケンシングに使用することができる。ユニバーサルプライマー結合部位は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチドまたは塩基対を含むことができる。別の例では、ユニバーサルプライマー結合部位は、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００または１００００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。一部の事例では、ユニバーサルプライマー結合部位は、１〜１０、１０〜２０、１０〜３０、または１０〜１００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。一部の事例では、ユニバーサルプライマー結合部位は、約１〜９０、１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、２〜９０、２〜８０、２〜７０、２〜６０、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、１〜９００、１〜８００、１〜７００、１〜６００、１〜５００、１〜４００、１〜３００、１〜２００、１〜１００、２〜９００、２〜８００、２〜７００、２〜６００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、５〜９０、５〜８０、５〜７０、５〜６０、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１０、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１０、５〜９００、５〜８００、５〜７００、５〜６００、５〜５００、５〜４００、５〜３００、５〜２００、５〜１００、１０〜９００、１０〜８００、１０〜７００、１０〜６００、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、２５〜９００、２５〜８００、２５〜７００、２５〜６００、２５〜５００、２５〜４００、２５〜３００、２５〜２００、２５〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、３００〜１０００、３００〜９００、３００〜８００、３００〜７００、３００〜６００、３００〜５００、３００〜４００、４００〜１０００、４００〜９００、４００〜８００、４００〜７００、４００〜６００、４００〜５００、５００〜１０００、５００〜９００、５００〜８００、５００〜７００、５００〜６００、６００〜１０００、６００〜９００、６００〜８００、６００〜７００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、８００〜９００、または９００〜１０００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。
１つまたは複数のプライマーを複数のポリヌクレオチドの少なくとも一部分にアニールすることができる。１つまたは複数のプライマーを複数のポリヌクレオチドの３’末端および／または５’末端にアニールすることができる。１つまたは複数のプライマーを複数のポリヌクレオチドの内部領域にアニールすることができる。内部領域は、複数のポリヌクレオチドの３’末端または５’末端から少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または１０００ヌクレオチドであってもよい。１つまたは複数のプライマーは、プライマーの固定パネルを含むことがある。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のカスタムプライマーを含むことがある。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の対照プライマーを含むことがある。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含むことがある。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含むことがある。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールすることができる。一部の事例では、１つまたは複数のカスタムプライマーは、特異的領域、その補体、またはそれらのいずれかの組合せにアニールする。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含むことがある。１つまたは複数のプライマーを、１つもしくは複数のポリヌクレオチドを増幅させるために、または１つもしくは複数のポリヌクレオチドのプライマー伸長、逆転写、線形伸長、非指数関数的増幅、指数関数的増幅、ＰＣＲもしくは任意の他の増幅方法を行うために設計することができる。
プライマーが結合するポリヌクレオチドの特異的領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または１０００ヌクレオチドまたは塩基対を含むことができる。別の例では、標的特異的領域は、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００または１００００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。一部の事例では、プライマーが結合するポリヌクレオチドの標的特異的領域は、約５〜１０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜３０、１５〜３０、１０〜７５、１５〜６０、１５〜４０、１８〜３０、２０〜４０、２１〜５０、２２〜４５、２５〜４０、７〜９、１２〜１５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜４５、１５〜５０、１５〜５５、１５〜６０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、２０〜６０、２〜９００、２〜８００、２〜７００、２〜６００、２〜５００、２〜４００、２〜３００、２〜２００、２〜１００、２５〜９００、２５〜８００、２５〜７００、２５〜６００、２５〜５００、２５〜４００、２５〜３００、２５〜２００、２５〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、３００〜１０００、３００〜９００、３００〜８００、３００〜７００、３００〜６００、３００〜５００、３００〜４００、４００〜１０００、４００〜９００、４００〜８００、４００〜７００、４００〜６００、４００〜５００、５００〜１０００、５００〜９００、５００〜８００、５００〜７００、５００〜６００、６００〜１０００、６００〜９００、６００〜８００、６００〜７００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、８００〜９００または９００〜１０００ヌクレオチドまたは塩基対を含む。
プライマーは、二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するための公知のパラメータに従って設計することができる。一部の事例では、異なるプライマーペアは、ほぼ同じ温度で、例えば、別のプライマーペアの１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃以内で、アニールおよび融解することができる。一部の事例では、複数のプライマーの中の１つまたは複数のプライマーは、ほぼ同じ温度で、例えば、複数のプライマーの中の別のプライマーの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０℃以内で、アニールおよび融解することができる。一部の事例では、複数の中の１つまたは複数のプライマーは、複数のプライマーの中の別のプライマーとは異なる温度でアニールおよび融解することができる。
本明細書で説明される方法の１つまたは複数のステップのための複数のプライマーは、約、最大で約、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００の同じまたは異なるプライマーを含む、複数のプライマーを含むことができる。例えば、複数のプライマーの中の各プライマーは、ポリヌクレオチドの特異的領域と結合する同じまたは異なる配列を含むことがある。
酵素
本明細書で開示される方法およびキットは、１つまたは複数の酵素を含むことがある。酵素の例としては、リガーゼ、逆転写酵素、ポリメラーゼ、および制限ヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の事例では、アダプターのポリヌクレオチドへの付着は、１つまたは複数のリガーゼの使用を含む。リガーゼの例としては、ＤＮＡリガーゼ、例えばＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ、ならびにＲＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼＩおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で開示される方法およびキットは、１つまたは複数の逆転写酵素の使用をさらに含むことがある。一部の事例では、逆転写酵素は、ＨＩＶ−１逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、およびテロメラーゼ逆転写酵素である。一部の事例では、逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である。
一部の事例では、本明細書で開示される方法およびキットは、１つまたは複数のプロテアーゼの使用を含む。
一部の事例では、本明細書で開示される方法およびキットは、１つまたは複数のポリメラーゼの使用を含む。ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一部の事例では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、およびＤＮＡポリメラーゼＩＶである。市販のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｂｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎ（商標）ｍＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＯｎｅＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）γ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＫＡＰＡ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の事例では、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ｐｈｉ６ ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。
追加の試薬
本明細書で開示される方法およびキットは、１つまたは複数の試薬の使用を含むことがある。試薬の例としては、ＰＣＲ試薬、ライゲーション試薬、逆転写試薬、酵素試薬、ハイブリダイゼーション試薬、試料調製試薬、アフィニティーキャプチャー試薬、固体支持体、例えばビーズ、ならびに核酸精製および／または単離用の試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
固体支持体は、事実上、あらゆる不溶性または固体材料を含むことができ、多くの場合、水に不溶性である固体支持体組成物が選択される。例えば、固体支持体は、シリカゲル、ガラス（例えば、制御孔ガラス（ＣＰＧ））、ナイロン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、セルロース、金属表面（例えば、鋼、金、銀、アルミニウム、ケイ素および銅）、磁性材料、プラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ））などを含むことができ、またはこれらから本質的になることができる。事例に従って使用するためのビーズの例には、ビーズと核酸分子の相互作用を可能にするアフィニティー部分構造が含まれ得る。固相（例えば、ビーズ）は、結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたはそれらの誘導体）を含むことがある。例えば、ビーズは、ストレプトアビジン被覆ビーズであってもよく、このビーズ上への固定化のために核酸分子は、ビオチン部分構造を含み得る。一部の事例では、各ポリヌクレオチド分子は、ポリヌクレオチドをさらに安定させるために、ビオチンなどの、２つのアフィニティー部分構造を含むことがある。ビーズは、核酸の固定化に使用するための追加の特徴部、または下流のスクリーニングもしくは選択プロセスで使用され得る追加の特徴部を含むことがある。例えば、ビーズは、結合部分構造、蛍光標識、または蛍光クエンチャーを含むことがある。一部の事例では、ビーズは、磁性であってもよい。一部の事例では、固体支持体は、ビーズである。ビーズの例としては、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、ポリヌクレオチド−ｄＴコンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシ末端磁性ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。ビーズまたは粒子は、膨潤性（例えば、Ｗａｎｇ樹脂などの高分子ビーズ）であってもよく、または非膨潤性（例えば、ＣＰＧ）であってもよい。一部の事例では、固相は、実質的に親水性である。一部の事例では、固相（例えば、ビーズ）は、実質的に疎水性である。一部の事例では、固相は、結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたはそれらの誘導体）を含み、実質的に疎水性であるか、または実質的に親水性である。一部の事例では、固相は、結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたはそれらの誘導体）を含み、固体支持体１ｍｇ当たり遊離捕捉剤（例えば、遊離ビオチン）約１３５０ピコモルより大きい結合能を有する。一部の事例では、結合対のメンバーを含む固相の結合能は、固体支持体１ｍｇ当たり遊離捕捉剤８００、９００、１０００、１１００、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１８００、２０００ピコモルより大きい。本発明に好適であるビーズの他の例は、金コロイド、またはビーズ、例えばポリスチレンビーズもしくはシリカビーズである。実質的にあらゆるビーズ半径を使用することができる。ビーズの例としては、１５０ｎｍ〜１０μｍにわたる半径を有するビーズを挙げることができる。他のサイズを使用することもできる。
本明細書で開示される方法およびキットは、１つまたは複数の緩衝液の使用を含むことがある。緩衝液の例としては、洗浄緩衝液、ライゲーション緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液、増幅緩衝液、および逆転写緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。一部の事例では、ハイブリダイゼーション緩衝液は、市販の緩衝液、例えば、ＴＭＡＣ Ｈｙｂ溶液、ＳＳＰＥハイブリダイゼーション溶液、およびＥＣＯＮＯ（商標）ハイブリダイゼーション緩衝液である。本明細書で開示される緩衝液は、１つまたは複数の界面活性剤を含むことがある。
本明細書で開示される方法およびキットは、１つまたは複数の担体の使用を含むことがある。担体は、本明細書で開示される１つまたは複数の反応（例えば、ライゲーション反応、逆転写、増幅、ハイブリダイゼーション）の効率を高めるまたは向上させることができる。担体は、分子またはその任意の産物（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはアンプリコン）の非特異的損失を減少または防止することができる。例えば、担体は、表面への吸収によるポリヌクレオチドの非特異的損失を減少させることができる。担体は、表面または基板（例えば、コンテナー、エッペンドルフチューブ、ピペット先端部）へのポリヌクレオチドの親和性を減少させることができる。あるいは、担体は、表面または基板（例えば、ビーズ、アレイ、ガラス、スライド、チップ）に対するポリヌクレオチドの親和性を増大させることができる。担体は、ポリヌクレオチドを分解から保護することができる。例えば、担体は、ＲＮＡ分子をリボヌクレアーゼから保護することができる。あるいは、担体は、ＤＮＡ分子をＤＮアーゼから保護することができる。担体の例としては、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ、またはポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡ担体の例としては、プラスミド、ベクター、ポリアデニル化ＤＮＡ、およびＤＮＡポリヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ担体の例としては、ポリアデニル化ＲＮＡ、ファージＲＮＡ、ファージＭＳ２ ＲＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡ、酵母ＲＮＡ、酵母ｔＲＮＡ、哺乳動物ＲＮＡ、哺乳動物ｔＲＮＡ、短鎖ポリアデニル化合成リボヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ担体は、ポリアデニル化ＲＮＡであってもよい。あるいはＲＮＡ担体は、非ポリアデニル化ＲＮＡであってもよい。一部の事例では、担体は、細菌、酵母またはウイルスからのものである。例えば、担体は、細菌、酵母またはウイルスに由来するポリヌクレオチドまたはポリペプチドであってもよい。例えば、担体は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓからのタンパク質である。別の例では、担体は、Ｅ．ｃｏｌｉからのポリヌクレオチドである。あるいは、担体は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ヤギ、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌもしくはウサギ）、鳥類、両生類、または爬虫類からのポリヌクレオチドまたはペプチドである。
本明細書で開示される方法およびキットは、１つまたは複数の対照薬剤の使用を含むことがある。対照薬剤としては、対照ポリヌクレオチド、不活性酵素、非特異的競合物質を挙げることができる。あるいは、対照薬剤は、ブライトハイブリダイゼーション、ブライトプローブ対照、核酸鋳型、スパイクイン対照、ＰＣＲ増幅対照を含む。ＰＣＲ増幅対照は、陽性対照であってもよい。他の事例では、ＰＣＲ増幅対照は、陰性対照である。核酸対照は、既知濃度のものであり得る。対照薬剤は、１つまたは複数の標識を含むことがある。
スパイクイン対照は、反応または試料に添加される鋳型であってもよい。例えば、スパイクインポリヌクレオチドを増幅反応に添加してもよい。スパイクインポリヌクレオチドを第１の増幅サイクル後のいずれの時点で増幅反応に添加してもよい。一部の事例では、スパイクインポリヌクレオチドは、サイクル番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０の後に増幅反応に添加される。スパイクインポリヌクレオチドを最終増幅サイクル前のいずれの時点で増幅反応に添加してもよい。スパイクインポリヌクレオチドは、１つまたは複数のヌクレオチドまたは核酸塩基対を含むことがある。スパイクインポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せを含むことがある。スパイクインポリヌクレオチドは、１つまたは複数の標識を含むことがある。
シーケンシング情報からのリンパ球の選択
開示される方法は、シーケンシング情報の解析に基づいてリンパ球またはそのポリヌクレオチドを選択するステップをさらに含む。選択するステップは、免疫シーケンシングステップから得られるシーケンシングデータを解析すること、例えば、シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析を行うことを含むことがある。リンパ球またはそのポリヌクレオチドは、シーケンシング情報とともに含まれている１つまたは複数のパラメータまたは情報のピースに基づいて選択することができる。リンパ球を選択するために使用することができるシーケンシング情報（すなわち、リンパ球の抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列）とともに含まれている例示的なパラメータまたは情報のピースとしては、抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列の発現量；抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列の変異レベルまたはパターン；正常（非罹患）組織、例えば正常隣接組織と比較した疾患にかかった組織における抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列を含むＴＩＬの濃縮；抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列のアイソタイプまたはアイソタイププロファイル；抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列の系統発生的クラスター；抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列の系統発生的クラスターのサイズ；同じ疾患を有する複数の患者からの試料間の抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列の相関；同じ疾患を有する複数の患者からの試料間の抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列の類似性（またはその欠如）；およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列の選択は、選択のために複数のポリヌクレオチドを正確かつ効率的にシーケンシングして、ポリヌクレオチド配列または該ポリヌクレオチド配列を含むリンパ球を識別することを含むことがある。一部の事例では、方法は、腫瘍浸潤リンパ球からのポリヌクレオチド配列を選択するステップを含む。一部の事例では、方法は、疾患関連または疾患特異的ポリペプチドを標的にする候補ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を選択するステップを含む。例えば、方法は、癌遺伝子発現産物を標的にするＢ細胞からの免疫グロブリンのＶＨまたはＶＬをコードするポリヌクレオチドを選択するステップを含むことがある。例えば、方法は、疾患関連または疾患特異的抗原を標的にするＴ細胞のＴＣＲのＶαまたはＶβをコードするポリヌクレオチドを識別するステップを含むことがある。
一部の事例では、方法は、Ｂ細胞からのポリヌクレオチド配列を選択するステップを含む。例えば、選択されたポリヌクレオチドは、腫瘍浸潤Ｂ細胞からの候補ポリペプチドをコードすることができる。一部の事例では、候補ポリペプチドは、抗体またはその断片を含む。例えば、候補ポリペプチドは、抗体の可変ドメインを含むことがある。一部の事例では、候補ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖を含む。一部の事例では、候補ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖を含む。一部の事例では、候補ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む。一部の事例では、候補ポリペプチドは、ＶＨドメインを含む。一部の事例では、候補ポリペプチドは、ＶＬドメインを含む。一部の事例では、方法は、ＶＨ配列およびＶＬ配列を含むポリヌクレオチドを選択するステップを含む。例えば、方法は、単一Ｂ細胞からのＶＨ配列およびＶＬ配列を含むポリヌクレオチドを選択するステップを含むことがある。
一部の事例では、方法は、第１の試料からのＶＨ配列および第２の試料からのＶＬ配列を含むポリヌクレオチドを選択するステップを含む。一部の事例では、方法は、第１の試料からのＶＨ配列および第２の試料からの複数のＶＬ配列を含むポリヌクレオチドを選択するステップを含む。一部の事例では、方法は、第１の試料からのＶＨ配列および複数の第２の試料からのＶＬ配列を含むポリヌクレオチドを選択するステップを含む。
一部の事例では、方法は、Ｔ細胞からのポリヌクレオチド配列を選択するステップを含む。例えば、選択されたポリヌクレオチドは、腫瘍浸潤Ｔ細胞からの候補ポリペプチドをコードすることができる。一部の事例では、候補ポリペプチドは、ＴＣＲまたはその断片である。例えば、候補ポリペプチドは、ＴＣＲの可変ドメインを含むことがある。一部の事例では、候補ポリペプチドは、ＴＣＲα鎖を含む。一部の事例では、候補ポリペプチドは、ＴＣＲβ鎖を含む。一部の事例では、候補ポリペプチドは、ＴＣＲγ鎖を含む。一部の事例では、候補ポリペプチドは、ＴＣＲδ鎖を含む。一部の事例では、候補ポリペプチドは、ＴＣＲのＶαドメインを含む。一部の事例では、候補ポリペプチドは、ＴＣＲのＶβドメインを含む。一部の事例では、候補ポリペプチドは、ＴＣＲのＶγドメインを含む。一部の事例では、候補ポリペプチドは、ＴＣＲのＶδドメインを含む。一部の事例では、方法は、Ｖα配列およびＶβ配列を含むポリヌクレオチドを選択するステップを含む。例えば、方法は、単一Ｔ細胞からのＶα配列およびＶβ配列を含むポリヌクレオチドを選択するステップを含むことがある。一部の事例では、方法は、Ｖγ配列およびＶδ配列を含むポリヌクレオチドを選択するステップを含む。例えば、方法は、単一Ｔ細胞からのＶγ配列およびＶδ配列を含むポリヌクレオチドを選択するステップを含むことがある。
開示される方法は、シーケンシング情報に基づいて免疫細胞またはそのポリヌクレオチド、例えば、腫瘍浸潤リンパ球またはそのポリヌクレオチドを選択するステップを含む。免疫細胞またはそのポリヌクレオチド、例えば、浸潤免疫細胞またはそのポリヌクレオチドは、シーケンシング情報に基づいて浸潤免疫細胞のポリヌクレオチド配列を選択することによって選択することができる。浸潤免疫細胞のポリヌクレオチドは、浸潤免疫細胞ポリヌクレオチドの配列を決定することによって、例えば、浸潤免疫細胞を含む組織試料からの複数の免疫細胞のハイスループットシーケンシングによって選択することができる。本明細書で提供される浸潤免疫細胞を選択するためのポリヌクレオチドをシーケンシングする方法は、非浸潤免疫細胞の数と比較して試料中の浸潤免疫細胞の少ない絶対数および／または試料中の浸潤免疫細胞の少ない数のため、概してハイスループットシーケンシングを用いる。シーケンシングステップの前に、１つまたは複数の浸潤免疫細胞を抽出することなく、該１つまたは複数の浸潤免疫細胞を含む組織試料に関するシーケンシングを行うことができる。
一部の事例では、試料の選択されたリンパ球からシーケンシングされるポリヌクレオチドは、異なる濃度または量（例えば、異なる分子数）で試料中に存在することがある。例えば、選択されたリンパ球からシーケンシングされる１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、その試料中のリンパ球からシーケンシングされる別のポリヌクレオチドの濃度または量より少ないこともあり、または多いこともある。例えば、選択されたリンパ球からシーケンシングされる１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、その試料中のリンパ球からシーケンシングされる少なくとも１つのポリヌクレオチドの濃度または量の少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００分の１またはそれ未満であることがある。例えば、選択されたリンパ球からシーケンシングされる１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、その試料中のリンパ球からシーケンシングされる少なくとも１つのポリヌクレオチドの濃度または量より少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００倍またはそれを超えることがある。一部の事例では、試料中の少なくとも１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、シーケンシングされるポリヌクレオチドの少なくとも１．５％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の濃度または量の、少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００分の１またはそれ未満である。別の例では、１つのポリヌクレオチドの濃度または量は、その試料中の別のポリヌクレオチドの濃度または量未満である。
一部の疾患では、単一リンパ球前駆細胞は、進行中の体細胞高頻度変異に起因して、または疾患関連体細胞変異、例えば、塩基置換、異所再構成などに起因して、わずかに異なるＴＣＲまたは抗体を各々が有するおよび／または発現する、多くの関連リンパ球子孫を生じさせることがあり、したがって、異なる系統発生的クローンを生じさせることがある。１セットの系統発生的クローン、例えば関連系統発生的クローンを、系統発生的クラスターと言うことがある。一態様では、抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列の選択は、系統発生的クローンの頻度に基づく選択を含む。一態様では、抗体またはＴＣＲポリヌクレオチド配列の選択は、個々の系統発生的クローンの頻度ではなく、系統発生的クラスターの頻度（すなわち、該クラスターの構成要素である系統発生的クローン型の頻度の合計）に基づく選択を含む。
系統発生的クローンは、親クローンとの関連性についての１つまたは複数の尺度によって識別することができる。一事例では、系統発生的クローンを例えば相同性パーセントによって同じクラスターにグループ化することができる。別の事例では、系統発生的クローンまたは系統発生的クラスターは、Ｖ領域、Ｊ領域および／またはＤ領域の共通使用によって識別される。例えば、クラスターを、共通のＪおよびＤ領域を有するが異なるＶ領域を有するクローンによって定義することができる、または同じＶおよびＪ領域を有するが異なるＤ領域を有するクローンによって定義することができる、またはクラスターメンバーを生成するために１〜１０塩基、もしくは１〜５塩基、もしくは１〜３塩基の１つまたは複数の挿入および／もしくは欠失を被ったクローンによって定義することができる。単一試料の系統発生的クローンをクラスターにグループ化することができ、異なる時点で獲得した逐次的試料からのクラスターを互いに比較することができる。本発明の一態様では、がんなどの疾患と相関関係があるクローンを含有するクラスターが、その時点での試料から決定されるクローンの中から識別される。その時点からの相関するクローンのクラスターを以前の試料のものと比較して、ＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチドを選択することができ、例えば、逐次的クラスターに関して、特定のクローンの頻度が増加するのか、または減少するのか、集団研究またはデータベースから相関していることが分かる新たな相関するクローンが出現するかどうか、などを判定することができる。
一部の事例では、シーケンシング情報の解析に基づくリンパ球またはそのポリヌクレオチドの選択は、シーケンシング情報の解析に基づく抗体またはＴＣＲポリヌクレオチドのアイソタイプに基づく選択を含むことがある。例えば、シーケンシング情報の解析に基づくリンパ球またはそのポリヌクレオチドの選択は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤ抗体を選択することを含むことがある。例えば、シーケンシング情報の解析に基づくリンパ球またはそのポリヌクレオチドの選択は、ＩｇＧ抗体を選択することを含むことがある。
選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのクローニングおよび発現
組換えおよび合成法ならびに組成物
選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされる抗体およびＴＣＲを、合成および／または組換え法ならびに組成物を使用して産生することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。一部の事例では、ポリペプチドをコードする、単離された、選択されたポリヌクレオチドが提供される。そのような核酸は、例えばＶＬを含むアミノ酸配列、および／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードすることができる。さらなる事例では、そのような核酸を含む１つまたは複数のベクターが提供される。「ベクター」は、その核酸分子が連結されている別の核酸を伝達することができる核酸分子である。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターはもちろん、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれているベクターも含む。ある特定のベクターは、該ベクターが動作可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。
さらなる事例では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は、外来性核酸が導入された細胞であり、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、初代形質転換細胞、および継代数を問わずそれらに由来する子孫を含む、「形質転換体」および「形質転換細胞」を含む。子孫は、核酸含有量の点で親細胞と完全に同一ではないことがあるが、変異を含有することがある。本明細書には、元々形質転換されていた細胞でスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫が含まれる。１つのそのような事例では、宿主細胞は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、そのようなベクターで形質転換されている）。一部の事例では、宿主細胞は、真核性、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一部の事例では、選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを作製する方法であって、ポリペプチドをコードする選択核酸を含む宿主細胞を、ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養するステップと、任意選択で、宿主細胞または宿主細胞培養培地からポリペプチドを回収するステップとを含む方法が提供される。
選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの組換え産生のために、選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、例えば抗体をコードする単離された核酸が、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のための１つまたは複数のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を使用して容易に単離およびシーケンシングすることができる。
ポリペプチドをコードするベクターのクローニングおよび発現に好適な宿主細胞には、本明細書で説明される原核および真核細胞が含まれる。例えば、選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌内で産生することができる（例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号および同第５，８４０，５２３号；Charlton、Methods in Molecular Biology、２４８巻、２４５〜２５４頁（２００３年）を参照されたい）。発現後、選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離することができ、そしてさらに精製することができる。
原核生物に加えて、真核微生物、例えば、糸状菌類または酵母は、ポリペプチドをコードするベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である（例えば、Gerngross、Nat. Biotech.２２巻：１４０９〜１４１４頁（２００４年）、およびLiら、Nat. Biotech.２４巻：２１０〜２１５頁（２００６年）を参照されたい）。グリコシル化ポリペプチド、例えば抗体、の発現に好適な宿主細胞は、無脊椎動物および脊椎動物を含む、多細胞生物からも得られる。無脊椎動物の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる（例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、および同第６，４１７，４２９号を参照されたい）。脊椎動物細胞の例としては、哺乳動物細胞株；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓株（２９３、または例えばGrahamら、J. Gen Virol.３６巻：５９頁（１９７７年）に記載されているような２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２）；ＴＲ１細胞；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＨＦＲ ＣＨＯ細胞を含む）；ならびに骨髄腫細胞株、例えばＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０が挙げられる。（例えば、YazakiおよびWu、Methods in Molecular Biology、２４８巻、２５５〜２６８頁（２００３年）を参照されたい）。
用語「抗体発現ライブラリー」、「ＴＣＲ発現ライブラリー」、「組換え抗体ライブラリー」、「組換えＴＣＲライブラリー」、「合成抗体ライブラリー」および「合成ＴＣＲライブラリー」は、２つまたはそれ超の選択されたリンパ球からの核酸レベルまたはタンパク質レベルのどちらかでの分子（すなわち２つまたはそれ超の分子）の収集物を指す。したがって、これらの用語は、複数の抗体もしくはＴＣＲ分子をコードする発現ベクターの（すなわち、核酸レベルでの）収集物を指すこともあり、または抗体もしくはＴＣＲ分子の、それらが組換えで産生された、例えば、適切な発現系において発現された、もしくは例えばペプチド合成装置を使用して合成された後の（すなわち、タンパク質レベルでの）収集物を指すこともある。発現ベクターライブラリーは、それらを発現することができる好適な宿主細胞に含有されていることがある。発現ライブラリーの中のコードまたは発現される抗体またはＴＣＲ分子は、適切ないずれの形式であってもよく、例えば、全抗体もしくはＴＣＲ分子であってもよく、または抗体もしくはＴＣＲ断片、例えば、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体）、Ｆｖ抗体もしくはＴＣＲ、Ｆａｂ’抗体もしくはＴＣＲ、（Ｆａｂ’）２断片、ダイアボディなどであってもよい。特定のポリペプチドを「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」／「コードする（ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ）」核酸配列、または特定のポリペプチドを「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」／「コードする（ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ）」ヌクレオチド配列のＤＮＡコード配列であるような、「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」および「コードする（ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ）」という用語、ならびに他の同義の用語は、適切な調節配列、例えばプロモーター配列、の制御下に置かれたときにポリペプチドに転写され、翻訳されるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合して下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、ＤＮＡ配列の一部である。この配列領域は、その３’末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な要素を有する最小数の塩基を含む。しかし、ＲＮＡポリメラーゼが配列に結合し、開始コドン（プロモーターを有する３’末端）で転写が開始されると、転写は、下流に、３’方向に進行する。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いるマッピングによって適便に定義される）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合の原因となるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。
抗体またはＴＣＲ発現または合成ライブラリーによって識別された、そのようなライブラリーに由来する、そのようなライブラリーから選択される、またはそのようなライブラリーから得ることができる抗体またはＴＣＲ分子は、本発明のさらにさらなる態様を形成する。これらの抗体またはＴＣＲ分子もやはり、抗体またはＴＣＲ分子をコードするタンパク質または核酸であり得、そしてまたこれらの核酸は、合成されることもあり、適切な発現ベクターに導入されることもあり、および／または適切な宿主細胞に含有されていることもある。
ｃＤＮＡプールを、抗体またはＴＣＲ遺伝子の重鎖またはＴＣＲα鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体またはＴＣＲ遺伝子のＶＨ鎖またはＶα鎖領域の５’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドとの、ＰＣＲ反応に供すことができる。ｃＤＮＡプールを、抗体またはＴＣＲ遺伝子の重鎖またはＴＣＲα鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体またはＴＣＲ配列を含むバーコード化ポリヌクレオチドのＶＨまたはＶα鎖領域の５’末端の５’側の領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドとの、ＰＣＲ反応に供すことができる。ＰＣＲ反応は、ＶＬまたはＶβ鎖プールの、例えば、カッパおよびラムダクラスの増幅用にも構成される。ｃＤＮＡプールを、抗体またはＴＣＲ遺伝子の軽鎖またはＴＣＲβ鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体またはＴＣＲ遺伝子のＶＬまたはＴＣＲβ鎖領域の５’末端にハイブリダイズするポリヌクレオチドとの、ＰＣＲ反応に供すことができる。ｃＤＮＡプールを、抗体またはＴＣＲ遺伝子の軽鎖またはＴＣＲβ鎖の定常領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および抗体またはＴＣＲ配列を含むバーコード化ポリヌクレオチドのＶＬまたはＶβ鎖領域の５’末端の５’側の領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドとの、ＰＣＲ反応に供すことができる。そのようなオリゴヌクレオチドまたはプライマーは、免疫グロブリン遺伝子配列データベース情報に基づいて設計することができる。
一部の事例では、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列は、重鎖または軽鎖またはＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子に特異的ではない、特に、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβポリヌクレオチドの末端領域の一方または両方に特異的ではない１つまたは複数のプライマーを使用してＰＣＲ増幅により産生されたＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列のライブラリーから適便に得ることができる。一部の事例では、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列は、容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に特異的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅により産生されたＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列のライブラリーから適便に得ることができる。一部の事例では、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列は、Ｃ遺伝子ファミリー特異的プライマーまたはＣ遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲ増幅により産生されたＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列のライブラリーから適便に得ることができる。一部の事例では、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列は、容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に特異的な第１のプライマーとＣ遺伝子ファミリー特異的プライマーまたはＣ遺伝子特異的プライマーである第２のプライマーまたは複数の第２のプライマーとを有するプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅により産生されたＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列のライブラリーから適便に得ることができる。一部の事例では、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列は、容器バーコード化ポリヌクレオチドの領域に特異的な第１のプライマーとユニバーサル配列に特異的な第２のプライマーとを有するプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅により産生された、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列のライブラリーから適便に得ることができる。
一部の事例では、逆転写し次第、得られたｃＤＮＡ配列を、免疫グロブリン遺伝子に特異的な、特に、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβポリヌクレオチドの末端領域の一方または両方に特異的な１つまたは複数のプライマーを使用してＰＣＲにより増幅することができる。一部の事例では、ＶＨおよびＶＬまたは非天然ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列は、Ｖ遺伝子ファミリー特異的プライマーまたはＶ遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲ増幅により産生されたＶＨおよびＶＬまたは非天然ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列のライブラリーから得ることができる（Nichollsら、J. Immunol.Meth、１９９３年、１６５巻、８１頁；ＷＯ９３／１２２２７）か、または入手可能な配列情報に基づいて当分野において公知の標準的方法に従って設計される。（天然または非天然ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ配列をライゲーションして、例えば、（例えば、インフレーム可動性ペプチドスペーサーをコードする）介在スペーサー配列を用いてライゲーションして、一本鎖抗体をコードするカセットを形成することができる）。Ｖ領域配列は、免疫グロブリンまたはＴＣＲ発現細胞のｃＤＮＡまたはＰＣＲ増幅産物として適便にクローニングすることができる。天然または非天然ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ領域は、任意選択で、本明細書で説明される方法で、および特に、述べられているある特定のステップ後（例えば、単一細胞ＰＣＲ後；哺乳動物または他の細胞表面提示後；ＦＡＣＳスクリーニング後など）に、シーケンシングされる。シーケンシングは、数ある理由の中でも特に、多様性レベルが許容可能なレベルで存在することを検証するために使用できる。シーケンシングには、ハイスループットシーケンシング、ディープシーケンシング、またはこれら２つの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
一部の事例では、本明細書で説明される発現または合成方法を使用して天然または非天然ＶＨとＶＬまたはＶαとＶβの組合せを物理的に連結させる必要がない。一部の事例では、選択されたリンパ球からのポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、物理的に連結されない。一部の事例では、ｃＤＮＡ、バーコード化ポリヌクレオチド、またはＰＣＲで増幅されたバーコード化ｃＤＮＡは、同じ発現ベクターの中で物理的に連結されていない。
一部の事例では、天然または非天然ＶＨとＶＬまたはＶαとＶβの組合せは、ｃＤＮＡプライマーに加えて、ＶＨまたはＶα領域遺伝子の５’末端のための１つのプライマーまたは複数のプライマー、およびＶＬまたはＶβ遺伝子の５’末端のための別のプライマーまたは複数のプライマーを使用して、物理的に連結される。これらのプライマーは、ＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβ遺伝子の自己集合を可能にする、余分な配列の相補的テールも含有する。ＰＣＲ増幅および連結後、増幅および連結反応は各細胞内で行われるため、混合された産物、言い換えると、混合された可変領域が得られる確率は極わずかである。Ｖ領域ｃＤＮＡペアが、細胞内区画から出て混ざらず、ＰＣＲ増幅および連結のために細胞内に残存することをさらに確実にするために、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドなどの嵩高い試薬を用いることにより、混合のリスクをさらに減少させることができる。増幅された配列は、相補的末端配列のハイブリダイゼーションによって連結される。連結後、配列は、本明細書で説明されるさらなる方法ステップでの使用のために細胞から回収することができる。例えば、回収されたＤＮＡを、必要に応じて末端プライマーを使用してＰＣＲ増幅させ、ベクターにクローニングすることができ、ベクターは、下で詳述するようにプラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルスベクターまたはこれらの組合せであってもよい。クローニングを助長するために、ハイブリダイズした配列に適便な制限酵素部位を組み込んでもよい。これらのベクターを連結可変領域のライブラリーとして後の使用のためにとっておいてもよい。
追加のＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδの組合せを得ることが望まれる一部の事例では、発現系は、これを助長するように選ばれる。例えば、バクテリオファージ発現系は、重鎖および軽鎖配列のランダム組換えを可能にする。他の好適な発現系は、当業者に公知である。
非ヒトに由来するＶＨおよびＶＬまたはＶαおよびＶβまたはＶγおよびＶδ配列の場合、場合によっては、これらの配列を完全ヒトＦｃでキメラ化することが好ましいことがあることに留意されたい。本明細書で使用される場合、「キメラ化された」は、重および軽Ｉｇ鎖またはアルファおよびベータＴＣＲ鎖可変領域がヒト起源のものでなく、定常領域がヒト起源のものである、免疫グロブリンまたはＴＣＲを指す。これは、可変ドメインの増幅およびヒトＦｃへのクローニングによって果たされる。ヒトＦｃは、ベクターの一部であることもあり、または別の分子内にあることもあり、およびＦｃのライブラリーを使用することもできるだろう。好ましい事例では、キメラ化分子は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞において増殖され、ＦＡＣＳを用いて２回スクリーニングされて、細胞集団における目的のポリペプチドを発現する細胞が濃縮される。キメラ化抗体およびＴＣＲは、シーケンシングおよび続いての機能的特性解析によって特性解析されるか、または直接的な機能的特性解析もしくは動態によって特性解析される。増殖、スクリーニングおよび特性解析は、下で詳細に説明される。
発現ベクターのライブラリーが生成されたら、次いで、当技術分野において周知の、実証されている適切な技法を使用して、コードされる抗体またはＴＣＲ分子を適切な発現系で発現させ、スクリーニングすることができる。したがって、上で定義された本発明の方法は、下でさらに詳細に解説されるように、適切な発現系において発現ベクターのライブラリーを発現させるさらなるステップおよび発現されたライブラリーを所望の特性を有する抗体についてスクリーニングするさらなるステップを含むことがある。
本明細書に示されているように、抗体またはＴＣＲ配列をコードするポリヌクレオチドを含む本開示の方法により調製されるポリヌクレオチドは、これらに限定されるものではないが、抗体またはＴＣＲ断片のアミノ酸配列を単独でコードするもの、全抗体もしくはＴＣＲまたはその一部分についての非コード配列をコードするもの、抗体またはＴＣＲ、断片または部分についてのコード配列をコードするもの、ならびに、追加の配列、例えば、少なくとも１つのシグナルリーダーまたは融合ペプチドのコード配列であって、非コード５’および３’配列をこれらに限定されないが含む追加の非コード配列、例えば、転写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含むｍＲＮＡプロセッシング（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）において役割を果たす、転写された非翻訳配列とともに、前述の追加のコード配列、例えば少なくとも１つのイントロンを含む、または含まない、追加の配列をコードするもの；追加の機能性を提供するものなどの追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列をコードするものを含むことができる。したがって、抗体またはＴＣＲをコードする配列をマーカー配列に融合させることができ、マーカー配列は、例えば、抗体またはＴＣＲ断片または部分を含む融合した抗体またはＴＣＲの精製を助長するペプチドをコードする配列である。
次いで、一次ＰＣＲ産物を、任意選択で、抗体またはＴＣＲ可変ドメインの５’および３’末端にハイブリダイズする新たなポリヌクレオチドセットとの二次ＰＣＲ反応に供すことができる。これらのポリヌクレオチドは、後続のクローニングのための制限酵素（すなわち、制限酵素部位）の被定義セットに特異的なＤＮＡ配列を含むのが有利である。選択される制限酵素は、ヒト抗体またはＴＣＲ Ｖ遺伝子セグメント内で切断されないように選択しなければならない。そのようなポリヌクレオチドは、公知のおよび公表されている免疫グロブリンまたはＴＣＲ遺伝子配列および制限酵素データベース情報に基づいて設計することができる。そのような二次ＰＣＲ反応の産物は、様々な可変抗体またはＴＣＲ断片／ドメインのレパトアである。したがって、このタイプの二次ＰＣＲ反応は、目的の発現ライブラリー形式が、抗体またはＴＣＲの可変ドメインのみが存在するｓｃＦｖまたはＦｖ形式である場合、一般に実行することができる。
ＰＣＲ産物を、ポリヌクレオチドの５’および３’末端にハイブリダイズする新たなプライマーセットとのＰＣＲ反応に供すこともできる。これらのポリヌクレオチドは、後続のクローニングのための制限酵素（すなわち、制限酵素部位）の被定義セットに特異的なＤＮＡ配列を含むことができるのが有利である。選択される制限酵素は、ヒトＶ遺伝子セグメント内で切断されないように選択しなければならない。そのようなポリヌクレオチドは、公知のおよび公表されている免疫グロブリンまたはＴＣＲ遺伝子配列および制限酵素データベース情報に基づいて設計することができる。
リンパ球に由来する可変領域またはそれらの断片を含むクローニングされた断片のそのようなレパトアのライブラリーは、本発明のさらなる態様を形成する。クローニングされた可変領域を含むこれらのライブラリーを、任意選択で、発現ベクターに挿入して発現ライブラリーを形成することができる。
一部の事例では、ＰＣＲ反応を、単離された免疫細胞集団に含有される様々な鎖の定常領域のすべてまたは一部を保持するように構成することができる。これは、発現ライブラリー形式がＦａｂ形式である場合に望ましい。かさねて、鎖の定常領域のすべてまたは一部を含むそのようなクローニングされた断片のライブラリーは、本発明のさらなる態様を形成する。
これらの核酸は、本発明のポリヌクレオチドに加えて都合よく配列を含むことができる。例えば、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を、ポリヌクレオチドの単離に役立つように核酸に挿入することができる。また、翻訳可能な配列を、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離に役立つように挿入することができる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製する適便な手段を提供する。コード配列を含まない本発明の核酸は、任意選択で、本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび／または発現のためのベクター、アダプターまたはリンカーである。
追加の配列を、そのようなクローニングおよび／または発現配列に、クローニングおよび／または発現におけるそれらの機能を最適化するように、ポリヌクレオチドの単離に役立つように、またはポリヌクレオチドの細胞への導入を向上させるように付加させることができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプターおよびリンカーの使用は、当技術分野において周知である。（例えば、Ausubel、上掲；またはSambrook、上掲を参照されたい）。
例えば、ＶＨおよびＶＬ鎖またはＶαおよびＶβ鎖またはＶγおよびＶδ鎖を、例えば２９３Ｋ細胞における、例えば完全ヒトＩｇＧ形式での発現のために、発現ベクターにクローニングすることができる。例えば、１００〜５００のＩｇまたはＴＣＲ鎖を細胞における発現のために発現ベクターにクローニングすることができる。
一部の実施形態では、シーケンシングに並行して、ＶＨおよびＶＬ鎖またはＶαおよびＶβ鎖またはＶγおよびＶδ鎖のライブラリーを例えば容器から回収することができ、例えば酵母ディスプレイスクリーニングのために、発現ベクターにクローニングし、コトランスフェクトすることができる。この同一ライブラリープールのクローニングは、一部の希少な免疫細胞がどちらか一方または他方のアッセイでのみ捕捉されることになるので、生体試料を最初に分割するのと比較して好ましい方法である。例えば、ヒト由来のＶＨおよびＶＬ鎖またはＶαおよびＶβ鎖のライブラリーを、正しいまたは間違ったＶＨとＶＬペアのマッチングまたはＶαとＶβペアのマッチングに関係なく、発現させることができる。例えば、その場合、可能性のある抗体またはＴＣＲ候補を濃縮するために１つまたは複数の抗原標的に対する酵母ディスプレイスクリーニングを行ってもよい。酵母ディスプレイなどのディスプレイ技法から浮かび上がる陽性候補抗体およびＴＣＲをシーケンシングし、候補抗体およびＴＣＲのリガンドを照会してもよい。
一部の実施形態では、モノクローナル抗体を、最初にKohlerら、Nature、２５６巻：４９５頁（１９７５年）によって説明されたハイブリドーマ法を使用して作製することができ、または組換えＤＮＡ法（Ｕ．Ｓ．４，８１６，５６７）によって作製することができる。ハイブリドーマ法の場合、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターに、本明細書において上で説明したように免疫処置を施して、免疫処置に使用したタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を惹起する。あるいは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリンパ球に免疫力をつけてもよい。その場合、適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、５９〜１０３頁（Academic Press、１９８６年））。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地において播種され、増殖される。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、そのハイブリドーマ用の培養培地は、概してヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むことになり（ＨＡＴ培地）、これらの物質が、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を防止する。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性であるものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、およびアメリカ合衆国細胞培養系統保存機関、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡから入手できるＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Kozbor、J. Immunol.、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、５１〜６３頁（Marcel Dekker, Inc.、New York、１９８７年））。ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって判定される。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munsonら、Anal.Biochem.、１０７巻：２２０頁（１９８０年）のスキャッチャード分析によって判定することができる。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が識別されたら、クローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる（Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、５９〜１０３頁（Academic Press、１９８６年））。この目的のために好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞を、動物において腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地、腹水液または血清から従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーによって好適に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、シーケンシングされる。単離されたら、そのＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、これらが、次いで、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞にトランスフェクトされて、それらの組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が達成される。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総説論文としては、Skerraら、Curr. Opinion in Immunol.、５巻：２５６〜２６２頁（１９９３年）およびPliickthun、Immunol. Revs.、１３０巻：１５１〜１８８頁（１９９２年）が挙げられる。さらなる事例では、抗体または抗体断片を、McCaffertyら、Nature、３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）に記載されている技法を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clacksonら、Nature、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）およびMarksら、J. Mol.Biol.、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）には、ファージライブラリーを使用するマウスおよびヒト抗体の単離がそれぞれ記載されている。後続の刊行物には、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Marksら、Bio/Technology、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年））、ならびに超大型ファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え（Waterhouseら、Nuc. Acids. Res.、２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年））が記載されている。したがって、これらの技法は、モノクローナル抗体の単離のための旧来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替法である。例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を相同マウス配列の代わりに使用すること（Ｕ．Ｓ．４，８１６，５６７；Morrisonら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、８１巻、６８５１頁（１９８４年））によって、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合的に連結させることによって、ＤＮＡを修飾することもできる。典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドで、抗体の定常ドメインが置換されるか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体が作成される。
あるいは、ファージディスプレイ技術（McCaffertyら、Nature、３４８巻：５５２〜５５３頁（１９９０年））を使用して、ヒト抗体またはＴＣＲおよび抗体断片またはＴＣＲを免疫グロブリンまたはＴＣＲ可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパトアからｉｎ ｖｉｔｒｏで産生することができる。この技術によると、抗体またはＴＣＲ Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージの主要または非主要コートタンパク質遺伝子、例えばＭ１３またはｆｄのどちらかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面に機能性抗体またはＴＣＲ断片として提示される。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体またはＴＣＲの機能的特性に基づく選択は、それらの特性を示す抗体またはＴＣＲをコードする遺伝子の選択ももたらす。したがって、ファージは、Ｂ細胞またはＴ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で行うことができる。それらの総説については、例えば、JohnsonおよびChiswell、Current Opinion in Structural Biology、３巻：５６４〜５７１頁（１９９３年）を参照されたい。Marksら、J. Mol.Biol.、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）、またはGriffithら、EMBO J.、１２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）によって記載された技術に本質的に従って、Ｖ遺伝子のレパトアを構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を単離することができる。Ｕ．Ｓ．５，５６５，３３２および５，５７３，９０５も参照されたい。ヒト抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって産生させることもできる（Ｕ．Ｓ．５，５６７，６１０および５，２２９，２７５を参照されたい）。
抗体またはＴＣＲ断片の産生のために様々な技術が開発された。旧来、これらの断片は、インタクト抗体またはＴＣＲのタンパク質消化によって得られた（例えば、Morimotoら、J. Biochem.Biophys.Methods、２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年）およびBrennanら、Science、２２９巻：８１頁（１９８５年）を参照されたい）。しかし、これらの断片を今では組換え宿主細胞によって直接産生させることができる。例えば、抗体またはＴＣＲ断片を上で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。
一部の実施形態では、抗体またはＴＣＲ可変ドメインが免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。一部の実施形態では、融合物は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、融合物は、融合物の少なくとも１つの中に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を含む。免疫グロブリン重鎖融合物と必要に応じて免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入することができ、それらが好適な宿主生物にコトランスフェクトされる。これは、構築に使用された不等比のポリペプチド鎖が最適な収量をもたらす場合、ポリペプチド断片の相互の割合の調整の大きな自由度をもたらす。しかし、等しい比での少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現の結果として高い収量が得られる場合、または比が特別な有意性がないものである場合、１つの発現ベクターの中にポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
Ｕ．Ｓ．５，７３１，１６８に記載されている別のアプローチによると、抗体分子のペア間の境界面を、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大化するように改変することができる。好ましい境界面は、抗体またはＴＣＲ定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体またはＴＣＲ分子の境界面からの１つまたは複数の小さいアミノ酸側鎖が、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きい側鎖と同一または同様のサイズの代償的「空洞」が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することによって第２の抗体またはＴＣＲ分子の境界面に作成される。これは、他の望ましくない最終生成物、例えばホモ二量体よりヘテロ二量体の収量を増加させるメカニズムを提供する。
抗体およびＴＣＲは、培養上清または他の培養物から、例えば、飽和硫酸アンモニウム沈殿、真性グロブリン沈殿法、カプロン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２）、あるいは抗ＩｇカラムまたはプロテインＡ、ＧもしくはＬカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、単離および精製することができる。
別の態様では、ＣＤＲの１つまたは複数についてのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを、例えば組換え技術によって、抗体、抗原結合断片または結合タンパク質をコードする既存ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入することができる。
高レベル産生のために最も広く使用されている哺乳動物発現系は、デヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（「ｄｈｆｒ−」）チャイニーズハムスター卵巣細胞によって提供される遺伝子増幅手順を用いるものである。この系は、当業者に周知である。この系は、デヒドロ葉酸塩のテトラヒドロ葉酸塩への転換を触媒するＤＨＦＲ酵素をコードするデヒドロ葉酸レダクターゼ「ｄｈｆｒ」遺伝子に基づく。高い産生量を達成するために、所望のタンパク質をコードする遺伝子とともに機能性ＤＨＦＲ遺伝子を含有する発現ベクターを用いてｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。
競合ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサート（ＭＴＸ）の量を増加させることによって、ｄｈｆｒ遺伝子を増幅させることにより組換え細胞は耐性を生じる。標準的な場合、用いられる増幅ユニットは、ｄｈｆｒ遺伝子のサイズよりはるかに大きい。
抗体またはＴＣＲ鎖などのタンパク質の大規模産生が所望される場合、用いることになる細胞の発現レベルと安定性の両方が考慮される。長期培養の場合、組換えＣＨＯ細胞集団は、単一の親クローンに由来したとしても、増幅中にそれらの特異的抗体またはＴＣＲ産生力に関する均一性を喪失する。
選択されたリンパ球からの抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含有するベクター、ならびにそのようなポリヌクレオチドを転写しポリペプチドに翻訳するための宿主細胞および発現系を含む、組成物が提供される。
本出願は、上記のような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物も提供する。
本出願は、上記のような１つまたは複数の構築物を含む組換え宿主細胞も提供する。選択されたリンパ球からのあらゆる抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片をコードする核酸自体が本出願の態様を形成し、抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片の産生方法であって、選択されたリンパ球からの抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片をコードする核酸からの発現を含む方法も、本出願の態様を形成する。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって達成することができる。発現による産生後、いずれの好適な技法を使用して抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片を単離および／または精製してもよく、次いで、必要に応じて、例えば検証のために、それを使用することができる。
選択されたリンパ球からの特異的抗体、ＴＣＲ、抗原結合断片ならびにコード化核酸分子およびベクターを、例えばそれらの天然の環境から、単離および／もしくは精製して、実質的に純粋なもしくは均一な形態で提供することができ、または核酸の場合、必要機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸もしくは遺伝子がないもしくは実質的にない形態で提供することができる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができ、完全合成のものであってもよく、または部分合成のものであってもよい。
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系を、開示される方法で使用することができる。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウイルス系が挙げられるが、これらに限定されない。異種ポリペプチドの発現に当技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞および多くの他のものが含まれる。一般的な細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における抗体、ＴＣＲおよびその断片の発現を場合によっては使用することができる。総説については、例えば、Pluckthun、A. Bio/Technology ９巻：５４５〜５５１頁（１９９１年）を参照されたい。培養での真核細胞における発現も、本明細書で説明される抗体および抗原結合断片の産生の選択肢として、当業者には利用可能である。最近の総説については、例えば、Raff, M.E.（１９９３年）Curr.Opinion Biotech.４巻：５７３〜５７６頁；Trill J.J.ら（１９９５年）Curr.Opinion Biotech ６巻：５５３〜５６０頁を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を必要に応じて含む適切な調節配列を含有する好適なベクターを選ぶことができ、または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えばファージ、またはファージミドであってもよい。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual：第２版、Sambrookら、１９８９年、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。核酸の例えば核酸構築物の調製の際の操作、変異誘発、シーケンシング、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現ならびにタンパク質の分析のための多くの公知の技法およびプロトコールが、Short Protocols in Molecular Biology、第２版、Ausubelら編、John Wiley & Sons、１９９２年に詳細に記載されている。ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらの開示は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。
したがって、さらなる態様は、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。さらにさらなる態様は、そのような核酸を宿主細胞に導入するステップを含む方法を提供する。導入には利用可能ないずれの技法を用いてもよい。真核細胞に好適な技法としては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えばワクシニアを使用する、あるいは昆虫細胞についてはバキュロウイルスを使用する形質導入を挙げることができる。細菌細胞に好適な技術としては、例えば、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用するトランスフェクションを挙げることができる。
導入後、例えば遺伝子発現条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こす、または可能にすることができる。
一事例では、核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込まれる。標準的技法に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることにより、組込みを促進することができる。
本出願は、発現系において上述の構築物を使用して抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片を発現させるステップを含む方法も提供する。
本出願は、本明細書で説明される方法を使用して識別されたものに結合する選択されたリンパ球からの抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合配列をコードする、単離された核酸、例えば、組換えＤＮＡ分子もしくはクローン化遺伝子、またはその縮重バリアント、それらの変異体、類似体または断片にも関する。
別の特徴は、本明細書で開示されるＤＮＡ配列の発現である。当技術分野において周知であるように、ＤＮＡ配列は、それらを適切な発現ベクター内の発現制御配列に動作可能に連結すること、およびその発現ベクターを用いて適切な単細胞宿主を形質転換することによって発現させることができる。
ＤＮＡ配列の発現制御配列へのそのような動作可能な連結は、まだＤＮＡ配列の一部ではなくても、ＤＮＡ配列の上流の正しいリーディングフレームへの開始コドン、ＡＴＧの提供をもちろん含む。
ポリヌクレオチドおよびベクターは、単離されたおよび／または精製された（例えば、必要機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド以外の起源のポリヌクレオチドがないまたは実質的にない）形態で提供することができる。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」および「実質的にない」は、例えば、２０％もしくはそれ未満の外来性物質、１０％もしくはそれ未満の外来性物質、５％もしくはそれ未満の外来性物質、４％もしくはそれ未満の外来性物質、３％もしくはそれ未満の外来性物質、２％もしくはそれ未満の外来性物質、または１％もしくはそれ未満の外来性物質を含有する溶液または懸濁液を指す。
多種多様な宿主／発現ベクターの組合せを本発明のＤＮＡ配列の発現に用いることができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。好適なベクターとしては、ＳＶ４０および公知の細菌プラスミドの誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌ Ｅｌ、Ｐｃｒ１、Ｐｂｒ３２２、Ｐｍｂ９およびそれらの誘導体、プラスミド、例えばＲＰ４；ファージＤＮＡ、例えば、ファージλの非常に多くの誘導体、例えばＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば２ｕプラスミドまたはその誘導体；真核細胞において有用なベクター、例えば、昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されるベクター、例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるために修飾されたプラスミド、などが挙げられる。
多種多様な発現制御配列−それに動作可能に連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列−のいずれを、これらのベクターにおいてＤＮＡ配列を発現させるために使用してもよい。そのような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルスの早期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母□−接合因子のプロモーター、ならびに原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、ならびにこれらの様々な組合せが挙げられる。
多種多様な単細胞宿主細胞もまたＤＮＡ配列の発現に有用である。これらの宿主としては、周知の真核生物および原核生物宿主、例えば、組織培養での、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、真菌、例えば酵母、および動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＹＢ／２０、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、Ｒｌ．ｌ、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、ならびにヒト細胞および植物細胞の株が挙げられる。
すべてのベクター、発現制御配列および宿主が、ＤＮＡ配列を発現するように同様によく機能するとは限らないことが理解される。すべての宿主が、同じ発現系で同様によく機能するとも限らない。しかし、当業者は、本出願の範囲から逸脱することなく所望の発現を果たすのに妥当なベクター、発現制御配列および宿主を過度の実験なしに選択することができるであろう。例えば、ベクターを選択する場合、宿主を考慮しなければならない。なぜなら、ベクターはその中で機能しなければならないからである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびベクターによってコードされるいずれかの他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現も考慮される。当業者は、本出願の範囲から逸脱することなく所望の発現を果たすのに妥当なベクター、発現制御配列および宿主を選択することができる。例えば、ベクターを選択する場合、宿主が考慮される。なぜなら、ベクターはその中で機能するからである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびベクターによってコードされるいずれかの他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現も考慮され得る。
本出願は、選択されたリンパ球からの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、本明細書の他の箇所で説明されるようなプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物も提供する。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選択可能マーカーおよび他の配列を必要に応じて含む、適切な調節配列を含有する、好適なベクターを、選ぶことができ、または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えばファージ、ファージミドなどであってもよい。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual：第２版、Sambrookら、１９８９年、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。核酸の、例えば核酸構築物の調製の際の操作、変異誘発、シーケンシング、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現ならびにタンパク質の分析のための多くの公知の技法およびプロトコールが、Short Protocols in Molecular Biology、第２版、Ausubelら編、John Wiley & Sons、１９９２年に詳細に記載されている。ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
発現制御配列を選択する場合、通常、様々な因子が考慮されることになる。これらには、例えば、系の相対強度、その可制御性、および発現されることになる特定のＤＮＡ配列または遺伝子とのその適合性、特に、可能性のある二次構造に関してのその適合性が含まれる。好適な単細胞宿主は、例えば、選ばれるベクターとのそれらの適合性、それらの分泌特性、タンパク質を正しく折り畳むそれらの能力、およびそれらの発酵要件はもちろん、発現されることになるＤＮＡ配列によってコードされる産物の宿主に対する毒性、および発現産物の精製の容易さも考慮することにより選択されることになる。
選択されたリンパ球からの抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを、クローニングするのに加えて、またはクローニングするのではなく、組換えで／合成的に調製することができる。ポリヌクレオチドは、抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片にとって適切なコドンを用いて設計することができる。一般に、配列が発現に使用されることになる場合、所期の宿主に好ましいコドンを選択することになる。標準的方法によって調製された重複オリゴヌクレオチドから完全ポリヌクレオチドを組み立て、そして完全コード配列に組み立てることができる。例えば、Edge、Nature、２９２巻：７５６頁（１９８１年）；Nambairら、Science、２２３巻：１２９９頁（１９８４年）；Jayら、J. Biol.Chem ２５９巻：６３１１頁（１９８４年）を参照されたい。
タンパク質への非天然アミノ酸の部位特異的組み込みのための一般的方法は、Christopher J. Noren、Spencer J. Anthony-Cahill、Michael C. Griffith、Peter G. Schultz、Science、２４４巻：１８２〜１８８頁（１９８９年４月）に記載されている。この方法を使用して、非天然アミノ酸を有する類似体を作成することができる。
上で述べたように、抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列を、クローニングするのではなく、合成的に調製することができる。
バリアント
一部の事例では、本明細書で提供される選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列バリアントが企図される。バリアントは、本明細書で具体的に開示されるポリペプチドとは１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入の点で概して異なる。そのようなバリアントは、天然に存在するものであってもよく、または例えば、本発明の上記ポリペプチド配列の１つもしくは複数を修飾すること、および本明細書で説明されるようなポリペプチドの１つもしくは複数の生物学的活性を評価すること、および／または当技術分野において周知のいくつかの技法のいずれかを使用することによって、合成的に生成してもよい。例えば、選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの結合親和性および／または他の生物学的特性を向上させることが望ましいことがある。選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ポリペプチドをコードする選択ヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、および／またはアミノ配列への残基の挿入、および／またはアミノ配列内の残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有するのであれば、欠失、挿入および置換のいずれの組合せを行って最終構築物に達してもよい。
一部の事例では、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する選択されたポリヌクレオチドのバリアントによってコードされるポリペプチドが提供される。抗体ポリペプチドの置換による変異誘発のための目的の部位は、ＣＤＲおよびＦＲを含む。目的の選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドにアミノ酸置換を導入し、その産物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持／向上、免疫原性の低下、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの向上についてスクリーニングすることができる。
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疎水性アミノ酸は、ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅを含む。中性親水性アミノ酸は、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎを含む。酸性アミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕを含む。塩基性アミノ酸は、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含む。鎖の配向に影響を与える残基を有するアミノ酸は、ＧｌｙおよびＰｒｏを含む。芳香族アミノ酸は、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅを含む。
一部の事例では、抗原への結合を実質的に低減させない置換、挿入または欠失を、１つまたは複数のＣＤＲ内で行うことができる。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的置換をＣＤＲに加えることができる。そのような変更がＣＤＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外部に存在してもよい。バリアントＶＨおよびＶＬ配列の一部の事例では、各ＣＤＲは、変更されないか、または１つ、２つもしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
変更（例えば、置換）をＣＤＲに、例えば、親和性を向上させるために加えることができる。そのような変更を、体細胞成熟中の高い変異率を有するコドンをコードするＣＤＲに加えることができ（例えば、Chowdhury、Methods Mol.Biol.２０７巻：１７９〜１９６頁（２００８年）を参照されたい）、得られたバリアントを結合親和性について試験することができる。親和性成熟（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、ＣＤＲのランダム化、またはオリゴヌクレオチド指定変異誘発を使用する）を使用して、親和性を向上させることができる（例えば、Hoogenboomら、Methods in Molecular Biology １７８巻：１〜３７頁（２００１年）を参照されたい）。標的または抗原結合に関与するＣＤＲ残基を、例えばアラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に識別することができる（例えば、CunninghamおよびWells、Science、２４４巻：１０８１〜１０８５頁（１９８９年）を参照されたい）。特に、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３は標的化されることが多い。あるいは、または加えて、抗体またはＴＣＲと抗原との接点を識別するために抗原−抗体または抗原−ＴＣＲ複合体の結晶構造。そのような接触残基および隣接残基を標的化してもよく、または置換の候補として除去してもよい。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを判定してもよい。
アミノ酸配列挿入および欠失は、１残基から、百またはそれ超の残基を含有するポリペプチドまで、長さに幅があるアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入および欠失を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基が挙げられる。分子の他の挿入バリアントは、抗体またはＴＣＲの血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ）またはポリペプチドへの、抗体もしくはＴＣＲのＮまたはＣ末端の 融合を含む。
一部の事例では、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、（例えば、１つまたは複数のグリコシル化部位が作成または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって）そのグリコシル化を増加または減少させるように変更される。例えば、Ｆｃ領域に付着している炭水化物を変更することができる。哺乳動物細胞からのネイティブ抗体は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ連結によって付着されている分岐した二分岐オリゴ糖を概して含む（例えば、WrightらTIBTECH １５巻：２６〜３２頁（１９９７年）を参照されたい）。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、二分岐オリゴ糖構造の幹の中のＧｌｃＮＡｃに付着しているフコースであり得る。抗体中のオリゴ糖に修飾を加えて、例えば、ある特定の特性が向上した抗体バリアントを作成することができる。抗体およびＴＣＲグリコシル化バリアントは、向上したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ機能を有することができる。
したがって、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、外因性および／または高内因性グリコシルトランスフェラーゼ活性の１つまたは複数を有する宿主細胞によって産生され得る。グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子としては、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩ）、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）、およびβ（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）が挙げられる。グリコトランスフェラーゼは、ゴルジ局在ドメインを含む融合物を含み得る（例えば、Lifelyら、Glycobiology ３１８巻：８１３〜２２頁（１９９５年）；Schachter、Biochem.Cell Biol.６４巻：１６３〜８１頁（１９８６年）；米国仮特許出願第６０／４９５，１４２号および同第６０／４４１，３０７号；特許公開第ＵＳ２００３／０１７５８８４号および同第ＵＳ２００４／０２４１８１７号；ならびにＷＯ０４／０６５５４０を参照されたい）。一部の事例では、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、破壊または不活性化されたグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む宿主細胞において発現され得る。したがって、一部の事例では、本発明は、（ａ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸、および（ｂ）ヒト疾患特異的標的などのヒト標的に結合する抗体またはＴＣＲポリペプチドをコードする選択されたリンパ球からの単離されたポリヌクレオチドを含む、宿主細胞を対象とする。特定の事例では、宿主細胞によって産生される選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの修飾ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含むＩｇＧ定常領域またはその断片を有する。別の特定の事例では、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、Ｆｃ領域を含むヒト化抗体またはその断片である。単離された核酸は、核酸分子を通常含有する細胞内に含有されている核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置にある。
宿主細胞によって産生される、グリコシル化変更を有する、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、Ｆｃ受容体結合親和性増加（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体などのＦｃγ活性化受容体への結合増加）および／またはエフェクター機能増加を示すことができる。エフェクター機能増加は、次のうちの１つまたは複数の増加であり得る：抗体依存性細胞傷害増加、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）増加、サイトカイン分泌増加、抗原提示細胞による免疫複合体介在性抗原取込み増加、Ｆｃ介在性細胞傷害増加、ＮＫ細胞への結合増加、マクロファージへの結合増加、多形核細胞（ＰＭＮ）への結合増加、単球への結合増加、標的結合抗体またはＴＣＲの架橋増加、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達増加、樹状細胞成熟増加、およびＴ細胞プライミング増加。したがって、一態様では、本発明は、糖鎖改変されていないポリペプチドと比較してエフェクター機能が増加された、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの糖型を提供する。（例えば、Tangら、J. Immunol.１７９巻：２８１５〜２８２３頁（２００７年）を参照されたい）。
本発明は、修飾オリゴ糖を有する、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを産生するための方法であって、（ａ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を発現するように改変された宿主細胞を、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生産を可能にする条件下で培養するステップであって、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、前記宿主細胞によって産生される選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＦｃ領域におけるオリゴ糖を改変するのに十分な量で発現されるステップと；（ｂ）選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを単離するステップとを含む方法も対象とする。別の事例では、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する２つのポリペプチドが存在する。本発明の方法によって産生される選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、増加したＦｃ受容体結合親和性および／または増加したエフェクター機能を有することができる。
一部の事例では、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのＦｃ領域におけるバイセクト型Ｎ連結オリゴ糖のパーセンテージは、全オリゴ糖の少なくとも約１０％〜約１００％、特に、少なくとも約５０％、さらに特に、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０〜９５％である。
別の事例では、本明細書で説明される方法によって産生される、増加したエフェクター機能および／または増加したＦｃ受容体結合親和性を有するように改変された選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む、組成物が提供される。一部の事例では、抗体またはＴＣＲは、インタクト抗体またはＴＣＲである。一部の事例では、抗体またはＴＣＲは、Ｆｃ領域を含有する抗体もしくはＴＣＲ断片であるか、または免疫グロブリンもしくはＴＣＲ鎖のＦｃ領域と同等の領域を含む融合タンパク質である。
一態様では、本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する本発明の抗体およびＴＣＲの生成のための宿主細胞発現系を提供する。詳細には、本発明は、向上した治療上の価値を有する本発明の抗体およびＴＣＲの糖型の生成のための宿主細胞系を提供する。したがって、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現するように選択または改変された宿主細胞発現系を提供する。
一般に、上で論じた細胞株を含むいずれのタイプの培養細胞株を、本発明の宿主細胞株を改変するためのバックグラウンドとして使用してもよい。一部の事例では、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞もしくはハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または植物細胞が、本発明の改変宿主細胞株を生成するためのバックグラウンド細胞株として使用される。
一部の事例では、本明細書で提供される抗体またはＴＣＲを、当技術分野において公知であり容易に利用できる追加の非タンパク質性部分構造を含有するように、さらに修飾することができる。抗体の誘導体化に好適な部分構造は、これに限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定のため、製造において有利であり得る。
ポリマーは、いずれの分子量のものであってもよく、および分岐していてもよく、または分岐していなくてもよい。抗体またはＴＣＲに付着させるポリマーの数は様々であってもよく、２つまたはそれ超のポリマーを付着させる場合、それらは、同じ分子であってもよく、または異なる分子であってもよい。
別の事例では、放射線への曝露によって選択的に加熱することができる、抗体またはＴＣＲと非タンパク質性部分構造のコンジュゲートが提供される。一部の事例では、非タンパク質性部分構造は、カーボンナノチューブである（例えば、Kamら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA １０２巻：１１６００〜１１６０５頁（２００５年）を参照されたい）。放射線は、いずれの波長のものであってもよく、通常の細胞を害さないが、抗体−またはＴＣＲ−非タンパク質性部分構造の近くにある細胞が殺滅される温度に非タンパク質性部分構造を加熱する波長を含むが、これに限定されない。
変異頻度
抗体またはＴＣＲは、対応する生殖系列配列からの少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％もしくは２０％の、またはそれより高い変異頻度を有する重鎖、軽鎖、ＴＣＲαまたはＴＣＲβ配列を含むことができる。例えば、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされる抗体は、生殖系列配列からの少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％もしくは２０％の、またはそれより高い変異頻度を有する軽鎖配列であるＣＤＲ３領域を含むことがある。例えば、本発明の抗体は、対応する生殖系列配列からの少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％もしくは２０％の、またはそれより高い変異頻度を有する重鎖および軽鎖配列を含むことができる。
一部の事例では、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはＴＣＲは、ヒト抗体またはＴＣＲである。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技法を使用して産生することができる（例えば、van Dijkおよびvan de Winkel、Curr. Opin. Pharmacol.５巻：３６８〜７４頁（２００１年）；ならびにLonberg、Curr. Opin. Immunol.２０巻：４５０〜４５９頁（２００８年）を参照されたい）。ヒト抗体またはＴＣＲは、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体もしくはＴＣＲのアミノ酸配列に対応する、またはヒト抗体レパトア、もしくはヒト抗体をコードしている他の配列を用いて非ヒト源から誘導された抗体もしくはＴＣＲのアミノ酸配列に対応する、アミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体は、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドから、例えば、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドからの配列を含むベクターから、調製することができる。
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。例えば、ヒト抗体は、ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株から、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術および他の方法を使用して産生することができる（例えば、Kozbor、J. Immunol.、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、５１〜６３頁（１９８７年）；Boernerら、J. Immunol.、１４７巻：８６頁（１９９１年）；Liら、Proc. Natl. Acad.、１０３巻：３５５７〜３５６２頁（２００６年）；米国特許第７，１８９，８２６号；Ni、Xiandai Mianyixue、２６巻（４号）：２６５〜２６８頁（２００６年）；VollmersおよびBrandlein、Histology and Histopathology、２０巻（３号）：９２７〜９３７頁（２００５年）；ならびにVollmersおよびBrandlein、Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology、２７巻（３号）：１８５〜９１頁（２００５年）を参照されたい）。ヒト抗体およびＴＣＲは、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。そのような可変ドメイン配列を、次いで、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。
選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの標的の識別およびその特性解析
選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされる、組換えでまたは合成的に産生されたポリペプチドを検証または特性解析するステップを含む方法が開示される。選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、当技術分野において公知の様々なアッセイによってそれらの物理的／化学的特性および／または生物学的活性についてアッセイ、スクリーニングまたは特性解析することができる。選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの標的の正体を決定する方法が開示される。開示される方法は、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの物理的／化学的特性および／または生物学的活性を様々なアッセイによってスクリーニングまたは特性解析するステップを含むことがある。標的は、タンパク質または抗原、例えば、組織特異的タンパク質または抗原であり得る。一部の事例では、タンパク質または抗原は、疾患特異的タンパク質または抗原、例えば、がん特異的タンパク質または抗原であってもよい。
一態様では、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、例えば抗体またはＴＣＲは、その抗原結合活性について、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどによって試験される。例えば、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、複数の抗原またはタンパク質に対するその結合活性について、例えば、免疫沈降および質量分析を使用して、または試験されることになる複数のタンパク質もしくは抗原を含むタンパク質アレイを使用して、試験することができる。タンパク質アレイは、ポリペプチドの捕捉に適応するバイオチップを指す。多くのタンパク質バイオチップが当技術分野において記載されている。ポリペプチドアレイを生成する方法は、例えば、De Wildtら、２０００年、Nat. Biotechnol.１８巻：９８９〜９９４頁；Luekingら、１９９９年、Anal.Biochem.２７０巻：１０３〜１１１頁；Ge、２０００年、Nucleic Acids Res.２８巻、ｅ３、１−ＶＨ；MacBeathおよびSchreiber、２０００年、Science ２８９巻：１７６０〜１７６３頁；ＷＯ０１／４０８０３ならびにＷＯ９９／５１７７３Ａ１に記載されている。アレイの使用により、標的の識別をロボットでおよび／またはハイスループット様式で行うことが可能になる。
例えば、市販のロボット装置、例えばＧｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓまたはＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓからのものを使用して、アレイにポリペプチドを高速でスポッティングすることができる。アレイ基板は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば表面改質ガラスであってもよい。アレイは、多孔質マトリックス、例えば、アクリルアミド、アガロース、または別のポリマーも含むことがある。バイオチップ上に捕捉し次第、例えば、気相イオン分光法、光学的方法、電気化学的方法、原子間力顕微鏡法および高周波法から選択される様々な検出方法によって、分析物を検出することができる。特に興味深いのは、質量分析および特にＳＥＬＤＩの使用である。光学的方法は、例えば、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、複屈折率または屈折率の検出（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共鳴ミラー法、グレーティングカプラ導波管法、または干渉法）を含む。光学的方法は、顕微鏡法（共焦点のものと非共焦点のもの両方）、イメージング法および非イメージング法を含む。様々な形式でのイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）は、固相上に捕捉された分析物の検出によく用いられる方法である。電気化学的方法は、ボルタンメトリーおよびアンペロメトリー法を含む。高周波法は、多極共鳴分光法を含む。
一態様では、競合アッセイを使用して、選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと標的への結合について競合する分子、例えば、ポリペプチド、抗体または小分子を識別することができる。一部の事例では、そのような競合分子は、選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが結合するのと同じエピトープ（例えば、直鎖状または立体構造エピトープ）と結合する。例示的なエピトープマッピング法は公知である（例えば、Methods in Molecular Biology 第６６巻（１９９６年）におけるMorris、「Epitope Mapping Protocols」を参照されたい）。例示的な競合アッセイでは、固定化標的は、該標的と結合する選択されたポリヌクレオチドによってコードされる第１の標識ポリペプチドと第２の非標識ポリペプチドとを含む溶液中でインキュベートされ、第２の非標識ポリペプチドが、選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、標的との結合について競合するその能力について試験されることになる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在することがある。対照として、固定化標的は、選択されたポリヌクレオチドによってコードされる第１の標識ポリペプチドを含むが第２の非標識分子を含まない溶液中でインキュベートされる。選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの標的への結合が可能な条件下でのインキュベーション後、過剰な非結合ポリペプチドが除去され、固定化標的と会合している標識の量が測定される。固定化標的と会合している標識の量が、対照試料と比べて試験試料において実質的に低減された場合には、それは、第２の分子が、選択されたリンパ球の選択されたポリヌクレオチドによってコードされる第１のポリペプチドと、標的への結合について競合していることを示す（例えば、HarlowおよびLane Antibodies：A Laboratory Manual １４章（１９９６年）を参照されたい）。
一部の事例では、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはＴＣＲポリペプチドは、約１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０１ｎＭ、または０．００１ｎＭもしくはそれ未満（例えば、１０−８Ｍもしくはそれ未満、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。本発明の別の態様は、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、その標的に対する親和性が増したポリペプチド、例えば、親和性成熟した抗体またはＴＣＲを提供する。親和性成熟した抗体またはＴＣＲは、１つまたは複数の超可変領域（ＨＶＲ）の１つまたは複数の変更を、そのような変更を有さない親抗体またはＴＣＲと比較して、有する抗体またはＴＣＲであり、そのような変更は、抗原または標的に対する抗体またはＴＣＲの親和性の向上をもたらす。これらの抗体およびＴＣＲは、約５×１０−９Ｍ、２×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、２×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１×１０−１２Ｍ、またはそれ未満のＫＤで標的と結合することができる。一部の事例では、本発明は、生殖系列抗体またはＴＣＲと比較して少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍またはそれを超えて増加した親和性を有する、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはＴＣＲを提供する。一部の事例では、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ＡＤＣＣ活性を含む、Ｆｃ介在性細胞傷害などの、エフェクター機能活性を示す。
ＫＤは、任意の好適なアッセイによって測定することができる。例えば、ＫＤは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定することができる（例えば、Chenら、J. Mol.Biol.２９３巻：８６５〜８８１頁（１９９９年）；Prestaら、Cancer Res.５７巻：４５９３〜４５９９頁（１９９７年）を参照されたい）。例えば、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００を使用して）測定することができる。
一部の事例では、本明細書で提供される抗体またはＴＣＲは、多重特異性抗体またはＴＣＲ、例えば、二重特異性抗体またはＴＣＲである。多重特異性抗体またはＴＣＲは、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有する抗体またはＴＣＲであり得る（例えば、米国特許公開第ＵＳ２００８／００６９８２０号を参照されたい）。一部の事例では、結合特異性の１つは、第１の標的に対するものであり、その他は、いずれかの他の標的に対するものである。一部の事例では、二重特異性抗体またはＴＣＲは、標的の２つの異なるエピトープと結合することができる。二重特異性抗体またはＴＣＲを使用して、疾患にかかった細胞または感染細胞に細胞傷害性薬剤を局在させることもできる。二重特異性抗体またはＴＣＲは、完全長抗体もしくはＴＣＲとして調製されることもあり、または抗体もしくはＴＣＲ断片として調製されることもある。
多重特異性抗体またはＴＣＲを作製するための例示的な技法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアまたはＴＣＲα鎖−ＴＣＲβ鎖ペアの組換え共発現；Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための静電誘導効果の改変；２つまたはそれ超の抗体、ＴＣＲまたはその断片の架橋；二重特異性抗体またはＴＣＲを産生するためのロイシンジッパーの使用；二重特異性抗体またはＴＣＲ断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体の使用；三重特異性抗体またはＴＣＲの調製、および「ノブインホール」工学（"knob-in-hole" engineering）が挙げられる（例えば、MilsteinおよびCuello、Nature ３０５巻：５３７頁（１９８３年）；ＷＯ０９／０８９００４Ａ１；ＷＯ９３／０８８２９；Trauneckerら、EMBO J. １０巻：３６５５頁（１９９１年）；米国特許第４，６７６，９８０号および同第５，７３１，１６８号；Brennanら、Science、２２９巻：８１頁（１９８５年）；Kostelnyら、J. Immunol.、１４８巻（５号）：１５４７〜１５５３頁（１９９２年）；Hollingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）；Gruberら、J. Immunol.、１５２巻：５３６８頁（１９９４年）；ならびにTuttら、J. Immunol.１４７巻：６０頁（１９９１年）を参照されたい）。３つまたはそれ超の機能的抗原結合部位を有する改変抗体またはＴＣＲも含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６を参照されたい）。
一態様では、生物学的活性を有する選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされる１つまたは複数のポリペプチドを識別するためのアッセイが提供される。一部の事例では、標的に対する中和活性を有する選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを識別するためのアッセイが提供される。ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでのそのような生物学的活性を有する選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも提供される。一部の事例では、本発明の選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、そのような生物学的活性について試験される。
一態様では、試料が採取された疾患にかかった組織の病態に関連するまたは特異的な抗原または標的に対して反応性、高い親和性および／または高い特異性を有する、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされる１つまたは複数のポリペプチドを識別するためのアッセイが提供される。
一態様では、ファージ、リボソーム、またはＲＮＡディスプレイ技法を使用して、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされる１つまたは複数のポリペプチドを識別するためのアッセイが提供される。例えば、これらの技法を使用して、関連反応性を有する選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドについて選択することができる。選択前の反応性と選択後の反応性を比較することで、反応性を有するポリペプチド、したがって病的である可能性が高いポリペプチドを識別することができる。別の事例では、特異的ディスプレイ技法（例えば、ファージ、リボソームまたはＲＮＡディスプレイ）をアレイ形式で使用することができる。例えば、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされる１つまたは複数のポリペプチドからの個々の配列を保有する個々の分子（またはこれらの個々の分子の増幅）をファージ、リボソームまたはＲＮＡのいずれかに応じて配置することができる。次いで、特異的標的または抗原を研究して、それらに結合するペプチド（例えば、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチド）をコードする配列を識別することができる。次いで、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされる１つまたは複数のポリペプチドの標的の正体に基づいて、疾患に関連する抗原を阻害する薬物を選択することができる。
一部の態様では、罹患およびまたは非罹患試料、例えば組織試料またはＦＦＰＥ試料、またはＮＡＴ試料を使用するイムノアッセイ技法を使用する、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされる１つまたは複数のポリペプチドを識別するためのアッセイが提供される。組織試料は、いくつかの公知の組織学的分析技法、組織化学的分析技法、免疫組織学的分析技法、病理組織学的分析技法、顕微鏡分析技法（形態計測分析および／または三次元再構成を含む）、細胞学的分析技法、生化学的分析技法、薬理学的分析技法、分子生物学的分析技法、免疫化学的分析技法、イメージング分析技法または他の分析技法のいずれかによる分析のために、実質的に平行な面に沿って切断して複数の連続組織切片にすることができる。例えば、BancroftおよびGamble、Theory and Practice of Histological Techniques（第６版）、２００７年、Churchill Livingstone、Oxford、UK；Kieman、Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice、２００１年、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.；M. A. Hayat（編）、Cancer Imaging - １および２巻、２００７年、Academic Press、NYを参照されたい。
使用方法
疾患特異的細胞、例えばがん細胞、の免疫系介在性破壊に関与する疾患特異的抗原、例えばがん抗原、の分子識別は、本明細書で説明される方法を使用して識別された標的を阻害する、公知の薬物の識別ならびに／または特異的活性薬物、例えばペプチド、核酸、抗体および小分子、の開発に有用である。疾患特異的細胞、例えばがん細胞、の免疫系介在性破壊に関与する疾患特異的抗原、例えばがん抗原、の分子識別は、疾患に対する特異的能動免疫処置戦略（例えば、がんワクチン）の開発に有用であり、養子免疫療法で使用するためのリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成にも有用である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトがん抗原に対して反応性のリンパ球を使用することにより、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングしてこれらの抗原をコードする遺伝子を識別することが可能となった。
本明細書で説明される抗体および抗原結合断片などの、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの組成物は、非治療用薬剤として（例えば、アフィニティー精製剤）として使用することができる。一般に、１つのそのような事例では、当技術分野において公知の従来の方法を使用して目的のタンパク質をＳｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙などの固相上に固定化する。固定化されたタンパク質を、精製すべき目的の標的（またはその断片）を含有する試料と接触させ、その後、支持体を、固定化されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチド（例えば、抗体）と結合している標的タンパク質を除いて、試料中の実質的にすべての材料を除去する好適な溶媒で洗浄する。最後に、支持体を別の好適な溶媒、例えば、グリシン緩衝液、ｐＨ５．０で洗浄し、これにより標的タンパク質が放出されることになる。精製に加えて、組成物は、標的タンパク質に関連する疾患および障害の検出、診断および治療に使用することができる。
本出願の一事例による患者は、疾患または障害、例えば罹患試料と同じ疾患または障害、の１つまたは複数の臨床兆候および／または症状を示す哺乳動物（例えば、ヒト）である。ある特定の状況では、患者は、無症状であるにもかかわらず、やはり疾患または障害の臨床兆候を有することがある。
選択された抗体、ＴＣＲもしくはその抗原結合断片を治療用部分構造にコンジュゲートしてもよく、または選択された抗体、ＴＣＲもしくはその抗原結合断片が、治療用部分構造を含有する融合タンパク質であってもよい。選択された抗体、ＴＣＲもしくはその抗原結合断片を検出可能な部分構造にコンジュゲートしてもよく、または検出可能な部分構造を含有する融合タンパク質であってもよい。一事例では、選択された抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片を、治療用部分構造と検出可能な部分構造の両方にコンジュゲートすることができる。選択された抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片をアフィニティータグ（例えば精製タグ）にコンジュゲートしてもよく、またはアフィニティータグを用いて組換え操作によって作ってもよい。
本明細書で提供される抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片は、治療用部分構造および／またはイメージングもしくは検出可能な部分構造および／またはアフィニティータグにコンジュゲートするまたは連結させることができるような、抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片である。ポリペプチドをコンジュゲートするまたは連結させる方法は、当技術分野において周知である。化合物と標識間の会合（結合）は、これらに限定されるものではないが、共有結合性および非共有結合性相互作用、化学的コンジュゲーションならびに組換え技法を含む、当技術分野において公知のあらゆる手段を含む。
診断法
抗タンパク質抗体、ＴＣＲおよびそれらの断片は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出、診断および／またはモニタリング目的に使用することができる。標的タンパク質（および場合によっては、過剰または変異タンパク質）は、複数の疾患および障害に関与し得る。標的タンパク質関連疾患および状態の処置は、一部にはそれらの診断に依存し、本明細書で説明される抗体、ＴＣＲおよびその抗原結合断片は、過剰もしくは変異標的タンパク質の診断に、または標的タンパク質活性に関連する疾患および状態の診断に有用である。
試料または対象における標的タンパク質レベルを検出する方法であって、（ｉ）抗体、ＴＣＲ、またはその抗原結合断片を対象からの試料と接触させるステップと、（ｉｉ）選択された抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片とタンパク質の複合体を検出するステップとを含む方法が本明細書で提供される。
一事例では、選択された抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片は、検出可能な部分構造をさらに含む。検出は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行ってもよく、ｉｎ ｖｉｖｏで行ってもよく、またはｅｘ ｖｉｖｏで行ってもよい。選択された抗体、ＴＣＲまたはそれらの抗原結合断片を用いる標的タンパク質の検出および／または判定（定量、定性など）のためのｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイには、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびウェスタンブロットが含まれるが、これらに限定されない。標的タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出、診断またはモニタリングは、患者から試料（例えば、生検試料）を得ること、および試料を例えば標準的ＥＬＩＳＡアッセイで試験することによって、行うことができる。例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートを、本明細書で説明される選択された抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片で被覆し、被覆膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／ＢＳＡで洗浄して、非特異的結合を阻害することができる。試料を系列希釈し、２ウェルずつウェルに入れることができ、これらのウェルが標的タンパク質の系列希釈標準曲線と比較される。ウェルのインキュベーションおよび洗浄後、ビオチンで標識された抗標的タンパク質抗体またはＴＣＲを添加し、その後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを添加することができる。ウェルを洗浄し、基質（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を添加してプレートを現像することができる。従来のプレートリーダーおよびソフトウェアを使用してプレートを読み取ることができる。
検出がｉｎ ｖｉｖｏで行われる場合、接触は、本明細書の他の箇所で説明されるものなどの任意の従来の手段を使用する抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片の投与によって行われる。そのような方法では、試料または対象における標的タンパク質（および場合によっては標的タンパク質の過剰レベル）の検出を使用して、本明細書で説明される疾患および障害などの、標的タンパク質の活性に関連するまたは相関する疾患または障害を診断することができる。
標的タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの検出、診断またはモニタリングの場合、標的タンパク質と結合する選択された抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片であって、検出可能な部分構造と結合している、選択された抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片が、患者に投与される。検出可能な部分構造は、当技術分野において認知されている方法、例えば、これらに限定されるものではないが、例えば、各々その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，０９６，２８９号、米国特許第７，１１５，７１６号、米国特許第７，１１２，４１２号、米国特許出願第２００３０００３０４８号および米国特許出願第２００６０１４７３７９号に記載されているような、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、蛍光、放射性イメージング、内視鏡、腹腔鏡または血管内留置カテーテルによって供給される光源（すなわち、光活性剤の検出による）、フォトスキャニング、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャニング、全身核磁気共鳴（ＮＭＲ）、放射性シンチグラフィー、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、標的化近赤外領域（ＮＩＲ）スキャニング、Ｘ線、超音波などを使用して可視化することができる。そのような方法を使用して化合物を検出するための標識もまた当技術分野において公知であり、このような特許および出願に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。検出可能な部分構造の可視化は、標的タンパク質に関連する状態または疾患の検出、診断および／またはモニタリングを可能にすることができる。
所望の標的タンパク質、すなわち標的タンパク質、に特異的な抗体またはＴＣＲを用いるさらなる診断アッセイは当技術分野において公知であり、それらもまた本明細書において企図される。
状態および疾患の検出、診断またはモニタリングの場合、選択されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが検出可能な部分構造にコンジュゲートされている、選択された抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片の組成物を対象患者に投与することができる。部分構造は、上で説明したものなどの当技術分野において認知されている方法を使用して可視化することができる。検出可能な部分構造の可視化は、状態または疾患の検出、診断および／またはモニタリングを可能にすることができる。
したがって、治療的処置の必要性を示す可能性がある、疾患または障害に関連する標的タンパク質の過剰レベルの、またはそのような標的タンパク質の、検出または診断に有用である、標的タンパク質に対するＩｇまたはＴＣＲポリペプチド（例えば、抗体、ＴＣＲ、およびその抗原結合断片）を含む組成物が提供される。ある特定の事例では、抗体またはＴＣＲは、本明細書で説明される選択されたおよび任意選択でヒト化された抗標的タンパク質抗体またはＴＣＲを含む。他の事例では、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはＴＣＲポリペプチドは、第２の薬剤をさらに含む。そのような薬剤は、例えばレポーター分子または検出可能な標識などの、分子または部分構造であってもよい。このような検出方法のための検出可能な標識／部分構造は、当技術分野において公知であり、より詳細に下で説明される。レポーター分子は、アッセイを使用して検出することができる、あらゆる部分構造である。ポリペプチドにコンジュゲートされたレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはリガンド、例えばビオチンが挙げられる。検出可能な標識には、それらの特異的な機能的特性および／または化学的特徴のため検出することができる化合物および／要素が含まれ、それらの使用により、それらが付着しているポリペプチドを検出すること、および／または必要に応じてさらに定量することが可能になる。多くの適切な検出可能（イメージング）薬剤が当技術分野において公知であり、ポリペプチドにそれらを付着させる方法も公知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号、同第４，９３８，９４８号および同第４，４７２，５０９号を参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる）。
検出可能な部分構造を有する抗体またはＴＣＲなどのポリペプチドを連結する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、融合タンパク質を形成するための組換えＤＮＡ技術、およびコンジュゲーション（例えば、化学的コンジュゲーション）を含む。化学的コンジュゲーションまたは組換え工学によって融合タンパク質を調製するための方法は、当技術分野において周知である。成分を共有結合的におよび非共有結合的に連結させる方法も、当技術分野において公知である。例えば、Williams（１９９５年）Biochemistry ３４巻：１７８７〜１７９７頁；Dobeli（１９９８年）Protein Expr.Purif.１２巻：４０４〜４１４頁；およびKroll（１９９３年）DNA Cell.Biol.１２巻：４４１〜４５３頁を参照されたい。
一部の事例では、標識または部分構造と抗体、ＴＣＲまたはそれらの抗原結合断片の１つまたは複数の部分との間に非構造ポリペプチドリンカー領域を導入する必要があることがある。リンカーは、いずれか２つの断片間の可動性向上および／または立体障害低減を助長することができる。リンカーは、各断片の適切な折り畳みの発生を助長することもできる。リンカーは、タンパク質の２ドメイン間のランダムコイルの中に存在すると判定された配列などの、天然起源のものであってもよい。１つのリンカー配列は、サブユニットであるＲＮＡポリメラーゼのＣ末端ドメインとＮ末端ドメインの間で見出されるリンカーである。天然に存在するリンカーの他の例としては、１ＣＩおよびＬｅｘＡタンパク質において見出されるリンカーが挙げられる。
リンカー内のアミノ酸配列は、実験により決定されるようなまたはモデリングによって明らかにされるようなリンカーの特徴に基づいて変えることができる。リンカーを選ぶ上での考慮事項としては、リンカーの可動性、リンカーの電荷、および天然に存在するサブユニット内のリンカーの一部のアミノ酸の存在が挙げられる。リンカーは、リンカー内の残基がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と接触するように設計することもでき、そうすることによって結合親和性もしくは特異性または他のタンパク質との相互作用に影響を与えることができる。サブユニット間のより長い距離にわたる必要がある場合またはドメインが特定の立体配置で保持されなければならない場合などの一部の事例では、リンカーは、任意選択で、追加の折り畳まれたドメインを含有することがある。一部の事例では、リンカーの設計は、リンカーが比較的短い距離、例えば約１０オングストローム（Å）未満にわたることが求められるドメインの配置を含むことがある。しかし、ある特定の事例では、リンカーは、約５０オングストロームまでの距離にわたる。
リンカー内のアミノ酸配列は、実験により決定されるようなまたはモデリングによって明らかにされるようなリンカーの特徴に基づいて変えることができる。リンカーを選ぶ上での考慮事項としては、リンカーの可動性、リンカーの電荷、および天然に存在するサブユニット内のリンカーの一部のアミノ酸の存在が挙げられる。リンカーは、リンカー内の残基がＤＮＡと接触するように設計することもでき、そうすることによって結合親和性もしくは特異性または他のタンパク質との相互作用に影響を与えることができる。一部の事例では、サブユニット間のより長い距離にわたる必要がある場合、またはドメインが特定の立体配置で保持されなければならない場合、リンカーは、任意選択で、追加の折り畳まれたドメインを含有することがある。
ポリペプチド（遊離または細胞結合）をビーズに結合させるための方法は、当分野において公知である。結合されたポリペプチドを選択するための方法、またはポリペプチドを提示する細胞を選択する方法も、当技術分野において公知である。簡単に言うと、官能基で修飾された、あるいは様々な抗体またはリガンド、例えばアビジン、ストレプトアビジンもしくはビオチンで被覆された、微粒子表面にペプチドを結合させる、常磁性ポリスチレン微粒子が市販されている（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ、ＩＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。
微粒子の常磁性特性により、磁石を使用してそれらを溶液から分離することが可能になる。磁石から除去すると微粒子を容易に再懸濁させることができる。ポリペプチドを、ポリウレタン層で被覆された常磁性ポリスチレン微粒子に、試験管の中で結合させることができる。微粒子表面のヒドロキシ基は、ｐ−トルエンスルホニルクロリドとの反応によって活性化される（Nilsson KおよびMosbach K.、「p-Toluenesulfonyl chloride as an activating agent of agarose for the preparation of immobilized affinity ligands and proteins」、Eur. J. Biochem.１９８０年：１１２巻：３９７〜４０２頁）。あるいは、表面カルボン酸を含有する常磁性ポリスチレン微粒子をカルボジイミドで活性化し、その後、ポリペプチドと結合させ、その結果、ポリペプチドの第１級アミノ基と微粒子の表面のカルボン酸基との間に安定したアミド結合を生じさせることができる（Nakajima NおよびIkade Y、Mechanism of amide formation by carbodiimide for bioconjugation in aqueous media、Bioconjugate Chem.１９９５年、６巻（１号）、１２３〜１３０頁；Gilles MA、Hudson AQおよびBorders CL Jr、Stability of water-soluble carbodiimides in aqueous solution、Anal Biochem.１９９０年２月１日、１８４巻（２号）：２４４〜２４８頁；Sehgal DおよびVijay IK、a method for the high efficiency of water-soluble carbodiimide-mediated amidation、Anal Biochem.１９９４年４月、２１８巻（１号）：８７〜９１頁；Szajani Bら、Effects of carbodiimide structure on the immobilization of enzymes、Appl Biochem Biotechnol.１９９１年８月、３０巻（２号）：２２５〜２３１頁）。別の選択肢は、表面がストレプトアビジンの単層と共有結合的に連結している常磁性ポリスチレン微粒子に、ビオチン化ポリペプチドを結合させることである。（Argarana CE、Kuntz ID、Birken S、Axel R、Cantor CR、Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene、Nucleic Acids Res.１９８６年、１４巻（４号）：１８７１〜８２頁；Pahler A、Hendrickson WA、Gawinowicz Kolks MA、Aragana CE、Cantor CR、Characterization and crystallization of core streptavidin、J Biol Chem １９８７年、２６２巻（２９号）：１３９３３〜７頁）。
ポリペプチドを多種多様な蛍光色素、クエンチャーおよびハプテン、例えば、フルオレセイン、Ｒ−フィコエリトリンおよびビオチンにコンジュゲートすることができる。コンジュゲーションをポリペプチド合成中に行ってもよく、またはポリペプチドを合成し、精製した後に行ってもよい。ビオチンは、アビジンおよびストレプトアビジンタンパク質に高い親和性で結合する小さい（２４４ｋＤａ）ビタミンであり、ほとんどのペプチドにそれらの生物学的活性を変えることなくコンジュゲートすることができる。ビオチン標識ポリペプチドは、固定化ストレプトアビジンおよびアビジンアフィニティーゲルを使用して非標識ポリペプチドから容易に精製され、ストレプトアビジンまたはアビジンコンジュゲートプローブを使用して、例えばＥＬＩＳＡ、ドットブロットまたはウェスタンブロット利用で、ビオチン化ポリペプチドを検出することができる。ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、最も一般的に使用されているタイプのビオチン化剤である。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ビオチンは、生理学的緩衝液中で第１級アミノ基と効率的に反応して、安定したアミド結合を形成する。ポリペプチドは、Ｎ末端に第１級アミンを有し、そしてまたリシン残基の側鎖にもいくつかの第１級アミンを有することができ、これらの第１級アミンは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ビオチン試薬での標識の標的として利用可能である。様々な特性およびスペーサーアーム長を有する、ビオチンのいくつかの異なるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）が、入手可能である。スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル試薬は水溶性であり、それによって有機溶媒の非存在下で反応を行うことができる。
ビオチンのポリペプチドに対するモル対モル比は、当技術分野において認知されている技法を使用する２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）アッセイを使用して概算することができる（Green, NM、（１９７５年）、「Avidin.In Advances in Protein Chemistry.」、Academic Press、New York.２９巻、８５〜１３３頁；Green, NM、（１９７１年）、「The use of bifunctional biotinyl compounds to determine the arrangement of subunits in avidin」、Biochem J. １２５巻、７８１〜７９１頁；Green, NM.、（１９６５年）、「A spectrophotometric assay for avidin and biotin based on binding of dyes by avidin」、Biochem.J. ９４巻：２３ｃ〜２４ｃ頁）。いくつかのビオチン分子をポリペプチドにコンジュゲートすることができ、各ビオチン分子は、１つのアビジン分子に結合することができる。ビオチン−アビジン結合形成は非常に迅速であり、有機溶媒、極端なｐＨおよび変性試薬中で安定している。ビオチン化を定量するために、ビオチン化ポリペプチドを含有する溶液が２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）とアビジンの混合物に添加される。ビオチンのほうがアビジンに対する親和性が高いため、ビオチンが２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）を置換し、５００ｎｍでの吸光度が比例的に低下する。溶液中のビオチンの量は、単一キュベットにおいて、ビオチン含有ペプチドの添加前および添加後の２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）−アビジン溶液の吸光度を測定することによって、定量することができる。吸光度の変化は、２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸）−アビジン複合体の減衰係数により試料中のビオチンの量に関係づけられる。
あるいは、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを蛍光部分構造とコンジュゲートすることができる。ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドと蛍光部分構造（例えば、Ｒ−フィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）など）のコンジュゲーションは、例えば、Glazer, ANおよびStryer L.（１９８４年）、Trends Biochem.Sci.９巻：４２３〜７頁；Kronick, MNおよびGrossman, PD（１９８３年）Clin.Chem.２９巻：１５８２〜６頁；Lanier, LLおよびLoken, MR（１９８４年）J. Immunol.、１３２巻：１５１〜１５６頁；Parks, DRら（１９８４年）Cytometry ５巻：１５９〜６８頁；Hardy, RRら（１９８３年）Nature ３０６巻：２７０〜２頁；Hardy RRら（１９８４年）J. Exp.Med.１５９巻：１１６９〜８８頁；Kronick, MN（１９８６年）J. Immuno.Meth.９２巻；１〜１３頁；Der-Balian G、Kameda, NおよびRowley, G.（１９８８年）Anal.Biochem.１７３巻：５９〜６３頁に記載されている、当技術分野において認知されている技法を使用して、果たすことができる。
１つの非限定的な事例では、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを、標的タンパク質の免疫検出のために放射性核種、鉄関連化合物、色素、イメージング剤または蛍光剤などの検出可能な標識と会合させる（そのような標識にコンジュゲートする）ことができ、そのような標識を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで標的タンパク質へのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの結合を可視化することができる。
放射標識の非限定的な例としては、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７１Ｇｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７７Ａｓ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ／８１ＭＫｒ、８７ＭＳｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１００Ｐｄ、１０１Ｒｈ、１０３Ｐｂ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１９Ｓｂ、１２１Ｓｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２８Ｂａ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３１Ｃｓ、１４３Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９１Ｏｓ、１９３Ｐｔ、１９４Ｉｒ、１９７Ｈｇ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉおよび２１３Ｂｉが挙げられる。放射標識は、従来の化学を使用して化合物に付着させることができる。放射標識化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断技法において、およびｉｎ ｖｉｖｏ放射性イメージング技法において、および放射免疫療法において有用である。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングの事例では、例えば、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、キレート基によって多数の常磁性イオンを持っている場合、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを、放射性同位体ではなく、磁気共鳴イメージング増強剤を含むがこれに限定されないイメージング剤にコンジュゲートしてもよい。キレート基の例としては、ＥＤＴＡ、ポルフィリン、ポリアミンクラウンエーテルおよびポリオキシムが挙げられる。常磁性イオンの例としては、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユーロピウム、ランタン（lanthanium）、ホルミウムおよびフェルミウム（ferbium）が挙げられる。そのような検出可能な部分構造には、金属；金属キレート剤；ランタニド；ランタニドキレート剤；放射性金属；放射性金属キレート剤；陽電子放射性核種；マイクロバブル（超音波の場合）；リポソーム；リポソームまたはナノスフェアにマイクロカプセル化された分子；単結晶性酸化鉄ナノ化合物；磁気共鳴イメージング造影剤；光吸収、反射および／または散乱剤；コロイド粒子；フルオロフォア、例えば近赤外フルオロフォアも含まれる。多くの場合、そのような第２級官能基／部分構造は比較的大きく、例えば、サイズが少なくとも２５原子質量単位（ａｍｕ）であり、多くの事例で、サイズが少なくとも５０、１００または２５０ａｍｕであり得る。ある特定の事例では、第２級官能基は、金属をキレート化するためのキレート部分構造、例えば、放射性金属または常磁性イオンのためのキレート剤である。複数の事例では、それは、放射線治療またはイメージング手順に有用な放射性核種用のキレート剤である。
治療
識別された標的タンパク質に関連する１つまたは複数の疾患または障害を予防または処置する方法であって、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、例えば選択された抗体、ＴＣＲもしくはその抗原結合断片、の識別された標的を阻害するもしくはそれと結合する薬物、ペプチド、核酸、または小分子を含む、組成物であって、疾患または障害に関連する識別された標的タンパク質と結合する組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
標的タンパク質に関連する１つまたは複数の疾患または障害を予防または処置する方法であって、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、例えば選択された抗体、ＴＣＲもしくはその抗原結合断片、の識別された標的を阻害するもしくはそれと結合する薬物、ペプチド、核酸、または小分子を含む、組成物であって、疾患または障害に関連するタンパク質と結合し、識別された標的タンパク質とその識別されたタンパク質の結合パートナー、例えばリガンドとの複合体形成を減少させる組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、例えば選択された抗体、ＴＣＲもしくはその抗原結合断片、の識別された標的を阻害するもしくはそれと結合する薬物、ペプチド、核酸、または小分子を含む、組成物を、患者（例えば哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物、例えば霊長類、齧歯動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）に、識別された標的タンパク質に関連する疾患または障害を阻害することによってあらゆる医療処置に適用可能な妥当な損益比で何らかの望ましい治療効果を生じさせるのに有効である治療有効量で、投与することができる。本組成物をヒト患者に投与するために、本組成物を当業者に公知の方法論によって製剤化することができる。治療有効量は、臓器または組織において所望の治療または発病予防効果を少なくとも部分的に達成する量である。一例では、疾患または障害の予防および／または治療的処置をもたらすのに必要な、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、例えば選択された抗体、ＴＣＲもしくはその抗原結合断片、の識別された標的を阻害するもしくはそれと結合する薬物、ペプチド、核酸、または小分子の量、それ自体は、固定されない。選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、例えば選択された抗体、ＴＣＲもしくはその抗原結合断片、の識別された標的を阻害するもしくはそれと結合する薬物、ペプチド、核酸、または小分子の投与される量は、薬物のタイプ、疾患のタイプ、疾患の広がり、および疾患または障害に罹患している哺乳動物のサイズによって異なるであろう。一部の事例では、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、例えば選択された抗体、ＴＣＲもしくはその抗原結合断片、の識別された標的を阻害するもしくはそれと結合する２つまたはそれ超の薬物、ペプチド、核酸、または小分子が、組合せで患者に投与される。組合せは、選択されたリンパ球のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、例えば選択された抗体、ＴＣＲもしくはその抗原結合断片、の識別された標的を阻害するもしくはそれと結合する薬物、ペプチド、核酸、または小分子の同時投与または後続投与を含む。
応答は、患者が、病気の徴候または症状の部分的もしくは完全緩和または低減を経験すると得られ、特に、生存期間の延長を含むが、これに限定されない。予想無増悪生存期間は、再発数、病期および他の因子を含む予後因子に依存して、数ヶ月から数年間、測定されることがある。生存期間延長は、少なくとも１カ月、少なくとも約２カ月、少なくとも約３カ月、少なくとも約４カ月、少なくとも約数ヶ月、少なくとも約１年、少なくとも約２年、少なくとも約３年などの期間を限定することなく含む。全生存期間もまた数カ月から数年間、測定されることがある。患者の症状は、静止したままであることもあり、減少することもある。
当技術分野における通常の技能を有する医師または獣医は、必要とされる組成物の有効量（ＥＤ５０）を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医は、組成物に用いる化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるものより低いレベルで開始し、その所望の効果が達成されるまで投薬量を漸増させることができるだろう。
上で説明したものなどのいずれの適便な経路によって組成物を患者に投与してもよい。選択される投与経路に関わらず、組成物は、下で説明するものなどの許容される剤形に製剤化されるか、または当業者に公知の他の従来の方法によって製剤化される。
組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物および投与方式について所望の治療応答を達成するのに有効であり、患者にとって毒性ではない、活性成分の量が得られるように変えることができる。選択される投薬量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、投与経路、投与回数、用いられることになる特定の化合物の排泄率、処置の継続期間、用いられる特定の組成物と併用される他の薬物、化合物および／または材料、処置を受けることになる患者の年齢、性別、体重、状態、総体的な健康および過去の病歴、ならびに医療技術分野において周知の同様の因子を含む、様々な因子に依存することになる。
例えば、より詳細に下で説明するようなコンジュゲートまたは融合タンパク質を作成するための化学的コンジュゲーション、共有結合もしくは非共有結合または組換え技法などの、当技術分野において公知の方法を使用して、ＩｇもしくはＴＣＲポリペプチドまたは他の薬物を、治療用部分構造と組み合わせることができ、または検出可能（イメージング）部分構造に結合させることができる。あるいは、ＩｇもしくはＴＣＲポリペプチドおよび／または他の薬剤を同時または逐次投与のための別々の組成物で併用することができる。
医薬組成物
本明細書で説明される化合物の各々は、許容される担体または賦形剤と組み合わせた場合に組成物として使用することができる。そのような組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでの分析に有用であり、または開示される化合物で対象を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏでの対象への投与に有用である。
したがって、医薬組成物は、活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の材料を含んでいてもよい。そのような材料は、非毒性であるべきであり、活性薬剤の有効性に干渉してはならない。担体または他の材料の厳密な性質は、投与経路に依存することになる。
本明細書で説明される方法によって識別された目的のタンパク質、例えば、リンパ球の選択されたポリヌクレオチドによってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを含む医薬製剤は、所望の純度を有するＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 第１６版、Oslo, A.編（１９８０年））と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保存用に調製することができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であるものであり、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存薬（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む）；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
許容される担体は、投与される患者に生理学的に許容され、それが投与される化合物の治療特性を保持する。許容される担体およびそれらの製剤は、例えば、Remington' pharmaceutical Sciences（第１８版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、PA、１９９０年）において一般的に説明されている。１つの例示的な担体は、生理食塩水である。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という句は、ある臓器もしくは身体部位の投与部位から別の臓器もしくは身体部位への対象化合物の運搬もしくは輸送に関与する、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系に含まれる、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体もしくは固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、それが投与される対象に有害ではないという意味で、許容される。許容される担体は、対象化合物の特異的活性も変化させてはならない。
一態様では、医薬品投与に適合する、溶媒（水性または非水性）、溶液、エマルジョン、分散媒、被覆剤、等張剤および吸収促進または遅延剤を含む、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される組成物が本明細書で提供される。したがって、医薬組成物または医薬製剤は、対象における薬学的使用に好適な組成物を指す。医薬組成物および製剤は、ある量の本明細書で説明される化合物および薬学的にまたは生理学的に許容される担体を含む。
組成物を特定の投与経路（すなわち、全身または局所）に適合するように製剤化することができる。したがって、組成物は、様々な経路による投与に好適な担体、希釈剤または賦形剤を含む。
別の事例では、組成物は、組成物中の化合物の安定性を向上させるために、および／または組成物の放出速度を制御するために、許容される添加剤を必要に応じてさらに含むことができる。許容される添加剤は、対象化合物の特異的活性を変化させない。例示的な許容される添加剤としては、糖、例えば、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシリトール、トレハロース、ソルボース、スクロース、ガラクトース、デキストラン、デキストロース、フルクトース、ラクトースおよびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。許容される添加剤を許容される担体および／または賦形剤、例えばデキストロース、と併用してもよい。あるいは、例示的な許容される添加剤としては、ペプチドの安定性を増加させるおよび溶液のゲル化を減少させるための界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤は、溶液の０．０１％〜５％の量で組成物に添加することができる。そのような許容される添加剤の添加は、保存中の組成物の安定性および半減期を増加させる。
医薬組成物は、例えば注射によって投与することができる。注射用の組成物は、水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌注射用液剤または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。静脈内投与に好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適する混合物を含有する、溶媒または分散媒であってもよい。流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散液の場合は必要粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。抗菌および抗真菌剤としては、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールが挙げられる。等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物に含めてもよい。得られた溶液をそのまま使用するために包装してもよく、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥された調製物を、後に、投与の前に滅菌溶液と併用することができる。静脈内注射または苦痛部位での静脈内注射用の活性成分は、発熱物質不含であり、かつ好適なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態であるであろう。当業者は、例えば等張性ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液を使用して、好適な溶液を調製することが十分にできる。保存薬、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を必要に応じて含めてもよい。無菌注射用溶液は、上に列挙した成分の１つまたは組合せを必要に応じて有する適切な溶媒に必要量の活性成分を添合し、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒と上に列挙したものからのその他の必要成分とを含有する滅菌ビヒクルに活性成分を添合することによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、任意の追加の所望成分を加えた活性成分の粉末を、前以て滅菌濾過されたその溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥である。
組成物は、例えば単位用量の注射などにより、従来どおりに静脈内投与することができる。注射用の活性成分は、実質的に発熱物質不含であり、かつ好適なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。例えば、等張性ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液を使用して、好適な溶液を調製することができる。保存薬、安定剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加剤を必要に応じて含めてもよい。加えて、組成物は、エアロゾル化によって投与することができる。（Lahnら、Aerosolized Anti-T-cell-Receptor Antibodies Are Effective against Airway Inflammation and Hyperreactivity、Int. Arch.Allegery Immuno.、１３４巻：４９〜５５頁（２００４年））。
一事例では、組成物は、例えば保存中の半減期を増加させるために、凍結乾燥される。組成物は、医薬品でのまたは本明細書で提供される方法のいずれかでの使用が考えられる場合、組成物がヒト患者に投与されたときに炎症反応も危険なアレルギー反応も引き起こさないように、組成物は実質的に発熱物質不含であり得ることが企図される。発熱物質についての組成物の試験、および発熱物質が実質的にない組成物の調製は、当業者に十分理解されており、市販のキットを使用して果たすことができる。
許容される担体は、吸収またはクリアランスを安定、増加または遅延させる化合物を含有することができる。そのような化合物には、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、スクロースもしくはデキストラン；低分子量タンパク質；ペプチドのクリアランスもしくは加水分解を低減させる組成物；または賦形剤もしくは他の安定剤および／もしくは緩衝剤が含まれる。吸収を遅延させる薬剤としては、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンが挙げられる。リポソーム担体を含む、医薬組成物を安定させるために、またはその吸収を増加もしくは減少させるために、界面活性剤も使用されることがある。消化から保護するために、化合物を組成物と複合体化して、酸加水分解および酵素加水分解に対して耐性にすることができ、または化合物をリポソームなどの適切な耐性のある担体中で複合体化することができる。消化から化合物を保護する手段は、当技術分野において公知である（例えば、治療剤の経口送達用の脂質組成物が記載されている、Fix（１９９６年）Pharm Res.１３巻：１７６０〜１７６４頁；Samanen（１９９６年）J. Pharm.Pharmacol.４８巻：１１９〜１３５頁；および米国特許第５，３９１，３７７号を参照されたい）。
組成物は、投与製剤に適合する様式で、および治療有効量で投与することができる。投与される量は、処置されることになる対象、活性成分を利用する対象の免疫系の能力、および所望される結合能の程度に依存する。投与する必要がある活性成分の正確な量は、実施者の判断に依存し、各個体に特有である。初回投与および追加投与に好適なレジメンもまた可変的であるが、典型的には、初回投与、続いての１時間またはそれより長い間隔での後続注射または他の投与による反復投与である。あるいは、血液中の濃度を維持するのに十分な持続静注が企図される。
一事例は、状態、疾患または障害の処置のための医薬品を製造するための、本明細書で説明される組成物の使用を企図している。例えば、選択されたリンパ球からのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの識別後、状態、疾患または障害を処置するための医薬品を製造するために、識別されたものを阻害する薬物、例えば抗体、ペプチド、核酸または小分子。医薬品は、処置を必要とする患者／対象の身体的特徴に基づいて製剤化することができ、状態、疾患または障害の病期に基づいて単一または複数の製剤に製剤化することができる。医薬品は、病院および診療所への配給のために適切なラベルを有する好適なパッケージに包装することができ、ラベルは、本明細書で説明される疾患を有する対象の処置の指示のためのものである。医薬品を単一または複数の単位として包装することができる。組成物の投薬量および投与についての指示を、下で説明するようにパッケージに含めることができる。本発明は、本明細書において上で説明したヒト化抗標的タンパク質抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片および薬学的に許容される担体の医薬品をさらに対象とする。
製造物品
本発明の一態様では、上で説明した障害の処置、予防および／または診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、コンテナー、およびそのコンテナー上のまたはその容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。好適なコンテナーとしては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。コンテナーをガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。コンテナーは、単独である組成物を保持するか、または状態の処置、予防および／もしくは診断に有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌取出し口を有することができる（例えば、コンテナーは、静脈内溶液バッグであってもよく、または皮下注射針によって穴を開けることができるストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、選択されたポリヌクレオチドによってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドである。ラベルまたは添付文書は、選ばれた状態の処置に組成物が使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）本発明の選択されたポリヌクレオチドによってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを含む組成物が中に入っている第１のコンテナー、および（ｂ）さらなる細胞傷害剤または別の治療剤を含む組成物が中に入っている第２のコンテナーを含むことができる。本発明のこの事例での製造物品は、特定の状態を処置するために組成物を使用することができることを示す添付文書をさらに含むことができる。あるいは、または加えて、製造物品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）コンテナーをさらに含むことができる。製造物品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジをはじめとする、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
パッケージおよびキット
さらにさらなる事例では、本出願は、上で説明した化合物とともに使用するためのキットに関する。標的タンパク質に結合する選択された抗体、ＴＣＲまたはその抗原結合断片をキットに備えさせることができる。したがって、キットは、好適なコンテナー手段の中に、標的タンパク質に結合するＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを含む組成物を含むことになる。キットは、好適なコンテナー手段の中の、標的タンパク質に結合するＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを含むことができる。
キットのコンテナー手段は、少なくとも１つのポリペプチドを入れることができる、および／または好ましくは適切に小分けすることができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジおよび／または他のコンテナー手段を一般に含むことになる。キットは、商業販売のために厳重に密封された状態で少なくとも１つの融合タンパク質、検出可能な部分構造、レポーター分子および／または任意の他の試薬コンテナーを収容するための手段を含むことができる。そのようなコンテナーとしては、所望のバイアルが保持される射出および／またはブロー成形プラスチックコンテナーを挙げることができる。キットは、そのキット中に材料の使用についての印刷物も含むことができる。
パッケージおよびキットは、医薬製剤中の緩衝剤、保存薬および／または安定剤をさらに含むことができる。キットの各構成要素が個々のコンテナー内に封入されていてもよく、様々なコンテナーのすべてが単一のパッケージ内にあってもよい。本発明のキットは、低温保存または室温保存用に設計することができる。
加えて、調製物は、キットの有効保存期間を増すための安定剤を含有することができ、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むことができる。組成物を凍結乾燥させる場合、キットは凍結乾燥された調製物を再構成するための溶液のさらなる調製物を含有することができる。許容される再構成溶液は、当技術分野において周知であり、例えば、薬学的に許容されるリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。
加えて、本明細書で提供されるパッケージまたはキットは、例えば、１つもしくは複数のレポーター分子および／または１つもしくは複数の検出可能な部分構造／薬剤などの、本明細書で提供される他の部分構造のいずれかをさらに含むことができる。
パッケージおよびキットは、例えばＥＬＩＳＡアッセイなどの、アッセイのための１つまたは複数の構成要素をさらに含むことができる。この用途で試験されることになる試料は、例えば、生検試料および組織切片を含む。パッケージおよびキットは、試料の収集のための１つまたは複数の構成要素（例えば、シリンジ、カップ、スワブなど）をさらに含むことができる。
パッケージおよびキットは、例えば、製品説明、投与方式および／または処置の指示を明記するラベルをさらに含むことができる。本明細書で提供されるパッケージは、本明細書で説明されるような組成物のいずれかを含むことができる。パッケージは、疾患の処置についてのラベルをさらに含むことができる。
指示は、処置方法を含む、本明細書で説明される方法のいずれかを実施するための指示を含むことができる。指示は、満足な臨床エンドポイントもしくは起こり得るあらゆる有害症状の表示、またはヒト対象に対する使用のために米国食品医薬品局などの監督機関によって求められる追加情報をさらに含むことができる。
指示は、「印刷物」上にあってもよく、例えば、キット内のもしくはキットに貼られた紙もしくは厚紙上にあってもよく、またはキットもしくは包装材に貼られたラベル上にあってもよく、またはキットの構成要素が入っているバイアルもしくはチューブに接着されていてもよい。加えて、指示をコンピュータ可読媒体、例えばディスク（フロッピー（登録商標）ディスケットまたはハードディスク）、光ＣＤ、例えばＣＤ−またはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープ、電気記録媒体、例えばＲＡＭおよびＲＯＭ、ＩＣチップならびにこれらのハイブリッド、例えば磁気／光記録媒体に含めることができる。
追加の実施形態
本明細書で開示される方法および組成物のために使用することができるか、それらと併用することができるか、それらの調製に使用することができるか、またはそれらの産物である、分子、材料、組成物および成分が、本明細書で開示される。これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示され、これらの分子および化合物の様々な個々のおよび集合的組合せおよび順列の各々についての具体的な言及が明確に開示され得ない場合、各々は、本明細書において具体的に企図され、説明されると理解される。例えば、ヌクレオチドまたは核酸が開示され、論じられており、そのヌクレオチドまたは核酸を含むいくつかの分子に加えることができるいくつかの修飾が論じられている場合、相反する具体的な指示がない限り、ヌクレオチドまたは核酸および可能である修飾のあらゆる組合せおよび順列が、具体的に企図される。この概念は、これらに限定されるものではないが開示される方法および組成物の製造および使用方法のステップを含む、本出願のすべての態様に適用される。したがって、行うことができる様々な追加のステップがある場合、これらの追加のステップの各々は、開示される方法のいずれかの特定の事例または事例の組合せで行うことができ、各々のそのような組合せは具体的に企図されており、それらを、開示されていると見なすべきであることが理解される。
本明細書で説明される一部の事例をここで明らかにし、説明したが、そのような事例は、単に例として提供されるものに過ぎない。ここで提供される開示から逸脱することなく、非常に多くの変形、変更および置換が今や当業者の心に浮かぶことであろう。ここで説明した事例の様々な代案を、ここで説明した方法を実施する際に用いることができることを理解されたい。
別段の解説がない限り、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、ここで使用することができる方法および組成物の事例を含む：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、第１８版、出版元Merck Research Laboratories、２００６年； Benjamin Lewin、Genes IX、出版元Jones & Bartlett Publishing、２００７年；Kendrewら（編）、The Encyclopedia of Mol.Biology、出版元Blackwell Science Ltd.、１９９４年；およびRobert A. Meyers（編）、Mol.Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、出版元VCH Publishers, Inc.、（１９９５年）。
本開示の標準手順は、例えば、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、USA（１９８２年）；Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、USA（１９８９年）；Davisら、Basic Methods in Molecular Biology、Elsevier Science Publishing, Inc.、New York、USA（１９８６年）；またはMethods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques １５２巻、S. L. BergerおよびA. R. Kimmerl（編）、Academic Press Inc.、San Diego、USA（１９８７年）において説明されている。Current Protocols in Molecular Biology (CPMB)（Fred M. Ausubelら編、John Wiley and Sons, Inc.）、Current Protocols in Protein Science (CPPS)（John E. Coliganら編、John Wiley and Sons, Inc.）、Current Protocols in Immunology (CPI)（John E. Coliganら編、John Wiley and Sons, Inc.）、Current Protocols in Cell Biology (CPCB)（Juan S. Bonifacinoら編、John Wiley and Sons, Inc.）、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique、R. Ian Freshney著、出版社：Wiley-Liss、第５版（２００５年）；ならびにAnimal Cell Culture Methods（Methods in Cell Biology、５７巻、Jennie P. MatherおよびDavid Barnes編、Academic Press、第１版、１９９８年）。
（実施例１）
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシーケンシングを行うための細胞を調製するためのプロトコール
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む疾患にかかった組織試料から細胞集団を得る。対応する正常組織試料およびＮＡＴ試料も得る。細胞は、インタクト細胞膜を有し、したがって、過剰なｍＲＮＡ量が周囲媒質に漏れない。細胞は、生細胞である必要はない。試料は、リンパ球も、正常細胞および／または疾患にかかった細胞（例えば、がん性細胞）も含む。
Ｔ細胞およびＢ細胞を、細胞緩衝液：１×ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１０分間、２回の遠心分離２００ｇによって洗浄する。次いで、細胞を細胞緩衝液で細胞３．５×１０６個／ｍＬの細胞濃度に希釈する。次いで、その懸濁液を、２０μｍセルストレーナーを通してピペッティングする。
（実施例２）
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシーケンシングを行うためのエマルジョン反応混合物を調製するためのプロトコール
下の表中の試薬およびオリゴヌクレオチドを含有するエマルジョン反応混合物を、ＰＣＲ−クリーンフードの中で、室温で、混合する。
Figure 0006894380
 オリゴヌクレオチド配列：
Figure 0006894380
 （実施例３）
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシーケンシングを行うためのエマルジョンを生成するためのプロトコール
細胞および反応混合物を調製したら、エマルジョンを形成する。１００μＬ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒシリンジを使用して、１００μＬ ＰＥＥＫ試料ループに各々約１００μＬの反応混合物の２回の注入で過剰充填する。１００μＬ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｇａｓｔｉｇｈｔシリンジを使用して、約１１０μＬの細胞懸濁液を約１００μＬ、内径０．２ｍｍ ＦＥＰチューブループに充填する。そのループを、細胞の沈降および集群化を防止するために、１〜２秒ごとにおおよそ１回、絶えず細胞ループを反転させるメカニカルローテータに取り付ける。内側親フッ素性被覆が施されたＤｏｌｏｍｉｔｅ ２−試薬チップ経由で集束流を噴射することによってエマルジョンを形成する。外側のオイルチャネルには、ＨＦＥ７５００（Ｎｏｖｅｃ ７５００）フルオロカーボン油中の０．５〜５．０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール系界面活性剤が入っていた。エマルジョンジェットを（細胞相および反応相チャネルにおいて等しい）一定流量で流す。エマルジョンチップ排出量を、１２ｃｍ、内径０．５ｍｍ ＰＥＥＫチューブ経由で、冷却ブロック内でおおよそ０℃に保たれているポリプロピレンＰＣＲチューブに滴下することによって回収する。エマルジョン中の５０μＬの水性材料を各々が含有する４つの画分を回収する（１画分当たり５分の実行時間）。沈降した油の大部分をキャピラリーマイクロピペットで各チューブの底部から除去する。各エマルジョン画分に、４０μＬのオーバーレイ溶液：５０ｍＭ Ｎａ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．００２％（ｗ／ｖ）クレゾールレッドを、穏やかに重層する。エマルジョンを、サーマルサイクラーで、次のプログラム（分：秒）でインキュベートする：
１．４２．０℃、３０：００間（逆転写）
２．９５．０℃、０５：００間（変性逆転写酵素およびＤＮＡ鋳型）
３．９５．０℃、００：１０間
４．６５．０℃、００：３０間
５．７２．０℃、００：３０間
６．３に戻り合計５５サイクル行う（容器バーコードを増幅し、ｃＤＮＡに融合させる）
７．４．０℃、時間制限なし
エマルジョンを４．０℃で一晩保持する。
（実施例４）
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシーケンシングを行うためのエマルジョンを破壊するためのプロトコール
キャピラリーマイクロピペット先端部を使用して、できる限り多くのオーバーレイ溶液を、エマルジョン材料を除去することなく除去する。各チューブに、１２．５μＬ Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼ溶液および２．５μＬの０．５Ｍ Ｎａ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を添加する。４０μＬの１：１ ＦＣ−４０：パーフルオロオクタノールの添加および約１０回の穏やかな反転により、エマルジョンを破壊する。
チューブの内容物を穏やかに遠心分離し、サーマルサイクラーで、次のプログラム（分：秒）でインキュベートする：
１．５０℃、１５：００間（プロテアーゼ消化）
２．７０℃、１０：００間（プロテアーゼ不活性化）
３．９５℃、０３：００間（プロテアーゼ不活性化およびＤＮＡ変性）
４．４．０℃、長時間
チューブを遠心分離し、上部水性相および界面を新たなマイクロ遠心チューブに移し、１５，０００ｇで１分間、遠心分離する。上部水性相を、界面を乱すことなく、新しいチューブに移入する。
（実施例５）
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシーケンシングを行うためのエマルジョンからのポリヌクレオチドを浄化するためのプロトコール
０．２５ＶのＮＥＢストレプトアビジンビーズを２ｘＢＷ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ ｔｗｅｅｎ−２０）に添加し、室温で１５分間インキュベートする。次いで、ビーズを１ｘＢＷで洗浄し、０．００１％ ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、０．２５Ｖの０．００１％ ｔｗｅｅｎ−２０の添加および９５℃で３分間の加熱によって溶離する。５容量のＱｉａｇｅｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＰＢを添加し、シリカカラムにかける。次いで、ビーズを０．７ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、１８０μＬの［５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００１％ ｔｗｅｅｎ−２０］で溶離する。
（実施例６）
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシーケンシングを行うための次世代シーケンシングのためのポリヌクレオチドの第１のＰＣＲ反応（ＰＣＲ１）のプロトコール
１６３．２μＬの精製ｃＤＮＡをＰＣＲ１に使用する。
Figure 0006894380
 プライマー配列
「Ｉｇ−Ｃ」ミックス：
Figure 0006894380
４×６０μＬの反応物をＰＣＲチューブに小分けし、次のプログラムをサーモサイクラーで実行する：
１．９８℃、０１：００間
２．９８℃、００：１０間
３．６４℃、００：２０間
４．７２℃、００：２０間
５．２に戻り合計６サイクル行う
６．４℃、時間制限なし
ＰＣＲ産物を１．２容量のＡＭＰｕｒｅ ＸＰで精製し、８０％エタノールで洗浄し、６０μＬ希釈緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶離する。
（実施例７）
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシーケンシングを行うための次世代シーケンシングのためのポリヌクレオチドの第２のＰＣＲ反応（ＰＣＲ２）のプロトコール
２０μＬの精製ＰＣＲ１産物を各サブライブラリー（例えば、ＩｇＬ鎖またはＩｇＨ鎖またはＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖）に使用する。
Figure 0006894380
 プライマー配列
Ｐ５−ＩｇＨ（重）ミックス
Figure 0006894380
 Ｐ５−ＩｇＬ（軽）ミックス
Figure 0006894380
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｃ７、６塩基バーコード、およびＰ７配列：n5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[NNNNNN]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTの連鎖を含む「Ｐ７−インデックス−Ｃ７」プライマーを使用する。
次のプログラムをサーモサイクラーで実行する：
１．９８℃、０１：００間
２．９８℃、００：１０間
３．６４℃、００：２０間
４．７２℃、００：２０間
５．２に戻り合計６サイクル行う
６．４℃、時間制限なし
ＰＣＲ産物を１．２容量のＡＭＰｕｒｅで精製し、４０μＬの希釈緩衝液で溶離する。
（実施例８）
エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシーケンシングを行うための次世代シーケンシングのためのポリヌクレオチドの第３のＰＣＲ反応（ＰＣＲ３）のプロトコール
０．８μＬの精製ＰＣＲ２産物をパイロットｑＰＣＲに使用して、増幅サイクルの最後の番号を決定する。
Figure 0006894380
 プライマー配列
Ｐ５：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Ｃ７：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
次のプログラムをｑＰＣＲマシンで実行する：
１．９８℃、０１：００間
２．９８℃、００：１０間
３．６４℃、００：２０間
４．７２℃、００：２０間
５．プレートを読み取る
６．２に戻り合計２５サイクル行う
ｑＰＣＲ強度プロットを精査して、蛍光強度が最大であるがＤＮＡの指数関数的増幅がまだ終了していなかった増幅サイクルを決定する。これがＰＣＲ３終点の最終サイクル番号である。
２４．０μＬの精製ＰＣＲ２産物を終点ＰＣＲ３に使用する。
Figure 0006894380
次のプログラムをサーモサイクラーで実行する：
１．９８℃、０１：００間
２．９８℃、００：１０間
３．６４℃、００：２０間
４．７２℃、００：２０間
５．２に戻り決定されたサイクル数行う
６．４℃、長時間
ＰＣＲ産物を１．２容量のＡＭＰｕｒｅで精製し、２０μＬの希釈緩衝液で溶離する。ライブラリーは、いつでもシーケンシングできる状態になっている。所望される場合には、混入短縮アンプリコンを除去するためにアガロースゲル精製して、またはせずに、それらをプールし、次いで、次世代シーケンシング技術プラットフォームを使用してシーケンシングする。
（実施例９）
ヒト化選択抗体の発現
ベクター構築物
ヒト化選択抗体ＶＨ（Ｈ１）およびＶＬ（κ１）領域のコドンを含有する２つのｄｓＤＮＡ配列を合成する。これらの合成配列は、５’および３’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を付加するためにまたは５’および３’末端の制限エンドヌクレアーゼ部位を保存するために必要なヌクレオチドも含有する。すべてのコドンをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞での発現のために最適化する。重鎖および軽鎖を完成するために使用するシグナルペプチドおよび定常領域配列は、ｃＤＮＡに由来する。すべての構築物のコード領域配列をＤＮＡシーケンシングによって確認する。タンパク質産物は、選択抗体＃１（ＩｇＧ４用）および選択抗体＃２（ＩｇＧ１用）である。
発現ベクター構築物
上で説明したベクター構築物からの重鎖および軽鎖コード領域をバイシストロン性発現ベクターにサブクローニングする。バイシストロン性発現ベクターの多重クローニング部位（ＭＣＳ）への挿入を助長するために末端制限部位を有するコード領域を生成するためのプライマーを設計する。加えて、将来の構築物の生成を助長するために８塩基対制限部位を付加させる。カッパ鎖をＭＣＳ１の制限部位にライゲーションする。ＩｇＧ１重鎖をＭＣＳの好適な制限部位にライゲーションする。
ＩｇＧ４を１本の重鎖および１本の軽鎖として発現すことができることは、十分に確証されている。ＩｇＧ４を安定させるために、そのヒンジ領域をＩｇＧ１のもので置換する。したがって、３ウェイライゲーションで、ＶＨとＣＨ１とヒンジ領域とを含有するＩｇＧ１の断片を、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含有するＩｇＧ４の断片にライゲーションする。ＰＣＲおよびベクター構築物からバイシストロン性発現ベクターへの免疫グロブリン配列の転移に好適なプライマーを使用する。
（実施例１０）
標的タンパク質に対する選択抗体の親和性の測定
本明細書で説明される抗体およびそれらの抗原結合断片の標的タンパク質に対する（for to）親和性は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ）などの従来の技法を使用して評価することができる。
様々な選択抗体および抗原結合断片の標的タンパク質への結合についての親和定数を、例えば、ＣＭ５センサーチップを装着したＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００分析システム（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）を使用するＳＰＲによって決定する。選択抗体または抗原結合断片を、最大１５００レゾナンスユニットのＣＭ５センサーチップに（１０ｍＭ 酢酸緩衝液中の１０μｇ／ｍＬの濃度、および試験した特定の選択抗体または抗原結合断片に適切なｐＨを使用して）共有結合させる。標的タンパク質（４０μＬ）を５〜２５０ｎＭの濃度で、３０μＬ／分の流量で注入する。各サイクル後に１０マイクロリットルの１０ｍＭ ＨＣｌ溶液を使用してチップを再生させる。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００（ラングミュア結合モデル）のソフトウェアを用いて会合および解離速度定数を計算する。
（実施例１１）
多様な種の標的タンパク質に対する選択抗体の親和性
選択抗体＃３のラット、マウス、ウサギおよびヒト標的タンパク質への結合をＰ−ＥＬＩＳＡによって判定する。選択抗体の相対親和性は、ヒト＝ウサギ＞マウス＞ラットである。ＥＬＩＳＡによる予備評価により、親マウス抗体と比べてヒト標的タンパク質に対するおおよそ２〜４倍大きい親和性が得られる。ヒトおよびウサギ標的タンパク質に対する親和性は、親マウス抗体と比べて４〜５倍大きいようであり得る。
ヒト化抗体は、マウス標的タンパク質と結合する。選択抗体のマウス標的タンパク質に対する相対親和性は、ウサギ標的タンパク質と結合するマウス親抗体のものとほぼ同じである。親抗体はウサギ疾患モデルにおいて有効性を示すので、選択抗体は、マウス疾患モデルにおいて有効性を示すと予想することができる。ヒト化の過程でのＣＤＲの近位に加えられる変更は、ヒト標的タンパク質に対する、より高い親和性、ならびにマウスおよびラット標的タンパク質に対する有意な反応性をもたらす。マウス標的タンパク質に対する選択抗体＃２の親和性は、親マウス抗標的タンパク質と比べて１０倍を超えて大きいようである。
（実施例１２）
選択抗体の標的タンパク質への結合定数の測定
ヒト化選択抗体および対応する親マウス抗体についての結合定数を測定するためにこの実験を行う。
ヒト化選択抗体を抗ヒトＩｇＧ表面に５つの異なる表面密度で捕捉する。０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０と０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡとを有するＰＢＳを使用して、ヒト化選択抗体＃１および親マウス抗体＃１を１００ｎＭの開始濃度に希釈し、３倍希釈系列で試験する。結合データを２５℃で収集する。会合相を５分間モニターし、解離相を２．５時間モニターする。５つの異なる密度の抗体表面に対する各抗原についての応答データの単純１：１相互作用モデルへのグローバルフィッティングを行う。データへのフィットを判定し、２５℃での結合定数を決定する。例示的な結合定数の概要を次の表に提供する。
Figure 0006894380
 （実施例１３）
選択抗体の標的タンパク質への結合定数の測定
いくつかの生物分析アッセイを用いて、最終薬物候補の選択および初回薬物動態評価を支援する。これらは、ストレプトアビジン被覆マイクロタイターウェルに固定化されたｎ−末端ビオチン標識標的タンパク質からなる標的タンパク質ＥＬＩＳＡ（Ｐ−ＥＬＩＳＡ）を含む。選択抗体結合をＨＲＰコンジュゲート抗ヒト抗体で検出する。アッセイの感度は、１０〜２０ｎｇ／ｍｌであると判定される。
Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（商標）被覆プレートを使用するＥＬＩＳＡのプロトコール
すべての試薬を室温にし、洗浄緩衝液（１×ＴＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で希釈を行う。簡単に言うと、プロトコールステップは、次のとおりである：１００μＬのＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（商標）Ｐｉｅｒｃｅ＃３１０００（ＴＢＳ中０．５μｇ／ｍｌ）を９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ−４プレートに添加する。１時間、室温でインキュベートする。２００μｌの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄する。５０μＬのビオチン化標的タンパク質（０．０６ｎＭ）を添加する。１時間、室温でインキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄する。１００μＬの選択抗体を添加する。３０分、室温でインキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄する。５０μＬの二次Ａｂ−ＨＲＰ（１：１０，０００）を添加する。３０分、室温でインキュベートする。プレートを４回、洗浄緩衝液で洗浄する。１００μｌのＴＭＢ試薬（基質）を添加する。室温でインキュベートする。１００μＬの２Ｍ硫酸を添加して、基質の発色を停止させる。４５０ｎｍフィルターと参照としての６１５〜６２０ｎｍフィルターを使用してプレートを読み取る。
（実施例１４）
免疫組織化学染色
切断してＶｅｃｔａｂｏｎｄ被覆スライド上に載置したクリオスタット切片（１０μｍ）をメタノールで固定し（−２０℃、５分）、当技術分野において以前に説明された３ステップペルオキシダーゼ法を使用して染色する。簡単に言うと、これらを一次選択抗体で一晩、４℃で標識するか、または１時間、室温で、標的タンパク質＃１、リン酸化標的タンパク質＃２、非リン酸化標的タンパク質＃２もしくはＣＤ４５に対する抗体で標識する。この後、適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートとともにインキュベートする。ＣＤ４５について染色された切片をマイヤーヘマトキシリンで対比染色する。一次抗体、二次抗体またはアビジンビオチン複合体を含めないものを常例的に対照として使用する。
（実施例１５）
タンパク質抽出およびウェスタンブロッティング
動物の急速凍結罹患試料を計量し、細かく切断し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に、１：１０ ｇ湿潤重量／ｍｌで再懸濁させる。高強度超音波プロセッサーを使用して試料を均質化し、氷上で３０分間インキュベートする。組織懸濁液をエッペンドルフ遠心機において６０分間、４℃で、１５，０００ｇで回転させ、上清を回収し、小分けして−７０℃で保存する。脊髄ホモジネートの全タンパク質濃度を、フォリンフェノール法（Lowryら、J. Biol.Chem、１９３巻：２６５〜７５頁（１９５１年））によって決定する。
ウェスタンブロット分析のために、４０μｇの上清タンパク質をＴｒｉｓ−ＨＣｌドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで分割し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐポリフッ化ビニリデン膜に転写する。膜上の非特異的結合部位を、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳＴ）（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）に溶解した５％Ｍａｒｖｅｌ（登録商標）脱脂粉乳で１時間、室温でブロックし、次いで、ＴＢＳＴ中５％のＭａｒｖｅｌ（登録商標）で１：１０００希釈した一次抗体とともに２時間、室温でインキュベートする。一次抗体源および泳動条件を表１に要約する。ＴＢＳＴで洗浄後、膜を二次抗体とともにインキュベートし、それをＨＲＰ：抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ、抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ、または抗ヤギＩｇＧ ＨＲＰに１時間、室温で結合させる。３回の最終洗浄後、ブロットを強化化学発光によって現像する。特異的タンパク質の半定量的測定を得るために、得られたブロットを、分析ソフトウェアパッケージを使用して解析し、バンド密度を任意単位で測定する。タンパク質の均等な充填を確実にするために、このような好適なアッセイについての発現レベルに対して正規化するために、膜を剥ぎ取り、対照抗体でプローブする。
（実施例１６）
標的タンパク質変異体の結合親和性を評価するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェルプレートを、標的タンパク質＃１、標的タンパク質＃１変異体−１または標的タンパク質＃１変異体２に対するマウス抗体で、４μｇ／ｍｌで、４８時間、４℃で被覆する。１ｘＰＢＳ中１％のＢＳＡで一晩、４℃でウェルをブロックし、次いでプレートを１ｘＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ８０（０．００４％）で洗浄する。タンパク質抽出試料および標準物質を、０．００４％ Ｔｗｅｅｎ ８０と０．１％ＢＳＡと５ｍＭ ＥＤＴＡとを含有する１ｘＰＢＳで希釈し、１ウェル当たり１８０μｌを添加し、一晩、４℃でインキュベートする。標準曲線を生成する。洗浄後、ビオチン化二次抗体を１時間、３７℃で添加する。ＡＢＣ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ）の１時間、室温での添加後、ｏ−フェニレンジアミンを使用してプレートを現像し、４Ｍ硫酸を使用して反応を停止させる。吸光度を４９０ｎｍで読み取り、参照読み取りを６５０ｎｍで行う。標的抗原基質活性の評価は、ＥＬＩＳＡによって行い、製造業者の指示に従って実行する。
（実施例１７）
免疫組織化学的染色
罹患試料のクリオスタット切片（５μｍ厚）を、０．０７Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）中パラホルムアルデヒド１％で５分間、またはアセトンで１０分間、室温で固定し、次いで、一次抗体とともにインキュベートする。選択抗体を１時間、室温でインキュベートする。切片をＰＢＳで（３回、各１０分）洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）にコンジュゲートした適切な二次抗体を添加し、３０分間適用する。免疫染色のために、１滴の３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ＋、Ｄａｋｏ）を添加し、切片を１分間、ヘマトキシリンで対比染色する。免疫蛍光染色のために、ＰＢＳで３回、各１０分間、洗浄し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）で最終すすぎを行った後、落射蛍光光学系を装備した倒立顕微鏡下で分析する。正常試料または正常隣接組織を罹患試料と同時的に分析することによって、染色の特異性を評価する。データをコンピュータ（Ｐｒｉｓｍ ３．０、ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で分析する。マン・ホイットニー検定を使用して、異なる実験条件間に有意（Ｐ＜０．０５）差があるかどうかを判定する。
（実施例１８）
免疫蛍光スクリーニング
複数の選択抗体を使用して免疫蛍光スクリーニングアッセイを行った。７人の異なる膵臓がん患者からの罹患試料は、１０６の抗体のうち８８（８３％）が、７人すべての患者にわたって強い染色を示す。複数の抗体の中のこれらの選択抗体の多くは、正常隣接組織と比較して膵臓腫瘍組織に対して高い特異性も示した。質量分析と結合させた免疫沈降実験を実行して、未知標的タンパク質の正体を解明する。複数の選択抗体のうちの抗体Ａ１−１０８は、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）がん組織試料の免疫組織蛍光染色に使用したとき、正常隣接組織と比較して膵臓導管腺癌組織の強い特異的染色も示した。さらに、Ａ１−１０８は、膵臓の腺扁平上皮癌と神経内分泌癌の両方を染色した。１４の追加の正常組織のＡ１−１０８染色は、非常に弱いまたは完全に非存在のままであった。
（実施例１９）
標的タンパク質の選択抗体中和
基質プロテアーゼ活性の標的タンパク質阻害を中和する選択抗体の能力を判定する。データは、ヒト化選択抗体＃１の中和活性が親マウス抗体＃１と同等であることを示す。ヒト抗体対照は、標的タンパク質活性を中和しない。選択抗体およびバリアントの中和活性を最低３つのアッセイで比較する。
（実施例２０）
標的タンパク質中和アッセイ
抗体およびそれらの抗原結合断片の機能的特性は、標的タンパク質中和アッセイを用いて活性標的タンパク質を阻害するそれらの能力を評価することにより、判定することができる。
酵素結合発色法（enzyme coupled chromogenic method）を使用して標的タンパク質活性を判定する。簡単に言うと、２５μＬ 標的タンパク質（５０ｎｇ／ｍＬ 活性標的タンパク質）を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルの中で、同容量のＴＢＳ緩衝液（０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）とともに、または結果として１〜１２８のモル過剰（抗体：標的タンパク質）になる選択抗体もしくはその抗原結合断片の２倍系列希釈物とともにインキュベートする。混合物を２時間、室温で反応させる。その後、５０μＬの標的抗原基質（２０ＩＵ／ｍＬまたは４０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、プレートを１５分間、３７℃でインキュベートする。次いで、酵素（１μＭ）とＣＮＢｒで消化された酵素基質（１μＭ）と発色団（０．６ｍＭ）とを含有する１００μＬの溶液を添加する。４０５ｎｍでの吸光度変化を記録して、残留標的タンパク質活性を測定する。１００％標的タンパク質活性は、抗体の非存在下で観察される標的タンパク質活性である。抗体による阻害（すなわち、標的タンパク質活性の中和）パーセンテージを、抗体の存在下で測定した残留標的タンパク質活性から計算する。
（実施例２１）
抗体中和アッセイ
選択抗体の標的に対する活性アッセイであって、その標的の活性に対する選択抗体の阻害を測定するアッセイを試験する。このアッセイを使用して、抗体による標的の中和効率を判定することができる。
すべての試薬を室温にし、プレートリーダーを３７℃に予温する。すべての希釈を、アッセイ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で行う。最終条件は、次のとおりである：１００μｌ−重複ウェル、標的タンパク質の酵素基質１．５Ｕ／ウェル、８ｎＭ 活性ヒト野生型標的タンパク質、２５μｌ 発色基質、０〜８０μｇ／ｍｌ 選択抗体。アッセイステップは、次のとおりである：選択抗体の希釈物５０μｌを９６ウェルに配置する；２５μｌの標的タンパク質基質酵素（１．５Ｕ）を添加し、プレートリーダー上で３秒間震盪する；５分間、３７℃でインキュベートする；２５μｌ 発色基質を添加してプレートを現像する。プレートを３秒間震盪し、４０５ｎｍフィルターを用いてプレートリーダーで、３７℃で、３０分まで、５分ごとに読み取る。活性パーセンテージ（％）を平均Ｖから計算する。
（実施例２２）
標的タンパク質不活性化の測定
本明細書で説明される選択抗体またはそれらの抗原結合断片の標的タンパク質不活性化速度に対する効果を、従来の技法を使用して判定することができる。例えば、選択抗体またはその抗原結合断片の存在下での標的タンパク質の半減期を計算することができる。
標的タンパク質（ＰＢＳ中、４０μｇ／ｍＬ）を３倍モル過剰の選択抗体またはその抗原結合断片とともに３７℃でインキュベートする。様々な時間間隔で一定分量を取り出し、標的抗原に対して２倍モル過剰の基質とともにインキュベートする（３７℃で２５分）。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いて銀染色によって分析する。反応生成物の定量は、後のデンシトメトリースキャニングによって行う。各時点での活性標的タンパク質の量に基づいて、選択抗体またはその抗原結合断片の存在下での標的タンパク質の半減期を計算することができる。
（実施例２３）
基質に対する標的抗原活性によって生じる反応生成物の阻害の測定
本明細書で説明される選択抗体またはそれらの抗原結合断片の、標的タンパク質と基質の相互作用中に生ずる反応生成物に対する効果を、従来の技法を使用して評価することができる。
簡単に言うと、標的タンパク質（ＰＢＳ中、４０μｇ／ｍＬ）を１０分間、３７℃で、８倍モル過剰の選択抗体または抗原結合断片の非存在下（対照）または存在下のいずれかでインキュベートする。次いで、試料を２倍モル過剰の基質とともにインキュベートする（３７℃で２５分）。ＳＤＳ（１％の最終濃度）の添加および３０秒間、１００℃での加熱によって、反応を停止させる。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いてクーマシーブリリアントブルーでの染色によって分析する。反応生成物の定量は、後のデンシトメトリースキャニングによって行う。
（実施例２４）
疾患の治療薬としての選択抗体のｉｎ ｖｉｖｏ評価。
動物を異なる処置群に分け、複数の動物を各処置群に入れる。疾患を誘導する。次いで、動物試験群に、抗標的タンパク質抗体または抗原結合断片の投薬量を、試験期間のために確立した多剤投与レジメンで事前に決定された時点で投与する。処置の有効性は、処置期間を通してＥＬＩＳＡまたはＨＰＬＣによって疾患進行または退縮に関連する分析物のレベルまたはレベルの変化を判定することによって、評価する。疾患に関連する形態変化の証明のために、処置期間を通して動物を屠殺して動物からの様々な生体試料、例えば臓器を検査する。加えて、疾患に関連する分子変化を証明するために処置期間を通して免疫組織化学染色を行う。本明細書で説明される抗タンパク質抗体および抗原結合断片の疾患処置についての有効性は、疾患の動物モデルによって試験することができる。
（実施例２５）
血漿中のタンパク質抗体の検出
ＰＫおよび有効性研究においてＰ−ＥＬＩＳＡを使用して選択抗体の血漿レベルをモニターすることができる。Ｐ−ＥＬＳＡは、対照ＩｇＧ、血漿非存在下での抗体、または抗体＋ＥＤＴＡと比較して、添加血漿試料中のタンパク質抗体を検出することができる。Ｐ−ＥＬＩＳＡによる血漿試料中の選択抗体の検出に影響を与える可変要素の影響を判定することができる。これは、試料プロセッシングおよび保存条件を含む。
（実施例２６）
免疫シーケンシングＶ２
固有の識別子（ＵＩＤ）バーコードを使用して、あらゆる単一ＲＮＡ分子にタグを付けた。次いで、ＵＩＤを多くのコピーで増幅させ、その結果、シーケンシング後の複数のシーケンシングリードは、より高い塩基精度で単一の配列に圧縮し、ＰＣＲまたはシーケンシングエラーと対比して真の抗体配列および変異を明らかにした。ＵＩＤを使用して、複数の試料にわたってコンタミネーションも追跡した。
出発物質
抗体をコードし、定常領域を含有する、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントで構成されている免疫細胞からのＲＮＡまたはＤＮＡを、出発物質として使用した。一部の実験では、ＲＮＡは、Ｔ細胞からのものであった。一部の実験では、ＲＮＡは、重鎖（Ｖ、Ｄ、Ｊセグメント）、または軽鎖（Ｖ、Ｊセグメントのみ）であった。
逆転写
次の部分で構成されているポリヌクレオチド１つまたはポリヌクレオチドプールを使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した：ＲＮＡの領域（通常は定常領域中の、またはｍＲＮＡのポリＡテールへの）に相補的な部分。ＵＩＤ、これは、塩基挿入位置が分かっているまたは分かっていない約２０縮重ヌクレオチド（例えば、ＮＮＮＮＷＮＮＮＮＷＮＮＮＮＷＮＮＮＮＷ（ここで、ＷはＡまたはＴを意味する））のストレッチであった。ＵＩＤの長さが増加するにつれて、各ＲＮＡ分子をバーコーディンしたときに、それが２回検出される可能性は低くなった。オーバーハングテール（Ｐ５）は、下流でリード−１シーケンシングプライミング部位としての機能を果たした。複数のポリヌクレオチドを使用して、様々な定常領域にアニールした。各ポリヌクレオチドは、完全に固有のＵＩＤを有し、したがって、各ＲＮＡ分子は、ＵＩＤによって実際に固有にバーコード化された。
逆転写は、５ｐｍｏｌのＩＧＨＣ−ＵＩＤ−Ｐ５プライマーミックスと、５００μＭの各ｄＮＴＰと、５ｍＭのＤＴＴと、１μｌのＲＮアーゼ阻害剤（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）と、１ｘＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ緩衝液中の１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とを含有する２０μｌの反応物中、５００ｎｇの全ＲＮＡで行った。反応を４５分間、５５℃でインキュベートし、その後、さらに５分間、８５℃でインキュベートして、酵素を不活性化した。次いで、１μｌのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を添加し、反応を１５分間、３７℃でインキュベートした。１５分、８５℃でのインキュベーション後、１μｌのＲＮアーゼＨ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を添加し、反応をさらに１５分間、３７℃でインキュベートした。
ＰＣＲ１
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームでのクラスター化のために、次のプライマーを使用してｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した：（１）リード−２シーケンシングおよびリード−３シーケンシングプライミング部位としての機能を果たすオーバーハングテール（Ｐ７）を有するＶセグメントの上流の、ＲＮＡに相補的なフォワードプライマープール、および（２）オーバーハング（Ｃ５）を有するＰ５配列で構成されているリバースプライマー。一部の実験では、フォワードプライマーは、免疫細胞によって発現される可能性のあるすべてのＶ領域へのアニーリングのための多くのポリヌクレオチドのプールであった。他の実験では、フォワードプライマーは、Ｐ７、ＳＢＣ、およびＣ７オーバーハングを有した。リバースプライマーはＵＩＤの後に位置し、したがって、固有のＵＩＤ各々が増幅された。
上で調製した２０μｌの逆転写反応物を、１μＭのＰ５／Ｃ５プライマーと、１μＭのＩＧＨＶ−Ｐ７プライマーミックスと、２００μＭの各ｄＮＴＰと、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液中の１ユニットのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＩＩポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）とを含有する５０μｌ ＰＣＲ反応で増幅した。反応を９８℃で１サイクル、続いて、１０秒間９８℃、２０秒間６２℃、２０秒間７２℃の１２サイクル、続いて、７２℃で３分の１サイクルにわたってインキュベートした。
ｑＰＣＲ
次いで、１μｌのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を添加し、反応を２０分間３７℃でインキュベートし、続いて８０℃で１５分のインキュベーションを行った。ＰＣＲ２
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームでクラスター化するために、次のプライマー：ＰＣＲ１で使用したのと同じＰ５Ｃ５リバースプライマー、およびＰ７配列と試料バーコード（ＳＢＣ）とで構成されているフォワードプライマーを用いる、ならびに第２のオーバーハング（Ｃ７）を用いる、第２のＰＣＲ相を使用して、ＰＣＲ１産物を増幅した。試料バーコードは、実験でプロセッシングした試料ごとに異なり、したがって、複数の試料を１回のシーケンシング実行で一緒にプールすることができた。ＰＣＲ１は、ＰＣＲ１反応に使用したプライマーの多重プールのため、偏りを導入し得る。ＰＣＲ１サイクル数の制限およびＰＣＲ２でのユニバーサル増幅によって、導入される偏りを制限した。ＰＣＲ２もシーケンシングのための試料バーコードおよびクラスター化タグをロードした。
１μＭのＰ５−Ｃ５プライマーと、１μＭのＰ７−Ｃ７プライマーと、２００μＭの各ｄＮＴＰと、１×サイバーグリーンと、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液中の０．５ユニットのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＩＩポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）とを含有する２５μｌ サイバーグリーンｑＰＣＲを構築した。反応を９８℃で１サイクル、続いて、１０秒間９８℃、２０秒間６２℃、２０秒間７２℃の３５サイクル、続いて、７２℃で３分の１サイクルにわたってインキュベートした。
２５μｌのＰＣＲ−１反応物を、１μＭのＰ５−Ｃ５プライマーと、１μＭのＰ７−ＳＢＣ−Ｃ７と、２００μＭの各ｄＮＴＰと、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液中の１ユニットのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＩＩポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）とを含有する５０μｌ ＰＣＲ反応で増幅した。反応を９８℃で１サイクル、続いて、ｑＰＣＲ分析によって決定したいくつかのＰＣＲサイクルにわたってインキュベートした。サイクリング；９８℃１０秒、６２℃２０秒、７２℃２０秒のＮサイクル、続いて、７２℃で３分の１サイクル。試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉｓｅｑまたはＨＩｓｅｑシステムを製造業者のプロトコールに従って用いるハイスループットシーケンシングに供す。
最終ライブラリー
得られたライブラリーは、シーケンシングされた適切なタグおよびクラスター化セグメントを伴う全抗体配列で構成されていた。固有の出発ＲＮＡ分子ごとに生成される同一ＵＩＤの多くのコピーがあった。シーケンシングにより、同一ＵＩＤをマッチングし、シーケンシングリードをコンセンサス配列に圧縮することによって、シーケンシングおよびＰＣＲエラーを削除した。シーケンシングを、リード−１のためにＰ５部位（Ｃ、Ｊ、Ｄ、Ｖ）から行い、続いてシーケンシングをリード−２のためにＰ７部位（ＵＩＤおよびＶＤＪ）から、そして最後にＳＢＣのインデキシングリード−３のためにリバースＰ７部位から行った。
（実施例２６）
免疫シーケンシングＶ３
これは、多重Ｖプライマーのプールの使用をなくすための、したがって、ＰＣＲの偏りの問題を除去するための、逆転写中の鋳型乗り換えの使用を説明するものである。このプロセスを抗体次世代シーケンシングに使用し、固有の識別子（ＵＩＤ）ポリヌクレオチドの組み込みにも使用した。
出発物質
出発物質は、抗体をコードし、定常領域を含有する、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントで構成されている免疫細胞またはＴ細胞からのＲＮＡまたはＤＮＡであった。一部の実験では、ＲＮＡは、重鎖セグメント（Ｖ、Ｄ、Ｊセグメント）、または軽鎖セグメント（Ｖ、Ｊセグメント）を含んだ。
逆転写
遺伝子特異的可変セグメントプライマーを必要とすることなく免疫グロブリン再構成重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのライブラリーを生成するために、まず、ＲＮＡ試料の逆転写を鋳型乗り換え（ＴＳ）ポリヌクレオチドの存在下で行う。ＴＳポリヌクレオチドは、３つの末端リボグアノシン残基を含有し、これらによって、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素による逆転写伸長産物の末端に付加された末端シトシン残基の鋳型として動作することができる。これによって、すべてのｃＤＮＡ断片の３’末端にユニバーサル配列末端が生成される。重要なこととして、ＴＳポリヌクレオチドは、約１５塩基縮重バーコード配列（ユニバーサル識別子またはＵＩＤ）を保有するので、すべてのｃＤＮＡ分子が異なるバーコードを保有することになり、それによってシーケンシング結果の中のＰＣＲデュプリケートの識別が可能になり、これは、前に論じたようにいくつかの利点をもたらす。次の部分で構成されたポリヌクレオチドの１つまたはポリヌクレオチドプールを使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する：ＲＮＡの領域に相補的な部分。この場合、ＲＮＡの領域に相補的な部分は、ｍＲＮＡの定常領域にまたはポリＡテールに相補的であった。複数のポリヌクレオチドを使用して、様々な定常領域にアニールした。ここで使用した逆転写酵素は、非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を含んだ。逆転写酵素は、鋳型の末端に到達すると、自然に３つの鋳型なしシトシン残基を付加した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をこの目的のために使用した。
鋳型乗り換え
以前の逆転写反応は、次の部分で構成されている５’タギングポリヌクレオチドの存在下で行った：シーケンシングプライマーをアニールするために使用したＰ７セグメント、ＵＩＤ、逆転写酵素によって産生される鎖に相補的であり、それにアニールされる３’末端の３つのリボ−グアニン残基（ｒＧｒＧｒＧ）（ＲＮＡ塩基）。一部の実験では、３つのグアニン残基をリボ−グアニンの代わりに（ＤＮＡヌクレオチドをＲＮＡヌクレオチドの代わりに）使用した。タギングポリヌクレオチドをｃＤＮＡ鎖のＣＣＣにアニールすると、逆転写酵素がｃＤＮＡをタギングポリヌクレオチドの中に伸長させ続け、その結果、その反応ですべてのｃＤＮＡへのユニバーサルタグが作成された。他の実験では、鋳型乗り換えを、逆転写反応を行うのと同時に行うのではなく、別の反応で行った。これらの実験では、５’タギングポリヌクレオチドを逆転写反応後に付加させ、逆転写酵素またはポリメラーゼなどの酵素を使用して同様にタギングポリヌクレオチドの中に伸長させた。タギングポリヌクレオチドは、あらゆる単一分子上に固有の縮重ＵＩＤを有していたので、各ｃＤＮＡにＵＩＤのタグが固有に付けられた。
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌと、７５ｍＭのＫＣｌと、３ｍＭのＭｇＣｌ２と、３ｍＭのＭｎＣｌ２と、１０ｍＭのジチオトレイトールと、各２５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰと、２ユニット／μｌ ＲＮアーゼ阻害剤（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と、１０ユニット／μｌのＭｕＭＬＶ逆転写酵素ＲＮアーゼＨ−（ＮＥＢ）と、５００ｎＭのポリヌクレオチドｄＴ（１８）プライマーと５００ｎＭのＴＳポリヌクレオチドとを含有する２０μｌの反応で鋳型乗り換えを伴う逆転写に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの２００ｎｇの全ＲＮＡを供した。反応を引き起こし、４２℃で４５分間インキュベートした。産物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で精製し、２０μｌ Ｈ２Ｏで溶離した。
ＰＣＲ１
次の部分で構成されているプライマーを使用してＰＣＲを行った：ＵＩＤの上流のタギングポリヌクレオチド末端に相補的なフォワードプライマー（Ｐ７）、およびＲＮＡに相補的なセグメント（Ｃ）とシーケンシングに使用されるオーバーハング（Ｐ５）で構成されているリバースプライマー。Ｃセグメントを逆転写ポリヌクレオチドの入れ子にし、正しいＲＮＡ標的に対する反応の特異性増加をもたらした。他の実験では、Ｃ７オーバーハングおよび試料バーコードがフォワードＰ７プライマー上に既に存在した。
精製された逆転写産物を、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の定常セグメントに相補的なプライマーと、ｃＤＮＡ断片の３’末端の鋳型乗り換え領域に相補的なプライマーとを使用する第１ラウンドのＰＣＲに供した。
合計２０μｌの精製された逆転写産物を、１×Ｑ５緩衝液（ＥＢ）と、各々２００ｕＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰと、各々６５ｎＭの重鎖／軽鎖定常プライマー（ＩＧＨＣ、ＩＧＫＣ、ＩＧＬＣ）と、４０ｎＭの長鎖鋳型乗り換えプライマーと、８００ｎＭの短鎖鋳型乗り換えプライマーと、０．０２ユニット／μｌのＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）とを含有する５０ｕｌ ＰＣＲ反応に含めた。反応を、９８℃で１分間、続いて１２サイクルの、９８℃、１０秒；６４℃、３０秒；７２℃、１５秒に供した。産物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰによって精製し、２５μｌ Ｈ２Ｏで溶離した。
ＰＣＲ１産物の定量
精製されたＰＣＲ１産物の一定分量を、次に、サイバーグリーン定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって定量した。５μｌの精製ＰＣＲ１産物を、１× Ｑ５緩衝液（ＥＢ）と、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰと、０．２５×サイバーグリーンＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、４００ｎＭのＩｌｌｕｍｉｎａ適合性フォワードプライマー（Ｐ５−Ｃ５）と、４００ｎＭのＩｌｌｕｍｉｎａ適合性ペアードエンドプライマー（Ｐ７−ＳＢＣ−Ｃ７）と、０．０２ユニット／μｌのＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）とを含有する２５μｌ ＰＣＲ反応に含めた。反応を９８℃１分、続いて２０サイクルの［９８℃、１０秒；７２℃、４５秒］に供した。
インデキシングＰＣＲ２
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームでクラスター化するために、次のプライマー：ＰＣＲ１で使用したのと同じＰ５Ｃ５リバースプライマー、およびＰ７配列と試料バーコード（ＳＢＣ）とで構成されているフォワードプライマーを用いる、ならびに第２のオーバーハング（Ｃ７）を用いる、第２のＰＣＲ相を使用して、ＰＣＲ１産物を増幅した。試料バーコードは、実験でプロセッシングした試料ごとに異なり、したがって、複数の試料を１回のシーケンシング実行で一緒にプールすることができた。ＰＣＲ１は、ＰＣＲ１反応に使用したプライマーの多重プールのため、偏りを導入し得る。ＰＣＲ１サイクル数の制限およびＰＣＲ２でのユニバーサル増幅によって、導入される偏りを制限した。ＰＣＲ２もシーケンシングのための試料バーコードおよびクラスター化タグをロードした。
次いで、残りのＰＣＲ１産物をＰＣＲで増幅して、プールシーケンシングのための試料特異的インデックスを含む完全Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列をライブラリーに加えた。望ましくないＰＣＲアーチファクトが生成される可能性が高いプラトー相へとＰＣＲが進むのを防止するために理想的ＰＣＲサイクル数を、ｑＰＣＲ結果に基づいて選んだ。
インデキシングＰＣＲのために、１０μｌの精製ＰＣＲ１産物を、１× Ｑ５緩衝液（ＥＢ）と、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰと、０．２５×サイバーグリーンＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、４００ｎＭのＩｌｌｕｍｉｎａ適合性フォワードプライマー（Ｐ５−Ｃ５）と、４００ｎＭのＩｌｌｕｍｉｎａ適合性ペアードエンドプライマー（Ｐ７−ＳＢＣ−Ｃ７）と、０．０２ユニット／μＬのＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）とを含有する５０μｌ ＰＣＲ反応に含めた。反応を、９８℃で１分間、続いて、先行するｑＰＣＲの結果に基づいて決定されるサイクル数での［９８℃、１０秒；７２℃、４５秒］のサイクルに供した。ハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングおよび分析の前に、産物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製し、２５μｌのＴＥ緩衝液で溶離し、ゲル電気泳動によって可視化した。
最終ライブラリー
得られたライブラリーは、シーケンシングされた適切なタグおよびクラスター化セグメントを伴う全抗体配列で構成されていた。固有の出発ＲＮＡ分子ごとに生成される同一ＵＩＤの多くのコピーがあった。ＵＩＤは、実施例１で説明した位置と比較して、異なる位置にあった。シーケンシングにより、同一ＵＩＤをマッチングし、シーケンシングリードをコンセンサス配列に圧縮することによって、シーケンシングおよびＰＣＲエラーを削除した。シーケンシングを、リード−１のためにＰ５部位（Ｃ、Ｊ、Ｄ、Ｖ）から行い、その後、シーケンシングをリード−２のためにＰ７部位（ＵＩＤおよびＶＤＪ）から、そして最後に試料バーコード（ＳＢＣ）のインデキシングリード−３のためにリバースＰ７部位から行った。
（実施例２７）
直接腫瘍試料からのＴＩＬのシーケンシング
ＴＩＬの単離を伴わない４００，０００個の卵巣腫瘍解離細胞を含む卵巣腫瘍試料（すなわち、この試料は、正常上皮細胞、がん細胞およびＴＩＬを含む）を、上で説明したようなエマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシーケンシングを行うために調製した。試料中のＢおよびＴ細胞からのＩｇおよびＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを、細胞型に基づいて事前に単離せずにシーケンシングした。細胞を、細胞緩衝液：１×ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１０分間、２回の遠心分離２００ｇによって洗浄した。次いで、細胞を細胞緩衝液で細胞３．５×１０６個／ｍＬの細胞濃度に希釈した。次いで、その懸濁液を、２０μｍセルストレーナーを通してピペッティングした。
次いで、エマルジョンベースの超ハイスループット単一細胞ポリヌクレオチドシーケンシングを行うためのエマルジョン反応混合物を、上で説明したように調製した。細胞および反応混合物を調製したら、エマルジョンを形成した。１００μＬ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒシリンジを使用して、１００μＬ ＰＥＥＫ試料ループに各々約１００μＬの反応混合物の２回の注入で過剰に充填した。１００μＬ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｇａｓｔｉｇｈｔシリンジを使用して、約１１０μＬの細胞懸濁液を約１００μＬ、内径０．２ｍｍ ＦＥＰチューブループに充填した。そのループを、細胞の沈降および集群化を防止するために１〜２秒ごとにおおよそ１回、絶えず細胞ループを反転させるメカニカルローテータに取り付けた。内側親フッ素性被覆が施されたＤｏｌｏｍｉｔｅ ２−試薬チップ経由で集束流を噴射することによってエマルジョンを形成した。外側のオイルチャネルには、ＨＦＥ７５００（Ｎｏｖｅｃ ７５００）フルオロカーボン油中の０．５〜５．０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール系界面活性剤が入っていた。エマルジョンジェットを（細胞相および反応相チャネルにおいて等しい）一定流量で流した。エマルジョンチップ排出量を、１２ｃｍ、内径０．５ｍｍ ＰＥＥＫチューブ経由で、冷却ブロック内でおおよそ０℃に保たれているポリプロピレンＰＣＲチューブに滴下することによって回収した。エマルジョン中の５０μＬの水性材料を各々が含有する４つの画分を回収した（１画分当たり５分の実行時間）。沈降した油の大部分をキャピラリーマイクロピペットで各チューブの底部から除去した。各エマルジョン画分に、４０μＬのオーバーレイ溶液：５０ｍＭ Ｎａ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．００２％（ｗ／ｖ）クレゾールレッドを、穏やかに重層した。エマルジョンを、サーマルサイクラーで、次のプログラム（分：秒）でインキュベートした：
１．４２．０℃、３０：００間（逆転写）
２．９５．０℃、０５：００間（変性逆転写酵素およびＤＮＡ鋳型）
３．９５．０℃、００：１０間
４．６５．０℃、００：３０間
５．７２．０℃、００：３０間
６．３に戻り合計５５サイクル行う（容器バーコードを増幅し、ｃＤＮＡに融合させる）
７．４．０℃、時間制限なし
エマルジョンを４．０℃で一晩保持した。次いで、エマルジョンを破裂させた。キャピラリーマイクロピペット先端部を使用して、できる限り多くのオーバーレイ溶液を、エマルジョン材料を除去することなく除去した。各チューブに、１２．５μＬ Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼ溶液および２．５μＬの０．５Ｍ Ｎａ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を添加した。４０μＬの１：１ ＦＣ−４０：パーフルオロオクタノールの添加および約１０回の穏やかな反転により、エマルジョンを破壊した。チューブの内容物を穏やかに遠心分離し、サーマルサイクラーで、次のプログラム（分：秒）でインキュベートした：
１．５０℃、１５：００間（プロテアーゼ消化）
２．７０℃、１０：００間（プロテアーゼ不活性化）
３．９５℃、０３：００間（プロテアーゼ不活性化およびＤＮＡ変性）
４．４．０℃、長時間
チューブを遠心分離し、上部水性相および界面を新たなマイクロ遠心チューブに移し、１５，０００ｇで１分間、遠心分離した。上部水性相を、界面を乱すことなく、新しいチューブに移入した。次いで、０．２５ＶのＮＥＢストレプトアビジンビーズを２ｘＢＷ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ ｔｗｅｅｎ−２０）に添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、ビーズを１ｘＢＷで洗浄し、０．００１％ ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、０．２５Ｖの０．００１％ ｔｗｅｅｎ−２０の添加および９５℃への３分間の加熱によって溶離した。５容量のＱｉａｇｅｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＰＢを添加し、シリカカラムにかけた。次いで、ビーズを０．７ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、１８０μＬの、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で溶離した。次いで、ポリヌクレオチドを３ＰＣＲラウンドによって増幅した。最終ＰＣＲ産物を１．２容量のＡＭＰｕｒｅで精製し、２０μＬの希釈緩衝液で溶離した。次いで、次世代シーケンシング技術プラットフォームを使用してライブラリーをシーケンシングした。
図１８Ａ〜Ｃに示すように、ＢおよびＴ細胞を同時的にシーケンシングしたとき、６，０５６のＩｇＨ−ＩｇＬ受容体鎖の組合せ、および５，２１７のＴＣＲα−ＴＣＲβ受容体鎖の組合せが、クロストークもコンタミネーションもなく、正確なＢ細胞受容体とＴ細胞受容体のペアリングでシーケンシングされた（図１８Ａ）。６，０５６のＩｇＨ−ＩｇＬ受容体鎖の組合せのうち、５，１５２は、ＩｇＧアイソタイプのものであった。これは、腫瘍が活性化ＩｇＧ浸潤物の有意な濃縮を示したことを実証する（図１８Ｂ）。腫瘍は、ＴＩＬを採取した重度に変異した浸潤物の有意な濃縮を示した（図１８Ｃ）。

Claims (31)

  1. （ａ）
    対象からの生体試料から単離された単一の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞を含む第１の容器と、
    前記対象からの生体試料から単離された単一の非ＴＩＬ細胞を含む第２の容器と
    を含む複数の容器を形成するステップであって、
    前記第１および第２の容器は、それぞれさらに、
    容器バーコード化ポリヌクレオチドと、
    複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドと、
    それぞれの前記単一のＴＩＬ細胞および単一の非ＴＩＬ細胞からの免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと
    を含む、形成するステップ；
    （ｂ）前記複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの分子バーコード化ポリヌクレオチドおよび前記容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物を、それぞれの前記単一のＴＩＬ細胞および単一の非ＴＩＬ細胞からの前記Ｉｇまたは前記ＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその増幅産物に付着させるステップ；
    （ｃ）
    （ｉ）前記単一のＴＩＬ細胞からの前記Ｉｇまたは前記ＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその増幅産物、および付着された分子バーコード化ポリヌクレオチドおよび容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物、並びに
    （ｉｉ）前記単一の非ＴＩＬ細胞からの前記Ｉｇまたは前記ＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその増幅産物、および付着された分子バーコード化ポリヌクレオチドおよび容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物
    をシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップ；ならびに
    （ｄ）前記単一のＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を前記配列情報に基づいて選択するステップ
    を含む方法。
  2. （ａ）
    対象からの生体試料から単離された単一のＴＩＬ細胞を含む第１の容器と、
    前記対象からの生体試料から単離された単一の非ＴＩＬ細胞を含む第２の容器と
    を含む複数の容器を形成するステップであって、
    前記第１および第２の容器は、それぞれさらに、
    容器バーコード化ポリヌクレオチドと、
    複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドと、
    それぞれの前記単一のＴＩＬ細胞および単一の非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと
    を含む、形成するステップ；
    （ｂ）前記複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの分子バーコード化ポリヌクレオチドおよび前記容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物を、それぞれの前記単一のＴＩＬ細胞および単一の非ＴＩＬ細胞からの前記Ｉｇまたは前記ＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその増幅産物に付着させるステップ；
    （ｃ）
    （ｉ）前記単一のＴＩＬ細胞からの前記Ｉｇまたは前記ＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその増幅産物、および付着された分子バーコード化ポリヌクレオチドおよび容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物、並びに
    （ｉｉ）前記単一の非ＴＩＬ細胞からの前記Ｉｇまたは前記ＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその増幅産物、および付着された分子バーコード化ポリヌクレオチドおよび容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物
    をシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップ；
    （ｄ）前記配列情報を、対応する正常隣接組織試料から得た配列情報と比較するステップ；ならびに
    （ｅ）前記単一のＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を前記比較に基づいて選択するステップ
    を含む方法。
  3. （ａ）
    第１の対象からの生体試料から単離された単一のＴＩＬ細胞を含む第１の容器と、
    前記第１の対象からの生体試料から単離された単一の非ＴＩＬ細胞を含む第２の容器とを含む複数の容器を形成するステップであって、
    前記第１および第２の容器は、それぞれさらに、
    容器バーコード化ポリヌクレオチドと、
    複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドと、
    それぞれの前記単一のＴＩＬ細胞および単一の非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと
    を含む、形成するステップ；
    （ｂ）前記複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの分子バーコード化ポリヌクレオチドおよび前記容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物を、それぞれの前記単一のＴＩＬ細胞および単一の非ＴＩＬ細胞からの前記Ｉｇまたは前記ＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその増幅産物に付着させるステップ；
    （ｃ）
    （ｉ）前記単一のＴＩＬ細胞からの前記Ｉｇまたは前記ＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその増幅産物、および付着された分子バーコード化ポリヌクレオチドおよび容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物、並びに
    （ｉｉ）前記単一の非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその増幅産物、および付着された分子バーコード化ポリヌクレオチドおよび容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物
    をシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップ；
    （ｄ）前記配列情報を、第２の対象からの生体試料から得た配列情報と比較するステップであって、前記第１および第２の対象が同じ疾患を有するステップ；
    （ｅ）前記単一のＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を前記比較に基づいて選択するステップ
    を含む方法。
  4. 前記生体試料が、組織試料である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを産生するステップをさらに含み、前記産生するステップが、前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを合成すること、または組換え発現させることを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. インビトロアッセイを用いて、前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの標的抗原を識別するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記単一のＴＩＬ細胞および前記単一の非ＴＩＬ細胞が、前記生体試料中に１：１０，０００またはそれ未満、１：１００，０００またはそれ未満あるいは１：１，０００，０００またはそれ未満の比で存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記単一のＴＩＬ細胞からの前記Ｉｇまたは前記ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド、および前記単一の非ＴＩＬ細胞からの前記Ｉｇまたは前記ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドが、前記シーケンシングするステップ中に１：１０，０００またはそれ未満、１：１００，０００またはそれ未満あるいは１：１，０００，０００またはそれ未満の比で存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記選択するステップが、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベル、ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生殖系列配列からの変異のパターン、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生殖系列配列からの変異レベル、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在、および正常細胞からの配列情報セットの中の前記選択されたポリヌクレオチド配列の非存在、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの濃縮、および正常細胞からの配列情報セットの中の前記ポリヌクレオチド配列の非存在、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのアイソタイププロファイル、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの系統発生的クラスター、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの系統発生的クラスターのサイズ、前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列と、疾患にかかった生体試料からの配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列との間の類似性、ならびに前記配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列と、正常生体試料からの配列情報の中のＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列との間の類似性の欠如からなる群から選択される少なくとも１つのバイオインフォマティクス解析に基づく、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. インビトロアッセイを用いて、前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの疾患にかかった生体試料または疾患にかかった細胞への特異性を判定するステップをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
  11. 特異性を判定する前記ステップが、前記疾患にかかった生体試料または前記疾患にかかった細胞に対する前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの親和性、および同じ組織型の、対応する正常隣接組織または対応する正常生体試料または対応する正常細胞に対する前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの親和性を判定することを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. インビトロアッセイを用いて、疾患にかかった細胞を殺滅する産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドを識別するステップをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記単一の非ＴＩＬ細胞が、上皮細胞、またはリンパ球を含み、前記単一のＴＩＬ細胞が、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記上皮細胞またはリンパ球ががん細胞である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記選択されたポリヌクレオチド配列が、１〜５００の固有のＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記生体試料の前記単一のＴＩＬ細胞および前記単一の非ＴＩＬ細胞が、前記シーケンシングするステップの前に選別、分離または選択されない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 少なくとも１つの前記シーケンシングされるポリヌクレオチドが、Ｉｇ重鎖（ＩｇＨ）、Ｉｇ軽鎖（ＩｇＬ）、Ｉｇ定常ドメイン領域、Ｉｇ重鎖可変領域（ＶＨ）、またはＩｇ軽鎖可変領域（ＶＬ）のうちの少なくとも１つをコードするＩｇポリヌクレオチドを含み、または少なくとも１つの前記シーケンシングされるポリヌクレオチドが、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＴＣＲα鎖可変領域（Ｖα）、ＴＣＲβ鎖可変領域（Ｖβ）、ＴＣＲγ鎖可変領域（Ｖγ）、ＴＣＲδ鎖可変領域（Ｖδ）、ＴＣＲα定常ドメイン、ＴＣＲβ定常ドメイン、ＴＣＲγ定常ドメイン、またはＴＣＲδ定常ドメインのうちの少なくとも１つをコードするＴＣＲポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ＩｇＨを同じＢ細胞からの前記Ｉｇ軽鎖（ＩｇＬ）とペアリングするステップ、前記ＴＣＲα鎖を同じＴ細胞からのＴＣＲβ鎖とペアリングするステップ、または前記ＴＣＲγ鎖を同じＴ細胞からのＴＣＲδ鎖とペアリングするステップのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記選択されたＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の変異フレームワーク残基を含むフレームワーク領域配列を含むＩｇまたはＴＣＲポリペプチドをコードする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、疾患関連タンパク質または疾患特異的タンパク質に関して１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍまたはそれ未満のＫＤを有する、請求項５または６に記載の方法。
  21. （ａ）
    対象からの生体試料から単離された単一のＴＩＬ細胞を含む第１の容器と、
    前記対象からの生体試料から単離された単一の非ＴＩＬ細胞を含む第２の容器と
    を含む複数の容器を形成するステップであって、
    前記第１および第２の容器は、それぞれさらに、
    （ｉ）複数の分子バーコード化ポリヌクレオチド、および
    （ｉｉ）容器バーコード化ポリヌクレオチド
    を含む、形成するステップと；
    （ｂ）（ｉ）それぞれの前記単一のＴＩＬ細胞および単一の非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第１のポリヌクレオチドに相補的である第１の相補的ポリヌクレオチド、および
    （ｉｉ）それぞれの前記単一のＴＩＬ細胞および単一の非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードする第２のポリヌクレオチドに相補的である第２の相補的ポリヌクレオチド
    を産生するステップと；
    （ｃ）（ｉ）前記複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの１つの第１の分子バーコード化ポリヌクレオチドを前記第１の相補的ポリヌクレオチドに、および
    （ｉｉ）前記複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドのうちの１つの第２の分子バーコード化ポリヌクレオチドを前記第２の相補的ポリヌクレオチドに
    付着させることによって、第１および第２の単一ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドおよび第１および第２の単一非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと；
    （ｄ）前記容器バーコード化ポリヌクレオチド、またはその増幅産物を、第１または第２の容器のそれぞれにおいて、
    （ｉ）前記第１および第２の単一ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドに、および
    （ｉｉ）前記第１および第２の単一非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドに付着させることによって、第１および第２の単一細胞二重バーコード化配列のライブラリーを形成するステップと
    （ｅ）第１および第２の単一細胞二重バーコード化配列のライブラリーをシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップ
    （ｆ）前記ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を前記配列情報に基づいて選択するステップ
    を含む方法。
  22. （ａ）
    対象からの生体試料から単離された単一のＴＩＬ細胞を含む第１の容器と、
    前記対象からの生体試料から単離された単一の非ＴＩＬ細胞を含む第２の容器と
    を含む複数の容器を形成するステップであって、
    前記第１および第２の容器は、それぞれさらに、
    容器バーコード化ポリヌクレオチド
    を含む、形成するステップ；
    （ｂ）（ｉ）前記生体試料からの前記単一のＴＩＬ細胞または前記単一の非ＴＩＬ細胞からのＶＨまたはＴＣＲαをコードするポリヌクレオチドから第１の相補的ポリヌクレオチドを、および
    （ｉｉ）前記生体試料からの前記単一のＴＩＬ細胞または前記単一の非ＴＩＬ細胞からのＶＬまたはＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドから第２の相補的ポリヌクレオチドを、
    （Ａ）前記生体試料からの前記単一のＴＩＬ細胞または前記単一の非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドに存在する同じ領域に相補的な領域を含む第１のプライマー、
    （Ｂ）前記生体試料からの前記単一のＴＩＬ細胞または前記単一の非ＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドに存在する同じ領域に相補的な領域を含む第２のプライマー、
    （Ｃ）３つまたはそれ超の同一の非鋳型ヌクレオチドを前記第１および第２の相補的ポリヌクレオチドの３’末端に付加させる非鋳型ターミナルトランスフェラーゼ活性を含む逆転写酵素、ならびに
    （Ｄ）（１）分子バーコード、
    （２）容器バーコード化ポリヌクレオチドに存在する領域に相補的な５’末端領域、および
    （３）前記３つまたはそれ超の同一の非鋳型ヌクレオチドに相補的な３’末端領域を各々が含む、複数の分子バーコード化ポリヌクレオチドを用いて産生することにより、第１および第２の単一のＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチド並びに第１および第２の単一の非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと；
    （ｃ）前記容器バーコード化ポリヌクレオチドを増幅することにより、第１および第２の単一のＴＩＬ二重バーコード化ポリヌクレオチド並びに第１および第２の単一の非ＴＩＬ二重バーコード化ポリヌクレオチドを形成するステップと；
    （ｄ）前記第１および第２の単一のＴＩＬ二重バーコード化ポリヌクレオチドおよび前記第１および第２の単一の非ＴＩＬ二重バーコード化ポリヌクレオチドを増幅することにより、前記ＶＨ、ＶＬ、ＴＣＲαまたはＴＣＲβポリヌクレオチドの可変領域を含む配列のライブラリーを形成するステップと；
    （ｅ）前記試料の免疫状態を表す前記ライブラリーの１つまたは複数の配列をシーケンシングすることにより、配列情報を得るステップと；
    （ｆ）前記単一のＴＩＬ細胞からのＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列を前記配列情報に基づいて選択するステップとを含む方法。
  23. （ｉ）前記第１および第２の単一のＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドまたは前記第１および第２の単一の非ＴＩＬ単一バーコード化ポリヌクレオチドが、異なる分子バーコードを含み、または（ｉｉ）前記第１および第２の単一のＴＩＬ二重バーコード化ポリヌクレオチドまたは前記第１および第２の単一の非ＴＩＬ二重バーコード化ポリヌクレオチドが、異なる分子バーコードを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記疾患が、自己免疫疾患、がんまたは前がん性疾患である、請求項３に記載の方法。
  25. 前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドが、正常隣接組織の細胞または前記疾患を有さない対象における同じ組織からの細胞と実質的に相互作用しないか、または結合しない、請求項３に記載の方法。
  26. 前記識別するステップが、全ゲノムｓｉＲＮＡスクリーニング、前記選択されたポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ＩｇまたはＴＣＲポリペプチドに関してタンパク質ディスプレイスクリーニング、酵母ツーハイブリッドスクリーニング、２Ｄゲル電気泳動、タンパク質アレイ、プロテオームスクリーニング、免疫沈降、質量分析、抗体依存性細胞介在性細胞傷害アッセイ、または結合アッセイを行うことを含む、請求項６に記載の方法。
  27. 抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された細胞を生成するステップをさらに含み、前記抗原結合ドメインが、前記選択されたＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列によってコードされる抗原結合ドメインを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された細胞を生成するステップをさらに含み、前記抗原結合ドメインが、前記産生されたＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの識別された標的抗原のエピトープを認識する、請求項６に記載の方法。
  29. 前記選択されたＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列によってコードされる抗原結合ドメインを発現するように遺伝子改変された細胞を生成するステップをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記選択されたＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を生成するステップをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記選択されたＩｇまたはＴＣＲポリヌクレオチド配列によってコードされるＩｇまたはＴＣＲポリペプチドの識別された標的抗原の阻害剤を選択するステップをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
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