TWI388829B - 聚合酶連鎖反應之方法、聚合酶連鎖反應之液珠裝置及其陣列式液珠裝置 - Google Patents
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Description
本發明是有關於一種方法及液珠裝置，特別是有關於一種聚合酶連鎖反應之方法、聚合酶連鎖反應之液珠裝置及其陣列式液珠裝置。
聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)是由Kary Mullis於1985年所發明，Mullis並因此獲得諾貝爾獎以及專利權[US 4,683,195][US 4,683,202]。能夠成為專利是因為它是發明而非發現，換句話說，自然界並不存在這種生化反應。PCR是人為的，其為DNA雙股結構(double helix)與鹼基配對(base pairing)的邏輯應用。PCR具有兩大功能，需要四種材料，以及一再循環的三個步驟。兩大功能是指搜索與複製，PCR能在長達數千萬鹼基對(base pair,bp)的核酸分子中，精確的搜索出長度約數百鹼基對的特定鹼基序列，並將此段序列複製一百萬倍以上。而四種材料是指DNA模版(template)、一對引子(primer，亦為核酸分子，長度約25~30 bp)、核酸(dNTP)與聚合酶(polymerase)。
而PCR的三步驟則包含：(1)雙股分離(denature)：升溫到95℃，藉此打開DNA模版的雙股結構。(2)引子雜交(annealing)：降溫至30~65℃，此時一對引子進入雙股DNA分子中，分頭搜索與本身互補的鹼基序列並結合在此位置。(3)核酸合成(extension)：升溫至65~75℃
，藉此活化聚合並結合在引子的3’端，依模版上的鹼基序列結合對應的dNTP，以合成新的核酸分子鏈。以上三步驟稱為一個循環(cycle)，藉由調整此循環次數，則可完成聚合酶連鎖反應。
PCR技術的發展以液體而言，可分為液體連續式移動(溫度固定)，另一個為固定式液體(溫度變化)。以液體連續式移動而言，在一先前技術中，利用三個金屬塊形成三個不同的溫度區間進而進行PCR反應[Science,vol 280,page 1046-1048,1998]。其技術特徵為，在玻璃基材上成形一特定的流道，此流道提供液體的流動，並配合玻璃基板下方之三區不同的熱源，經由幫浦(pump)推動，驅使流體流流經所設計之三區不同溫度區間，完成PCR反應。由於液體的驅動是利用幫浦所推動，因此在微小化的過程中，易造成流道式的液體驅動產生問題。
此外，以固定式液體而言，在另一先前技術中，利用上下加熱之方式完成PCR反應[Science,vol 298,page 793,2002][US 20050074782]。利用上下兩不同溫度之溫度板產生不同溫差，驅使液體流動，並利用固定的方塊(cube)將試劑包覆於方塊中，並以兩個不同之溫度板所產生之溫差完成PCR放大的效果。而為了能使穩定的溫度進行PCR反應，因此需要有上下的溫度造成流動。又，在一先前技術中，利用光學的方式完成加熱的方法[Physical Biology,vol 1,page 1-8,2004]，其利用遠紅外線的加熱方式聚焦至一點，驅使液體產生
溫度，進而完成PCR的放大效果，此方式需一光學系統及對準裝置，會增加系統整合上的困難度。
有鑑於上述習知技藝之問題，本發明之目的就是在提供一種聚合酶連鎖反應之方法、聚合酶連鎖反應之液珠裝置及其陣列式液珠裝置，以達到單一溫度控制則可完成PCR反應，且短時間內則可完成模板放大之功用。
根據本發明之目的，提出一種聚合酶連鎖反應之方法，其步驟包括：將含有待測物之液體滴入液珠裝置之加熱線圈上，以於加熱線圈上形成液珠，其待測物包括一模板(template)、一引子(primer)、一核酸(dNTP)及一聚合酶(polymerase)。接著，滴入疏水性液體於液珠之表面，以防止液體揮發。最後，將液珠裝置之至少一導線通以電流或電壓，進而加熱其加熱線圈。液珠之內部受熱後，使其內部產生浮力，進而驅動待測物移動至內部之頂部。隨後待測物往內部之周圍移動，以形成一熱循環。
其中，液珠之底部之溫度約為90~100℃，使得模板進行分離(denature)，並透過所述之浮力使待測物移動至頂部。而頂部之溫度約為30~65℃，可造成引子結合(annealing)於模板之特定位置。透過圓弧狀之液珠使待測物移動至液珠之側邊，而其側邊之溫度約為65~80℃，以延長(extension)模板之特定位置。最後，待測物再移動回其底部，以形成所述之熱循環，故藉由重覆熱循環以放大待測物中之模板。
此外，本發明更提出一種聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其包含：冷卻底板、基板、加熱線圈、至少一導線、複數個感測單元、第一容置區及第二容置區。其中，基板可設置於冷卻底板上，而加熱線圈、至少一導線、複數個感測單元、第一容置區與第二容置區皆設置於基板上。加熱線圈設置於第一容置區之中心，至少一導線可連接加熱線圈，而複數個感測單元可設置於加熱線圈外圍，以感測加熱線圈之溫度變化。第一容置區可容置含有待測物之液體，而第二容置區圍繞於第一容置區，以容置疏水性液體，進而防止含有待測物之液體揮發。
其中，待測物包含模板、引子、核酸及聚合酶。而疏水性液體可避免液珠揮發。當至少一導線係通以電流或電壓時，可加熱其加熱線圈，使液體之內部產生浮力，而驅動待測物移動至內部之頂部。隨後待測物往內部之周圍移動，以形成熱循環，並藉由熱循環以放大待測物中之模板。
又，本發明進一步提出一種聚合酶連鎖反應之陣列式液珠裝置，係為複數個以上所述之液珠裝置以陣列方式排列而形成。
承上所述，依本發明之聚合酶連鎖反應之方法、聚合酶連鎖反應之液珠裝置及其陣列式液珠裝置，其可具有一或多個下述優點：
(1)藉由本發明之聚合酶連鎖反應之方法，利用微量體積可以反應時間更短，試劑更少，進而達到微小化功用
。
(2)藉由本發明之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，僅需控制單一溫度(即加熱線圈所供應之熱源係為固定)則可完成聚合酶連鎖反應。
(3)可利用本發明之聚合酶連鎖反應之陣列式液珠裝置，同時處理多種樣本，或同時測試多種引子結合(annealing)之溫度，因此可節省實驗時間。
請參閱第1圖，其係為本發明之聚合酶連鎖反應之液珠裝置之一實施例示意圖。圖中，液珠裝置包含：冷卻底板11、基板12、加熱線圈13、至少一導線14、複數個感測單元15、第一隔板16及第二隔板17。其中，基板12可設置於冷卻底板11上，而加熱線圈13、至少一導線14、複數個感測單元15、第一隔板16與第二隔板17皆設置於基板12上。至少一導線14可連接加熱線圈13，而複數個感測單元15可設置於加熱線圈13外圍，以感測加熱線圈13之溫度變化。第一隔板16圍繞加熱線圈13外圍，使第一隔板16可與加熱線圈13形成第一容置區161，以容置含有待測物之液體。第二隔板17則圍繞於第一隔板16之外圍，使第二隔板17與第一隔板16形成第二容置區171，以容置疏水性液體22。
請參閱第2圖，其係為本發明之聚合酶連鎖反應之液珠裝置之另一實施例示意圖。圖中，可選擇於放置含待測物之液體的第一容置區161上塗佈(coating)親水性材料31，而於放置疏水性液體之第二容置區171上可塗佈疏水性
材料32。因含有待測物之液體為親水性，因此可藉由將其直接滴於第一容置區161，而使其固定於第一容置區161之親水性材料上。而因疏水性液體與第二容置區171之塗佈材料均為疏水性，因此可藉由將其滴於第二容置區171時，而使其可固定於疏水性材料上。因此可不必設置第一隔板16與第二隔板17，而達到含有待測物之液體形成液珠之效果。親水性材料31之官能基可包括氫基、羧基、羥基、磺酸基或胺基，而疏水性材料32則可包括環氧乙烷(epoxides)、環乙縮醛(cyclic acetals)或苯乙烯。
其中，上述待測物包含模板、引子、核酸及聚合酶，而液體更可含有甘油(glycerol)，因甘油可以使得待測物之黏滯性增加，故可藉由黏滯性增加，使得使用者可調整待測物於特定的溫度之停留時間。此外，若欲控制待測物於特定的溫度之停留時間，亦可調整液珠之大小，亦即調整第一容置區161與第二容置區171之大小，例如可分別調整第一隔板16及第二隔板17與加熱線圈13之間距，以及調整塗佈親水性材料31與疏水性材料32於基板12上之寬度。例如第一隔板16與加熱線圈13中心之間距可約為0.5~2.5 mm，而第二隔板17與加熱線圈13中心之間距則可約為1~3 mm。當至少一導線14係通以電流或電壓時，可加熱其加熱線圈13，使液體底部211溫度增高，造成液體底部211密度降低，導致水分子及待測物往上移動至頂部212，進而產生浮力。隨後待測物往內部之周圍移動，以形成熱循環，並藉由熱循環以放大待測物中之
模板。
較佳地，疏水性液體22可為礦物油，礦物油常被應用於聚合酶連鎖反應中避免揮發之液體。故本發明之液珠裝置於基板12表面製作兩種液體可以存放之設計，即為第一隔板16與第二隔板17。利用SU-8光阻配合標準的黃光微影製程技術(Photolithography)定義出兩種液體存放之區域，即為第一容置區161與第二容置區171。使液體可在加熱的過程中透過礦物油的保護而避免揮發。
所述之加熱線圈13之金屬導電係數可高於至少一導線14，故加熱線圈13之金屬可為銀、銅、金、白金、鋁、鐵、錫、鉛或其組合，而至少一導線14包括銀、銅、金、白金、鋁、鐵、錫、鉛或其組合。例如，加熱線圈13若為白金時，至少一導線14則可為鋁線。而模板可為去氧核醣核酸(DNA)或核醣核酸(RNA)，若為DNA時，可進行傳統之聚合酶連鎖反應，若為RNA(例如mRNA)時，則可進行反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)。此外，加熱線圈13可包括圓形、角形或不規則形狀。而基板12之材質包括矽晶片(silica)、玻璃(glass)、尼龍(nylon)、聚合物(polymer)或陶瓷，冷卻底板11之材質則可包含矽/石英(Si/Quartz)。
然而，於加熱線圈13旁設計一組以上之感測單元15，係為了能精確的控制溫度到達一定的溫度，可藉由下式精確算出實際溫度。
RT=R0[1+α(T-T0)]………(1)
式(1)中RT為在溫度T時的阻質，R 0為在溫度T 0的溫度阻質，α為溫度電阻係數(TCR,0C-1)。因此當加熱線圈13加熱之後，可影響周圍的感測單元15，因此藉由此方式子可以精確的定義實際溫度。利用金屬受熱會導致金屬的阻質變化的方式完成溫度的監控。
請參閱第3圖，其係為本發明之聚合酶連鎖反應之陣列式(array)液珠裝置。因將以上所述之液珠裝置以陣列式排放於同一材料上，故可同時處理多種樣本，或同時測試多種引子結合(annealing)之溫度，因此可節省實驗時間。
請參閱第4圖，其係為本發明之聚合酶連鎖反應之方法之流程示意圖。其步驟包括：步驟S11，將含有待測物之液體滴入液珠裝置之加熱線圈13上，以於加熱線圈13上形成液珠21，其液體包括一模板(template)、一引子(primer)、一核酸(dNTP)及一聚合酶(polymerase)，更可包括甘油(glycerol)，因甘油可以使得待測物之黏滯性增加，故可藉由黏滯性增加，使得使用者可調整待測物於特定的溫度之停留時間。步驟S12，滴入疏水性液體22於液珠21之表面，以防止液體揮發，步驟S13，將液珠裝置之至少一導線14通以電流或電壓，進而加熱其加熱線圈13。而液珠21之內部受熱後，使其內部產生浮力，進而驅動待測物移動至內部之頂部212。隨後待測物往內部之周圍移動，以形成一熱循環。
其中，液珠21之底部211之溫度為90~100℃，使得模板進行分離(denature)，並透過所述之浮力使待測物移動至頂部212。而頂部212之溫度為30~65℃，可造成引子結合(annealing)於模板之特定位置。透過液珠21之特定形狀使待測物移動至液珠21之側邊213，而其側邊213之溫度為65~80℃，以延長(extension)模板之特定位置。最後，待測物再移動回其底部211，以形成所述之熱循環，如第5圖所示，故藉由熱循環以放大待測物中之模板。
較佳地，疏水性液體22可為礦物油，礦物油常被應用於聚合酶連鎖反應中避免揮發之液體。所述之加熱線圈13之金屬導電係數高於至少一導線14，故加熱線圈13之金屬可為銀、銅、金、白金、鋁、鐵、錫、鉛或其組合，而至少一導線14包括銀、銅、金、白金、鋁、鐵、錫、鉛或其組合。例如，加熱線圈13若為白金時，至少一導線14則可為鋁線。而模板可為DNA或RNA，若為DNA時，可進行傳統之聚合酶連鎖反應，若為RNA(例如mRNA)時，則可進行反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)。此外，加熱線圈13可包括圓形、角形或不規則形狀。因此，利用導線14給予電流或電壓時，加熱線圈因所給予之電壓或電流，導致溫度提升。因溫度造成之效應，進而驅使液珠21內部造成溫度變化及流場變化，進而產生熱循環軌跡。利用此熱循環，進而完成所欲放大之模板之聚合酶連鎖反應。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
11‧‧‧冷卻底板
12‧‧‧基板
13‧‧‧加熱線圈
14‧‧‧導線
15‧‧‧感測單元
16‧‧‧第一隔板
161‧‧‧第一容置區
17‧‧‧第二隔板
171‧‧‧第二容置區
21‧‧‧液珠
211‧‧‧底部
212‧‧‧頂部
213‧‧‧側邊
22‧‧‧疏水性液體
31‧‧‧親水性材料
32‧‧‧疏水性材料
S11~S13‧‧‧步驟
第1圖係為本發明之聚合酶連鎖反應之液珠裝置之一實施例示意圖；第2圖係為本發明之聚合酶連鎖反應之液珠裝置之另一實施例示意圖；第3圖係為本發明之聚合酶連鎖反應之陣列式液珠裝置之一實施例示意圖；第4圖係為本發明之聚合酶連鎖反應之方法之流程示意圖；以及第5圖係為本發明之聚合酶連鎖反應之液珠裝置之熱循環軌跡之示意圖。
11‧‧‧冷卻底板
12‧‧‧基板
13‧‧‧加熱線圈
14‧‧‧導線
15‧‧‧感測單元
16‧‧‧第一隔板
161‧‧‧第一容置區
17‧‧‧第二隔板
171‧‧‧第二容置區
Claims (26)
- 一種聚合酶連鎖反應之方法，其步驟包括：將含有一待測物之一液體滴入一液珠裝置之一第一容置區之內部之一加熱線圈上，以於該加熱線圈上形成一液珠，該待測物包括一模板(template)、一引子(primer)、一核酸(dNTP)及一聚合酶(polymerase)，且該第一容置區係塗佈一親水性材料；滴入一疏水性液體於圍繞該第一容置區之一第二容置區上，且該疏水性液體係位於該液珠之表面，以防止該液體揮發，該第二容置區係塗佈一疏水性材料；將該液珠裝置之至少一導線通以一電流或一電壓而加熱該加熱線圈，使該液珠之一內部產生一浮力，進而驅動該待測物移動至該內部之一頂部，隨後該待測物往該內部之周圍移動，以形成一熱循環；以及透過設置於該加熱線圈之外圍之複數個感測單元，以感測該加熱線圈之溫度變化；其中，該液珠之一底部之溫度為90~100℃，使得該模板進行分離(denature)，並透過該浮力使該待測物移動至該頂部；該頂部之溫度為30~65℃，造成該引子結合(annealing)於該模板之一特定位置；透過該圓弧狀之液珠使該待測物移動至該液珠之一側邊，而該側邊之溫度為65~80℃，係以延長(extension)該模板之該特定位置；最後該待測物再移動回該底部，以形成該熱循環，藉由重覆該熱循環以放大該模板。
- 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應之方法，其 中該疏水性液體包括礦物油。
- 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應之方法，其中該加熱線圈之金屬導電係數高於該至少一導線。
- 如申請專利範圍第3項所述之聚合酶連鎖反應之方法，其中該加熱線圈包括銀、銅、金、白金、鋁、鐵、錫、鉛或其組合。
- 如申請專利範圍第4項所述之聚合酶連鎖反應之方法，其中該至少一導線包括銀、銅、金、白金、鋁、鐵、錫、鉛或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應之方法，其中該模板包括去氧核醣核酸(DNA)或核醣核酸(RNA)。
- 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應之方法，其中該加熱線圈包括圓形、角形或不規則形狀。
- 申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應之方法，其中該液體包括甘油(glycerol)。
- 一種聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其包含：一冷卻底板；一基板，係設置於該冷卻底板上；一第一容置區，係設置於該基板上，以容置含有一待測物之一液體；一第二容置區，係設置於該基板上，並圍繞於該第一容置區，以容置一疏水性液體，其中該疏水性液體係位於該液體之一表面；一加熱線圈，係設置於該第一容置區之中心，該加熱線圈係位於該第一容置區之內部；至少一導線，係設置於該基板上，並連接該加熱線圈；以 及複數個感測單元，係設置於該加熱線圈之外圍，以感測該加熱線圈之溫度變化；其中，該待測物包含一模板(template)、一引子(primer)、一核酸(dNTP)及一聚合酶(polymerase)，該至少一導線係通以一電流或一電壓而加熱該加熱線圈，使該液體之一內部產生一浮力，而驅動該待測物移動至該內部之一頂部，隨後該待測物往該內部之周圍移動，以形成一熱循環，藉由該熱循環以放大該模板。
- 如申請專利範圍第9項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該第一容置區係由一第一隔板圍繞於該加熱線圈之外圍所構成。
- 如申請專利範圍第10項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該第一隔板與該加熱線圈之間距係為0.5公厘~2.5公厘(mm)。
- 如申請專利範圍第11項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該第二容置區係由一第二隔板圍繞於該第一隔板之外圍所構成。
- 如申請專利範圍第12項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該第二隔板與該加熱線圈之間距係為1公厘~3公厘(mm)。
- 如申請專利範圍第9項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該第一容置區係塗佈一親水性材料。
- 如申請專利範圍第14項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該親水性材料之官能基包括氫基、羧基、羥基、磺酸基或胺基。
- 如申請專利範圍第15項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該第二容置區係塗佈一疏水性材料。
- 如申請專利範圍第16項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該疏水性材料包括環氧乙烷(epoxides)、環乙縮醛(cyclic acetals)或苯乙烯。
- 如申請專利範圍第9項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該疏水性液體包括礦物油。
- 如申請專利範圍第9項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該基板之材質包括矽晶片(silica)、玻璃(glass)、尼龍(nylon)、聚合物(polymer)或陶瓷。
- 如申請專利範圍第9項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該加熱線圈之金屬導電係數高於該至少一導線。
- 如申請專利範圍第20項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該加熱線圈包括銀、銅、金、白金、鋁、鐵、錫、鉛或其組合。
- 如申請專利範圍第21項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該至少一導線包括銀、銅、金、白金、鋁、鐵、錫、鉛或其組合。
- 如申請專利範圍第9項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該模板包括去氧核醣核酸(DNA)或核醣核酸(RNA)。
- 如申請專利範圍第9項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該加熱線圈包括圓形、角形或不規則形狀。
- 如申請專利範圍第9項所述之聚合酶連鎖反應之液珠裝置，其中該液體更包含甘油(glycerol)。
- 一種聚合酶連鎖反應之陣列式液珠裝置，係由複數個如申 請專利範圍第9項至第25項之任一項之液珠裝置所構成，且該複數個液珠裝置係以陣列方式排列。
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