JP2013208066A - 熱サイクル装置及び熱サイクル装置の制御方法 - Google Patents

熱サイクル装置及び熱サイクル装置の制御方法 Download PDF

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Abstract

【課題】リアルタイムＰＣＲに適した熱サイクル装置及び熱サイクル装置の制御方法を提供すること。
【解決手段】蛍光プローブを含む反応液と、反応液とは比重が異なりかつ反応液とは混和しない液体とが充填され、対向する内壁に反応液が近接して移動する流路を含む反応容器を装着する装着部と、装着部に反応容器が装着された場合に、流路の第１領域を加熱する第１加熱部と、流路の第２領域を加熱する第２加熱部と、装着部、第１加熱部及び第２加熱部の配置を、流路の最下点の位置が第１領域内となる第１の配置と、第２領域内となる第２の配置との間で切換える駆動機構と、光の強度を測定する測定部と、駆動機構、第１加熱部、第２加熱部及び測定部を制御する制御部と、を含み、制御部は第１加熱部を第１温度、第２加熱部を第２温度に制御し、第２の配置で第１時間を経過した場合に、第２の配置から第１の配置へと切換え、その後に光の強度を測定する。
【選択図】図１

Description

本発明は、熱サイクル装置及び熱サイクル装置の制御方法に関する。
近年、遺伝子の利用技術の発展によって、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）及び試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階又は３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。
ＰＣＲ法では一般に、チューブや生体試料反応用チップ（バイオチップ）と称する、生化学反応を行うための容器を使用する。しかしながら従来の手法においては、必要な試薬等の量が多く、また反応に必要な熱サイクルを実現するために装置が複雑化したり、反応に時間がかかったりするという問題があった。そのため微少量の試薬や検体を用いてＰＣＲを精度よく短時間で行うためのバイオチップや反応装置が必要とされていた。
このような問題を解決するために、特許文献１には、反応液と、反応液と混和せず反応液よりも比重の小さい液体とが充填された生体試料反応用チップを、水平方向の回転軸の周りに回転させることで、反応液を移動させて熱サイクルを施す生体試料反応装置が開示されている。
また、ＰＣＲによる増幅を、所定の波長の光を検出することによって経時的に（リアルタイムに）測定するリアルタイムＰＣＲが知られている。
特開２００９−１３６２５０号公報
特許文献１に記載の装置は、バイオチップを連続して回転させることで反応液に熱サイクルを施していた。しかしながら、反応液は回転に伴ってバイオチップの流路内を移動するので、反応液を所望の温度に所望の時間保持することが困難であった。そのため、適切にリアルタイムＰＣＲを行うためにはさらなる工夫が必要であった。
本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様によれば、リアルタイムＰＣＲに適した熱サイクル装置及び熱サイクル装置の制御方法を提供することができる。
（１）本形態に係る熱サイクル装置は、ＤＮＡ配列と結合することによって所定の波長の光の強度が変化する蛍光プローブを含む反応液と、前記反応液とは比重が異なり、かつ、前記反応液とは混和しない液体とが充填され、対向する内壁に前記反応液が近接して移動する流路を含む反応容器を装着する装着部と、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記流路の第１領域を加熱する第１加熱部と、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域とは異なる前記流路の第２領域を加熱する第２加熱部と、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記装着部に前記反応容器を装着した場合に、重力の作用する方向における前記流路の最下点の位置が前記第１領域内となる第１の配置と、重力の作用する方向における前記流路の最下点の位置が前記第２領域内となる第２の配置との間で切換える駆動機構と、前記所定の波長の光の強度を測定する測定部と、前記駆動機構、前記第１加熱部、前記第２加熱部及び前記測定部を制御する制御部と、を含み、前記制御部は、前記第１加熱部を第１温度に制御する第１処理と、前記第２加熱部を前記第１温度よりも高い第２温度に制御する第２処理と、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第２の配置で第１時間が経過した場合に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記第２の配置から前記第１の配置へと切換えるように前記駆動機構を制御する第３処理と、前記第３処理の後に、前記所定の波長の光の強度を測定するように前記測定部を制御する第４処理と、を行う。
本形態によれば、装着部、第１加熱部及び第２加熱部の配置を切り換えることで、反応容器が第１の配置に保持された状態と、反応容器が第２の配置に保持された状態とを切り換えることができる。第１の配置は、反応容器を構成する流路の第１領域が、重力の作用する方向における流路の最下部に位置する配置である。第２の配置は、反応容器を構成する流路の第２領域が、重力の作用する方向における流路の最下部に位置する配置である。すなわち、反応液の比重が相対的に大きい場合には、重力の作用によって第１の配置においては反応液を第１領域に、第２の配置においては反応液を第２領域に保持できる。第１領域は第１加熱部によって加熱され、第２領域は第２加熱部によって加熱されるので、第１領域と第２領域とは異なる温度とすることができる。したがって、第１の配置又は第２の配置に反応容器を保持する間、反応液を所定の温度に保持できるので、加熱時間を容易に制御可能な熱サイクル装置を提供できる。また、第３処理では反応液が第２温度に保持され、第４処理では反応液が第２温度よりも低い第１温度に保持される。例えば、第１温度をアニーリング及び伸長温度、第２温度をＤＮＡの熱変性温度とすることで、ＰＣＲを行うことができる。第４処理において所定の波長の光の強度を測定するように測定部を制御することによって、反応液がアニーリング及び伸長温度に保持されている期間に、ＤＮＡ配列に結合する蛍光プローブが発する所定の波長の光の強度を測定できる。したがって、リアルタイムＰＣＲに適した熱サイクル装置を実現できる。
（２）上述の熱サイクル装置において、前記制御部は、さらに、前記第２処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第２の配置で第２時間を経過させる第５処理を行い、前記第５処理の後に、前記第３処理を行なってもよい。
第５処理では反応液が第２温度に保持される。一般に、ホットスタート酵素を用いるＰＣＲにおいては、ホットスタート酵素は熱変性温度で活性化する（ホットスタート）。したがって、例えば、第２温度を熱変性温度とすれば、第５処理を行うことによって、第３処理の第１時間に影響を与えることなく、ホットスタートを含んだ熱サイクルを実現できる。
（３）上述の熱サイクル装置において、前記制御部は、さらに、前記第１加熱部を前記第１温度よりも低い第３温度に制御し、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第１の配置で第３時間を経過させる第６処理と、前記第６処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記第１の配置から前記第２の配置へと切換えるように前記駆動機構を制御する第７処理と、を行い、前記第７処理の後に、前記第５処理を行なってもよい。
第７処理では反応液が第１温度よりも低い第３温度に保持される。第３温度は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）における逆転写反応が進行する温度とすることができる。したがって、第５処理に先立って第７処理を行うことによって、ＰＣＲの前に逆転写反応を行うことができるので、ＲＴ−ＰＣＲに適した熱サイクル装置を実現できる。
（４）上述の熱サイクル装置において、制御部は、前記第４処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第１の配置で第４時間を経過した場合に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記第１の配置から前記第２の配置へと切換えるように前記駆動機構を制御する第８処理、前記第３処理及び前記第４処理を所定回数繰り返して行なってもよい。
これによって、ＰＣＲに適した熱サイクルを所定回数繰り返して行うことができる。
（５）上述の熱サイクル装置において、前記測定部は、前記第１領域を含む領域からの光の強度を測定してもよい。
これによって、第４処理において、反応液がアニーリング及び伸長温度に保持されている第１領域からの光の強度を測定できるので、特定のＤＮＡの量に相関する所定の波長の光の強度をより正確に測定できる。
（６）本形態に係る熱サイクル装置の制御方法は、熱サイクル装置の制御方法であって、前記熱サイクル装置は、ＤＮＡ配列と結合することによって所定の波長の光の強度が変化する蛍光プローブを含む反応液と、前記反応液とは比重が異なり、かつ、前記反応液とは混和しない液体とが充填され、対向する内壁に前記反応液が近接して移動する流路を含む反応容器を装着する装着部と、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記流路の第１領域を加熱する第１加熱部と、前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域とは異なる前記流路の第２領域を加熱する第２加熱部と、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記装着部に前記反応容器を装着した場合に、重力の作用する方向における前記流路の最下点の位置が前記第１領域内となる第１の配置と、重力の作用する方向における前記流路の最下点の位置が前記第２領域内となる第２の配置との間で切換える駆動機構と、前記所定の波長の光の強度を測定する測定部と、を含み、前記制御方法は、前記第１加熱部を第１温度に制御する第１処理を行うことと、前記第２加熱部を前記第１温度よりも高い第２温度に制御する第２処理を行うことと、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第２の配置で第１時間を経過した場合に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記第２の配置から前記第１の配置へと切換えるように前記駆動機構を制御する第３処理を行うことと、前記第３処理の後に、前記所定の波長の光の強度を測定するように前記測定部を制御する第４処理を行うことと、を含む。
本形態によれば、装着部、第１加熱部及び第２加熱部の配置を切り換えることで、反応容器が第１の配置に保持された状態と、反応容器が第２の配置に保持された状態とを切り換えることができる。第１の配置は、反応容器を構成する流路の第１領域が、重力の作用する方向における流路の最下部に位置する配置である。第２の配置は、反応容器を構成する流路の第２領域が、重力の作用する方向における流路の最下部に位置する配置である。すなわち、反応液の比重が相対的に大きい場合には、重力の作用によって第１の配置においては反応液を第１領域に、第２の配置においては反応液を第２領域に保持できる。第１領域は第１加熱部によって加熱され、第２領域は第２加熱部によって加熱されるので、第１領域と第２領域とは異なる温度とすることができる。したがって、第１の配置又は第２の配置に反応容器を保持する間、反応液を所定の温度に保持できるので、加熱時間を容易に制御できる熱サイクル装置の制御方法を実現できる。また、第３処理では反応液が第２温度に保持され、第４処理では反応液が第２温度よりも低い第１温度に保持される。例えば、第１温度をアニーリング及び伸長温度、第２温度を熱変性温度とすることで、ＰＣＲを行うことができる。第４処理において所定の波長の光の強度を測定するように測定部を制御することによって、反応液がアニーリング及び伸長温度に保持されている期間に、ＤＮＡ配列に結合する蛍光プローブが発する所定の波長の光の強度を測定できる。したがって、リアルタイムＰＣＲに適した熱サイクル装置の制御方法を実現できる。
実施形態に係る熱サイクル装置１の斜視図。 実施形態に係る熱サイクル装置１の本体１０の分解斜視図。 図１のＡ−Ａ線における垂直断面図。 実施形態に係る熱サイクル装置１に装着される反応容器１００の構成を表す断面図。 実施形態に係る熱サイクル装置１の機能ブロック図。 図６（Ａ）は、第１の配置における、図１（Ａ）のＡ−Ａ線を通り回転軸Ｒに垂直な面における断面を模式的に示す断面図、図６（Ｂ）は、第２の配置における図１（Ａ）のＡ−Ａ線を通り回転軸Ｒに垂直な面における断面を模式的に示す断面図。 実施形態に係る熱サイクル装置１の制御方法の第１具体例を説明するためのフローチャート。 実施形態に係る熱サイクル装置１の制御方法の第２具体例を説明するためのフローチャート。 実施形態に係る熱サイクル装置１の制御方法の第３具体例を説明するためのフローチャート。 第１実施例における反応液１４０の組成を示す表。 フォワードプライマー（F primer）、リバースプライマー（R primer）、プローブ（Probe）の塩基配列を示す表。 第１実施例における、熱サイクル処理のサイクル数と測定される輝度との関係を示すグラフ。 第２実施例における反応液１４０の組成を示す表。 第２実施例における、熱サイクル処理のサイクル数と測定される輝度との関係を示すグラフ。
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
１．本実施形態に係る熱サイクル装置の全体構成
図１は、本実施形態に係る熱サイクル装置１の斜視図である。図２は、本実施形態に係る熱サイクル装置１の本体１０の分解斜視図である。図３は、図１のＡ−Ａ線における垂直断面図である。図３において、矢印ｇは重力の作用する方向を表す。
本実施形態に係る熱サイクル装置１は、ＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid）配列と結合することによって所定の波長の光の強度が変化する蛍光プローブを含む反応液１４０と、反応液１４０とは比重が異なり、かつ、反応液１４０とは混和しない液体１３０とが充填され、対向する内壁に反応液１４０が近接して移動する流路１１０を含む反応容器１００（詳細は「２．本実施形態に係る熱サイクル装置に装着される反応容器の構成」の項で後述される）を装着する装着部１５と、装着部１５に反応容器１００が装着された場合に、流路１１０の第１領域１１１を加熱する第１加熱部２１と、装着部１５に反応容器１００が装着された場合に、第１領域１１１とは異なる流路１１０の第２領域１１２を加熱する第２加熱部２２と、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、重力の作用する方向における流路１１０の最下点の位置が第１領域１１１内となる第１の配置と、重力の作用する方向における流路１１０の最下点の位置が第２領域１１２内となる第２の配置との間で切換える駆動機構３０と、所定の波長の光の強度を測定する測定部５０と、駆動機構３０、第１加熱部２１、第２加熱部２２及び測定部５０を制御する制御部４０と、を含む。
図１に示される例では、熱サイクル装置１は、本体１０と駆動機構３０とを含んで構成されている。図２に示されるように、本体１０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を含んで構成されている。
装着部１５は、反応容器１００を装着する構造である。図１及び図２に示される例では、熱サイクル装置１の装着部１５は、挿入口１５１を有し、挿入口１５１から反応容器１００を差し込んで装着するスロット構造である。図２に示される例では、装着部１５は、第１加熱部２１の第１ヒートブロック２１ｂ及び第２加熱部２２の第２ヒートブロック２２ｂを貫通する穴に反応容器１００を差し込む構造となっている。第１ヒートブロック２１ｂ及び第２ヒートブロック２２ｂについては後述する。本体１０に設けられる装着部１５の数は複数であってもよく、図１及び図２に示される例では、１０個の装着部１５が本体１０に設けられている。また、図２及び図３に示される例では、装着部１５が第１加熱部２１及び第２加熱部２２の一部として構成されているが、駆動機構３０を動作させた場合に両者の位置関係が変化しない限り、装着部１５と第１加熱部２１及び第２加熱部２２とは別の部材として構成されていてもよい。
なお、本実施形態においては、装着部１５がスロット構造である例を示したが、装着部１５は反応容器１００を保持できる構造であればよい。例えば、反応容器１００の形状に合わせた窪みに反応容器１００をはめ込む構造や、反応容器１００を挟んで保持する構造を採用してもよい。
第１加熱部２１は、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、反応容器１００の流路１１０の第１領域１１１を加熱する。図３に示される例では、第１加熱部２１は、本体１０において、反応容器１００の第１領域１１１を加熱する位置に配置されている。
第１加熱部２１は、熱を発生させる機構と、発生した熱を反応容器１００に伝える部材とを含んでもよい。図２に示される例では、第１加熱部２１は、熱を発生させる機構としての第１ヒーター２１ａと、発生した熱を反応容器１００に伝える部材としての第１ヒートブロック２１ｂを含んで構成されている。
熱サイクル装置１においては、第１ヒーター２１ａはカートリッジヒーターであり、導線１９によって図示しない外部電源に接続される。第１ヒーター２１ａとしてはこれに限らず、カーボンヒーター、シートヒーター、ＩＨヒーター（電磁誘導加熱器）、ペルチェ素子、加熱液体、加熱気体などを使用できる。第１ヒーター２１ａは第１ヒートブロック２１ｂに挿入されており、第１ヒーター２１ａが発熱することで第１ヒートブロック２１ｂが加熱される。第１ヒートブロック２１ｂは、第１ヒーター２１ａから発生した熱を反応容器１００に伝える部材である。熱サイクル装置１においては、第１ヒートブロック２１ｂは、アルミニウム製のブロックである。カートリッジヒーターは温度制御が容易であるので、第１ヒーター２１ａをカートリッジヒーターとすることで、第１加熱部２１の温度を容易に安定させることができる。したがって、より正確な熱サイクルを実現できる。
ヒートブロックの材質は熱伝導率、保温性、加工しやすさ等の条件を考慮して適宜選択できる。例えば、アルミニウムは熱伝導率が高いので、第１ヒートブロック２１ｂをアルミニウム製とすることで、反応容器１００を効率よく加熱できる。また、ヒートブロックに加熱ムラが生じにくいので、精度の高い熱サイクルを実現できる。また、加工が容易なので第１ヒートブロック２１ｂを精度よく成型でき、加熱の精度を高めることができる。したがって、より正確な熱サイクルを実現できる。なお、ヒートブロックの材質は、例えば銅合金を使用してもよく、複数の材質を組み合わせてもよい。
第１加熱部２１は、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、反応容器１００に接触していることが好ましい。これによって、第１加熱部２１によって反応容器１００を加熱した場合に、第１加熱部２１と反応容器１００とが接触しない構成よりも第１加熱部２１の熱を反応容器１００に安定して伝えることができるので、反応容器１００の温度を安定させることができる。本実施形態のように、装着部１５が第１加熱部２１の一部として形成されている場合には、装着部１５が反応容器１００と接触することが好ましい。これによって、第１加熱部２１の熱を反応容器１００に安定して伝えることができるので反応容器１００を効率よく加熱できる。
第２加熱部２２は、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、第１領域１１１よりも挿入口１５１に近い反応容器１００の流路１１０の第２領域１１２を、第１の温度とは異なる第２の温度に加熱する。図３に示される例では、第２加熱部２２は、本体１０において、反応容器１００の第２領域１１２を加熱する位置に配置されている。第２加熱部２２は、第２ヒーター２２ａ及び第２ヒートブロック２２ｂを含む。本実施形態における第２加熱部２２の構成は、加熱される反応容器１００の領域及び加熱する温度が第１加熱部２１と異なる以外は、第１加熱部２１と同様である。なお、第１加熱部２１と第２加熱部２２とで異なる加熱機構を採用してもよい。また、第１ヒートブロック２１ｂと第２ヒートブロック２２ｂとが異なる材質であってもよい。
第１加熱部２１及び第２加熱部２２は、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、流路１１０に対して、反応液１４０が移動する方向に温度勾配を形成する温度勾配形成部として機能する。ここで、「温度勾配を形成する」とは、所定の方向に沿って温度が変化する状態を形成することを意味する。したがって、「反応液１４０が移動する方向に温度勾配を形成する」とは、反応液１４０が移動する方向に沿って温度が変化する状態を形成することを意味する。「所定の方向に沿って温度が変化する状態」は、例えば、所定の方向に沿って温度が単調に高く又は低くなっていてもよいし、所定の方向に沿って、温度が高くなる変化から低くなる変化へ、又は、低くなる変化から高くなる変化へ、途中で変化していてもよい。熱サイクル装置１の本体１０においては、第１加熱部２１が装着部１５の挿入口１５１から相対的に遠い側、第２加熱部２２が装着部１５の挿入口１５１から相対的に近い側に配置されている。
また、第１加熱部２１と第２加熱部２２とは、互いに離間して本体１０に設けられている。これによって、互いに異なる温度に制御された第１加熱部２１と第２加熱部２２とが互いに影響を及ぼしにくくなるので、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度が安定しやすくなる。第１加熱部２１と第２加熱部２２との間にスペーサーを設けてもよい。熱サイクル装置１の本体１０においては、第１加熱部２１及び第２加熱部２２は、その周囲を固定部材１６、フランジ１７及びフランジ１８で固定されている。フランジ１８は軸受３１で支持されている。なお、所望の反応精度が確保できる程度に温度勾配が形成される限り、加熱部の数は２以上の任意の数であってもよい。
第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度は、図示しない温度センサー及び後述される制御部４０によって制御されてもよい。第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度は、反応容器１００が所望の温度に加熱されるように設定されることが好ましい。第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度の制御の詳細については、「３．熱サイクル装置の制御例」の項で詳述される。なお、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度は、反応容器１００の第１領域１１１及び第２領域１１２が所望の温度に加熱されるように制御されていればよい。例えば、反応容器１００の材質や大きさを考慮することで、第１領域１１１及び第２領域１１２の温度をより正確に所望の温度に加熱できる。本実施形態においては、温度センサーによって第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度を測定する。本実施形態の温度センサーは熱電対である。なお、温度センサーとしてはこれに限らず、例えば測温抵抗体やサーミスタを使用してもよい。
駆動機構３０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、重力の作用する方向における流路１１０の最下点の位置が第１領域１１１内となる第１の配置と、重力の作用する方向における流路１１０の最下点の位置が第２領域１１２内となる第２の配置との間で切換える。本実施形態においては、駆動機構３０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を、重力の作用する方向に対して垂直な成分を有し、かつ、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に流路１１０を反応液１４０が移動する方向に対して垂直な成分を有する回転軸Ｒの周りに回転させる機構である。
「重力の作用する方向に対して垂直な成分を有する」方向は、「重力の作用する方向に対して平行な成分」と「重力の作用する方向に対して垂直な成分」とのベクトル和で表した場合における、重力の作用する方向に対して垂直な成分を有する方向である。
「流路１１０を反応液１４０が移動する方向に対して垂直な成分を有する」方向は、「流路１１０を反応液１４０が移動する方向に対して平行な成分」と「流路１１０を反応液１４０が移動する方向に対して垂直な成分」とのベクトル和で表した場合における、流路１１０を反応液１４０が移動する方向に対して垂直な成分を有する方向である。
本実施形態に係る熱サイクル装置１においては、駆動機構３０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を、同一の回転軸Ｒの周りに回転させている。また、本実施形態においては、駆動機構３０は図示しないモーター及び駆動軸を含み、駆動軸と本体１０のフランジ１７とが接続されて構成されている。駆動機構３０のモーターを動作させると、駆動軸を回転軸Ｒとして本体１０が回転される。本実施形態においては、回転軸Ｒの方向に沿って１０個の装着部１５が並設されている。なお、駆動機構３０としては、モーターに限らず、例えばハンドル、ぜんまい等を採用できる。
熱サイクル装置１は測定部５０を含む。測定部５０は、所定の波長の光の強度を測定する。本実施形態においては、測定部５０として蛍光検出器を採用している。これによって、例えばリアルタイムＰＣＲのような蛍光測定を伴う用途に熱サイクル装置１を使用できる。測定部５０の数は測定が問題なく行える限り任意である。図１に示される例では、１個の測定部５０をスライド５２に沿って移動させて蛍光測定を行う。
測定部５０の位置は、第２加熱部２２に近い側よりも第１加熱部２１に近い側が好ましい。これによって、反応容器１００を装着部１５に装着する際に作業の障害となりにくくなる。また、測定部５０は、反応容器１００の第１領域１１１を含む領域からの光を測定するように設けられていてもよい。第１加熱部２１の温度をＰＣＲのアニーリング及び伸長温度（アニーリング及び伸長反応が進行する温度）にした場合に、特定のＤＮＡの量に相関する所定の波長の光の強度をより正確に測定できる。したがって、リアルタイムＰＣＲにおいて適切な蛍光測定ができる。また、後述される蓋（封止部１２０）付きの反応容器１００を用いる場合には、蓋に近い側となる第２領域１１２よりも、蓋から遠い側となる第１領域１１１の方が、測定部５０と反応液１４０との間に存在する部材が少ないので、より適切な蛍光測定ができる。
上述のように、熱サイクル装置１をリアルタイムＰＣＲに用いる場合には、ＰＣＲに必要な熱サイクルを反応液１４０に施す期間中においては、測定部５０を第１加熱部２１に近い側に設け、第１加熱部２１をＰＣＲのアニーリング及び伸長温度（５０℃〜７５℃程度）にすることが好ましい。この場合、挿入口１５１に近い第２加熱部２２をＰＣＲのアニーリング及び伸長温度よりも高い熱変性温度（９０℃〜１００℃程度）にする。
熱サイクル装置１は、制御部４０を含む。制御部４０は、第１加熱部２１、第２加熱部２２、駆動機構３０及び測定部５０を制御する。制御部４０による制御例については、「３．熱サイクル装置の制御例」の項で詳述される。制御部４０は、専用回路によって実現して後述される制御を行うように構成されていてもよい。また、制御部４０は、例えばＣＰＵ（Central Processing Unit）がＲＯＭ（Read Only Memory）やＲＡＭ（Random Access Memory）等の記憶装置に記憶された制御プログラムを実行することによってコンピューターとして機能し、後述される制御を行うように構成されていてもよい。この場合、記憶装置は、制御に伴う中間データや制御結果などを一時的に記憶するワークエリアを有していてもよい。また、制御部４０は、時間を計測するためのタイマーを有していてもよい。また、制御部４０は、上述した図示しない温度センサーの出力に基づいて第１加熱部２１及び第２加熱部２２を所望の温度に制御してもよい。
熱サイクル装置１は、反応容器１００を第１加熱部２１及び第２加熱部２２に対して所定の位置に保持する構造を含むことが好ましい。これによって、第１加熱部２１及び第２加熱部２２によって反応容器１００の所定の領域を加熱できる。より具体的には、反応容器１００を構成する流路１１０の、第１領域１１１を第１加熱部２１によって、第２領域１１２を第２加熱部２２によって、加熱できる。本実施形態においては、第１ヒートブロック２１ｂ及び第２ヒートブロック２２ｂに設けられた貫通孔（装着部１５の直径）の大きさを適切に設定することによって、第１加熱部２１及び第２加熱部２２に対して反応容器１００を所定の位置に保持している。
第１ヒートブロック２１ｂは、フィン２１０を有する構造であってもよい。これによって、第１加熱部２１の表面積が大きくなるので、第１加熱部２１の温度を高い温度から低い温度に変更する場合に要する時間が短くなる。
熱サイクル装置１は、第１加熱部２１及び第２加熱部２２に対して送風するファン５００を含んでいてもよい。送風することによって、第１加熱部２１と第２加熱部２２との間での熱の移動を抑制できる。したがって、互いに異なる温度に制御された第１加熱部２１と第２加熱部２２とが互いに影響を及ぼしにくくなるので、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の温度が安定しやすくなる。
２．本実施形態に係る熱サイクル装置に装着される反応容器の構成
図４は、本実施形態に係る熱サイクル装置１に装着される反応容器１００の構成を表す断面図である。図４において、矢印ｇは重力の作用する方向を表す。
反応容器１００は、ＤＮＡ配列と結合することによって所定の波長の光の強度が変化する蛍光プローブを含む反応液１４０と、反応液１４０とは比重が異なり、かつ、反応液１４０とは混和しない液体１３０（以下、「液体１３０」という）とが充填され、反応液１４０が対向する内壁に沿って移動する流路１１０を含む。本実施形態においては、液体１３０は、反応液１４０よりも比重が小さく、かつ、反応液１４０とは混和しない液体である。なお、液体１３０として、例えば、反応液１４０とは混和せず、かつ、反応液１４０よりも比重が大きい液体を採用してもよい。図４に示される例では、反応容器１００は流路１１０及び封止部１２０を含む。流路１１０には、反応液１４０と、液体１３０とが充填され、封止部１２０によって封止されている。
なお、蛍光プローブ以外のリアルタイムＰＣＲ用色素を用いてもよい。例えば、２本鎖ＤＮＡに非特異に結合して（ＤＮＡの配列によらず結合して）蛍光が変化するインターカレーターを使用してもよい。インターカレーターの例としては、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（「ＳＹＢＲ」は登録商標）などが挙げられる。蛍光の強度と増幅されたＤＮＡの量とは相関があるので、蛍光の強度を測定することでＤＮＡが増幅されたか否かを判定したり、増幅されたＤＮＡの量を推定したりすることができる。また、「所定の波長」とは、リアルタイムＰＣＲ用色素とＤＮＡとの結合の状態が変化した場合に強度が変化する、リアルタイムＰＣＲ用色素が発する光の波長又は波長帯を意味する。
流路１１０は、対向する内壁に沿って反応液１４０が移動するように形成されている。ここで、流路１１０の「対向する内壁」とは、流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域を意味する。「沿って」とは、反応液１４０と流路１１０の壁面との距離が近い状態を意味し、反応液１４０が流路１１０の壁面に接触する状態を含む。したがって、「対向する内壁に沿って反応液１４０が移動する」とは、「流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域の両方に対して距離が近い状態で、反応液１４０が移動する」ことを意味する。換言すれば、流路１１０の対向する２つ内壁間の距離は、反応液１４０が該内壁に沿って移動する程度の距離である。
反応容器１００の流路１１０がこのような形状であると、流路１１０内を反応液１４０が移動する方向を規制できるので、流路１１０内を反応液１４０が移動する経路をある程度規定できる。これによって、流路１１０内を反応液１４０が移動する所要時間を、ある程度の範囲に制限できる。したがって、流路１１０の対向する２つ内壁間の距離は、流路１１０内を反応液１４０が移動する時間のバラツキによって生じる、反応液１４０に対して施される熱サイクル条件のバラツキが、所望の精度を満たせる程度、すなわち、反応の結果が所望の精度を満たせる程度であることが好ましい。より具体的には、流路１１０の対向する２つの内壁間の反応液１４０が移動する方向に対して垂直な方向における距離が、反応液１４０の液滴が２つ以上入らない程度であることが望ましい。
図４に示される例では、反応容器１００の外形は円錐台状であり、中心軸に沿う方向（図４における上下方向）を長手方向とする流路１１０が形成されている。流路１１０の形状は、流路１１０の長手方向に対して垂直な方向の断面、すなわち流路１１０のある領域における反応液１４０が移動する方向に対して垂直な断面（これを流路１１０の「断面」とする）が円形となる円錐台状である。したがって、反応容器１００においては、流路１１０の対向する内壁は、流路１１０の断面の中心を挟んで対向する流路１１０の壁面上の２点を含む領域である。また、「反応液１４０が移動する方向」は、流路１１０の長手方向となる。
なお、流路１１０の形状は錐台状に限られず、例えば、柱状であってもよい。また、流路１１０の断面の形状は円形に限らず、多角形や楕円形など、対向する内壁に沿って反応液１４０が移動できる限り任意である。例えば、反応容器１００の流路１１０の断面が多角形の場合には、「対向する内壁」は、流路１１０に内接する断面が円形の流路を仮定した場合に、該流路の対向する内壁であるものとする。すなわち、流路１１０に内接する、断面が円形の仮想流路の対向する内壁に沿って反応液１４０が移動するように流路１１０が形成されていればよい。これによって、流路１１０の断面が多角形の場合にも、第１領域１１１と第２領域１１２との間を反応液１４０が移動する経路をある程度規定できる。したがって、反応液１４０が第１領域１１１と第２領域１１２との間を移動する所要時間を、ある程度の範囲に制限できる。
反応容器１００の第１領域１１１は、第１加熱部２１によって加熱される、流路１１０の一部の領域である。第２領域１１２は、第２加熱部２２によって加熱される、第１領域１１１とは異なる流路１１０の一部の領域である。図４に示される例では、第１領域１１１は、流路１１０の長手方向における一方の端部を含む領域であり、第２領域１１２は、流路１１０の長手方向における他方の端部を含む領域である。図４に示される例では、流路１１０のうち封止部１２０に相対的に遠い側の端部を含む点線で囲まれた領域が第１領域１１１であり、流路１１０のうち封止部１２０に相対的に近い側の端部を含む点線で囲まれた領域が第２領域１１２である。本実施形態に係る熱サイクル装置１は、第１加熱部２１が反応容器１００の第１領域１１１を加熱し、第２加熱部２２が反応容器１００の第２領域１１２を加熱することによって、反応容器１００の流路１１０に対して、反応液１４０が移動する方向に温度勾配を形成する。
流路１１０には、液体１３０と、反応液１４０とが充填されている。液体１３０は、反応液１４０とは混和しない、すなわち混ざり合わない性質であるため、図４に示されるように、反応液１４０は液体１３０の中に液滴の状態で保持されている。反応液１４０は、液体１３０よりも比重が大きいため、流路１１０の重力の作用する方向における最下部の領域に位置している。液体１３０としては、例えば、ジメチルシリコーンオイル又はパラフィンオイルを使用できる。反応液１４０は、反応に必要な成分を含む液体である。例えば、反応がリアルタイムＰＣＲである場合には、反応液１４０には、蛍光プローブに加えて、標的（増幅対象）となるＤＮＡ、当該ＤＮＡを増幅するために必要なＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー等が含まれる。反応がＲＴ−ＰＣＲである場合には、さらに、逆転写酵素、逆転写の鋳型となるＲＮＡ、逆転写されたｃＤＮＡが含まれる。例えば、液体１３０としてオイルを用いてＰＣＲを行う場合には、反応液１４０は上述の成分を含む水溶液であることが好ましい。
３．熱サイクル装置の制御例
図５は、本実施形態に係る熱サイクル装置１の機能ブロック図である。制御部４０は、第１加熱部２１に対して制御信号Ｓ１を出力することによって第１加熱部２１の温度を制御する。制御部４０は、第２加熱部２２に対して制御信号Ｓ２を出力することによって第２加熱部２２の温度を制御する。制御部４０は、駆動機構３０に対して制御信号Ｓ３を出力することによって駆動機構３０を制御する。制御部４０は、測定部５０に対して制御信号Ｓ４を出力することによって測定部５０を制御する。
次に、本実施形態に係る熱サイクル装置１の制御例について説明する。以下では、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を、装着部１５に反応容器１００を装着した場合に、重力の作用する方向における流路１１０の最下点の位置が第１領域１１１内となる第１の配置と、重力の作用する方向における流路１１０の最下点の位置が第２領域１１２内となる第２の配置との間で回転させる制御を例にとり説明する。
図６（Ａ）は、第１の配置における、図１（Ａ）のＡ−Ａ線を通り回転軸Ｒに垂直な面における断面を模式的に示す断面図、図６（Ｂ）は、第２の配置における図１（Ａ）のＡ−Ａ線を通り回転軸Ｒに垂直な面における断面を模式的に示す断面図である。図６（Ａ）及び図６（Ｂ）において、白抜き矢印は本体１０の回転方向、矢印ｇは重力の作用する方向を表す。
図６（Ａ）に示されるように、第１の配置は、装着部１５に反応容器１００が装着された場合に、第１領域１１１が重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する配置である。図６（Ａ）に示される例では、第１の配置では、液体１３０よりも比重が大きい反応液１４０は第１領域１１１に存在する。また、図６（Ｂ）に示されるように、第２の配置は、装着部１５に反応容器１００が装着された場合に、第２領域１１２が重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する配置である。図６（Ｂ）に示される例では、第２の配置では、液体１３０よりも比重が大きい反応液１４０は第２領域１１２に存在する。
このように、駆動機構３０が、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を、第１の配置と、第１の配置とは異なる第２の配置との間で回転させることによって、反応液１４０に対して熱サイクルを施すことができる。
本実施形態によれば、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を切り換えることで、反応容器１００が第１の配置に保持された状態と、反応容器１００が第２の配置に保持された状態とを切り換えることができる。第１の配置は、反応容器１００を構成する流路１１０の第１領域１１１が、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する配置である。第２の配置は、反応容器１００を構成する流路１１０の第２領域１１２が、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する配置である。すなわち、反応液１４０の比重が液体１３０に比べて相対的に大きい場合には、重力の作用によって第１の配置においては反応液１４０を第１領域１１１に、第２の配置においては反応液１４０を第２領域１１２に保持できる。第１領域１１１は第１加熱部２１によって加熱され、第２領域１１２は第２加熱部２２によって加熱されるので、第１領域１１１と第２領域１１２とは異なる温度とすることができる。したがって、第１の配置又は第２の配置に反応容器１００を保持する間、反応液１４０を所定の温度に保持できるので、加熱時間を容易に制御可能な熱サイクル装置１を提供できる。
駆動機構３０は、第１の配置から第２の配置へと回転させる場合と、第２の配置から第１の配置へと回転させる場合とで、反対方向に装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２を回転させてもよい。これによって、回転によって生じる導線１９などの配線の捩れを低減するための特別な機構が不要となる。したがって、小型化に適した熱サイクル装置１を実現できる。また、第１の配置から第２の配置へと回転させる場合の回転数、及び、第２の配置から第１の配置へと回転させる場合の回転数は、１回転未満（回転角度が３６０°未満）であることが好ましい。これによって、配線が捩れる程度を軽減できる。また、図１及び図２に示されるように、フランジ１８が導線１９を巻き取れる構成にしてもよい。
３−１．熱サイクル装置の制御方法の第１具体例
次に、熱サイクル装置１の制御方法の第１具体例について、２段階温度ＰＣＲでリアルタイム測定を行う場合を例にとり説明する。図７は、本実施形態に係る熱サイクル装置１の制御方法の第１具体例を説明するためのフローチャートである。
図７において、まず、制御部４０は、第１加熱部２１の温度を第１温度に制御し（第１処理）、第２加熱部２２の温度を第１温度よりも高い第２温度に制御する（第２処理）（ステップＳ１００）。本具体例においては、第１温度はＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長温度である。「ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長温度」は、核酸を増幅するための酵素の種類に依存する温度であるが、一般的には５０℃以上７０℃以下程度の範囲内である。本具体例においては、第２温度はＰＣＲにおける熱変性温度である。「ＰＣＲにおける熱変性温度」は、核酸を増幅するための酵素の種類に依存する温度であるが、一般的には９０℃以上１００℃以下程度の範囲内である。
ステップＳ１００の後に、制御部４０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を第１の配置から第２の配置へと切換えるように駆動機構３０を制御する（ステップＳ１０２）。図１に示される熱サイクル装置１においては、装着部１５に反応容器１００を装着した直後には、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第１の配置になっているので、ステップＳ１０２を行うことで、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を第２の配置とする。
なお、ステップＳ１００の後でステップＳ１０２の前に、装着部１５に反応容器１００を装着してもよい。また、装着部１５への反応容器１００の装着が、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第２の配置で行われる構成の場合には、ステップＳ１０２を行わなくてもよい。装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第２の配置である場合には、反応液１４０は第２領域１１２に保持される。すなわち、反応液１４０は、第２温度に保持される。
ステップＳ１０２の後に、制御部４０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第２の配置で第１時間を経過した場合に、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を、第２の配置から第１の配置へと切換えるように駆動機構３０を制御する第３処理を行う。
より具体的には、まず、制御部４０が、ステップＳ１０２が終了してから第１時間を経過したか否かを判定する（ステップＳ１０４）。本具体例において、第１時間は、ＰＣＲにおける熱変性に必要となる時間である。第１時間を経過していないと制御部４０が判定した場合（ステップＳ１０４でＮＯの場合）には、制御部４０はステップＳ１０４を繰り返す。第１時間を経過したと制御部４０が判定した場合（ステップＳ１０４でＹＥＳの場合）には、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を、第２の配置から第１の配置へと切換えるように駆動機構３０を制御する（ステップＳ１０６）。装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第１の配置である場合には、反応液１４０は第１領域１１１に保持される。すなわち、反応液１４０は、第１温度に保持される。なお、第３処理においては、第１加熱部２１が第１温度となっていればよい。すなわち、第３処理は第１処理の後であれば、第２処理の前であっても、第２処理と同時であってもよい。
第３処理の後に、制御部４０は、所定の波長の光の強度を測定するように測定部５０を制御する第４処理を行う。より具体的には、ステップＳ１０６の後に、測定部５０が蛍光測定を開始する（ステップＳ１０８）。測定部５０をスライド５２上で移動させて、複数の反応容器１００についての蛍光測定を行なってもよい。
第４処理において所定の波長の光の強度を測定するように測定部５０を制御することによって、反応液１４０がアニーリング及び伸長温度に保持されている期間に、ＤＮＡ配列に結合する蛍光プローブが発する所定の波長の光の強度を測定できる。したがって、リアルタイムＰＣＲに適した熱サイクル装置１を実現できる。
第４処理の後に、制御部４０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第１の配置で第４時間を経過した場合に、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を、第１の配置から第２の配置へと切換えるように駆動機構３０を制御する第８処理、第３処理及び第４処理を所定回数繰り返して行なってもよい。
より具体的には、まず、ステップＳ１０８の後に、制御部４０は、ステップＳ１０６が終了してから第４時間を経過したか否かを判定する（ステップＳ１１０）。本具体例において、第４時間はＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長に必要となる時間である。第４時間を経過していないと制御部４０が判定した場合（ステップＳ１１０でＮＯの場合）には、制御部４０はステップＳ１１０を繰り返す。第４時間を経過したと制御部４０が判定した場合（ステップＳ１１０でＹＥＳの場合）には、制御部４０は、所定のサイクル数に達したか否かを判定する（ステップＳ１１２）。
所定のサイクル数に達していないと制御部４０が判定した場合（ステップＳ１１２でＮＯの場合）には、制御部４０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を第１の配置から第２の配置へと切換えるように駆動機構３０を制御する（ステップＳ１１４）。ステップＳ１１４の後に、ステップＳ１０４からステップＳ１１２までを繰り返す。制御部４０が所定のサイクル数に達したと判定した場合（ステップＳ１１２でＹＥＳの場合）には、処理を終了する。
第３処理及び第４処理では第２の配置で第１時間を経過するまで反応液１４０が第２温度に保持され、第８処理では第１の配置で第４時間を経過するまで反応液１４０が第１温度に保持される。このように、第８処理と第３処理と第４処理（より具体的には、ステップＳ１１４とステップＳ１０４からステップＳ１１２）を繰り返すことによって、ＰＣＲに適した熱サイクルを所定回数繰り返して行うことができる。
３−２．熱サイクル装置の制御方法の第２具体例
次に、熱サイクル装置１の制御方法の第２具体例について、ホットスタート工程を含む２段階温度ＰＣＲでリアルタイム測定を行う場合を例にとり説明する。図８は、本実施形態に係る熱サイクル装置１の制御方法の第２具体例を説明するためのフローチャートである。なお、図７に示される熱サイクル装置１の制御方法の第１具体例と同一の工程については同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
熱サイクル装置１の制御方法の第２具体例において、制御部４０は、第２処理の後に、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第２の配置で第２時間を経過させる第５処理を行い、第５処理の後に、第３処理を行う。
より具体的には、ステップＳ１０２の後に、制御部４０は、ステップＳ１０２が終了してから第２時間を経過したか否かを判定する（ステップＳ２００）。本具体例において、第２時間はＰＣＲ酵素の活性化に必要となる時間である。第２時間を経過していないと制御部４０が判定した場合（ステップＳ２００でＮＯの場合）には、制御部４０はステップＳ２００を繰り返す。第２時間を経過したと制御部４０が判定した場合（ステップＳ２００でＹＥＳの場合）には、制御部４０はステップＳ１０４を行う。本具体例においては、ステップＳ１０４では、制御部４０が、ステップＳ２００を終了してから第１時間を経過したか否かを判定する。ステップＳ１０６以降については、図７に示される熱サイクル装置１の制御方法の第１具体例と同一である。なお、第５処理においては、第２加熱部２２が第２温度となっていればよい。すなわち、第５処理は第２処理の後であれば、第１処理の前であっても、第１処理と同時であってもよい。
図８に示される例では、第５処理では反応液１４０が第２温度に保持される。本実施形態においては、第２温度は、ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長温度でありかつＰＣＲ酵素の活性化温度である。「ＰＣＲ酵素の活性化温度」はＰＣＲ酵素の種類に依存する温度であるが、一般的にはＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長温度と同程度である。
このように、第５処理を行うことによって、第３処理の第１時間に影響を与えることなく、ＰＣＲ酵素を活性化させる工程であるＰＣＲのホットスタートを含んだ熱サイクルを実現できる。
また、図７に示される熱サイクル装置１の制御方法の第１具体例と同様に、第４処理において所定の波長の光の強度を測定するように測定部５０を制御することによって、反応液１４０がアニーリング及び伸長温度に保持されている期間に、ＤＮＡ配列に結合する蛍光プローブが発する所定の波長の光の強度を測定できる。したがって、リアルタイムＰＣＲに適した熱サイクル装置１を実現できる。
また、図７に示される熱サイクル装置１の制御方法の第１具体例と同様に、第８処理と第３処理と第４処理（より具体的には、ステップＳ１１４とステップＳ１０４からステップＳ１１２）を繰り返すことによって、ＰＣＲに適した熱サイクルを所定回数繰り返して行うことができる。
３−３．熱サイクル装置の制御方法の第３具体例
次に、熱サイクル装置１の制御方法の第３具体例について、ホットスタート工程を含むＲＴ−ＰＣＲでリアルタイム測定を行う場合を例にとり説明する。図９は、本実施形態に係る熱サイクル装置１の制御方法の第３具体例を説明するためのフローチャートである。なお、図７に示される熱サイクル装置１の制御方法の第１具体例及び図８に示される熱サイクル装置１の制御方法の第２具体例と同一の工程については同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
熱サイクル装置１の制御方法の第３具体例において、制御部４０は、第１加熱部２１を第１温度よりも低い第３温度に制御し、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置が第１の配置で第３時間を経過させる第６処理と、第６処理の後に、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を、第１の配置から第２の配置へと切換えるように駆動機構３０を制御する第７処理と、を行い、第７処理の後に、第５処理を行う。
より具体的には、まず、制御部４０は、第１加熱部２１の温度を第３温度に制御する（ステップＳ３００）。本具体例において、第３温度は逆転写酵素によって逆転写反応が進行する温度である。「逆転写酵素によって逆転写反応が進行する温度」は逆転写酵素の種類に依存する温度であるが、一般的には２０℃以上７０℃以下程度の範囲内であり、より好適な温度は、一般的には４０℃以上５０℃以下程度の範囲内である。また、本具体例においては、初期動作時における装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置は第１の配置である。したがって、反応液１４０は第１領域１１１に保持される。すなわち、反応液１４０は第３温度に保持される。
なお、ステップＳ３００において、制御部４０は、第２加熱部２２の温度を逆転写酵素が失活しない温度に制御してもよい。「逆転写酵素が失活しない温度」は、逆転写酵素の種類に依存する温度であるが、一般的には２０℃以上７０℃以下程度の範囲内である。また、一般的には、７０℃を超える温度では、逆転写酵素が失活したり劣化しやすくなったりする。なお、「酵素が失活する」とは、酵素活性が低下又は消失し、実験条件を調節しても本来の活性を示さなくなることを意味する。本明細書においては、逆転写酵素の至適温度において測定される、反応液１４０に含まれる逆転写酵素の活性が、当該逆転写酵素が当該反応液の環境（ｐＨ等の条件）において期待される活性よりも低下した状態を意味する。「逆転写酵素が失活しない温度」は、期待される酵素活性に対して１００％の活性を逆転写酵素が示す場合、及び、ＲＴ−ＲＣＲにおいて許容される程度に活性が低下する場合（含まれる逆転写酵素の一部が失活する場合）を含む。第２加熱部２２の温度を逆転写酵素が失活しない温度に制御することによって、装着部１５に反応容器１００を装着する際に、逆転写酵素が失活するような高温に反応液１４０が曝されることがなくなる。
ステップＳ３００の後に、制御部４０は、ステップＳ３００が終了してから第３時間を経過したか否かを判定する（ステップＳ３０２）。本具体例において、第３時間は逆転写反応に必要となる時間である。第３時間を経過していないと制御部４０が判定した場合（ステップＳ３０２でＮＯの場合）には、制御部４０はステップＳ３０２を繰り返す。第３時間を経過したと制御部４０が判定した場合（ステップＳ３０２でＹＥＳの場合）には、制御部４０は、第１加熱部２１の温度を第１温度に制御し、第２加熱部２２の温度を第２温度に制御する（ステップＳ３０４）。第１温度及び第２温度は、図７を用いて説明した熱サイクル装置１の制御方法の第１具体例と同様である。
ステップＳ３０４の後に、制御部４０は、装着部１５、第１加熱部２１及び第２加熱部２２の配置を第１の配置から第２の配置へと切換えるように駆動機構３０を制御する（ステップＳ３０６）。したがって、反応液１４０は第２領域１１２に保持される。すなわち、反応液１４０は第２温度に保持される。
ステップＳ３０６の後に、制御部４０はステップＳ２００を行い、以降については、図８を用いて説明した熱サイクル装置１の制御方法の第２具体例と同一である。
このように、第５処理に先立って第７処理を行うことによって、ＰＣＲの前に逆転写反応を行うことができるので、ＲＴ−ＰＣＲに適した熱サイクル装置１を実現できる。
また、図７に示される熱サイクル装置１の制御方法の第１具体例と同様に、第４処理において所定の波長の光の強度を測定するように測定部５０を制御することによって、反応液１４０がアニーリング及び伸長温度に保持されている期間に、ＤＮＡ配列に結合する蛍光プローブが発する所定の波長の光の強度を測定できる。したがって、リアルタイムＰＣＲに適した熱サイクル装置１を実現できる。
また、図８に示される熱サイクル装置１の制御方法の第２具体例と同様に、第５処理を行うことによって、第３処理の第１時間に影響を与えることなく、ＰＣＲ酵素を活性化させる工程であるＰＣＲのホットスタートを含んだ熱サイクルを実現できる。
また、図７に示される熱サイクル装置１の制御方法の第１具体例と同様に、第８処理と第３処理と第４処理（より具体的には、ステップＳ１１４とステップＳ１０４からステップＳ１１２）を繰り返すことによって、ＰＣＲに適した熱サイクルを所定回数繰り返して行うことができる。
４．実施例
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
４−１．第１実施例
第１実施例では、熱サイクル装置１を用いて２段階温度のリアルタイムＰＣＲを行なった例について説明する。
図１０は、第１実施例における反応液１４０の組成を示す表である。図１０において、「SuperScript III Platinum」は「SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System with ROX（「Platinum」は登録商標）」であり、ＰＣＲ酵素が含まれている。プラスミドは、予め図１１に示されるプライマーを用いて得られたＰＣＲ反応産物をサブクローニングして、コピー数が既知のサンプルを作製した。サンプルＡは１０５個、サンプルＢは１０４個、サンプルＣは１０３個、サンプルＤは１０２個のプラスミドを加えた。
図１１は、インフルエンザＡ型（InfA）、豚インフルエンザＡ型（SW InfA）、豚インフルエンザＨ１型（SW H1）及びリボヌクレアーゼＰ（RNase P）に対応するフォワードプライマー（F primer）、リバースプライマー（R primer）、プローブ（Probe）の塩基配列を示す表である。いずれも、「CDC protocol of realtime RTPCR for swine influenza A(H1N1)」（World Health Organization、２００９年４月３０日改訂１版）に記載されている塩基配列と同一である。図１１に示される４種類のプローブ（Probe）は、いずれも核酸の増幅に伴い測定される蛍光輝度が増加する。
実験手順は、図８に示されるフローチャートの通りであり、第１温度は５８℃、第２温度は９８℃、第１時間は５秒、第２時間は１０秒、第４時間は３０秒、熱サイクル処理のサイクル数は５０回とした。また、装着部１５に装着される反応容器１００は４個（サンプルＡ〜サンプルＤ）とした。
図１２は、第１実施例における、熱サイクル処理のサイクル数と測定される輝度との関係を示すグラフである。図１２の横軸は熱サイクル処理のサイクル数、縦軸は輝度の相対値を表す。
図１２に示されるように、サンプルＡ〜サンプルＤのいずれも、熱サイクル処理のサイクル数が２０回〜３５回程度となる辺りから輝度が大きく上昇していることが分かる。これによって、ＤＮＡが増幅されていることが確認された。また、図１２から、相対的にプラスミドのコピー数が多いサンプルほど少ないサイクル数で輝度が大きく上昇し、反応液１４０に含まれるプラスミドの濃度が高いほど、輝度が上昇するサイクル数が早いことが確認された。
このように、本実施形態に係る熱サイクル装置１を用いて、２段階温度のリアルタイムＰＣＲを行うことができることが確認された。
４−２．第２実施例
第２実施例では、熱サイクル装置１を用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった例について説明する。
図１３は、第２実施例における反応液１４０の組成を示す表である。図１３において、「SuperScript III Platinum」は「SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System with ROX（「Platinum」は登録商標）」であり、ＰＣＲ酵素と逆転写酵素が含まれている。ＲＮＡとしては、ヒト鼻腔拭い液（ヒトサンプル）から抽出したＲＮＡを用いた。なお、当該ヒトサンプルについては、市販のキット（「エスプラインインフルエンザＡ＆Ｂ−Ｎ（「エスプライン」は登録商標）」、富士レビオ株式会社製）を用いてイムノクロマトグラフィーを行った結果、インフルエンザＡ型が陽性であった。なお、イムノクロマトグラフィーにおける「Ａ型陽性」は、下記インフルエンザＡ型（InfA）を特異的に判別するものではない。図１３におけるフォワードプライマー（F primer）、リバースプライマー（R primer）、プローブ（Probe）の塩基配列は、図１１に示されている塩基配列と同一である。
実験手順は、図９に示されるフローチャートの通りであり、第１温度は５８℃、第２温度は９８℃、第３温度は４５℃、第１時間は５秒、第２時間は１０秒、第３時間は６０秒、第４時間は３０秒、熱サイクル処理のサイクル数は５０回とした。また、装着部１５に装着される反応容器１００は４個（サンプルＥ〜サンプルＨ）とした。
サンプルＥは、インフルエンザＡ型（InfA）に対応するフォワードプライマー、リバースプライマー及び蛍光プローブを含む。サンプルＦは、豚インフルエンザＡ型（SW InfA）に対応するフォワードプライマー、リバースプライマー及び蛍光プローブを含む。サンプルＧは、豚インフルエンザＨ１型（SW H1）に対応するフォワードプライマー、リバースプライマー及び蛍光プローブを含む。サンプルＨは、リボヌクレアーゼＰ（RNase P）に対応するフォワードプライマー、リバースプライマー及び蛍光プローブを含む。
図１４は、第２実施例における、熱サイクル処理のサイクル数と測定される輝度との関係を示すグラフである。図１４の横軸は熱サイクル処理のサイクル数、縦軸は輝度の相対値を表す。
図１４に示されるように、サンプルＥ〜サンプルＨのいずれも、熱サイクル処理のサイクル数が２０回〜３０回程度となる辺りから輝度が大きく上昇していることが分かる。これによって、ＲＮＡを鋳型として逆転写されたｃＤＮＡが増幅されていることが分かる。サンプルＨは内在性コントロールの実験であり、サンプルＨで輝度が上昇していることから、ヒトサンプル由来のＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が増幅されたことが確認できた。さらに、サンプルＥ〜サンプルＨでｃＤＮＡが増幅されたことから、ヒトサンプルにはＩｎｆＡ、ＳＷ ＩｎｆＡ、ＳＷ Ｈ１の全てのＲＮＡが含まれていたことがわかった。この結果は、イムノクロマトグラフィーの結果とも合致している。したがって、本実施形態に係る熱サイクル装置１を用いて、１ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲを行うことができることが確認された。
なお、上述した実施形態及び変形例は一例であって、これらに限定されるわけではない。例えば各実施形態及び各変形例は、複数を適宜組み合わせることが可能である。
本発明は、上述した実施形態及び実施例に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
１…熱サイクル装置、１５…装着部、１６…固定部材、１７…フランジ、１８…フランジ、１９…導線、２１…第１加熱部、２１ａ…第１ヒーター、２１ｂ…第１ヒートブロック、２２…第２加熱部、２２ａ…第２ヒーター、２２ｂ…第２ヒートブロック、３０…駆動機構、３１…軸受、４０…制御部、５０…測定部、５２…スライド、１００…反応容器、１１０…流路、１１１…第１領域、１１２…第２領域、１３０…液体、１４０…反応液、１５１…挿入口、２１０…フィン
配列番号１は、ＩｎｆＡのフォワードプライマーの配列である。
配列番号２は、ＩｎｆＡのリバースプライマーの配列である。
配列番号３は、ＩｎｆＡの蛍光プローブの配列である。
配列番号４は、ＳＷ ＩｎｆＡのフォワードプライマーの配列である。
配列番号５は、ＳＷ ＩｎｆＡのリバースプライマーの配列である。
配列番号６は、ＳＷ ＩｎｆＡの蛍光プローブの配列である。
配列番号７は、ＳＷ Ｈ１のフォワードプライマーの配列である。
配列番号８は、ＳＷ Ｈ１のリバースプライマーの配列である。
配列番号９は、ＳＷ Ｈ１の蛍光プローブの配列である。
配列番号１０は、ＲＮａｓｅ Ｐのフォワードプライマーの配列である。
配列番号１１は、ＲＮａｓｅ Ｐのリバースプライマーの配列である。
配列番号１２は、ＲＮａｓｅ Ｐの蛍光プローブの配列である。

Claims (6)

  1. ＤＮＡ配列と結合することによって所定の波長の光の強度が変化する蛍光プローブを含む反応液と、前記反応液とは比重が異なり、かつ、前記反応液とは混和しない液体とが充填され、対向する内壁に前記反応液が近接して移動する流路を含む反応容器を装着する装着部と、
    前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記流路の第１領域を加熱する第１加熱部と、
    前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域とは異なる前記流路の第２領域を加熱する第２加熱部と、
    前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記装着部に前記反応容器を装着した場合に、重力の作用する方向における前記流路の最下点の位置が前記第１領域内となる第１の配置と、重力の作用する方向における前記流路の最下点の位置が前記第２領域内となる第２の配置との間で切換える駆動機構と、
    前記所定の波長の光の強度を測定する測定部と、
    前記駆動機構、前記第１加熱部、前記第２加熱部及び前記測定部を制御する制御部と、
    を含み、
    前記制御部は、
    前記第１加熱部を第１温度に制御する第１処理と、
    前記第２加熱部を前記第１温度よりも高い第２温度に制御する第２処理と、
    前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第２の配置で第１時間が経過した場合に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記第２の配置から前記第１の配置へと切換えるように前記駆動機構を制御する第３処理と、
    前記第３処理の後に、前記所定の波長の光の強度を測定するように前記測定部を制御する第４処理と、
    を行う、熱サイクル装置。
  2. 請求項１に記載の熱サイクル装置において、
    前記制御部は、さらに、
    前記第２処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第２の配置で第２時間を経過させる第５処理を行い、
    前記第５処理の後に、前記第３処理を行う、熱サイクル装置。
  3. 請求項２に記載の熱サイクル装置において、
    前記制御部は、さらに、
    前記第１加熱部を前記第１温度よりも低い第３温度に制御し、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第１の配置で第３時間を経過させる第６処理と、
    前記第６処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記第１の配置から前記第２の配置へと切換えるように前記駆動機構を制御する第７処理と、
    を行い、
    前記第７処理の後に、前記第５処理を行う、熱サイクル装置。
  4. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の熱サイクル装置において、
    前記制御部は、
    前記第４処理の後に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第１の配置で第４時間を経過した場合に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記第１の配置から前記第２の配置へと切換えるように前記駆動機構を制御する第８処理、前記第３処理及び前記第４処理を所定回数繰り返して行う、熱サイクル装置。
  5. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載の熱サイクル装置において、
    前記測定部は、前記第１領域を含む領域からの光の強度を測定する、熱サイクル装置。
  6. 熱サイクル装置の制御方法であって、
    前記熱サイクル装置は、
    ＤＮＡ配列と結合することによって所定の波長の光の強度が変化する蛍光プローブを含む反応液と、前記反応液とは比重が異なり、かつ、前記反応液とは混和しない液体とが充填され、対向する内壁に前記反応液が近接して移動する流路を含む反応容器を装着する装着部と、
    前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記流路の第１領域を加熱する第１加熱部と、
    前記装着部に前記反応容器が装着された場合に、前記第１領域とは異なる前記流路の第２領域を加熱する第２加熱部と、
    前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記装着部に前記反応容器を装着した場合に、重力の作用する方向における前記流路の最下点の位置が前記第１領域内となる第１の配置と、重力の作用する方向における前記流路の最下点の位置が前記第２領域内となる第２の配置との間で切換える駆動機構と、
    前記所定の波長の光の強度を測定する測定部と、
    を含み、
    前記制御方法は、
    前記第１加熱部を第１温度に制御する第１処理を行うことと、
    前記第２加熱部を前記第１温度よりも高い第２温度に制御する第２処理を行うことと、
    前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置が前記第２の配置で第１時間を経過した場合に、前記装着部、前記第１加熱部及び前記第２加熱部の配置を、前記第２の配置から前記第１の配置へと切換えるように前記駆動機構を制御する第３処理を行うことと、
    前記第３処理の後に、前記所定の波長の光の強度を測定するように前記測定部を制御する第４処理を行うことと、
    を含む、熱サイクル装置の制御方法。
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