JP6168140B2 - 反応生成物をリアルタイムにサンプリングするための方法 - Google Patents

Description

本発明は、反応チャンバで反応を行い、反応チャンバ内容物のサンプルを分離チャンネルに移動し、そして分離チャンネル内でサンプルを分析するように構成されたマイクロ流体デバイス、及びそのようなデバイスを操作する方法に関する。

マイクロ流体デバイスは、化学的及び生物学的分析物の分析を実施することに関する大きな関心の対象である。「マイクロ流体」デバイス又は「マイクロスケール」デバイスは、一般にマイクロ流体エレメント（例えば、チャンネル及び／又はチャンバ）のネットワークを含む流体を操作するためのデバイスを指し、少なくとも１つのエレメントは、約０．５μｍから約５００μｍの範囲の少なくとも１つの寸法を有する。例えば、チャンネルはこの範囲の深さ及び／又は幅を有してもよく、一方チャンバは少なくとも深さをこの範囲で有すればよい。

マイクロ流体デバイスは、小スケールの反応を可能にし、それは当業界に周知のように、試薬の使用量の削減、サンプル量の削減、及び迅速な操作などの多くのメリットを有する。また、単一のデバイスにいくつかの機能を統合することが可能であり、ここでサンプルは、次の処理、反応又は分析のために、１つのデバイスエレメントからの別のエレメントに移動させてもよい。この統合の態様は、オペレーター又はロボットステーションにより処理するサンプル量を削減し、必要なスペースを小さくし、そしてさらに、遠隔地又は現場使用のために可搬性であるので、サンプル処理能力の改善を可能にする。

さらに、多数のサンプルウェル、反応チャンバ、及び／又は分析領域を単一のデバイスに備えることができ、それは、原理的に多数の分析を並行して実施することを可能にする。それにもかかわらず、プロセスが連続的しか実施できない場合には支障が生じる。例えば、検出器システム（例えば、レーザー又は光学検出器）又は分析チャンネルが共有される場合、１つのサンプルが前のサンプルの分析が終了するのを待たなければならないような分析工程によってしばしばサンプル処理能力は制限される。マイクロ流体チャンネル及びウェルのマイクロ流体デバイスレイアウトもまた考慮すべき事項であり、デバイスの配置は、1つのマイクロ流体エレメントから別のエレメントまでの分析物の通過時間を短縮することによって処理能力を改善するために用いることができる。

チャンネル配置に基づいて改善されたデバイスの処理能力の例は、Dubrowらが特許文献１で開示している。Dubrowらは、複数のサンプルリザーバに供給された異なるサンプルの電気泳動的分離分析用のデバイスを開示している。デバイスは単一の分析チャンネルを有するが、サンプルリザーバは、リザーバの数を最大にし、さらにサンプルが分析チャンネルに到達するために移動しなければならない距離を最短にするために、分析チャンネルの両側に配置されている。更に、分離チャンネルの１つの側のリザーバから導入された１つのサンプルが、電気泳動的分離によって分析されている間に、チャンネルの反対側にあるリザーバからのサンプルを先行ロードさせることができる、即ち、分離チャンネルに近いロードチャンネルの位置に提供される。一旦第１のサンプルの分析が終了すると、ロードチャンネルにあらかじめ位置したサンプルは、サンプルリザーバから分析チャンネルとの交差部までロードチャンネルに沿った移行を完了することができ、次に分析用の分析チャンネルに導入される。

単に複数のサンプルリザーバ以外にマイクロ流体エレメントと機能を含むデバイスは、高処理能力及び／又は分析時間の短縮に対する別の課題及び問題を提示する。特に、反応チャンバを含むマイクロ流体デバイスは、デバイス内のサンプルの移動と反応の進行を調整することについての課題を提示する。例えば、サーモサイクル反応に関して、サーモサイクルによって引き起こされるサンプル及び／又は輸送特性への温度誘導変化が考慮されなければならないし、分析または他の使用のためにサンプルを取り出すことができる時間が制限されるだろう。

マイクロ流体デバイスへの適切な１つの適用としては、核酸増幅反応を行い、増幅産物を分析する統合デバイスがある。例えば、ＰＣＲのような増幅反応用のチャンバとキャピラリー電気泳動（ＣＥ）検出用の分離チャンネルを統合することにより、増幅の進行をリアルタイムに追跡し、原サンプル中の標的の量を定量する方法が提供される。

このような統合デバイスの例は、ＰＣＲ−ＣＥデバイスを含めてこの業界で知られている。そのような装置の１つは、同じ譲受人に譲渡されたBousse及びZhangによる特許文献２に記載されており、その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。デバイスの反応チャンバ内の溶液は、ＰＣＲ増幅産物を生成するためにサーモサイクルされ、一定のサイクルの後、反応生成物のサンプルは移動され、増幅反応で生成された生成物の量が分析される。しかしながら、一般的に、ＰＣＲ−ＣＥ統合デバイスは、ＣＥ分離が行われる間、又は少なくともサンプルがチャンバから分離チャンネルへ輸送されるまで、サーモサイクリングプロセスを休止する。この一時停止により、分析を完了するために必要な合計時間が長くなる。従って、サンプルの処理能力を増大し運転コストを削減するため、サンプルの移動をより効率的に調整することができ、より少ない時間で分析を完了することができるデバイス及び方法の必要性が残っている。

米国特許第５９７６３３６号公報 米国特許第８３９４３２４号公報

サンプルの迅速な分析のための統合したマイクロ流体デバイス、並びにデバイスを操作するための方法が提供される。特に、デバイスは、チャンバで反応を実施し、その都度チャンバから反応生成物の一部を移動させ、そして生成物を分析するように構成される。このデバイスは一般に反応/分析マイクロ流体デバイスと呼ばれる。開示された方法を用いることにより、反応及び生成した産物の定期的な分析が完了する時間は、従来この業界で知られる方法と比較して有意に短縮されるが、それはデバイス構造が特定の行程を連続的よりはむしろ同時に実施することを可能にし、方法がそれを予期する（contemplate）からである。デバイス及び反応を実施するための補助装置を組み込むシステム並びに検出方法も開示される。

１つの実施態様では、マイクロ流体デバイスは、反応チャンバ、反応チャンバからロード廃棄ウェルに通じるロードチャンネル、分離先頭ウェルからロードチャンネルと交差して分離廃棄ウェルに通じる分離チャンネル、及びロードチャンネルと分離チャンネルの交差部（ロードチャンネル／分離チャンネル交差部）とチャンバとの間に位置するロードチャンネルからプレロード廃棄ウェルに通じるプレロードチャンネル、を含むデバイスが提供される。

デバイスは、２以上の反応チャンバを含んでもよく、付加的なチャンバは同一のロードチャンネル又は異なるロードチャンネルの何れかを介して同じ分離チャンネルに接続されてもよい。または、付加的な反応チャンバは違う分離チャンネルと接続されてもよい。容量（反応チャンバと分離チャンネルの数）及びデバイスのレイアウトは、適用、望ましい試験処理量、製造能力、デバイスを含むシステムの一部として使用される温度調節器、検出装置、電源などの周辺器具類に従って調整することができる。

別の実施態様において、マイクロ流体デバイスはさらにロードチャンネルからサイド先頭ウェルに通じるサイド・チャンネルを含み、ここで、ロードチャンネル／サイドチャンネルの接点は、反応チャンバとロードチャンネル／プレロードチャンネル接点の間にある。

別の実施態様では、マイクロ流体デバイスはさらに、分離チャンネルから焦点用色素ウェルに通じる焦点用色素チャンネルを含み、ここで、分離チャンネル／焦点用色素チャンネル接点は、分離チャンネルの検出ポイントの下流にある。

さらなる実施態様では、マイクロ流体デバイスはさらに、チャンバ、ロード廃棄ウェル、プレロード廃棄ウェル、分離先頭ウェル、分離廃棄ウェル、そしてもし存在すれば、焦点用色素ウェル及びサイド先頭ウェルの内容物と電気化学的並びに流体的に連通しているチャンバ又はウェルに位置する電極を含む。好ましくは、電極は独立に制御可能である。電極に印加される電圧（電位）又は電極を通して流れる電流を独立にコントロールすることによって、サンプル成分を、デバイス内の特定の場所の間で動電的に移動させることができる。電極は、それらがそれぞれのチャンバ又はウェル内の溶液、即ちチャンバ内の溶液又はロード廃棄ウェル内の溶液など、と電気的な接触ができるように配置される。

反応チャンバは、少なくとも２つのアクセス・チャンネル及び少なくとも１つのロードチャンネルに接続する。各アクセス・チャンネルは、チャンバから別々のアクセス・ウェルに通じる。流体、例えば反応液は、アクセス・チャンネルを使用して反応チャンバに加えられる。一般に、流体は第１のアクセス・ウェルに導入され、第１のアクセス・チャンネルを経由してチャンバ内に移動し、そして最終的にチャンバを満たす。追い出された空気は第２のアクセス・チャンネル及び第２のアクセス・ウェルを経て排出される。従って、少なくとも２つのアクセス・チャンネルは、流体が１つのアクセス・チャンネルからチャンバに流れ、チャンバを満たし、そして第２のアクセス・チャンネルを通って出てもよいようにチャンバに接続される。１つの実施態様では、アクセス・チャンネルは、対向してチャンバに接続される。

上述のように、反応チャンバは、ロードチャンネルにも接続する。ロードチャンネルは、分析チャンネルネットワークの一部分である。分析チャンネルネットワークは、ロードチャンネル、プレロードチャンネル、及び分離チャンネル、そしてもし存在すればサイド・チャンネルを含む。

分析チャンネルネットワークのチャンネルの寸法は、デバイスを通して少量の物質の連動的な移動が可能になるように設計される。設計は、いくつかの考慮すべき事項に基づく。１つの考慮すべき事項は、反応チャンバに対する分析チャンネルネットワークのサイズ及び／又は流体抵抗に関する。米国特許第８３９４３２４号に記載されているように、このチャンネルネットワークは、分析又は他の使用のために反応チャンバ内の成分の小さな画分だけをチャンネルネットワーク中に移動させる必要があるため、反応チャンバよりも小さい内容積を有するように構成されればよい。例えば、チャンネルネットワークのチャンネルの総体積は、反応チャンバの体積よりも約１００倍小さい、又は約１００倍〜約１０００倍小さい、又は約３００倍〜約１０００倍小さくてもよい。また、米国特許第８３９４３２４号に記載されているように、デバイスは、チャンネルネットワークの流体力学的流体抵抗が反応チャンバのそれよりも高くなるように、チャンネルが小さな断面積を有する分析チャンネルネットワークを含むように設計されればよい。例えば、分析チャンネルネットワークと反応チャンバの間の流体抵抗率が約１０^３以上、又は約１０^３〜約１０^９、又は約１０^３〜約１０^７、又は約１０^４〜約１０^６であるようなチャンネル寸法とすることにより、反応チャンバからロードチャンネルへの入口にゲート機能を与える。そのような流体力学的流体抵抗の値を達成するために使用できる設計上の配慮及び代表的なチャンネル寸法は、米国特許第８３９４３２４号に記載されている。

第２の考慮すべき事項は、他のチャンネルとの接点と交差部の間のロードチャンネルに沿った長さ、及びプレロードチャンネルの長さに関係する。特定のチャンネル部分の長さについて本明細書に記載される設計基準を満たすデバイスを提供することによって、デバイスを、分析チャンネルネットワーク内の協調的なサンプル移動及び一連のサンプルのより迅速な分析を可能にする方法に使用することができる。ロードチャンネルセグメントの長さに対する設計基準、及びその様なセグメントに対する典型的な範囲の議論は以下に提供される。

反応／分析用のマイクロ流体デバイス及び本発明の方法を実施するために使用される補助装置を含むシステムもまた提供される。補助装置は、サーモサイクラー装置、マイクロ流体デバイスで使用する一組の電極セットの電位及び／又は電流をコントロールするための電源、及び検出装置を含んでもよい。

システムの１つの実施態様では、サーモサイクラー装置は、反応チャンバの領域のマイクロ流体デバイスに接し、反応チャンバの流体の温度をコントロールする働きをする。サーモサイクラー装置は、加熱又は冷却の何れか又は両方ができればよい。サーモサイクラー装置は、一定の温度又は時間に応じて変化可能な温度で流体をインキュベートするために使用することができる。１つの実施態様では、必要な試薬、プライマー及び標的物の存在下でＰＣＲが起こるように、反応チャンバ内の流体の温度は、サーモサイクラー装置を用いて繰り返し上昇及び下降される。当業者が容易に理解できるような、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、自立的配列増幅（ＳＳＳＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、並びに類似の及び関連した核酸検出技術などの他の増幅反応もまた、本明細書に記載の方法及びシステムを用いて実施する事ができる。酵素反応も、その方法及びシステムを用いて分析することができる。

システムの１つの実施態様では、検出装置は、分離チャンネルの内容物のレーザー誘起蛍光検出を行うための機器を含む。例えば、レーザー、光学系及び検出器は、分離チャンネル内の成分から蛍光を誘起し検出するために一列に整列される。検出サブシステムの分離チャンネルとの整列は数々の方法で達成することができる。例えば、マイクロ流体デバイスは、機器の内部に一列にするための一つ又は複数の基準面に対して既知の位置に分離チャンネルの検出領域を持たせて製造することができる。または、光源（例えば、レーザー）などの検出システムのコンポーネントは、分離チャンネルそして同時にその検出領域を検知するために、業界で知られるさまざまな技術によってマイクロ流体デバイスを走査してもよい。例として、分離チャンネル内に蛍光マーカー物質を用意し、そしてその蛍光マーカー物質を検知することによって検出領域を位置付けることが挙げられる。チャンネルに内蔵されるゲルなどの分離媒体は、蛍光マーカー物質を含んでもよく、あるいは、分析の開始前にチャンネルを位置付ける目的で、蛍光物質は一時的に分離チャンネルと連通しているサイド・チャンネルから検出領域に（例えば、電気泳動によって）移動することができる。当業者はよく知っているように、検出装置の多くのバリエーションは可能である。バリエーションとしては、光の波長、光線の形、検出に１つ又はそれ以上の波長の使用、並びに光源と検出器の種類が挙げられる。特定の適用のために求められる感度は、検出装置の種類を選択する上での要因となる。

臨床サンプル等のＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸を含むアッセイサンプル、及びアッセイの過程でそこに形成されるサンプル成分などを含むアッセイサンプルを、マイクロ流体デバイスで分析する方法もまた提供される。該方法は、上記のデバイスを使用する。

１つの方法は、以下のステップを含む：（ａ）アッセイ溶液をチャンバに加える；（ｂ）分離先頭ウェルと分離廃棄ウェルの間に、第１の長さの時間、第１の電圧を印加して、すでにロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動した最初のアッセイ溶液からのサンプル成分の第１のセットを分離チャンネルに導入し、そして分離チャンネル内のサンプル成分の第１のセットの分析を行う；（ｃ）チャンバとプレロード廃棄ウェルの間に、第２の長さの時間、第２の電圧を印加して、２度目のアッセイ溶液由来のサンプル成分の第２セットを、チャンバからロードチャンネルを経由してプレロードチャンネルに移動させる；（ｄ）ステップ（ｂ）の後に、プレロード廃棄ウェルとロード廃棄ウェルの間に、第３の長さの時間、第３電圧を印加して、サンプル成分の第２セットをプレロードチャンネルからロードチャンネルに、そしてロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動させる。

例えば、上記の実施態様では、そして〜１００〜５００塩基対のＤＮＡフラグメントの分析に対しては、５００〜３０００Ｖの第１の電圧が２０〜１２０秒間印加されればよく、３００〜１０００Ｖの第２の電圧が２０〜６０秒間印加されればよく、そして４００〜１６００Ｖの第３の電圧は１０〜４０秒間印加されればよい。これらのパラメータは、電圧及び時間の大きさの順序の有用な指針であり、方法を実施するための設計基準は以下に記載される。

その方法は、さらにチャンバ内で核酸増幅反応を行うことを含んでもよい。その方法は、なおさらに、一連のステップ：ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）、ステップ（ｄ）、及びステップ（ｃ）の終わりに開始する少なくとも１回の増幅サイクルを行うステップ（ｅ）、を少なくとも２度繰り返すことを含んでもよく、ここで場合により、最初に一連のステップが実施されるときは、ステップ（ｂ）は除外され、次の一連のステップはステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）の終了後に開始され、そして任意に、最後に一連のステップが繰り返されるときは、その一連のステップはステップ（ｂ）だけを含んでいてもよい。該方法は、さらに、ステップ（ｂ）及びステップ（ｃ）がほぼ同時に始まり、１つの増幅サイクルが各ステップ（ｃ）の終わりに開始される各ステップ（ｅ）で行なわれる上記の方法を含んでもよい。

１つの方法は、以下のステップを含む：（ａ）アッセイ溶液をチャンバに加える；（ｂ）チャンバ内のアッセイ溶液からサンプル成分の第１のセットを、最も移動の遅いサンプル成分がプレロードチャンネルに入るような第１の長さの時間、ロードチャンネルを経由してプレロードチャンネルに移動させる；（ｃ）プレロードチャンネル内のサンプル成分の第１のセットの部分を、最も移動の遅いサンプル成分がロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に到達するような第２の長さの時間、プレロードチャンネルからロード廃棄ウェルの方向にそしてロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動させる；（ｄ）サンプル成分の第１のセットをロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域から分離チャンネルに導入する；そして（ｅ）分離チャンネル内のサンプル成分の第１のセットを分析する。方法は、さらに次の：（ｆ）大よそステップ（ｅ）の開始時に、サンプル成分の第２のセットをチャンバ内のアッセイ溶液から、サンプル成分の第２のセットの最も移動の遅いサンプル成分がプレロードチャンネルに入る第１の長さの時間、ロードチャンネルを経由してプレロードチャンネルに移動させる。

１つの方法は、マイクロ流体デバイスで核酸増幅反応を行い、少なくとも一度、生成した産物の量を同一のマイクロ流体デバイスの分離チャンネルで、電気泳動的分離によって分析することを含む。方法は、以下のステップを含む：（ａ）増幅チャンバで少なくとも１回の増幅サイクルを行い、増幅産物を生成する；（ｂ）電気泳動によって増幅産物を増幅チャンバからロードチャンネルを経由してプレロードチャンネルに移動させる；（ｃ）増幅チャンバで少なくとも１回の増幅サイクルを行い、さらなる増幅産物を生成する；（ｄ）電気泳動によって増幅産物をプレロードチャンネルからロード廃棄ウェルに向けてロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動させる；（ｅ）以下のステップのサイクルを少なくとも２回行う：（１）現在の増幅サイクルによって生成された増幅産物を電気泳動によって反応チャンバからロードチャンネルを経由してプレロードチャンネルに移動させる；（２）ロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域にある前の増幅サイクル由来の増幅産物を分離チャンネルに導入する；（３）導入された増幅産物を電気泳動によって分離チャンネルに沿って分離する；（４）分離した増幅産物を検出する；（５）場合により、ステップ（ｅ）（１）の後、そしてステップ（ｅ）（６）と少なくとも部分的に時間をオーバーラップして、少なくとも１回の増幅サイクルを増幅チャンバで行い；そして（６）増幅産物を電気泳動によってプレロードチャンネルからロード廃棄ウェルに向けてロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動させる；ここで、核酸増幅反応の進行は、増幅サイクル数の関数として生成される増幅産物を検出することによって解析される。

１つの方法は、以下のステップを含む：（ａ）アッセイ溶液をチャンバに加える；（ｂ）第１の長さの時間、チャンバとロード廃棄ウェルの間に第１の電圧を印加して、（ｉ）アッセイ溶液から最初に取り出されそして前にロードチャンネルに移動したサンプル成分の第１のセットを、ロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動させ、且つ（ii）アッセイ溶液からの二度目のサンプル成分の第２のセットをチャンバからロードチャンネルに移動させる；（ｃ）ステップ（ｂ）の後、第２の長さの時間、チャンバとプレロード廃棄ウェルの間に第２電圧を印加し、アッセイ溶液からの二度目のサンプル成分の第２のセットをチャンバからプレロード廃棄ウェルに向けてロードチャンネルに移動させ続ける；そして（ｄ）ステップ（ｂ）の後、第３の長さの時間、分離先頭ウェルと分離廃棄ウェルの間に第３の電圧を印加し、サンプル成分の第１のセットをロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域から分離チャンネルに導入し、分離チャンネル内のサンプル成分の第１セットの分析を行う。

例えば、上記の実施態様では、〜１００〜５００塩基対のＤＮＡフラグメントの分析のためには、５００〜１５００Ｖの第１の電圧が５〜５０秒間印加されればよく、３００〜１０００Ｖの第２の電圧が２０〜６０秒間印加されればよく、そして５００〜３０００Ｖの第３の電圧は２０〜１２０秒間印加されればよい。これらのパラメータは、電圧及び時間の大きさの順序の有用な指針であり、方法を実施するための設計基準は以下に提供される。

その方法は、さらにチャンバで核酸増幅反応を行うことを含んでもよい。方法は、なおさらに一連のステップ：ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）、ステップ（ｄ）、及びステップ（ｃ）の終わりに開始する少なくとも１回の増幅サイクルを行うステップ（ｅ）、を少なくとも２度繰り返すことを含んでもよく、ここで場合により、一連のステップが実施される最初のときは、ステップ（ｄ）は除外され、次の一連のステップはステップ（ｄ）後に開始されステップ（ｅ）で終る、そして任意に、一連のステップが繰り返される最後のときは、その一連のステップはステップ（ｂ）及びステップ（ｄ）だけを含む。該方法は、さらに上記の方法を含んでもよく、ここでステップ（ｃ）及びステップ（ｄ）は各ステップ（ｂ）が終了するときに開始し、各ステップ（ｃ）の終わりに始まる１サイクルの増幅サイクルは各ステップ（ｅ）で行なわれる。

１つの方法は、以下のステップを含む：（ａ）アッセイ溶液をチャンバに加える；（ｂ）チャンバ内のアッセイ溶液からサンプル成分の第１セットの第１の部分を、最も移動の早いサンプル成分がロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に到達しないような第１の長さの時間、ロードチャンネルに移動させる；（ｃ）サンプル成分の第１セットの第２の部分をチャンバ内のアッセイ溶液から、ならびにロードチャンネル内の第１の部分を、第２の長さの時間、プレロード廃棄ウェルに向けてロードチャンネルに移動させる；（ｄ）ロードチャンネル内のサンプル成分の第１セットを、第３の長さの時間、ロードチャンネルに沿ってロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動させるが、ここで、第３の長さの時間は第１の長さの時間と同じであり、（ｉ）移動が最も遅い成分が第３の長さの時間に移動する距離は、ロードチャンネル／プレロードチャンネル接点からロードチャンネル／分離チャンネル交差部までの距離よりも長く、そして（ii）移動が最も遅い成分が第１、第２及び第３の合計の長さの時間に移動する距離は、ロードチャンネルに沿ってチャンバからロードチャンネル／分離チャンネル交差部までの距離よりも長いものである；（ｅ）サンプル成分の第１セットをロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域から分離チャンネル内に導入する；そして（ｆ）サンプル成分の第１セットを分離チャンネルで分析する。

その方法は、さらにステップ （ｂ）の間に、既にアッセイ溶液からロードチャンネルに移動したサンプル成分の第２のセットはロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動するが、ここでサンプル成分の第２セットの中の移動が最も遅いサンプル成分はロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に到達すること、そしてさらにステップ（ｇ）：ステップ（ｂ）の後に、サンプル成分の第２のセットをロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域から分離チャンネルに導入し、分離チャンネルで第２のサンプルを分析すること、を含んでもよい。

その方法は、なおさらに、ステップ （ｄ）の間に、チャンバ内のアッセイ溶液からサンプル成分の第３セットの第１の部分はロードチャンネルに移動するが、ここでサンプル成分の第３セットの中の移動が最も早い成分はロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に到達しないで移動すること、そしてさらにステップ（ｈ）：ステップ（ｆ）の間に、サンプル成分の第３セットの第２の部分をチャンバ内のアッセイ溶液からロードチャンネルに、ならびにロードチャンネル内の第１の部分を、第２の長さの時間と同じ第４の長さの時間、プレロード廃棄ウェルに向けて移動すること、を含んでもよい。

１つの方法は、以下のステップを含む：（ａ）増幅チャンバで少なくとも1回の増幅サイクルを行い、増幅産物を生成する；（ｂ）電気泳動によって増幅産物の第１の部分を増幅チャンバからロードチャンネルに及びそれに沿ってロード廃棄ウェルに向けて、増幅産物はロードチャンネルに沿った経路の一部を移動するけれどもロードチャンネル／分離チャンネル交差部に到達しないように、移動させる；（ｃ）電気泳動によって増幅産物の第２の部分を増幅チャンバからロードチャンネルに、そして増幅産物の第１の部分と共に、プレロードチャンネルに沿ってロード廃棄ウェルに向けて移動させる；（ｄ）増幅チャンバ内で１回の増幅サイクルを行う；そして（ｅ）以下のステップのサイクルを少なくとも２回おこなう：（１）電気泳動によって、（ｉ）現在の増幅サイクルによって生成された増幅産物の第１の部分を、増幅チャンバからロードチャンネルに、そしてそれに沿ってロード廃棄ウェルに向けて、現在の増幅サイクルによって生成した増幅産物はロードチャンネルに沿った経路の一部を移動するけれどもロードチャンネル／分離チャンネル交差部に到達しないように、移動させ、そして（ii）前の増幅サイクルの後にロードチャンネルにそしてプレロード廃棄ウェルに向けて移動した増幅産物を、ロードチャンネルに沿ってロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動させる；（２）電気泳動によって、現在の増幅サイクルによって生成された増幅産物の第２の部分を、増幅チャンバからロードチャンネルに、そして現在の増幅サイクルによって生成されたロードチャンネル内の増幅産物の第１の部分と共に、ロードチャンネルに沿ってプレロード廃棄ウェルに向けて移動させる；（３）増幅産物をロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域から分離チャンネルに導入する；（４）導入された増幅産物を、電気泳動によって、分離チャンネルに沿って分離する；（５）分離した増幅産物を検出する；及び（６）場合により、ステップ（ｅ）（２）の後及びステップ（ｅ）（３）〜（５）の間に、増幅チャンバ内で少なくとも1回の増幅サイクルを行い、ここで、核酸増幅反応の進行は、増幅サイクル数の関数として生成される増幅産物を検出することによって解析される。

本発明のこれら及び他の目的及び特徴は、以下の本発明の詳細な説明を添付の図面と関連して読むとき、より完全に明らかになるだろう。

図１Ａは、本発明の１つの実施態様によるマイクロ流体デバイスを示す。図１Ｂは、本発明の１つの実施態様によるマイクロ流体デバイスを示す。図１Ｃは、本発明の１つの実施態様によるマイクロ流体デバイス用のパラメータを設計するための図解法を示す。 図２は、本発明の１つの実施態様によるサンプル成分の移動パターンを示す。 図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、本発明の１つの実施態様による一連のステップを示す。 図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃは、本発明の実施態様による事象の典型的な時系列を示す。 図５は、本発明の１つの実施態様によるサンプル成分の移動パターンを示す。 図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、本発明の１つの実施態様による一連のステップを示す。 図７Ａ及び７Ｂは、本発明の１つの実施態様による事象の典型的な時系列を示す。 図８Ａ及び８Ｂは、実施例１に記載された本発明の１つの実施態様によって実施されたリアルタイムＰＣＲ−ＣＥ分析の結果を示す。 図９Ａ及び９Ｂは、実施例１に記載された本発明の１つの実施態様によって実施されたリアルタイムＰＣＲ−ＣＥ分析の結果を示す。 図１０Ａ及び１０Ｂは、実施例２に記載された本発明の１つの実施態様によって実施されたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ−ＣＥ分析の結果を示す。 図１１Ａ及び１１Ｂは、実施例３に記載された本発明の１つの実施態様によって実施されたリアルタイムＰＣＲ−ＣＥ分析の結果を示す。

本発明のデバイス、方法及びシステムは、一般に、単一のマイクロ流体デバイス内で反応を実施し反応産物を分析するのに有用である。反応は、分子生物学的もしくは化学的な反応又はアッセイに関連してもよい。反応条件は、反応液をインキュベート又はサーモサイクルすることを含んでもよい。反応生成物は定期的に又は時々反応チャンバから引き出され、チャンネルネットワークを経由して分析用の分離チャンネルに運ばれる。

１つの具体的な適用は、リアルタイムＰＣＲ解析又は定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）用である。そのような適用では、オリゴヌクレオチドプライマー対を、ポリメラーゼ酵素及びヌクレオチド三リン酸のようなＰＣＲ反応に必要な試薬を含む溶液中で対象となる（目的とする）サンプルと接触させる。反応液は、サーモサイクルさせる、即ち、二本鎖ポリヌクレオチドの変性、テンプレートへのプライマーのアニーリング、及び増幅産物とも呼ばれるポリヌクレオチド生成物へのプライマーの伸長をそれぞれ支援する温度の反復サイクルにかけられる。増幅産物の量は、各サーモサイクルの後、又は少なくとも数サーモサイクル毎に測定してもよく、このようにして、反応の進行を追跡することができる。本発明のデバイス、方法及びシステムは、１つのマイクロ流体デバイスの中に、増幅反応を実施するためのチャンバ、及び反応で生成される増幅産物（ポリヌクレオチド生成物）量を測定するためにそれに接続された分離チャンネルを備える。

関連した適用は、標的分析物の有無（及び量）を示す反応産物を生成させるために、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの標的を検出する等温増幅法を含めた別のタイプの核酸増幅反応を用いることを含む。等温反応は、温度変化によって定義された慎重なサイクルに従っては進行しないが、同じ原理が反応生成物の定期的な測定に適用できる。

Ａ．デバイス
図１Ａは、本発明のマイクロ流体デバイス１００の実施態様を図示する。デバイスは、反応を行うためのチャンバ１１を含む。

チャンバ１１は、約０．５μＬから約２００μＬの体積を有するように設計される。チャンバ１１の体積は、そこで実施される反応の種類によって、反応が、分析、検出、又は他の使用に十分な生成物の量を生産できるような大きさすることができる。例えば、反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅反応なら、デバイス内で実施されるＰＣＲアッセイの望ましい感度が、反応チャンバの容量の設定の要因となる。もし１０個の標的コピーを確実に増幅できるなら、そして望ましい感度が１コピー／マイクロリットルなら、反応チャンバ体積は少なくとも約１０μＬでなければならない。反応チャンバは、体積が約０．５μＬ、１．０、１０、２５、５０、７５、１００、１５０又は２００μＬを有することが考えられる。

反応液は、例えばアクセス・チャンネル１８及び１９を使用して、チャンバ１１に導入されればよい。アクセス・チャンネル１８及び１９は、それぞれアクセス・ウェル５及び６からチャンバ１１に通じる。ここに例示されるように、アクセス・チャンネルは、チャンバ内の液体中の気泡又は空気を避けながら反応液によるチャンバの充填を容易にするために、チャンバ１１の反対側にアクセスできるようにしてもよい。例えば、アクセス・ウェル５に導入された溶液は、アクセス・チャンネル１８を通して移送させることができ、チャンバ１１に入ってそれを満し、アクセス・チャンネル１９を通ってチャンバから出ていく。

チャンバ１１への流体の移動は、例えば、毛管作用、流体への加圧、又は動電学によって引き起こすことができる。圧力は第１アクセス・ウェルに加えられる陽圧、又は第２アクセス・ウェルに加えられる陰圧であればよい。一般に、第１のアクセス・ウェルの容量は、チャンバ及び少なくとも２つのアクセス・チャンネルの少なくとも一部を満たすのに十分な流体の体積に対応できるほど大きくなければならない。第１のアクセス・ウェルの容量は、チャンバ、少なくとも２つのアクセス・チャンネル、及びアクセス・ウェルの少なくとも一部分を満たすのに十分な流体の体積を収容できる大きさであればよい。

チャンバ１１はまた、分析チャンネルネットワークと流体連通している。分析チャンネルネットワークはロードチャンネル１２、プレロードチャンネル１３、分離チャンネル１４、そして、もし存在すれば、サイド・チャンネル２１を含む。ロードチャンネル１２は、チャンバ１１からロード廃棄ウェル３に通じている。分離チャンネル１４は、分離先頭ウェル４から分離廃棄ウェル１に通じており、ロードチャンネル／分離チャンネルの交差部１６でロードチャンネル１２と交差する。プレロードチャンネル１３は、チャンバ１１とロードチャンネル／分離チャンネルの交差部１６の間の位置のロードチャンネル１２からプレロード廃棄ウェル９に通じている。プレロードチャンネル１３がロードチャンネル１２と出会う点はまた、ロードチャンネル／プレロードチャンネル接点１５と呼ばれてもよい。サイド・チャンネル２１は、チャンバ１１とロードチャンネル／プレロードチャンネル接点１５の間の位置のロードチャンネル１２からサイド廃棄ウェル８に通じている。サイド・チャンネル２１がロードチャンネル１２と出会う点はまた、ロードチャンネル／サイド・チャンネル接点１７と呼ばれてもよい。ロードチャンネルとサイド・チャンネルの接点、接点１７の位置は、図１Ａに示されたそれと異なってもよい。例えば、サイド・チャンネルが、ポリヌクレオチド鎖長マーカーをサンプル成分と混合するためにロードチャンネルに送達するために使用される場合、サイド・チャンネルは、接点１５と交差部１６の間のロードチャンネル１２と合流すればよい。接点１７の位置に関する特定の条件は他にない。いくつかの実施態様では、焦点用色素チャンネル２２は、分離チャンネル１４から焦点用色素ウェル２に通じている。焦点用色素チャンネル／分離チャンネル接点は、通常は、検出領域として使われる分離チャンネルの部分の下流に位置する。

いくつかの実施態様では、ウェル７はチャンネル２０を経由してチャンバ１１と流体連通している。そのようなウェルは、ウェルから反応チャンバ１１に流体的及び電気化学的な連通を提供する。

電極（図示されない）は、ウェル１、２、３、４、７、８及び９のそれぞれに存在する。電極は、場合によりウェル５及び／又は６に存在してもよい。電極は、独立に制御可能である。２つの電極間に電位差を印加する、又は特定の電流が特定の電極（又は、一組の電極の電位と流電制御の組み合わせ）を通して達成されるように電位差を印加することによって、マイクロ流体デバイスの２点間の経路に沿って動電移送を誘導することができる。ウェル７にある電極は、チャンバ１１と分析チャンネルネットワーク内の別の点、通常はロード廃棄ウェル３又はプレロード廃棄ウェル９などの別のウェル、との間に電位差を与えるために使用することができる。従って、ウェル７と別のウェルの１つとの間の電位差は、例えば下記のように、チャンバからロード廃棄ウェル３又はプレロード廃棄ウェル９のいずれかに向かう分析チャンネルネットワークの中に反応液成分の動電移送を誘導するために使用することができる。電極は、ウェル内に下げられた外部電極として提供することができる、又は電極はデバイス自体の部分としてマイクロ加工することができる。

図１Ａに示されるように、ウェル１０は、デバイス１００の特定の構成には使用されない。

図１Ｂに示されるロードチャンネル１２に沿ったチャンバ１１から交差部１６までの距離（「距離Ａ」）、及び接点１５から交差部１６までの距離（「距離Ｂ」）は、デバイス１００を用いて分析する成分の移動度に基づく条件を満たすように設計され、即ち、速度に基づく条件を満たすように設計される。距離Ａ及び距離Ｂの例示的な長さは、それぞれ、０．１〜２ｃｍ及び０．０１〜０．２ｃｍである。これらの範囲は、一般に、１００〜５００塩基対の核酸フラグメントの分析のために実際に適用されるチャンネルセグメントの長さを示す。詳細な設計基準及びこれらのセグメント長の間の関係は下記に記載される。これらの設計基準によって、デバイス１００は、本発明の方法を実行することができ、それによっていくつかのステップを同時に行うことができるので、ほかの方法よりも迅速に結果を提供する。

チャンバ１１内の反応液中の荷電成分（正味正又は正味負の電荷を有する分子)は、次のように分析できる。分析する反応液中の各荷電成分の電気泳動的移動度μ_ｉを考える。一対の電極間に電位差を加えることによって構築される一定の電場Ｅに対して、反応液成分の速度ｖ_ｉは、ｖ_ｉ＝μ_ｉＥである。分析する成分の中から、移動の最も早い成分と移動の最も遅い成分を決める。但し、荷電種で分析する対象外の成分が反応液に存在する可能性があることを、認識しなければならない。そのような他の荷電種は、この決定には含まれない。例えば、本明細書に開示されるデバイス及び方法は、リアルタイムＰＣＲ分析に適用され、対象となる荷電種としては、反応液と接触するプライマー対から生成される増幅産物が挙げられる。動電学的速度を、それぞれｖ_fast及びｖ_slowとして明示する。距離Ａ及び距離Ｂについて、ロードチャンネル１２に沿った長さは次の条件が満たされなければならない：
（１）ｖ_fast（ｔ_load）＜ 距離Ａ、
（２）ｖ_slow（ｔ_load+ｔ_preload+ｔ_load) ＞ 距離Ａ、
（３）ｖ_slow（ｔ_load）＞ 距離Ｂ。
ここで、ｖ_fast、ｖ_slow、距離Ａ、及び距離Ｂは、上記で定義した通りであり、ｔ_loadとｔ_preloadは、それぞれロードステップ及びプレロードステップを行なうために電位差が加えられる時間である。従って、時間ｔ_loadの間、移動度μを有する成分は、距離μＥ（ｔ_load）-＝ｖ（ｔ_load）＝Ｄ_loadを移動することになる。ロードステップ及びプレロードステップの間に動いた相対的距離のデバイス設計への適用は既に述べたが、ステップそれ自体は以下に、さらに説明する。

対象となるサンプル成分がただ１つである場合、早い種と遅い種は同じ種となり、従って上記の条件において、ｖ_fast＝ｖ_slowである。より一般的には、反応液中に少なくとも２つの対象となる種が存在するようになる。例えば、２つの種は、分析物とポジティブコントロール、又は２つの異なる分析物を含めばよい。反応が増幅反応である場合、分析物は増幅産物である。反応がＰＣＲ反応である場合、分析物は、標的配列を増幅するプライマー対によって産生される増幅産物である。

広範な設計解は、式（１）〜（３）の条件を満たす。独自の解決手法はない。むしろ、時間を固定し、有効な距離Ａ及びＢの範囲を決定する、又は距離Ａ及びＢを固定し、ロード及びプレロードステップのための動作時間範囲を決定する。

条件は、以下の要件を定める。式（１）は、最も速い移動種が「ロードステップ」の継続時間の間に距離Ａ（チャンバ１１から交差部１６まで）を進まないことを規定する。式（２）は、最も遅い移動種が２つの 「ロードステップ」及び１つの「プレロードステップ」の継続時間の間に少なくとも距離Ａを進むことを規定する。最後に、式（３）は、最も遅い移動種が「ロードステップ」の継続時間の間に少なくとも距離Ｂ（接点１５から交差部１６まで）を進むことを規定する。これらのステップ及び様々な移動の基準の重要性は、下記に説明される方法ステップを考慮すれば理解できる。

１つの実施態様は、ポリヌクレオチド産物の分析を意図する。例えば、反応は、核酸増幅産物を生成する核酸増幅反応であればよい。典型的な核酸増幅産物産物は、約２〜３×１０^−４ｃｍ^２／ｓＶの移動度を有する。１００Ｖ／ｃｍの電場の印加は、増幅産物産物に０．０２〜０．０３ｃｍ／秒の速度での移動を引き起こす。ｔ_load及びｔ_preloadをそれぞれ１０秒及び２０秒に設定すると、以下のロードチャンネル用の設計基準が得られる。
（１’）ｖ_fast（ｔ_load）＜ 距離Ａ；０．０３（１０）＝０．３ｃｍ＜距離Ａ
（２’）ｖ_slow（ｔ_load+ｔ_preload+ｔ_load) ＞ 距離Ａ；０．０２（４０）＝０．８＞距離Ａ
（３’）ｖ_slow（ｔ_load）＞ 距離Ｂ；０．０２（１０）＝０．２ｃｍ＞距離Ｂ

従って、ステップの所定の時間に対して、距離Ｂは０．２ｃｍ未満であり、一方距離Ａは、０．３ｃｍより大きく０．８ｃｍ未満であるべきであることが決定できる。チャンバ１１からロードチャンネル１２に沿った接点１７までの距離は、距離Ａから距離Ｂを差し引くことによって求められる。チャンバ１１から接点１７までの距離を距離Ｃ（図１Ｂを参照）とすると、上記の条件はセグメントの長さの距離Ｂ及び距離Ｃに関して表すことができる。それ故、上記の例については、以下の規定となる。
（１’）距離Ｃ＞０．３ｃｍ−距離Ｂ
（２’）距離Ｃ＜０．８ｃｍ−距離Ｂ
（３’）距離Ｂ＜０．２ｃｍ

従って、上記式は、所定のｔ_load及びｔ_preload時間並びに分析物の速度のセットに対する有効な解答の範囲を提供する。同様に、ロードチャンネルセグメントの長さ及び分析物の速度を固定し、適切なｔ_load及びｔ_preload時間を決定することができる。

これらの式は、またグラフを使って解くことができる。図１Ｃは、ロードチャンネルセグメントの長さに対する有効解の範囲を図解するグラフを示す。グラフの斜線領域は、接点１５から交差部１６（距離Ｂ）まで及びチャンバから接点１５（距離Ｃ）までのロードチャンネルの、本明細書で定義した設計基準に適合するセグメント長の範囲を示す。グラフ上に引かれた３本の線は３つの式によって与えられた限界を示す。

本発明によるマイクロ流体デバイスの製造は、一般に、寸法が異なる、特に深さが異なる流体特性（例えば、チャンネル、チャンバ）を備えたデバイスの作成に関する。例えば、通常、アクセス・チャンネル１８並びに１９及びチャンバ１１は、分析に必要なサンプル量に適応するためにより深く、例えば、深さが５０〜５００μｍである。一方、分析チャンネル・ネットワークは、通常、深さがより少ない、例えば、深さが２０〜６０μｍの小断面のチャンネルを含む。上述のように、断面及び分析チャンネルネットワークの全体的な体積を小さくすることによって、反応液の小画分しか分析のために除く必要がなく、チャンネルネットワークに導入ための大きな流体力学的抵抗は弁として働く。

マイクロ流体デバイスは、当業者が知るいかなる好適な材料からも造ることができる。米国特許第８３９４３２４号に記載されるように、そのようなデバイスを製造する方法は、当業界において公知である。ポリメチルメタクリレート及び環状オレフィンコポリマーは、異なる寸法（即ち、深さ）のチャンネルを作成するのに適している。材料は、デバイスを製造するために材料を接合することを含むマイクロ加工技術との適合性で選択される。例えば、デバイスは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）又は環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエステル（ＰＥ）及び他の好適なポリマー又はエラストマー、ガラス、石英及び半導体材料などのような高分子材料から形成させることができる。

環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）は、例えば、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン（ノルボルネン）又は１，２，３，４，４ａ，５，８，８ａ−オクタヒドロ−１,４：５，８−ジメタノナフタレン（テトラシクロドデセン）のような環状モノマーとエテンとの連鎖共重合によって製造される。ＣＯＣの例としては、Ticona社のTOPAS（登録商標）および三井化学のAPELTM（商標）が挙げられる。ＣＯＣはまた、種々の環状モノマーの開環メタセシス重合の後、水素化によって製造してもよい。そのようなポリマーの例としては、日本合成ゴムのARTON及びZeon Chemicals社のZeonex（登録商標）及びZeonor（登録商標）が挙げられる。一方、単一種の環状モノマーを重合させると、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）が得られる。また、三菱のlupilon（登録商標）ポリカーボネートなどのＰＣ、Evonik CYRO社のAcrylite（登録商標）系のアクリレート（例えば、S10、L40、M30）などのＰＭＭＡは、マイクロ流体デバイスを製造するために好適なプラスチックである。

一般に、そのようなポリマーは、多数のグレードが使用可能である。適用によって、ＦＤＡ承認済グレードが適切であってもよいが、他のグレードの種類で十分であってもよい。マイクロ流体デバイス用の基板の選択に関する他の考慮事項としては、製造の容易性及び再現性、並びに光学測定における低バックグラウンドが挙げられる。これらのパラメータは、当業者により容易に最適化される。

典型的には、チャンバ、チャンネル及びウェルのネットワークを含むマイクロ流体デバイスは、デバイスを形成するために共に接合される２つ又はそれ以上の基板層から製造されてもよい。そのようなデバイスのための製造技術は、一般にマイクロ加工技術と呼ばれ、業界に周知されている。デバイス製造法の1つの例では、マイクロ流体チャンバ及びチャンネルの機構が第１の層を含む基板の第１の表面にマイクロ加工され、第２の層は、機構がマイクロ加工された第１の層の第１の表面に、それによって機構を封入するために接合される。多層化デバイスも製造することができ、それは業界でよく知られていることである。

１つの実施態様では、デバイスは、そこに定義されたマイクロ流体ネットワークを有する基板の第１の表面（即ち、堀、窪み、溝、穴などを与える表面）に、ポリマー性の薄膜を、それによってネットワークを封入するために、接合させることによって製造してもよい。薄膜は、約２０μｍから約５００μｍ、又は約５０μｍから約２００μｍの厚さを有すればよい。薄膜は、厚さの均一性、可用性、接合の容易性、透明性、光学特性、熱特性、化学的特性および他の物理特性に従って選択されればよい。接合技術としては、業界に知られるような積層、超音波溶接、ＩＲ溶接などが挙げられる。薄膜材料は、それが接合される基板と同じ又は別の材料であってもよい。

Ｂ．デバイスを使用する方法
本明細書に記載の設計条件を満たすデバイスは、チャンバからの２つ又はそれ以上のサンプルを時系列に分析するために、本明細書に開示された方法を用いて操作することができる。本方法は、チャンバ内容物を時間の関数として分析するために有用である。本方法は、チャンバ内で行われる反応の進行の追跡、又はチャンバの内容物を時間とともに監視することに用途を見出せる。例えば、核酸増幅反応で生成する増幅産物の量の増加、又は酵素反応若しくは結合反応の動態を測定することができる。１つの具体的な適用は、ＰＣＲ反応の進行を追跡することに関する。ＰＣＲ増幅産物は、各サイクルの後又は選択されたサイクルの後、チャンバからサンプルを取り除き、各サンプルを分析チャンネルネットワークで分離分析することによって解析することができる。

図２は、１つの方法について、デバイスにおけるサンプル成分の概略的な流れを示す。図２では、主要なデバイス機能は、図１と同じ番号を用いて示される。機能には、チャンバ１１、チャンバ１１からロード廃棄ウェル３に通じるロードチャンネル１２、ロードチャンネル１２との接点１５からプレロード廃棄ウェル９に通じるプレロードチャンネル１３、及び分離先頭ウェル４から分離廃棄ウェル１に通じ、そして交差部１６でロードチャンネル１２と交差する分離チャンネル１４が含まれる。

サンプル成分の一般的な順序及び流れ方向は、破線（Ｉ）’、（Ｉ）’’、（II）及び（III）で示される。最初に、サンプル成分はチャンバ１１からロード廃棄ウェル３に向けて移動し、（Ｉ）’及び（Ｉ）’’で示される移動を生じさせる。この方法によると、２つの異なるサンプルは、（Ｉ）’及び（Ｉ）’’で表されるロードチャンネル１２に存在する。しかしながら、サンプル成分がチャンバ１１から最初に移動するときは、ロードチャンネル１２には前のサンプルは存在せず、従って（Ｉ）’’で表される成分の移動は未だない。サンプル成分がチャンバ１１から最初に移動するときは、（Ｉ）’で表されるチャンバからロードチャンネル１２内へのサンプル成分の移動がある。

次に、サンプル成分は、（II）で表示される移動に従って、チャンバ１１からプレロード廃棄ウェル９に向けて移動する。従って、（II）の移動のために、ロードチャンネル１２に進出したサンプル成分は、ロードチャンネル１２に沿って（Ｉ）’で示されるように移動し続け、次にロードチャンネル１２を離れてプレロードチャンネル１３に入る。さらに、チャンバ１１からのサンプル成分は、ロードチャンネル１２内への進入が続けられることになる。このように、（Ｉ）’及び（II）で表示される移動の組み合わせによって、サンプル成分は接点１５までのロードチャンネル１２を満たし、そしてまたプレロードチャンネル１３に見出されてもよい。

ある時間経過した後、分析用のサンプル成分の次のセットを取り出すのが適切になったら、サンプル成分はチャンバ１１からロード廃棄ウェル３に向けて移動し、（Ｉ）’及び（Ｉ）’’で示される移動が生じる。サンプル成分の次のセットは、先にロードチャンネル１２に進出した最初のサンプル成分について上で説明したように、（Ｉ）’で示されるようにロードチャンネル１２に入ることになる。そして、この時、前にサンプル成分が接点１５までのロードチャンネルに移動しているので、これらのサンプル成分はロードチャンネル１２に沿って移動し、ロードチャンネル／分離チャンネルの交差部１６を横切り、ロード廃棄ウェル３に向けて移動することになる。同様に、更なるサンプル成分のセットが分析のために後期にチャンバ１１から排出されると、２つの異なるサンプル成分のセットがロードチャンネル１２に存在することになる。チャンバ１１から排出された前のサンプル成分のセットは、大よそ接点１５までのロードチャンネル１２に存在し、一方チャンバ１１から排出された現在のサンプル成分のセットは、ちょうどロードチャンネル１２に進入したことになる。

３番目のタイプのサンプル成分の移動は、（III）で示される。先にロードチャンネル／分離チャンネルの交差部１６に移動したサンプル成分は、分離チャンネル１４に導入され、分離廃棄ウェル１に向けて移動される。サンプル成分が分離チャンネル１４に沿って移動している時に成分は分離され検出される。これらの様々な移動のタイミング、連携及び継続時間は、さらに図３及び４と併せて説明する。

図３Ａ〜３Ｃは、図２に関連して議論した（Ｉ）’、（Ｉ）’’、（II）及び（III）の移動を誘導するために、マイクロ流体デバイス中の様々な位置の間に電圧を印加するためのパターンを図示する。本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスにおいて、図３Ａ〜３Ｃに示されるＶＤ１、ＶＤ２、及びＶＤ３の３つのパターンに従った電圧差の反復印加は、チャンバ１１からの一連のサンプル成分の迅速な分析をもたらす。図３Ａは、チャンバ１１とロード廃棄ウェル３の間の第１電圧ＶＤ１の印加を示す。チャンバ１１に関連する電極１１ｅは、チャンバ１１に位置するように図に示されるが、これは本明細書に記載されるデバイスの実施態様の視覚的表現を単純化するためである。図１Ａに記載されるデバイスについて、チャンネル２０を介してチャンバ１１と電気化学的に連通しているウェル７の電極は、図３Ａ及び３Ｂに関連して説明されるように、通常は、第１及び第２の電圧を印加するために用いられる。例えば、アニオン性の分析物成分をチャンバ１１からロードチャンネル１２に移動させるために、ロード廃棄ウェル３にある電極３ｅはプラスにバイアスがかけられ（陽極）、チャンバ１１と電気化学的に接触している電極１１ｅはマイナスにバイアスがかけられる（陰極）。逆の分極は、カチオン性分析物成分をチャンバ１１からロードチャンネル１２内に及びそれに沿って移動させる。第１の電圧が印加されている間、既にロードチャンネル１２内に存在する荷電した分析物成分は、チャンネルに沿ってロード廃棄ウェル３に向けて移動し、そしてチャンバ１１内の荷電した分析物成分はロードチャンネル１２に移動することになる。さらに、図３Ａの第１電圧ＶＤ１は、（ｉ）ロードチャンネル１２に存在する最も移動の遅い分析物成分が接点１５から少なくとも交差部１６まで移動することができ、そして（ii）チャンバ１１内の最も移動の速い分析物はロードチャンネル１２に入るが、交差部１６に到達しないような時間印加される。

図３Ａに示される第１電圧ＶＤ１の印加の次に、図３Ｂに示される、チャンバ１１の電極１１ｅとプレロード廃棄ウェル９の電極９ｅの間の第２電圧ＶＤ２の印加は、荷電した分析物成分がロードチャンネル１２に沿って移動し、プレロードチャンネル１３に進入することになる。さらに、チャンバ１１からの荷電した分析物成分は、ロードチャンネル１２内への進入が続けられることになる。第２電圧は、サンプル成分が、チャンバ１１からロードチャンネル１２に移動してしまい、最大でも分離チャンネル１４に近い位置のプレロードチャンネルとの接点（接点１５）に至り、そしてプレロードチャンネル１３に移動するまでの時間、印加される。さらに、第２電圧ＶＤ２は、第１電圧が２回そして第２電圧が１回
印加される間に、最も遅い荷電した分析物成分が、少なくともチャンバ１１からロードチャンネル／分離チャンネル交差部１６までの距離を移動するような時間の間、印加される。

また、図３Ａに示される第１電圧ＶＤ１の印加の後、分離先頭ウェル４の電極４ｅと分離廃棄ウェル１の電極１ｅ間の第３電圧ＶＤ３の印加は、図３Ｃに示すように、ロードチャンネル／分離チャンネル交差部１６内及び周辺に存在する荷電した分析物成分を、分離チャンネル１４に移動させる。ロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に存在する荷電した分析物成分は、分離チャンネル１４内に導入することができる。導入される物質は、厳密には、文字通りの２つのチャンネルの交差部内の分析物成分に限定されない。それよりむしろ、業界に知られるように、文字通りの２つのチャンネルの交差部及び交差部に隣接するロードチャンネル１２の部分に存在する分析物成分もまた、この工程で分離チャンネル１４に導入される。分析物成分が交差部領域から導入される範囲は、関連するウェルに印加される引き戻し電圧のタイミング及び大きさに依存する。第３電圧ＶＤ３は、分離チャンネル１４において分析物成分の分離及び分析を行なうのに十分な時間印加される。必要な時間は、電界強度、分離媒体中の分析物の移動度、交差部１６から検出ポイントまでの距離などに依存する。これらの要因は、迅速な分離時間を好適な検出感度及び分解能を維持して最適化することができる。

図４Ａは、本発明に記載の反応を実施し反応生成物を定期的に測定する１つの方法における、ステップの順序及びタイミングのための例示的なプロトコルを図解する。プロトコルは、４種類のステップ:（ｉ）チャンバ内の反応周期；（ii）チャンバからロード廃棄ウェルの方向へのサンプル成分の移動；（iii）チャンバからプレロード廃棄ウェルの方向へのサンプル成分の移動；及び（iv）分離分析を含む。図４Ａでは、５つの反応周期、及びそれに続くそれぞれの反応周期後生成した反応生成物の５つの分離分析が実施される。図から理解できるように、第１反応周期の開始及び最後の分離分析の段階的減少は別として、同時に実施される２つのステップがある。もしステップのいずれかのオーバーラップが無かったならば、全行程は５１０秒かかるだろう。本明細書に開示された方法によるデバイスで反応及び分離分析を行えば、この例で設定された時間パラメータによれば５つのサイクルの全工程は３９０秒かかることになる。

適切な反応周期は、例えば反応溶液のインキュベートに関与する時間枠や、加熱プログラムを完了するのに必要な時間によって規定される。従って、一定温度で行われる反応は定期的にサンプリングしてもよい。時間は、一定であっても又は変動してもよい。又は、反応液の温度を上げそして下げるサーマルサイクルが反応周期を構成してもよい。サーマルサイクルは、ＰＣＲサイクルであってもよい。下記図４Ｂ〜４Ｃでより詳細に説明されるように、反応周期の間に、複数回のサーマルサイクルが行われてもよい。図３Ａ〜３Ｃに記載されるように、移動ステップ（ii）及び（iii）と分離ステップ（iv）は、第１の電圧、第２の電圧及び第３の電圧の印加に対応する。図４Ａに示されるように、反応周期は３０秒であり、第１の電圧は１０秒間、第２の電圧は２０秒間、そして第３の電圧は５０秒間の長さで印加される。

図４Ａに図解されたプロトコルは、最初に反応周期、続いてサンプル成分をチャンバ１１からロード廃棄ウェル３に向けて移動させるために第１の時間の長さの第１の電圧ＶＤ１の印加、及び次にサンプル成分をチャンバ１１からプレロード廃棄ウェル９に向けて移動させるために第２の時間の長さの第２電圧ＶＤ２の印加を含む。この時点で、第１の反応周期までに生成された反応生成物は、ロードチャンネル１２から接点１５まで移動している。サンプル成分はまだ交差部１６に進んでいないので分離分析は必要ないが、第３の時間の長さの第３の電圧ＶＤ３を、悪影響を与えなければ、印加してもよい。

次に、第２の反応周期が行われ、続いて再び第１の時間の長さの第１の電圧ＶＤ１が印加される。この時、第１の反応周期のサンプル成分はロード廃棄ウェル３に向けて交差部１６に移動され、その間に第２の反応周期のサンプル成分はロードチャンネル１２内に移動される。この時点で、第２の電圧ＶＤ２がチャンバ１１とプレロード廃棄ウェル９の間に印加され、そして第３の電圧ＶＤ３が分離先頭ウェル４と分離廃棄ウェル１の間に印加される。図示されるように、これら２つの工程は並列で実施される。第２の電圧及び第３の電圧は、ほぼ同時に印加が開始される。第２の電圧を印加するステップは、第３の電圧を印加するステップ（分離ステップ）の前に終了する。第３の電圧を印加するステップが継続する間に、次の反応周期が開始できる。従って、反応周期は、分離分析時間内に完全に実行される。

分離分析パラメータ（例えば、分析物の移動速度、検出器までの距離など）及び反応周期パラメータ（例えば、サーモサイクラー温度、時間、ランプ速度など）の調節によって、これらの時間がほぼ同時に終了するように調整できる。ほぼ同時にこれらのステップを終了させることによって、新しく生成された反応生成物をチャンバ１１からロード廃棄ウェル３に向けて移動する次のステップを即座に開始できる。

図４Ａは、５つの反応周期及び５つの分離分析から成る例示的なプロトコルを示すが、反応周期及び分離分析の数は、実験の必要に応じて自由に調整できる。例えば、チャンバ内の反応液の内容物に関して一連の少なくとも２、５、１０、１５、２０又は２５、又は５０もの分離分析が行われてもよい。最初の分離分析の前に、任意の数の反応周期を実施することができる。分離分析の開始を遅らせることで、生成物の量がより容易に測定されるレベルに増加させてもよい。いくつかの実施態様では、生成物ピークが閾値を超えて検出されたとき、又は生成物ピークの検出後の所定の回数の反応周期の後、分析を停止してもよい。

分離分析は、各反応周期後の代わりに、１つおき、又は３つの反応周期毎、又はいかなる特定の反応周期のセットの後でも実施することができる。反応周期は、すべてが同じ継続時間である必要は無く、必要又は要望に応じて変化させることができる。反応がＰＣＲのような核酸増幅反応の場合、生成された産物の量を分析する前に、約８から約１７のサーモサイクルを行えばよい。その後、生成物の量は、例えば、毎サーモサイクルの後、又は一つおきのサーモサイクルの後に分析すればよい。実施されるサーモサイクルの総数は、検出感度、増幅効率、及び予測される標的の量、並びにチャンバの体積及び分析チャンネルネットワークの体積に応じて、約３５回〜約４５回であればよい。アッセイサンプル中に予測される標的分析物の量が多ければ、より少ないサイクル数で十分である。

表１は、サーモサイクルの回数及び実施されるＣＥ分離分析を調整することによって全体的な分析時間をどの程度最適化できるかを図解する。例えば、ＣＥ分析は、例えば１０回目の反応サイクルから、即ち、９回の反応サイクルが行われた後に、開始できる。さらにその上、ＣＥ分析は、毎反応サイクル後の代わりに１回おきの反応サイクル後に実施することができる。もう１つの形は、生成物が検出されるまでは１回おきの反応サイクル後にＣＥ分析を実施し、次に、より高い精度で成長曲線を定義するために毎サイクル後に分析を実施することである。このＣＥ分析は、場合により、成長曲線が一定回数のサイクルの後に適切に定義されるだろうと言う推定に基づいて、予めセットされた分析回数の後、停止することができる。例えば、ある実施態様では、生成物ピークの検出に続いて８サイクル後、１０サイクル後、１２サイクル後、又はおおよそ１４サイクル後、成長は十分に示される。表１で説明される「ピーク検出時点から毎サイクル」モードは、生成物ピークがサイクル１２で検出され、その後ＣＥ分析が、サイクル１４から始まり例えば連続した１０サイクルの間毎サイクルで実施され、そしてそこでＣＥ分析が停止される場合の例を示す。サイクル１２とサイクル１４の間のギャップは、サイクル１２の分析結果が、反応サイクル１３及び１４が完了するまで分からない故に生じる。生成物ピークが検出されない場合、その時、ＣＥ分析は分析時間の間１回おきのサイクルを継続し、その後すぐにサンプルは「陰性サンプル」であると報告される。

表１に見られるように、さらなる時間短縮は、実施されるＣＥ分析の回数を調整することによって達成することができる。３１回のＣＥ実行を必要とする（この例では）毎サイクルの反応をアッセイするよりもむしろ、いくつかの実施態様では、ＣＥ分析が１つおきの反応サイクル後に起こるように予めセットされればよく、その場合（この例では）１６回だけのＣＥ実行が必要である。約７．５分の時間短縮（図４Ａ及び４Ｂに示された時間パラメータから見積もられる）の利点は、成長曲線を定義する精度の損失に対してバランスが保たれるべきである。当業者は、どちらのファクターが方法の適用に重要であるかを容易に決定できる。ＣＥ分析回数の別の形は、もちろん可能である。別の実施態様では、ＣＥ分析の頻度は、生成物が検出された時点で、１つおきのサイクルから毎サイクルに変えられ、そこでは１２回のＣＥ分析が実施されることになる(この例では)。ここで、約１８分、即ち毎サイクルモードのアッセイ時間の約半分の時間短縮を、成長曲線の精度のごく僅かな変化で達成することができる。

図４Ｂは、２つの反応サイクルが実施されそして２つのサイクルの第２のものから生じる生成物が測定される実施態様について、ステップの順序及びタイミングの例示的なプロトコルを図解する。換言すれば、図４Ｂでは、１つおきの反応サイクルが分析される。プロトコルはまた以下の同じ４種類のステップ：（ｉ）チャンバ内の反応周期、（ii）チャンバからロード廃棄ウェルの方向へのサンプル成分の移動、（iii）チャンバからプレロード廃棄ウェルの方向へのサンプル成分の移動、及び（iv）分離分析、を含む。図４Ｂでは、８つの反応周期、及びそれに続く１つおきの４つの反応周期後生成した反応生成物の分離分析が示される。図４Ｂから理解できるように、図４Ａと比較したとき、余分な反応周期は、分離分析が行われている間に実施されるものの後に直接挿入され、それに続くステップは反応周期の第２の終わりを待つ。図４Ａの実施態様のために５つのサイクル及び５つの分析を完全に処理するために必要な時間は３９０秒であるのに対して、図４Ｂの実施態様では、６つの反応サイクル及び１つおき（３つ）の分析には同じ３９０秒かかることになる。さらなる時間短縮はより多いサイクル数で達成されることになる。

同様に、図４Ｃは、２つの反応サイクルが実施されそして２つのサイクルの第１のサイクルから生じる生成物が測定される実施態様の、ステップの順序及びタイミングのための例示的なプロトコルを図解する。図４Ｃでも、１つおきの反応サイクルが分析される。プロトコルはまた以下の同じ４種類のステップ：（ｉ）チャンバ内の反応周期、（ii）チャンバからロード廃棄ウェルの方向へのサンプル成分の移動、（iii）チャンバからプレロード廃棄ウェルの方向へのサンプル成分の移動、及び（iv）分離分析を含む。図４Ｃでは、８つの反応周期及びそれに続く４つの周期対それぞれの第１の反応周期後生成した反応生成物の分離分析が示される。図４Ｃから理解できるように、図４Ｂと比較したとき、その対の第１の反応周期の後、サンプルは移動されサンプル移動（ii）及び（iii）に付され、そして次に前のサンプルの分離分析が行われる間に第２の反応周期が起こる。図４Ａの実施態様のために５つのサイクル及び５つの分析を完全に処理するために必要な時間は３９０秒であり、６つの反応サイクル及び１つおき（３つ）の分析を行った図４Ｂの実施態様には同じ３９０秒かかるのに対して、図４Ｃの実施態様では６つの反応サイクル及び３つの分析に３６０秒しかかからない。さらなる時間短縮はより多いサイクル数で達成されることになる。

図５では、本発明による別の方法について、デバイスにおけるサンプル成分の概略的な流れを図示する。図５では、主要なデバイス機能は、図１と同じ番号を用いて示される。機能には、チャンバ１１、チャンバ１１からロード廃棄ウェル３に通じるロードチャンネル１２、ロードチャンネル１２との接点１５からプレロード廃棄ウェル９に通じるプレロードチャンネル１３、及び分離先頭ウェル４から分離廃棄ウェル１に通じ、交差部１６でロードチャンネル１２と交差する分離チャンネル１４が含まれる。

サンプル成分の概略的な順序及び流れ方向は、破線（Ｉ）、（II）及び（III）で示される。最初に、サンプル成分はチャンバ１１からプレロード廃棄ウェル９に向けて移動し、（Ｉ）で示される移動をもたらす。サンプル成分がチャンバ１１から最初に移動するときは、ロードチャンネル１２に前のサンプルは存在しなく、従って分離チャンネルで分析されるべきセットのサンプル成分は未だ無い。

次に、移動（Ｉ）の結果としてプレロードチャンネル１３内に移動されたサンプル成分は、ロードチャンネル１２に向けて逆方向に送り返され、次にそれらのサンプル成分の少なくとも一部は、（II）で示される移動に従って、ロードチャンネル１２に沿ってロード廃棄ウェル３に向けて移動し、ロードチャンネル／分離チャンネル交差部１６を占領する。このように、（Ｉ）と（II）で示される移動の組み合わせのため、サンプル成分は一般に、ロードチャンネル１２を交差部１６に至るまで、交差部１６に、及び交差部１６を超えて満たすだろうし、また、プレロードチャンネル１３にも見出されてもよい。

３番目のタイプのサンプル成分の移動は、（III）で示される。前にロードチャンネル／分離チャンネル交差部１６に移動したサンプル成分は、分離チャンネル１４内に導入され、そして分離廃棄ウェル１に向けて移動される。サンプル成分が分離チャンネル１４に沿って移動している時に成分は分離され検出される。これらの様々な移動のタイミング、連携及び継続時間は、さらに図６及び７と併せて説明する。

移動の（Ｉ）及び（III）は、移動経路が交差又はオーバーラップしないので、同時に実施することができる。（Ｉ）及び（III）のそれぞれの移動に先行するステップ、チャンバ１１における反応周期（（Ｉ）に先行する）、及び移動（II）（（III）に先行する）もまた、これらの事象が他を妨げそうにないので、同時に実施することができる。同時の事象の対のどちらも実施するのにほぼ同じ量の時間を必要としない限り、常により短い事象をより長い事象の時間内に実施することができる。例えば、もし移動（II）が反応周期よりも短い時間で起こるなら、そのとき移動（II）は、例えば、（ｉ）反応周期とほぼ同時に開始するが早期に終了することができる、（ii）反応周期中にその２つがほぼ同時に終了するように開始することができる、又は（iii）１つの反応周期内に開始し終了することができる。しかし、注意すべきことは、短い事象の一部が、より長い事象の実施に必要な時間外に起きなくもないことである。特に、別の事象の対が大よそ時間内で等しくない場合、４つの事象の相対的タイミングは、１つの実施が他の実施を妨げない限り、同時に起こる事象の異なる組み合わせと異なってオーバーラップしてもよい。例えば、反応周期もまた移動（III）とオーバーラップしてもよい。他方、反応周期と移動（Ｉ）は恐らく妨害するだろうし、移動（Ｉ）と（II）、及び（II）と（III）は互いに妨害しあうことになる。それにもかかわらず、移動（Ｉ）と移動（III）のような１対の事象が大よそ同じ時間である範囲内で、そのとき他の対の事象である反応周期と移動（II）は両者とも、移動（Ｉ）及び（III）が起こらない時に起こるだろう。

図６Ａ〜６Ｃは、図５に関連して議論した（Ｉ）、（II）、及び（III）の移動を誘導するために、マイクロ流体デバイス中の様々な位置の間に電圧を印加するためのパターンを図示する。本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスにおいて、図６Ａ〜６Ｃに示される３つのパターンに従った電圧差ＶＤ１、ＶＤ２、及びＶＤ３の反復印加は、チャンバ１１からの一連のサンプル成分の迅速な分析をもたらす。図６Ａは、チャンバ１１とプレロード廃棄ウェル９の間の第１電圧ＶＤ１の印加を示す。チャンバ１１に付随する電極１１ｅは、チャンバ１１に位置するように図に示されるが、これは本明細書に記載されるデバイスの実施態様のために視覚的表現を単純化するためである。図１Ａに記載のデバイスに関して、チャンネル２０を介してチャンバ１１と電気化学的に連通しているウェル７の電極が、図６Ａに関連して説明されるように、第１電圧を印加するために一般的に用いられる。例えば、アニオン性の分析物成分をチャンバ１１からロードチャンネル１２に移動させるために、プレロード廃棄ウェル９にある電極９ｅはプラスにバイアスがかけられ（陽極）、チャンバ１１と電気化学的に接触している電極１１ｅはマイナスにバイアスがかけられる（陰極）。逆の分極は、カチオン性分析物成分にチャンバ１１からロードチャンネル１２内に及びそれに沿った移動を起こさせる。第１の電圧が印加されている間、チャンバ１１内の荷電した分析物成分はロードチャンネル１２に、そして次にプレロードチャンネル１３に移動することになる。図６Ａの第１電圧は、（ｉ）チャンバ１１に存在する最も移動の遅い分析物成分がプレロードチャンネル１３に移動できるような時間にわたって印加される。

図６Ａに示される第１電圧ＶＤ１の印加の次に、図６Ｂに示されるように、電極９ｅと電極３ｅの間の第２電圧ＶＤ２の印加は、荷電した分析物成分をプレロードチャンネル１３からロードチャンネル１２に戻し、ロード廃棄ウェル３に向けて移動させることになる。第２電圧は、サンプル成分が、プレロードチャンネル１３から、そして交差部１６に移動してしまうまでの時間印加される。

また、図６Ｂに示される第２電圧を印加した後に、分離先頭ウェル４の電極４ｅと分離廃棄ウェル１の電極１ｅの間の第３電圧ＶＤ３の印加は、図６Ｃに示すように、ロードチャンネル／分離チャンネル交差部１６内及び周辺に存在する荷電した分析物成分を、分離チャンネル１４に移動させる。ロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に存在する荷電した分析物成分は、分離チャンネル１４内に導入することができる。導入される物質は、厳密には、文字通りの２つのチャンネルの交差部内の分析物成分に限定されない。それよりむしろ、業界に知られるように、文字通りの２つのチャンネルの交差部及び交差部に隣接するロードチャンネル１２の部分に存在する分析物成分もまた、この工程で分離チャンネル１４に導入される。分析物成分が交差部領域から導入される範囲は、関連するウェルに印加される引き戻し電圧のタイミング及び大きさに依存する。第３電圧は、分離チャンネル１４において分析物成分の分離及び分析を行なうのに十分な時間印加される。必要な時間は、電界強度、分離媒体中の分析物の移動度、交差部１６から検出ポイントまでの距離などに依存する。これらの要因は、迅速な分離時間を好適な検出感度及び分解能を維持して最適化することができる。

図７Ａは、本発明に記載の反応を実施し反応生成物を定期的に測定する１つの方法における、ステップの順序及びタイミングについての例示的なプロトコルを図解する。プロトコルは、４種類のステップ:（ｉ）チャンバ内の反応周期；（ii）チャンバからプレロード廃棄ウェルの方向へのサンプル成分の移動；（iii）プレロードチャンネルからロード廃棄ウェルの方向へのサンプル成分の移動；及び（iv）分離分析を含む。図７Ａでは、５つの反応周期、及びそれに続くそれぞれの反応周期後生成した反応生成物の５つの分離分析が実施される。図から理解できるように、最初の反応周期の開始及び最後の分離分析の段階的縮小は別として、同時に実施される２つのステップがある。もしステップのいずれかのオーバーラップが無かったならば、全行程は６１０秒かかるだろう。本明細書に開示された方法によるデバイスで、この例で設定された時間パラメータに従って反応及び分離分析を行えば、５つのサイクルの全工程は、４７０秒で実施できる。

好適な反応周期は、例えば、反応液のインキュベートに関与する時間枠又は加熱プログラムを完了するのに必要な時間によって規定される。従って、一定温度で行われる反応は定期的にサンプリングしてもよい。時間は、一定であっても又は変動してもよい。又は、反応液の温度を上げそして下げるサーマルサイクルが反応周期を構成してもよい。サーマルサイクルは、ＰＣＲサイクルであってもよい。下記に図７Ｂでより詳細に説明されるように、反応周期の間に、複数回のサーマルサイクルが行われてもよい。図６Ａ〜６Ｃに記載されるように、移動ステップ（ii）及び（iii）及び分離ステップ（iv）は、第１の電圧、第２の電圧及び第３の電圧の印加に対応する。図７Ａに示されるように、反応周期は３０秒であり、第１の電圧は５０秒間、第２の電圧は１０秒間、そして第３の電圧は５０秒間の長さで印加される。

図７Ａに図解されたプロトコルは、最初に反応周期、続いてサンプル成分をチャンバ１１からロードチャンネル１２を通り、そしてプレロード廃棄ウェル９に向けてプレロードチャンネル１３に移動させるために、第１の時間の第１の電圧ＶＤ１の印加を含む。

次に、第２の反応周期が実施され、その第２の反応周期の間に、サンプル成分をプレロードチャンネル１３からロード廃棄ウェル３に向けて交差部１６に移動させるために、第２の時間、第２の電圧ＶＤ２が印加される。この時点で、チャンバ内容物は次の分析のために抜き取られる準備ができており、前の反応周期のサンプル成分はロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動されており、分離分析のための準備ができている。

従って、この時点で第１の電圧ＶＤ１がチャンバ１１とプレロード廃棄ウェル９の間に印加され、そして第３の電圧ＶＤ３が分離先頭ウェル４と分離廃棄ウェル１の間に印加される。図示されるように、これら２つの工程は並列で実施される。第１の電圧及び第３の電圧は、ほぼ同時に印加が開始されればよい。

分離分析パラメータ（例えば、分析物の移動速度、検出器までの距離など）及び反応周期パラメータ（例えば、サーモサイクラー温度、時間、ランプ速度など）の調節によって、これらの時間がほぼ同時に終了するように調整できる。ほぼ同時にこれらのステップを終了させることによって、新しく生成された反応生成物をチャンバ１１からプレロード廃棄ウェル９に向けて移動する次のステップを即座に開始できる。

図７Ａは、５つの反応周期及び５つの分離分析から成る例示的なプロトコルを示すが、反応周期及び分離分析の数は、実験の必要に応じて自由に調整できる。例えば、チャンバ内の反応液の内容物について一連の少なくとも２、５、１０、１５、２０又は２５、又は５０もの分離分析を行ってもよい。最初の分離分析の前に、任意の数の反応周期を実施することができる。分離分析の開始を遅らせることで、生成物の量がより容易に測定されるレベルに増加させればよい。いくつかの実施態様では、生成物ピークが閾値を超えて検出されたとき、又は生成物ピークの検出後の所定の回数の反応周期の後、分析は停止される。

分離分析は、反応周期毎に代わって、１つおき、又は３つの反応周期毎、又は任意の特定の反応周期のセットの後でも実施することができる。反応周期は、すべてが同じ継続時間である必要は無く、必要又は要望に応じて変化させることができる。反応がＰＣＲのような核酸増幅反応の場合、生成された産物の量を分析する前に、約８から約１７のサーモサイクルを行えばよい。その後に、生成物の量は、例えば、毎サーモサイクルの後、又は一つおきのサーモサイクルの後に分析すればよい。実施されるサーモサイクルの総数は、検出感度、増幅効率、及び予測される標的の量、並びにチャンバの体積及び分析チャンネルネットワークの体積に応じて、約３５回から約４５回であればよい。アッセイサンプル中に予測される標的分析物の量が多ければ、より少ないサイクル数で十分であってもよい。

表１の原理は、図７Ａの実施態様にも適用することができる。このように、全体の分析時間は、同様のやり方で実施されるサーモサイクル及びＣＥ分離分析の回数を調整することによって、短縮することができる。時間短縮の度合いは、もちろんアッセイに適用される反応及び分離パラメータに依存する。

図７Ｂは、２つの反応サイクルが実施されそして２つのサイクルの第２のものから生じる生成物が測定される実施態様の、ステップの順序及びタイミングのための例示的なプロトコルを図解する。換言すれば、図７Ｂでは、１つおきの反応サイクルが分析される。プロトコルはまた以下の同じ４種類のステップ：（ｉ）チャンバ内の反応周期、（ii）チャンバからロード廃棄ウェルの方向へのサンプル成分の移動、（iii）プレロードチャンネルからプレロード廃棄ウェルの方向へのサンプル成分の移動、及び（iv）分離分析を含む。図７Ｂでは、６つの反応周期、及びそれに続く１つおきの３つの反応周期後生成した反応生成物の分離分析が示される。図７Ｂから理解できるように、図７Ａと比較したとき、余分な反応周期が正常に行われる第１のものに続いて直接挿入され、それに続くステップは第２の反応周期の終わりを待つ。図７Ａの実施態様で５つのサイクル及び５つの分析を完全に処理するために必要な時間は４７０秒であるのに対して、図７Ｂの実施態様では、６つの反応サイクル及び１つおき（３つ）の分析には４３０秒しかかからないことになる。さらなる時間短縮はより多いサイクル数で達成されることになる。

実施例１ ＰＣＲ反応
１−１．デバイス
ＰＣＲ−ＣＥマイクロ流体デバイスは、ラミネート加工によって接合された射出成型ポリカーボネート基板およびポリカーボネートフィルム（GE Plastics社、125 μm Lexan 8010）から製造した。マイクロ流体デバイスの設計は図１Ａに示す。デバイス全体の寸法は、約４５．５ｍｍ×２５．５ｍｍ×５．５ｍｍである。反応チャンバは、約３５０μｍの深さ及び約２５μＬの体積を有する。ロードチャンネル、プレロードチャンネル、分離チャンネル、及びサイド・チャンネルは、それぞれ約３０μｍの深さ及び４０μｍの幅である。電極は、ラミネート加工する前にポリカーボネートフィルム上にプリントされたスクリーンであった。製造されたとき、電極は、基板／フィルムラミネート加工デバイスのウェルに添加される溶液と接触する位置に配置される。

１−２．ＰＣＲ反応液
Ｅ. ｃｏｌｉ配列を増幅させるためのプライマーは、以下の配列を合成し、プライマー対として用いた：
配列番号１：（順方向プライマー）５’−ATCTATGACTGTACGCCACTGTCCCTAG
配列番号２：（逆方向プライマー）５’−GCCTAGCAAACTCGGAAGATT

ＰＣＲ反応液は、以下の組成に調製した: １×Ｔａｑ緩衝液、ＭｇＣｌ_２（３ｍＭ）、Fermentas Taqポリメラーゼ（１．５Ｕ／２５μＬ）、プライマー（それぞれ０．４μＭ）、ｄＮＴＰ（０．４ｍＭ）、及びＢＳＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）。増幅標的配列（１００塩基）は、Ｅ. ｃｏｌｉゲノムに含まれる。Ｅ. ｃｏｌｉゲノムＤＮＡは、１０，０００コピー／２５μＬ反応液の濃度で、鋳型として添加した。

１−３．デバイスのロード
実施例１−１のマイクロ流体デバイスは、実施のために以下のように準備した。分析チャンネルネットワークは、ＴＡＰＳ緩衝液（２００ｍＭ）ｐＨ８、ポリジメチルアクリルアミド篩マトリックス（２．５％）、及びエチジウムブロミド二量体蛍光色素を含む分離ゲルで満たした。実施例１−２のＰＣＲ反応液（２５μＬ）を、アクセス・ウェル６にロードし、毛細管作用でチャンバ１１に送達させた。ウェル７は、ＰＣＲ緩衝液で満たした。他のウェルは、分離ゲル又はマーカー又は焦点用色素で満たした。試薬の分配は、以下の表に示した。最後に、１５μＬのシリコーン油（２０ｃｓｔ）をウェル５及び６（反応チャンバへの注入口）ならびにウェル７に添加した。

ゲル緩衝液：ＭｇＣｌ_２（３ｍＭ）、ＴＡＰＳ（２００ｍＭ）、ｐＨ８．０；
ゲル：ＰＤＭＡ３１−１４６（２．５％）、ＥｔｈＤのゲル緩衝液溶液（０．１５μＭ）；
焦点用色素：５−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（０．２μＭ）、ＥｔｈＤのゲル緩衝液溶液（０．１５μＭ）；
マーカー：Fermentas社製 NoLimits ＤＮＡ：１５、３００、５００ｂｐのゲル緩衝液溶液（各１ｎｇ／μＬ）；
ＰＣＲ緩衝液：１×Ｔａｑ緩衝液、ＭｇＣｌ_２（３ｍＭ）、ｄＮＴＰ（０．４ｍＭ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１００ｍｇ／ｍＬ）。

ロードされたマイクロ流体デバイスは、熱電ヒーター／冷却モジュールに接続された平らな銅板から成るサーマルサイクリング装置（Model HV56, Nextreme, Durham, NC）（図示されない）上に置いた。その内容全体が本明細書に組み込まれている、Liらの米国公開特許第２０１０／０２００４０２号（出願番号第１２／６００１７１号）に開示されている一種の圧力マニホールドを、マイクロ流体デバイスのウェル上におろし、全てのウェルを耐圧にシールにした。２０ｐｓｉの圧力をマニホールド装置を通してすべてのウェルに均等に加えた。

１−４．デバイス操作
実施例１−３で用意したロードされたマイクロ流体デバイスのリアルタイムＰＣＲ−ＣＥ分析は、以下のように実施した。ＰＣＲサーモサイクリングのプロトコルは、次の一連の、変性、アニーリング及び伸長の温度と時間でプログラム化した：
サイクル１：９８℃で６０秒間、５８℃で１４秒間、及び７７℃で８秒間；
サイクル２〜１６：９８℃で７秒間、６２℃で１４秒間、及び７７℃で８秒間；
サイクル１７〜最後：９８℃で７秒間、６２℃で１４秒間、及び７７℃で３９秒間。

初めに、１６サイクルを実施した。次に、サイクル１７を発端に、各ＰＣＲサイクル後に、電気泳動によってＰＣＲ反応液のサンプル成分をチャンバから取り出し、分離チャンネルに移動し、そして電気泳動によって分析した。各ウェルの電極における電位又は電流は、以下のプロトコルに従ってコントロールした：

第１、第２、及び第３のステップは、図３Ａ〜３Ｃに図示したように、第１の電圧、第２の電圧、及び第３の電圧の印加に対応する。プロトコルは、ＰＣＲサイクル１７のスタートから２９秒後に開始した。第１ステップの電位及び電流コントロールは１０秒間適用し、第２ステップの条件は２１秒間適用し、及び第３ステップの条件は２９秒間適用し、そして次に、第１、第２、及び第３ステップ用の電位及び電流コントロールの同じプロトコルを、ＰＣＲ反応の最後まで繰り返した。

１−５．結果
実施例１−４に記載のＰＣＲ及び電気泳動のプロトコルを実施することによって、反応生成物のサンプルは、サイクル１７で始まる各サイクルの後に取り出し、キャピラリー電気泳動分析に付した。サイクル２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６の生成物を分析する電気泳動図は、図８Ａ（左から右、上段から下段に）に示した。サイクル２０を分析した電気泳動図では、左上に、３つのマーカーのピークがはっきり見える。３つのピークは、それぞれ１５、３００及び５００の塩基対マーカーである。予想される増幅産物（１００塩基対）のピークは、矢印で示した。予想される増幅産物のピークは、右上の電気泳動図（サイクル２４を分析）では辛うじて確認できたが、示された最後の電気泳動図（サイクル３６を分析）では明確に確認できた。

図８Ｂは、同じ実験に関して、生成物の成長曲線、即ちサイクル数の関数としての増幅産物の量を示す。

図９Ａは、上記のように実施した一連の実験についての成長曲線を示し、ここで実験に含まれる標的ＤＮＡの量は、２５μＬ当たり１０^１、１０^２、１０^３及び１０^４であった。結果は、本明細書に記載されたデバイス、方法、及びシステムを用いることによって、最小のコピー数である１０コピーさえ検出されたことを示している。図９Ｂは、図９Ａで報告された実験で添加されたコピー数の対数に対する閾値の交差部のプロットを示す。データは線形相関を有する。

実施例２ ＲＴ−ＰＣＲ反応
２−１．デバイス
実施例１-１に記載のデバイスを使用した。

２−２．ＲＴ−ＰＣＲ反応液
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びＭＳ２バクテリオファージ、ＲＮＡファージを増幅させるためのプライマーを準備し、ＲＴ−ＰＣＲ反応液に含めた。さらに、この実施例では、それぞれのプライマーの１つのプライマーは、蛍光色素５−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識した。
ＨＣＶプライマー：
配列番号３：５’−（TAMRA）-GAAAGCGTCTAGCCATGGCGT−３’
配列番号４：５’−CTCGCAAGCACCCTATCAGGCA−３’
ＭＳ２プライマー：
配列番号５：５’−GGTATAGTGTGGGAAAAGGTG−３’
配列番号６：５’−（TAMRA）-ACGAGAACGAACTGAGTAAAG−３’

アッセイは２つの内部コントロールを有するように設計した。ＭＳ２ＲＮＡファージは、ＲＮＡ抽出及び精製工程のコントロールの役割をする。ファージＲＮＡのＭＳ２プライマーによって３８０ｂｐ増幅産物生成を成功裏に増幅させることは、アッセイ手順がＨＣＶウイルス粒子からＨＣＶＲＮＡを抽出するのに十分であったことを示す。ＲＴ−ＰＣＲアッセイ用の内部コントロールとしてＭＳ２バクテリオファージを使用することは、DreierらによりJournal of Clinical Microbiology, 2005, Vol. 43(9), p. 4551−4557に記載されている。ＨＣＶプライマー対によって増幅することができる配列を組み入れたプラスミドもまた反応液（下記）に含まれる。このように、ＨＣＶプライマー対は、もしサンプル中にＨＣＶが存在すれば、ＨＣＶプライマー対は２つの異なる増幅産物：内部コントロールプラスミドからの1つの生成物、及びＨＣＶウイルス粒子からの１つ、を生成することになる。それぞれの増幅産物の長さは、内部コントロールに対しては４４０ｂｐ及びＨＣＶに対しては２５０ｂｐである。内部コントロールプラスミドからの増幅産物の出現は、ＰＣＲ反応に対する適切な条件をコントロールする。

ＲＴ−ＰＣＲ反応液は、以下の組成で調製した：
ＰＣＲ緩衝液（下記参照）
１×ｄＮＴＰ ０．４ｍＭ
ＫＯＤエキソ(−)ポリメラーゼ（東洋紡社） ０．０５μｇ／μＬ
ＨＣＶプライマー ０．４μＭ（それぞれ）
ＭＳ２プライマー ０．１μＭ（それぞれ）
ＤＭＳＯ ５％
ＨＣＶウイルス粒子 ５０〜５０，０００コピー／３０μＬ
ＭＳ２ウイルス粒子 ４０，０００コピー／３０μＬ
ＰＣＲ内部コントロールプラスミド 〜１，０００コピー／３０μＬ
HCV High Positive Control ウイルス粒子は、世界保健機構標準 NIBSC 96/798に較正された製品であり、Acrometrix社(Benicia, CA)から入手した。ＭＳ２バクテリオファージ、１５５９７−Ｂ１株は、Virapur社(San Diego, CA)から入手した。

成分は、混ぜ合わせ、徹底的にボルテックス撹拌し、そして短時間遠心し、３０μＬを、ＲＴａｓｅ酵素、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤、反応緩衝液、追跡用色素（tracking dye）及び特許化された安定化剤の凍結乾燥混合物の入ったBioneer RT premix tube, K-2041（Bioneer社、Alameda, CA）に移した。チューブの内容物を室温に１分間放置し、次にボルテックス撹拌して短時間遠心し、そして２８μＬの内容物をデバイスのチャンバに移した。

２−３．デバイスのロード
実施例２−１のマイクロ流体デバイスは、操作のために以下のように準備した。分析チャンネルネットワークは、ｐＨ８のＴＡＰＳ緩衝液（２００ｍＭ）、及びポリジメチルアクリルアミドマトリックス（３％）を含む分離ゲルで満たした。まず、分離ゲル（１５μＬ）をウェル１に添加し、ウェル１にかかる陽圧を用いてゲルをチャンネルネットワークの中に導入した。次いで分離ゲル（１５μＬ）をウェル３、４、及び９のそれぞれに添加した。次に、１５μＬの焦点用色素をウェル２に添加し、そして次に１５μＬのＤＮＡマーカー溶液をウェル８に添加した。実施例２−２のＰＣＲ反応液（２８μＬ）はウェル５を経由してチャンバに添加した。チャンバが完全に満たされた後、１５μＬの分離ゲル緩衝液をウェル７に添加し、そして軽い圧力を１０秒間ウェル７に加えた。最後に、１５μＬのシリコーン油（２０ｃｓｔ）をウェル５及び６（反応チャンバへの導入口）及びウェル７に添加した。

試薬の分配は表にまとめ、その下に溶液成分を記載した。

焦点用色素：５−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）のゲル緩衝液溶液（０．２μＭ）；
ゲル緩衝液：ＭｇＣｌ_２（３ｍＭ）、ＴＡＰＳ（２００ｍＭ）、ｐＨ８．０；
ゲル：ＰＤＭＡ３１−１４６のゲル緩衝液溶液（３％）；
ＰＣＲ緩衝液：１×ＫＯＤ緩衝液、ＭｇＣｌ_２（３ｍＭ）、ＴＡＰＳ（２００ｍＭ）（ｐＨ８．０）、Ｐｒｏｃｌｉｎ ３００（０．２％）
ＤＮＡマーカー：ＴＡＭＲＡで標識した３００及び５００塩基対のｄｓＤＮＡのゲル緩衝液溶液（それぞれ１ｎｇ／μＬ）。
ロードされたマイクロ流体デバイスを、実施例１−３に記載されるようにサーマルサイクラ―装置に取り付けた。

２−４．デバイス操作
実施例２−３によって準備したロードされたマイクロ流体デバイスのリアルタイムＲＴＰＣＲ−ＣＥ分析を、以下のように実施した。
逆転写酵素（ＲＴ）反応を、マイクロ流体デバイスを４２℃で２０分間インキュベートすることによって行った。
ＰＣＲサーモサイクリングのプロトコルを、次の一連の、変性、アニーリング、及び伸長の温度と時間で実施した：
サイクル１〜１４：１０１℃で７秒間、６０℃で１４秒間、及び７４℃で８秒間；
サイクル１５〜４０：１０１℃で７秒間、６２℃で１４秒間、及び７７℃で３９秒間。
最初の１４サイクルを実施した後、サイクル１５から始め、各ＰＣＲサイクルの後、ＰＣＲ反応液中のサンプル成分を電気泳動によってチャンバから取り出し、分離チャンネルに移動し、そして電気泳動によって分析した。各ウェルの電極における電位又は電流は、以下のプロトコルに従ってコントロールした：

第１、第２、及び第３のステップは、図３Ａ〜３Ｃに図示したように、第１の電圧、第２の電圧、及び第３の電圧の印加に対応する。プロトコルは、ＰＣＲサイクル１５のスタートから２９秒後に開始した。電位及び電流コントロールの第１ステップは１０秒間適用し、第２ステップの条件は２１秒間適用し、そして第３ステップの条件は２９秒間適用し、そして次いで、第１、第２、及び第３ステップ用の電位及び電流コントロールの同じプロトコルを、ＰＣＲ反応の終わりまで繰り返した。

２−５．結果
実施例２−４に記載のＰＣＲ及び電気泳動のプロトコルを実施することにより、反応生成物のサンプルは、サイクル１５で始まる各サイクルの後に取り出され、キャピラリー電気泳動分析に付された。サイクル２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、及び３１によって生成された生成物を分析した電気泳動図を、図１０Ａ（左から右、上段から下段に）に示した。サイクル２３の生成物を分析する電気泳動図では、左上に、２つのマーカーのピークがはっきり見える。２つのピークは、それぞれ３００及び５００の塩基対マーカーである。予想される増幅産物（１００塩基対）のピークを、矢印で示す。予想されるＨＣＶ増幅産物のピークは、右上の電気泳動図（サイクル２５で生成）で、辛うじて確認できる。ＭＳ２及び内部コントロール（ＩＣ）のピークは、サイクル２８を始めとして明白である。

ＨＣＶ標的、ＭＳ２コントロール、及びＰＣＲ内部コントロールに対するピークの成長は、ＲＮＡがウイルス粒子から抽出され、ＲＮＡがＲＴによってＤＮＡに変換され、ＤＮＡがＰＣＲによって増幅され、そして増幅産物生成物が反応チャンバから抜き出され、分離チャンネルに移送され、ＣＥで成功裏に分析されたことを示す。

図１０Ｂは、生成物及び２つのコントロールの成長曲線、即ち、同じ実験のためのサイクル数の関数としての増幅産物の量を示す。図１０Ｂに見られるように、増幅産物の量が２の閾値と交差するときのサイクル数（Ｃｑ）は，ＨＣＶで２８．０、ＰＣＲ内部コントロールで３０．６、及びＭＳ２で３３．６であった。

実施例３ １サイクルおきにサンプリングするＰＣＲ反応
３−１．デバイス
実施例１-１に記載のデバイスを使用した。

３−２．ＰＣＲ反応液
バクテリオファージ−λゲノムの２００塩基領域を増幅するためのプライマーを、下記の配列を合成し、ＰＣＲ反応液を調製するために使用した。逆方向プライマーは、蛍光色素５−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識した。
ファージ−λプライマー：
配列番号７：（順方向プライマー）５’−CGGGATAACACGCTCACCATGA
配列番号８：（逆方向プライマー）５’−TAMRA-GGCCAGACCGAGCCTTCAATAC

ＰＣＲ反応液を、以下の組成で調製した：１×ＰＣＲ緩衝液（下記参照）、ｄＮＴＰ（０．４ｍＭ）、ＫＯＤエキソ(−)ポリメラーゼ（０．０５μｇ／μＬ）、Prpcline 300（０．２％） （Superico, 48912-U）、CHAPS （１％）（Dojindo Laboratories, C-008）、Olfine（０．１％）（Nissin社、 AK-02）、順方向プライマー（０．２μＭ）、逆方向プライマー（０．２μＭ）。Sigma-Aldrich社から入手したλ−ファージＤＮＡ（製品番号Ｄ９７６８）を、鋳型として、１０,０００コピー／２５μＬ反応液の濃度で添加した。

３−３．デバイスのロード
実施例３−１のマイクロ流体デバイスを、操作のために以下のように準備した。分析チャンネルネットワークを、実施例２−３で説明したように、ｐＨ８のＴＡＰＳ緩衝液（２００ｍＭ）及びポリジメチルアクリルアミド篩マトリックス（３％）を含む分離ゲルで満たした。実施例３−２のＰＣＲ反応液（２５μＬ）をアクセス・ウェル６にロードし、毛細管作用でチャンバ１１に送達させた。ウェル７を、ＰＣＲ緩衝液で満たした。シリコーン油（１５μＬ、２０ｃｓｔ）をウェル５及び６（反応チャンバへの注入口）及びウェル７に添加した。他のウェルを、以下の表に示した試薬の分配によって示されるように分離ゲル又はマーカー又は焦点用色素で満たした。

焦点用色素：５−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）のゲル緩衝液溶液（０．２μＭ）；
ゲル緩衝液：ＭｇＣｌ_２（３ｍＭ）、ＴＡＰＳ（２００ｍＭ）、ｐＨ８．０；
ゲル：ＰＤＭＡ３１−１４６のゲル緩衝液溶液（３％）；
ＰＣＲ緩衝液：１×ＫＯＤ緩衝液、ＭｇＣｌ_２（３ｍＭ）、ＴＡＰＳ（２００ｍＭ）（ｐＨ８．０）、Ｐｒｏｃｌｉｎｅ ３００（０．２％）
ＤＮＡマーカー：ＴＡＭＲＡで標識した３００及び５００塩基対のｄｓＤＮＡのゲル緩衝液溶液（それぞれ１ｎｇ／μＬ）。
ロードされたマイクロ流体デバイスは、実施例１−３に記載されるようにサーマルサイクラ―装置に取り付けた。

３−４．デバイス操作
実施例３−３で準備したロードされたマイクロ流体デバイスのリアルタイムＰＣＲ−ＣＥ分析を、以下のように実施した。ＰＣＲサーモサイクリングのプロトコルを、次の一連の、変性、アニーリング、及び伸長の温度と時間でプログラミングした：
サイクル１：１０４℃で１２０秒間、６３．８℃で１４秒間、及び７４．５℃で８秒間、
サイクル２〜１６：１０１℃で７秒間、６３．８℃で１４秒間、及び７４．５℃で８秒間、
サイクル１７：１０１℃で７秒間、６３．８℃で１４秒間、及び７４．５℃で５９秒間、
以下を終わりまで繰り返す、
サイクル１８（偶数）：１０１℃で７秒間、６３．８℃で１４秒間、及び７４．５℃で３９秒間、
サイクル１９（奇数）：１０１℃で７秒間、６３．８℃で１４秒間、及び７４．５℃で８秒間。

最初に、１７サイクルを実施した。次いで、サイクル１８及び１９から始まり、各偶数ＰＣＲサイクル（対のサイクルの第一のサイクル、例えば、１８、２０など）の後、ＰＣＲ反応液のサンプル成分を２９秒の電気泳動によってチャンバから取り除き、分離チャンネルに移動し、そして電気泳動によって分析した。タイミング図は、図４Ｃに反映される。各ウェルの電極における電位又は電流を、以下のプロトコルに従ってコントロールした：

第１、第２、及び第３のステップは、図３Ａ〜３Ｃに図示したように、第１の電圧、第２の電圧、及び第３の電圧の印加に対応する。プロトコルは、ＰＣＲサイクル１８のスタートから２９秒後に開始した。電位及び電流コントロールの第１ステップを１０秒間適用し、第２ステップの条件を２１秒間適用し、そして第３ステップの条件を２９秒間適用し、そして次いで、第１、第２、及び第３ステップ用の電位及び電流コントロールの同じプロトコルを、ＰＣＲ反応の終わりまで繰り返した。

３−５．結果
実施例３−４に記載のＰＣＲ及び電気泳動のプロトコルを実施することによって、反応生成物のサンプルは、サイクル１８で始まる偶数サイクルの後に取り出し、マイクロ流体デバイス中のキャピラリー電気泳動によって分析した。サイクル１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、及び３４の生成物を分析する一連の電気泳動図を、図１１Ａに示した。電気泳動図で、ＤＮＡマーカーのピークは約２５秒（３００ｂｐマーカー）及び３０秒（５００ｂｐマーカー）で見てすぐに分かる。約１５秒のピークはプライマーであり、２００ｂｐの標的増幅産物（矢印で示す）は約２２秒に現れる。予想される増幅産物のピークは、上部中央の電気泳動図（サイクル２０の生成物）では辛うじて確認できるが、示された最後の電気泳動図（サイクル３４の生成物）では電気泳動図を支配していた。図１１Ｂは、ＰＣＲサイクルの関数とした標的増幅産物量の成長曲線を示し、４回の繰り返し実験から方法の再現性を明示している。

本発明は、特定の実施態様及び適用に関して説明されているが、当業者は、本明細書に開示された本発明の適用の範囲及び方法を理解するだろう。

Claims (20)

1. チャンバ；チャンバからロード廃棄ウェルに通じるロードチャンネル；分離先頭ウェル（head well）から分離廃棄ウェルに通じ、ロードチャンネルと交差する分離チャンネル；及びロードチャンネルと分離チャンネルの交差部（ロードチャンネル／分離チャンネル交差部）とチャンバとの間に位置するロードチャンネルからプレロード廃棄ウェルに通じるプレロードチャンネル、を含むマイクロ流体デバイス内で、サンプル成分を分析するための方法であって、その方法は以下のステップを含み、且つ下記ステップ（ｃ）と（ｄ）は、少なくとも部分的に時間内でオーバーラップする、上記方法：
   （ａ）アッセイ溶液をチャンバに加える；
   （ｂ）第１の長さの時間、チャンバとロード廃棄ウェルの間に第１の電圧を印加し、（ｉ）アッセイ溶液から最初に取り出され、そして予めロードチャンネルに移動したサンプル成分の第１のセットを、ロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動させ、且つ（ii）アッセイ溶液から二度目に取り出されたサンプル成分の第２のセットをチャンバからロードチャンネルに移動させる；
   （ｃ）ステップ（ｂ）の後、第２の長さの時間、チャンバとプレロード廃棄ウェルの間に第２電圧を印加して、アッセイ溶液からの二度目のサンプル成分の第２のセットをチャンバから取り出しプレロード廃棄ウェルに向けてロードチャンネルへ移動させ続ける；及び
   （ｄ）ステップ（ｂ）の後、第３の長さの時間、分離先頭ウェルと分離廃棄ウェルの間に第３の電圧を印加して、サンプル成分の第１のセットをロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域から分離チャンネルに導入し、分離チャンネル内のサンプル成分の第１のセットの分析を行う。
2. ステップ（ｃ）は、ステップ（ｄ）が終了する前に終了する、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）が終了する時に開始する、請求項２に記載の方法。
4. ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）が終了する時に開始する、請求項３に記載の方法。
5. ステップ（ｂ）は、ステップ（ｄ）が終了した後に繰り返される、請求項２に記載の方法。
6. ステップ（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）のサイクルが、少なくとも１０回繰り返される、請求項５に記載の方法。
7. ステップ（ａ）の後で、チャンバ内で少なくとも１つの核酸増幅反応を行うことをさらに含んでなる請求項１に記載の方法であって、下記一連のステップ（ｂ）〜（ｅ）が少なくとも２回繰り返され：
   ステップ（ｂ）；
   ステップ（ｃ）；
   ステップ（ｄ）；及び
   ステップ（ｅ）：ステップ（ｃ）の終わりに開始する少なくとも1回の増幅サイクルを行う；
   ここで：
   一連のステップが最初に実施されるときは、ステップ（ｄ）は場合により除外され；
   次の一連のステップは、ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）が終った後に開始し；
   そして場合により、一連のステップが繰り返される最後のときは、その一連のステップはステップ（ｂ）及びステップ（ｄ）だけを含む；上記方法。
8. 請求項７に記載の方法であって；
   ステップ（ｃ）及びステップ（ｄ）は、各ステップ（ｂ）が終わるときに開始し；そして
   各ステップ（ｃ）の終わりに始まる１サイクルの増幅サイクルは、各ステップ（ｅ）で行なわれる；上記方法。
9. チャンバ；チャンバからロード廃棄ウェルに通じるロードチャンネル；分離先頭ウェルから分離廃棄ウェルに通じ、ロードチャンネルと交差する分離チャンネル；及びチャンバとロードチャンネル／分離チャンネル交差部の間の位置のロードチャンネルからプレロード廃棄ウェルに通じるプレロードチャンネルを含むマイクロ流体デバイス内で、サンプル成分を分析するための方法であって、その方法は以下のステップを含む、上記方法：
   （ａ）アッセイ溶液をチャンバに加える；
   （ｂ）分離先頭ウェルと分離廃棄ウェルの間に、第１の長さの時間、第１の電圧を印加し、予めロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動した最初のアッセイ溶液からのサンプル成分の第１のセットを分離チャンネルに導入し、そして分離チャンネル内のサンプル成分の第１のセットの分析を行う；
   （ｃ）チャンバとプレロード廃棄ウェルの間に、第２の長さの時間、第２の電圧を印加し、２度目のアッセイ溶液からのサンプル成分の第２のセットを、チャンバからロードチャンネルを経由してプレロードチャンネルに移動させる；
   （ｄ）ステップ（ｂ）の後、プレロード廃棄ウェルとロード廃棄ウェルの間に、第３の長さの時間、第３の電圧を印加し、サンプル成分の第２のセットをプレロードチャンネルからロードチャンネルに、そしてロードチャンネル／分離チャンネル交差部領域に移動させる。
10. ステップ（ｂ）と（ｃ）は少なくとも部分的に時間内でオーバーラップする、請求項９に記載の方法。
11. ステップ（ｂ）と（ｃ）がほぼ同時に開始する、請求項１０に記載の方法。
12. ステップ（ｃ）はステップ（ｂ）が終了する前に終了する、請求項１１に記載の方法。
13. ステップ（ｃ）はステップ（ｄ）が終了した後繰り返される、請求項１２に記載の方法。
14. ステップ（ｂ）はステップ（ｄ）が終了した後に繰り返され、それによって次のサンプルの分離チャンネルへの導入及び分析が開始される、請求項１１に記載の方法。
15. ステップ（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）のサイクルが少なくとも１０回繰り返される、請求項１４に記載の方法。
16. サンプル成分が電気泳動によって移動する、請求項９に記載の方法。
17. サンプルが少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、請求項９に記載の方法。
18. ステップ（ａ）の後チャンバ内で少なくとも１つの核酸増幅反応を行うことをさらに含む、請求項９に記載の方法。
19. 請求項１８に記載の方法であって、下記一連のステップ（ｂ）〜（ｅ）が少なくとも２回繰り返され：
    ステップ（ｂ）；
    ステップ（ｃ）；
    ステップ（ｄ）；そして
    ステップ（ｅ）：ステップ（ｃ）の終わりに開始する少なくとも1回の増幅サイクルを行う；
    ここで：
    一連のステップが最初に実施されるときは、ステップ（ｂ）は場合により除外され；
    次の一連のステップはステップ（ｄ）後に開始されステップ（ｅ）で終る；
    そして場合により、一連のステップが繰り返される最後のときは、その一連のステップはステップ（ｂ）だけを含む；上記方法。
20. 請求項１９に記載の方法であって；
    ステップ（ｂ）及びステップ（ｃ）は、ほぼ同時に開始し；そして
    各ステップ（ｃ）の終わりに始まる１サイクルの増幅サイクルは、各ステップ（ｅ）で行なわれる；上記方法。

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