CN114867868A - 用于检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的引物组、及使用了该引物组的方法、以及用于该方法的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种即使存在于试样中的分枝杆菌属的浓度(拷贝数)存在差异，也能够检测它们的方法，并涉及“一种引物组，其包含：(i)由序列号1所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号2所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的结核分枝杆菌检测用引物对；(ii)由序列号3所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号4所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的鸟分枝杆菌检测用引物对；及(iii)由序列号5所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号6所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的胞内分枝杆菌检测用引物对。”。

Description

用于检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的引物 组、及使用了该引物组的方法、以及用于该方法的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的引物组、及使用了该引物组的方法、以及用于该方法的试剂盒。
背景技术
结核病、非结核性抗酸菌病等抗酸菌病为在全世界蔓延的细菌性疾病，其特征为全身的疲倦感、食欲不振、发烧等症状。已知结核病及非结核性抗酸菌病是由作为抗酸菌的一种的分枝杆菌(Mycobacterium)属引起的。结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的，非结核性抗酸菌病主要是由鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)及胞内分枝杆菌(Mycobacterium int racellulare)引起的。
并且，在结核病和非结核性抗酸菌病中，治疗药物等不同，因此区分结核病和非结核性抗酸菌病在临床上是重要的。
以往，为了区分结核病和非结核性抗酸菌病，主要使用在固态培养基上分离并培养被检体的方法。
然而，在该方法中，结核病的诊断需要约3周，非结核性抗酸菌病的诊断需要约4周左右，因此无法快速区分它们。
因此，近年来，随着分子遗传学的发展，开发了一种利用了聚合酶链反应(PCR)等核酸扩增法的快速方法(专利文献1-专利文献3)。
这些专利文献1-专利文献3的方法为分别检测有无结核分枝杆菌、有无鸟分枝杆菌及有无胞内分枝杆菌的方法。
然而，如上所述，由结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌引起结核病、非结核性抗酸菌病等抗酸菌病，因此在进行适当的治疗的方面，期望同时检测有无这3个菌种。
作为同时检测有无结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的方法，已知有使用对在分枝杆菌属之间共同保存的序列进行退火的引物及与结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的特异性序列分别进行杂交的探针的方法(专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4905130号公报
专利文献2：日本专利第6166806号公报
专利文献3：日本专利第5958498号公报
专利文献4：日本特开平6-261757号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
然而，上述专利文献4的方法例如具有如下问题：在源自受试者的试样中所包含的分枝杆菌属的种类之间存在浓度差异(拷贝数之差)的情况下，无法适当地检测存在于试样中的分枝杆菌属。具体而言，例如，在试样中以低浓度(例如，4拷贝/μL)存在结核分枝杆菌，且分别以高浓度(例如，400拷贝/μL)存在鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的情况下，源自在试样中以最低浓度存在的结核分枝杆菌的核酸的扩增量远远少于源自在试样中以最高浓度存在的鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的核酸的扩增量，因此难以检测结核分枝杆菌。
上述问题起因于专利文献4的方法中的引物的性质。即，这是因为：该引物设计成对在分枝杆菌属之间共同保存的序列进行退火，因此优先对源自在试样中以最高浓度存在的鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的核酸进行退火，其结果，该核酸优先扩增。因此，在专利文献4的方法中，即使结核分枝杆菌组在于试样中，也难以检测其。
由以上内容，期望开发一种即使存在于试样中的分枝杆菌属(结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌)的浓度(拷贝数)存在差异，也能够检测它们的方法。
本发明的课题在于提供一种即使存在于试样中的分枝杆菌属(结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌)的浓度(拷贝数)存在差异，也能够检测它们的方法。
用于解决技术课题的手段
本发明是为了解决上述课题而完成的，包括以下结构。
[1]
一种引物组，其包含：
(i)由序列号1所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号2所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的结核分枝杆菌检测用引物对；
(ii)由序列号3所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号4所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的鸟分枝杆菌检测用引物对；及
(iii)由序列号5所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号6所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的胞内分枝杆菌检测用引物对。
[2]
根据[1]所述的引物组，其中，
所述(i)、(ii)及(iii)的正向引物和反向引物中的至少一者分别用标记物质标记。
[3]
根据[1]或[2]所述的引物组，其中，
所述标记物质从荧光物质、放射性同位素或酶中选择。
[4]
一种结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的检测方法，其通过如下方式来进行：使用[1]至[3]中任一项所述的引物组，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测所获得的核酸扩增产物。
[5]
一种试剂盒，其包含：
(i)由序列号1所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号2所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的结核分枝杆菌检测用引物对；
(ii)由序列号3所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号4所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的鸟分枝杆菌检测用引物对；及
(iii)由序列号5所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号6所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的胞内分枝杆菌检测用引物对。
[6]
根据[5]所述的试剂盒，其中，
所述(i)、(ii)及(iii)的正向引物和反向引物中的至少一者分别用标记物质标记。
发明效果
根据本发明的用于检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的引物组、及使用了该引物组的方法、以及用于该方法的试剂盒，即使存在于试样中的分枝杆菌属(结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌)的浓度(拷贝数)存在差异，也能够检测它们。
附图说明
图1是实施例1中所获得的、基于使用了靶不存在下的各种引物组的核酸扩增反应(PCR)的检测结果。
图2是实施例2中所获得的、基于使用了靶存在下的引物组3的核酸扩增反应(PCR)的检测结果。
图3是比较例1(比较例1-1)中所获得的、基于使用了靶存在下的公知的引物对及探针的核酸扩增反应(PCR)的检测结果。
图4是比较例1(比较例1-2)中所获得的、基于使用了靶存在下的公知的引物对及探针的核酸扩增反应(PCR)的检测结果。
图5是比较例1(比较例1-3)中所获得的、基于使用了靶存在下的公知的引物对及探针的核酸扩增反应(PCR)的检测结果。
图6是比较例1(比较例1-4)中所获得的、基于使用了靶存在下的公知的引物对及探针的核酸扩增反应(PCR)的检测结果。
图7是比较例1(比较例1-5)中所获得的、基于使用了靶存在下的公知的引物对及探针的核酸扩增反应(PCR)的检测结果。
图8是比较例1(比较例1-6)中所获得的、基于使用了靶存在下的公知的引物对及探针的核酸扩增反应(PCR)的检测结果。
图9是比较例1(比较例1-7)中所获得的、基于使用了靶存在下的公知的引物对及探针的核酸扩增反应(PCR)的检测结果。
图10是实施例3中所获得的、构成引物组3的结核分枝杆菌检测用引物对的最佳浓度的检验结果。
图11是实施例3中所获得的、构成引物组3的鸟分枝杆菌检测用引物对的最佳浓度的检验结果。
图12是实施例3中所获得的、构成引物组3的胞内分枝杆菌检测用引物对的最佳浓度的检验结果。
具体实施方式
＜本发明的用于检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的引物组＞
本发明的用于检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的引物组(以下，有时简称为本发明的引物组。)包含：
(i)由序列号1所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号2所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的结核分枝杆菌检测用引物对(以下，有时简称为本发明所涉及的结核检测用引物对)；
(ii)由序列号3所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号4所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的鸟分枝杆菌检测用引物对(以下，有时简称为本发明所涉及的鸟检测用引物对。)
及
(iii)由序列号5所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号6所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的胞内分枝杆菌检测用引物对(以下，有时简称为本发明所涉及的胞内检测用引物对。)。
[本发明所涉及的结核检测用引物对]
本发明所涉及的结核检测用引物对由序列号1所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号2所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成。
由序列号1所表示的碱基序列构成的正向引物(GenbankID：CP023640.1，碱基编号889765～889784)和由序列号2所表示的碱基序列构成的反向引物(GenbankID：CP023640.1，碱基编号889925～889946)分别对结核分枝杆菌的碱基序列中序列号7所表示的碱基序列(GenbankID：CP023640.1，碱基编号889765～889946)进行退火。
因此，若使用本发明所涉及的结核检测用引物对和源自结核分枝杆菌的DNA等含核酸试样进行PCR等核酸扩增反应，则上述序列号7所表示的碱基序列被扩增。
[本发明所涉及的鸟检测用引物对]
本发明所涉及的鸟检测用引物对由序列号3所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号4所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成。
由序列号3所表示的碱基序列构成的正向引物(GenbankID：CP000479.1，碱基编号829817～829835)和由序列号4所表示的碱基序列构成的反向引物(GenbankID：CP000479.1，碱基编号829684～829703)分别对鸟分枝杆菌的碱基序列中序列号8所表示的碱基序列(GenbankID：CP000479.1，碱基编号829684～829835)进行退火。
因此，若使用本发明所涉及的鸟检测用引物对和源自鸟分枝杆菌的DNA等含核酸试样进行PCR等核酸扩增反应，则上述序列号8所表示的碱基序列被扩增。
[本发明所涉及的胞内检测用引物对]
本发明所涉及的胞内检测用引物对由序列号5所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号6所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成。
由序列号5所表示的碱基序列构成的正向引物(GenbankID：CP023149.1，碱基编号3015253～3015271)和由序列号6所表示的碱基序列构成的反向引物(GenbankID：CP023149.1，碱基编号3015059～3015076)分别对胞内分枝杆菌的碱基序列中序列号9所表示的碱基序列(GenbankID：CP023149.1，碱基编号3015059～3015271)进行退火。
因此，若使用本发明所涉及的胞内检测用引物对和源自胞内分枝杆菌的DNA等含核酸试样进行PCR等核酸扩增反应，则上述序列号9所表示的碱基序列被扩增。
本发明的引物组中的本发明所涉及的结核检测用引物对、鸟检测用引物对及胞内检测用引物对的浓度(最终浓度)如下述表1所示。
另外，上述引物对的浓度(最终浓度)是指构成引物对的正向引物及反向引物各自在PCR等核酸扩增反应液中的浓度。例如，在引物对的浓度为400nM的情况下，是指构成该引物对的正向引物及反向引物的浓度在PCR等核酸扩增反应液中分别为400nM。以下，在本说明书中相同。
[表1]
Figure BDA0003699525810000071
并且，本发明的引物组中的本发明所涉及的结核检测用引物对、鸟检测用引物对及胞内检测用引物对的浓度比率(最终浓度比率)如下述表2所示。
另外，下述表2表示仅由本发明所涉及的结核检测用引物对、鸟检测用引物对及胞内检测用引物对构成的本发明的引物组中的各引物对的浓度比率(最终浓度比率)。
上述浓度比率(最终浓度比率)表示将整体的浓度设为100％时各引物对各自所占的浓度(％)。并且，下述表中，“约”是指达到指定的值的+/-1％的范围。以下，在本说明书中相同。
[表2]
Figure BDA0003699525810000081
作为获得构成本发明所涉及的结核检测用引物对、鸟检测用引物对及胞内检测用引物对(以下，有时简称为本发明所涉及的引物对。)的引物(以下，有时简称为本发明所涉及的引物。)的方法，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出通过亚磷酰胺法等化学合成法制备的方法、通过使用载体等的基因操作法获得的方法等，优选通过化学合成法制备的方法。
本发明所涉及的引物优选用标记物质标记。具体而言，例如，优选正向引物及反向引物中的至少一者用标记物质标记。更具体而言，例如，若为本发明所涉及的结核检测用引物对，则只要由序列号1所表示的碱基序列构成的正向引物及由序列号2所表示的碱基序列构成的反向引物中的至少一者用标记物质标记即可。若为本发明所涉及的鸟检测用引物对，则只要由序列号3所表示的碱基序列构成的正向引物及由序列号4所表示的碱基序列构成的反向引物中的至少一者用标记物质标记即可。并且，若为本发明所涉及的胞内检测用引物对，则只要由序列号5所表示的碱基序列构成的正向引物及由序列号6所表示的碱基序列构成的反向引物中的至少一者用标记物质标记即可。
作为用于用标记物质标记本发明所涉及的引物的标记物质，只要是通常在该领域中使用的本身公知的物质，则可以是任何物质，具体而言，例如，可举出荧光物质、放射性同位素、酶等，优选荧光物质。
作为上述荧光物质，例如，可举出TAMRATM(Sigma-Aldrich Co.LLC制造)、Alexa555、Alexa647(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)、Cyanine Dye系Cy3、Cy5(GEHealthcare制造)、荧光素等，优选TAMRATM。
作为上述放射性同位素，例如，可举出32P、33P、35S等。
作为上述酶，例如，可举出碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等。
用标记物质标记的本发明所涉及的引物中，标记物质可以与引物直接结合，也可以经由连接体结合。作为连接体，只要是在该领域中通常使用的连接体即可，具体而言，例如，优选1～3个碱基的核酸，更优选1～3个碱基的DNA，进一步优选2个碱基的DNA，尤其优选腺嘌呤(A)-腺嘌呤(A)这2个碱基。
作为用荧光物质标记本发明所涉及的引物的方法，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出根据本身公知的方法将用荧光素标记的核苷酸掺入到引物中的方法等。
作为用放射性同位素标记本发明所涉及的引物的方法，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出通过掺入用放射性同位素标记的核苷酸来标记的方法等。具体而言，可举出随机引物法、缺口平移法、基于T4多核苷酸激酶的5’末端标记法、基于末端脱氧核苷酸转移酶的3’末端标记法等。
作为用酶标记本发明所涉及的引物的方法，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出使碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶分子与要标记的引物直接共价结合的直接标记法等。
＜本发明的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的检测方法＞
本发明的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的检测方法(以下，有时简称为本发明的检测方法。)通过如下方式来进行：使用本发明的引物组，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应(以下，有时简称为本发明所涉及的扩增工序。)，检测所获得的扩增产物(以下，有时简称为本发明所涉及的检测工序。)。
[本发明所涉及的试样]
作为本发明所涉及的试样，只要是结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌可能存在的活体试样，则可以是任何试样，具体而言，例如，可举出喀痰、唾液、肺灌洗液、胃液、全血、血浆、血清、尿液、粪便、皮肤、胰液等，优选喀痰、唾液、肺灌洗液及胃液，更优选喀痰。
对于本发明所涉及的试样，可以在供于本发明的检测方法之前，进行存在于该试样中的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的浓缩、分离、及从结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌中提取、纯化核酸等操作。
存在于上述试样中的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的浓缩、分离、及结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的浓缩及分离，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出过滤、离心分离等。
上述结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的核酸的提取及纯化，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出：破坏结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的细胞壁之后，用苯酚及氯仿进行处理的方法；及用乙醇、异丙醇等醇进行处理的方法。
另外，作为破坏结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的细胞壁的方法，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出：使用SDS等表面活性剂、硫氰酸胍等蛋白质变性剂的方法；及通过玻璃珠等物理性地破碎的方法等。
[本发明所涉及的核酸]
本发明所涉及的核酸是指源自存在于上述试样中的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的核酸，且为DNA或RNA，优选为DNA。
另外，在核酸为RNA的情况下，可以通过逆转录反应合成互补的DNA(cDNA)，并附加到后述的本发明所涉及的扩增工序。
[本发明所涉及的扩增工序]
关于本发明所涉及的扩增工序，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的核酸扩增反应进行即可，具体而言，例如，可举出PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶链式反应)法、TMA(Transcription-mediated amplification：转录媒介增幅反应)法、SDA(Strand Displacement Amplification：链置换扩增)法等，优选PCR法。
作为本发明所涉及的扩增工序中所使用的试剂，只要是通常在该领域中使用的本身公知的试剂，则可以是任何试剂，具体而言，例如，可举出Taq聚合酶等核酸合成酶、dNTP等核酸合成基质、Tris缓冲液、TAPS缓冲液等缓冲液、MgCl2、KCl、(NH4)2SO4等的盐等。
而且，除了上述试剂以外，还能够使用聚乙二醇、Triton(The Dow Chem icalCompany制造)、Nonidet(Shell Chemical Co.,Ltd.制造)、CHAPS(DOJINDO LABORATORIES制造)、Tween等表面活性剂、ProClin等防腐剂、BSA(牛血清白蛋白)等多肽等。
在本发明所涉及的扩增工序中，除了本发明的引物对以外，还可以使用用于检测内控物的引物对进行扩增反应。
作为该内控物，只要是除了结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌以外的菌类即可，可举出枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、艰难梭菌等菌类，优选枯草芽孢杆菌。作为用于检测该枯草芽孢杆菌的引物对，优选由序列号21所表示的碱基序列构成的正向引物和由序列号22所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成。
并且，构成用于检测作为内控物选择的菌类的引物对的引物可以分别用标记物质标记。具体而言，例如，只要该引物对中的正向引物及反向引物中的至少一者用标记物质标记即可。
另外，标记物质及用标记物质标记的方法如＜本发明的引物组＞中所述，具体例、优选例等也相同。
[本发明所涉及的检测工序]
关于本发明所涉及的检测工序，只要根据通常在该领域中进行的本身公知的方法进行即可，具体而言，例如，可举出终点法、实时法等，优选实时法。
终点法是指在使用了本发明的引物对的核酸扩增反应之后分离并检测所获得的扩增产物的方法。
另一方面，实时法是指在该核酸扩增反应中实时检测通过使用了本发明的引物对的核酸扩增反应获得的扩增产物的方法。
作为上述终点法及实时法的具体方法，可举出(a)标记引物法、(b)嵌入法及(c)标记探针法，优选(a)标记引物法。
(a)标记引物法
(a)标记引物法例如如下。
“进行使用用标记物质标记了各引物对中的至少一者的本发明的引物组且以试样中的核酸作为模板的核酸扩增反应。接着，核酸扩增反应之后，将所获得的扩增产物分别进行分离，分别检测该扩增产物中的标记(终点法)、或分别实时检测每进行1～3个循环的核酸扩增反应获得的扩增产物中的标记(实时法)。
其结果，(i)在检测到由本发明所涉及的结核检测用引物对扩增的扩增产物的源自标记的荧光的情况下，判定为“该试样为结核分枝杆菌阳性”。
(ii)在检测到由本发明所涉及的鸟检测用引物对扩增的扩增产物的源自标记的荧光的情况下，判定为“该试样为鸟分枝杆菌阳性”。
(iii)在检测到由本发明所涉及的胞内检测用引物对扩增的扩增产物的源自标记的荧光的情况下，判定为“该试样为胞内分枝杆菌阳性”。”
作为标记引物法中的“实时检测”方法，可以暂时将每进行1～3个循环的核酸扩增反应获得的扩增产物进行分离之后，检测该扩增产物的源自标记的荧光。
另外，本说明书中的“检测标记”是指根据标记物质的性质直接或间接地测定标记物质。
作为(a)标记引物法中的分离，具体而言，例如，可举出电泳、高速液相色谱(HPLC)法等本身公知的方法，优选电泳。
作为上述电泳，具体而言，例如，可举出毛细管电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺电泳(平板电泳)、淀粉凝胶电泳、等电点电泳等，优选毛细管电泳。
另外，在进行毛细管电泳的情况下，例如，只要根据WO2007/027495、WO2011/118496、WO2008/075520等中所记载的本身公知的方法进行即可。
(b)嵌入法
关于(b)嵌入法，在用终点法进行的情况下，例如如下。
“进行使用本发明的引物组且以试样中的核酸作为模板的核酸扩增反应。然后，将所获得的扩增产物分别进行分离。接着，用嵌入剂对该扩增产物进行染色，检测源自该嵌入剂的荧光。
其结果，(i)在检测到由本发明所涉及的结核检测用引物对扩增的扩增产物中的源自嵌入剂的荧光的情况下，判定为“该试样为结核分枝杆菌阳性”。
(ii)在检测到由本发明所涉及的鸟检测用引物对扩增的扩增产物中的源自嵌入剂的荧光的情况下，判定为“该试样为鸟分枝杆菌阳性”。
(iii)在检测到由本发明所涉及的胞内检测用引物对扩增的扩增产物中的源自嵌入剂的荧光的情况下，判定为“该试样为胞内分枝杆菌阳性”。”
并且，关于(b)嵌入法，在用实时法进行的情况下，如下。
“进行使用本发明的引物组及嵌入剂且以试样中的核酸作为模板的核酸扩增反应。接着，分别检测源自与所获得的扩增产物的扩增量相关地嵌入的嵌入剂的荧光。
其结果，(i)在检测到由本发明所涉及的结核检测用引物对扩增的扩增产物中的源自嵌入剂的荧光的增大的情况下，判定为“该试样为结核分枝杆菌阳性”。
(ii)在检测到由本发明所涉及的鸟检测用引物对扩增的扩增产物中的源自嵌入剂的荧光的增大的情况下，判定为“该试样为鸟分枝杆菌阳性”。
(iii)在检测到由本发明所涉及的胞内检测用引物对扩增的扩增产物中的源自嵌入剂的荧光的增大的情况下，判定为“该试样为胞内分枝杆菌阳性”。”
作为嵌入法中的分离，如(a)标记引物法中所述，具体例、优选例等也相同。
作为嵌入法中的嵌入剂，只要是通常在该领域中使用的本身公知的嵌入剂，则可以是任何嵌入剂，具体而言，例如，可举出WO2017/170376中所记载的嵌入剂，其中，优选SYTOX(商标)系色素[例如，SYBR Gold(商标)、SYBR Green I(商标)、SYBR Green II(商标)、SYTOX Green(商标)、SYTOX Blue(商标)、SYTOX Orange(商标)(均由Thermo FisherScientific K.K.制造)]。
(c)标记探针法
关于(c)标记探针法，在用终点法进行的情况下，例如如下。
“进行使用本发明的引物组且以试样中的核酸作为模板的核酸扩增反应。然后，将所获得的扩增产物分别进行分离。接着，通过用氢氧化钠等碱性溶液对该扩增产物进行处理，分别形成单链。接着，通过使该扩增产物和具有与该扩增产物的全部或一部分碱基序列互补的碱基序列且用标记物质标记的探针进行杂交，形成混合体，并分别检测该混合体中的标记。
其结果，(i)在检测到源自与由本发明所涉及的结核检测用引物对扩增的扩增产物进行杂交的探针的标记的情况下，判定为“该试样为结核分枝杆菌阳性。”。
(ii)在检测到源自与由本发明所涉及的鸟检测用引物对扩增的扩增产物进行杂交的探针的标记的情况下，判定为“该试样为鸟分枝杆菌阳性。”。
(iii)在检测到源自与由本发明所涉及的胞内检测用引物对扩增的扩增产物进行杂交的探针的标记的情况下，判定为“该试样为胞内分枝杆菌阳性。”。”
作为标记探针法中的标记物质及用标记物质标记的方法，如＜本发明的引物组＞中所述，具体例、优选例等也相同。
并且，关于(c)标记探针法，在用实时法进行的情况下，例如如下。
“进行使用本发明的引物组及荧光标记探针且以试样中的核酸作为模板的核酸扩增反应。接着，分别检测所获得的扩增产物中的源自探针的荧光。
其结果，(i)在检测到源自与由本发明所涉及的结核检测用引物对扩增的扩增产物进行杂交的探针的荧光的增大的情况下，判定为“该试样为结核分枝杆菌阳性。”。
(ii)在检测到源自与由本发明所涉及的鸟检测用引物对扩增的扩增产物进行杂交的探针的荧光的增大的情况下，判定为“该试样为鸟分枝杆菌阳性。”。
(iii)在检测到源自与由本发明所涉及的胞内检测用引物对扩增的扩增产物进行杂交的探针的荧光的增大的情况下，判定为“该试样为胞内分枝杆菌阳性。”。”
另外，所谓上述荧光标记探针，设计成与通过使用了本发明所涉及的引物对的核酸扩增反应扩增的区域进行杂交，并且例如用荧光色素(报告荧光色素)标记了其5’末端且例如用淬灭色素标记了3’末端。
作为标记探针法中的分离，如(a)标记引物法中所述，具体例、优选例等也相同。
[本发明的检测方法的具体例]
以下，对本发明的检测方法的具体例进行说明。
首先，根据本身公知的方法，从试样(例如，喀痰)中提取核酸(例如，DNA)。
接着，通过化学合成法(例如，亚磷酰胺法)，分别合成本发明所涉及的结核检测用引物对、鸟检测用引物对及胞内检测用引物对。然后，通过本身公知的方法，分别用标记物质(例如，荧光物质)标记上述引物对中的至少一者。
接着，使用上述核酸及引物对，进行如下所示的核酸扩增反应(例如，PCR)。
即，制备含有构成各200nM～400nM的本发明所涉及的结核检测用引物对的引物、构成各700nM～900nM的本发明所涉及的鸟检测用引物对的引物、构成各500nM～700nM的本发明所涉及的胞内检测用引物对的引物、0.5mM～5mM的盐(例如，MgCl2)、0.05mg/mL～10mg/mL的多肽(例如，BSA)、各0.1mM～2mM的核酸合成基质(例如，dATP、dCTP、dGT及dTTP)及0.5U/mL～100U/mL的核酸合成酶(例如，Taq聚合酶)的pH7～10的1～300mM的缓冲液(例如，Tris缓冲液或TAPS缓冲液)，将其作为核酸扩增反应用液。接着，在该反应液5μL～100μL中加入上述核酸0.01ng～1000ng，将其作为核酸扩增反应用试样。
接着，在下述条件下，通过热循环仪等核酸扩增装置，进行核酸扩增反应(例如，PCR法)。
核酸扩增反应(例如，PCR)条件：
在93℃～98℃下加热10秒～3分钟之后，以(1)93℃～98℃、1秒～30秒→(2)50℃～70℃、5秒～30秒→(3)60℃～80℃、3秒～30秒作为1个循环，进行30～50个循环。
接着，实时检测每进行1～3个循环的核酸扩增反应获得的扩增产物中的标记。
其结果，(i)在检测到由本发明所涉及的结核检测用引物对扩增的扩增产物的源自标记的荧光的情况下，判定为“该试样为结核分枝杆菌阳性”。
(ii)在检测到由本发明所涉及的鸟检测用引物对扩增的扩增产物的源自标记的荧光的情况下，判定为“该试样为鸟分枝杆菌阳性”。
(iii)在检测到由本发明所涉及的胞内检测用引物对扩增的扩增产物的源自标记的荧光的情况下，判定为“该试样为胞内分枝杆菌阳性”。
＜本发明的用于检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的试剂盒＞
本发明的用于检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的试剂盒(以下，有时简称为本发明的试剂盒。)包含本发明的引物组。
本发明的试剂盒需要(A)本发明的引物组，但是例如可以包含下述(B)、(C)、(D)、(E)、(F)或/和(G)。
(B)：内控物检测用引物对
(C)：消毒液
(D)：核酸提取相关试剂
(E)：核酸扩增相关试剂
(F)：电泳相关试剂
(G)：说明书
(B)：内控物检测用引物对
(B)所谓内控物检测用引物对，用于检测作为内控物选择的菌类，具体而言，例如，可举出用于检测枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、艰难梭菌等的引物对，优选用于检测枯草芽孢杆菌的引物对，更优选由序列号21所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号22所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的引物对。
(C)：消毒液
(C)所谓消毒液，用于对存在于试样中的分枝杆菌属(结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌等)及作为内控物选择的菌类进行杀菌，具体而言，例如，优选含有2-丙醇等醇。并且，优选在上述消毒液中包含作为内控物选择的菌类。
(D)：核酸提取相关试剂
(D)所谓核酸提取相关试剂，用于从存在于试样中的分枝杆菌属(结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌等)中提取核酸，可举出核酸结合液、核酸溶出液、核酸清洗液等。
作为核酸结合液，具体而言，例如优选含有胍盐酸盐等蛋白质变性剂、Tris缓冲液、Tris/EDTA缓冲液(TE缓冲液)或/和源自鲑鱼精巢的脱氧核糖核酸钠盐。
作为核酸溶出液，具体而言，例如优选含有Tris缓冲液等缓冲液或/和Pro Clin等防腐剂。
并且，作为核酸清洗液，具体而言，例如优选含有氯化钠等盐、Tris缓冲液等缓冲液、乙醇等醇或/和Tween等表面活性剂。
(E)：核酸扩增相关试剂
(E)所谓核酸扩增相关试剂，用于进行PCR等核酸扩增反应，具体而言，例如优选Tris缓冲液、TAPS缓冲液等缓冲液、核酸合成基质、核酸合成酶、ProClin等防腐剂或/和BSA等多肽等。
(F)：电泳相关试剂
(F)所谓电泳相关试剂，用于对通过核酸扩增反应获得的核酸扩增产物进行电泳，具体而言，例如，可举出电泳用缓冲液、聚合物溶液、电泳用标记等。
作为电泳用缓冲液，具体而言，例如优选MgCl2等盐、TAPS等缓冲液、甘油等醇或/和ProClin等防腐剂。
作为聚合物溶液，具体而言，例如优选含有聚乙二醇、纤维素衍生物、琼脂糖、聚丙烯酰胺、具有源自二甲基甲酰胺的单体单元的聚合物等高分子聚合物。
作为电泳用标记，具体而言，例如优选已知分子量的核酸(DNA等)。
(G)：说明书
(G)所谓说明书，通过文章、图表等实质上记载有本发明的检测方法的特征、原理、操作步骤、判定步骤等，具体而言，例如优选本发明的试剂盒的操作说明书、附件、小册子等。
作为本发明的试剂盒，优选将上述(A)～(G)分别容纳于单独容器(管等)。
＜本发明所涉及的辅助抗酸菌病的诊断的方法＞
本发明所涉及的辅助抗酸菌病的诊断的方法(以下，有时简称为本发明所涉及的辅助方法。)通过如下方式来进行：根据本发明的检测方法的结果来判定受试者是否患有抗酸菌病(以下，有时简称为本发明所涉及的判定工序。)。
[本发明所涉及的判定工序]
本发明所涉及的判定工序根据本发明的检测方法的结果，例如以下述方式进行。
即，(i)在检测到源自由本发明所涉及的结核检测用引物对扩增的产物的信号(荧光等)的情况下，判定“源自该试样的受检者有可能患有抗酸菌病(结核病)或患有抗酸菌病(结核病)的可能性高”等。并且，(ii)在未检测到源自由本发明所涉及的结核检测用引物对扩增的产物的信号(荧光等)的情况下，判定“源自该试样的受检者不可能患有抗酸菌病(结核病)或患有抗酸菌病(结核病)的可能性低”等。
(i’)在检测到源自由本发明所涉及的鸟检测用引物对扩增的产物的信号(荧光等)的情况下，判定“源自该试样的受检者有可能患有抗酸菌病(非结核性抗酸菌病)或患有抗酸菌病(非结核性抗酸菌病)的可能性高”等。并且，(ii’)在未检测到源自由本发明所涉及的鸟检测用引物对扩增的产物的信号(荧光等)的情况下，判定“源自该试样的受检者不可能患有抗酸菌病(非结核性抗酸菌病)或患有抗酸菌病(非结核性抗酸菌病)的可能性低”等。
并且，(i”)在检测到源自由本发明所涉及的胞内检测用引物对扩增的产物的信号(荧光等)的情况下，判定“源自该试样的受检者有可能患有抗酸菌病(非结核性抗酸菌病)或患有抗酸菌病(非结核性抗酸菌病)的可能性高”等。并且，(ii”)在未检测到源自由本发明所涉及的胞内检测用引物对扩增的产物的信号(荧光等)的情况下，判定“源自该试样的受检者不可能患有抗酸菌病(非结核性抗酸菌病)或患有抗酸菌病(非结核性抗酸菌病)的可能性低”等。
根据本发明所涉及的辅助方法，能够进行高准确度(灵敏度/特异性)的抗酸菌病(结核病或/和非结核性抗酸菌病)的诊断。
＜本发明所涉及的治疗抗酸菌病的方法＞
所谓本发明所涉及的治疗抗酸菌病的方法(以下，有时简称为本发明所涉及的治疗方法。)，通过如下方式来进行：根据本发明所涉及的辅助方法的结果来实施适当的治疗(以下，有时简称为本发明所涉及的治疗工序。)。
[本发明所涉及的治疗工序]
关于本发明所涉及的治疗工序，分为如下情况，以下分别进行说明：(i)判定为受检者有可能患有结核病或患有结核病的可能性高；(ii)判定为受检者有可能患有非结核性抗酸菌病或患有非结核性抗酸菌病的可能性高；或(iii)判定为受检者有可能患有结核病及非结核性抗酸菌病或患有结核病及非结核性抗酸菌病的可能性高。
(i)判定为受检者有可能患有结核病或患有结核病的可能性高的情况
在(i)的情况下，作为本发明所涉及的治疗工序，具体而言，例如，可举出通过服用利福平(通用名)、异烟肼(酰肼)(通用名)、链霉素(通用名)、乙胺丁醇(通用名)、吡嗪酰胺(通用名)等对结核病有效的抗生素来进行的药物治疗法、外科治疗法等。
(ii)判定为受检者有可能患有非结核性抗酸菌病或患有非结核性抗酸菌病的可能性高的情况
在(ii)的情况下，作为本发明所涉及的治疗工序，具体而言，例如，可举出通过服用克拉霉素(通用名)、乙胺丁醇(通用名)、利福平(通用名)等对非结核性抗酸菌病有效的抗生素来进行的药物治疗法、外科治疗法等。
(iii)判定为受检者有可能患有结核病及非结核性抗酸菌病或患有结核病及非结核性抗酸菌病的可能性高的情况
在(iii)的情况下，作为本发明所涉及的治疗工序，具体而言，例如，可举出通过分别服用对上述结核病有效的抗生素及对上述非结核性抗酸菌病有效的抗生素来进行的药物治疗法、外科治疗法等。
根据本发明所涉及的治疗方法，能够对判定为有可能患有抗酸菌病(结核病或/和非结核性抗酸菌病)或患有抗酸菌病(结核病或/和非结核性抗酸菌病)的可能性高的受试者实施适当的治疗。
＜本发明所涉及的用于辅助抗酸菌病的诊断的装置＞
所谓本发明所涉及的用于辅助抗酸菌病的诊断的装置(以下，有时简称为本发明所涉及的装置。)，至少具备(1)核酸扩增反应部及(2)检测部。而且，可以具备(3)核酸提取部、(4)判定部、(5)输出部及(6)输入部。
本发明所涉及的装置中的(1)核酸扩增反应部构成为可进行使用了本发明的引物组的核酸扩增反应。
本发明所涉及的装置中的(2)检测部构成为能够检测(1)核酸扩增反应部中所获得的核酸扩增产物。
另外，(1)核酸扩增反应部及(2)检测部可以分别独立地构成，也可以构成为一体，具体而言，例如，优选日本特开2018-89611号公报及日本特表2015-514994号公报中所记载的微流控器件。
本发明所涉及的装置中的(3)核酸提取部构成为能够从试样中提取或/和纯化核酸。具体而言，例如，优选构成为能够实施WO2016/079981中所记载的核酸的提取方法、WO2015/157650中所记载的核酸的纯化方法。
本发明所涉及的装置中的(4)判定部构成为能够根据由(2)检测部获得的结果来判定受试者是否患有抗酸菌病(结核病或/和非结核性抗酸菌病)。
本发明所涉及的装置中的(5)输出部构成为能够输出由(1)核酸扩增反应部、(2)检测部、(3)核酸提取部或/和(4)判定部获得的结果。
本发明所涉及的装置中的(6)输入部构成为能够向(1)核酸扩增反应部或/和(3)核酸提取部发送用于使该(1)核酸扩增反应部或/和(3)核酸提取部工作的信号。
根据本发明所涉及的装置，能够简便、短时间且高准确度地进行本发明所涉及的辅助方法。
以下，根据实施例对本发明进行具体说明，但是本发明不受这些实施例任何限定。
实施例
＜实施例1.靶不存在下的引物组的研究＞
通过进行使用了靶不存在下的各种引物组的核酸扩增反应，进行了各种引物组的研究。
(1)引物组
使用了下述表3所示的引物组。
[表3]
Figure BDA0003699525810000211
(2)试样(DNA)的制备
使用TE缓冲液(pH8.0)(NIPPON GENE CO.,LTD.制造)，将源自鲑鱼精的脱氧核糖核酸(Sigma-Aldrich Co.LLC制造)制备为10mg/mL，将其作为试样(DNA)。
(3)核酸扩增反应/检测
制备含有分别为400nM的上述引物组1中的各引物、1.5mM MgCl2、0.5mg/mL BSA、分别为0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP及60U/mL KOD Exo(-)(TOYOBO CO.,LTD.制造)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，将其作为PCR用反应液。
并且，使用引物组2、3或4中的各引物来代替引物组1中的各引物，以相同的方式制备了PCR用反应液。
接着，将在上述(2)制备的DNA分别悬浮于上述PCR用反应液25μL，以使最终量成为5μg，将其作为PCR用试样。
将上述各PCR用试样分别放入到96well plate(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)中，使用StepOnePlusTM(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)进行了PCR。
另外，关于PCR，在97℃下加热30秒之后，以(1)在97℃下为10秒→(2)在65℃下为20秒→(3)在72℃下为30秒作为1个循环，进行了40个循环。
PCR结束之后，使用全自动微芯片型毛细管电泳装置2100生物分析仪(AgilentTechnologies Japan,Ltd.制造)，根据设备附带的方案对所获得的各核酸扩增产物进行毛细管电泳，由此分别进行了所获得的扩增产物的分离、检测。
(4)结果
将通过上述(3)获得的结果示于图1。
另外，图1中的各条带表示检测到核酸扩增产物。
并且，在上述PCR用试样中不含源自结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的DNA。因此，在检测到表示检测到核酸扩增产物的条带的情况下，表示核酸被非特异性地扩增(获得了非特异性核酸扩增产物)。
根据图1明确可知，在引物组1、引物组2及引物组4中，检测到许多显示非特异性核酸的扩增的强度高的(深色的)条带。
尤其，已知在引物组1中观察到的存在于150碱基对附近的条带非常靠近由鸟分枝杆菌检测用引物对扩增的产物的位置，因此成为假阳性的可能性非常高。并且，已知在引物组2中观察到的存在于200碱基对附近的条带分别非常靠近由胞内分枝杆菌检测用引物对扩增的产物的位置，因此成为假阳性的可能性非常高。而且，已知在引物组4中观察到的存在于180碱基对附近的条带分别非常靠近由结核分枝杆菌检测用引物对扩增的产物的位置，因此成为假阳性的可能性非常高。
另一方面，在引物组3中，未检测到显示非特异性核酸的扩增的条带，当然条带未存在于由结核分枝杆菌检测用引物对、鸟分枝杆菌检测用引物对及胞内分枝杆菌检测用引物对扩增的产物的位置(150碱基对～200碱基对附近)。
由以上结果已知，根据引物组3，能够抑制非特异性核酸的扩增，因此成为假阳性的可能性非常低。
＜实施例2.结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的检测＞
使用实施例1中的引物组3，进行了结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的检测。
(1)引物组
使用了实施例1的引物组3。
(2)模板DNA的调整
根据本身公知的方法培养结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosisvar.BCG)、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌之后，使用本身公知的核酸纯化法获得了纯化基因组DNA。接着，使用SYBRTM Premix Ex TaqTM II(Takara Bio Inc.制造)，通过实时PCR装置(StepOnePlusTM(Thermo Fisher Scientific K.K.制造))计算出各纯化DNA的拷贝数。然后，使用TE缓冲液(pH8.0)(NIPPON GENE CO.,LTD.制造)，将上述纯化DNA分别制成结核分枝杆菌DNA、鸟分枝杆菌DNA及胞内分枝杆菌DNA。
(3)核酸扩增反应/检测
调整含有结核分枝杆菌检测用引物对(各引物300nM)、鸟分枝杆菌检测用引物对(各引物800nM)、胞内分枝杆菌检测用引物对(各引物600nM)、1.0mM MgCl2、0.2mg/mL BSA、分别为0.4mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、1U/mL Takara Ex Taq(Takara Bio Inc.制造)的缓冲液，将其作为PCR用反应液。
将在上述(3)制备的模板DNA分别悬浮于上述PCR用反应液25μL，以成为下述表4所示的浓度，将其作为PCR用试样。
[表4]
Figure BDA0003699525810000241
将上述PCR用试样放入到96well plate(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)中，使用StepOnePlusTM(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)进行了PCR。关于反应，在97℃下加热30秒之后，以(1)在97℃下为10秒→(2)在64℃下为10秒→(3)在72℃为20秒作为1个循环，进行了40个循环。
PCR结束之后，使用全自动微芯片型毛细管电泳装置2100生物分析仪(AgilentTechnologies Japan,Ltd.制造)，根据设备附带的方案对所获得的核酸扩增产物进行毛细管电泳，由此分别进行了所获得的核酸扩增产物的分离、检测。
(4)结果
将所获得的电泳的结果示于图2。
另外，图2中的各条带表示检测到核酸扩增产物。
根据图2明确可知，在实施例2-1～实施例2-7全部的情况下，分别检测到由结核分枝杆菌检测用引物对扩增的产物(182碱基对)的条带(条带a)、由鸟分枝杆菌检测用引物对扩增的产物(152碱基对)的条带(条带b)及由胞内分枝杆菌检测用引物对扩增的产物(213碱基对)的条带(条带c)。
尤其，如实施例2-2～实施例2-7那样，即使在结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌之间存在浓度(拷贝数)差异，也分别检测到它们的扩增产物的条带。
因此，已知通过使用引物组3，能够检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌。
而且，已知即使在结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌之间存在浓度(拷贝数)差异，也能够检测它们。
＜比较例1.基于现有方法的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的检测＞
进行了基于现有方法(专利文献4的方法)的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的检测。
(1)引物组及探针
使用了下述表5中所记载的引物组及探针。
另外，在结核分枝杆菌检测用探针中，用荧光物质(FAM)标记了由序列号18所表示的碱基序列构成的探针的5’末端且用荧光物质(TAMRATM)标记了3’末端。
在胞内分枝杆菌检测用探针中，用荧光物质(FAM)标记了由序列号19所表示的碱基序列构成的探针的5’末端且用荧光物质(TAMRATM)标记了3’末端。
并且，在鸟分枝杆菌检测用探针中，用荧光物质(FAM)标记了由序列号20所表示的碱基序列构成的探针的5’末端且用荧光物质(TAMRATM)标记了3’末端。
[表5]
Figure BDA0003699525810000261
(2)模板DNA的制备
以与实施例2的(2)相同的方式，分别制备了结核分枝杆菌DNA、鸟分枝杆菌DNA及胞内分枝杆菌DNA。
(3)核酸扩增反应/检测
调整含有各引物500nM、各探针280nM、1.0mM MgCl2、0.2mg/mL BSA、分别为0.4mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、1U/mL Takara Ex Taq(Takara Bio Inc.制造)的缓冲液，将其作为PCR用反应液。
将在上述(2)制备的DNA分别悬浮于上述PCR用反应液25μL，以成为下述表6所示的浓度，将其作为PCR用试样。
[表6]
Figure BDA0003699525810000271
将这些PCR用试样放入到96well plate(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)中，使用StepOnePlusTM(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)进行实时PCR，并实时检测出核酸扩增产物。关于反应，在97℃下加热30秒之后，以(1)在97℃下为10秒→(2)在64℃下为10秒→(3)在72℃为20秒作为1个循环，进行了40个循环。
(4)结果
将(3)的实时PCR的结果分别示于图3～图9。
另外，在图3～图9中，示出检测到以增大荧光强度为目的的核酸扩增产物。并且，在图3～图9中，1-1a～1-7a表示结核分枝杆菌的检测结果，1-1b～1-7b表示鸟分枝杆菌的检测结果，1-1c～1-7c表示胞内分枝杆菌的检测结果。
根据图3(比较例1-1)的结果明确可知，在结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的浓度相同的情况下，分别确认到荧光强度的增大(图3中的1-1a、1-1b及1-1c)。因此，能够分别检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌。
根据图4(比较例1-2)～图9(比较例1-7)的结果明确可知，在结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌之间存在浓度(拷贝数)差异的情况下，确认到源自以最高浓度(400拷贝/μL)存在的菌类的荧光强度的增大，但是未确认到源自以最低浓度(4拷贝/μL)存在的菌类的荧光强度的增大。
根据图4(比较例1-2)～图9(比较例1-7)已知，在现有方法(专利文献4的方法)中，在结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌中存在浓度(拷贝数)差异的情况下，无法适当地检测它们。换句话说，已知在现有方法(专利文献4的方法)中，有可能产生假阴性。
＜实施例3.引物组3中的各引物对的浓度的研究＞
进行了构成实施例1中的引物组3的各引物对的最佳浓度的研究。
(1)引物组
使用了实施例1中所使用的引物组3。
但是，在结核分枝杆菌检测用引物对中，用标记物质(TAMRATM)标记了由序列号2所表示的碱基序列构成的反向引物的5’末端。
在鸟分枝杆菌检测用引物对中，在由序列号3所表示的碱基序列构成的正向引物的5’末端附加连接体(腺嘌呤(A)-腺嘌呤(A))，进一步用标记物质(TAMRATM)标记了该5’末端。
并且，在胞内分枝杆菌检测用引物对中，在由序列号5所表示的碱基序列构成的正向引物的5’末端附加连接体(腺嘌呤(A)-腺嘌呤(A))，进一步用标记物质(TAMRATM)标记了该5’末端。
而且，将内控物(枯草芽孢杆菌)检测用引物对(正向引物：序列号21所表示的碱基序列、反向引物：序列号22所表示的碱基序列)与该引物组3一并使用。
(2)模板DNA的制备
以与实施例1的(2)相同的方式，分别制备了结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的DNA。
(3)核酸扩增反应/检测
调整含有下述表7所示的浓度的各引物对、1.5mM MgCl2、0.5mg/mL BSA、分别为0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、60U/mL Takara Ex Taq(Takara Bio Inc.制造)的10mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)，将其作为PCR用反应液。
另外，下述表7中的浓度比率表示结核分枝杆菌检测用引物对、鸟分枝杆菌检测用引物对及胞内分枝杆菌检测用引物对中的各引物对的浓度比率(％)。
[表7]
Figure BDA0003699525810000291
接着，将在上述(2)制备的DNA分别悬浮于上述PCR用反应液25μL，以分别成为0.08拷贝/μL，将其作为PCR用试样。
然后，使用全自动基因分析装置μTASWako g1(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)，根据装置的操作说明书，进行了使用了上述试样的核酸扩增反应(PCR)及电泳。
(4)结果
将(3)的结果分别示于图10～图12。图10～图12中的纵轴表示对同一实施例测定共计8次时成为阳性的比率(％)。并且，横轴表示引物组中的各引物对的浓度比率。
另外，在各实施例中，在同一个反应体系中进行了结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的检测，但是关于结果，分为图10(结核分枝杆菌)、图11(鸟分枝杆菌)及图12(胞内分枝杆菌)分别进行了记载。
并且，关于图10～图12中的各标绘的编号表示实施例3-1～实施例3-7中的哪一个，如下述表8所示。
[表8]
Figure BDA0003699525810000301
根据图10(实施例3-1～实施例3-7)、图11(实施例3-1～实施例3-7)及图12(实施例3-1～实施例3-7)明确可知，随着引物组中的各引物对的浓度比率上升而阳性率变高。
其中，已知结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的阳性率相等的临床上理想条件为实施例3-7的条件。
即，为结核分枝杆菌检测用引物对的浓度比率成为约18％(300nM)(图10中的2)、鸟分枝杆菌检测用引物对的浓度比率成为约47％(800nM)(图11中的6)及胞内分枝杆菌检测用引物对的浓度比率成为约35％(600nM)(图12中的6)的条件。已知，若为该条件，则结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的阳性率分别显示良好的值且为75％。
因此，启示了通过将结核分枝杆菌检测用引物对的浓度比率设定为约18％(300nM)、将鸟分枝杆菌检测用引物对的浓度比率设定为约47％(800nM)及将胞内分枝杆菌检测用引物对的浓度比率设定为约35％(600nM)，适合于实际临床现场中的使用。
根据上述实施例1～实施例3及比较例1的结果已知，通过使用引物组3，能够特异性且高精确度地检测有无结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌。并且，已知即使在结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌之间存在浓度(拷贝数)差异，也能够特异性且高精确度地检测它们。
产业上的可利用性
根据本发明的用于检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的引物组、及使用了该引物组的方法、以及用于该方法的试剂盒，即使存在于试样中的分枝杆菌属(结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌)的浓度(拷贝数)存在差异，也能够检测它们。
序 列 表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 用于检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌的引物组、及使用了该引物组的方法、以及用于该方法的试剂盒
<130> 2148PCT
<150> 2019-228461
<151> 2019-12-18
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 1
acctcaccta tgtgtcgacc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 2
aacgtctttc aggtcgagta cg 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 3
gtggaagggc aaaaacacc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 4
tggaaacagg gaacaagacc 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 5
gcaggagatc catcaggaa 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 6
cacgccagac caagacga 18
<210> 7
<211> 182
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<400> 7
acctcaccta tgtgtcgacc tgggcagggt tcgcctacgt ggcctttgtc accgacgcct 60
acgctcgcag gatcctgggc tggcgggtcg cttccacgat ggccacctcc atggtcctcg 120
acgcgatcga gcaagccatc tggacccgcc aacaagaagg cgtactcgac ctgaaagacg 180
tt 182
<210> 8
<211> 152
<212> DNA
<213> 鸟分枝杆菌
<400> 8
tggaaacagg gaacaagacc gaaccgtatt ccgggctgga ctggcgatgc gcccagtggc 60
tgcatgacca cgaggtcgcc gcggtcgcct cggacaacct gcaggtcgaa gacccggtgt 120
ccggcgtcga cggggtgttt ttgcccttcc ac 152
<210> 9
<211> 213
<212> DNA
<213> 胞内分枝杆菌
<400> 9
cacgccagac caagacgatc gacgaggtct tcaccggcaa gccgctgacc accatccccg 60
tcggcacggc cgaagacgtc gaagccgcct tcgccgaggc gcgcgcggcg caggccgact 120
gggcgaaccg tccggtcagc gagcgcgtcg atgtcatcag ccggtatcgc gacctggtcg 180
tcgagaaccg cgagttcctg atggatctcc tgc 213
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 10
tgggtagcag acctcaccta t 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 11
cgagtacgct ttcttgttgg 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 12
cgcacggatg tgattggta 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 13
cggagtagtg gacgaagagg 20
<210> 14
<211> 178
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌
<400> 14
tgggtagcag acctcaccta tgtgtcgacc tgggcagggt tcgcctacgt ggcctttgtc 60
accgacgcct acgctcgcag gatcctgggc tggcgggtcg cttccacgat ggccacctcc 120
atggtcctcg acgcgatcga gcaagccatc tggacccgcc aacaagaagg cgtactcg 178
<210> 15
<211> 145
<212> DNA
<213> 鸟分枝杆菌
<400> 15
cgcacggatg tgattggtac atccgcattt gatgagagaa gtaagtaaat ggcacaggga 60
actgtgaaat ggttcaacgg tgaaaagggc ttcggcttca tcacccctga cgacggcacg 120
aaggacctct tcgtccacta ctccg 145
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 16
cacatgcaag tcgaacggaa agg 23
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 17
gcccgtatcg cccgcacgct caca 24
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸探针
<400> 18
acgggatgca tgtcttgtgg tggaaagcgc tttagc 36
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸探针
<400> 19
tttaggcgca tgtctttagg tggaaagctt 30
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸探针
<400> 20
tcaagacgca tgtcttctgg tggaaagctt ttgc 34
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 21
cgcaatagag ggaagtggtt cc 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引物
<400> 22
cagcctccat aaggcttagc c 21

Claims (6)

1.一种引物组，其包含：
(i)由序列号1所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号2所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的结核分枝杆菌检测用引物对；
(ii)由序列号3所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号4所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的鸟分枝杆菌检测用引物对；及
(iii)由序列号5所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号6所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的胞内分枝杆菌检测用引物对。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中，
所述(i)、(ii)及(iii)的正向引物和反向引物中的至少一者分别用标记物质标记。
3.根据权利要求2所述的引物组，其中，
所述标记物质从荧光物质、放射性同位素或酶中选择。
4.一种结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌或/和胞内分枝杆菌的检测方法，其通过如下方式来进行：使用权利要求1所述的引物组，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测所获得的核酸扩增产物。
5.一种试剂盒，其包含：
(i)由序列号1所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号2所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的结核分枝杆菌检测用引物对；
(ii)由序列号3所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号4所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的鸟分枝杆菌检测用引物对；及
(iii)由序列号5所表示的碱基序列构成的正向引物与由序列号6所表示的碱基序列构成的反向引物的组合构成的胞内分枝杆菌检测用引物对。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，
所述(i)、(ii)及(iii)的正向引物和反向引物中的至少一者分别用标记物质标记。
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