PT528306E

PT528306E - Iniciadores e sondas de micobacterias

Info

Publication number: PT528306E
Application number: PT92113540T
Authority: PT
Inventors: Karen K Y Young
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1991-08-15
Filing date: 1992-08-08
Publication date: 2000-05-31
Also published as: ES2140400T3; JP2675723B2; AU659657B2; FI923660A0; EP0528306B1; JPH06261757A; NO923201L; FI106213B; DE69230305D1; CN1076397C; IL102765A; NO923201D0; NO310884B1; ATE186749T1; DE69230305T2; DK0528306T3; FI923660L; NZ243921A; CA2075847A1; EP0528306A2

Description

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Descrição “Iniciadores e sondas de micobactérias” A presente invenção refere-se a reagentes e métodos para a detecção da presença de ácido riucleico micobacteriano e para a detecção de espécies micobacterianas donde se obteve uma amostra de ácido nucleico micobacteriano. De forma concreta, a presente invenção descreve um par de iniciadores oligonucleotídicos capazes de amplificarem uma região relevante do gene de ARN ribossómico 16S ou o correspondente ARN de uma espécie micobacteriana, em que o primeiro iniciador compreende a sequência KY18 (SEQID N° 1) e o segundo iniciador compreende a sequência KY75 (SEQ ID N° 2). Mais concretamente, á presente invenção descreve métodos para detectar ou identificar um ácido nucleico micobacteriano numa amostra mediante a amplificação de uma região relevante do gene de ARN ribossómico 16S ou o correspondente ARN de uma espécie micobacteriana, misturando o ácido nucleico amplificado com uma sonda hibridante e detectando ou identificando os híbridos formados entre o referido ácido nucleico e essa sonda hibridante, pelo que são apresentadas sonda específicas. A presente invenção também prevê a apresentação de estojos para a realização dos métodos.

As micobactérias são bacilos aeróbios de crescimento lento e resistentes aos ácidos descolorantes. Até ao momento presente foram já identificados pelo menos dezanove espécies de micobactérias associadas a doenças dos seres humanos, com relevo especial para M íuberculosis, M. bovis e M leprae. Algumas espécies, tais como M. avium, M. Intercelhdare e M. kansasii, embora não sejam normalmente patogénicas para indivíduos saudáveis, podem provocar doenças em indivíduos imunocomprometidos, tal como sucede com as pessoas

infectadas com o vírus da SIDA. Além disso, há diversas espécies que raramente provocam doenças nos seres humanos, mas podem surgir em espécimes clínicos como as saprófítas. Os métodos para detectar e identificar as espécies micobactenanas compreendem a cultura bacteriana, a detecção de anticorpos e mais recentemente a detecção de ADNr (o mesmo que rRNA) por hibridação com uma sonda hibridante de ácido nucleico marcada radioactivamente. Cada um destes métodos tem problemas consideráveis. A detecção por cultura dos bacilos é lenta, sendo necessários até cerca de dois meses e tipicamente são necessários ensaios bioquímicos complementares para identificar a espécie. No que diz respeito à detecção de anticorpos, falta-lhes especificidade devido à interreactividade entre as espécies micobacterianas e também lhes falta sensibilidade. Além disso, é difícil a diferenciação entre as infecções actuais e as passadas. A detecção, utilizando fragmentos de ADN marcados radioactivamente como sondas para hibridar o ARN ribossómico da subunidade pequena (ARN 16S), é de sensibilidade insuficiente e continua a ser necessário pelo menos um período de criação em cultura de vários dias (ver o documento PCT/WO 84/02721). A invenção da reacção em cadeia com a polimerase (RCP), que é um método para amplificar sequências específicas de ácidos nucleicos, faz com que seja possível a detecção rápida dos ácidos nucleicos existentes numa célula em que previamente haja uma quantidade exígua não detectável. Recorrendo à amplificação por RCP, é possível detectar mesmo uma só cópia do ácido nucleico relevante. A detecção directa, por hibridação com uma sequência oligonucleotídica de sequência específica, de uma sequência de ácido nucleico amplificado até um nível detectável, faz com que sejam possíveis testes de diagnóstico suficientemente específicos para detectar mudanças nucleotídicas singulares em sequência. No entanto, nem todos os pares de iniciadores e nem todas as sondas hibridantes são úteis. A escolha dos

iniciadores, e consequentemente a escolha da região que irá ser amplificada, em conjunto com a escolha das sondas hibridantes determina folgadamente a especificidade e a sensibilidade que é possível obter. A amplificação por RCP tem sido utilizada na sequenciação do ácido nucleico mico-bacteriano, na detecção de ácidos nucleicos micobacterianos numa amostra e na identificação de espécies micobacterianas. Foram já utilizadas diversas regiões do genoma bacteriano para detectar e identificar ácidos nucleicos micobacterianos em amostras. A maior parte destes testes de diagnóstico foi concebida para detectar apenas uma espécie ou um pequeno número delas e há eventualmente contraprovas de especificidade limitada para pesquisa do ADN não micobacteriano. A detecção de uma região do gene que codifica o antigénio de 65 quilodalton (KDa) foi descrita por Chia et ai, 1990, J. Clin. Microbiol. 28(9): 1877-1880; Brisson-Noel et ai, 1989, Lancet 334:1069-1071; Hackel et al., 1990, ‘Molecular and Cellular Probes 4:205--210’; Woods e Cole, 1989, FEMS Microbiology Letters 65:305-310; e Hance et ai, 1989, ‘Molecular Microbiology 3(7):843-8495. Não foram distinguidos mais de três conjuntos de espécies micobacterianas em qualquer dos testes baseados no gene que codifica o antigénio de 65 KDa. A amplificação do elemento de .ADN repetitivo, IS6110, foi descrita por Thierry et ai, 1990, ‘J. Clin. Microbiol. 28( 12):2668-2673% e Eisenach et ai, 1990, ‘J. Infectious Disease 161:977-981’. A amplificação do 1S6110 serve basicamente apenas para testar a presença de espécies particulares de micobactérias, embora as espécies M. tuberculosis e M. bovis possam ser distinguidas pelo número de cópias (Plikaytis et ai, 1991, ‘Molecular and Cellular Probes 5:215-2195). 4 O antigénio de 36 KDa de M. leprae foi utilizado num teste de diagnóstico efectuado por Kartskeerl et ai, 1989, ‘J. gen. Microbiol. 135:2357-2364’. Embora esse teste fosse específico para M leprae, também foi observada uma hibridação entre fraca a moderada com o ADN de outras micobactérias. A sequência de gene que codifica o antigénio b das proteínas foi utilizado por Sjobring et ai, 1990, ‘J. Clin. Microbiol. 28(10):2200-2204’ para produzir um teste para M tuberculosis/ /bovis com base na presença ou na ausência de um produto amplificado. Há um teste destinado exclusivamente a determinar a presença de M. tuberculosis com base na sequência do gene que codifica a proteína MPB 64 que foi descrito por Shankar et al., 1990, ‘Lancet 335:423’.

As sondas hibridantes construídas a partir de fragmentos de ADN clonado foram descritas por Patel et ai, 1990, ‘J. Clin. Microbiol. 28(3):513-5185 e Fdris et ai, 1990, ‘Molecular and Cellular Probes 4:87-105’. Obteve-se especificidade para a sonda através de um processo de selecção, mais do que por uma análise sequencial, durante a concepção da sonda hibridante.

Uma das regiões do genoma micobacteriano que tem sido analisada e identificada para utilização num teste de diagnóstico é o ARN ribossómico da subunidade pequena (ARNr 16S, o mesmo que lóSrRNA). Edwards et al, em Nucl. Ácido Res. 17, 19, 7843-7853 (1989) descrevem aí o isolamento e quase completam a determinação nucleotídica do gene que codifica o ARNr 16S de Mycobacterium kansasii, utilizando para tal iniciadores de amplificação e iniciadores de sequenciação concebidos para corresponderem às sequências filogeneticamente conservadas de espécies procarióticas e eucarióticas.

A publicação do pedido de patente de invenção europeia n° 395 292 descreve um método para efectuar a distinção entre micobactérias. utilizando uma sonda de ADN

hibridante obtida a partir de uma sequência particular de 73 nucleótidos da região variável V2 do gene que codifica o ARN ribossómico 16S proveniente de Mycobacterium bovis.

Bottger descreveu em 1989, em ‘FEMS Microbiology Letters 65:171-176’, a amplificação dos genes de ARNr 16S de diversos organismos utilizando iniciadores “universais” concebidos e projectados para amplificar ácido nucleico proveniente de uma grande variedade de organismos, tendo efectuado a sua sequenciação directamente. A relação filogenética de espécies micobacterianas foi estudada comparando as sequências dos genes ARNr 16S, conforme consta do trabalho de Rogall et ai, 1990, ‘J. Gen. Micro. 136:1915-1920’. Boddinghaus et ai, 1990, ‘ J. Clin. Microbiol. 28(8): 1751-1759’ apresentou resultados respeitantes às determinações que é possível realizar utilizando oligonucleótidos de sequências específicas para efeitos de amplificação e hibridação com regiões da sequência de ARNr 16S. Estudou-se uma região fortemente variável da sequência de ARNr 16S respeitante a três espécies micobacterianas. Foram utilizados iniciadores específicos de géneros para amplificar uma região que continha a região variável utilizada para a hibridação de sondas específicas de espécies.

Estudou-se e efectuou-se a sequenciação do ARNr da subunidade pequena de um grande número de organismos, tanto os mais semelhantes como os mais dissemelhantes com as micobactérias. Há uma compilação das sequências de ARNr da subunidade pequena de um grande número de organismos, apresentada por Neefs et ai, 1990, em “Nuc. Acids Res. Supplement 18:2237-2317”.

Continua a ser necessário que haja um teste rápido e sensível para identificar a presença do ADN micobacteriano e as espécies donde esse ADN foi retirado. A presente invenção proporciona um ensaio rápido e sensível que tem por base a RCP para a detecção e para a identificação de espécies de micobactérias. A invenção proporciona 6 iniciadores e sondas específicos para as sequências do gene de ARN ribossómico 16S. A detecção das micobactérias é realizada por amplificação com o par de iniciadores específicos dos géneros, definidos antes, seguindo-se a despistagem com sondas específicas de géneros num ensaio de hibridação pelo método das imagens pontilhadas. Se forem detectadas micobactérias, identifica-se a espécie a partir do ADN amplificado, normalmente a partir da mesma reacção de amplificação, utilizando para tal sondas específicas de espécies, num ensaio pelo método reverso das imagens pontilhadas das amostras hibridadas. A amplificação de sequências que codificam o ARN ribossómico 16S (ARN) tem diversas vantagens. É possível utilizar a presente invenção para detectar e distinguir entre mais de trinta espécies micobacterianas e muitos outros organismos que possam eventualmente estar presentes numa amostra clínica. O par de iniciadores anteriormente definidos e as sondas hibridantes previstas pela presente invenção proporcionam a máxima especificidade possível, minimizando consequentemente a probabilidade de um resultado falso positivo originado pela presença de um organismo congénere com uma sequência semelhante. O gene de ARN 16S possui regiões altamente conservadas. Os iniciadores e as sondas descritos, específicos dos géneros, hibridam com tais regiões conservadas e são capazes de hibridar com sequências de quase todas as espécies de um género; os iniciadores amplificam o ácido nucleico de 14 das 15 espécies micobacterianas testadas e dessas 14 sequências de ADN micobacteriano amplificado, as sondas específicas do género hibridam com 12 delas. O ARNr 16S também contém regiões altamente variáveis dentro da região amplificada. As sondas específicas de espécies da presente invenção hibridam numa região variável em que cada espécie relevante possui uma sequência única. 7

Uma vantagem adicional da escolha de iniciadores e sondas hibridantes a partir do ARNr 16S assenta no facto de o ARN se encontrar presente numa célula em desenvolvimento segundo um grande número de cópias (103 a 104). O número de sequências de genes na forma de ARN numa determinada amostra clinica seria consequentemente até 104 vezes superior ao número das correspondentes sequências de ADN. No caso de se pretender uma maior sensibilidade de detecção, é possível utilizar o próprio ARN como objectivo da amplificação.

De acordo com outro aspecto da invenção, realiza-se uma segunda reacção de amplificação como teste confirmativo. A segunda reacção de amplificação fúndamenta-se na presença de sequências relevantes não directamente relacionadas com o primeiro objectivo, isto é, os ácidos nucleicos de ARN ribossómico SI6. As sequências relevantes adequadas são conservadas preferencialmente entre as espécies de Mycobacrterium e não estão relacionadas com as espécies diferentes de Mycobacterium. Um gene relevante adequado pode ser, por exemplo, o gene que codifica o gene da proteína de 65 KDa. Pao et al., 1989, ‘FEMS Micro Letters 65:305-310’, Hartskeerl et al., 1989, ‘J. Gen. Micro. 135:2357-2364’ ; e Hackel et al., 1990, ‘Mol. Cel. Probes 4:205-210’. Embora seja útil para confirmar os resultados de uma primeira reacção de amplificação, a amplificação de uma segunda sequência relevante é parti-cularmente significativa para o esclarecimento de resultados discordantes que possam surgir em estudos comparativos, designadamente na comparação dos métodos de RCP e de cultura.

No presente texto são escritas sondas capazes de detectar a presença de ácido nucleico de Mycobacterium (sondas específicas de géneros) e de determinar a identidade das espécies donde foi obtido o ácido nucleico (sondas específicas de espécies). A presente invenção também descreve sondas hibridantes de consenso para a amplificação e detecção de espécies dissemelhantes de isolados de Mycobacterium. As sondas de consenso 8

Ο oligonucleotídicas não hibridam com espécies que sejam de Mycobacterium estreitamente afins das micobactérias.

As sondas de consenso são adequadas para uma grande variedade de detecções da substância relevante específica, utilizando uma única sonda hibridante oligonucleotídica. Uma sonda hibridante de consenso, tal como aqui utilizada, é uma sonda hibridante oligonucleotídica cuja sequência não é idêntica a nenhuma das sequências de ácido nucleico micobacteriano que se pretende detectar. As sondas hibridantes de consenso são composições de oligonucleótidos híbridos que compreendem sequências de ácidos nucleicos não naturais. As sondas de consenso descritas na presente invenção podem ser utilizadas tanto para excluir como para incluir espécies seleccionadas num ensaio de detecção. Apesar de tais sondas detectarem genericamente espécies micobacterianas, não detectam espécies não micobacterianas estreitamente afins, por exemplo, Corynebacter. A invenção refere-se ao par de iniciadores definidos antes para amplificar uma região específica de ácido nucleico micobacteriano. Esta região contém simultaneamente uma região conservada entre as espécies de Mycobacterium e uma região variável com heterogeneidade entre espécies, suficiente para permitir determinar a origem do ácido nucleico relevante, utilizando sondas oligonucleotídicas de sequência específica.

Outro aspecto da presente invenção diz respeito aos métodos de detecção e de identificação das espécies. A amplificação do ácido relevante por RCP, utilizando o par de iniciadores da invenção, permite detectar a presença de ácido nucleico micobacteriano misturando o ácido nucleico amplificado com as sondas hibridantes específicas de géneros e detectando a eventual ocorrência de hibridação, ao passo que a identificação da espécie é efectuada determinando o padrão de hibridação com sondas especificas de espécies. 9

Um outro aspecto da invenção diz respeito aos estojos de sondas hibridantes. Estes estojos assumem uma variedade de formas e compreendem uma ou várias sondas hibridantes, para além do par de iniciadores reivindicados e compreendem também, de acordo com uma variante, um painel de sondas suficientes para determinar a identidade de um Mycobacterium infectante ao nível da espécie e instruções para utilizar os ingredientes desse estojos. Os estojos também podem compreender um ou vários reagentes de amplificação, v.g. iniciadores específicos de géneros, polimerase, tampões e nucleósido-trisfosfatos.

Ainda de acordo com outra variante, cada estojo pode conter contraprovas positivas e negativas. No presente texto descreve-se uma contraprova positiva preferida.

Para ajudar a compreender a invenção são utilizados vários termos adiante definidos. O termo “oligonucleótido” designa uma molécula constituída por dois e mais vulgarmente por mais de dois desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos, tais como iniciadores, sondas, fragmentos de ácido nucleico que se pretender detectar e contraprovas de ácido nucleico. O tamanho exacto de um oligonucleótido depende de muitos factores e da função ou utilização previstas em última instância para o oligonucleótido. Os oligonucleótidos podem ser preparados por qualquer método conveniente, incluindo, por exemplo, a clonagem e a restrição de sequências adequadas e a síntese química directa, segundo um método tal como o método do fosfotiester de Narang et ai, 1979 ‘Meth. Enzymol. 68:90-99’; o método do fosfo-diéster de Brown et ai, 1979, ‘Meth. Enzymol. 68:109-151’; o método da dietilfosforamidite de Beaucage et ai, 1981, ‘Tetrahedron Lett. 22:1859-1862’; e o método de suporte sólido descrito na patente de invenção norte-americana n° 4 458 066. O termo “iniciador” designa um oligonucleótido, quer seja natural ou sintético, capaz de funcionar como ponto de arranque da síntese do ADN em condições em que seja induzida a síntese de um produto de prolongamento do iniciador, complementar de uma cadeia de ácido nucleico, isto é, na presença de quatro desoxirribonucleósido-trifosfatos diferentes e de um agente para a polimerização (isto é, polimerase do ADN ou transcriptase reversa) num tampão adequado e a uma temperatura conveniente. De preferência, o iniciador é um oligo-desoxinibonucleótido de cadeia simples. O comprimento adequado de um iniciador vai depender do fim previsto para esse iniciador, mas está compreendido normalmente entre 15 e 25 nucleótidos. As moléculas dos iniciadores mais curtos necessitam geralmente de temperaturas mais baixas para formarem com a matriz complexos híbridos suficientemente estáveis. Não é necessário que um iniciador reflicta a sequência exacta da matriz, mas deve ser suficientemente complementar para hibridar com uma matriz e deve servir para iniciar a síntese do ADN.

Nas variantes das invenção descritas são apresentadas sequências específicas de iniciadores, conforme descrito antes, e de sondas. É evidente para os especialistas na matéria, armados com estes conhecimentos, que as sondas de sequências específicas podem ser modificadas, por exemplo, pela adição de nucleótidos tanto na extremidade 5’ como na extremidade 3’, sendo esses nucleótidos complementares da sequência relevante ou sendo não complementares da sequência relevante. O termo “iniciador” pode designar mais do que um iniciador, em particular no caso de haver uma certa ambiguidade na informação respeitante a uma ou às duas extremidades da região relevante que se pretende amplificar. Se uma região “conservada” revelar níveis significativos de polimorfismo numa população, é possível preparar misturas de iniciadores que amplifiquem tais sequências ou então é possível conceber e projectar iniciadores que amplifiquem mesmo as sequências que não estejam a condizer. Se desejado, é possível marcar um iniciador incorporando-lhe um marcador detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, 11 bioquímicos, imunoquímicos ou químicos. Assim, como exemplos de marcadores úteis refere-se os seleccionados entre P, corantes fluorescentes, reagentes electronicamente densos, enzimas (um protocolo vulgarmente utilizado é o de EISLE (o mesmo que ELISA)), biotina ou haptenos e as proteínas para as quais existem disponíveis anti-soros ou anticorpos monoclonais. Também é possível utilizar um marcador para “capturar” o iniciador, por forma a facilitar a imobilização quer do iniciador quer de um produto de prolongamento do iniciador, tal como um ADN amplificado, num suporte sólido. A expressão “oligonucleótido específico da sequência” e a abreviatura “OES” designam oligonucleótidos que possuem uma sequência, designada por “região de hibridação”, complementar da sequência que se pretende detectar, a qual irá hibridar, em “condições de hibridação rigorosas específicas da sequência” apenas com a sequência relevante que seja exactamente complementar. O afrouxamento do rigor das condições de hibridação permite que sejam toleradas situações de emparelhamentos das sequências menos exactos; o grau de inexactidão tolerada no emparelhamento de sequências pode ser controlado mediante o ajustamento adequado das condições de hibridação. Os termos “sondas” e “sonda de OES” são utilizados intermutavelmente com o termo OES. A expressão “região relevante” designa uma região de um ácido nucleico que se pretende analisar. A expressão “enzima polimerase termostável” designa uma enzima que é relativamente estável ao calor e que catalisa a polimerização dos nucleósido-trifosfatos para formar os produtos de prolongamento do iniciador que são complementares de uma das cadeias de ácido nucleico de sequência relevante. A enzima inicia a síntese na extremidade 3’ do iniciador e prossegue o sentido da extremidade 5’ da matriz, até terminar a síntese. Há uma enzima

polimerase termostável purificada que vem descrita mais minuciosamente na patente de invenção norte-americana n° 4 889 818. A expressão “transcriptase reversa” designa uma enzima que catalisa a polimerização dos nucleósido-trisfosfatos para a formação dos produtos de prolongamento do iniciador que são complementares de uma matriz de ácido ribonucleico. A enzima inicia a síntese na extremidade 30’ do iniciador e prossegue no sentido da extremidade 5’ da matriz até que a síntese esteja terminada. Como exemplos de agentes de polimerização adequados que convertem a sequência relevante de ARN numa sequência complementar de ADN de cópia (ADNc) refere-se a transcriptase reversa dos vírus da mieloblastose das aves e a polimerase do ADN de Thermus thermophilus, que é uma polimerase de ADN termostável com actividade de transcriptase reversa. A figura 1 mostra os resultados de experiências de hibridação em que foram utilizadas tanto as sondas específicas de géneros como as sondas específicas de espécies da presente invenção. Testou-se a especificidade das sondas hibridantes utilizando para tal ADN obtido a partir de treze espécies diferentes de Mycobacterium. A presente invenção proporciona um ensaio rápido e sensível, baseado na RCP, para detectar e identificar espécies de Mycobacterium. A invenção proporciona os iniciadores e as sondas específicas para as sequências do gene de ARN ribossómico 16S micobacteriano. A detecção micobacteriana é executada por amplificação com iniciadores específicos do género, seguindo-se uma pesquisa de despistagem com sondas específicas do género num ensaio de hibridação por imunotransferência. No caso de serem detectadas micobactérias, determina-se a identificação da espécie a partir do ADN proveniente da mesma reacção de amplificação utilizando para tal sondas específicas de espécies num ensaio pelo método reverso das 13

imagens pontilhadas. Qualquer dos ensaios directo e reverso pelo método das imagens pontilhadas pode ser realizado de uma forma bastante conveniente numa placa de microtitulação.

Os iniciadores e as sondas específicos do género hibridam com regiões conservadas do gene de ARNr 16S e as sondas específicas das espécies hibridam com regiões variáveis do gene de ARNr 16S. Uma vez que a síntese começa na extremidade 3’ do iniciador, os empa-relhamentos incorrectos na extremidade 3’ são mais críticos. A timidina é mais tolerante do que as outras bases de um segmento desemparelhado, pelo que foram concebidos e projectados iniciadores para evitar que haja uma base timidina na extremidade 3’. As bases existentes num oligonucleótido afectam a temperatura de desnaturação. O rigor e a especificidade da ligação do iniciador ou da sonda aumentam à medida que aumenta a temperatura. No entanto, atendendo a que todas as ondas hibridam simultaneamente no método reverso das imagens pontilhadas, as condições óptimas de hibridação das sondas são semelhantes para todas elas.

Os pares de iniciadores da presente invenção funcionam eficientemente na amplificação de uma sequência do gene de ARNr 16S a partir de todas as espécies de Mycobacterium relevantes, mas não amplificam o correspondente ADN de muitas outras fontes. Além do mais, as condições de amplificação e a eficiência destes iniciadores são razoavelmente uniformes através das espécies, pelo que quase todas as espécies de Mycobacterium são detectáveis por meio de um só teste. O quadro 1 mostra as sequências de hibridação dos iniciadores da presente invenção. 5!CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG 3’

Iniciador Listagem das sequências KY18 SEQ ID N° 1

Quadro 1 Sequência hibrídante KY75 SEQ fD N° 2 5OCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA 3 ’ 14

Utilizando o sistema de numeração de £. coli, o iniciador de montante K.Y18 abrange as bases 52-74 e o iniciador de jusante K.Y75 abrange as bases 624-647 do gene de ARNr 16S. Em conjunto, estes iniciadores especificam a síntese de um produto que tem aproximadamente um comprimento de 583 pares de bases; o tamanho exacto depende da espécie. A pesquisa inicial da presença de ADN micobacteriano é realizada com duas sondas hibridantes específicas do género que são utilizadas simultaneamente soba a forma de uma mistura.

Quadro 2

Sonda Listagem de seauèncias Sequência hibridante KY101 SEQ ID N° 3 5’TCGCGTTGTTCGTGAAATCTCACgGCTTAA 3’ KY102 SEQ ID N° 4 5’TCGCGTTGTTCGTGAAAaCTCACAGCTTAA 3’ KY165 SEQ ID N° 13 5’TCGCGTTGTTCGTGAAATCTCACAGCTTAA 3’ K.Y166 SEQ ID N° 14 5 TCGCGTTGTTCGTGgAATCTCACAGCTTAA 3 ’ M. xenopi SEQ ID N° 15 5 TCGCGTTGTTCGTGgAATgçCACAGCTTAA 3’ A razão para a utilização de sondas mistas reside no facto de a maior parte das espécies bacterianas poderem ser divididas em dois grupos relacionados com as sequências na região de KY101 (SEQID N° 3) E K.Y102 (SEQID N° 4). Estas duas sequências detectam ADN de 12 das 14 espécies dos géneros de Mycobacterium.

De acordo com uma variante alternativa, a sonda KY165 (SEQ ID N° 13) substitui as sondas KY101 (SEQ ID N° 3) e KY102 (SEQ ID N° 4). No quadro 2 estão indicadas as sequências KY101 (SEQ ID N° 3), KY102 (SEQ ID N° 4), KY165 (SEQ ID N° 13) e KY166 (SEQ ID N° 14). A sonda KY165 (SEQ ID N° 13) é uma sonda de consenso que compreende simultaneamente as sequências KY101 (SEQ ID N° 3) e KY102 (SEQ ID N° 4). As sondas KY101 (SEQID N° 3) e KY102 (SEQ LD N° 4) diferem uma da outra por duas bases. A sonda KY165 (SEQ ID N° 13) não é idêntica nem à sonda KY10I (SEQ ID N° 3) nem à sonda KY102 (SEQ ID N° 4), diferindo de cada uma delas por uma única base. Este consenso foi conseguido “favorecendo” a sonda KY101 (SEQ ID N° 3) numa das posições desencontradas (não emparelhadas) e a sonda KY102 (SEQ ID N° 4) na outra dessas posições desencontradas. A sonda KY165 (SEQ ID N° 13) é capaz de hibridar suficientemente com todas as espécies micobacterianas específicas das sondas K.Y101 (SEQ ID N° 3) e KY102 (SEQ ID N° 4). A sonda KY165 (SEQ ID N° 13) não hibrida com M. xenopi (SEQ ID N° 15) em condições de elevado rigor, devido à existência de outros desemparelhamentos. A sonda KY166 (SEQ ID N° 14) é uma sonda de consenso mais ampla para detectar espécies micobacterianas* incluindo M xenopi (SEQ ID N° 15). A sequência da sonda KY166 (SEQ ID N° 14), tal como sucede com a sequência da sonda KY165 (SEQ ID N° 13), não corresponde a nenhuma espécie não micobacteriana. A sonda hibiidante é concebida e projectada para ser igualmente dissemelhante em relação às sondas KY101 (SEQ ID N° 3) e KY102 (SEQ ID N° 4) e a correspondente sequência em M xenopi (SEQ ID N° 15) (n° X52929 de acesso ao ‘GenBank’, podendo ser obtida por intermédio de Intelligenetics). A sonda KY166 (SEQ ID N° 14) difere das sondas KY101 (SEQ ID N° 3), KY102 (SEQ ID N° 4) e de M xenopi (SEQ ID N° 15) por duas bases em cada caso. A sonda KY166 (SEQ ID N° 14) hibrida eficientemente com todas as espécies específicas das sondas KY101 (SEQ ID N° 3) e KY102 (SEQ ID N° 4) e com M. xenopi (SEQ ID N° 15). Além disso, a sonda KY166 (SEQ ID N° 14) não hibrida com Corynebacter pseudodiphlheriticum ou C. diphtheriae que são duas espécies não micobacterianas muitíssimo afins com os microrganismos Mycobactehum. A correspondente sequência de M. xenopi (SEQ ID N° 15) está indicada no quadro 2. Nesse

quadro, os desemparelhamentos relativos à sonda KY166 (SEQ ID N° 14) estão sublinhados. Os desemparelhamentos relativos à sonda KY165 (SEQ ED N° 13) estão indicados por letras minúsculas.

Se na amostra houver ácido nucleico micobacteriano, então a espécie donde provém esse ácido nucleico pode ser determinada por hibridação com um painel de sondas específicas das espécies. As sondas utilizadas no passo de identificação das espécies estão agrupadas no Quadro 3.

Quadro 3

Sonda Listagem de sequências Especificidade KY21 SEQ1DN0:5 M. tuberculosis/bovis/tb 5’ ACGGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGC 3’ KY25 SEQ ID NO:6 M. kamasii/gastri/scrofidaceum 5’ ACTTGGCGCATGCCTTGTGGTGGAAAGCTT 3’ KY26 SEQ ID NO: 7 M. míraceJhdare 5’ TTTAGGCGCATGTCTTTAGGTGGASAAGCTT 3’ KY63 SEQ ID NO:8 M. avhim/marimim/microti 5’TCAAGACGCATGTCTTCTGGTGGAAAGCTTTTGC 3’ KY151 SEQIDNO:9 M. Marimim/M. microti 5’ TCCCGAAGTGCAGGCCAGATTGCCCACGTG 3’ KY106 SEQ ID NO: 10 M.scrofalaceum 5’ GAAGGCTCACTTTGTGGGTTGACGGTAGGT 3’ KY126 SEQ ID NO: 11 M. kamaswgastri 5’ GCAATCTGCCTGCACACCGGGATAAGCCTG 3’ KY139 SEQ ID NO: 12 M. gordonae 5’ GGGT CT AAT ACCGAATAGGACC AC AGGAC AC AT G 3’ KY157 SEQ ID NO: 16 M. xenopi 5’ ATAGGACCATTCTGCGCATGTGGTGTGGTG 3’ 17 ΚΥ167 SEQIDN0:17 M. avium/marinum/microti 5’ ACCTCAAGACGCATGTCTTCTGGT 3’ KY168 SEQIDN0:18 M.gordonae 5’ CCGAATAGGACCACAGGACACATG 3’ KY169 SEQIDN0:19 M. intracellulare 5’ ACCTTTAGGCGCATGTCTTTAGGT 3’ KY170 SEQIDNO:20 M. kansasii/gastri/scrofiilaceum 5’ AACACTTGGCGCATGCCTTGTGGT 3’ KY171 SEQIDN0:21 M. scrofulaceum 5’ GAAGGCTCACTTTGTGGGTTGACG 3’ KY172 SEQID NO:22 M. bovis/tb 5’ T GT GGT GG AAAGCGCTTT AGCGGT 3’ KY173 SEQ ID NO:23 M.xenopi 5’ AGGACC ATTCT GCGC AT GT GGT GT 3’

As espécies com o interesse clínico mais relevante são M. tuberculosis, M. kansasii, M. xenopi, M. intracellulare e M. avium. A espécie M. gordonae não está normalmente associada a doenças mas aparece frequentemente em amostras retiradas de seres humanos. Em consequência, prevê-se que por vezes tenha lugar a detecção do ácido nucleico micobacteriano pelas sondas específicas dos géneros devido à presença da espécie M. gordonae clinicamente irrelevante. O exemplo 6 contém informação complementar respeitante à especificidade das sondas específicas das espécies.

Um aspecto importante da presente invenção é a amplificação de uma região do gene de ARNr 16S. Aqueles que na prática venham a executar a presente invenção irão verificar que, embora a reacção em cadeia com a polimerase seja o método preferido de amplificação, a amplificação das sequências relevantes numa amostra pode ser realizada por qualquer método conhecido, por exemplo, reacção em cadeia com uma liase (RCL), amplificação com 18

transcrição e replicação autossustentada de sequências, proporcionando cada um destes métodos uma amplificação suficiente para que a sequência relevante possa ser detectada por hibridação do ácido nucleico com uma sonda de OES. Em alternativa, é possível utilizar métodos que amplifiquem a sonda hibridante até níveis detectáveis, por exemplo, a amplificação com QP-replicase. O termo “sonda” compreende os oligonucleótidos de sequências específicas utilizados nos procedimentos anteriores; por exemplo, os dois ou mais oligonucleótidos utilizados na RCL são “sondas” para os efeitos da presente invenção, pese embora o facto de a RCL apenas exigir a ligação das sondas hibridantes para indicar a presença da sequência.

Embora o processo da RCP seja bem conhecido na especialidade (ver as patentes de invenção norte-americanas n- 4 683 195; 4 683 202 e 4 965 188), apresenta-se seguidamente alguma informação geral sobre a RCP por razões de clareza e total compreensão da invenção para aqueles que não estejam familiarizados com os processos da RCP.

Para amplificar por RCP uma sequência de ácido nucleico relevante, a sequência em causa deve estar acessível aos componentes do sistema de amplificação. Em geral, esta acessibilidade é garantida mediante o isolamento dos ácidos nucleicos a partir da amostra. São já conhecidas na especialidade diversas técnicas para extrair ácidos nucleicos de amostras biológicas. Por exemplo, ver as técnicas descritas por Higuchi et al., 1989 em ‘PCR Technology’ (Erlich ed., Stockton Press, Nova Iorque). Em alternativa, se for relativamente fácil desmembrar a amostra por lise, não será necessário purificar o ácido nucleico antes da amplificação por meio da técnica RCP, isto é, se a amostra for constituída por células, em particular linfócitos ou aminiócitos do sangue periférico, é possível efectuar a lise e a dispersão dos componentes intracelulares colocando simplesmente as células em suspensão num tampão hipotónico.

Cada ciclo da RCP implica a separação da hélice dupla de ácido nucleico formada pela amplificação do iniciador. De acordo com uma variante preferida do processo da RCP, a separação das cadeias tem lugar aquecendo o meio de reacção a uma temperatura suficientemente elevada durante um período eficaz para provocar a desnaturação da hélice dupla, mas sem provocar uma desnaturação irreversível da polimerase (ver a patente de invenção norte-americana n° 4 965 188). A desnaturação térmica típica tem lugar a temperaturas compreendidas entre cerca de 80°C e 105°C durante períodos variáveis entre segundos e minutos. A separação das cadeias pode ser realizada, no entanto, por qualquer método adequado de desnaturação, incluindo meios físicos, químicos ou enzimáticos. A separação das cadeias pode ser induzida, por exemplo, por uma helicase ou por uma enzima capaz de exibir actividade de helicase. Por exemplo, a enzima RecA tem actividade de helicase na presença de ATP. As condições de reacção adequadas para a separação das cadeias por acção das helicases são conhecidas na especialidade (ver Kuhn Hoffinan-Berling, 1978, ‘CSH-Quantitative Biology 43:63-67’; e Radding, 1982, ‘Ann. Rev. Genetics 16:405-436’).

No entanto, seja qual for o método utilizado para separar as cadeias, logo que estas estejam separadas, o passo subsequente da RCP consiste em hibridar as cadeias separadas com iniciadores que flanqueiem a sequência relevante. Os iniciadores são depois prolongados para formarem cópias complementares das cadeias relevantes. Para que a amplificação por RCP seja bem sucedida, os iniciadores são concebidos e projectados por forma a que a posição onde cada iniciador hibrida ao longo de uma sequência da hélice dupla seja tal que um produto prolongado sintetizado a partir de um iniciador, quando separado da matriz (complemento), sirva como matriz para o prolongamento do outro iniciador. O ciclo de desnaturação, hibridação e ampliação é repetido tantas vezes quantas as necessárias para se obter a quantidade desejada de ácido nucleico amplificado.

A amplificação dos iniciadores na RCP, dependente da matriz, é catalisada por um agente de polimerização na presença de quantidades adequadas de quatro desoximbonucleósido--trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP e dTTP; utiliza-se o dUTP em vez do dTTP ou complemen-tarmente com este se estiver incoiporado o sistema de esterilização UNG adiante descrito) num meio de reacção constituído por sais, catiões metálicos e sistemas de tamponamento do pH convenientes. Os agentes de polimerização adequados são enzimas sobre as quais se sabe que catalisam a síntese do ADN dependente da matriz. Como exemplos de polimerases convenientes para serem utilizadas com uma matriz de ADN refere-se a ADN-polimerase I de E. coli ou o fragmento de Klenow dessa enzima, a ADN-polimerase das T4 e a polimerase de Taq que é uma polimerase de ADN termicamente estável, isolada a partir de Thermus aquaticus. Esta última enzima é vulgarmente utilizada na amplificação e sequenciação de ácidos nucleicos. As condições de reacção para a utilização das polimerases de Taq são conhecidas na especialidade e foram descritas por Gelfand, 1989 em ‘PCR Technology’, supra. Os agentes polimerizantes adequados para sintetizar uma sequência complementar de um ADN de cópia (ADNc) proveniente de uma matriz de ARN são a transcriptase reversa (TR), por exemplo, a TR dos vírus da mieloblastose das aves, ou a ADN-polimerase de Thermus thermophilus que é uma ADN-polimerase termostável com actividade de transcriptase reversa. De forma típica, a matriz de ARN é degradada por via térmica durante o primeiro passo de desnaturação a seguir ao passo inicial com a transcriptase reversa, deixando apenas a matriz de ADN para a amplificação subsequente.

No caso de se pretender amplificar o ARNr de 16S utiliza-se inicialmente a transcrição reversa (TR) para se criar uma cópia de ADN (ADNc) do ARN. A publicação da patente de invenção PCT com o n° WO 91/09944, descreve a transcrição reversa a altas temperaturas por 21

acção de uma polimerase termostável que funciona também na amplificação por RCP. A TR a elevadas temperaturas proporciona uma maior especificidade do iniciador e uma melhor eficiência. Os mesmos iniciadores e a mesma polimerase são suficientes simultaneamente para os passos de transcrição reversa e de amplificação por RCP e as condições de reacção são optimizadas de tal modo que as duas reacções tenham lugar sem mudança de reagentes. Utiliza-se a ADN-polimerase de Thermus thermophilus que é uma ADN-polimerase termostável que pode funcionar como transcriptase reversa, em todos os passos para aumentar o iniciador, independentemente da matriz. Ambos os processos podem ser realizados sem que seja necessário abrir o tubo de ensaio para substituir ou acrescentar reagentes; apenas é necessário ajustar o perfil de temperatura entre o primeiro ciclo (matriz de ARN) e a parte restante dos ciclos de amplificação (matriz de ADN). O método da RCP pode ser realizado de fornia progressiva, sendo acrescentados novos reagentes a seguir a cada asso, ou então pode ser executado adicionando todos s reagentes simultaneamente, ou ainda de uma forma parcialmente progressiva em que reagentes novos ou diferentes são acrescentados ao fim de um determinado número de passos. Por exemplo, se a separação das cadeias for induzida por via térmica e a polimerase for sensível ao calor, então a polimerase tem de ser acrescentada a seguir a cada período de separação das cadeias. No entanto, no caso de se utilizar, por exemplo, uma helicase para a desnaturação, ou no caso de se utilizar uma polimerase termostável para a amplificação, então é possível acrescentar inicialmente todos os reagentes ou em alternativa, se as proporções molares entre reagentes dependerem da reacção, é possível efectuar uma recarga periódica dos reagentes, à medida que forem consumidos pela reacção de síntese.

Os especialistas na matéria sabem que o processo da RCP é executado mais vulgarmente de forma automática com uma enzima termostável. Neste processo, a temperatura da mistura de reacção varia, descrevendo um ciclo através de uma região de desnaturação, uma região de recombinação do iniciador e uma região de reacção. Há um aparelho adaptado especificamente para ser utilizado com uma enzima termostável, produzido para comercialização por ‘Perkin Elmer’.

Os especialistas na matéria também devem estar atentos ao problema da contaminação de uma RCP por influência do ácido nucleico amplificado proveniente de reacções anteriores. Os métodos para atenuar este problema permitem a degradação enzimática de qualquer ADN amplificado proveniente de reacções anteriores. A amplificação por RCP tem lugar na presença de dUTP em vez de dTTP. O produto resultante de hélice dupla contendo uracilo é sujeito a degradação pela uracil-N-glicosilase (UNG), ao passo que o ADN normal que contém timidina não é degradado pela UNG. A adição de UNG à mistura de reacção de amplificação antes de essa amplificação ter início vai degradar todo o ADN eventualmente relevante que contém uracilo. Uma vez que a única fonte de ADN que contém uracilo é o produto amplificado de uma reacção anterior, então este método esteriliza de forma eficaz a mistura de reacção, eliminando o problema de contaminação com contaminantes provenientes de reacções anteriores (transferência de contaminantes). A UNG passa a estar temporariamente inactiva por acção do calor pelo que os passos de desnaturação no procedimento de amplificação servem também para inactivar a UNG. Assim sendo, formam-se novos produtos de amplificação ao incoiporar uracilo num ambiente isento de UNG, não sendo degradados. A hibridação de uma sonda específica da sequência é um passo importante para a consecução dos métodos da presente invenção. As sondas oligonucleotídicas específicas de 23 sequências da presente invenção hibridam especificamente com um segmento particular do genoma micobacteriano e possuem desemparelhamentos desestabilizadores com as sequências de outros organismos, no caso das sondas específicas de géneros, e com as de outras espécies micobacterianas, no caso das sondas específicas de espécies. As condições rigorosas de hibridação podem ser escolhidas por forma a que as sondas hibridem especificamente apenas com as sequências que sejam exactamente complementares. Na detecção do produto amplificado utiliza-se esta hibridação específica da sequência para garantir que apenas é detectado o alvo correcto amplificado, diminuindo a probabilidade de um resultado falso positivo originado pela presença de sequências homólogas de organismos congéneres.

Nos métodos de ensaio para a detecção de híbridos formados entre sondas de OES e sequências de ácidos nucleicos podem ser necessárias sondas com particularidades complementares, para além da região de hibridação. Por exemplo, no protocolo das imagens pontilhadas as sondas hibridantes são marcadas de uma forma típica Se a sonda hibridante for imobilizada em primeiro lugar, tal como sucede no protocolo das imagens pontilhadas “reversas” adiante descrito, então a sonda hibridante também pode conter segmentos compridos de poli-dT que podem ser fixados a um suporte de ‘nylon’ por irradiação, que é uma técnica descrita mais minuciosamente na publicação da patente de invenção PCT com o n° 89/11548.

As sondas hibridantes aqui descritas podem ser sintetizadas e marcadas utilizando as técnicas anteriormente descritas para a síntese de oligonucleótidos. Por exemplo, é possível marcar uma sonda na extremidade 5’ com P por incubação dessa sonda com ΊΡ-ΑΤΡ e quinase. Um marcador adequado não radioactivo para as sondas de OES é a peroxidase do rábano silvestre (PRS, o mesmo que HRP). Os métodos para a preparação e para a detecção de sondas que contêm este marcador estão descritos nas patentes de invenção norte- 24 -americanas η- 4 914 210 e 4 962 02. Para mais informação sobre a utilização de tais sondas marcadas veja-se a patente de invenção norte-americana n° 4 789 630; Saiki et ai, 1988, N. Eng. J. Med. 319:537-541; e Bugawan et al., 1988, Bio/Technology 6:943-947. Os cromogénios úteis são o leucocorante vermelho e a 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidma (TMB). Em ‘PCR Protocols’, San Diego, Califórnia, Academic Press, Inc., 1990, pp. 119-128 Helmuth descreve procedimentos para a detecção não isotópica de produtos da RCP.

As sondas aqui descritas podem ser utilizadas para se determinar se há sequências de ácido nucleico numa amostra, determinando se as sondas se ligam às sequências existentes na amostra. Os métodos de ensaio convenientes para a finalidade da presente invenção, que é a de detectar híbridos formados entre sondas hibridantes e sequências de ácidos nucleicos numa amostra, são conhecidos na especialidade. Por exemplo, é possível efectuar a detecção recorrendo a um protocolo de imagens pontilhadas, conforme descrito no Exemplo 4. No protocolo das imagens pontilhadas, a amostra amplificada e não marcada é ligada a um suporte sólido, tal como uma membrana, essa membrana é incubada com a sonda hibridante marcada em condições de hibridação adequadas, a sonda não hibridada é removida por lavagem e depois procura-se no filtro a presença da sonda ligada. No caso de serem analisadas amostras múltiplas utilizando poucas sondas, tal como sucede no caso das amostras que são analisadas para pesquisar a presença de ácido nucleico micobacteriano utilizando sondas específicas dos géneros, o protocolo de imagens pontilhadas é bastante útil. Há um método alternativo bastante útil quando se utiliza um grande número de sondas diferentes. Este método consiste em obter uma imagem pontilhada “reversa” em que a sequência amplificada contém um marcador e a sonda é ligada ao suporte sólido. Segundo este protocolo, as sondas não marcadas são ligadas à membrana e expostas à amostra marcada

em condições de hibridação adequadamente rigorosas. A amostra marcada não hibridada é depois removida por lavagem, em condições adequadamente rigorosas, e procura-se depois no filtro a presença de sequências ligadas. Uma vez que a determinação da espécie exige a utilização de sondas múltiplas específicas da espécie para cada amostra amplificada, o protocolo das imagens pontilhadas reversas é o protocolo de ensaio preferido para este passo.

Em alternativa, pode eventualmente ser desejável utilizar um método de detecção em que haja um conjunto de cavidades ou locais de hibridação da sonda. Por exemplo, considera-se particularmente útil um suporte sólido, tal como uma placa de microtitulação, nas aplicações clínicas dos métodos da presente invenção em grande escala. Os métodos para a hibridação/captura de ADN amplificado por RCP ou os métodos dos suportes sólidos são bem conhecidos. De acordo com uma variante de tais métodos, marca-se o ADN relevante amplificado (v.g. com biotina) durante a amplificação na RCP. O ADN marcado é capturado especificamente por hibridação do produto da RCP com uma sonda de captura oligonucleo-tídica específica do ADN relevante, em que tal sonda tenha sido ligada a uma cavidade de uma placa de microtitulação. O produto ligado é detectado convenientemente em conformidade com o tipo de marcador utilizado. Por exemplo, no caso de se utilizar biotina como marcador, acrescenta-se o complexo de avidina e PRS e faz-se reagir altemativamente com (a) um substrato de peróxido de hidrogénio e o cromogénio O-fenileno-diamina (OPD) ou então (b) com um substrato de peróxido de hidrogénio e o cromogénio tetrametil-benzidina (TMB). Desenvolve-se então um sinal colorimétrico que permite a detecção quantitativa do ADN amplificado por RCP.

Conforme é prática corrente nos laboratórios clínicos biomédicos, os procedimentos de detecção em que se recorre a ensaios com placas de microtitulação podem ser 26 normalizados para um conjunto bastante amplo de substâncias relevantes que se pretenda pesquisar. Eventualmente pode ser preferível dispor de sondas de detecção cujo comprimento seja inferior a 25 nucleótidos. As sondas mais curtas minimizam a possibilidade de ocorrência de interreactividade e são particularmente úteis em procedimentos de pesquisa em grande escala. Assim sendo, descreve-se no exemplo 8 o método preferido para detectar uma espécie de Mycobacterium, segundo um protocolo para placas de microtitulação. Qualquer especialista na matéria sabe que as sondas com um comprimento superior a 25 nucleótidos são igualmente adequadas nos esquemas de detecção em placas de microtitulação; no entanto, pode vir a ser necessário determinar individualizadamente as condições adequadas de hibridação e de rigor para garantir uma especificidade máxima.

De acordo com outro sistema de ensaio adequado acrescenta-se uma sonda marcada durante o processo de amplificação por RCP. Qualquer sonda que hibride com o ADN relevante durante cada passo de síntese é degradada pela actividade da polimerase da hexanuclease de 5’ para 3’ utilizada para catalisar a amplificação do iniciador. Depois detecta-se o produto de degradação desta sonda hibridante. Assim, a presença do produto de degradação indica que teve lugar a hibridação entre a sonda hibridante e o ADN relevante. A presente invenção refere-se também a estojos que são unidades de vários receptáculos que contêm o par de iniciadores definidos antes. Um estojo útil também pode conter sondas de OES para detectar o ácido nucleico micobacteriano. Em alguns casos, as sondas de OES podem ser fixadas a uma membrana de suporte adequada. Há outros componentes facultativos que podem fazer parte do estojo, salientando-se, por exemplo, a transcriptase reversa ou a polimerase, os nucleósido-trifosfatos do substrato, os meios utilizados para fazer a marcação (por exemplo, um conjugado de avidina-enzima e o substrato da enzima e ainda o cromogénio, se o marcador for a biotrna) ou para detectar o marcador e ainda as substâncias tampão convenientes para a RCP, para a transcrição reversa ou para as reacções de hibridação. Para além dos componentes referidos antes, o estojo também pode conter as instruções para realizar os métodos de amplificação e detecção da presente invenção.

De acordo com uma variante preferida da invenção, os estojos para a detecção de micobactérias também podem conter substâncias das contraprovas positivas e negativas. De preferência, uma substância de contraprova positiva compreende uma sequência de ácido nucleico que seja amplificável utilizando o mesmo par de iniciadores que é utilizado para amplificar os ácidos nucleicos micobacterianos numa amostra de ensaio. São conhecidos métodos para a utilização de uma substância de contraprova positiva em que se utiliza o mesmo par de iniciadores tanto para a substância relevante, que pode ou não estar presente, como para a substância de contraprova positiva. De preferência, a substância de contraprova positiva é concebida e seleccionada de modo que o ADN em causa tenha um tamanho discreto facilmente distinguível do tamanho do ADN relevante. A invenção descreve também uma substância de contraprova positiva que é capaz de hibridar com as sondas para a detecção de sondas micobacterianas específicas do género e também para a detecção de sondas micobacterianas específicas da espécie. O Exemplo 9 descreve a construção de um ácido nucleico de contraprova positiva.

Conforme aqui descrito, pode ser desejável utilizar eventualmente um segundo referencial de amplificação, em particular para a resolução da RCP e de dados de cultura discordantes. Tendo em conta os preceitos da presente memória descritiva para a concepção de um vector interno de contraprova positiva, qualquer especialista na matéria pode concluir facilmente que é possível construir outros vectores internos de contraprova positiva. Por exemplo, um vector de contraprova positiva poderia incorporar locais do iniciador para hibridar tanto o alvo primário (ARNr 16S) como o alvo secundário (y.g. o gene da proteína de 65 KDa) e para amplificar subsequentemente um segmento discreto de ADN de contraprova positiva.

Os exemplos da presente invenção adiante apresentados têm apenas fins ilustrativos.

Exemplo 1

Preparação da Amostra

Procedeu-se ao isolamento de ácidos nucleicos a partir de amostras de saliva, utilizando para tal o sistema isoQuick™’ fornecido em termos comerciais por “MicroProbe”. Utilizou-se uma quantidade de cerca de 10 mL de uma amostra de saliva liquefeita e desinfectada, concentrou-se por centrifugação e colocou-se novamente em suspensão numa quantidade de cerca de 1 mL de uma solução tampão contendo ASB (o mesmo que BSA). Para esta amostra centrifugou-se entre 200 a 500 pL para concentrar a bactéria. Colocou-se essas massas concentradas novamente em suspensão em 100 pL de uma amostra de tampão A e depois efectuou-se a lise com 100 pL de reagente 1 de lise. A seguir procedeu-se à extracção dos lisados com 7 volumes de reagente 2 e 4 volumes de reagente 3 (os reagentes 1, 2 e 3 e também o tampão A de amostragem são fornecidos conjuntamente com o sistema ‘IsoQuick™’. Realizou-se a centrifugação da amostra e a seguir acrescentou-se NH4AC 10 M, numa quantidade correspondente a um terço em volume, à fase aquosa e fez-se precipitar 0 ADN com igual volume de isopropanol. O ADN assim reunido foi lavado com EtOH a 70% e depois de seco ao ar foi novamente colocado em suspensão em 100 pL de TE a pH 8,0. Para a reacção de amplificação utilizou-se um volume de 50 pL de cada preparação de ADN.

Exemplo 2

Amplificação do ADN micobacteriano

Preparou-se uma mistura reagente principal por forma a que cada reacção contivesse os reagentes seguintes: 25 pmol de cada iniciador, 10 nmol de cada dNTP, tampão de RCP a 2X (tampão a 10X = KC1500 mM, Tris-HCl 500 mM, pH 8,9, MgCl2 20 mM), 3 unidades de polimerase de Taq, 2 unidades de (JNG e H2O até perfazer 50 mL de mistura reaccional para cada reacção. Recobriu-se esta mistura padrão com 50 pL de óleo mineral e acrescentou-se a amostra de ADN à mistura de reacção que estava por baixo da camada de óleo. Acrescentou--se a quantidade necessária de H20 até perfazer um volume total de reacção de 100 pL. O ADN foi amplificado num equipamento de realização dos ciclos térmicos de modelo ‘Perkin Elmer’. O equipamento de realizar os ciclos térmicos foi programado para executar 37 ciclos de desnaturação, recombinação do iniciador e amplificação do iniciador; 2 ciclos de 98°C, 62°C e 72°C durante 1 minuto cada um, seguindo-se então 35 ciclos de 94°C, 62°C e 72°C de 1 minuto cada um. O equipamento de realização dos ciclos térmicos de modelo ‘Perkin Elmer’ foi programado para aquecer as amostras a 72°C durante um período indeterminado a seguir ao último ciclo, de modo a garantir que estava completa a amplificação final e para manter inactiva a enzima UNG, no caso de ter sido utilizado 0 sistema de esterilização UNG. Depois foi então possível analisar os produtos da amplificação por electroforese em gel e/ou por hibridação, pelo método das imagens pontilhadas. Se tiver de ser executada a análise por electroforese em gel, então acrescenta-se cerca de 10 pL de tampão de amostragem 10X (0,25% de xileno-cianol, 0,25% de azul-de-bromofenol, 25% de ‘Ficoll’) e depois extrai-se 0 óleo mineral e inactiva-se a polimerase de Taq com 100 pL de clorofórmio.

Exemplo 3

Protocolo das Imagens (Autorradiografias) Pontilhadas A pesquisa inicial da amostra amplificada permite detectar a presença do ácido nucleico de Mycobacterium. De acordo com o protocolo das imagens pontilhadas, efectua-se a desnaturação de uma pequena quantidade de ADN amplificado, aplica-se sobre um filtro de ‘nylon’ e procede-se à imobilização conforme adiante se descreve. Depois mergulha-se o filtro numa solução da sonda hibridante para realizar a hibridação com uma das sondas marcadas. Cada uma dessas sondas pode ser marcada radioactivamente, mas também é possível utilizar sondas conjugadas de forma covalente com peroxidase do rábano silvestre (PRS) para proporcionar um sistema de detecção não isotópico na presença de um substrato cromogénico ou quimioluminescente. O ADN relevante imobilizado é hibridado com uma mistura de duas sondas KY101 e KY102 específicas do género. Uma vez que se prevê que o número de amostras examinadas exceda bastante o número de sondas (uma mistura de duas sondas), o protocolo das imagens pontilhadas é o mais conveniente para esta pesquisa inicial. É possível hibridar um grande número de amostras diferentes em locais discretos e num único suporte sólido e expô-las simultaneamente às sondas marcadas por imersão do suporte numa solução dessas sondas. A amplificação é realizada conforme descrito no exemplo 2. A seguir efectua-se a desnaturação do produto da RCP por tratamento com uma substância alcalina. Acrescenta-se a uma quantidade de 5 pL do produto da RCP uma quantidade de 5 pL de EDTA 0,5 mM, pH 8,0, 8 pL de NaOH 5 N e 82 pL de H20. Deixa-se a mistura em repouso à temperatura ambiente durante 10 minutos para completar a desnaturação.

Os filtros de ‘nylon’ de tipo ‘BioDyne^B’ (Pall Corp., Glen Cove, NY) são preparados mergulhando-os em H20 durante 5 a 10 minutos e enxaguando-os ainda mais com

200 pL de Η20 depois de ter sido regulado o mecanismo de obtenção das imagens (autorra-diografias) pontilhadas (Bio-Dot™ de Bio rad. Richmond, CA). A seguir à desnaturação aplica-se uma quantidade de 100 pL da mistura da amostra, sob uma pressão hipobárica, a uma membrana de ‘nylon’, utilizando para tal o aparelho das autorradiografias pontilhadas. Depois enxagua-se cada cavidade com 200 pL de NaOH 0,4 N e depois enxagua-se rapidamente com SSC 2X e seca-se ao ar até já não haver resíduos de líquido. Imobiliza-se o ADN e faz--se reticular com um filtro de ‘nylon’ por irradiação ultravioleta com um fluxo de 1200 mJ/cm, utilizando para tal uma luminária de UV ‘Stratalinker™’ (Stratagene, LaJolla, CA) (ajustada para “autorreticulação).

Os filtros são “pré-hibridados” por imersão na solução tampão de hibridação (SSC 0,5X, solução de Denhardt 5X, 0,1% de DSS (o mesmo que SDS) e ADN do espermen de arenque na concentração de 50 pg/mL) em sacos isotérmicos, à temperatura de 60°C (em ar agitado) pelo menos durante 30 minutos. No caso de serem utilizadas sondas marcadas radio-activamente. então prepara-se o tampão com uma quantidade igual da mesma solução contendo a sonda marcada com a dose de 1 x 106 cpm e depois deixa-se o filtro hibridar durante um período compreendido entre 2 horas e a noite toda a 60°C. A seguir à hibridação efectua-se a lavagem dos filtros três vezes com SSC 2X/0,1% de DSS; duas vezes durante 20 minutos à temperatura ambiente e depois uma vez durante 20 minutos à temperatura rigorosa de 71°C em, banho de água agitado. Depois faz-se a autorradio-grafia dos filtros secos que são envolvidos por uma folha de plástico e expostos de modo a impressionarem uma película de raios-X a -70°C com uma ou duas camadas de intensificação.

Um método alternativo de visualização consiste em realizar a hibridação com sondas oligonucleotídicas conjugadas com a peroxidase do rábano silvestre, preparadas conforme 32 descrito por Levenson e Chang, 1989, em ‘PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications’ (Innis et ai, eds., Academic Press, San Diego) páginas 92-112 e Saiki et ai, 1988, N. Eng. J. Med. 319:537-541.

Realiza-se a hibridação com 2 pmol de sonda de PRS - OES (o mesmo que HRP-SSO) por cada 5 mL de solução de hibridação. A seguir à lavagem enxagua-se então os filtros, que irão ser revelados com um substrato de corante cromogénico, com uma solução de citrato de sódio 100 mM a pH 5,0, sendo depois colocados numa solução de citrato de sódio 100 mM a pH 5,0 contendo 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidima na concentração de 0,1 mg/mL (Fluka) e 0,0015% de peróxido de hidrogénio, e efectua-se a incubação sob agitação suave durante um período de 10 a 30 minutos à temperatura ambiente. Os filtros revelados são então enxaguados com água e imediatamente fotografados. Prepara-se o sistema de detecçao ‘TMB’ e utiliza-se praticamente conforme descrito nas instruções do estojo de ADN de tipo ‘ AmpliType® DQalpha’, concebido e fabricado por “Hoffinan-La Roche” e que pode ser obtido em “Perkin Elmer”. De acordo com outra variante, os filtros são revelados com o sistema de detecção quimioluminescente (ECL; Amersham, Arlington Heights, IL). Os filtros são enxaguados com uma solução STP (o mesmo que PBS) durante 5 minutos e colocados na solução de ECL durante um minuto, sob agitação suave. A seguir expõe-se os filtros de modo a impressionarem uma película de raios X à temperatura ambiente durante 1 a 5 minutos.

Exemplo 4

Protocolo das Imagens (Autorradiografías) Pontilhadas Reversas A identificação de espécies impõe que cada amostra seja exposta a um conjunto de sondas específicas das espécies; a identidade é indicada pela sonda que se liga ao ADN da amostra. Uma vez que cada amostra é exposta a várias sondas, é mais conveniente o protocolo das autorradiografias pontilhadas reversas. As sondas são fixadas em locais discretos de uma membrana e depois mergulha-se toda a membrana numa solução que contém o ADN relevante amplificado para permitir a hibridação com as sondas ligadas à membrana. O processo das autorradiografias pontilhadas reversas está descrito nos pedidos de patentes de invenção copendentes com os n- de série 197 000 e 347 495; na obra de Saiki et al., 1989, ‘Proc. Natl. Acad. Sei. 86:6230-6234’; e nas instruções que acompanham o estojo de ADN ‘AmpliType® DQalpha’, concebido e produzido por “Hoffinan-La Roche” e que pode ser obtido em “Perkin Elmer”. Os iniciadores de amplificação são biotinilados, conforme descrito na obra de Levenson e Chang, 1989, supra, por forma a que seja possível detectar facilmente qualquer ADN amplificado que hibride com as sondas ligadas à membrana.

De acordo com uma variante, efectua-se a detecção fazendo reagir peroxidase do rábano silvestre conjugada com estreptavidina (PRS-EA, o mesmo que SA-HRP) com ADN biotinilado (através dos iniciadores) e amplificado que hibridou com a sonda ligada à membrana. A PRS fica assim ligada, pela interaeção com EA-biotina (o mesmo que SA-biotina) ao ADN amplificado e pode ser utilizada para gerar um sinal por vários meios bem conhecidos, por exemplo, a geração de um composto colorido, v.g. mediante a oxidação da tetrametil-benzidina (ver a patente de invenção norte-americana n° 4 789 630).

Embora a sonda possa ser fixada à membrana por quaisquer meios, um método preferido consiste em “juntar um apêndice” numa região hibridante da sonda oligonucleotídica, constituído por uma sequência muito mais comprida de poli-dT. O “apêndice” resultante de poli-dT pode então reagir com grupos amina sobre uma membrana e ‘nylon’ para fixar a sonda à membrana de forma covalente. Esta reacção pode ser facilitada por irradiação UV. E possível utilizar desoxinibonucleotidil-transferase terminal (TdT, Ratliff Biochemical; para as reacções diante descritas admitir uma concentração de cerca de 120 unidades/pL que corresponde a 100 pmol/pL) para criar um apêndice poli-dT numa sonda, embora também seja possível sintetizar a sonda com o apêndice acrescentado num sintetizador de ADN co-mercialmente disponível. No caso de se utilizar um sintetizador de ADN para obter a sonda com o apêndice acrescentado, então o apêndice deve ser acrescentado na extremidade 5’ da sonda, de modo a que a terminação da cadeia prematura indesejada ocorra principalmente na região do apêndice.

As reacções com TdT devem ser realizadas num volume de cerca de 100 pL contendo sais de TdT IX, 200 pmol de oligonucleótido, DTT 800 μΜ e 60 unidades de TdT. O sal de TdT 10X é cacodilato de K 1000 mM, CoCl2 10 mM, ditiotreitol 2 mM, Tris-HCl 250 mM a pH 7,6 e é preparado conforme descrito por Roychoudhury e Wu, “Meth. Enzymol. 65:43-62, obra que aqui se considera incorporada por referência. É possível preparar uma solução-mãe 10X de dTTP 8 mM (neutralizada para pH 7 com NaOH) por razões de conveniência. A reacção com TdT deve ter lugar a 37°C durante 2 horas e depois deve ser interrompida por adição de 100 pL de EDTA 100 mM a pH 8. A concentração final do oligonucleótido com o apêndice acrescentado é de 1 pM (1 pmol/pL) e o comprimento do apêndice homopolimérico é de cerca de 400 resíduos. E possível modificar o comprimento do apêndice ajustando a proporção molar entre dTTP e o oligonucleótido. As sondas com os apêndices acrescentados podem ser guardadas a -20°C até virem a ser utilizadas. A membrana de ‘nylon’ preferida para o protocolo das autorradiografias pontilhadas reversas é a membrana de nylon de tipo ‘Biodine™ B’ com poros de 0,45 pm, fabricada por Pall e também comercializada por ICN, tal como sucede com a membrana de nylon 35 ΤΜϊ ‘BioTrans Com as sondas é possível pontilhar uma membrana muito convenientemente, utilizando para tal o aparelho de produzir autorradiografias pontilhadas de modelo ‘Bio-Dot™’ fabricado por “BioRad”. Com cada sonda aplica-se um pingo num único local discreto sobre a membrana. Mistura-se previamente cerca de 2 a 10 pmol de cada sonda, com o apêndice acrescentado, conjuntamente com 50 a 100 pL de tampão TE antes da aplicação ao aparelho de realizar as autorradiografias pontilhadas. Depois de a membrana estar pontilhada coloca-se rapidamente sobre papel absorvente para remover o excesso de líquido. Depois coloca-se a membrana dentro de um compartimento com uma luminária de UV, tal como a câmara com luminária ‘StratalinkerTM’ fabricada por “Stratagene”, e expõe-se a uma radiação de 50 a 60 mJ/cm2 a 254 nm para fixar a sonda com o apêndice à membrana de ‘nylon’. Após um enxaguamento rápido (durante cerca de 15 minutos na solução de hibridação) para remoção da sonda que não ficou ligada, a membrana está pois pronta para hibridação com o produto da RCP biotinilado.

Os produtos amplificados por RCP são desnaturados aquecendo-os a 95°C durante 3 a 10 minutos e depois acrescenta-se 40 pL de produto de desnaturado por RCP a cada um dos painéis de sondas para a hibridação.

Realiza-se a hibridação a 57°C durante 20 minutos em banho de água agitada numa solução tampão de hibridação constituída por SSC 0,5X, 0,25% de DSS e solução de Denhardt 5X. Substitui-se a solução tampão de hibridação com 3 mL de uma solução constituída por 25 pL de PRS-EA, que pode ser adquirida em ‘Perkin Elmer’, em 3,1 mL de solução tampão de hibridação e realiza-se a incubação durante 20 minutos a 57°C em banho de água agitada.

Realiza-se a lavagem com uma solução tampão de lavagem de SSC 2X e 0,1% de DSS. Após um breve enxaguamento da membrana com 10 mL de solução tampão de

lavagem realiza-se uma outra lavagem rigorosa durante 12 minutos com 10 mL de solução tampão à temperatura de 57°C. Depois realiza-se uma outra lavagem à temperatura ambiente durante 5 minutos, seguindo-se mais uma lavagem durante 5 minutos com 10 mL de uma solução de citrato de sódio 0,1 M a pH 5,0.

Efectua-se a ligação do cromogénio em 5 mL de solução de cromogénio constituída por 5 mL de citrato de sódio 0,1 M, 5 pL de peróxido de hidrogénio a 3% e 0,25 mL de cromogénio (TMB da ‘Perkin Elmer’) durante 25 a 30 minutos à temperatura ambiente. São ainda realizadas três lavagens de 10 minutos cada uma em água destilada e à temperatura ambiente. Uma pós-lavagem em STP IX à temperatura ambiente durante 30 minutos pode melhorar a qualidade do sinal. Durante os passo em que o cromogénio está presente, a membrana deve ficar protegida da luz por meio de uma folha de cobertura de alumínio. A membrana revelada deve ser fotografada para que haja um registo permanente.

Exemplo 5

Detecção do ADN Micobacteriano

Efectuou-se a detecção do ADN micobacteriano por amplificação com as formas biotiniladas dos iniciadores KY18 (SEQ ID N° 1) e HY75 (SEQ ID N° 2) específicos do género, utilizando o protocolo descrito no exemplo 2 supra, seguindo-se a hibridação com as sondas KY101 (SEQ ID N° 3) e KY102 (SEQ ID N° 4) específicas do género, utilizando o ensaio das autorradiografias pontilhadas descrito no exemplo 3 supra. No quadro l anterior estão indicadas as sequências das regiões de hibridação do iniciador de montante KY18 (SEQ Π) N° 1) e do iniciador de jusante KY75 (SEQ ID N° 2). No quadro 2 anterior estão indicadas as sequências das regiões de hibridação das sondas KY101 (SEQ ID N° 3) e KY102 (SEQ ID N° 4) específicas do género 37

Os iniciadores ΚΎ18 (SEQ ID N° 1) e KY75 (SEQ ID N° 2), específicos do género, foram utilizados na reacção em cadeia com a polimerase (RCP) para amplificar os ácidos nucleicos de 15 espécies de Mycobacterium. Os resultados obtidos estão agrupados no quadro 4. Conforme previsto, o iniciador KY18 (SEQ ID N° 1)/KY75 (SEQ ID N° 2) amplificou o ADN de todas as espécies de Mycobacterium com a excepção de M. simiae. Não era de prever a amplificação do ADN de M. simiae ou M. chitae devido ao facto de o iniciador KY75 (SEQ ID N° 2) ser diferente, em quatro das cinco bases do terminal 3’, de M. simiae e ser diferente, em duas bases do terminal 3’, de M. chitae. No entanto, atendendo a que M simiae raramente aparece associado a doenças dos seres humanos, a sua detecção não é clinicamente importante. Com a excepção do ADN de M. xenopi e M. terrae, todo o ADN micobacteriano amplificado e hibridado foi detectado por hibridação com as sondas KY101 (SEQ ID N° 3) e K.Y102 (SEQ ID N° 4) específicas do genero.

Quadro 4

Amplificação do ADN de Espécies Micobacterianas Diferentes e Hibridação com Sondas Específicas do Género

Micobactéria Amplificação Hibridação M. tuberculosis + + M. scrojulaceum + + M. fortuitum + + M. avium + + M. kansasii + + M. intracellulare + + M. phlei + + M. smegmatis + + M. mariinum + + 38 M. favescens + + M. xenopi + - M. simiae - - M. chelonae + + M. gordonae + + M. terrae + -

Testou-se a especificidade destes iniciadores procurando amplificar ADN proveniente de 22 espécies não micobacterianas diferentes. A partir do ADN de Corynebacter diphtheriae, Corynebacter xerosis, Nisseria sicca e Propionibacterium acnes foram obtidos apenas produtos da amplificação. No entanto, estes produtos da amplificação não foram capazes de hibridar com sondas específicas do género, pelo que não houve resultados falsos positivos. Os organismos testados estão enumerados no quadro 5 subsequente.

Quadro 5

Amplificação do ADN de Organismos não Micobacterianos

Organismo Amplificação Hibridação Bordatella períussis - - Borrelia burgdorjeri - - Corynebacter diphtheriae + - Corynebacter zerosis + - Enterobacter aerogenes - - Escherichia coli - - Haemophilus injluenzae - - Klebsiella pneumoniae - - Legionella pneumophila - - Neisseria gonorrhea - -

Neisseria meningitidis

Nisseria sicca +

Propionibaclerium acnes +

Psuedomonas aeruginosa

Salmonella typhimurium

Serratia marcescens

Staphylococcus aureus

Streproccus agalactiae

Streptococcus pyogenes

Streptomyces hygrocopicns

Streptomyces rubiginosis

Treponema pallidum

Exemplo 6

Identificação das Espécies

Uma vez detectado o ácido nucleico micobacteriano numa amostra clínica é possível determinar donde proveio esse ácido nucleico pelo padrão de hibridação com sondas específicas das espécies, utilizando o protocolo das autorradiografias pontilhadas reversas do Exemplo 4. As espécies com interesse clínico que podem ser detectadas pelo sistema de presente invenção são M. avium, M. intracellulare, M. kansasii e M. tuberculosis. Além disso, também é desejável a detecção de M. gordonae uma vez que este organismo aparece frequentemente em amostras clínicas. A figura 1 mostra os resultados de um teste sobre a especificidade de sondas específicas das espécies seleccionadas entre as sondas enumeradas no quadro 3. No quadro 3 anterior está indicada a sequência da região hibridante de cada sonda conjuntamente com a especificidade esperada. Foram utilizados produtos amplificados de ADN purificado de 13

espécies diferentes de Mycobactermm para testar a especificidade de sondas especificas dos géneros e de sondas específicas das espécies. Para cada espécie utilizou-se 1 pg de ADN purificado proveniente de bactérias criadas em cultura (o equivalente a cerca de 300 genomas bacterianos), conforme descrito no exemplo 2 e utilizando iniciadores biotinilados. Efectuou-se a detecção da hibridação da sonda utilizando o protocolo das autorradiografias pontilhadas reversas do exemplo 4. Como contraprova positiva para detectar a presença do ADN amplificado foram incluídas sondas específicas dos géneros nas fitas testadas, conjuntamente com as sondas específicas das espécies.

Exemplo 7

Amplificação do ARNr 16S Micobacteriano É possível amplificar o ARNr 16S criando em primeiro ligar ADNc por transcrição reversa e amplificando esse ADNc. São utilizados para tal os mesmos iniciadores utilizados no exemplo 2 anterior. Nesse exemplo, tanto a transcrição a alta temperatura como a amplificação por RCP foram realizadas com polimerase de Tth termostável.

Realiza-se a transcrição reversa num volume de 20 pL que contém os seguintes componentes: 8 pL de H2O, 2 pL de tampão de reacção de TR 10X (Tris-HCl 100 mM a pH 8,3 e KC1900 mM), 2 pL de MnCL2 10 mM, 2 pL de solução de dNTP (2 mM de cada uma das substâncias dATP, dCTP, dGTP e dTTP em H2O a pH 7,0), 2 pL do iniciador de “jusante” (7,5 mM em H20), 2pL de polimerase de Tth 0,18 pM em tampão de armazenagem IX (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, KC1 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, 0,2% de Tween 20 (“Pierce Surfactants”), glicerol a 50% (volume/volume) e 2 pL da solução de ARN da matriz (< 250 nm em Tris-HCl 10 mM e EDTA 1 mM). Todas as soluções que não continham Tris

41 foram tratadas com pirocarbonato de dietilo (PCDE, o mesmo que DEPC) para a remoção de todos os vestígios de ribonuclease contaminante, conforme descrito na página 190 da obra de Maniatus et al., 1982, ‘Molecular Cloning, a Laboratory Manual’ (Cod Springs Harbor Laboratoiy, Nova Iorque). Realiza-se a transcrição reversa a 72°C durante 15 minutos num aparelho de realizar os ciclos térmicos. Interrompe-se a reacção arrefecendo-a com gelo para a temperatura de 4°C. A amplificação por RCP tem lugar com os seguintes reagentes acrescentados: 2pL do iniciador remanescente (7,5 mM em H20), 2 pL de solução de dNTP (10 mM de cada uma das substâncias dATP, dCTP, dGTP e dTTP em H20 a pH 7,0), 8 pL de tampão de RCP 10X (Tris-HCl 100 mM a pH 8,3, KC1 1 mM, MgCl2 18,75 mM, EGTA 7,5 mM e glicerol a 50% (volume/volume)) e 68 pL de H20 tratada com PCDE. O ácido nucleico é amplificado num aparelho de realização dos ciclos térmicos de modelo ‘Perkin Elmer’, com o mesmo perfil térmico utilizado no exemplo 2. O produto amplificado é então analisado tal como descrito nos exemplos anteriores.

Exemplo 8

Ensaio em Placa de Microtitulaçâo para a Deteccão de Mvcobacterium Nesta variante da invenção a sonda é fixada a uma cavidade de uma placa de microtitulaçâo. O ADN relevante amplificado é hibridado com a sonda ligada, conforme descrito antes. Tal como sucedia no exemplo anterior, os iniciadores da amplificação são bio-tinilados para permitirem a detecção do ADN amplificado que hibrida com as sondas ligadas.

Em primeiro lugar deixou-se que as sondas desejadas, conjugadas com ASB, fossem adsorvidas pela superfície plástica de cada uma das cavidades. As cavidades foram então 42 bloqueadas com proteínas, por exemplo, a albumina do soro de bovinos. De preferência são utilizadas placas de 96 cavidades fornecidas por “Corning”.

Uma vez completada a amplificação procedeu-se à remoção dos tubos da RCP para fora do aparelho de execução dos ciclos térmicos (Perkin Elmer). Acrescentou-se a cada tubo da RCP 100 pL da solução de desnaturação. Utilizou-se uma ponta nova de pipeta para cada tubo. De acordo com uma variante, a detecção pode não ser realizada imediatamente. Nesse caso, os tubos da RCP foram guardados de um dia para o outro a uma temperatura entre 2°C e 8°C. As reacções de amplificação do produto desnaturado ficaram viscosas ao serem guardadas a uma temperatura entre 2°C e 8°C. Os tubos foram aquecidos rapidamente a uma temperatura entre 25°C e 30°C antes de serem abertos para facilitar o trabalho com a pipeta. Removeu-se o número adequado de 8 fitas de placas de microtitulação com cavidades (no mínimo de duas fitas) que foram depois colocadas na estrutura de suporte das placas de microtitulação. Com uma pipeta transferiu-se 100 pL de tampão de hibridação para cada uma das cavidades da placa de microtitulação. A solução de desnaturação contém NaOH 0,4 N; EDTA 80 mM e 0,005% de azul-de--tirnol. O tampão de hibridação/neutralização contém: NaSCN 3 M; NaH2P04 80 mM; NaH2P04 10 mM; e 0,125% de Tween 20. Antes da utilização verificou-se se o pH estava no valor de 5,0 ±0,2.

Utilizando pontas obturadas, com um pipetador multicanais, pipetou-se 25 pL da reacçào de amplificação desnaturada proveniente de cada um dos tubos de RCP do tabuleiro para a correspondente posição da cavidade na placa de microtitulação. Cobriu-se a placa com a tampa respectiva e bateu-se-lhe levemente de lado 10 a 15 vezes. As cavidades para onde havia sido pipetado o reagente adequado passaram a ter uma cor amarelo claro. Se isso não

43 acontecer, ou se apenas tiver ocorrido uma mudança simples para uma cor azul, é porque se acrescentou excesso de amplicão. O teste prossegue à medida que vão aumentando os valores positivos de DO, mas os valores negativos de DO não são afectados. Realizou-se depois a incubação da placa durante 60 minutos a 37°C. Após a hibridação inicial a 37°C durante 1 hora removeu-se o tampão de hibridação/neutralização e substituiu-se com tampão igual e efectuou-se a incubação da placa durante mais 15 minutos a 37°C. A seguir à incubação lavou-se a placa 5 vezes com solução de lavagem. A lavagem da placa pode ser realizada manualmente ou com um aparelho automático de lavagem de placas de microtitulação, programado para o efeito. Para a lavagem utilizou-se o tampão de lavagem de RCP IX. Preparou-se um tampão de lavagem de RCP concentrado 10X do modo seguinte: 9,94 g por cada litro de fosfato de sódio dibásico; 4,41 g por cada litro de fosfato de sódio (monobásico); 3,722 g por cada litro de EDTA; 87,66 g por cada litro de cloreto de sódio; 13,7 g por cada litro de Tween 20; e 10 g por cada litro de ’Pro Clin 300’ (Rohm and Haas, Philadelphia, PA). O pH da solução é ajustado com ácido fosfórico (é preferível um valor de pH entre 6,5 e 7,1).

Para a lavagem manual esvaziou-se o conteúdo da placa e bateu-se-lhe levemente a seco. Introduziu-se em cada cavidade da placa que se pretendia testar 300 pL de solução de lavagem e deixou-se a placa secar durante 15 a 30 segundos. Esvaziou-se novamente a placa e bateu-se-lhe levemente a seco. Repetiu-se este processo de lavagem mais 4 vezes.

Com um aparelho automático de lavar microplacas utilizou-se o procedimento a seguir descrito. Aspirou-se o conteúdo das cavidades. Programou-se o aparelho de lavagem de modo a acrescentar 350 uL da solução de lavagem a cada cavidade da placa que se pretendia testar, esperou-se que ocorresse a impregnação durante 30 segundos e aspirou-se. Estes passos foram repetidos mais 4 vezes. Depois bateu-se levemente na placa a seco.

Juntou-se 100 pL de conjugado a cada cavidade da placa que se pretendia testar. Preparou-se o conjugado de avidina-PRS conforme a seguir se descreve. A concentração de diluente é 0,1 M; 0,25% de ‘Emulsit 25’ (DKS International Inc., Tóquio, Japão); 1,0% de ‘Kathon CG’ (Rohm and Haas, Philadelphia, PA); 0,1% de fenol; 1,0% de γ-globulina de bovino. Ajustou-se o pH da solução para 7,3 com HC1 concentrado. A este diluente acrescentou-se 10 nm de avidina conjugada (Vector Labs, Burlingame, CA). Depois tapou-se a placa e a seguir incubou-se durante 50 minutos a 37°C e mais uma vez se lavou conforme descrito antes. Preparou-se o substrato de trabalho misturando 2,0 mL de substrato A e 0,5 mL de substrato B para cada múltiplo de duas fitas de placas de microtitulação de 8 cavidades (16 testes). O substrato A contém peróxido de hidrogénio 3 mM, citrato 6,5 mM e 0,1% de ‘Kathon CG’. O substrato B contém 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidina 4,2 mM e 40% de dimetilformamida. Preparou-se o substrato de trabalho não mais do que 3 horas antes da sua utilização e guardou-se ao abrigo da luz solar directa.

Acrescentou-se 100 pL de substrato de trabalho (mistura de substratos A e B) a cada cavidade da placa que se pretendia testar. Depois tapou-se a placa e incubou-se ao abrigo da luz durante 10 minutos à temperatura ambiente (entre 20°C e 25°C). Acrescentou-se 100 pL de ‘Stop Reagent’ (H2S04 a 5%) a cada cavidade que se pretendia testar. Leu-se a absorvência de cada cavidade a 450 nm ao fim de 1 hora após a adição de ‘Stop Reagent’. Registou-se o valor da absorvência para cada espécimen e contraprova.

Exemplo 9

Construção de um Vector de Contraprova Positiva Útil nos Métodos para a Amplificação e para a Detecção dos Ácidos Nucleicos Micobacterianos

Efectuou-se a síntese dos oligonucleótidos que contêm as sequências que se ligam às sondas específicas das espécies e também aos seus complementos (KY178 [SEQID N° 24] --KY181 [SEQ ID N° 27], infra). (Estes oligonucleótidos possuem locais de reconhecimento para as enzimas de restrição nos dois terminais para facilitar a clonagem). Combinou-se l pg de cada uma das sequências KY178 (SEQ ID N° 24) e K.Y179 (SEQ ID N° 25) ou KY180 (SEQ ID N° 26) e KY181 (SEQ ID N° 27), aqueceu-se durante 5 minutos a 98°C e depois incubou-se durante 1 hora a 75°C para permitir a recombinação das cadeias complementares. Procedeu-se à separação dos produtos recombinados a partir dos oligonucleótidos residuais de cadeia singular por electroforese através de ‘Nusieve’ a 3% (FMC Products)/gel de agarose a 1%. Efectuou-se o corte das bandas dos produtos de cadeia dupla e realizou-se a eluição do ADN. Os fragmentos de ADN foram então cortados com enzimas de restrição adequadas e ligados uns aos outros. Isolou-se os produtos da ligação a partir do gel de Nusieve/agarose, conforme referido antes.

Preparou-se o vector recipiente. O vector recipiente era um plasmídeo no qual se inseriu um fragmento do gene de ARNr 16S de M. tb que continha os locais de ligação do iniciador e da sonda, e foi preparado conforme adiante se descreve.

Amplificou-se 50 pg de ADN de M tuberculosis utilizando os iniciadores KY70 (SEQ ID N° 28) e CR01 (SEQ ID N° 29) na presença de 50 pmol de CR01 (SEQ ID N° 29), 80 pmol de KY70 (SEQ ID N° 28), 20 nmol de cada dNTP, 2,5 unidades de polimerase de Taq e tampão de RCP IX (Tris-HCl 50 mM, pH 8,9; KC1 50 mM; MgCl? 1,5 mM) num volume total de reacção de 100 pL. As condições de realização dos ciclos térmicos são as explicitadas no exemplo 2. Procedeu-se à extracção dos produtos de amplificação com 100 pL de clorofórmio.

Tanto os produtos de amplificação como o vector pBS(+) (Stratagene) foram digeridos com a endonuclease de restrição Pst I, extraídos uma vez com fenol/clorofórmio e depois obrigados precipitar com etanol. (O iniciador CROl contém um local Pst I na extremidade 5’ e o produto de amplificação possui um local interno Pst I a jusante dos locais de ligação para os iniciadores e para as sondas micobacterianas específicas). O vector de corte Pst I foi desfosforilado por tratamento com fosfatase do intestino do vitelo (Maniatis) e extraído com fenol/clorofórmio e obrigado a precipitar com etanol. Os produtos de amplificação assim preparados foram ligados ao vector em condições convencionais (Maniatis). O ADN ligado foi transformado dentro de um microrganismo E. Coli qualificado. As colónias portadoras dos plasmídeos que contêm o produto intercalar desejado foram identificadas por hibridação pontilhada das colónias com a sonda KY21 (SEQ 1D N° 59 específica de íb, conforme a seguir se descreve. As bactérias foram dispostas às riscas sobre um filtro circular de nitrocelulose aplicado sobre uma placa de gelose nutriente e depois ficaram a crescer de um dia para o outro. Removeu-se o filtro e aplicou-se sucessivamente (com a face que continha as bactérias voltada para cima) sobre papéis de filtro 3MM impregnados com DSS a 10% (3 minutos), NaOH 0,5M/NaCl 1,5 M (5 minutos), Tris-HCl 0,5 M a pH 8/NaCl 1,5 M (5 minutos) e SSC 2X (5 minutos). Deixou-se os papéis de filtro secar ao ar. O ADN foi interligado sobre o filtro por irradiação UV e depois hibridou com KY21 (SEQ ID N° 5) e a seguir lavou-se conforme descrito no exemplo 3. 47

Sequências Oligonucleotí dicas KY70 - SEQ ID N° 28

5’ GCGGTACCTG CACACAGGCC ACAAGGGAA CR01 - SEQ ID N° 29

5’ CGCCTGCAGT TAACACATGC AAGTCGAACG G

Este vector, designado por pKY5, foi cortado com as enzimas de restrição Sty I e Xho I para se remover um fragmento de 174 pb que continha o local de ligação da sonda específica da espécie, mas deixando ficar intactos os locais de ligação da sonda específicos do iniciador e do género. O plasmídeo de corte foi separado do fragmento de 174 pb por electroforese através de gel de agarose a 1,5% de baixa temperatura de fusão. A banda que continha o vector foi cortada a partir do gel e purificada por cromatografia através de uma coluna NACS (Bethesda Research Lab), tendo precipitado em etanol. O fragmento intercalar que contém os locais de reconhecimento para as sondas específicas das espécies é ligado ao vector preparado. Os produtos de ligação são transformados dentro de bactérias hospedeiras qualificadas.

Os transformantes que contêm os segmentos intercalares adequados são identificados por amplificação por RCP. Coloca-se novamente em suspensão as colónias bacterianas transformantes em 0,5 mL de tampão TE. Introduz-se 50 μι da suspensão bacteriana em tubos da RCP que contêm os componentes necessários para a amplificação do ADN micobacteriano e realiza-se a amplificação conforme descrito antes. As bactérias portadoras dos plasmídeos que contêm o segmento intercalar desejado vão gerar produtos de RCP de 640 pb utilizando o par de iniciadores KY18 (SEQ. ID NO. 1) e KY75 (SEQ. ID NO. 2). A amplificação das bactérias que contêm o plasmídeo original pKY5 gera produtos de RCP de

48 584 pb. Os amplicões assim gerados podem ser hibridados com sondas micobacterianas específicas dos géneros e específicas das espécies por hibridação reversa das autorradiografias pontilhadas, conforme descrito no exemplo 4, para confirmar a presença dos locais de hibridação para as sondas específicas dos géneros e específicas das espécies descritas nos exemplos. E possível preparar de igual modo os plasmídeos de contraprova positiva para hibridação com sondas específicas de géneros e com um subconjunto seleccionado de sondas específicas das espécies. Por exemplo, ao utilizar um estojo pode ser desejável que este contenha um plasmídeo de contraprova positiva que permita distinguir entre o microrganismo da tuberculose e outras espécies, para além de compreender um plasmídeo de contraprova positiva que contenha as sequências KY178-KY181 (SEQ. ID NOS. 24-27).

Sequências oligonucleotídicas KY178 - SEP. ID NO, 24

5’ CCATCGATAG GACCATTCTG CGCATGTGGT

AGGCTCACTT TGTGGGTTGA CGGTAGGTAA TCCAAGGCA 3’ KY179 - SEP. ID NO, 25

5’ TGCCTTGGAA GCTTTCCACC ACAAGGCATG

CATGTGTCCT GTGGTCCTAT TCGGTATTAG TATCGATGG 3’ KY180 - SEP. ID NO. 26

GTCTTGTGGT CGCATGTCTT

5’ CCGCTCGAGA CGGGATGCAT

GTGGAAAGCT TAACTCAAGA KY181-SEQ.IDNQ. 27 CCATCGATGC AAAAGCTTTC CACCAGAAGA CTAAAGTTAC CGCTAAAGCG CTTTCCACCA Exemplo 10

Utilização do plasmideo de contraprova positiva Uma das utilizações do plasmideo de contraprova positiva consiste em verificar a eficiência da amplificação em qualquer experiência específica. Em tais aplicações, são efectuadas diluições sequenciais do plasmideo de contraprova positiva. E possível utilizar cópias do plasmideo, em número conhecido, como matrizes nas reacções de amplificação. O menor número de moléculas de ADN plasmídico que é possível amplificar dá uma medida da eficiência da reacção de amplificação. A outra utilização do plasmideo de contraprova positiva consiste em gerar produtos que podem ser utilizados para verificar a eficiência com que as sondas específicas de géneros e específicas das espécies detectam o ADN micobateriano. Os produtos gerados por amplificação, conforme descrito antes, podem servir de substrato na reacção de hibridação. A geração dos sinais de hibridação adequados permite fazer uma avaliação do modo como as sondas são capazes de detectar o ADN micobacteriano.

50

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG 23 INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: GCCCGTATCG CCCGCACGCT CACA 24 INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: TCGCGTTGTT CGTGAAATCT CACGGCTTAA 30

51 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: TCGCGTTGTT CGTGAAAACT CACAGCTTAA 30 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TEPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: ACGGGATGCA TGTCTTGTGG TGGAAAGCGC TTTAGC 36 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6: ACTTGGCGCA TGCCTTGTGG TGGAAAGCTT 30

- INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TEPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: TTTAGGCGCA TGTCTTTAGG TGGAAAGCTT 30 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 parese de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: TCAAGACGCA TGTCTTCTGG TGGAAAGCTT TTGC 34 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: TCCCGAAGTG CAGGCCAGAT TGCCCACGTG 30 53 INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: GAAGGCTCAC TTTGTGGGTT GACGGTAGGT 30 INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: GCAATCTGCC TGCACACCGG GATAAGCCTG 30 INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: GGGTCTAATA CCGAATAGGA CCACAGGACA CATG 34 / Ό 54 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TLPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: TCGCGTTGTT CGTGAAATCT CACAGCTTAA 30 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: TCGCGTTGTT CGTGGAATCT CACAGCTTAA 30 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: TCGCGTTGTT CGTGGAATGC CACAGCTTAA 30

55 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: ATAGGACCAT TCTGCGCATG TGGTGTGGTG 30 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17: ACCTCAAGAC GCATGTCTTC TGGT 24 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: CCGAATAGGA CCACAGGACA CATG 24

56 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA Π) NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ED NO: 19: ACCTTTAGGC GCATGTCTTT AGGT 24 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20: AACACTTGGC GCATGCCTTG TGGT 24 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21: GAAGGCTCAC TTTGTGGGTT GACG 24 57 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22: TGTGGTGGAA AGCGCTTTAG CGGT 24 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23: AGGACCATTC TGCGCATGTG GTGT 24 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N0 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 139 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:24: CCATCGATAG GACCATTCTG CGCATGTGGT GTGGTGGGTC TAATACCGAA TAGGACCACA 60 GGACACATGA AGGCTCACTT TGTGGGTTGA CGGTAGGTAA CACTTGGCGC ATGCCTTGTG 120 GTGGAAAGCT TCCAAGGCA 139 58 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ED N0 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 139 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:25: TGCCTTGGAA GCTTTCCACC ACAAGGCATG CGCCAAGTGT TACCTACCGT CAACCCACAA 60 AGTGAGCCTT CATGTGTCCT GTGGTCCTAT TCGGTATTAG ACCCACCACA CCACATGCGC120 AGAATGGTCC TATCGATGG 139 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 126 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26: CCGCTCGAGA CGGGATGCAT GTCTTGTGGT GGAAAGCGCT TTAGCGGTAA CTTTAGGCGC 60 ATGTCTTTAG GTGGAAAGCT TAACTCAAGA CGCATGTCTT CTGGTGGAAA GCTTTTGCAT 120 CGATGG 126 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 126 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 59 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:27: CCATCGATGC AAAAGCTTTC CACCAGAAGA CATGCGTCTT GAGTTAAGCT TTCCACCTAA 60 AGACATGCGC CTAAAGTTAC CGCTAAAGCG CTTTCCACCA CAAGACATGC ATCCCGTCTC 120 126

GAGCGG - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N0 28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0 28: GCGGTACCTG CACACAGGCC ACAAGGGAA 29 - INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA. ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:29: CGCCTGCAGT TAACACATGC AAGTCGAACG G 31

Lisboa, 14 de Fevereiro de 2000

3 Agente Oficial da Propriedade Industrial

Rua do Salitre, 195, r/c-Drt 1250 LISBOA

Claims

Reivindicações 1. Par de iniciadores oligonucleotídicos capazes de amplificarem uma região relevante do gene do ARN ribossómico 16S ou o correspondente ARN de uma espécie micobacteriana, em que o primeiro iniciador compreende a sequência KY18 (SEQ ID NO. 1) e o segundo iniciador compreende a sequência KY75 (SEQ ID NO. 2).
2. Estojo para detectar e facultativamente identificar um ácido nucleico micobacteriano numa amostra, contendo esse estojo um par de iniciadores de acordo com a reivin-.dicação 1.
3. Estojo de acordo com a reivindicação 2, o qual contém também uma sonda oligo-nucleotídica que compreende uma sequência de ácido nucleico capaz de hibridar com a região do gene ARN ribossómico 16S amplificado pelo par de iniciadores KY18 (SEQ ID NO. 1) e KY75 (SEQ ID NO. 2).
4. Estojo de acordo com a reivindicação 3, em que a sequência da referida sonda não é idêntica a nenhuma sequência das espécies micobacterianas que se pretende detectar.
5. Estojo de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 4, o qual contém também pelo menos uma sonda oligonucleotídica seleccionada entre o conjunto constituído por uma subsequência que compreende pelo menos 14 nucleótidos das sequências KY21 (SEQ ID NO. 5), K.Y25 (SEQ ID NO. 6), KY26 (SEQ ID NO. 7), KY63 (SEQ ID NO. 2 8), ΚΥ151 (SEQ ID NO. 9), KY106 (SEQ ID NO. 10), KY126 (SEQ ID NO. 11), KY139 (SEQ ED NO. 12), KY157 (SEQ ID NO. 16), KY167 (SEQ ID NO. 17), KY168 (SEQ ID NO. 18), KY169 (SEQ ID NO. 19), KY170 (SEQ ID NO. 20), KY171 (SEQ ID NO. 21), KY172 (SEQ ID NO. 22) e KY173 (SEQ ID NO. 23) e uma sequência que lhes é complementar.
6. Estojo de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 4, o qual compreende também um painel de sondas oligonucleotídicas constituído pelo menos por duas sondas oligonucleotídicas seleccionadas entre o conjunto constituído por uma subsequência que compreende pelo menos 14 nucleótidos das sequências KY21 (SEQ ID NO. 5), KY25 (SEQ ID NO. 6), KY26 (SEQ ID NO. 7), KY63 (SEQ ID NO. 8), KY151 (SEQ ED NO. 9), KY106 (SEQ ID NO. 10), KY126 (SEQ ID NO. 11), KY139 (SEQ ID NO. 12), KY157 (SEQ ID NO. 16), KY167 (SEQ ID NO. 17), KY168 (SEQ ID NO. 18), KY169 (SEQ ID NO. 19), KY170 (SEQ ID NO. 20), KY171 (SEQ ID NO. 21), KY172 (SEQ ID NO. 22) e KY173 (SEQ ID NO. 23) e uma sequência que lhes é complementar.
7. Estojo de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 6, o qual compreende também uma sequência oligonucleotídica de contraprova interna flanqueada por sequências de montante e de jusante que são complementares dos iniciadores KY18 (SEQ ID NO. 1) e KY75 (SEQ ID NO. 2).
8. Processo para detectar o ácido nucleico micobacteriano contido numa amostra, o qual compreende os passos seguintes: (a) amplificar uma região do referido ácido nucleico a partir de um gene de ARN ribossómico 16S, utilizando um par de iniciadores de acordo com a reivindicação 1; (b) misturar o referido ácido nucleico amplificado no passo (a) com uma sonda específica de um género de Mycobacterium-, e (c) detectar os híbridos formados entre o referido ácido nucleico e a referida sonda.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a sonda específica de um género de Mycobacterium é uma sonda que possui uma sequência seleccionada entre o conjunto constituído pelas sequências KY101 (SEQ ID NO. 3), KY102 (SEQID NO. 4), KY165 (SEQ ED NO. 13) e KY166 (SEQ ID NO. 14) e uma sequência que lhes é complementar.
10. Processo para classificar um microrganismo micobacteriano, o qual compreende os passos seguintes: (a) amplificar uma região de ácido nucleico a partir de um gene de ARN ribossómico 16S do referido microrganismo micobacteriano, utilizando um par de iniciadores de acordo com a reivindicação 1; (b) misturar o referido ácido nucleico amplificado no passo (a) com um painel de sondas oligonucleotídicas constituído pelo menos por duas sondas oligonucleotídicas seleccionadas entre o conjunto constituído pelas sequências KY21 (SEQ ID NO. 5), KY25 (SEQ ID NO. 6), KY26 (SEQ ID NO. 7), KY63 (SEQ ID NO. 8), ΚΎ151 (SEQ ID NO. 9), KY106 (SEQ ID NO. 10), K.Y126 (SEQ ID NO. 11), K.Y139 (SEQ ID NO. 12), KY157 (SEQ ID NO. 16), KY167 (SEQ ID NO. 17), K.Y168 (SEQ ID NO. 18), KY169 (SEQ ID NO. 19), KY170 (SEQ ID NO. 20), KY171 (SEQ ID NO. 21), ΚΎ172 4 (SEQ ID NO. 22) e KY173 (SEQ ID NO. 23) e uma sequência que lhes é complementar; e (c) detectar os híbridos formados entre o referido ácido nucleico e as referidas sondas.
11. Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 a 10, em que a amplificação é realizada por meio de uma reacção em cadeia com a polimerase. Lisboa, 14 de Fevereiro de 2000

Rua do Satttre, t!)5, r/c-Drt. 1258 LISBOA I Resumo “Iniciadores e sondas de micobactérias” É possível utilizar iniciadores e sondas para detectar o ácido nucleico de um microrganismo micobacteriano numa amostra e para determinar a espécie donde proveio esse ácido nucleico. Os iniciadores amplificam as regiões do gene de ARN ribossómico 16S e hibridam com regiões conservadas entre espécies. As sondas específicas de géneros hibridam com sequências dentro da região amplificada e conservada entre espécies micobacterianas, ao passo que as sondas específicas de espécies hibridam com uma região variável, pelo que apenas é possível determinar exclusivamente a identidade das espécies. A invenção proporciona sondas de consenso para a detecção de ácidos nucleicos micobacterianos, não sendo essas sondas idênticas a nenhuma das sequências das espécies micobacterianas. Lisboa, 14 de Fevereiro de 2000

fea do S:>iá1re, 195,, r/e-Drf. 1250 LISBOA