JPH11239484A - ウエルシュ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
ウエルシュ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH11239484A JPH11239484A JP10045555A JP4555598A JPH11239484A JP H11239484 A JPH11239484 A JP H11239484A JP 10045555 A JP10045555 A JP 10045555A JP 4555598 A JP4555598 A JP 4555598A JP H11239484 A JPH11239484 A JP H11239484A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応
のプライマーとして機能させる遺伝子増幅技術により、
ウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子を検出すること
を目的とする。 【解決手段】本発明は、ウエルシュ菌のエンテロトキシ
ン遺伝子に選択的にハイブリダイズする配列番号１〜９
のオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、エンテロトキ
シン産生性のウエルシュ菌を検出する。
のプライマーとして機能させる遺伝子増幅技術により、
ウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子を検出すること
を目的とする。 【解決手段】本発明は、ウエルシュ菌のエンテロトキシ
ン遺伝子に選択的にハイブリダイズする配列番号１〜９
のオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、エンテロトキ
シン産生性のウエルシュ菌を検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査、とりわ
け食中毒検査、もしくは下痢症検査におけるエンテロト
キシン産生性ウエルシュ菌、およびウエルシュ菌のエン
テロトキシン遺伝子の検出に関するものである。
け食中毒検査、もしくは下痢症検査におけるエンテロト
キシン産生性ウエルシュ菌、およびウエルシュ菌のエン
テロトキシン遺伝子の検出に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ウエルシュ菌は偏性嫌気性であり、増殖
条件が悪くなると芽胞を形成する。また自然界（土壌、
下水、河川等）にも広く分布し、ヒトや家畜の腸管内常
在菌でもある。これらの理由からか、ウエルシュ菌食中
毒の原因食品としては、獣肉、魚介類の調理食品が加熱
調理された後、不適切に放置されたものが多い。ウエル
シュ菌食中毒にかかる検査では、患者の糞便および食品
が主な検体となる。これらの検体中からウエルシュ菌を
検出し、同定する場合には、嫌気条件下で増菌培養およ
び分離培養を行い、得られた菌コロニ−数個について生
化学性状試験を行う。
条件が悪くなると芽胞を形成する。また自然界（土壌、
下水、河川等）にも広く分布し、ヒトや家畜の腸管内常
在菌でもある。これらの理由からか、ウエルシュ菌食中
毒の原因食品としては、獣肉、魚介類の調理食品が加熱
調理された後、不適切に放置されたものが多い。ウエル
シュ菌食中毒にかかる検査では、患者の糞便および食品
が主な検体となる。これらの検体中からウエルシュ菌を
検出し、同定する場合には、嫌気条件下で増菌培養およ
び分離培養を行い、得られた菌コロニ−数個について生
化学性状試験を行う。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ところが、これらの培
養段階に要する時間は、それぞれ１８〜４８時間であ
り、総所要時間にすると５〜６日となり、非常に長時間
である。しかもウエルシュ菌は自然界に広く分布するの
で、食中毒検査の原因菌であるとするには、ウエルシュ
菌の検出知見だけでは不十分である。
養段階に要する時間は、それぞれ１８〜４８時間であ
り、総所要時間にすると５〜６日となり、非常に長時間
である。しかもウエルシュ菌は自然界に広く分布するの
で、食中毒検査の原因菌であるとするには、ウエルシュ
菌の検出知見だけでは不十分である。
【０００４】さらに患者糞便からのエンテロトキシン検
出、分離菌のエンテロトキシン産生検査、血清型別およ
び推定原因食品中の菌数測定等の知見が必要であり、検
査に費やす時間と労力は極めて大きいと言える。したが
って、現在のウエルシュ菌検査法では、迅速性および簡
便性に欠け、実効的でない。
出、分離菌のエンテロトキシン産生検査、血清型別およ
び推定原因食品中の菌数測定等の知見が必要であり、検
査に費やす時間と労力は極めて大きいと言える。したが
って、現在のウエルシュ菌検査法では、迅速性および簡
便性に欠け、実効的でない。
【０００５】そこで、本発明は、オリゴヌクレオチドを
核酸合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅
技術により、ウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子を
検出するもので、臨床検査、とりわけ食中毒・下痢症に
かかる検査に簡便、迅速、かつ高感度なウエルシュ菌の
検査法を提供することにある。
核酸合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅
技術により、ウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子を
検出するもので、臨床検査、とりわけ食中毒・下痢症に
かかる検査に簡便、迅速、かつ高感度なウエルシュ菌の
検査法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、ウエルシュ菌
のエンテロトキシン遺伝子に選択的にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用いている。これに
より、ウエルシュ菌の食中毒病原因子であるエンテロト
キシンを産生する菌のみを選択的に検出することを特徴
としている。
のエンテロトキシン遺伝子に選択的にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用いている。これに
より、ウエルシュ菌の食中毒病原因子であるエンテロト
キシンを産生する菌のみを選択的に検出することを特徴
としている。
【０００７】ここで、オリゴヌクレオチドは、以下の配
列群、 （５’）ｄ−ＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＡＣ
Ｃ−（３’）・・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＴＣＡＡＧＴ
Ｃ−（３’）・・・（ｂ：配列番号２） （５’）ｄ−ＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＴＡＧ
ＣＣ−（３’）・・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＧＧＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧ
ＧＡＴ−（３’）・・・（ｄ：配列番号４） （５’）ｄ−ＴＡＡＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＴ
Ｃ−（３’）・・・（ｅ：配列番号５） （５’）ｄ−ＧＡＡＣＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＡＴＴＴＣ
Ｃ−（３’）・・・（ｆ：配列番号６） （５’）ｄ−ＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＣＡＡ
ＧＧ−（３’）・・・（ｇ：配列番号７） （５’）ｄ−ＡＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡ
Ｇ−（３’）・・・（ｈ：配列番号８） （５’）ｄ−ＣＣＡＴＣＡＣＣＴＡＡＧＧＡＣＴＧＴＴ
Ｃ−（３’）・・・（ｉ：配列番号９） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
列群、 （５’）ｄ−ＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＡＣ
Ｃ−（３’）・・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＴＣＡＡＧＴ
Ｃ−（３’）・・・（ｂ：配列番号２） （５’）ｄ−ＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＴＡＧ
ＣＣ−（３’）・・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＧＧＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧ
ＧＡＴ−（３’）・・・（ｄ：配列番号４） （５’）ｄ−ＴＡＡＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＴ
Ｃ−（３’）・・・（ｅ：配列番号５） （５’）ｄ−ＧＡＡＣＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＡＴＴＴＣ
Ｃ−（３’）・・・（ｆ：配列番号６） （５’）ｄ−ＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＣＡＡ
ＧＧ−（３’）・・・（ｇ：配列番号７） （５’）ｄ−ＡＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡ
Ｇ−（３’）・・・（ｈ：配列番号８） （５’）ｄ−ＣＣＡＴＣＡＣＣＴＡＡＧＧＡＣＴＧＴＴ
Ｃ−（３’）・・・（ｉ：配列番号９） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【０００８】また、遺伝子増幅は、Saiki らが開発した
Polymerase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略す
る；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、ウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子の塩
基配列を有する領域）を検出する場合、その領域の両端
の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブ
リダイゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用意
し、それを熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対
し、鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとし
て機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離
し、再び同様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰
り返すことで、２つのプライマーに挟まれた領域は検出
できるまでにコピー数が増大してくる。
Polymerase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略す
る；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、ウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子の塩
基配列を有する領域）を検出する場合、その領域の両端
の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブ
リダイゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用意
し、それを熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対
し、鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとし
て機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離
し、再び同様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰
り返すことで、２つのプライマーに挟まれた領域は検出
できるまでにコピー数が増大してくる。
【０００９】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
【００１０】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。プライマーが規定してい
るウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子のヌクレオチ
ド配列における増幅領域は、５０塩基から２，０００塩
基、望ましくは、１００塩基から１，０００塩基となれ
ばよい。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。プライマーが規定してい
るウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子のヌクレオチ
ド配列における増幅領域は、５０塩基から２，０００塩
基、望ましくは、１００塩基から１，０００塩基となれ
ばよい。
【００１１】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜９
５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃
で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイ
クル行って増幅させる。検出はＰＣＲを終えた反応液を
そのままアガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅
されたヌクレオチド断片の存在、およびその長さを確認
できる。その結果から検体中にプライマーが認識すべき
配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定
することができる。この判定は、そのままエンテロトキ
シン遺伝子をもつウエルシュ菌の有無を判定するものと
なる。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他
の電気泳動法やクロマトグラフィーも有効である。
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜９
５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃
で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイ
クル行って増幅させる。検出はＰＣＲを終えた反応液を
そのままアガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅
されたヌクレオチド断片の存在、およびその長さを確認
できる。その結果から検体中にプライマーが認識すべき
配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定
することができる。この判定は、そのままエンテロトキ
シン遺伝子をもつウエルシュ菌の有無を判定するものと
なる。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その他
の電気泳動法やクロマトグラフィーも有効である。
【００１２】
【実施例】（実施例１）検体の調製 使用したウエルシュ菌は患者等から由来したもので、各
菌株保存機関から分与された総計３４株を用いた。各菌
株の培養は、ＧＡＭブイヨン（日水製薬）、３７℃、嫌
気的条件下で１晩行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍
に希釈し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った後、こ
れらを遠心し、その上清を検体とした。
菌株保存機関から分与された総計３４株を用いた。各菌
株の培養は、ＧＡＭブイヨン（日水製薬）、３７℃、嫌
気的条件下で１晩行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍
に希釈し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った後、こ
れらを遠心し、その上清を検体とした。
【００１３】プライマーの合成 文献（Maruke van Damme-Jongsten, Antonie van Leeuw
enhoek, 56:181-190(1989)）に記載されたウエルシュ菌
のエンテロトキシン遺伝子の塩基配列から、請求項第１
項に示した各配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴ
ヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、サイクロン
プラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社
製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト法に
より行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18
逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行っ
た。
enhoek, 56:181-190(1989)）に記載されたウエルシュ菌
のエンテロトキシン遺伝子の塩基配列から、請求項第１
項に示した各配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴ
ヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、サイクロン
プラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社
製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト法に
より行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18
逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行っ
た。
【００１４】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７．０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．０μｌ、プライマー(2) １．
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．０μｌ、プライマー(2) １．
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
【００１５】10x 反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tri
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl21%(w/V)ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2):前述した化学合成精製品の水
溶液（濃度3.75OD/ml) プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表のと
おりに組合せて使用した。 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (a) ＋ (f) (b) ＋ (g) (c) ＋ (g) (d) ＋ (h) (e) ＋ (i) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus社製）。
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl21%(w/V)ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2):前述した化学合成精製品の水
溶液（濃度3.75OD/ml) プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表のと
おりに組合せて使用した。 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (a) ＋ (f) (b) ＋ (g) (c) ＋ (g) (d) ＋ (h) (e) ＋ (i) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus社製）。
【００１６】反応条件は、次のとおりである。 熱変性： ９４℃、１分 アニーリング： ５５℃、１分 重合反応： ７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００１７】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）とし、臭化エチジ
ウム（0.5 μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版
（1989）に記載されている技法で行った。反応液の他に
分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較
によりヌクレオチド断片の長さを算出した。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）とし、臭化エチジ
ウム（0.5 μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版
（1989）に記載されている技法で行った。反応液の他に
分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較
によりヌクレオチド断片の長さを算出した。
【００１８】サザンーハイブリダイゼーション試験 ウエルシュ菌エンテロトキシン遺伝子に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを用いて、Tadaらの方法（Tada,
J. et al., Mol. Cell. Probe. 6, 477(1992)）に準じ
て行った。
ヌクレオチドプローブを用いて、Tadaらの方法（Tada,
J. et al., Mol. Cell. Probe. 6, 477(1992)）に準じ
て行った。
【００１９】逆受身ラテックス凝集反応（Reversed Pas
sive Latex Agglutination；RPLA）試験 市販のウエルシュ菌エンテロトキシン検出用ＲＰＬＡキ
ット（ＰＥＴ−ＲＰＬＡ「生研」デンカ生研製）を購入
し、付属の使用説明書に従い、検体を調製して試験を行
った。
sive Latex Agglutination；RPLA）試験 市販のウエルシュ菌エンテロトキシン検出用ＲＰＬＡキ
ット（ＰＥＴ−ＲＰＬＡ「生研」デンカ生研製）を購入
し、付属の使用説明書に従い、検体を調製して試験を行
った。
【００２０】結果 前述したようにウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。そ
れによるとプライマー(a) と(f) の組合せでは、４７３
塩基（または４７３塩基対）の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。そ
れによるとプライマー(a) と(f) の組合せでは、４７３
塩基（または４７３塩基対）の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。
【００２１】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、エ
ンテロトキシン遺伝子中の標的としている領域を正しく
増幅しており、かつ、当該菌株はエンテロトキシン遺伝
子を有していると判断した。被験菌株３４株で調べた結
果を表１に示す。さらに、各プライマーの組合せにより
増幅されたヌクレオチドが、目的とするウエルシュ菌エ
ンテロトキシン遺伝子の一部の領域であることをサザン
ハイブリダイゼーション試験で確認した。
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、エ
ンテロトキシン遺伝子中の標的としている領域を正しく
増幅しており、かつ、当該菌株はエンテロトキシン遺伝
子を有していると判断した。被験菌株３４株で調べた結
果を表１に示す。さらに、各プライマーの組合せにより
増幅されたヌクレオチドが、目的とするウエルシュ菌エ
ンテロトキシン遺伝子の一部の領域であることをサザン
ハイブリダイゼーション試験で確認した。
【００２２】すなわち、本発明のプライマーは、ウエル
シュ菌エンテロトキシン遺伝子を正しく増幅し、その遺
伝子をもつウエルシュ菌を正確に検出していることを示
している。
シュ菌エンテロトキシン遺伝子を正しく増幅し、その遺
伝子をもつウエルシュ菌を正確に検出していることを示
している。
【００２３】
【表１】 （実施例２）実施例１で得られた結果がエンテロトキシ
ン遺伝子をもつウエルシュ菌に対して、選択的なものか
どうかを確かめるため、ウエルシュ菌以外の主なClostr
idium 属菌および臨床検査において検査対象となるウエ
ルシュ菌以外の下痢症菌等の遺伝子について、本発明の
プライマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の
調製法を除いて、実施例１で示したものと同じである。
ン遺伝子をもつウエルシュ菌に対して、選択的なものか
どうかを確かめるため、ウエルシュ菌以外の主なClostr
idium 属菌および臨床検査において検査対象となるウエ
ルシュ菌以外の下痢症菌等の遺伝子について、本発明の
プライマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の
調製法を除いて、実施例１で示したものと同じである。
【００２４】検体の調製 表２中に示した各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接種
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、全て
のClostridium 属菌、Campylobacter jejuni、Campylob
acter coli、Ba cteroides fragilis、Bacteroides vulg
atus、およびLactobacillus acidophilu s である）。各
菌株培養液０．５ｍｌから遠心操作により、菌体を回収
し、ＴＥ緩衝液で菌体を１回洗浄した。この菌体に５０
ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解したＮ- アセチルム
ラミニダーゼ溶液、およびアクロモペプチダーゼ溶液を
各終濃度が５０μｇ／ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなる
ように加え、３７℃で１０分間処理し、溶菌した。ＴＥ
緩衝液で飽和させたフェノールおよびクロロフォルムか
らなる混合液（混合比１：１）を溶菌液に加えて、よく
撹拌した。
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、全て
のClostridium 属菌、Campylobacter jejuni、Campylob
acter coli、Ba cteroides fragilis、Bacteroides vulg
atus、およびLactobacillus acidophilu s である）。各
菌株培養液０．５ｍｌから遠心操作により、菌体を回収
し、ＴＥ緩衝液で菌体を１回洗浄した。この菌体に５０
ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解したＮ- アセチルム
ラミニダーゼ溶液、およびアクロモペプチダーゼ溶液を
各終濃度が５０μｇ／ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなる
ように加え、３７℃で１０分間処理し、溶菌した。ＴＥ
緩衝液で飽和させたフェノールおよびクロロフォルムか
らなる混合液（混合比１：１）を溶菌液に加えて、よく
撹拌した。
【００２５】遠心後、上層液を回収し、エタノール処理
を行って、核酸成分を沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌ
のＴＥ緩衝液に溶かして検体とした。また、ヒト胎盤由
来ＤＮＡ（Human placenta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃
度のものを調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
を行って、核酸成分を沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌ
のＴＥ緩衝液に溶かして検体とした。また、ヒト胎盤由
来ＤＮＡ（Human placenta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃
度のものを調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
【００２６】結果 表２に一部のプライマーの組合せにおける試験結果を示
す。
す。
【００２７】
【表２】 表中のプライマーの全ての組合せは、下痢症菌ＤＮＡを
はじめとする種々のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを
増幅することはなかった。したがって、本発明のプライ
マーはウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子と選択的
に反応するものと断言できる。
はじめとする種々のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを
増幅することはなかった。したがって、本発明のプライ
マーはウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子と選択的
に反応するものと断言できる。
【００２８】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩基
（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであ
れば５から１０塩基（塩基対）、また、１００から５０
０塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１０
から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違いを
区別可能である。さらに、アクリルアミドなどをゲル材
に用いると、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができるので、ウエルシュ菌エンテロトキシン遺
伝子の選択的検出における信頼度は、さらに高まるもの
と考えられる。
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩基
（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであ
れば５から１０塩基（塩基対）、また、１００から５０
０塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１０
から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違いを
区別可能である。さらに、アクリルアミドなどをゲル材
に用いると、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができるので、ウエルシュ菌エンテロトキシン遺
伝子の選択的検出における信頼度は、さらに高まるもの
と考えられる。
【００２９】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よびウエルシュ菌の食中毒病原因子であるエンテロトキ
シン遺伝子を標的とするプライマーを用いたことによ
り、エンテロトキシン遺伝子を有する菌の検出におい
て、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ、ある
いは、それ以上の数のプライマーで反応が規定されるこ
とによる高い選択性とが得られる。
よびウエルシュ菌の食中毒病原因子であるエンテロトキ
シン遺伝子を標的とするプライマーを用いたことによ
り、エンテロトキシン遺伝子を有する菌の検出におい
て、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ、ある
いは、それ以上の数のプライマーで反応が規定されるこ
とによる高い選択性とが得られる。
【００３０】また、検出感度が高いので、多量の検体を
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いること
で、プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増
幅されたヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結
果の信頼性は高いものとなる。
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いること
で、プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増
幅されたヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結
果の信頼性は高いものとなる。
【００３１】ウエルシュ菌にかかる食中毒の検査には、
発見患者の迅速・適切な治療および防疫措置のために、
遅滞のない正確な結果が要求される。また、本発明は、
ウエルシュ菌の食中毒病原因子であるエンテロトキシン
をコードしている遺伝子を選択的に検出するものであ
る。したがって、本発明により、食中毒起因菌としての
ウエルシュ菌の検出を迅速かつ正確に行うことが可能と
なる。
発見患者の迅速・適切な治療および防疫措置のために、
遅滞のない正確な結果が要求される。また、本発明は、
ウエルシュ菌の食中毒病原因子であるエンテロトキシン
をコードしている遺伝子を選択的に検出するものであ
る。したがって、本発明により、食中毒起因菌としての
ウエルシュ菌の検出を迅速かつ正確に行うことが可能と
なる。
【００３２】
【配列表】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＡ
ＣＣ
ＣＣ
【００３３】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＴＣＡＡＧ
ＴＣ
ＴＣ
【００３４】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＴＡ
ＧＣＣ
ＧＣＣ
【００３５】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＧＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴ
ＧＧＡＴ
ＧＧＡＴ
【００３６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；５ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＡＡＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣ
ＴＣ
ＴＣ
【００３７】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；６ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＡＡＣＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＡＴＴＴ
ＣＣ
ＣＣ
【００３８】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；７ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＣＡ
ＡＧＧ
ＡＧＧ
【００３９】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；８ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＧＡＧＴＴ
ＡＧ
ＡＧ
【００４０】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；９ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＡＴＣＡＣＣＴＡＡＧＧＡＣＴＧＴ
ＴＣ
ＴＣ
Claims (2)
- 【請求項１】検体中に存在するエンテロトキシン産生性
のウエルシュ菌（enterotoxin producing Clostridium
perfringens ）のエンテロトキシン遺伝子をコードする
ヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と
相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
であって、合成ヌクレオチドが配列番号１〜９のいずれ
かの配列の少なくとも連続した１０塩基以上または対応
する相補的配列からなることを特徴とするオリゴヌクレ
オチド。 - 【請求項２】請求項第１項に記載された配列のうち、少
なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応の
プライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選
択的に増幅させ、エンテロトキシン産生性ウエルシュ菌
を検出することを特徴とする方法であって、 検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプライ
マーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの重合
反応により鎖長反応を行わせ、 得られた２本鎖の標的ヌクレオチド配列を１本鎖に分
離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長
反応の鋳型として機能し、 これら２種のプライマーによるハイブリダイゼ−ショ
ンを繰り返すことにより、特定のヌクレオチド配列が増
幅して、増幅されたヌクレオチド断片を検出し その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在し
ているか否かを判定することでエンテロトキシン産生性
ウエルシュ菌の検出を行うことを含む方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04555598A JP3419299B2 (ja) | 1998-02-26 | 1998-02-26 | ウエルシュ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04555598A JP3419299B2 (ja) | 1998-02-26 | 1998-02-26 | ウエルシュ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11239484A true JPH11239484A (ja) | 1999-09-07 |
| JP3419299B2 JP3419299B2 (ja) | 2003-06-23 |
Family
ID=12722617
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04555598A Expired - Fee Related JP3419299B2 (ja) | 1998-02-26 | 1998-02-26 | ウエルシュ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3419299B2 (ja) |
-
1998
- 1998-02-26 JP JP04555598A patent/JP3419299B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3419299B2 (ja) | 2003-06-23 |
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