JP2675723B2 - マイコバクテリア属細菌の核酸の検出およびマイコバクテリア属細菌の同定のための試薬および方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉａ）核酸の存在を検出し、試料中のＭｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉａの核酸が生じたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉａ属種を同定するための試薬および方法に関するもの
である。特に、本発明はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種の
１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の標的領域または相当す
るＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプラ
イマーに関するもので、前記プライマーはハイブリダイ
ズする配列として配列５′ＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧ
ＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧ３′（ＫＹ１８）または５′ＧＣ
ＣＣＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＡ３′
（ＫＹ７５）を含む。さらに本発明は一対のプライマー
を用いた増幅により得られたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ
属種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子または相当するＲ
ＮＡの標的領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオ
チド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブに関するも
ので、ハイブリダイズする配列として、第一ののプライ
マーは配列ＫＹ１８を含み、第二のプライマーは配列Ｋ
Ｙ７５を含む。さらに特異的には、本発明はＭｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉａ種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子また
は相当するＲＮＡの標的領域を増幅し、プローブと増幅
した核酸を混合し、および前記核酸および前記プロー
ブ、ここには特異的プローブが存在するが、との間に形
成される雑種を検出または同定することにより、試料中
のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸を検出または同定す
る方法に関するものである。またさらに発明は方法を実
施するためのキットに関しても指示する。

【０００２】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａは遅い生育をす
る、耐酸性好気性バチルスである。少なくとも１９種の
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、最も著名なものではＭ．ｔ
ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓおよびＭ．ｌ
ｅｐｒａｅがこれまでヒトのの病気に関連している。
Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、
およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのようないくつかの種は健
康人には通常病原ではないが、ＡＩＤＳウイルスに感染
しているような免疫不全者に病気を引き起こす。さら
に、いくつかの種が希にヒトに病気を引き起こすが、腐
生植物のような臨床試料に生じる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉａ種の検出および同定の方法には細菌の培養、抗体
による検出および最近では放射活性標識された核酸プロ
ーブを用いたハイブリダイゼーションによるｒＲＮＡの
検出が含まれる。これらの方法のそれぞれは重要な問題
をもつ。

【０００３】バチルスを培養することによる検出は遅
く、二カ月まで必要で、典型的には種の同定のためにさ
らに生化学的試験が必要である。抗体による検出はＭｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種間の交差反応のために特異性を
欠いており、また感度も不足している。さらに現在およ
び過去の感染の区別が困難である。小サブユニットリボ
ソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）にハイブリダイズす
るプローブとして放射活性標識したＤＮＡ断片を用いる
検出は感度が不足しており、さらに少なくとも数日の培
養期間が必要である（ＰＣＴ／ＷＯ８４／０２７２１参
照）

【０００４】核酸の特異的な配列を増幅する方法である
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、以前には検
出できない程の少量であった細胞に存在する核酸の迅速
な検出を可能にした。ＰＣＲ増幅を用いて、一コピーの
標的核酸でさえ検出できる。配列特異的なオリゴヌクレ
オチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによる
検出できるレベルにまで増幅された核酸配列の直接的な
検出は、配列の単一のヌクレオチドの変化を検出するの
に充分な程特異的な診断試験を可能にした。しかし、全
てのプライマーの対およびプローブが有効なわけではな
い。プローブの選択とともに、プライマーおよびそれ故
増幅される領域の選択が得られる特異性および感度を大
部分決定する。

【０００５】ＰＣＲによる増幅はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉａの核酸のシークエンシング、試料中のＭｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉａ核酸の検出およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ａ種の同定に用いられた。最近ゲノムの各種の領域が試
料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ核酸を検出および同定
するために用いられた。これらの診断試験のほとんどは
たった一つまたは小数の種を検出するためにデザインさ
れており、ある場合には、限定された特異性チェックが
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａではない細菌のＤＮＡに対し
て行われた。

【０００６】６５キロダルトンの抗原を暗号化する遺伝
子領域の検出がＣｈｉａらの１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２８巻（第９号）、１８
７７から１８８０ページ；Ｂｒｉｓｓｏｎ−Ｎｏｅｌら
の１９８９年、Ｌａｎｃｅｔ、第３３４巻、１０６９か
ら１０７１ページ；Ｈａｃｋｅｌらの１９９０年、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ、第４巻、２０５から２１０ページ；Ｗｏｏｄｓお
よびＣｏｌｅの１９８９年、ＦＥＭＳ Ｍｙｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第６５巻、３０５から３
１０ページおよびＨａｎｃｅらの１９８９年、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第３巻（第７
号）、８４３から８４９ページに記述されている。６５
キロダルトン抗原遺伝子に基づく一度の試験ではＭｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉａ種を三種以上区別することはできな
い。

【０００７】繰り返しのＤＮＡ要素であるＩＳ６１１０
の増幅について、Ｔｈｉｅｒｒｙらの１９９０年、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２８巻（第１２
号）、２６６８から２６７３ページおよびＥｉｓｅｎａ
ｃｈらの１９９０年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉ
ｓｅａｓｅ、第１６１巻、９７７から９８１ページで報
告された。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ，ｂ
ｏｖｉｓはコピー数により区別されるのだが（Ｐｌｉｋ
ａｙｔｉｓらの１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、第５巻、２１５か
ら２１９ページ）、ＩＳ６１１０の増幅は基本的にはＭ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの特定の種の存在を試験すると
きにのみ用いられる。

【０００８】Ｍ．Ｉｅｐｒａｅの３６キロダルトン抗原
はＨａｒｔｓｋｅｅｒｌらの１９８９年、Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１３５巻、２３５７から２３
６４ページの中で診断試験に用いられた。試験はＭ．ｌ
ｅｐｒａｅに対して特異的であることを意味したが、他
のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａからのＤＮＡに対して弱い
ものから中程度のハイブリダイゼーションが観察され
た。

【０００９】タンパク抗原ｂをコードする遺伝子配列が
増幅産物の存在または非存在に基づくＭ．ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ／ｂｏｖｉｓの試験を作り出すためにＳｊ
ｏｂｒｉｎｇらの１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．、第２８巻（第１０号）、２２００から２
２０４ページの中で用いられた。

【００１０】ＭＰＢ６４タンパク質を暗号化する遺伝子
配列に基づくＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの存在の単
なる試験がＳｈａｎｋａｒらの１９９０年、Ｌａｎｃｅ
ｔ、第３３５巻、４２３ページに記述された。

【００１１】クローニングされたＤＮＡ断片から構築さ
れたプローブがＰａｔｅｌらの１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第２８巻（第３号）、５１
３から５１８ページおよびＦｒｉｅｓらの１９９０年、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅｓ、第４巻、８７から１０５ページに記述された。
プローブの特異性はプローブのデザインの間の配列解析
によるよりはむしろ選択の過程により得られた。

【００１２】診断試験に用いるために解析され、標的と
されるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのゲノムの領域の一つ
は、小サプユニットリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮ
Ａ）である。Ｂｏｔｔｇｅｒらの１９８９年、ＦＥＭＳ
ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ、第６５
巻、１７１から１７６ページで、各種の生物の１６Ｓｒ
ＲＮＡが広範囲の生物の核酸を増幅するようにデザイン
された「共通」プライマーを用いて増幅され、その後直
接的にシークエンスされた。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ
種の系統発生学的関係はＲｏｇａｌｌらの１９９０年、
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ．、第１３６巻、１９１５から
１９２０ページの中で、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を
比較することにより研究された。Ｂｏｄｄｉｎｇｈａｕ
ｓらの１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．、第２８巻（第８号）、１７５１から１７５９ペー
ジにおいて、同定に関して増幅のための配列特異的オリ
ゴヌクレオチドおよび１６Ｓ ｒＲＮＡ配列領域へのハ
イブリダイゼーションを用いてなされた証拠が示され
た。１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の高度に可変的な領域が三種
のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａについて研究された。属特
異的プライマーが種特異的プローブハイブリダイゼーシ
ョンに用いられるための可変領域を含む領域を増幅する
ために用いられた。

【００１３】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａに近縁の、およ
び疎遠の多くの生物の小サブユニットｒＲＮＡが研究さ
れ、シークエンスされている。多くの生物の小サブユニ
ットｒＲＮＡ配列の編集がＮｅｅｆｓらにより、Ｎｕ
ｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、補遺、第１８巻、２２３７
から２３１７ページ（１９９０）に用意されている。

【００１４】ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの存在
およびＤＮＡが生じた種を同定するために迅速で感度の
良い試験が必要である。

【００１５】本発明はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの検出
および種の同定のための迅速で感度の良いＰＣＲに基づ
く方法を提供する。１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列
に特異的なプライマーおよびプローブが提供される。Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの検出は属特異的プライマーを
用いた増幅およびそれに続くドットブロットハイブリダ
イゼーションによる属特異的プローブを用いたスクリー
ニングにより行われる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａが検
出されると、種の同定が増幅されたＤＮＡから、通常リ
バースドットブロット法による種特異的プローブを用い
た同じ増幅反応から決定される。

【００１６】１６ＳリボソームＲＮＡ（ＲＮＡ）を暗号
化する配列の増幅はいくつかの利点をもつ。本発明は臨
床試料に存在する３０以上のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ
属種および非常に多くの他の生物を検出し、区別するた
めに用いられる。本発明のプローブおよびプライマーは
可能な最大の特異性を提供し、それにより類似配列をも
つ関連生物の存在により引き起こされる誤りの陽性の可
能性を最小限にする。１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子は高度に保
存された領域を含む。本発明の属特異的プライマーおよ
びプローブはそのような保存された領域にハイブリダイ
ズし、属の中のほとんど全ての種の配列にハイブリダイ
ズできる；プライマーは試験された１５のＭｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉａ種のうち１４の核酸を増幅し、これらの１
４の増幅されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡ配列
のうち、属特異的プローブは１２にハイブリダイズす
る。１６Ｓ ｒＲＮＡはまた増幅される領域内に高度に
可変的な領域を含む。本発明の種特異的プローブは目的
のそれぞれの種が独特の配列をもつ可変領域にハイブリ
ダイズする。

【００１７】１６Ｓ ｒＲＮＡからプライマーおよびプ
ローブを選択することのさらに有利な点は、ＲＮＡが生
細胞中に多くのコピー数（１０^３から１０^４）で存在す
ることである。与えられた臨床試料中のＲＮＡの形態で
の遺伝子配列の数はそれ故これに相当するＤＮＡ配列の
数の１０^４倍にまでなる。さらに検出感度を望むなら
ば、ＲＮＡ自身が増幅標的として用いられる。

【００１８】本発明の別の面で、第二の増幅反応が確認
試験として行われる。第二の増幅反応は、直接的ではな
く第一の標的、即ち１６ＳリボソームＲＮＡ核酸に関連
する標的配列の存在をあてにするものである。適当な標
的配列が好ましくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種に保存
され、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａではない種には関連し
ない。適当な標的遺伝子は例えば、６５ｋＤａタンパク
質遺伝子を暗号化する遺伝子である（Ｐａｏらの１９８
９年、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、第６５
巻、３０５から３１０ページ；Ｈａｒｔｓｋｅｅｒｌら
の１９８９年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ．、第１３５
巻、２３５７から２３６４ページ；およびＨａｃｋｅｌ
らの１９９０年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、第４
巻、２０５から２１０ページ）。第一の増幅反応の結果
を確認するために役立つ一方、第二の標的配列の増幅は
比較研究、特にＰＣＲおよび培養法の比較から生じた一
致しない結果を解析するために特に意味がある。

【００１９】さらに本発明は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ａを検出するために陽性の対照として用いる新規組成に
関するものである。発明は種特異的Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉａプローブ同様、属特異的プローブを用いて、試験
の結果を確認するための新規組成を提供する。

【００２０】本発明の一面は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ａの核酸の存在を検出し（属特異的プローブ）、核酸を
生じる種の同一性を決定できる（種特異的プローブ）プ
ローブに関するものである。

【００２１】本発明の別の面は共通プローブに関するも
のである。好ましい具体例では、発明はＭｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉａの単離の異種の増幅および検出のための共通
オリゴヌクレオチドを提供する。共通オリゴヌクレオチ
ドプローブはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａに近縁の非Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種にはハイブリダイズしない。

【００２２】共通プローブは単一のオリゴヌクレオチド
プローブを用いた広範囲の標的特異的な検出に適してい
る。ここで用いられているような共通プローブは検出さ
れるべきＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのいずれの核酸配列
とも同一でないオリゴヌクレオチドプローブである。共
通プローブは非天然核酸配列を含む雑種オリゴヌクレオ
チド構成物である。本発明で記述されるような共通プロ
ーブは検出法において、選択された種を包含すると同時
に排除するために用いられる。具体的には、発明は新規
配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
これらのプローブは広くＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種を
検出するが、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒのような
近縁ではあるが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａではない種
を検出しない。

【００２３】本発明の別の面は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉａの核酸の特異的な領域を増幅するためのプライマー
に関するものである。この領域はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉａ種間に保存される領域および配列特異的オリゴヌク
レオチドプローブを用いて標的核酸の起源を決定できる
ような種間の充分な不均一性をもつ可変領域の両者を含
む。

【００２４】本発明の別の面は、検出および種同定法に
関するものである。発明のプライマーを用いたＰＣＲに
よる標的核酸の増幅は、増幅された核酸を属特異的プロ
ーブと混合し、ハイブリダイゼーションが起きるかを検
出することにより、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸の
検出をさせ、一方種の同定は種特異的プローブとのハイ
ブリダイゼーションのパターンを決定することにより行
われる。

【００２５】本発明のまた別の面は、キットに関するも
のである。これらのキットは各種の形態をとり、一つま
たはそれ以上のプローブを含み、具体的には種レベルで
感染したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの同一性を決定する
のに充分な一群のプローブおよびキットの成分を用いる
ための指示書を含む。キットはまた一つまたはそれ以上
の増幅試薬、例えば属特異的プライマー、ポリメラー
ゼ、緩衝液およびヌクレオシド三リン酸を含むことがで
きる。

【００２６】さらに具体的には、キットはまた陽性およ
び陰性の対照を含む。好ましい陽性の対照はこの中で記
述される。

【００２７】本発明を理解するために、いくつかの用語
が下に定義される。

【００２８】「オリゴヌクレオチド」なる用語は、検出
されるＤＮＡ断片および核酸の対照のような二つまたは
通常それ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌ
クレオチドからなる分子を指す。オリゴヌクレオチドの
正確な大きさは、多くの因子およびオリゴヌクレオチド
の最終的な機能または利用に依存する。オリゴヌクレオ
チドは、例えば適当な配列のクローニングおよび制限酵
素による切断およびＮａｒａｎｇらの１９７９年、Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第６８巻、９０から９９ペー
ジのホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎらの１９７９
年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第６８巻、１０９か
ら１５１ページのホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇ
ｅらの１９８１年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ．、第２２巻、１８５９から１８６２ページのジエチ
ルホスホアミダイド法；および米国特許第４，４５８，
０６６号の固体支持体法のような方法による直接的な化
学合成を含む適当な方法により調製される。

【００２９】「プライマー」なる用語は、天然または合
成の、適当な緩衝液で、適当な温度で、核酸の鎖に相補
的なプライマー伸長産物の合成が誘導される、即ち四種
の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびポリ
メリゼーションの試薬（即ちＤＮＡポリメラーゼまたは
逆転写酵素）の存在条件下で、ＤＮＡ合成の開始点とし
て作用できるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは
好ましくは一本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドで
ある。プライマーの適当な長さは用いようとするプライ
マーに依存するが、典型的には１５から２５ヌクレオチ
ドの範囲である。短いプライマー分子は一般に鋳型と充
分に安定な雑種複合体を形成するのに、より低い温度が
必要である。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する
必要はないが、鋳型とハイブリダイズし、ＤＮＡ合成を
開始できるのに充分相補的でなければならない。

【００３０】ここで明らかにされている発明の具体例で
は、特異的配列のプライマーおよびプローブが提供され
る。これらの具体例で提供される特異的配列のプライマ
ーおよびプローブは、例えば５′または３′端に標的配
列に相補的な、または相補的ではないヌクレオチドを付
加することにより修飾されることは技術者には明らかな
ことである。プライマー組成が標的配列の伸長開始点と
して作用し、プライマーおよびプローブがこれらの例示
される具体例に含まれる少なくとも１４の連続したヌク
レオチドからなる限り、そのような組成は発明の範囲内
にある。

【００３１】「プライマー」は、特に増幅される標的領
域の一方または両端の情報に不明瞭さがある場合、一つ
以上のプライマーを指す。「保存された」領域が集団中
で著しいレベルの多型を示すなら、そのような配列を増
幅するプライマーの混合液が調製されるか、またはプラ
イマーがミスマッチの配列さえ増幅するようにデザイン
される。もし望むならば、プライマーは分光学的に、光
化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によ
り検出できる標識を取り込むことにより標識される。例
えば、有効な標識には３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試
薬、（通常ＥＬＩＳＡで用いられるような）酵素、ビオ
チン、またはハプテン、および抗血清またはモノクロー
ナル抗体が得られるタンパク質が含まれる。標識はま
た、プライマーまたは増幅されたＤＮＡのようなプライ
マー伸長産物の固体支持体上への固定化を促進するため
に、プライマーを「捕捉する」のに用いられる。

【００３２】「配列特異的オリゴヌクレオチド」および
「ＳＳＯ」は、「ハイブリダイズする」領域と呼ばれる
検出される配列に相補的な配列をもつ、「配列特異的な
緊縮のハイブリダイゼーション条件」下で、正確に相補
的な標的配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドを指す。ハイブリダイゼーションの条件の緊縮度を
緩めることにより、配列のミスマッチが許容される；許
容されるミスマッチの程度はハイブリダイゼーション条
件の適当な調整によりコントロールされる。「プロー
ブ」および「ＳＳＯプローブ」はＳＳＯと互換的に用い
られる。

【００３３】「標的領域」は解析される核酸の領域を指
す。

【００３４】「熱安定性ポリメラーゼ酵素」は、相対的
に熱に安定で、標的配列の核酸の鎖の一方に相補的なプ
ライマー伸長産物を形成するためにヌクレオシド三リン
酸の重合を触媒する酵素を指す。酵素はプライマーの
３′端で合成を開始し、合成が停止するまで、鋳型の
５′端へ向かって進む。精製された熱安定性ポリメラー
ゼ酵素は米国特許第４，８８９，８１８号により充分に
記述されている。

【００３５】「逆転写酵素」は、リボ核酸の鋳型に相補
的なプライマー伸長産物を形成するためにヌクレオシド
三リン酸の重合を触媒する酵素を指す。酵素はプライマ
ーの３′端で合成を開始し、合成が停止するまで、鋳型
の５′端へ向かって進む。ＲＮＡ標的配列を相補的なコ
ピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換する適当な重合試薬
の例は、トリ骨髄芽腫ウイルス逆転写酵素および逆転写
酵素活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリ
メラーゼである。

【００３６】図１は本発明の属特異的および種特異的プ
ローブ両者を用いたハイブリダイゼーション試験の結果
を示している。プローブの特異性はＭｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉａの異なる１３種のＤＮＡで試験された。

【００３７】本発明はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの検出
および種の同定に関する迅速かつ感度の良いＰＣＲに基
づく方法を提供する。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの１６
ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列に特異的なプライマーお
よびプローブが提供される。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ
の検出は、属特異的プライマーを用いた増幅およびそれ
に続くドットブロットハイブリダイゼーション法による
属特異的プローブを用いたスクリーニングにより行われ
る。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａが検出されると、種の同
定がリバースドットブロット法により種特異的プローブ
を用いて、同じ増幅反応のＤＮＡから決定される。正
逆、両ドットブロット法は非常に簡便にマイクロタイタ
ープレートで行われる。

【００３８】属特異的プライマーおよびプローブは１６
Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の保存領域にハイブリダイズし、種
特異的プローブは１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の可変領域に
ハイブリダイズする。合成はプライマーの３′端で始ま
るので、３′端でのミスマッチはより重大である。チミ
ジンは他の塩基のミスマッチよりも許容される；それで
プライマーは３′端にチミジン塩基を付けないようにデ
ザインされた。オリゴヌクレオチドの塩基含量は変性温
度に影響を及ぼす。プライマーまたはプローブの結合の
緊縮度および特異性は温度上昇を増加する。しかし、全
てのプローブがリバースドットブロット法では同時にハ
イブリダイズされるので、最適なプローブハイブリダイ
ゼーション条件は全てのプローブで類似している。

【００３９】本発明のプライマーの対は目的の全てのＭ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列
の増幅で効果的に機能するが、殆どの他の材料からの相
当するＤＮＡを増幅しない。さらに、これらのプライマ
ーの増幅条件および効率は種間でかなり一定で、そのた
め殆ど全てのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種が一回の試験
で検出可能である。表１は本発明のプライマーのハイブ
リダイズする配列を示している。

【００４０】

【表１】

【００４１】大腸菌番号システムを用いると、上述プラ
イマーＫＹ１８は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基５２か
ら７４に、下流プライマーＫＹ７５は塩基６２４から６
４７に広がる。合わせると、これらのプライマーは約５
８３塩基対の長さの産物を合成する；正確な大きさは種
に依存する。

【００４２】ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの存在
に対する最初のスクリーニングは混合液として同時に用
いられる二つの属特異的プローブを用いて行われる。

【００４３】

【表２】

【００４４】混合プローブが用いられる理由は、殆どの
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種がＫＹ１０１（配列番号
３）およびＫＹ１０２（配列番号４）の領域の配列に関
して、二つのグループに分けられることである。これら
の二つのプローブは試験されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ａ属の１４種のうち１２種のＤＮＡを検出する。

【００４５】別の具体例では、ＫＹ１６５（配列番号１
３）がプローブＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１
０２（配列番号４）に置き換わる。プローブＫＹ１０１
（配列番号３）、ＫＹ１０２（配列番号４）、ＫＹ１６
５（配列番号１３）およびＫＹ１６６（配列番号１４）
は表２に与えられる。ＫＹ１６５（配列番号１３）はＫ
Ｙ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号
４）の両者の配列を含む共通プローブである。ＫＹ１０
１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号４）は互
いに二塩基異なる。ＫＹ１６５（配列番号１３）はＫＹ
１０１（配列番号３）またはＫＹ１０２（配列番号４）
と同一ではないが、互いに一塩基異なる。この一致は一
方のミスマッチの「有利な」ＫＹ１０１（配列番号３）
およびもう一方のミスマッチのＫＹ１０２（配列番号
４）で達成された。ＫＹ１６５（配列番号１３）は全て
のＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番
号４）特異的なＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種に充分ハイ
ブリダイズできる。ＫＹ１６５（配列番号１３）はさら
にミスマッチがあるために、高緊縮条件下でＭ．ｘｅｎ
ｏｐｉ（配列番号１５）にハイブリダイズしない。

【００４６】ＫＹ１６６（配列番号１４）は、Ｍ．ｘｅ
ｎｏｐｉ（配列番号１５）を含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉａ種を検出するための境界共通プローブである。ＫＹ
１６５（配列番号１３）の配列同様、ＫＹ１６６（配列
番号１４）の配列は非Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種に相
当しない。プローブはＫＹ１０１（配列番号３）、ＫＹ
１０２（配列番号４）、およびＭ．ｘｅｎｏｐｉ（配列
番号１５）（ＧｅｎＢａｎｋ取得番号Ｘ５２９２９、Ｉ
ｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓから入手可能）の相当す
る配列と同様に異なるようにデザインされる。ＫＹ１６
６（配列番号１４）はＫＹ１０１（配列番号３）、ＫＹ
１０２（配列番号４）およびＭ．ｘｅｎｏｐｉ（配列番
号１５）とそれぞれ二塩基異なる。ＫＹ１６６（配列番
号１４）は効果的に全てのＫＹ１０１（配列番号３）お
よびＫＹ１０２（配列番号４）に特異的な種およびＭ．
ｘｅｎｏｐｉ（配列番号１５）にハイブリダイズする。
さらにＫＹ１６６（配列番号１４）は、Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉａに近縁の二種の非Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ
である、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｏｄｉ
ｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍまたはＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒ
ｉａｅにはハイブリダイズしない。Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ
（配列番号１５）の相当する配列は表２に含まれる。表
で、ＫＹ１６６（配列番号１４）に対してのミスマッチ
は下線が引かれている。ＫＹ１６５（配列番号１３）に
対するミスマッチは小文字で示される。

【００４７】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ核酸が試料に存
在するならば、核酸が生じた種が一群の種特異的プロー
ブへのハイブリダイゼーションにより決定される。種の
同定の段階で用いられるプローブは表３に示される。

【００４８】

【表３】

【００４９】最も臨床的に興味のある種は、Ｍ．ｔｕｂ
ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｘｅ
ｎｏｐｉ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅおよび
Ｍ．ａｖｉｕｍである。Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅは普通は
病気とは関係ないが、頻繁にヒト試料に生じる。したが
って、属特異的プローブによるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ａの核酸の検出は臨床的に重要ではないＭ．ｇｏｒｄｏ
ｎａｅによることが頻繁に予想される。例６は種特異的
プローブの特異性に関する追加情報を含む。

【００５０】本発明の重要な一面は、１６Ｓ ｒＲＮＡ
遺伝子領域の増幅である。本発明を実施する者は、ポリ
メラーゼ連鎖反応は好ましい増幅方法であるが、試料中
の標的配列の増幅はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写
増幅および自己を維持する配列の複製のような、それぞ
れが充分な増幅をでき、その結果標的配列がＳＳＯプロ
ーブへの核酸ハイブリダイゼーションにより検出される
既知の方法により行われることに注目すべきである。代
わりとして、Ｑβ−レプリカーゼ増幅のような、検出で
きるレベルまでプローブを増幅する方法が用いられる。
「プローブ」は上記の方法に用いられる配列特異的オリ
ゴヌクレオチドを含む；例えば、ＬＣＲで用いられる二
つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドは、ＬＣＲが配
列の存在を示すためにプローブの連結のみを必要とする
場合でも本発明の目的の「プローブ」である。

【００５１】ＰＣＲの過程は技術的に良く知られている
が（米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２
０２号、および４，９６５，１８８号を参照せよ）、一
般的なＰＣＲの情報は以下のＰＣＲの過程に不慣れな者
に発明を明らかにし、充分理解させる目的を提供する。

【００５２】ＰＣＲにより試料中の標的核酸配列を増幅
するために、配列は増幅システムの成分に入れやすくな
ければならない。一般に、この入りやすさは試料から核
酸を分離することにより保証される。生物試料から核酸
を抽出する各種の方法が技術的に知られている。例え
ば、Ｈｉｇｕｃｈｉらが１９８９年に「ＰＣＲ工学」
（Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ）の中で記述していることを参照せよ。
代わって、試料がかなり容易に壊れるものならば、核酸
はＰＣＲ技術による増幅の前に精製される必要はない、
即ち、試料が細胞、特に末梢血リンパ球またはアミニオ
サイトを含むなら、細胞内成分の溶解および分散は単に
低調緩衝液に細胞を懸濁することにより行われる。

【００５３】ＰＣＲのそれぞれのサイクルはプライマー
伸長により形成される核酸二重鎖の分離を含む。ＰＣＲ
過程の好ましい具体例では、鎖の分離は反応液を二重鎖
の変性を引き起こすが、ポリメラーゼの非可逆的な変性
は引き起こさないような効果的な時間で、充分な高温に
熱することにより達成される（米国特許第４，９６５，
１８８号を参照せよ）。典型的な熱変性は秒から分の範
囲の時間に対して、約８０℃から１０５℃の範囲の温度
を含む。しかし、鎖の分離は物理的、化学的または酵素
的手段を含むいずれかの適当な変性法により行われる。
鎖の分離は例えば、ヘリカーゼまたはへリカーゼ活性を
もつ酵素により誘導される。例えば、酵素ＲｅｃＡはＡ
ＴＰ存在下でヘリカーゼ活性をもつ。ヘリカーゼによる
鎖の分離に適した反応条件は技術的に知られている（Ｋ
ｕｈｎ Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇの１９７８
年、ＣＳＨ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、第４３巻、６３から６７ページ；およびＲａｄｄｉ
ｎｇの１９８２年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、第１６巻４０５から４３６ページを参照せよ）。

【００５４】しかし例え鎖の分離が達成されても、鎖が
一度分離されると、ＰＣＲの次の段階には標的配列に隣
接したプライマーを用いて分離された鎖をハイブリダイ
ズすることが含まれる。プライマーは標的の鎖の相補鎖
を形成するために伸長される。好結果のＰＣＲ増幅で
は、プライマーは、二重鎖配列にハイブリダイズするそ
れぞれのプライマーが一つのプライマーから合成される
伸長産物が鋳型（相補鎖）から分離されると、他のプラ
イマーの伸長の鋳型として作用するような位置になるよ
うにデザインされる。変性、ハイブリダイゼーションお
よび伸長のサイクルは望みの量の増幅された核酸を得る
ために必要な回数繰り返される。

【００５５】ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存性の
伸長は、適当な塩、金属陽イオンおよびｐＨ緩衝システ
ムを含む反応系で、適当量の四種のデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およ
びｄＴＴＰ；以下に記述されるＵＮＧ滅菌システムが取
り込まれているならば、ｄＵＴＰがｄＴＴＰに代わっ
て、またはこれに加えて用いられる）存在下で重合試薬
により触媒される。適当な重合試薬は鋳型依存性ＤＮＡ
合成を触媒することが知られている酵素である。ＤＮＡ
鋳型とともに用いるのに適しているポリメラーゼの例に
は、大腸菌ポリメラーゼＩまたはこの酵素のＫｌｅｎｏ
ｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓから分離された熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼであるＴａｑポリメラーゼが含まれる。後者
の酵素は核酸の増幅およびシークエンシングに広く用い
られる。Ｔａｑポリメラーゼを用いる反応条件は技術的
に知られており、上述の「ＰＣＲ工学」（１９８９）中
でＧｅｌｆａｎｄにより記述されている。ＲＮＡ鋳型か
ら相補的なコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するために
適している重合試薬はトリ骨髄芽腫ウイルスＲＴのよう
な逆転写酵素（ＲＴ）または逆転写酵素活性をもつ熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼである。典型的
には、ＲＮＡ鋳型は次の増幅のためのＤＮＡ鋳型だけを
残して、最初の逆転写の段階後の最初の変性段階の間に
熱分解される。

【００５６】１６Ｓ ｒＲＮＡが増幅されるべきなら
ば、このＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を作るため
に最初の逆転写（ＲＴ）段階が行われる。ＰＣＴ特許公
示ＷＯ９１／０９９４４はＰＣＲ増幅でも機能する熱安
定性ポリメラーゼによる高温での逆転写について記述し
ている。高温ＲＴはより高いプライマーの特異性および
改良された効率を提供する。同一のプライマーおよびポ
リメラーゼは逆転写およびＰＣＲ増幅段階の両者に充分
であり、反応条件は両反応が試薬の変化なしに起きるよ
うに最適化される。逆転写酵素として機能できる熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼである、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼは鋳型に関係
なく全てのプライマー伸長段階に用いられる。両過程は
試薬を変えるまたは添加するためにチューブを開くこと
なしに行われる；温度プロフィールのみが最初のサイク
ル（ＲＮＡ鋳型）および残りの増幅サイクル（ＤＮＡ鋳
型）の間で調整される。

【００５７】ＰＣＲ法はそれぞれの段階の後、新たな試
薬が添加される段階的な様式で、または全ての試薬が同
時に添加される様式で、あるいは与えられた数の段階の
後、新鮮な、または異なる試薬が添加される、部分的に
段階的な様式で行われる。例えば、鎖の分離が熱により
誘導され、ポリメラーゼが熱感受性であるなら、ポリメ
ラーゼは鎖分離の回転後に添加されなければならない。
しかし、例えばヘリカーゼが変性に用いられ、または熱
安定性ポリメラーゼが伸長に用いられるならば、全ての
試薬が最初に添加され、あるいは代わって、試薬の分子
の割合が反応にとって重大であるならば、試薬は合成反
応により消費された場合、定期的に補充される。

【００５８】ＰＣＲ過程が最も普通に熱安定性酵素を用
いて自動的な過程として行われることを技術者は知るで
あろう。この過程において、反応液の温度は変性領域、
プライマーアニーリング領域および反応領域をサイクル
する。熱安定性酵素の使用に特異的に適している機械は
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入できる。

【００５９】当業者はまた前の反応の増幅された核酸に
よるＰＣＲの汚染の問題に気づくであろう。この問題を
減少する方法は前の反応の増幅されたＤＮＡを酵素的に
分解することである。ＰＣＲ増幅はｄＴＴＰの代わりに
ｄＵＴＰ存在下で行われる。得られた二重鎖ウラシルを
含む産物はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）に
より分解され、一方通常のチミンを含むＤＮＡはＵＮＧ
により分解されない。増幅前に増幅反応液にＵＮＧを添
加することにより、標的として作用する全てのウラシル
を含むＤＮＡの分解が始まる。ウラシルを含むＤＮＡの
唯一の材料は前の反応の増幅産物であるので、この方法
は効果的に反応液を滅菌し、前の反応からの汚染の問題
（持ち越し）を取り除く。ＵＮＧは熱により一時的に不
活化され、増幅の変性段階もまたＵＮＧを不活化するよ
うに作用する。それ故ウラシルを取り込んだ新たな増幅
産物はＵＮＧのない環境で形成され、分解はされない。

【００６０】配列特異的プローブハイブリダイゼーショ
ンは本方法を旨く実践するための重要な段階である。本
発明の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは特異的
にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａゲノムの特定の断片とハイ
ブリダイズし、属特異的プローブの場合、他の生物から
の、種特異的プローブの場合、他のＭｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉａ種からの配列について不安定化するミスマッチを
もつ。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、プローブが
特異的に正確に相補的な配列にのみハイブリダイズする
ように選択される。増幅産物の検出は、正しい増幅産物
のみが検出され、関連生物の相同配列の存在により引き
起こされる偽の陽性シグナルの機会を減少させることを
保証するためにこの配列特異的ハイブリダイゼーション
を用いる。

【００６１】ＳＳＯプローブおよび核酸配列の間に形成
される雑種を検出する方法は、ハイブリダイゼーション
の領域に加え、プローブがさらに特徴をもつことを必要
とする。ドットブロット法では、例えばプローブは典型
的に標識される。以下に記述される「リバース」ドット
ブロット法の場合のように、プローブが最初に固定化さ
れるならば、プローブはまたＰＣＴ特許公示８９／１１
５４８により詳細に記述される技術である、照射により
ナイロン膜へ固定されるポリーｄＴの長い伸長を含むこ
とができる。

【００６２】本発明のプローブは上述のオリゴヌクレオ
チドを合成する技術を利用して、合成され、標識され
る。例えば、プローブは３２Ｐ−ＡＴＰおよびキナーゼ
とともにプローブをインキュべートすることにより、３
２Ｐで５′端が標識される。ＳＳＯプローブの適当な非
放射活性標識は西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）である。この標識を含むプローブの調製および検出
方法が米国特許第４，９１４，２１０号および４，９６
２，０２号に記述されている。そのような標識プローブ
に関する追加情報は、米国特許第４，７８９，６３０
号；Ｓａｉｋｉらの１９８８年、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅ
ｄ．、第３１９巻、５３７から５４１ページ；およびＢ
ｕｇａｗａｎらの１９８８年、Ｂｉｏ／Ｔｈｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ、第６巻、９４３から９４７ページを参照せよ。
有効な色素原には赤白色素および３，３′，５，５′−
テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が含まれる。Ｈｅｌ
ｍｕｔｈは「ＰＣＲプロトコール」（Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、１９９０）の１１９から１２８ページで、ＰＣＲ
産物の非アイソトープ検出の方法について記述してい
る。

【００６３】本発明のプローブは、核酸配列が試料中に
存在しているかをプローブが試料中に存在している配列
に結合するかを決定することにより決めるのに用いられ
る。試料中にプローブおよび核酸配列の間に形成される
雑種を検出するための本発明の目的の適当な方法は技術
的に知られている。例えば、検出は例４に記述されるよ
うにドットブロット法を用いて行われる。ドットブロッ
ト法で、未標識の増幅試料は膜のような固体支持体に結
合され、膜は適当なハイブリダイゼーション条件下で標
識プローブとインキュベートされ、ハイブリダイズしな
かったプローブは洗浄により除去され、フィルターは結
合プローブの存在をモニターされる。試料が属特異的プ
ローブを用いてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸の存在
をスクリーニングされる場合のように、複数試料がいく
つかのプローブで解析される場合、ドットブロット法は
非常に有効である。

【００６４】非常に多くのプローブが用いられる場合別
の方法が非常に有効である。この方法は、増幅配列が標
識を含み、プローブが固体支持体に結合しているような
「リバース」ドットブロットである。この方法で、未標
識プローブは膜に結合され、適当な緊縮ハイブリダイゼ
ーション条件下で標識試料にさらされる。ハイブリダイ
ズしない標識試料はその後適当な緊縮条件下で洗浄によ
り除去され、フィルターは結合配列の存在がモニターさ
れる。種の決定にはそれぞれの増幅試料に対する複数の
種特異的プローブの使用が必要なので、リバースドット
プロット法はこの段階で好ましい試験方法である。

【００６５】別法として、多数のプローブハイブリダイ
ゼーション部位またはウェルをもつ検出方法を使用する
ことが望ましい。例えば、マイクロタイタープレートの
ような固体支持体が発明の方法の大規模な臨床応用に特
に有効である。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡのハイブリダ
イゼーション／捕捉または固体支持体についての方法は
知られている。これらの方法の具体例で、増幅された標
的ＤＮＡはＰＣＲ反応の増幅の間に（例えばビオチン
で）標識される。標識ＤＮＡは、ＰＣＲ産物のマイクロ
タイタープレートのウェルに結合した標的特異的オリゴ
ヌクレオチド捕捉プローブへのハイブリダイゼーション
により特異的に捕捉される。結合産物は用いられる標識
の型にしたがって適当に検出される。例えば、ビオチン
が標識として用いられるならば、アビジンＨＲＰ複合体
が添加され、（ａ）過酸化水素基質およびＯ−フェニレ
ンジアミン（ＯＰＤ）色素原、または（ｂ）過酸化水素
基質およびテトラメチルベンジジン色素原（ＴＭＢ）の
いずれかと反応される。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを定
量的に検出させる色素定量シグナルが開発された。

【００６６】臨床生物医学研究室で行われる場合、マイ
クロタイタープレート法を用いた検出方法が広範囲の標
的で標準化されている。長さ２５ヌクレオチド以下の検
出プローブをもつことが望ましい。より短いプローブは
交差反応の機会を最小にし、特に大規模スクリーニング
法では有効である。したがって、例８はマイクロタイタ
ープレート法によるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種を検出
する好ましい方法が記述される。２５ヌクレオチド以上
のプローブはマイクロタイタープレート検出法に同様に
適しているが、最大の特異性を保証するためにハイブリ
ダイゼーションおよび緊縮条件を個々に決定しなければ
ならないことを技術者は認識せねばならない。

【００６７】別の適当な検定システムでは、標識プロー
ブはＰＣＲ増幅過程の間に添加される。それぞれの合成
段階の間に標的ＤＮＡにハイブリダイズするプローブは
プライマー伸長を触媒するために用いられるポリメラー
ゼの５′から３′へのエキソヌクレアーゼ活性により分
解される。プローブの分解産物はその後検出される。そ
れ故、分解産物の存在はプローブおよび標的ＤＮＡの間
にハイブリダイゼーションが起きたことを示す。

【００６８】本発明はまた発明のプライマーおよびプロ
ーブからなる複数容器単位であるキットに関するもので
ある。有用なキットはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸
を検出するためにＳＳＯプローブを含むことができる。
いくつかの場合、ＳＳＯプローブは適当な支持膜に固定
される。キットはまたＰＣＲ増幅のプライマーを含むこ
とができる。キットの他の付随的な組成には、例えば逆
転写酵素またはポリメラーゼ、その基質のヌクレオシド
三リン酸、標識に用いられる手段（例えば、標識がビオ
チンならば、アビジン−酵素コンジュゲートおよび酵素
基質および色素原）または検出標識、およびＰＣＲ、逆
転写またはハイブリダイゼーション反応のための適当な
緩衝液が含まれる。上記成分に加え、キットはまた発明
の増幅および検出方法を行うための支持書を含む。

【００６９】本発明の好ましい具体例では、Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉａを検出するキットにはまた陽性および陰
性の対照が含まれる。好ましくは陽性の対照は試験試料
中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸を増幅するために
用いられた同一のプライマーの対を用いて増幅可能な核
酸配列を含む。陽性の対照を用いる方法は知られてお
り、ここでは存在するまたはしない標的および陽性の対
照は同一のプライマーの対を用いる。好ましくは陽性の
対照は産物ＤＮＡが標的の大きさと直ちに区別できる分
離した大きさとなるようにデザインされる。

【００７０】別の面で、本発明は種特異的Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉａプローブ同様、属特異的Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉａプローブを検出するためのプローブにハイブリ
ダイズできる陽性の対照を提供する。例９は陽性の対照
核酸の構築について記述している。

【００７１】ここで記述されているように、特に一致し
ないＰＣＲおよび培養のデータを解決するために、第二
の増幅標的を用いることが望ましい。内部陽性対照ベク
ターを提供するための本発明の教訓を与えると、さらに
内部陽性対照が構築されることを普通の技術者直ちに認
識するであろう。例えば、ハイブリダイズし、続いて陽
性の対照ＤＮＡの分離した断片を増幅するために、陽性
の対照は一次（１６ＳｒＲＮＡ）および二次標的（例え
ば、６５ｋＤａタンパク質遺伝子）の両者に対するプラ
イマー部位を取り込む。

【００７２】以下に示される本発明の例は例証の目的の
みで、発明の範囲を限定するものではない。

【００７３】

【実施例】例１ 試料の調製 核酸はＭｉｃｒｏＰｒｏｂｅから市販されるＩｓｏＱｕ
ｉｃｋ^ＴＭシステムを用いて唾液試料から分離される。
約１０ｍｌの唾液試料は液化／消毒され、遠心により沈
澱され、ＢＳＡを含む緩衝液約１ｍｌに再懸濁される。
この試料のうち２００から５００μｌが細菌を沈澱させ
るために遠心される。沈澱は１００μｌの試料緩衝液Ａ
に再懸濁され、１００μｌの溶菌試薬１で溶菌される。
溶菌液は７容の試薬２および４容の試薬３で抽出される
（試薬１、２および３は試料緩衝液ＡとともにＩｓｏＱ
ｕｉｃｋシステムで供給される）。試料は遠心され、そ
の後１／３容の１０Ｍ酢酸アンモニウムが水層に添加さ
れ、ＤＮＡが等量のイソプロパノールで沈澱される。沈
澱したＤＮＡは７０％エタノールで洗浄され、風乾後、
１００μｌのＴＥ、ｐＨ８．０に再懸濁される。５０μ
ｌのそれぞれの試料標品が増幅反応に用いられる。

【００７４】例２ ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの増幅 マスター試薬液はそれぞれの反応が次の試薬：それぞれ
のプライマー２５ｐｍｏｌ、それぞれのｄＮＴＰ１０ｎ
ｍｏｌ、２×ＰＣＲ緩衝液（１０×緩衝液＝５００ｍＭ
ＫＣｌ、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．
９、２０ｍＭ ＭｇＣ１２）、３単位のＴａｑポリメラ
ーゼ、２単位のＵＮＧ、および反応当り５０μｌの反応
液になるようにＨ_２Ｏを含むように調製される。このマ
スター溶液は５０μｌの鉱物油を重層され、ＤＮＡ試料
が油層の下で反応液に添加される。

【００７５】ＤＮＡはＰａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒのサー
マルサイクラーで増幅される。サーマルサイクラーは変
性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長の３
７サイクル；それぞれ１分当り９８℃、６２℃および７
２℃を２サイクル、続いて１分当り９４℃、６２℃およ
び７２℃を３５サイクルとなるようにプログラムされ
る。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラーは、
ＵＮＧ滅菌システムが用いられているなら、最終の伸長
を完全にし、ＵＮＧ酵素を不活性化したままにするため
に、最後のサイクルの後適当な時間７２℃に試料をおく
ようにプログラムされる。増幅産物はその後ゲル電気泳
動および／またはドットブロットハイブリダイゼーショ
ンにより解析される。ゲル電気泳動による解析がなされ
るなら、１０×試料緩衝液（０．２５％キシレンシアノ
ール、０．２５％ブロモフェノールブルー、２５％フィ
コール）が添加され、１００μｌのクロロホルムで鉱物
油が抽出され、Ｔａｑポリメラーゼは不活化される。

【００７６】例３ ドットブロット法 増幅試料の最初のスクリーニングにより、Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉａの核酸の存在が検出される。ドットブロッ
ト法で、増幅ＤＮＡの少量が変性され、ナイロンフィル
ターにのせられ、以下に記述されるように固定化され
る。フィルターはその後標識プローブの一つにハイブリ
ダイゼーションさせるためにプローブ溶液に浸される。
それぞれのプローブは放射活性標識されるが、西洋ワサ
ビのパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共有結合したプロー
ブはまた色素原の、または化学蛍光の基質存在下での非
同位元素の検出の手段を提供するために用いられる。固
定化された標的ＤＮＡは二つの属に特異的なプローブＫ
Ｙ１０１およびＫＹ１０２の混合液にハイブリダイズさ
れる。試験される試料数がプローブ数をはるかに超える
と予想されるので、（一つの混合液に二つのプロー
ブ）、ドットブロット法はこの最初のスクリーニングに
は最も便利である。非常に多くの試料が単一の固体支持
体の別々の位置でハイブリダイズされ、プローブ溶液に
支持体を浸すことによって同時に標識プローブにさらさ
れる。

【００７７】増幅は例２のように行われる。ＰＣＲ産物
はその後アルカリで処理することにより変性される。Ｐ
ＣＲ産物５μｌに対して５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、
ｐＨ８．０、８μｌの５Ｎ水酸化ナトリウムおよび８２
μｌが添加される。混合液は室温で１０分間放置され
る。

【００７８】ＢｉｏＤｙｎｅ^ＴＭＢナイロンフィルター
（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、ＧｌｅｎＣｏｖｅ、ＮＹ）は
Ｈ_２Ｏに５から１０分間浸され、さらにドットブロット
マニフォールド（Ｂｉｏ−Ｄｏｔ^ＴＭ、Ｂｉｏ Ｒａ
ｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）が設定された後、２００
μｌのＨ_２Ｏで洗浄されることにより調製される。変性
に続き、１００μｌの試料混合液はドットブロット器を
用いてナイロン膜へ真空下でのせられる。それぞれのウ
ェルはその後２００μｌの０．４Ｎ水酸化ナトリウムで
洗浄され、さらに簡単に２×ＳＳＣで洗浄され、液体が
残らなくなるまで乾燥される。ＤＮＡはＳｔｒａｔａｌ
ｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ、ＣＡ）ＵＶライトボックスを用いて（「オートクロ
スリンク」の設定で）、１２００ｍＪ／ｃｍ^２の紫外線
照射によりナイロン膜に固定化されクロスリンクされ
る。

【００７９】フィルターは少なくとも３０分間６０℃
（エアシェイカー）で熱シールできる袋の中でハイブリ
ダイゼーション緩衝液（０．５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ溶液、０．１％ ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌのマ
ス精子ＤＮＡ）に浸されて「プレハイブリダイズ」され
る。放射活性標識されたプローブが用いられるなら、緩
衝液はその後１×１０^６ｃｐｍのプローブを含む等量の
同一溶液に置き換えられ、フィルターは６０℃で２時間
から一晩の間ハイブリダイズされる。

【００８０】ハイブリダイゼーション後、フィルターは
三回２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで、二回２０分間室温
で、さらに一度２０分間振とう水浴中で７１℃の高度の
緊縮温度で洗浄される。フィルターは乾燥され、プラス
チックラップにくるまれ、一枚または二枚の増感スクリ
ーンとともに−７０℃でＸ線フィルムに露光される。

【００８１】視覚化する別の方法は西洋ワサビを結合し
たオリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイズ
することで、このオリゴヌクレオチドプローブは「ＰＣ
Ｒプロトコール：方法と応用へのガイド」（Ｉｎｎｉｓ
ら（編）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ）（１９８９）の９２から１１２ページのＬｅｖ
ｅｎｓｏｎおよびＣｈａｎｇにより、およびＮ．Ｅｎ
ｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．の第３１９巻、５３７から５４１ペー
ジ（１９８８）のＳａｉｋｉらにより記述されたように
調製される。ハイブリダイゼーションは５ｍｌのハイブ
リダイゼーション溶液当たり２ｐｍｏｌのＨＲＰ−ＳＳ
Ｏプローブを用いて行われる。

【００８２】洗浄後、色素原の色素基質で現像されるフ
ィルターは１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０
で洗浄され、０．１ｍｇ／ｍｌの３，３′，５，５′−
テトラメチルベンジジン（Ｆｌｕｋａ）および０．００
１５％過酸化水素を含む１００ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ５．０に入れられ、緩やかに攪拌しながら１０
から３０分間室温でインキュベートされる。現像された
フィルターは水で洗浄され、直ちに写真撮影される。Ｔ
ＭＢ検出システムはＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈ
ｅにより開発され製造され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
から入手できるＡｍｐｌｉＴｙｐｅ ＤＱａｌｐｈａＤ
ＮＡタイピングキットに記述されているように基本的に
は調製され用いられる。別の具体例では、フィルターは
化学蛍光検出システム（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａ
ｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて現
像される。フィルターは５分間ＰＢＳで洗浄され、緩や
かに攪拌しながらＥＣＬ溶液に１分間入れられる。フィ
ルターはその後室温で１から５分間Ｘ線フィルムに露光
される。

【００８３】例４ リバースドットブロット法 種の同定にはそれぞれの試料が各種の種特異的プローブ
にさらされる必要がある；同一性はプローブが試料ＤＮ
Ａに結合することにより示される。それぞれの試料が複
数のプローブにさらされるため、リバースドットブロッ
ト法がより便利である。プローブは膜の別々の位置に固
定され、その後膜に結合したプローブにハイブリダイズ
させるために、膜全体が増幅された標的ＤＮＡを含む溶
液に浸される。リバースドットブロットの過程は申請中
の出願第１９７，０００号および第３４７，４９５号
に；Ｓａｉｋｉらの１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８６巻、６２３０から６２３４
ページ；およびＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅに
より開発製造され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販
されるＡｍｐｌｉＴｙｐｅ ＤＱａｌｐｈａ ＤＮＡタ
イピングキットに記述される。増幅プライマーは上述の
ＬｅｖｅｎｓｏｎおよびＣｈａｎｇ の１９８９年の報
告に記述されたようにビオチン化され、そのため、膜結
合プローブにハイブリダイズするいずれの増幅されたＤ
ＮＡも容易に検出される。

【００８４】一つの具体例で、検出はストレプトアビジ
ンを結合させた西洋ワサビのパーオキシダーゼ（ＳＡ−
ＨＲＰ）を膜に結合したプローブにハイブリダイズした
ビオチン化させた（プライマーを介した）増幅ＤＮＡと
反応させることにより行われる。それ故ＨＲＰはＳＡ−
ビオチン相互作用を介して増幅ＤＮＡに結合し、例えば
テトラメチルベンジジンの酸化により色素化合物の生成
のような各種の既知の手段によりシグナルを生成するた
めに用いられる（米国特許第４，７８９，６３０号を参
照）。

【００８５】プローブはいずれかの手段により膜に固定
化されるが、好ましい方法はオリゴヌクレオチドプロー
ブのハイブリダイズする領域にポリ−ｄＴの長い配列を
「テーリング」させることを含む。得られたポリ−ｄＴ
の「テール」はナイロン膜上でプローブを膜に共有結合
で固定するためにアミン基と反応させることができる。
この反応はＵＶ照射により促進される。

【００８６】市販されるＤＮＡ合成機でテールを付けた
プローブをまた合成できるが、末端デオキシリボヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ、Ｒａｔｌｉｆｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；以下の反応に約１２０単
位／μｌ（１００ｐｍｏｌｅ／μｌ）の濃度を仮定）が
プローブにポリ−ｄＴテールを付けるために用いられ
る。しかし、テールを付けたプローブを作るためにＤＮ
Ａ合成機を用いる場合、プローブの５′端にテールを配
置し、そのために望まない未成熟の鎖の停止が主として
テール領域に生じる。

【００８７】ＴｄＴ反応は、１×ＴｄＴ塩、２００ｐｍ
ｏｌｅのオリゴヌクレオチド、８００μＭ ＤＴＴおよ
び６０単位のＴｄＴを含む約１００μｌの容量で行われ
る。１０×ＴｄＴ塩は１０００ｍＭカコジル酸カリウ
ム、１０ｍＭ塩化コバルト、２ｍＭジチオスレイトー
ル、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６であ
り、ここで参考として取り入れられているＲｏｙｃｈｏ
ｕｄｈｕｒｙおよびＷｕによるＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．、第６５巻、４３から６２ページに記述されている
ように調製される。８ｍＭ ｄＴＴＰの１０×保存溶液
は簡単に調製される（水酸化ナトリウムでｐＨ７に中和
される）。

【００８８】ＴｄＴ反応は３７℃で二時間行われ、その
後１００μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８を添加する
ことにより停止される。テールを付けたオリゴヌクレオ
チドの終濃度は１μＭ．（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）で、ホ
モポリマーテールの長さは約４００残基である。テール
の長さはｄＴＴＰのオリゴヌクレオチドに対する分子比
を調整することにより変えられる。テールを付けたプロ
ーブは−２０℃で使用まで保存される。

【００８９】リバースドットブロット法に好ましいナイ
ロン膜はＰａｌｌにより製造され、ＢｉｏＴｒａｎｓナ
イロン膜としてＩＣＮより販売されている、０．４５ミ
クロのポアサイズのＢｉｏｄｙｎｅ Ｂナイロン膜であ
る。プローブはＢｉｏＲａｄ製のＢｉｏ−Ｄｏｔブロッ
ト器を用いて非常に容易に膜にスポットされる。それぞ
れのプローブは膜上の単一の独立した位置にスポットさ
れる。それぞれのテールを付けたプローブ２から１０ｐ
ｍｏｌｅはドットブロット器にのせる前に５０から１０
０μｌのＴＥ緩衝液に予め混合される。ドットブロット
後、膜は過剰の液体を取り去るために吸収紙上に一時的
におかれる。膜はその後Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＳｔ
ｒａｔａｌｉｎｋｅｒライトボックスのようなＵＶライ
トボックス内へ入れられ、ナイロン膜へテールを付けた
プローブを固定するために２５４ｎｍで５０から６０ｍ
Ｊ／ｃｍ^２でＵＶにさらされる。未結合のプローブを除
去するための簡単な洗浄後（ハイブリダイゼーション溶
液で約１５分間）、膜はビオチン化ＰＣＲ産物とのハイ
ブリダイゼーションに用いられる。

【００９０】増幅ＰＣＲ産物は３から１０分間９５℃で
熱することにより変性され、４０μｌの変性ＰＣＲ産物
がハイブリダイゼーションのためにそれぞれのプローブ
に添加される。ハイブリダイゼーションは０．５×ＳＳ
Ｃ、０．２５％ ＳＤＳ、および５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ
溶液からなるハイブリダイゼーション緩衝液中で、振と
う水浴で２０分間５７℃で行われる。ハイブリダイゼー
ション緩衝液は、３．１ｍｌのハイブリダイゼーション
緩衝液にＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販される２５
μｌのＳＡ−ＨＲＰを含む３ｍｌの溶液に置き換えら
れ、振とう水浴中で５７℃、２０分間インキュベートさ
れる。

【００９１】洗浄は２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの
洗浄緩衝液中で行われる。１０ｍｌの洗浄緩衝液での簡
単な膜の洗浄後、１０ｍｌの緩衝液での１２分の厳密な
洗浄が５７℃で行われる。さらに５分の室温での洗浄が
行われ、続けて１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ５．０による５分間の洗浄が行われる。

【００９２】色素原の結合は、５ｍｌの０．１Ｍクエン
酸ナトリウム、５μｌの３％過酸化水素および０．２５
ｍｌの色素原（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＴＭＢ）か
らなる５ｍｌの色素原溶液中で２５から３０分間、室温
で行われる。蒸留水による１０分間の洗浄が三回室温で
行われる。１×ＰＢＳでの室温、３０分間の後洗浄はシ
グナルの質を増すことができる。色素原が存在する段階
の間は、膜はアルミ箔で被うことにより光から遮断され
なければならない。現像された膜は永久に記録するため
に写真撮影される。

【００９３】例５ ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの検出 ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの検出は上の例２に
記述されたプロトコールを用いた、ビオチン化した属特
異的プライマーＫＹ１８（配列番号１）およびＫＹ７５
（配列番号２）による増幅およびそれに続く上の例３に
記述されたドットブロット法を用いた、属特異的プロー
ブＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番
号４）へのハイブリダイゼーションにより行われる。上
流プライマーＫＹ１８（配列番号１）および下流プライ
マーＫＹ７５（配列番号２）のハイブリダイズする領域
の配列は上の表１にあげられている。属特異的プローブ
ＫＹ１０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号
４）のハイブリダイズする領域の配列は上の表２にあげ
られている。

【００９４】属特異的プライマーＫＹ１８（配列番号
１）およびＫＹ７５（配列番号２）はＭｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉａの１５種の核酸を増幅するためにポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に用いられた。結果が表４に示
されている。予想されるように、ＫＹ１８（配列番号
１）／ＫＹ７５（配列番号２）は、Ｍ．ｓｉｍｉａｅを
除く全てのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種のＤＮＡを増幅
した。ＫＹ７５（配列番号２）がＭ．ｓｉｍｉａｅの
３′端５塩基のうち４塩基が、Ｍ．ｃｈｉｔａｅの３′
端の２塩基が異なっているため、Ｍ．ｓｉｍｉａｅまた
はＭ，ｃｈｉｔａｅのＤＮＡの増幅は予想されなかっ
た。しかし、ヒトの病気へのＭ．ｓｉｍｉａｅの関連は
殆ど報告されていないので、検出は臨床的には重要では
ない。Ｍ．ｘｅｎｏｐｉおよびＭ．ｔｅｒｒａｅのＤＮ
Ａを除いて、ハイブリダイズした全ての増幅したＭｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡは属特異的プローブＫＹ１
０１（配列番号３）およびＫＹ１０２（配列番号４）と
のハイブリダイゼーションにより検出された。

【００９５】

【表４】

【００９６】これらのプライマーの特異性は２２の異な
るＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａではない種のＤＮＡを増幅
させることにより試験された。増幅産物はＣｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅおよびＣｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒ ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｎｉｓｓｅｒｉａ
ｓｉｃｃａおよびＰｒｏｐｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａ
ｃｎｅｓのＤＮＡのみから得られた。しかし、これらの
増幅産物は属特異的プローブとはハイブリダイズせず、
それ故、誤りの陽性結果は得られなかった。試験された
生物は下の表５にあげられている。

【００９７】

【表５】

【００９８】例６ 種の同定 ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡが臨床試料に検出さ
れると、核酸を生じる種が例４のリバースドットブロッ
ト法を用いて種特異的プローブとのハイブリダイゼーシ
ョンのパターンにより決定される。現在のシステムによ
り検出される臨床的に興味のある種はＭ．ａｖｉｕｍ、
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓ
ｉｉおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。さら
に、この種が頻繁に臨床試料に見いだされるため、Ｍ．
ｇｏｒｄｏｎａｅの検出が望まれる。

【００９９】図１は表３のプローブから選択された種特
異的プローブの特異性の試験の結果を示す。予想された
特異性とともに、それぞれのプローブのハイブリダイズ
する領域の配列が上の表３に示されている。Ｍｉｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉａの異なる１３種の精製ＤＮＡの増幅産物
が属特異的および種特異的プローブの特異性を試験する
ために用いられた。それぞれの種に対して、培養された
細菌から精製されたｌｐｇのＤＮＡ（約３００の細菌ゲ
ノムに相当）がビオチン化プライマーを用いて、例２の
ように増幅された。プローブハイブリダイゼーションの
検出は例４のリバースドットブロット法を用いて行われ
た。増幅ＤＮＡの存在の陽性の対照として、属特異的プ
ローブが種特異的プローブとともに試験ストリップに含
まれた。

【０１００】例７ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの１６Ｓ ｒＲＮＡの増幅 １６Ｓ ｒＲＮＡは逆転写により最初にｃＤＮＡを作成
し、このｃＤＮＡを増幅することにより増幅される。上
述の例２と同一のプライマーが用いられる。この例で
は、高温での逆転写およびＰＣＲ増幅の両者が熱安定性
Ｔｔｈポリメラーゼを用いて行われる。

【０１０１】逆転写は次の組成を含む２０μｌの容量で
行われる：８μｌのＨ_２Ｏ、２μｌの１０×ＲＴ反応緩
衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、お
よび９００ｍＭ塩化カリウム）、２μｌの１０ｍＭ塩化
マンガン、２μｌのｄＮＴＰ溶液（それぞれＨ_２Ｏに溶
解した２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄ
ＴＴＰ、ｐＨ７．０）、２μｌの「下流」プライマー
（Ｈ_２Ｏに溶解した７．５ｍＭ）、１×保存緩衝液（２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩
化カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、
０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｕｒｆ
ａｃｔａｎｔｓ）、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール）に
溶解した２μｌの０．１８μＭのＴｔｈポリメラーゼお
よび２μｌの鋳型ＲＮＡ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解した２５０ｎｇ以
下）。Ｔｒｉｓを除く全ての溶液は、Ｍａｎｉａｔｕｓ
らの１９８２年の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）」の１９０ページに記述された
ように混入したリボヌクレアーゼを除去するためにジエ
チルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理される。逆転
写はサーモサイクラーで５分間、７２℃で行われる。反
応は氷で４℃まで冷却することにより停止される。

【０１０２】ＰＣＲ増幅は次の試薬を添加することによ
り行われる：２μｌの残りのプライマー（Ｈ_２Ｏに溶解
した７．５ｍＭ）、２μｌのｄＮＴＰ溶液（それぞれＨ
_２Ｏに溶解した１０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
ＰおよびｄＴＴＰ、ｐＨ７．０）、８μｌの１０×ＰＣ
Ｒ反応緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．３、１ｍＭ塩化カリウム、１８．７５ｍＭ塩化マグ
ネシウム、７．５ｍＭＥＧＴＡおよび５０％（ｖ／ｖ）
グリセロール）および６８μｌのＤＥＰＣ処理したＨ_２
Ｏ。核酸は例２と同一の熱プローフィールを用いて、Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラーで増幅され
る。増幅産物は前述の例のように解析される。

【０１０３】例８ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの検出のためのマイクロタイ
タープレートアッセイ 本発明のこの具体例で、プローブはマイクロタイタープ
レートのウェルに固定される。増幅された標的ＤＮＡは
上述のように結合したプローブにハイブリダイズされ
る。前例にあるように、増幅プライマーは結合プローブ
にハイブリダイズした増幅ＤＮＡを検出するためにビオ
チン化される。

【０１０４】ＢＳＡに結合した望みのプローブは最初に
個々のウェルのプラスチック表面に吸着された。ウェル
はその後ウシ血清アルブミンのようなタンパク質でブロ
ックされた。好ましくはＣｏｒｎｉｎｇ製の９６ウェル
プレートが用いられる。

【０１０５】増幅が完了すると、ＰＣＲチューブはサー
モサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）から取り出
された。１００μｌの変性溶液がそれぞれのＰＣＲチュ
ーブに添加された。新しいチップがそれぞれのチューブ
に用いられる。一つの具体例で、検出は直ちには行われ
ない。その場合、ＰＣＲチューブは２から８℃で一晩保
存された。変性された増幅反応液は２から８℃の保存で
粘性をもつようになる。チューブは開ける前にピペッテ
ィングを容易にするために２５から３０℃で簡単に温め
られた。

【０１０６】適当な数の８ウェルのマイクロタイタープ
レートのストリップ（少なくとも二つのストリップ）が
取り出され、マイクロタイタープレート枠にセットされ
た。１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液がマイ
クロタイタープレートのそれぞれのウェルに入れられ
た。

【０１０７】変性溶液は０．４Ｍ水酸化ナトリウム；８
０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００５％チモールブルーを
含む。ハイブリダイゼーション／中和緩衝液は３Ｍチオ
シアン化ナトリウム；８０ｍＭリン酸一ナトリウム；１
０ｍＭリン酸一ナトリウムおよび０．１２５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含む。使用前にｐＨは５．０＋／−０．２にな
るようにチェックされる。

【０１０８】マルチチャンネルピペッターで充電チップ
を用いて、トレーのそれぞれのＰＣＲチューブからの２
５μｌの変性された増幅反応液がマイクロタイタープレ
ートの相当するウェルの位置に入れられた。プレートは
マイクロタイタープレートの蓋で被われ、１０から１５
回側面を緩やかにたたかれた。適正な試薬のピペッティ
ングが行われたウェルは黄色に着色する。色の変化がな
い、または青色への単一の変化が注目されるなら、過剰
量のアンプリコンが添加される。陽性のＯＤ値は増加す
るが、陰性のＯＤ値は影響されなくなるまで試験は続け
られる。プレートは６０分間、３７℃でインキュベート
された。３７℃、一時間の最初のハイブリダイゼーショ
ン後、ハイブリダイゼーション／中和緩衝液は除去さ
れ、同一緩衝液に置き換えられ、プレートはさらに１５
分、３７℃インキュベートされた。

【０１０９】インキュベーションに続いて、プレートは
五回、洗浄溶液で洗浄された。プレートの洗浄は手動
で、または適当にプログラムされた自動マイクロタイタ
ープレート洗浄機を用いて行われる。洗浄には、１×Ｐ
ＣＲ洗浄緩衝液が用いられた。１０×濃度のＰＣＲ洗浄
緩衝液は次のように調製された：９．９４ｇ／ｌのリン
酸二ナトリウム；４．４１ｇ／ｌのリン酸一ナトリウ
ム；３．７２２ｇ／ｌのＥＤＴＡ；８７．６６ｇ／ｌの
塩化ナトリウム；１３．７ｇ／ｌのＴｗｅｅｎ２０およ
び１０ｇ／ｌのＰｒｏ Ｃｌｉｎ３００（Ｒｏｈｍ ａ
ｎｄ Ｈａａｓ、Ｐｈｉｌａｎｄｅｌｐｈｉａ、Ｐ
Ａ）。溶液はｐＨをリン酸で調整される（ｐＨ６．５か
ら７．１が望ましい）。

【０１１０】手動洗浄では、プレートの中身は空にさ
れ、乾燥された。３００μｌの洗浄溶液が試験されるプ
レートのそれぞれのウェルに添加され、プレートは１５
から３０秒乾かされた。プレートは再び空にされ、乾燥
された。この洗浄の過程はさらに四回繰り返された。そ
の後プレートは乾燥された。

【０１１１】自動マイクロプレート洗浄機では、次の手
法が用いられた。ウェルの中身は吸引された。洗浄機は
試験されるプレートのそれぞれのウェルに３５０μｌの
洗浄溶液が添加され、３０秒間浸され、吸引されるよう
にプログラムされた。この段階がさらに四回繰り返され
た。プレートはその後乾燥された。

【０１１２】１００μｌのコンジュゲートが試験される
プレートのそれぞれのウェルに添加された。アビジン−
ＨＲＰコンジュゲートは次のように調製される。希釈液
は０．１モル；０．２５％Ｅｍｕｌｓｉｔ２５（ＤＫＳ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙ
ｏ、Ｊａｐａｎ）；１．０％Ｋａｔｈｏｎ ＣＧ（Ｒｏ
ｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、
ＰＡ）；０．１％フェノール；１．０％ウシγ−グロブ
リンを含む。溶液は濃塩酸でｐＨ７．３に調整された。
この希釈液に対して、１０ｎＭの結合したアビジン（Ｖ
ｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）
が添加された。プレートはその後カバーされ、５０分
間、３７℃でインキュベートされ、再び上述のように洗
浄された。作用基質は二つの８ウェルマイクロタイター
プレートのストリップ（１６検体）に対し、２．０ｍｌ
の基質Ａおよび０．５ｍｌの基質Ｂを混合することによ
り調製された。基質Ａは３ｍＭ過酸化水素、６．５ｍＭ
クエン酸および０．１％Ｋａｔｈｏｎ ＣＧを含む。基
質Ｂは４．２ｍＭ３，３′，５，５′−テトラメチルベ
ンジジンおよび４０％ジメチルホルムアミドを含む。作
用基質は使用三時間以内に調製され、直射日光を避けて
保存された。

【０１１３】１００μｌの作用基質（基質ＡおよびＢの
混合液）が試験されるプレートのそれぞれのウェルに添
加された。プレートはカバーされ、１０分間、室温（２
０から２５℃）で、暗所にてインキュベートされた。１
００μｌの停止試薬（５％硫酸）が試験されるそれぞれ
のウェルに添加された。それぞれのウェルの４５０ｎｍ
の吸収が停止試薬を添加後一時間以内に読まれた。吸収
値は試料および対照について記録された。

【０１１４】例９ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの核酸の増幅および検出のた
めの方法に有効な陽性の対照ベクターの構築 種特異的プローブ結合配列を含むオリゴヌクレオチドが
その相補鎖（ＫＹ１７８（配列番号２４）からＫＹ１８
１（配列番号２７））とともに合成された。（これらの
オリゴはクローニングを容易にするために両端に制限酵
素の認識部位を含む。）ＫＹ１７８（配列番号２４）お
よびＫＹ１７９（配列番号２５）、またはＫＹ１８０
（配列番号２６）およびＫＹ１８１（配列番号２７）の
それぞれ１μｇが、相補鎖をアニールさせるために、合
わされ、５分間９８℃で熱処理され、一時間７５℃でイ
ンキュベートされた。アニール産物は３％Ｎｕｓｉｅｖ
ｅ（ＦＭＣ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）／１％アガロースゲル
の電気泳動により、残留した一本鎖のオリゴから分離さ
れた。二本鎖の産物のバンドは切り出され、ＤＮＡが溶
出された。ＤＮＡ断片はその後適当な制限酵素で切断さ
れ、互いに連結された。連結産物は上記のＮｕｓｉｅｖ
ｅ／アガロースゲルから分離された。

【０１１５】レシピエントベクターが調製された。レシ
ピエントベクターはプライマーおよびプローブ結合部位
を含むＭ．ｔｂの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の断片が挿入
されたプラスミドで、次のように調製された。

【０１１６】５０ｐｇのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
のＤＮＡがプライマーＫＹ７０（配列番号２８）および
ＣＲ０１（配列番号２９）を用いて、全反応系１００μ
ｌ中に５０ｐｍｏｌのＣＲ０１（配列番号２９）、８０
ｐｍｏｌのＫＹ７０（配列番号２８）、２０ｎｍｏｌの
それぞれのｄＮＴＰ、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ
および１×ＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．９；５０ｍＭ塩化カリウム；１．５ｍＭ塩
化マグネシウム）が存在する状態で増幅された。熱のサ
イクル条件は例２の概略の通りである。増幅産物は１０
０μｌのクロロホルムで抽出された。

【０１１７】増幅産物およびベクターｐＢＳ（＋）（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）の両者は制限酵素ＰｓｔＩで消化
され、一度フェノール／クロロホルムで抽出され、エタ
ノールで沈澱された。（ＣＲ０１は５′端にＰｓｔＩ部
位を含み、増幅産物はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ特異的
プライマーおよびプローブの結合部位の下流に内部Ｐｓ
ｔＩ部位を含む。）ＰｓｔＩで切断されたベクターは仔
ウシの腸のホスファターゼでの処理により脱リン酸化さ
れ（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、フェノール／クロロホルムで
抽出された後、エタノールで沈澱された。調製された増
幅産物は標準条件下でベクターに連結された（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）。

【０１１８】連結されたＤＮＡは大腸菌のコンピテント
細胞に形質転換された。望みの挿入を含むプラスミドを
もつコロニーは次のようにｔｂ−特異的プローブＫＹ２
１（配列番号５）に対するコロニーブロットハイブリダ
イゼーションにより同定された。細菌は栄養寒天プレー
ト上に重層されたニトロセルロースフィルターディスク
に画線され、一晩培養された。フィルターは取り出さ
れ、続いて３ＭＭ漉紙に細菌側を上にして）重層され、
１０％ＳＤＳ（３分）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム／
１．５Ｍ塩化ナトリウム（５分）、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ８／１．５Ｍ塩化ナトリウム（５分）お
よび２×ＳＳＣ（５分）に浸された。フィルターは風乾
された。ＤＮＡはフィルター上でＵＶ照射によりクロス
リンクされ、その後ＫＹ２１（配列番号５）にハイブリ
ダイズされ、例３の概略のように洗浄された。

【０１１９】

【化１】

【０１２０】ｐＫＹ５と命名されたこのベクターは、種
特異的プローブ結合部位を含むが、完全なプライマーお
よび属特異的プローブ結合部位を取り去った１７４塩基
対の断片を除去するために、制限酵素ＳｔｙＩおよびＸ
ｈｏＩで切断されたプラスミドは１．５％低融点アガロ
ースゲル電気泳動により１７４塩基対の断片から分離さ
れた。ベクターを含むバンドはゲルから切り出され、Ｎ
ＡＣＳカラム（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂ）を用いたクロマトグラフィおよびエタノール沈
殿により精製された。種特異的プローブの認識部位を含
む挿入断片は調整したベクターに連結される。連結産物
はコンピテントの宿主細菌に形質転換される。

【０１２１】適当な挿入を含む形質転換体はＰＣＲ増幅
により同定される。形質転換体の細菌コロニーは０．５
ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁される。５０μｌの細菌懸濁
液はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡの増幅に必要な
組成を含むＰＣＲ反応チューブに入れられ、増幅が上述
のように行われる。望みの挿入を含むプラスミドをもつ
細菌はプライマーＫＹ１８（配列番号１）およびＫＹ７
５（配列番号２）の対を用いて、６４０塩基対のＰＣＲ
産物を生成する。元々のｐＫＹ５プラスミドを含む細菌
の増幅は５８４塩基対のＰＣＲ産物を生成する。

【０１２２】それ故生成されたアンプリコンは、例に記
述されている属特異的および種特異的プローブのハイブ
リダイゼーション部位の存在を確認するために、Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉａの属特異的および種特異的プローブ
に例４に概略されるリバースドットブロットハイブリダ
イゼーションによりハイブリダイズされる。陽性の対照
プラスミドは、属プローブおよび種特異的プローブの選
択された部分にハイブリダイズするように類似して調製
される。キットでは例えば、ＫＹ１７８からＫＹ１８１
（配列番号２４から２７）の配列を含む陽性の対照プラ
スミドを含むことに加え、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを
他の種と区別するための陽性の対照プラスミドを含むこ
とが望ましい。

【０１２３】

【化２】

【０１２４】例１０ 陽性の対照プラスミドの利用 陽性の対照プラスミドの一つの利用は、特異的な実験に
おける増幅の効率をモニターすることである。そのよう
な応用では、陽性の対照プラスミドの連続的な希釈液が
作成される。既知のコピー数のプラスミドが増幅反応の
鋳型として用いられる。増幅されるプラスミドＤＮＡの
最低数が増幅反応の効率の測定を与える。陽性の対照プ
ラスミドの別の利用は、属および種特異的プローブがＭ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡを検出する効率をモニ
ターするために用いられる産物を生成することである。
上述のように生成された増幅産物はハイブリダイゼーシ
ョン反応の基質として作用できる。適当なハイブリダイ
ゼーションシグナルの生成はプローブがどの程度良好に
ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＮＡを検出できるかにつ
いての評価を可能にする。

【０１２５】

【配列表】

【化３】

【０１２６】

【化４】

【０１２７】

【化５】

【０１２８】

【化６】

【０１２９】

【化７】

【０１３０】

【化８】

【０１３１】

【化９】

【０１３２】

【化１０】

【０１３３】

【化１１】

【０１３４】

【化１２】

【０１３５】

【化１３】

【０１３６】

【化１４】

【０１３７】

【化１５】

【０１３８】

【化１６】

【０１３９】

【化１７】

【０１４０】

【化１８】

【０１４１】

【化１９】

【０１４２】

【化２０】

【０１４３】

【化２１】

【０１４４】

【化２２】

【０１４５】

【化２３】

【０１４６】

【化２４】

【０１４７】

【化２５】

【０１４８】

【化２６】

【０１４９】

【化２７】

【０１５０】

【化２８】

【０１５１】

【化２９】

【０１５２】

【化３０】

【０１５３】

【化３１】

【図面の簡単な説明】

【図１】表３のプローブから選択されたプローブの特異
性の試験の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−130099（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−43087（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−164199（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／8456（ＷＯ，Ａ１) 国際公開90／10085（ＷＯ，Ａ１)

Claims (22)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
   ｒｉａ）属種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の標的領
   域またはそれに相当するＲＮＡを増幅できる一対のオリ
   ゴヌクレオチドプライマーで、第一のプライマーはハイ
   ブリダイズする配列として配列ＫＹ１８（配列番号１）
   の少なくとも１４ヌクレオチドからなるサブ配列を含
   み、第二のプライマーはハイブリダイズする配列として
   配列ＫＹ７５（配列番号２）の少なくとも１４ヌクレオ
   チドからなるサブ配列を含むオリゴヌクレオチドプライ
   マー。
2. 【請求項２】 ハイブリダイズする配列として、第一の
   プライマーが配列ＫＹ１８（配列番号１）を含有し、第
   二のプライマーが配列ＫＹ７５（配列番号２）を含有す
   る請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の一対のプライマーによ
   り増幅されるマイコバクテリア属種の１６Ｓリボソーム
   ＲＮＡ遺伝子の標的領域またはそれに相当するＲＮＡ内
   に保存される領域にハイブリダイズすることができる核
   酸配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、こ
   のプローブが配列ＫＹ１０１（配列番号３）の少なくと
   も１４ヌクレオチドからなるサブ配列またはその相補性
   配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブ。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の一対のプライマーによ
   り増幅されるマイコバクテリア属種の１６Ｓリボソーム
   ＲＮＡ遺伝子の標的領域またはそれに相当するＲＮＡ内
   に保存される領域にハイブリダイズすることができる核
   酸配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、こ
   のプローブが配列ＫＹ１０２（配列番号４）の少なくと
   も１４ヌクレオチドからなるサブ配列またはその相補性
   配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブ。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の一対のプライマーによ
   り増幅されるマイコバクテリア属種の１６Ｓリボソーム
   ＲＮＡ遺伝子の標的領域またはそれに相当するＲＮＡ内
   に保存される領域にハイブリダイズすることができる核
   酸配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、こ
   のプローブとハイブリダイズする配列が検出されるべき
   マイコバクテリア属種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子
   配列とは同一ではなく、かつこのプローブとハイブリダ
   イズする配列が配列ＫＹ１６５（配列番号１３）の少な
   くとも１４ヌクレオチドからなるサブ配列またはその相
   補性配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブ。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の一対のプライマーによ
   り増幅されるマイコバクテリア属種の１６Ｓリボソーム
   ＲＮＡ遺伝子の標的領域またはそれに相当するＲＮＡ内
   に保存される領域にハイブリダイズすることができる核
   酸配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、こ
   のプローブとハイブリダイズする配列が検出されるべき
   マイコバクテリア属種の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子
   配列とは同一ではなく、かつこのプローブとハイブリダ
   イズする配列が配列ＫＹ１６６（配列番号１４）の少な
   くとも１４ヌクレオチドからなるサブ配列またはその相
   補性配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブ。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の一対のプライマーによ
   り増幅されるマイコバクテリア属種の１６Ｓリボソーム
   ＲＮＡ遺伝子の標的領域またはそれに相当するＲＮＡ内
   の可変的な領域にハイブリダイズすることができる核酸
   配列からなるオリゴヌクレオチドプローブであって、こ
   のプローブは、配列ＫＹ２１（配列番号５）、配列ＫＹ
   ２５（配列番号６）、配列ＫＹ２６（配列番号７）、配
   列ＫＹ６３（配列番号８）、配列ＫＹ１５１（配列番号
   ９）、配列ＫＹ１０６（配列番号１０）、配列ＫＹ１２
   ６（配列番号１１）、配列ＫＹ１３９（配列番号１
   ２）、配列ＫＹ１５７（配列番号１６）、配列ＫＹ１６
   ７（配列番号１７）、配列ＫＹ１６８（配列番号１
   ８）、配列ＫＹ１６９（配列番号１９）、配列ＫＹ１７
   ０（配列番号２０）、配列ＫＹ１７１（配列番号２
   １）、配列ＫＹ１７２（配列番号２２）および配列ＫＹ
   １７３（配列番号２３）並びにこれらの完全に相補的な
   配列からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプロ
   ーブ。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の少なくとも二つのオリ
   ゴヌクレオチドプローブからなる一群のオリゴヌクレオ
   チドプローブ。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の一対のプライマーから
   なるサンプル中のマイコバクテリア核酸を検出し、場合
   により同定するキット。
10. 【請求項１０】 更に、一対のプライマー、ＫＹ１８
    （配列番号１）およびＫＹ７５（配列番号２）により増
    幅された１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の領域にハイブ
    リダイズすることができる核酸を含むオリゴヌクレオチ
    ドプローブからなる請求項９に記載のキット。
11. 【請求項１１】 前記プローブ配列が、検出されるマイ
    コバクテリア属種のいずれとも配列において同一ではな
    い請求項１０に記載のキット。
12. 【請求項１２】 更に、配列ＫＹ２１（配列番号５）、
    配列ＫＹ２５（配列番号６）、配列ＫＹ２６（配列番号
    ７）、配列ＫＹ６３（配列番号８）、配列ＫＹ１５１
    （配列番号９）、配列ＫＹ１０６（配列番号１０）、配
    列ＫＹ１２６（配列番号１１）、配列ＫＹ１３９（配列
    番号１２）、配列ＫＹ１５７（配列番号１６）、配列Ｋ
    Ｙ１６７（配列番号１７）、配列ＫＹ１６８（配列番号
    １８）、配列ＫＹ１６９（配列番号１９）、配列ＫＹ１
    ７０（配列番号２０）、配列ＫＹ１７１（配列番号２
    １）、配列ＫＹ１７２（配列番号２２）および配列ＫＹ
    １７３（配列番号２３）の少なくとも１４ヌクレオチド
    からなるサブ配列、並びにこれらの相補的な配列からな
    る群から選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチ
    ドプローブからなる請求項９〜１１のいづれか一つに記
    載のキット。
13. 【請求項１３】 更に、配列ＫＹ２１（配列番号５）、
    配列ＫＹ２５（配列番号６）、配列ＫＹ２６（配列番号
    ７）、配列ＫＹ６３（配列番号８）、配列ＫＹ１５１
    （配列番号９）、配列ＫＹ１０６（配列番号１０）、配
    列ＫＹ１２６（配列番号１１）、配列ＫＹ１３９（配列
    番号１２）、配列ＫＹ１５７（配列番号１６）、配列Ｋ
    Ｙ１６７（配列番号１７）、配列ＫＹ１６８（配列番号
    １８）、配列ＫＹ１６９（配列番号１９）、配列ＫＹ１
    ７０（配列番号２０）、配列ＫＹ１７１（配列番号２
    １）、配列ＫＹ１７２（配列番号２２）および配列ＫＹ
    １７３（配列番号２３）の少なくとも１４ヌクレオチド
    からなるサブ配列、並びにこれらの相補的な配列からな
    る群から選択される少なくとも二つのオリゴヌクレオチ
    ドプローブからなる一群のオリゴヌクレオチドプローブ
    を含んでなる請求項９〜１１のいづれか一つに記載のキ
    ット。
14. 【請求項１４】 プライマーＫＹ１８（配列番号１）お
    よびＫＹ７５（配列番号２）に相補的な上流および下流
    の配列に隣接した内部対照オリゴヌクレオチド配列を更
    に含む請求項９〜１３のいずれか一つに記載のキット。
15. 【請求項１５】 プライマーＫＹ１８（配列番号１）お
    よびＫＹ７５（配列番号２）に相補的な上流および下流
    の配列に隣接する請求項１に記載の一対のプライマーを
    用いて増幅することができる内部陽性対照オリゴヌクレ
    オチド。
16. 【請求項１６】 更に、配列ＫＹ１０１（配列番号
    ３）、配列ＫＹ１０２（配列番号４）、配列ＫＹ１６５
    （配列番号１３）および配列ＫＹ１６６（配列番号１
    ４）の少なくとも１４ヌクレオチドからなる核酸サブ配
    列を含んでなる請求項１５に記載のオリゴヌクレオチ
    ド。
17. 【請求項１７】 更に、配列ＫＹ２１（配列番号５）、
    配列ＫＹ２５（配列番号６）、配列ＫＹ２６（配列番号
    ７）、配列ＫＹ６３（配列番号８）、配列ＫＹ１５１
    （配列番号９）、配列ＫＹ１０６（配列番号１０）、配
    列ＫＹ１２６（配列番号１１）、配列ＫＹ１３９（配列
    番号１２）、配列ＫＹ１５７（配列番号１６）、配列Ｋ
    Ｙ１６７（配列番号１７）、配列ＫＹ１６８（配列番号
    １８）、配列ＫＹ１６９（配列番号１９）、配列ＫＹ１
    ７０（配列番号２０）、配列ＫＹ１７１（配列番号２
    １）、配列ＫＹ１７２（配列番号２２）および配列ＫＹ
    １７３（配列番号２３）の少なくとも１４ヌクレオチド
    からなるサブ配列からなる群から選択される核酸サブ配
    列を含んでなる請求項１６に記載のオリゴヌクレオチ
    ド。
18. 【請求項１８】 試料中に含まれるマイコバクテリアの
    核酸を検出する方法であって、 （ａ）請求項１に記載の一対のプライマーを用いて１６
    ＳリボソームＲＮＡ遺伝子由来の前記核酸領域を増幅
    し、 （ｂ）工程（ａ）にて増幅される前記核酸を、マイコバ
    クテリア属に特異的なプローブと混合し、そして （ｃ）前記核酸および前記プローブの間に形成されたハ
    イブリッドを検出することを含んでなる方法。
19. 【請求項１９】 マイコバクテリア属に特異的なプロー
    ブが、請求項３〜６のいずれかに記載のプローブである
    請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 マイコバクテリアを分類する方法であ
    って、 （ａ）請求項１に記載の一対のプライマーを用いて１６
    ＳリボソームＲＮＡ遺伝子由来の核酸領域を増幅し、 （ｂ）工程（ａ）にて増幅される前記核酸を、請求項８
    に記載の一群の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ
    と混合し、そして （ｃ）前記核酸および前記プローブの間に形成されたハ
    イブリッドを検出することを含んでなる方法。
21. 【請求項２１】 増幅がポリメラーゼ連鎖反応により行
    われる請求項１９および２０のいずれか一つに記載の方
    法。
22. 【請求項２２】 ポリメラーゼ連鎖反応が、配列ＫＹ１
    ８（配列番号１）および配列ＫＹ７５（配列番号２）か
    らなる一対のプライマーを用いて行われる請求項２１に
    記載の方法。