NO310884B1 - Par av oligonukleotidprimere, oligonukleotidprobe, anvendelse av dem for påvisning, samt analysesett som omfatter par avoligonukleotidprimere og valgfritt minst ±n oligonukleotidprobe - Google Patents

Abstract

Primere og prober til påvisning av nukleinsyre fra mycobakterium i en prøve og bestemmelse av artene fra hvilke nukleinsyren stammer. Primerene forøker området i 16S ribosam RNA genet og hybridiserer til områder som er bevart mellom arter. Genus-spesifikke prober hybridiserer til sekvenser innenfor det forøkte området som er bevart blant mycobakterie-arter, mens de arts-spesifikke probene hybridiserer til et variabelt område, slik at artsidentiteten kan bli entydig bestemt. Consensusprober tilveiebringes for påvisning av en mycobakterie nukleinsyrer, og disse prober er ikke identiske med noen av sekvensene i mycobakterieartene.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et par av oligonukleotidprimere, oligonukleotidprobe, anvendelse av dem for påvisning, samt analysesett som omfatter par av oligonukleotidprimere og valgfritt minst én oligonukleotidprobe for å påvise nærværet av mycobakteriell nukleinsyre og identifisere mycobakteriearter hvorfra en mycobakterie-nukleinsyre i en prøve stammer. Spesielt vedrører den foreliggende oppfinnelsen et par av oligonukleotidprimere som er i stand til å amplifisere et målområde i 16S ribosomal RNA-genet av en mycobakterieart eller dens tilsvarende RNA, kjennetegnet ved at den første primeren inneholder en delsekvens omfattende minst 14 nukleotider av sekvensen KY18 (SEKV. ID. NR.: 1) som hybridiseringssekvens og den andre primeren inneholderen delsekvens på minst 14 nukleotider av sekvensen KY 75 (SEKV. ID. NR.: 2) som hydbridiserings-sekvens. Foretrukket inneholder den første primeren sekvensen KY18 (SEKV.ID.NR.:1) og den andre primeren inneholder sekvensen KY75 (SEKV. ID.NR.:2) som hybridiseringssekvens. Videre vedrører den foreliggende oppfinnelse en oligonukleotidprobe som inneholder en oligonukleotidsekvens i stand til å hybridisere til et område som er konservert innen målområdet av 16S ribosom-RNA-genet av en mycobakterieart eller dens tilsvarende RNA amplifisert med et par primere ifølge krav 2, kjennetegnet ved at nevnte probe er sekvensen KY 101 (SEKV. ID. NR.: 3) eller sekvensen som helt er komplementær til denne, eller sekvensen KY102 (SEKV. ID. NR.: 4) eller sekvensen komplementær dertil. Nærmere bestemt vedrører den foreliggende oppfinnelse anvendelser av et par oligonukleotidprimere for å påvise eller identifisere en mycobakterienukleinsyre i en prøve ved å amplifisere et målområde av 16S ribosom-RNA genet eller det tilsvarende RNA i en mycobakterieart, blande den amplifiserte nukleinsyre med en probe og påvise eller identifisere hybrider som dannes mellom nukleinsyren og proben, hvorved spesifikke prober fremlegges. Videre vedrører oppfinnelsen et analysesett for utførelse av anvendelsene.

Mycobakterier er langsomtvoksende, syrebestandige, aerobe basiller. Minst 19 mycobakteriearter er hittil knyttet til sykdom hos mennesker, særlig M. tuberculosis, M. bovis og M. leprae. Noen arter såsom M. avium, M. intracellulare og M. kansasii, selvom de ikke normalt er patogene for friske individer, kan forårsake sykdom hos individer med immunsvikt, såsom dem som er infisert med AIDS-virus. I tillegg forårsaker flere arter sjelden sykdom hos mennesker, men kan opptre i kliniske prøver som saprofytter. Fremgangsmåter for påvisning og identifisering av mycobakteriearter som innbefatter bakteriedyrkning, antistoffpåvisning, og nylig påvisning av rRNA ved hybridisering til en radioaktivt merket nukleinsyreprobe. Hver av disse metodene medfører betydelige problemer.

Påvisning ved dyrkning av bakteriene er langsom, krever opp til to måneder, og krever gjerne ytterligere biokjemisk prøving for artsidentifikasjon. Antistoffpåvisning mangler spesifisitet på grunn av kryssreaktivitet mellom mycobakteriearter, og mangler også sensitivitet. Videre er differensiering mellom nåværende og tidligere infeksjoner vanskelig. Påvisning ved bruk av radioaktivt merkede DNA-fragmenter som prober, som hybridiserer til den lille underenhet ribosom-RNA (16S RNA) mangler sensitivitet og krever fortsatt en i det minste flere dagers dyrkningstid (se PCT/WO 84/02721).

Oppfinnelsen av polymerasekjedereaksjonen (PCR), en fremgangsmåte for å forøke spesifikke sekvenser av nukleinsyre, gjør det mulig å raskt påvise nukleinsyrer som er tilstede i en celle i det som tidligere var en ikke målbar mengde. Ved bruk av PCR-oppformering, kan en påvise endog en enkel kopi av målcellenukleinsyren. Direkte påvisning ved hjelp av hybridisering med en sekvens-spesifikk oligonukleotidprobe av en nukleinsyresekvens som er oppformert til et påvisbart nivå gjør mulig diagnostiske analyser som er spesifikke nok til å påvise en enkelt nukleotidsekvensforandring. Imidlertid er ikke alle primerpar og prober anvendbare. Valget av primere og, derfor, hvilken region som skal amplifiseres, sammen med probevalg bestemmer stort sett den spesifisitet og sensitivitet som kan oppnås.

Amplifikasjon ved hjelp av PCR er blitt benyttet for sekvensering av mycobakterie nukleinsyre, påvist gjennom mycobakterienukleinsyre i en prøve, og identifisering av myco-bakteriearter. Forskjellige regioner i bakteriegenomet er blitt benyttet for å påvise og identifisere mycobakterienukleinsyre i prøvene. Mesteparten av disse diagnostiske analyser ble laget for å påvise en eller et lite antall arter, og begrensede spesifisitetsundersøkelser, hvis noen i det hele tatt, ble utført ovenfor ikke-mycobakterie DNA.

Påvisning av et område i genet som koder for det 65 kilodalton antigenet ble beskrevet i Chia et al., 1990, J. Clin. Microbiol. 28(9): 1877 -1880; Brisson-Noel et al., 1989, Lancet 334:1069 -1071; Hackel et al., 1990, Molecular and Cellular Probes 4:205 - 210; Woods and Cole, 1989, FEMS Microbiology Letters 65:305 - 310; og Hance et al., 1989, Molecular Microbiology 3(7):843 - 849. Ikke fler enn 3 sett mycobakteriearter ble adskilt i noen av analysene basert på 65 kilodalton antigenet.

Amplifikasjon av det repetitive DNA-elementet, IS6110, ble omtalt i Thierry et al., 1990, J. Clin. Microbiol. 28(12):2668 -2673, og Eisenach et al., 1990, J. Infectious Disease 161:977 - 981. Amplifikasjon av IS6110 tjener hovedsaklig til å undersøke tilstedeværelsen av spesielle arter mycobakterier, skjønt M. tuberculosis og M. bovis kan adskilles ved kopitall (Plikaytis et al., 1991, Molecular and Cellular Probes 5:215 - 219).

Det 36 kilodalton antigenet fra M. leprae ble benyttet i en diagnostisk analyse i Hartskeerl et al., 1989, J. Gen. Microbiol. 135:2357 - 2364. Skjønt analysen var ment å være spesifikk for en M. leprae, ble svak til moderat hybridisering til DNA fra andre mycobakterier observert.

Gensekvensen som koder for proteinantigenet av M. tuberculosis ble benyttet i Sjobring et at., 1990, J. Clin. Microbiol. 28(10):2200 - 2204, for å lage en analyse for M. tuberculosis/ bovis basert på nærvær eller fravær av et amplifisert produkt.

En analyse bare for M. tuberculosis basert på gensekvensen som koder for MPB 64 proteinet ble beskrevet i Shankar et al., 1990, Lancet 335:423.

Prober som ble laget fra klonede DNA fragmenter ble beskrevet i Patel et al., 1990, J. Clin. Microbiol. 28(3):513-518, og Fries et al., 1990, Molecular and Cellular Probes 4:87-105. Probespesifisitet ble oppnådd ved en seleksjonsfrem-gangsmåte i stedet for ved sekvensanalyse under utvikling av proben.

Et av områdene i mycobakteriegenomet som har blitt analysert og blinket ut for anvendelse i en diagnostisk analyse er den lille subenhet ribosomale RNA (16S rRNA). I Bottger, 1989, FEMS Microbiology Letters 65:171 - 176, ble 16S rRNA fra en rekke organismer amplifisert ved bruk av "universell" primere laget for å amplifisere nukleinsyre fra en lang rekke organismer og så sekvensert direkte. Det fylogenetiske slektskap mellom mycobakteriearter ble studert ved å sammen-ligne 16S rRNA gensekvensen i Rogall et al. 1990, J. Gen. Micro. 136:1915 - 1920. In Boddinghaus et al., 1990, J. Clin. Microbiol. 28(8): 1751 -1959, og det ble presentert bevis med hensyn til resultater som kan bli oppnådd ved bruk av sekvensspesifikke oligonukleotider for amplifisering og hybridisering til regioner i 16S rRNA sekvensen. En sterkt variabel region i 16S rRNA sekvensen ble studert med hensyn til tre mycobakteriarter. Slekts-spesifikke primere ble benyttet for å amplifisere et område som inneholder den variable region benyttet for arts-spesifikk probehybridisering.

Den lille sub-enhet rRNA fra et stort antall organismer, både de som er nær og fjernt beslektet med mycobakterie, er blitt studert og sekvensert. En oppstilling av lille sub-enhet rRNA sekvensene fra et stort antall organismer er gitt i Neefs et al., 1990, Nuc. Acids Res. Supplement 18:2237 - 2317.

Det er fremdeles behov for en rask og følsom analyse for å identifisere tilstedeværelsen av mycobakterie DNA og artene som DNA stammer fra.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter en rask og følsom PCR basert analyse for påvisning og artsidentifisering av mycobakterier. Primere og prober som er spesifikke for 16S ribosomal RNA gensekvensene blir fremstilt. Mycobakteriepåvisning utføres med amplifisering ved hjelp av genus-spesifikke primere etterfulgt av undersøkelse med genus-spesifikke prober i en dot-blot-hybridiseringsanalyse. Hvis mycobakterier påvises, blir artsidentifisering bestemt ved hjelp av amplifisert DNA, normalt fra den samme amplifikasjonsreaksjon, ved bruk av arts-spesifikke prober i en revers dot-blot-analyse.

Amplifikasjon av sekvenser som koder for 16S ribosomal RNA (RNA) har flere fordeler. Den foreliggende oppfinnelse kan benyttes til å påvise og adskille

mellom mer enn 30 mycobakteriearter og tallrike andre organismer som kan være tilstede i en klinisk prøve. Probene og primerene i den foreliggende oppfinnelse gir den maksimalt mulige spesifisitet, og minsker derved sannsynligheten for en falsk positiv som forårsakes av tilstedeværelsen av en beslektet organisme med en lignende sekvens. 16S RNA genet inneholder sterkt konserverte områder. Arts-spesifikke primere og prober i den foreliggende oppfinnelse hybridiserer til slike konserverte områder og er i stand til å hybridisere til sekvenser fra omtrent alle arter i genus; primerene amplifiserer nukleinsyre fra 14 til 15 mycobakteriearter som er testet og av disse 14 forøkede mycobakteriesekvensene, hybridiserer de arts-spesifikke probene til 12.16S rRNA inneholder også sterkt varierende områder med forøket region. De arts-spesifikke probene i den foreliggende oppfinnelse hybridiserer innenfor et variabelt område hvor hver art av interesse har en enkeltstående (unik) sekvens.

En ytterligere fordel ved å velge primere og prober fra 16S rRNA er at RNA er tilstede i en voksende celle i stort kopitall (10^ -10^). Antall av gensekvenser i form av RNA i en gitt klinisk prøve skulle derfor være opptil 10 ganger større enn tallet i de korresponderende DNA sekvensene, hvis ytterligere analysefølsomhet ønskes, kan RNA selv bli benyttet som amplifikasjonsmål.

I en annen del av oppfinnelsen, gir en annen amplifikasjonsreaksjon utført som en bekreftende analyse, den andre forøkningsreaksjonen er basert på nærværet av målsekvenser som ikke er direkte beslektet med det første målet, det vil si 16S ribosomal rRNA nukleinsyrene. Foretrekkes konservert blant mycobakterieartene og er ikke beslektet med ikke-mycobakteriearter. Et passende målgen kan f.eks. være genet som koder for 65 kDa proteingenet. Pao et al., 1989, FEMS Micro. Letters 65:205 - 310; Hartskeerl et al., 1989, J. Gen. Micro. 135: 2357 - 2364; and Hackel et al., 1990, Mol. Cel probes 4:205-210. Dette er nyttig for å bekrefte resultatene fra den første amplifikasjonsreaksjonen, men amplifiseringen av en annen målsekvens er spesielt betydningsfullt for å løse motstridende resultater som kan oppstå fra komparative studier, spesielt sammenligningen mellom PCR og dyrkningsfremgangsmåter.

Et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelse omhandler et analysesett som inneholder nye sammensetninger for bruk som positive kontroller for å påvise mycobakterium. Oppfinnelsen omfatter en ny sammensetning for å bekrefte resultatene i en analyse ved bruk av genus-spesifikke prober såvel som arts-spesifikke mycobakteriumprober.

Et område for oppfinnelsen omfatter prober som er i stand til å påvise nærvær av mycobakterie nukleinsyre (genus-spesifikke prober) og for å bestemme artsidentiteten hvorfra nukelinsyren stammer (arts-spesifikke prober).

Et annet område i oppfinnelsen omhandler konsensusprober. I en foretrukket utførelsesform omtaler oppfinnelsen konsensusoligonukleotider for amplifikasjon og påvisningen av ulike arter mycobakterieisolater. Konsensus oligonukleotidprobene hybridiserer ikke til ikke-mycobakterium arter som er nær beslektet til mycobakterier.

Konsensusprobene passer for et bredt spektrum av målspesifikk påvisning ved bruk av en enkel nukleotidprobe. En konsensus-probe, som benyttet her, er en oligonuklotidprobe som er ikke-identisk i sekvens til noen av mycobakterie-nukleinsyre-sekvensene som skal påvises, onsensusprobene er hybrid oligonukleotidsammensetninger som omfatter ikke naturlige nukleinsyresekvenser. Konsensusprobene slik de beskrives i foreliggende oppfinnelse kan benyttes til å ekskludere så vel som inkludere utvalgte arter i en påvisningsmetode. I en utførelsesform, omtaler oppfinnelsen oligonukleotidprober som består av nye sekvenser. Mens disse probene påviser mange mycobakteriearter, påviser de ikke nær beslektede ikke-mycobakteriearter, f.eks. Corynebakterer.

En annen del av oppfinnelsen omfatter primere for å forøke et spesifikt område i mycobakterienukleinsyre. Dette område inneholder både et område som er konservert blant mycobakterieartene og et variabelt område med tilstrekkelige heterogenitet blant artene for å gjøre det mulig å bestemme nukleinsyre-opprinnelsen ved bruk av sekvens spesifikke oligonukleotidprober.

En annen del av oppfinnelsen omfatter påvisning og species identifisering. Amplifikasjon av målnukleinsyren ved hjelp av PCR, ved bruk av primere ifølge oppfinnelsen tillater en å påvise tilstedeværelse av mycobakterienukleinsyre ved å blande den amplifiserte nukleinsyren med genus-spesifikke prober og analysere hvis hybridisering skjer, mens artsidentifisering utføres ved å bestemme mønstret for hybridisering til arts-spesifikke prober.

Et ytterligere område for oppfinnelsen omfatter analysesett "kit". Disse analysesettene antar en rekke former og omfatter en eller flere prober, og i en utførelsesform, karakteriseres av et panel prober som er tilstrekkelig for å bestemme identiteten til en infiserende mycobakterie på artsnivå og instruksjoner for bruk av analysebestanddelene. Analysesettet kan også omfatte en eller flere forøkningsforbindelser, det vil si, genus-spesifikke primere, polymerase, buffere og nukleosidtrifosfater.

I ytterligere en utførelsesform, kan analysesettet også omfatte positive og negative kontroller. En foretrukket positiv kontroll beskrives her.

For å underlette forståelsen av oppfinnelsen, blir flere betegnelser nedenfor definert.

Betegnelsen "oligonukleotid" refererer seg til et molekyl som omfatter to eller vanligvis flere deoksyribonukleotider eller ribonukleotider, slik som primere, prober, nukleinsyrefragmenter som skal påvises, og nukleinsyrekontroller. Den nøyaktige størrelsen av et oligonukleotid avhenger av mange faktorer og den endelige funksjon til eller bruk av oligonukleotidet. Oligonukleotidene kan frem-stilles ved hjelp av en hvilken som helst passende metode, inklusive, f.eks., kloning og restriksjon av passende sekvenser og direkte kjemisk syntese ved hjelp av en fremgangsmåte slik som fosfotriesterfremgangs-måten til Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; fosfodiesterfremgangsmåten til Brown et al., 1979, Meth Enzymol. 68:109-151: dietylfosforamiditfremgangsmåten til Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; og fastfasefremgangsmåten til US patent nr. 4 458 066.

Betegnelsen "primere" refererer seg til et oligonukleotid, mens naturlig eller syntetisk, i stand til å virke som et startpunkt for DNA syntese under betingelser hvor et primer syntese forlengelsesprodukt som er komplementært til nuklein-syretråden igangsettes, det vil si i nærvær av fire forskjellige deoksyribonukleosid-trifosfater og en forbindelse for polymerisering (det vil si DNA polymerase revers transkriptase) i passende buffer og ved en passende temperatur. En primer er fortrinnsvis en enkeltkjedet oligodeoksyribonukletid. Den passende lengden til en primer avhenger av anvendelsen for primeren, men omfatter typisk 15 til 25 nukleotider. Korte primermolekyler krever vanligvis lavere temperaturer for å lage tilstrekkelig stabile hybridkomplekser med templatet. En primer må ikke gjenspeile den nøyaktige sekvensen til templatet, men må være tilstrekkelig komplementær til å hybridisere med et templat og tjene som startsted for DNA-syntese.

I de beskrevne utførelsesformene av oppfinnelsen, blir spesifikke sekvensprimere og prober omtalt. Det vil være klart for de som er erfarne i feltet at, sammen med disse utførelsesformene, kan spesifikke sekvensprimere og prober bli endret ved, f.eks., tilsetting av nukleotider til enten 5'- eller 3'-endene, disse nukleotidene er komplementære ovenfor målsekvensen eller er ikke komplementære til målsekvensen. Så lenge som primer sammensetningen tjener som et startpunkt for forlengelse av målsekvensene, og primerene og probene omfatter minst 14 sammenhengende nukleotider inneholdt i disse eksemplifiserte utførelses-formene, blir slike sammensetninger innenfor oppfinnelsens ramme.

Betegnelsen "primer" kan representere mer enn en primer, spesielt i tilfelle hvor det er en viss tvetydighet i informasjonen som har med en eller begge ender i målregionen som skal amplifiseres. Hvis et "bevart" område viser en betydelig polymorfisme i en populasjon, kan primer-blandinger bli fremstilt som vil amplifisere slike sekvenser, eller primerene kan konstrueres slik at de amplifiserer endog feil-parrete sekvenser. En primer kan merkes, hvis ønskelig, ved å innsette en markør, som påvises ved hjelp av spektroskopiske, fotokjemiske, biokjemiske, immunkjemiske eller kjemiske hjelpemidler. F.eks. omfatter anvendbare markører

<32>p, fluoriserende fargestoffer, elektron-tette reagenser, enzymer (som vanlig benyttet i ELISAer), biotin eller haptener og proteiner for hvilke antisera eller monoklonale antistoffer er tilgjengelige. En markør kan også benyttes for å "fange" primeren, for å underlette forankringen til et fast underlag av enten primeren eller et primer forlengelsesprodukt, slik som forøket DNA.

Betegnelsen "sekvensspesifikk oligonukleotid" og "SSO" refererer seg til oligonukleotider som har en sekvens, som betegner et "hybridiseringsområde" komplementært til sekvensen som skal påvises, som, under "sekvensspesifikke, stringente hybridiseringsbetingelser", vil hybridisere utelukkende til den nøyaktige komplementære målsekvens. Ved å slakke på hybridiseringsstringens-betingelsene vil sekvensfeiltilpasning tolereres; graden av feiltilpasning som tolereres kan bli kontrollert ved passende justering av hybridiseringsbetingelsene. Betegnelsene "probe" og "SSO probe" blir benyttet om hverandre med SSO.

Betegnelsene "målområde" refererer seg til et område i en nukleinsyre som skal analyseres.

Betegnelsen "termostabil polymeraseenzym" refererer seg til et enzym som er relativt stabilt ovenfor varme og katalyserer polymeriseringen av nukleosidtrifosfater for å lage primer forlengelsesprodukter som er komplementære til et av nukleinsyrekjedene i målsekvensen. Enzymet starter syntese ved 3'-enden i primeren og fortsetter i retning mot 5'-enden i templatet til syntesen av avsluttes. Et renset termostabilt polymerase enzym er beskrevet mer fullstendig i US patent nr. 4 889 818.

Betegnelsen "revers transkriptase" refererer seg til et enzym som katalyserer polymeriseringen av nukleosidtrifosfatet for å lage primerforlengelses-produkter som er komplementære til et ribonukleinsyretempelat. Enzymet starter syntesen i 3-enden i primeren og fortsetter i retning mot 5'-enden i templatet til syntesen avsluttes. Eksempler på passende polymeriseringsforbindelser som overfører RNA-målsekvensen til en komplementær, kopi DNA (cDNA)-sekvens er fugle myeloblastosevirus revers transkriptase og termustermofilus DNA-polymerase, en termostabil DNA-polymerase med revers transkriptaseaktivitet.

Figur 1 viser resultater av hybridiseringsanalyser ved bruk av genus-spesifikke og arts-spesifikke prober fra oppfinnelsen. Spesifisiteten til probene ble undersøkt med DNA fra tretten forskjellige arter Mycobacterium.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter en rask og følsom PCR-basert fremgangsmåte for påvisning og artsidentifisering av Mycobacterium. Primere og prober som er spesifikke for mycobakterie 16S ribosomal RNA-gensekvenser blir omtalt. Mycobakteriepåvisning utføres ved hjelp av amplifikasjon med genus-spesifikke primere etterfulgt av undersøkelser med genus-spesifikke prober i en dot-blot-hybridiseringsanalyse. Hvis mycobakterie blir påvist, blir artsidentifisering bestemt fra DNA fra den samme amplifikasjonsreaksjonen ved bruk av art-spesifikke prober i en revers dot-blot-analyse. Både forover- og revers dot-blot-analyser kan utføres med letthet i en mikrotiterskål.

Genus-spesifikke primere og prober hybridiserer til konserverte områder i 16S rRNA genet, og de species-spesifikke probene hybridiserer til variable områder i 16S rRNA-genet. Fordi syntese starter ved 3-enden i primeren, er feiltilpasninger til 3'-enden mer kritisk. Tymidin tåles bedre enn andre mismatchende baser; slik at primere ble konstruert hvor tyminbasen ble unngått ved 3'-enden. Baseinnholdet i et oligonukleotid påvirker denatureringstemperaturen. Stringensen og spesifisiteten for primer- eller probebinding øker med økende temperatur. Imidlertid fordi alle probene blir hybridisert samtidig i den reverse dot-blot-analysen, blir optimale probe hybridiseringsbetingelser lik for alle probene.

Primerparene ifølge oppfinnelsen fungerer effektivt i amplifikasjon av sekvens i 16S rRNA-genet fra alle mycobakterieartene av interesse, men amplifiserer ikke det tilsvarende DNA fra de fleste andre kilder. Videre, amplifikasjonsbetingelsene og effektiviteten til disse primerene blir omtrent likeartet fra art til art slik at nesten alle mycobakterieartene kan påvises ved bruk av en enkel analyse. Tabell 1 viser hybridiseringssekvensen til primerene i den foreliggende oppfinnelsen.

Ved bruk av E. co//-nummereringssystem, omfatter oppstrøms-primeren, KY18, basene 52 - 74, og nedstrømsprimeren, KY75, omfatter basene 624 - 647 i 16S rRNA-genet. Sammen spesifiserer disse primerene syntesen av et produkt som er omtrent 583 base-par langt, den nøyaktige størrelsen er artsavhengig.

Den første undersøkelsen for tilstedeværelsen av mycobakterie DNA utføres med to genus-spesifikke prober som benyttes samtidig i en blanding.

Grunnen for de blandede probene er at de fleste mycobakterie-arter kan deles i to grupper med hensyn til sekvensen i området til KY101(SEQ ID NO.3) og KY102(SEQ ID NO.4). Disse to probene påviser DNA fra 12 av 14 arter av genus Mycobacterium som er testet.

En alternativ utførelsesform, erstatter KY165(SEQ ID NO. 13) probene KY101 (SEQ ID NO.3) og KY102(SEQ ID NO.4). Sekvensen til probene KY101 (SEQ ID NO.3), KY102(SEQ ID NO.4), KY165(SEQ ID NO.13), og KY166(SEQ ID NO. 14) er oppgitt i tabell 2. KY165(SEQ ID NO.13) er en konsensusprobe som omfatter sekvensene til både KY101(SEQ ID NO.3) og KY102(SEQ ID NO.4), KY101(SEQ ID NO.3) og KY102(SEQ ID NO.4) adskiller seg fra hverandre ved to baser. KY165(SEQ ID NO.13) er ikke identisk med hverken KY101(SEQ ID NO.3) eller KY102(SEQ ID NO.4), men adskiller seg fra hverandre ved en enkel base. Denne konsensus ble oppnådd ved å "favorisere" KY101(SEQ ID NO.3) i en av de feiltilpassede posisjonene og KY102(SEQ ID NO.4) i de andre feiltilpassede posisjonene. KY165(SEQ ID NO.13) er i stand til å hybridisere i tilstrekkelig grad til alle KY101-(SEQ ID NO.3) og KY102-spesifikke (SEQ ID NO.4) mycobakterie-arter. KY165(SEQ ID NO.13) hybridiserer ikke til M. xenopi (SEQ ID NO. 15) under betingelser for høy stringens fordi ytterligere feiltilpasninger er tilstede.

KY166(SEQ ID NO. 14) er en bredere konsensusprobe for å påvise myco-bakteriearter inklusive M. xenopi (SEQ ID NO.15). Sekvensen til KY166(SEQ ID NO.14), som sekvens til KY165(SEQ ID NO.13), korresponderer ikke til noen av ikke-mycobaktereartene. Proben er konstruert for å være like forskjellig ovenfor KY101(SEQ ID NO.3), KY102(SEQ ID NO.4), og den tilsvarende sekvensen i M. xenopi (SEQ ID NO.15) (Genbank registreringsnummer X52929, tilgjengelig via Intelligenetics) KY166(SEQ ID NO.14) adskiller seg fra KY101(SEQ ID NO.3), KY102(SEQ ID NO.4), og M. xenopi (SEQ ID NO.15) ved to baser hver. KY166(SEQ ID NO.14), hybridiserer effektivt til alle KY101(SEQ ID NO.3) og KY102(SEQ ID NO.4) spesifikke arter og M. xenopi (SEQ ID NO.15). I tillegg, hybridiserer ikke KY166(SEQ ID NO.14) til Corynebacterpseudodiftericum eller C. diftheria, to ikke-mycobakteriarter som ikke er nær beslektet til Mycobacterium. Den tilsvarende sekvensen i M. xenopi (SEQ ID NO.15) er inkludert i tabell 2.1 tabellen er feiltilpasningene i forhold til KY166(SEQ ID NO.14) understreket. Feiltilpasningene relativt til KY165(SEQ ID NO.13) er i nedre del.

Hvis mycobakterienukleinsyre er tilstede i prøven, kan artene hvorfra nukleinsyren stammer påvises ved hybridisering til et panel av species-spesifikke prober. Probene som benyttes i species-identifiseringstrinnene er vist i tabell 3.

Artene som har størst klinisk interesse er M. tuberculosis, M. kansasii, M. xenopi, M. intracellulare og M. avium. M. gordonae direkte er ikke vanligvis forbundet med sykdom, men opptrer ofte i menneskelige prøver. Derfor, forventes påvisning av mycobakterienukleinsyre ved hjelp av genus-spesifikke prober å være ofte på grunn av klinisk ikke-viktige M. gordonae. Eksempel 6 inneholder ytterligere informasjon med hensyn til spesifisiteten til de arts-spesifikke probene.

En viktig del av den foreliggende oppfinnelse er oppformering av et område i 16S rRNA-genet. De som praktiserer den foreliggende oppfinnelse skulle bemerke at, selv om polymerasekjedereaksjonen er den foretrukne amplifikasjonsfremgangsmåten, kan amplifikasjon av målsekvenser i en prøve utføres ved hjelp av en hvilken som helst kjent fremgangsmåte, slik som ligasekjedereaksjonen (LCR), transkripsjonsamplifikasjon, og selv-understøttet sekvensreplikasjon, hver av disse gir tilstrekkelig amplifikasjon slik at målsekvensen kan påvises ved hjelp av nukleinsyrehybridisering til en SSO-probe. Alternative fremgangsmåter som kan amplifisere proben til påvisbare nivåer kan benyttes, slik som QB-replikase-amplifikasjon. Betegnelse "probe" omfatter sekvensspesifikke oligo-nukleotidene som benyttes i de ovenfor nevnte fremgangsmåter; f.eks., de to eller flere oligonukleotidene som benyttes i LCR er "prober" for anvendelse innenfor den foreliggende oppfinnelsen skjønt LCR bare krever kobling av probene for å vise tilstedeværelse av sekvensen.

Skjønt PCR fremgangsmåten er velkjent i feltet (se US patent nr.

4 683 195; 4 683 202 og 4 965 188), er en del generell PCR informasjon omtalt nedenfor av hensyn til klarhet og full forståelse av oppfinnelsen til de som ikke er kjent med PCR fremgangsmåten.

For å amplifisere en målnukleinsekvens i en prøve ved hjelp av PCR, må sekvensen være tilgjengelig for komponentene i amplifikasjonssystemet. Generelt er denne tilgjengeligheten sikret ved å isolere nukleinsyre fra prøven. En rekke fremgangsmåter for å ekstrahere nukleinsyre fra biologiske prøver er kjent i feltet. F.eks., se de som er beskrevet av Higuchi et al., 1989, i PCR Technology (Erlich ed., Stockton Press, New York). Alternativt, hvis prøven er noenlunde lett å oppløse, må ikke nukleinsyren renses før amplifikasjon ved hjelp av PCR-fremgangsmåten, det vil si hvis prøven omfatter celler, spesielt perifere blod-lymfocytter eller aminiocytter, kan lysis og fordeling av de intracellulære komponentene utføres ute-lukkende ved å suspendere cellene i hypoton buffer.

Hver syklus av PCR omfatter adskillelse av nukleinsyredupleksen som dannes ved primerforlengelse. En foretrukket tilførelsesform i PCR-fremgangsmåten, trådseparering oppnådd ved å oppvarme reaksjonen til tilstrekkelig høy temperatur i en riktig tid for å denaturere dupleksen, men ikke for å gi en irreversibel denaturering av polymerasen (se US patent nr. 4 965 188). Typisk varmedenaturering omfatter temperaturer som varierer fra omtrent 80°C til 105°C for tider som varierer fra sekund til minutter. Imidlertid kan trådseparering utføres ved hjelp av enhver passende denatureringsfremgangsmåte inklusive fysiske og kjemisk eller enzymatiske midler. Trådseparering kan induseres av en helikase, f.eks., eller et enzym som er istand til å. vise helikaseaktivitet. F.eks., har enzymet RecA helikaseaktivitet i nærvær av ATP. Reaksjonsbetingelser som passer trådseparering ved hjelp av helikase er kjent i feltet (se Kuhn Hoffman-Berling, 1978, CSH Quantitative Biology 43:63 - 67; og Radding, 1982, Ann. Rev. Genetics 16:405-436).

Uansett hvordan trådseparering oppnås, med en gang trådene er separert, omfatter det neste trinnet i PCR-hybridisering av de adskilte trådene med primere som flankerer målsekvensen. Primerene blir så forlenget til å lage komplementære kopier av målkjedene. For vellykket PCR-amplifikasjon, blir primerene konstruert slik at den posisjonen som hver primer hybridiserer til er slik at når ekstensjons-produktet som syntetiseres fra en primer separeres fra templaten (komplement), vil denne tjene som templat for forlengelse av den andre primeren. Syklus som består av denaturering, hybridisering og forlengelse gjentas så mange ganger som nødvendig for å oppnå den ønskede mengde amplifisert nukleinsyre. Templat-avhengig forlengelse av primer i PCR katalyseres av en polymeriserings-forbindelse i nærvær av adekvate mengder av de fire deoksyribonukleosid trifosfatene (dATP, dGTP, dCTP og dTTP; dUTP som benyttes istedenfor eller i tillegg til dTTP hvis UNG steriliseringssystem beskrevet nedenfor anvendes) i et reaksjonsmedium som består av passende salter, metallioner, pH-buffersystem. Passende polymeriseringsforbindelser er enzymer som er kjent for å katalysere templat-avhengig DNA-syntese. Eksempler på polymeraser som passer for anvendelse med et DNA-templat omfatter E. coli DNA-polymerase I eller Klenow-fragmentet til enzymet, T4-DNA-polymerase, og Taq-polymerase, en varmestabil DNA-polymerase isolert fra Thermus aquaticus. Det sistnevnte enzymet benyttes i utstrakt grad i amplifikasjon og sekvensering av nukleinsyrer. Reaksjonsbetingelsene for å benytte Taq-polymerasen er kjent i feltet og er beskrevet i Gelfand, 1989, i PCR Technology, supra. Polymeriserings-forbindelser som passer for å syntetisere en komplementær kopi DNA (cDNA)-sekvens fra RNA-templatet er revers transkriptase (RT), slik som fugle myeloblastosisvirus RT, eller Thermus thermofilus DNA-polymerase, en termostabil DNA-polymerase med revers transkriptaseaktivitet. RNA-templatet blir typisk varmedegradert under det første denatureringstrinnet etter det første reverse transskripsjonstrinnet hvilket etterlater kun DNA-templatet for videre amplifikasjon.

Hvis 16S rRNA skal amplifiseres, blir et første revers transskripsjons (RT)-trinn utført for å lage en DNA-kopi (cDNA) av RNA. PCT-patentpublikasjon nr. WO91/09944, beskriver høy temperatur revers transskripsjon ved hjelp av en termostabil polymerase som også fungerer i PCR-amplifikasjon. Høy temperatur RT gir større primerspesifisitet og øket effektivitet. De samme primerene og polymerase kan være tilstrekkelig for både den reverse transskripsjon og PCR-amplifikasjonstrinnene, og reaksjonsbetingelsene blir optimalisert slik at begge reaksjonene opptrer uten å forandre reagensene. Thermus thermofilus DNA-polymerase, en termostabil DNA-polymerase som kan fungere som revers transkriptase, blir benyttet for alle primer ekstensjonstrinnene uansett templat. Begge fremgangs-måter kan utføres uten å måtte åpne røret for å endre eller tilsette reagenser, kun temperaturprofilen blir justert mellom den første syklus (RNA templat) og resten av amplifikasjonssyklusene (DNA-templat).

PCR-fremgangsmåten kan utføres på en trinnvis måte, hvor nye reagenser blir tilsatt etter hvert trinn, eller på en måte hvor alle reagensene tilsettes samtidig, eller på en delvis trinnvis måte, hvor nye eller forskjellige reagenser tilsettes etter et gitt antall trinn. F.eks., hvis trådseparering blir gjort ved hjelp av varme, og polymerasen er varmefølsom, så må polymerasen tilsettes etter hver runde trådseparering. Imidlertid, hvis f.eks., en helikase blir benyttet for denaturering, eller, hvis en termostabil polymerase blir benyttet for forlengelse, så kan alle reagensene bli tilsatt først, eller, alternativt, hvis molare forhold av reagenser er et resultat av reaksjonen, kan forbindelsene erstattes periodisk ettersom de uttømmes ved syntesereaksjonen.

De som er erfarne i feltet vil vite at PCR-prosessen vanligvis blir utført som en automatisk prosess med termostabilt enzym. I denne prosess, blir temperaturen i reaksjonen variert gjennom et denaturerende område, et primer-bindingsområde og et reaksjonsområde. En maskin som er spesielt tilpasset bruk ved hjelp av termostabilt enzym er kommersielt tilgjengelig fra Perkin Eimer.

De som er erfarne i feltet vil også være klar over problemet med forurensning av PCR av amplifisert nukleinsyre fra tidligere reaksjoner. Fremgangsmåte for å redusere dette problemet tillater den enzymatiske degradering av ethvert amplifisert DNA fra tidligere reaksjoner. PCR-amplifikajonen utføres i nærvær av dUTP isteden for dTTP. Det resulterende dobbelt-tråd uracilinneholdende produktet degraderes ved hjelp av uracil N-glykosylase (UNG), mens normalt thymin-inneholdende DNA ikke degraderes av UNG. Tilsetting av UNG til amplifikasjonsreaksjonsblandingen før amplifikasjonen startes, degraderer all uracilinneholdende DNA som kan tjene som et mål. Fordi den eneste kilden til uracilinneholdende DNA er det amplifiserte produktet i en tidligere reaksjon, steriliserer denne fremgangsmåten effektivt reaksjonsblandingen, derved elimineres forurensningsproblemer fra tidligere reaksjoner (overføring). UNG blir gjort midlertidig inaktivt ved hjelp av varme, slik at denatureringstrinnet i. amplifikasjonsfremgangsmåten også tjener til å inaktivere UNG. Nye amplifikasjonsprodukter, selv om de inneholder uracil, blir derfor dannet i et UNG-fritt miljø og blir ikke degradert.

Sekvensspesifikk probehybridisering er et viktig trinn i vellykket utførelse av de foreliggende fremgangsmåtene. De sekvensspesifikke oligonukleotidprobene i den foreliggende oppfinnelse hybridiserer spesifikt med et spesielt segment i mycobakteriegenomet og har de stabiliserende feiltilpasninger til sekvensene fra andre organismer når det gjelder genus-spesifikke prober, og andre mycobakterie-arter, når det gjelder arts-spesifikke prober. Stringente hybridiseringsbetingelser kan velges slik at probene hybridiserer spesifikt kun til nøyaktig komplementære sekvenser. Påvisning av det amplifiserte produktet benytter denne sekvens-spesifikke hybridisering for å sikre at kun det korrekt amplifiserte målet blir påvist, og derved reduseres sjansen for falsk positiv forårsaket av tilstedeværelsen av homologe sekvenser fra beslektede organismer.

Analysefremgangsmåtene for å påvise hybrider dannet mellom SSO-probene og nukelinsyresekvenser kan kreve at probene inneholder ytterligere egenskaper i tillegg til hybridiseringsregionen. I dot-blot-formatet, er f.eks. probene typisk merket. Hvis proben først blir immobilisert, som i den "reverse" dot-blot-analysen beskrevet nedenfor, kan proben også inneholde lange strekninger med poly-dT som kan bindes til et nylonunderlag ved hjelp av bestråling, en fremgangsmåte som er beskrevet i mer detalj i PCT-patentpublikasjon nr. 89/11548.

Oppfinnelsens prober kan syntetiseres og merkes ved bruk av fremgangsmåte beskrevet ovenfor for å syntetisere oligonukleotider. F.eks. kan proben merkes i 5'-enden med <32>p Ved å inkubere proben med <32p_>ATP og kinase. En passende ikke radioaktiv markør for SSO-probene er pepperrot peroksidase (HRP). Fremgangsmåte for å lage og påvise prober som inneholder denne markør beskrives i US patent nr. 4 914 210 og 4 962 02. For ytterligere informasjon når det gjelder bruk av slike merkede prober se US patent nr. 4 789 630; Saiki et al., 1988, N. Eng. J. Med. 319:537 - 541; og Bugawan et al., 1988, Bio/Technology 6:943-947. Anvendbare kromogener omfatter rød leukofarge og 3,3', 5,5' - tetrametylbenzidin (TMB). Helmuth, PCR Protocols, San Diego, California, Academic Press, Inc., 1990, pp. 119 -128, beskriver fremgangsmåte for ikke-isotop-påvisning av PCR-produkter.

Probene i oppfinnelsen kan benyttes for å bestemme nukleinsyresekvenser tilstede i en prøve ved å bestemme hvis probene binder til sekvensene tilstede i prøven. Passende analysefremgangsmåter for formålene med den foreliggende oppfinnelse når det gjelder å påvise hybrider dannet mellom probe og nukleinsyresekvenser i en prøve er kjent i feltet. F.eks., kan påvisningen utføres ved bruk av en dot-blot-analyse, som beskrevet i eksempel 4.1 dot-blot-analysen blir den ikke-merkede amplifiserte prøven bundet til et fast underlag, slik som en membran, membranen inkuberes med merket probe under passende hybridiseringsbetingelser, den ikke-hybridiserte proben fjernes ved vask og filteranalyseres for tilstedeværelse av bundet probe. Når mange prøver blir analysert ved få prober, slik som er tilfelle når probene blir undersøkt for tilstedeværelse mycobakterie-nukleinsyre ved bruk av genus-spesifikke prober er dot-blot-anlysen ganske nyttig.

En alternativ fremgangsmåte er anvendelig når et stort antall forskjellige prober skal benyttes. Denne fremgangsmåte er en "revers" dot-blot hvor den forøkte sekvensen inneholder en markør, og proben bindes til det faste underlaget. I denne analysen, blir de ikke-merkede probene bundet til membranet og inkubert med den merkede prøven under passende stringente hybridiseringsbetingelser. Ikke-hybridisert merket prøve blir så fjernet ved vask under passende stringente betingelser, og filteret monitoreres for tilstedeværelsen av bundne sekvenser. Fordi artsbestemmelse krever bruk av mange species-spesifikke prober for hver amplifiserte prøve, er den reverse dot-blot-analysen den foretrukne testanalyse for dette trinn.

Alternativt, kan det være ønskelig å benytte en påvisningsmetode som har en rekke prober hybridiseringsseter- eller brønner. F.eks., blir et fast underlag slik som en mikrotiterskål spesielt nyttig i stor skala klinisk anvendelse av den de foreliggende fremgangsmåtene. Fremgangsmåter for hybridisering (innfanging av PCR-amplifisert DNA eller fast underlag er kjent) i en utførelsesform av disse fremgangsmåter blir det amplifiserte mål-DNA merket, (f.eks. med biotin) under amplifisering i PCR-reaksjonen. Det merkede DNA blir spesifikt fanget ved hybridisering med PCR-produkt til en mål-spesifikk oligonukleotid fangeprobe som er blitt bundet til mikrotiter skålbrønnen. Det bundne produktet påvises passende ifølge hvilken markør som er benyttet f.eks. hvis biotin er benyttet som markør, blir avidin-HRP-komplekset tilsatt med enten (a) hydrogenperoksidsubstrat og O-fenylendiamin (OPD) kromogen eller (b) hydrogenperoksidsubstrat og tetra-metylenbenzidinkromogen (TMP). Et kolorimetrisk signal utvikles, hvilket tillater kvantitative bestemmelse av PCR-amplifisert DNA.

Slik det praktiseres i kliniske biomedisinske laboratorier, kan påvisnings-fremgangsmåter ved bruk av mikrotiter skålanalyser standardiseres for en lang rekke mål. Det kan være ønskelig å ha påvisningsprober som er mindre enn 25 nukleotider lange. Korte prober reduserer muligheten for kryssreaksjon og er spesielt nyttige i storskala-undersøkelsefremgangsmåter. Følgelig, beskriver eksempel 8 en foretrukket fremgangsmåte for å påvise Mycobacteirum- arter i et mikrotiterformat. En erfaren i feltet vil gjenkjenne at prober lenger enn 25 nukleotider er like passende for mikrotiterplate påvisningsprotokoller; imidlertid kan det være nødvendig å bestemme individuelt de passende hybridiserings og stringensbetingelsene for å sikre maksimal spesifisitet.

I et annet passende analysesystem blir en merket probe tilsatt under PCR-amplifikajonsprosessen. En hver probe som hybridiserer til mål-DNA til hvert syntesetrinn blir degradert av 5'- til 3'-eksonukleaseaktivitet av polymerasen som benyttes for å katalysere primerforlengelse. Degraderingsproduktet av proben blir så påvist. Således viser tilstedeværelsen av degraderingsproduktet at hybridiseringen mellom proben og mål-DNA fant sted.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter også analysesett, multicontainer-enheter som består av primerene og probene i oppfinnelsen. Et anvendelig analysesett kan inneholde SSO-prober for å påvise mycobakterienukleinsyre. I visse tilfeller, kan SSO-probene bindes til en passende støtte-membran. Analysesettet kan også inneholde primere for PCR forøkning. Andre valgfri komponenter i analysesettet, omfatter, f.eks., revers transkriptase eller polymerase, substratet nukleotidtrifosfater, hjelpemidler som benyttes for å merke (f.eks., et avdidin-enzymkonjugat og enzymsubstrat og kromogen hvis markøren er biotin) eller å påvise markøren, og de passende bufferene får PCR, og revers transskripsjon eller hybridiseringsreaksjoner. I tillegg til de ovenfor nevnte komponenter, kan analysesettet også inneholde instruksjoner for å utføre forsterkning og påvisnings-fremgangsmåter i oppfinnelsen.

I en foretrukket utførelsesform ved oppfinnelsen kan analysesett for å påvirke mycobakterier også omfatte positive og negative kontroller. Spesielt omfatter en positiv kontroll en nukleinsyresekvens som kan amplifiseres ved bruk av de samme primerpar benyttet for å forøke mycobakterienukleinsyrer i en prøve. Fremgangsmåte for å benytte en positiv kontroll er kjent, heri både målet som kan eller ikke kan være tilstede og den positive kontroll benytter samme primerpar. Det foretrekkes at den positive kontroll konstrueres slik at produkt-DNA er av en passe størrelse som lett kan skilles fra størrelsen av målet.

Som en annen del, beskrives en positiv kontroll som er istand til å hybridisere til prober for å påvise genspesifikke mycobakteriumprober såvel som arts-spesifikke mycobakteriumprober. Eksempel 9 beskriver konstruksjonen av en positiv kontrollnukleinsyre.

Som beskrevet her, kan det være ønskelig å benytte et annet amplifikasjonsmål, spesielt for å skille mellom uoverstemmelse i PCR og kultur-resultater. Gitt det som den foreliggende oppfinnelse beskriver for å inkludere en intern positiv kontrollvektor, vil en med vanlig dyktighet i feltet lett kunne forstå at ytterligere interne positive kontroller kunne konstrueres. F.eks. kunne en positiv kontroll inneholde primersete både for det primære (16S rRNA) og det sekundære mål (f.eks. 65 kDa proteingen) til å hybridisere og deretter amplifisere en bestemt del av positivt kontroll-DNA.

Eksemplet på den foreliggende oppfinnelse vist nedenfor er bare for illustrasjonsformål og begrenser ikke omfanget av oppfinnelsen.

Eksempel 1

Prøvetillaging

Nukleinsyrer isoleres fra spyttprøver ved bruk av IsoQuick^<M> system som er kommersielt tilgjengelig fra MicroProbe. Omkring 10 ml av spytt blir fortynnet, desinfisert, bunnfelt ved sentrifugering og resuspendert ved omkring 1 ml buffer med BSA. Fra denne prøven, blir 200 til 500 pl sentrifugert for å bunnfelle bakteriene. Bunnfallene blir resuspendert i 100 pl prøve A, så lysert med 100 pl lysis reagens 1. Lysatene blir så ekstrahert med 7 volumer reagens 2 og 4 volumer av reagens 3 (reagensene 1, 2 og 3, sammen med prøver fra, forsynes med IsoQuick<TM> system). Prøven blir sentrifugert og deretter, blir 1/3 volum av 10M NH4AC tilsatt vannfasen og DNA bunnfelt med et likt volum isopropanol. Det bunnfelte DNA vaskes med 70% EtOH, lufttørres, og resuspenderes i 100ul TE, pH 8,0. Et 50 pl volum av hvert DNA-preparat benyttes i amplifikasjonsreaksjonen.

Eksempel 2

Amplifikasjon av Mvcobacteirum - DN / k

En utgangsreaksjonsblanding er laget slik at hver blanding inneholder de følgende reagensene 25 pmol av hver primer, 10 nmol av hver dNTP, PCR buffer i 2X (10X buffer = 500 mM Tris-HCI, pH 8,9, 20 mM MgCl2), 3 enheter Taq polymerase, 2 enheter UNG, og H2O opptil 50 pl reaksjonsblanding pr reaksjon. Denne utgangsblanding blir overlagt med 50 pl minearolje, DNA-prøven tilsatt reaksjonsblandingen under overlaget. Hvis nødvendig, blir H2O tilsatt for å lage totalt reaksjonsvolum på 100 ul.

DNA blir amplifisert i en Perkin Eimer termal sykler. Den termale sykler blir programmert til å gå gjennom sykler med denaturering, primerbinding, primerforlengelse; to sykler på 98°C, 62°C og 72°C i et minutt hver, etterfulgt av 35 sykler på 94°C, 62°C og 72°C i et minutt hver. Perkin Eimer termal sykler programmeres til å ta opp prøvene ved 72°C på ubestemt tid etter de to siste syklusene for å sikre at den endelige forlengelse er komplett og for å holde UNG enzymet inaktivt, hvis UNG steriliseringssystemet blir benyttet. Forøknings-produktene kan så analyseres ved gelelektroforese og/eller dot-blot-hybridisering. Hvis analyse ved hjelp av gelelektroforese utføres, blir 10 pl av 10 x prøvebuffer (0,25% xylen cyanol, 0,25% bromofenol blot, 25% Ficoll) tilsatt og mineralolje ekstrahert, og Taq-polymerase inaktivert, med 100 pl kloroform.

Eksempel 3

Dotblot- analvse

Den første undersøkelse av den amplifiserte prøven påviser tilstede-værelsen av Mycobacterium nukleinsyre. I dot-blot-formatet blir en liten del av amplifisert DNA denaturert, påsatt nylonfilter, og immobilisert som beskrevet nedenfor. Filteret blir så senket ned i en probeløsning for å tillate hybridisering til en av de merkede probene. Hver av probene kan merkes radioaktivt, men prober som konjugeres kovalent til pepperrotperoksidase (HRP) kan også benyttes til å gi mulighet for ikke-isotop påvisning i nærvær av et kromogent eller kjemiluminiscent substrat. Immobilisert mål-DNA hybridiseres til en blanding av to genus-spesifikke prober KY101 og KY102. Fordi antallet prøver som undersøkes forventes og sterkt overgå antallet prober (en blanding av to prober), er dot-blot-analysen mest passende for denne første undersøkelse. Et stort antall forskjellige prøver kan hybridiseres til bestemte områder i et enkelt fast underlag og inkuberes med de merkede probene samtidig ved å senke underlaget i en probeløsning.

Amplifiseringen blir utført som i eksempel 2. PCR-produktet blir så denaturert ved hjelp av alkalibehandling. Til 5 pl PCR produkt tilsettes 5 pl 0,5 M EDTA, pH 8,0, 8 pl 5 N NaOH, og 82 pl H2O. Blandingen tillates å stå i romtemperatur i 10 minutter for å komplettere denaturering.

BioDyne™ B-nylonfiltre (Pall Corp., Glen Cove, NY) behandles ved nedsenkning i H2O i 5 til 10 minutter og videre rensing i 200 pl H2O og dot-blot-apparatet (Bio-Dot™ ^ra B'° Rad, Richmond, CA) settes opp. Etter denaturering, blir 100 pl fra prøveblandingen påsatt under vakuum til nylonmembranen, ved bruk av dot-blot-apparatet. Hver brønn blir så renset med 200 pl 0,4N NaOH, så renset kort med 2 x SSC, og lufttørket til ikke noe væske er tilbake. DNA immobiliseres og kryssbindes til et nylonfilter ved hjelp av ultrafiolett stråling ved bruk av to

1200mJ/cm<2> med Stratalinker™ (Stratagene, La Jolla, CA) UV-lysboks (som "autokryssbinding" innstilling).

Filteret blir "prehybridisert" ved senking ned i hybridiseringsbuffer (0,5 x SSC, 5 x Denhardts løsning, 0,1% SDS, 50 pg/ml sillesperme DNA) i poser som lukkes ved varme ved 60°C (luftristing) i minst 30 minutter. Hvis radioaktive merkede prober benyttes blir bufferen så erstattet med en lik mengde av samme løsning som inneholder 1 x 10^ cpm probe, og filteret tillates å hybridisere mellom 2 timer og over natt ved 60°C.

Etter hybridisering, blir filtrene vasket tre ganger i 2X SSC/0,1% SDS, to ganger i 20 minutter i romtempereratur, og så en gang i 20 minutter med høy stringenstemperatur på 71 °C i et ristevannbad. Filtrene blir så blottet tørre, pakket inn i plast, og eksponert til røntgenfilm ved -70°C med en eller to forsterknings-skjermer.

En alternativ metode for synliggjøring er å hybridisere med pepperrotper-oksydase konjugert oligonukleotidprober, laget som beskrevet av (Levenson og Chang, 1989 i PCR Protocols: A Guide of Methods and Applications, (Innis et al., eds., Academic Press. San Diego) sidene 92 -112, og Saiki et al., 1988, N. Eng. J. Med. 319:537 - 541. Hybridisering blir utført med 2 pmol HRP-SSO probe pr 5 ml hybridiseringsløsnig.

Etter vasking, blir filtre som skal utvikles med et kromogent fargesubstrat renset i 100 mM natriumsitrat, pH 5,0, så plassert i 100 mM natriumsitrat, pH 5,0, som inneholder 0,1 mg/ml av 3,3', 5,5'-tetrametylbenzidin pr milliliter (Fluka) og 0,0015% hydrogenperoksid, og inkubert ved hjelp av svak risting i 10 - 30 minutter i romtemperatur. Utviklede filtre renses i vann og fotograferes øyeblikkelig. TMB påvisningssystemet lages og benyttes i det vesentlige som beskrevet i AmpliType® DQalpha DNA type analysesett utviklet og laget av Hoffman-La Roche og er tilgjengelig gjennom Perkin Eimer. I en annen utførelsesform, blir filtrene utviklet med kjemiluminescens påvisningssystem (ECL; Amersham, Arlington Heights, IL). Filtrene blir renset i PBS i 5 minutter og plassert i ECL løsning i 1 minutt med svak omristing. Filtrene blir så eksponert for røntgenfilm ved romtemperatur i 1 til 5 minutter.

Eksempel 4

Revers dot- blot- analvse

Artsidentifisering krever at hver prøve inkuberes med en rekke arts-spesifikke prober; identiteten vises ved hvilken probe som binder til prøve DNA. Fordi hver prøve inkuberes med mange prober, er den reverse dot-blot-analysen mest passende. Probene bindes til bestemte områder på en membran og så blir hele membranen senket ned i en løsning som inneholder det amplifiseerte mål-DNA for å tillate hybridisering til membranbundne prober. Revers dot-blot-fremgangsmåten er beskrevet i den samtidig innsendte søknad serie nr. 197 00 og 347 95; i Saiki et al., 1989, Proe. Nati. Acad. Sei. 86.6230 - 6234; og i AmpliType® DQalpaha DNA analysesett utviklet og laget av Hoffman-La Roche og tilgjengelig gjennom Perkin Eimer. Amplifiseringsprimerne er biotinylert, som beskrevet i Levenson og Chang, 1989, supera, slik at ethvert amplifisert DNA som er hybridisert i membranbundne prober, lett kan påvises.

I en utførelsesform, blir påvisning utført ved å reagere streptavidin konjugert pepperrotsperoksidase (SA-HRP) med ethvert biotinylert (gjennom primerene), amplifisert DNA hybridisert til den membranbundne proben. HRP blir således bundet, gjennom SA-biotinreaksjon til det amplifiserte DNA kan benyttes for å lage et signal ved hjelp av en rekke velkjente hjelpemidler, slik som utviklingen av et fargekompleks, f.eks. ved oksidasjon av tetrametylbenzidin (se US patent nr. 4 789 630).

Skjønt proben kan fikseres til membranen ved ulike hjelpemidler, omfatter en foretrukket fremgangsmåte, "endemerking" av en oligonukleotidprobes hybridiseringsområde med en meget lenger sekvens av poly-dT. Den resulterende dT "hale" kan så reageres med amingrupper for nylonmembran for å binde proben kovalent til membranen. Denne reaksjon kan underlettes ved UV-bestråling.

Terminal deoksyribonukleotidyltransferase (TdT, Ratliff Biochemicals; for reaksjonene nedenfor antar en konsentrasjon på 120 enheter/pl, som har 100 pmol/pl) kan benyttes for å lage poly-dT haleprobe, skjønt en kan også syntetisere den endemerkede proben på en kommersiell tilgjengelig DNA-syntesemaskin. Når en benytter en DNA syntesemaskin for å gjøre den endemerkede proben, bør en imidlertid plassere halen på 5-enden av proben, slik at ikke-ønsketfortidlig kjede-avslutning opptrer hovedsaklig i haleregionen.

TdT-reaksjoner bør utføres i et volum på 100 pl som inneholder 1 x TdT salter, 200 pmol oligonukleotid, 800 pM DTT, og 60 enheter TdT. 10 x TdT salter er 1000 mM K-cacodylat, 10 mM CoCtø, 2 mM ditiotreitol, 250 mM Tris-CI, pH 7,6

og lages som beskrevet av Roychoudhury og Wu, Meth. Encymol. 65:43 - 62, inntatt her som referanse. En 10 x stamløsning av 8 mM dTTP kan lages (nøytralisert til pH 7 med NaOH) for letthets skyld.

TdT-reaksjonen bør utføres ved 37°C i to timer og så stoppes ved tilsett-ingen av 100 pl av 10 mM EDTA, pH 8. Den endelige konsentrasjonen av endemerket oligonukleotid er 1 pM (1pmol/pl), og lengden av homopolymerhalen er omtrent 400 rester. Halelengden kan forandres ved å justere det molare forholdet av dTTP til oligonukleotid. De endemerkede probene kan lagres ved -20° C til de skal benyttes.

Nylonmembranen som foretrekkes for den revers dot-blot-analysen er Biodyne™ B nylonmembran, 0,45 mikron porestrørrelse, laget av Pall og også markedsført av ICN som BioTrans^<M> nylonmembranen. Probene kan plasseres på membranen med letthet med Bio-Dot^<M> apparat som lages av BioRad. Hver probe påsettes et enkeltstående adskilt sted på membranen. Omtrent 2-10 pmol er endemerket probe blandet på forhånd med 50 - 100 pl TE-buffer før påsetting på dot-blot-apparatet. Etter dot-blotting blir membranen plassert kort på filterpapir for å trekke vekk overskuddsvæske. Membranen blir så plassert på innsiden av en UV-lyseboks, slik som Stratalinker^<M> lyseboks laget av Stratagene, og belyst med 50 - 60 millijoules/cm<2> med fluks på 254 nm for å feste den endemerkede proben til nylonmembranen. Etter en kort vask (i omtrent 15 minutter hybridiserings-løsning) for å fjerne ikke-bunden probe, blir membranen klar for hybridisering med biotinylert PCR-produkt.

Amplifiserte PCR-produkter blir denaturert ved å varme opp til 95°C i 3 til 10 minutter; og 40 pl av det denaturerte PCR-produktet blir tilsatt hvert probepanel ved hybridisering. Hybridisering utføres ved 57°C i 20 minutter i et ristevannbad i en hybri-diseringsbuffer som består av 0,5 x SSC, 0,25% SDS, og 5 x Denhards-løsning. Hybridiseringsbufferen erstattes med 3 ml av en løsning som består av 25 pl SA-HRP, kommersielt tilgjengelig fra Perkin Eimer, i en 3,1 ml hybridiseringsbuffer, og inkubert i 20 minutter i 57°C i et ristevannbad.

Vask utføres i en vaskebuffer 2 x SSC og 0,1% SDS. Etter en kort vask av membranen i 10 ml vaskebuffer, blir en 12 minutt stringent vasking i 10 ml buffer utført ved 57°C. En annen 5 minutter romtemperaturvask utføres så, etterfulgt av 5 vask i 10 ml i 0,1 M natriumacitrat, pH 5,0.

Kromogen binding blir utført i 5 ml av kromogenløsning som består av 5 ml av 0,1 M natriumacetat, 5 pl 3% hydrogenperoksid, og 0,25 ml av kromogen (TMB fra Perkin Eimer) i 25 - 30 minutter ved romtemperatur. Tre 10 minutters vask i destillert vann blir utført i romtemperatur. En ettervask på 1 x PBS i romtemperatur i 30 minutter kan øke signalkvaliteten. I løpet av trinnet hvor kromogenet er tilstede, bør membranen beskyttes mot lys ved hjelp av en aluminiumsfolie-tildekning. Den utviklede membranen bør fotograferes for å ha en varig dokumentasjon.

Eksempel 5

Myco6acfene- DNA- påvisninq

Påvisning av mycobakteriell DNA utføres ved amplifikasjon med biotinylerte former av genus-spesifikke primere KY18(SEQ ID NO.1) og KY75(SEQ ID NO.2), ved bruk av protokoll beskrevet i eksempel 2, ovenfor, etterfulgt av hybridisering til genus-spesifikke prober KY101(SEQ ID NO.3) og KY102(SEQ ID NO.4), ved bruk av dot-blot-analysen beskrevet i eksempel 3, ovenfor. Sekvensene i de hybridiserende områdene til oppstrømsprimeren KY18(SEQ ID NO.1) og nedstrømsprimeren KY75(SEQ ID NO.2) er gitt i tabell 1, ovenfor. Sekvensene for de hybridiserende områdene i de genus-spesifikke probene KY101(SEQ ID NO.3) og KY102(SEQ ID NO.4) er gitt i tabell 2 ovenfor.

De genus-spesifikke primerene KY18(SEQ ID NO.1) og KY75(SEQ ID NO.2) ble benyttet i polymerasekjedereaksjon (PCR) amplifikasjoner for å lage nukleinsyre fra 15 Mycobacteirum- arter. Resultatene er vist i tabell 4. Som forventet, amplifiserte KY18 (SEQ ID N0.1)/KY75(SEQ ID NO.2) DNA fra alle Mycobacfen'u/77-artene bortsett fra M. simiae. Amplifisering av M. simiae eller M. cfr/fae-DNA var ikke ventet fordi KY75(SEQ ID NO.2) adskiller seg i fem av de 3-terminale basene fra M. simiae og to av de 3-terminale basene fra M. chitae. Imidlertid er påvisning ikke klinisk viktig fordi sammenhengen mellom M. simiae med menneskelig sykdom er sjelden blitt rapportert. Med unntagelse av DNA fra M. xenopi og M. terrae, ble all amplifisert Mycobacterium- DHA hybridisert påvist ved hjelp av hybridisering med de genus-spesifikke probene KY101(SEQ ID NO.3) og KY102(SEQ ID NO.4)

Spesifisiteten til disse primerne ble undersøkt ved å forøke DNA fra 22 forskjellige ikke-mycobakteriearter. Amplifikasjonsprodukter var et resultat kun fra DNA som stammer fra Corynebacter difteria og Corynebacterxerosis, Nisseria sicca og Propionibacterium acnes. Imidlertid, hybridiserte ikke disse amplifikasjonsproduktene med de genus-spesifikke probene slik at ingen falske positive opptrådte i resultatene. Organismene undersøkt er oppstilt i tabell 5 nedenfor.

Eksempel 6

Artsidentifikasjon

Når mycobakterienukleinsyre er påvist i en klinisk prøve, kan artene som nukleinsyren stamme fra bestemmes ved hjelp av hybridiseringsmønstret med de arts-spesifikke probene ved bruk av revers dot-blot-analyse i eksempel 4. Artene av klinisk interesse som skal påvises av det foreliggende systemet er M. avium, M. intracellulare, M. kansasii og M. tuberculosis. I tillegg, er påvisning av en M. gordonae ønskelig fordi organismen er ofte funnet i kliniske prøver.

Figur 1 viser resultatene av en undersøkelse med hensyn til spesifisiteten til arts-spesifikke prober valgt fra probene opplistet i tabell 3. Sekvensen til det hybridiserende område i hver probe, sammen med den forventede spesifisiteten, som er vist i tabell 3. Amplifiserte produkter fra renset DNA fra tretten forskjellige a rter av Mycobacterium ble benyttet for å undersøke spesifisiteten til både de genus-spesifikke og de arts-spesifikke probene. For hver art, ble 1 pg av DNA renset fra dyrkede bakterie (likt med 300 bakteriegenomet). Amplifisert som eksempel 2 ved hjelp av biotinylerte primere. Påvisning av probehybridisering ble utført ved bruk av revers dot-blot-analysen i eksempel 4. Som positiv kontroll for tilstede-værelsen av amplifisert DNA, ble genus-spesifikke prober inkludert i undersøkelsen sammen med de arts-spesifikke probene.

Eksempel 7

Am<p>lifiserin<g> av M<y>cobakterie 16S rRNA

16S rRNA kan amplifiseres ved å først lage cDNA ved revers transkripsjon og amplifisering av cDNAet. De samme primerne benyttes som i eksempel 2 ovenfor. I dette eksempel blir både høytemperatur reverstranskripsjon og PCR-iamplifisering utført med den termostabile Tth-polymerasen.

Den reverse transkripsjon blir utfør i et volum på 20 pl som inneholder de følgende komponentene 8 pl htøO, 2 pl 10 x RT reaksjonsbuffer (100 mM Tris-HCI, pH 8,3 og 900 mM KCI), 2 pl av 10 mM MnCtø, 2 pl dNTP løsning (2 mM hver av dATP, dCTP, dGTP, og dTTP i H2O, pH 7,0) 2 pl av "nedstrøms^primer (7,5 mM H2O) 2 pl 0,18 pM Tth-<p>olvmerase i 1 x løsningsbuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 100 mM KCL, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,2% Tween 20(Pierce Surfactants), 50% (volum/volum) glyserol) og 2 pl templat RNA løsning (<250 ng i 10 mM Tris-HCI og 1 mM EDTA). Alle løsningene som ikke inneholdt Tris blir behandlet med dietylpyrokarbonat (DEPC) for å fjerne all forurensende ribonuklease som beskrevet på side 190 i Maniatis et al,. 1982, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (Cold Springs Harbor, New York). Revers transkripsjon blir utført ved 72°C i 5 minutter i termosykler. Reaksjonen stoppes ved å avkjøle reaksjonen til 4°C på is.

PCR-amplifikasjonen utføres med de følgende reagenser tilsatt: 2 ul av den gjenværende primer, (7,5 mM i H2O), 2 pl dNTP løsning (10 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP i H2O, pH 7,0), 8 pl av 10 x PCR-reaksjonsbuffer (100 mM Tris-HCI, pH 8,3, 1 mM KCI, 18,75 mM MgCI2, 7,5 mM EDTA, og 50% (volum/- volum) glycerol), og 68 pl DEPC behandlet H2O. Nukleinsyren blir amplifisert i en Perkin Eimer sykler med den samme termale profil som i eksempel 2. Det amplifiserte produktet blir analysert som i tidligere eksempler.

Eksempel 8

Mikrotiterskålanalvse for påvisningen av Mvcobacterium

I denne utførelsesform av oppfinnelsen, blir proben bundet til en brønn i en mikrotiterskål. Det amplifiserte mål-DNA blir hybridisert til den bundne proben som beskrevet ovenfor. Som i det tidligere eksemplet, blir amplifikasjonsprimerne biotinylert for å tillate påvisning av amplifisert DNA som hybridiserer til de bundne probene.

De ønskede probene, konjugert til BSA, ble først tillatt absorbert til plastoverflaten i de individuelle brønnene. Brønnen ble så blokkert med protein, slik som bovint serumalbumin. Fortrinnsvis, benyttes 96-brønnskåler tilgjenglig fra Corning. Når amplifikasjonen er ferdig, blir PCR-rørene fjernet fra termosykleren (Perkin Eimer). 100 mikroliter av denatureringsløsning ble tilsatt til hvert PCR-rør. En ny pipettetupp ble benyttet for hvert rør. I en utførelsesform, kan påvisning ikke utføres øyeblikkelig, i det tilfellet, ble PCR-rørene lagret over natt ved 2°C - 8°C. Denaturerte amplifikasjonsreaksjoner ble viskøse ved lagring ved 2°C - 8°C. Rørene ble varmet kort opp til 25°C - 30°C til før rørene ble åpnet for å underlette pipettering. Det passende antall av 8 brønner mikrotiterskål "strips" (minimum 2 "strips") ble fjernet og satt inn i mikrotiterskålerammen. Ett hundre mikroliter hybridiseringsbuffer ble pipettert i hver brønn på mikrotiterplaten.

Denatureringsløsningen inneholder 0,4 M NaOH; 80 mM EDTA og 0,005% tymol blå. Hybridisering/nøytraliseringsbuffer inneholder: 3 M NaSCN; 80 mM NaH 2PO4; 10 mM NaH2P04; og 0,125% Tween 20. Før bruk blir pH kontrollert til å være 5,0 +/- 0,2.

Ved bruk av tiltettede spisser med en multikanal pipetter, ble 25 pl av den denaturerte amplifikasjonsreaksjonen fra hvert PCR-rør i skålen pipettert over til den korresponderende brønn-posisjon i mikrotiterskålen. Skålen blir dekket med mikrotiterplateskål og forsiktig banket på siden 10 til 15 ganger. Brønnen hvor den riktige reagenspipettering er blitt gjort vil bli lys gul i farge. Hvis ingen eller bare en enkel forandring i blå farge bemerkes, har overskuddsamplikon blitt tilsatt. Undersøkelsen blir fortsatt som positiv OD-verdier vil øke, men negative OD verdier blir ikke påvirket. Skålen inkuberes i 60 minutter ved 37°C. Etter den første hybridiseringen ved 37°C i en time, ble hybridisering/nøytraliseringbufferen fjernet og erstattet med samme buffer og sålen inkubert i ytterligere 15 minutter ved 37°

C.

Etter inkubasjon ble skålen vasket 5 ganger med vaskeløsning. Vasking av skålen kan utføres manuelt eller med en automatisk mikrotiterskålvask som var programmert. For vasking, blir en 1 x PCR vaskebuffer benyttet. En 10 x konsentrat av PCR-vaskebuffer laget som følger: 9,95 g pr liter natriumfosfat i basis; 4,41 g pr liter natriumfosfat (monobasis); 3,722 g pr. liter EDTA; 87,66 g pr liter natriumklorid; 13,7 g pr liter Tween 20; og 10 g pr liter Pro Clin 300 (Rohm og Haas, Philadelphia, PA). pH i løsningen justeres med fosforsyre (pH 6,5 - 7,1 som foretrukket).

For manuell vasking ble innholdet i skålen tømt og tappet tørr. Tre hundre mikroliter vaskeløsning ble tilsatt hver brønn i skålen som blir undersøkt, og skålen blir tillatt å tørke i 15 - 30 sekunder. Skålen blir så tømt og tappet tørr. Denne vaskeprosess ble gjentatt fire ytterligere ganger.

Med en automatisk mikroskålvasker, ble følgende fremgangsmåte benyttet. Innholdene i brønnene ble fjernet. Vaskingen ble programmert til å tilsette 350 mikroliter av arbeidsvaske-løsning til hver brønn i skålen som testes og inkubert i 30 sekunder og fjernet. Trinnet ble gjentatt fire ytterligere ganger. Skålen ble så tappet tørr.

Ett hundre mikroliter konjugat ble tilsatt i hver brønn i skålen som ble testet. Avidin-HRP konjugatet blir laget som følger. Fortynningen inneholder 0,1 molar; 0,25% Emulsit 25(DKS International, Inc.; Tokyo, Japan); 1,0% Kathon CG (Rohm og Haas, Philadelphia, PA); 0,1%fenol; 1,0% bovin-gammaglobulin. Løsningen ble justert til pH 7,3 med konstruert HCI. Til dette fortynningsmiddel ble 10nM konjugert avidin (Vector Labs, Burlingam, CA) tilsatt. Skålen ble så dekket 50 minutter ved 37°C og igjen vasket som beskrevet ovenfor. Arbeidssubstratet ble laget ved å blande 2,0 ml substrat A og 0,5 ml av substrat B for hver multippel på 8 brønn mikrotiterplate "strips" (16 prøver). Substrat A inneholder 3 mM hydrogenperoksid, 6,5 mM citrat og 0,1% Kathon CG. Substrat B inneholder 4,2 mM 3,3', 5,5' tetrametylbenzidin og 40% dimetylformamid. Arbeidssubstratet blir laget ikke mer enn 3 timer før anvendelse og holdt vekk fra direkte sollys.

Ett hundre mikroliter av arbeidssubstrat (substrat A og B blanding) ble tilsatt hver brønn i skålen som ble testet. Skålen ble så dekket og inkubert i mørket i 10 minutter ved romtemperatur (20°C - 25°C). Ett hundre mikroliter av stopp-reagens (5% H2SO4) ble tilsatt i hver brønn som ble testet. Absorpsjon av hver brønn ved 450 nM ble lest i løpet av 1 time etter tilsetting av stoppreagens. Absorbsjons-verdien ble registrert for prøver og kontroll.

Eksempel 9

Konstruksjon av en positiv kontrollvektor anvendelig i fremgangsmåte

for amplifikasio og påvisning av Mycopacferitvm- nukleinsvre Oligonukleotider som inneholder de arts-spesifikke probebindingssekvens-ene så vel som deres komplementære (KY178[SEQ ID NO.24] - KY181[SEQ ID N0.27] under) ble syntetisert. (Disse oligoene inneholder gjenkjennelsessete for restriksjonsenzymer ved begge endene for å underlette kloning). Ett mikrogram hver av KY178(SEQ ID NO.24) og KY179(SEQ ID N0.25) eller KY180(SEQ ID NO.26) og KY181(SEQ ID No.27) ble kombinert og oppvarmet i 5 minutter ved 98 °C så inkubert i en time ved 75°C for å tillate binding av de komblementære kjedene. Bundne produkter ble adskilt fra rest enkelt-kjedet oligoer ved hjelp av elektroforese gjennom 3% Nusieve (FMC produkter)/1% agarose-gel. Båndet på dobbelt-kjedeproduktet blir kuttet ut og DNA eluert. DNA-fragmentene blir så kuttet med de rette restriksjonsenzymene og bundet til hverandre. Bindingsproduktene blir isolert fra Nusieve/agarosegel som ovenfor.

Den mottagende vektoren ble laget. Den mottagende vektoren var et plasmid som hadde et fragment av det M. tb 16S rRNA-genet som inneholdt primer- og probe-bindingsseter var blitt innsatt og var laget som følger. 50 pikogram M. tuberculosis- DNA amplifisert ved bruk av primerne KY70(SEQ ID N0.28) og CR01(SEQ ID N0.29) i nærvær av 50 pikomol CR01(SEQ ID N0.29), 80 pmol KY70(SEQ ID N0.28), 20 nmol av hver dNTP, 2,5 enheter Taq-polymerase, og 1 x PCR buffer (50 mM TRIS-HCI, pH 8,9; 50 mM KCI; 1,5 mM MgCl2) i et totalt reaksjonsvolum på 100 mikroliter. Termale syklings-betingelser er beskrevet i eksempel 2. Amplifikasjonssproduktene ble ekstrahert med 100 mikroliter kloroform.

Amplifikasjonssproduktene og vektor pBS(+)(Stratagene) ble begge spaltet med restriksjons endonuklease Pst I, ekstrahert en gang med fenol/kloroform og så utfelt med etanol. (CR01 inneholder Pst l-sete med 5-enden og amplifikasjons-produktet inneholder et internt Pst l-sete nedstrøms for bindingssete for mycobakterie-spesifikke primere og prober). Pst I kuttet vektor ble defosforylert ved behandling med kalvetarm-fosfataser (Maniatis), ekstrahert med fenol/kloroform, og utfelt med etanol. De fremstilte amplifikasjonsprodukter ble bundet til vektoren under standardbetingelser (Maniatis).

Det ligerte DNA ble transformert inn i kompetent E. coli. Kolonier som hadde plasmider som inneholder det ønskede innskuddet ble identifisert ved koloni blot-hybridisering til den tb-spesifikke proben KY21(SEQ ID NO.5) som følger. Bakterie ble sådd ut på cellulosefilterskål overlagt med nærings agarskål og tillatt å vokse over natt. Filtre ble fjernet og deretter overlagt i rekkefølge (bakterieside opp) på 3 mM filterpapir bløtet i 10% SDS (3 minutter), 0,5 M NaOH/1,5 M NaCI (5 minutter), 0,5 M Tris-HCI, pH 8/1,5 M NaCI (5 minut-ter), og 2 x SSC (5 minutter). Filtrene ble lufttørket. DNA ble kryssbundet på filtret ved UV bestråling og så hybridisert til KY21(SEQ ID NO.5) og vasket som beskrevet i eksempel 3.

Oligonukleotidsekvenser

Denne vektor, betegnet pKY5, ble kuttet med restriksjons-enzymene Sty I og Xho I for å fjerne et 174 bp-fragment som inneholder det arts-spesifikke probebindingssetet, men lar være intakt primeren og de genus-spesifikke probebindingssetene. Det kuttede plasmidet ble separert fra 174 bp-fragmentet ved elektroforese gjennom 1,5% lavsmeltende temperatur agarosegel. Båndet som inneholdt vektoren ble kuttet fra gelen og renset ved kromatografi NACS-søyle (Bethsda Research Lab) og etanolutfelt. Det innskutte fragment som inneholdt gjenkjennelsessetene for de arts-spesifikke probene ble bundet til den fremstilte vektoren. De sammenkoblede produktene blir transformert inn i kompetente vertsbakterier.

Transformanter som inneholder de passende innskuddene blir identifisert ved hjelp av PCR-amplifikasjon. Transformerte bakteriekolonier blir resuspendert til 0,5 ml TE-buffer. 50 mikroliter av bakteriesuspensjon blir plassert i PCR-reaksjonsrør som inneholder komponenter som er nødvendig for amplifikasjon av mycobakterie-DNA og amplifikasjonene blir utført som beskrevet ovenfor. Bakterier som har plasmider som inneholder det ønskede innskuddet vil lage PCR-produkter på 640 bp ved bruk av primerpar KY18(SEQ ID NO.1) og KY75(SEQ ID NO.2). Forøkning av bakterier som inneholder det opprinnelige pKY5 plasmidet lager PCR-produkter på 584 bp.

De amplifiserte produktene som således lages (amplikoner) kan bli hybridisert i mycobakterie genus-spesifikke og art-spesifikke prober ved revers dot-blot-hybridisering som beskrevet i eksempel 4 for å bekrefte tilstedeværelsen av hybridiserings-setene for de genus-spesifikke og arts-spesifikke probene beskrevet i eksemplene. Positive kontrollplasmider kan lages på samme måte for hybridisering til genusprober og en utvalgt undergruppe av arts-spesifikke prober. I et analysesettformat kan det f.eks være ønskelig å inkludere et positivt kontoll-plasmid for å adskille tuberkulose fra andre arter i tillegg til å inkludere et positivt kontrollplasmid som inneholder sekvensene KY178-KY181(SEQ ID NOS.24 - 27).

Oli<q>onukleotidsekvenser

Eksempel 10

Anvendelsen av kontrollplasmid

En anvendelse av det positive kontrollplasmidet er å overvåke effektiviteten av amplifikasjon i ethvert eksperiment. Ved slike anvendelser, blir seriefortynn-inger av det positive kontrollplasmidet gjort. Kjente kopitall av plasmidet kan benyttes som templater i forøkningsreaksjonene. Det laveste tallet av plasmid-DNA-molekyler som kan amplifiseres, gir et mål på effektiviteten til amplifikasjonsreaksjonen. En annen anvendelse av de positive kontrollplasmid er å lage produkter som kan benyttes for å overvåke effektiviteten med hvilke de slekts- og arts-spesifikke prober påviser mycobakterie-DNA. Amplifikasjonsproduktene som lages som ovenfor kan tjene som substrat i hybridiseringsreaksjon. Fremstilling av de passende hybridiseringssignalene tillater en vurdering av hvor godt probene er i stand til å påvise mycobakterie-DNA.

Claims (13)

1. Par av oliogonukleotidprimere som er istand til å amplifisere et målområde i 16S ribosomal RNA genet av en mycobakterieart eller dens tilsvarende RNA, karakterisert ved at den første primeren inneholder en delsekvens omfattende minst 14 nukleotider av sekvensen KY18 (SEKV.ID.NR.:1) som hybridiseringssekvens og den andre primeren inneholder en delsekvens på minst 14 nukleotider av sekvensen KY75 (SEKV.ID. NR.:2) som hybridiseringssekvens.

2. Par av oligonukleotidprimere ifølge krav 1, karakterisert ved at den første primeren inneholder sekvensen KY18 (SEKV.ID.NR.:1) og den andre primeren inneholder sekvensen KY75 (SEKV.ID.NR.:2), som hybridiseringssekvens.

3. Oligonukleotidprobe inneholdende en nukleinsyresekvens istand til å hybridisere til et område som er konservert innen målområde til 16S ribosomal RNA genet av en mycobakterieart eller dens tilsvarende RNA amplifisert med et par primere ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte probe er sekvensen KY101 (SEKV.ID.NR.:3) eller sekvensen som helt er komplementær til denne, eller sekvensen KY102 (SEKV.ID.NR.:4) eller sekvensen komplementær dertil.

4. Oligonukleotidprobe inneholdende en nukleinsyresekvens istand til å hybridisere til et område som er konservert innen målområdet til 16S ribosomal RNA genet av en mycobakterieart eller dens tilsvarende RNA amplifisert med et par primere ifølge krav 2, karakterisert ved at proben er sekvensen KY165 (SEKV.ID.NR..13) eller sekvensen som er helt komplentær til denne, eller sekvensen KY166 (SEKV.ID.NR.:14) eller sekvensen som er komplementær dertil.

5. Oliogonukleotidprobe inneholdende en nukleinsyresekvens istand til å hybridisere til et område som er variabelt innen målområde til 16S ribosomal RNA genet til en mycobakterieart eller dens tilsvarende RNA amplifisert ved et par primere ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte probe er valgt fra gruppen bestående av sekvensene KY21 (SEKV.ID.NR.:5), KY25 (SEKV.ID.NR.:6), KY26 (SEKV.ID.NR.:7), KY63 (SEKV.ID.NR.:8), KY151 (SEKV.ID.NR.: 9), KY106 (SEKV.ID.NR.:10), KY126 (SEKV.ID.NR.:11), KY139 (SEKV.ID.NR.:12), KY157 (SEKV.ID.NR.:16), KY167 (SEKV.ID.NR.:17), KY168 (SEKV.ID.NR.:18), KY169 (SEKV.ID.NR.:19), KY170 (SEKV.ID.NR..20), KY171 (SEKV.ID.NR.:21), KY172 (SEKV.ID.NR.:22) og KY173 (SEKV.ID.NR.:23) og en sekvens komplementær dertil.

6. Panel av oligonukleotidprober, karakterisert ved at det omfatter minst to oligonukleotidprober ifølge krav 5.

7. Analysesett for påvisning av og valgfri identifisering av mycobakteriell nukleinsyre i en prøve, karakterisert ved at det omfatter et par primere ifølge kravene 1 eller 2 og, valgfritt minst en oligonukleotidprobe ifølge kravene 3 eller 4 og/eller minst ett oligonukleotid ifølge krav 5, og valgfritt en intern kontroll-oligonukleotidsekvens flankert av oppstrøms- eller nedstrømssekvenser som er helt komplementære til primerne KY18 (SEKV.ID.NR.:1) og KY75 (SEKV.ID.NR.:2).

8. Analysesett ifølge krav 7, karakterisert ved at det omfatter en intern positiv kontroll-oligonukleotid amplifiserbar ved bruk av et par primere ifølge krav 1, som er flankert av oppstrøms- og nedstrøms-sekvenser som helt er komplementære til primerne KY18 (SEKV.ID.NR.:1) og KY75 (SEKV.ID.NR.:2).

9. Anvendelse av et par primere ifølge krav 1 for påvisning av mycobakterie-nukleinsyre inneholdt i en prøve, karakterisert ved at den omfatter (a) amplifisering av et område av nevnte nukleinsyre fra 16 S ribosomal RNA genet ved bruk av et par primere ifølge krav 1, (b) blanding av nevnte nukleinsyre amplifisert i trinn (a) med en Mycobakterieslekts-spesifikk probe, og (c) påvisning av hybrider dannet mellom nevnte nukleinsyre og nevnte probe.

10. Anvendelse ifølge krav 9, karakterisert ved at den Mycobakterie-slekts-spesifikke probe er en probe i henhold til krav 3 eller 4.

11. Anvendelse av et par primere ifølge krav 1 for å klassifisere en mycobakterie, karakterisert ved at den omfatter (a) amplifisering av et område av nukleinsyre fra 16S ribosomal RNA genet fra nevnte mycobakterie ved bruk av et par primere ifølge krav 1, (b) blanding av nevnte nukleinsyre amplifisert i trinn (a) med et panel av sekvens-spesifikke oligonukleotidprober ifølge krav 6, og (c) påvisning av hybrider dannet mellom nevnte nukleinsyre og nevnte prober.

12. Anvendelse ifølge krav 9 til 11, karakterisert ved at amplifikasjonen er oppnådd ved polymerasekjedereaksjon.

13. Anvendelse ifølge krav 12, karakterisert ved at polymerase-kjedereaksjonen oppnås ved bruk av et par primere ifølge krav 2.