KR20220098246A - 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이것을 이용한 방법, 및 그를 위한 시약 키트 - Google Patents

마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이것을 이용한 방법, 및 그를 위한 시약 키트 Download PDF

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다츠야 나카무라
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후지필름 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 시료 중에 존재하는 마이코박테륨속의 농도(카피수)에 차가 있었다고 해도, 이들을 검출할 수 있는 방법의 제공을 과제로 하며, "(i) 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍, (ii) 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍 및 (iii) 배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍을 포함하는, 프라이머 세트."에 관한 것이다.

Description

마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이것을 이용한 방법, 및 그를 위한 시약 키트
본 발명은, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이것을 이용한 방법, 및 그를 위한 시약 키트에 관한 것이다.
결핵증, 비결핵성 항산균증 등의 항산균증은, 세계적으로 만연하고 있는 세균성 질환이며, 전신의 권태감, 식욕 부진, 발열 등의 증상을 특징으로 하는 것이다. 결핵증 및 비결핵성 항산균증은, 항산균의 일종인 마이코박테륨(Mycobacterium)속에 의하여 야기되는 것을 알 수 있다. 결핵증은, 마이코박테륨·투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 의하여 야기되며, 비결핵성 항산균증은, 주로 마이코박테륨·아비움(Mycobacterium avium) 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare)에 의하여 야기된다.
또, 결핵증과 비결핵성 항산균증에서는, 치료약 등이 상이하기 때문에, 결핵증과 비결핵성 항산균증을 구별하는 것은 임상상 중요하다.
종래, 결핵증과 비결핵성 항산균증을 구별하기 위해서는, 검체를 고형 배지 상에서 분리·배양하는 방법이 주류였다.
그러나, 이 방법에서는, 결핵증의 진단에 약 3주간, 비결핵성 항산균증의 진단에 약 4주간 정도 필요로 하기 때문에, 신속히 이들을 구별하는 것은 불가능했다.
따라서 최근, 분자 유전학의 발전에 의하여, 폴리메라제 연쇄 반응(PCR) 등의 핵산 증폭법을 이용한 신속한 방법이 개발되고 있다(특허문헌 1-3).
이들 특허문헌 1-3의 방법은, 마이코박테륨·투베르쿨로시스의 유무, 마이코박테륨·아비움의 유무, 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 유무를 각각 검출하는 방법이다.
그러나, 상술한 바와 같이, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레에 의하여, 결핵증, 비결핵성 항산균증 등의 항산균증이 야기되기 때문에, 이들 3균종의 유무를 동시에 검출하는 것이, 적절한 치료를 행하는 데 바람직하다.
마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 유무를 동시에 검출하는 방법으로서는, 마이코박테륨속 사이에서 공통으로 보존된 배열로 어닐링하는 프라이머 및 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레에 특이적인 배열로 각각 하이브리다이즈하는 프로브를 이용하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 4).
특허문헌 1: 일본 특허공보 제4905130호 특허문헌 2: 일본 특허공보 제6166806호 특허문헌 3: 일본 특허공보 제5958498호 특허문헌 4: 일본 공개특허공보 평6-261757호
그러나, 상기 특허문헌 4의 방법은, 예를 들면, 피험자 유래의 시료 중에 포함되는 마이코박테륨속의 종 사이에서 농도차(카피수의 차)가 있었던 경우, 시료 중에 존재하는 마이코박테륨속을 적절히 검출할 수 없다는 문제를 갖고 있었다. 구체적으로는, 예를 들면, 시료 중에 마이코박테륨·투베르쿨로시스가 저농도(예를 들면, 4카피/μL), 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레가 각각 고농도(예를 들면, 400카피/μL)로 존재하는 경우, 시료 중에 가장 저농도로 존재하고 있는 마이코박테륨·투베르쿨로시스에서 유래하는 핵산의 증폭량이, 시료 중에 가장 고농도로 존재하는 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레에서 유래하는 핵산의 증폭량에 비하여 훨씬 적게 되어 버리기 때문에, 마이코박테륨·투베르쿨로시스의 검출이 곤란해진다는 것이다.
상기 문제는, 특허문헌 4의 방법에 있어서의 프라이머의 성질에 기인한다. 즉, 당해 프라이머는, 마이코박테륨속 사이에서 공통으로 보존된 배열로 어닐링하도록 설계되어 있기 때문에, 시료 중에 가장 고농도로 존재하는 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레에서 유래하는 핵산에 우선적으로 어닐링하여, 결과적으로 당해 핵산이 우선적으로 증폭되기 때문이다. 그 때문에, 특허문헌 4의 방법에서는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스가 시료 중에 존재함에도 불구하고, 이것을 검출하는 것이 곤란해진다.
이상으로부터, 시료 중에 존재하는 마이코박테륨속(마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레)의 농도(카피수)에 차가 있었다고 해도, 이들을 검출할 수 있는 방법의 개발이 요망되고 있었다.
본 발명은, 시료 중에 존재하는 마이코박테륨속(마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레)의 농도(카피수)에 차가 있었다고 해도, 이들을 검출할 수 있는 방법의 제공을 과제로 한다.
본 발명은, 상기 과제를 해결할 목적으로 이루어진 것이며, 이하의 구성으로 이루어진다.
[1]
(i) 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍,
(ii) 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍
및
(iii) 배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍을 포함하는, 프라이머 세트.
[2]
상기 (i), (ii) 및 (iii)의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이, 각각 표지 물질로 표지되어 있는 것인, [1]에 기재된 프라이머 세트.
[3]
상기 표지 물질이, 형광 물질, 방사성 동위체 또는 효소로부터 선택되는 것인, [1] 또는 [2]에 기재된 프라이머 세트.
[4]
[1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 프라이머 세트를 이용하여, 시료 중의 핵산을 주형(鑄型)으로 하여 핵산 증폭 반응을 행하고, 얻어진 핵산 증폭 산물을 검출함으로써 이루어지는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 검출 방법.
[5]
(i) 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍,
(ii) 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍
및
(iii) 배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍을 포함하는, 시약 키트.
[6]
상기 (i), (ii) 및 (iii)의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이, 각각 표지 물질로 표지되어 있는 것인, [5]에 기재된 시약 키트.
본 발명의 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이것을 이용한 방법, 및 그를 위한 시약 키트에 의하면, 시료 중에 존재하는 마이코박테륨속(마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레)의 농도(카피수)에 차가 있었다고 해도, 이들을 검출할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 얻어진, 타깃 비존재하에 있어서의 각종 프라이머 세트를 이용한 핵산 증폭 반응(PCR)에 의한 검출 결과이다.
도 2는 실시예 2에서 얻어진, 타깃 존재하에 있어서의 프라이머 세트 3을 이용한 핵산 증폭 반응(PCR)에 의한 검출 결과이다.
도 3은 비교예 1(비교예 1-1)에서 얻어진, 타깃 존재하에 있어서의 공지의 프라이머쌍 및 프로브를 이용한 핵산 증폭 반응(PCR)에 의한 검출 결과이다.
도 4는 비교예 1(비교예 1-2)에서 얻어진, 타깃 존재하에 있어서의 공지의 프라이머쌍 및 프로브를 이용한 핵산 증폭 반응(PCR)에 의한 검출 결과이다.
도 5는 비교예 1(비교예 1-3)에서 얻어진, 타깃 존재하에 있어서의 공지의 프라이머쌍 및 프로브를 이용한 핵산 증폭 반응(PCR)에 의한 검출 결과이다.
도 6은 비교예 1(비교예 1-4)에서 얻어진, 타깃 존재하에 있어서의 공지의 프라이머쌍 및 프로브를 이용한 핵산 증폭 반응(PCR)에 의한 검출 결과이다.
도 7은 비교예 1(비교예 1-5)에서 얻어진, 타깃 존재하에 있어서의 공지의 프라이머쌍 및 프로브를 이용한 핵산 증폭 반응(PCR)에 의한 검출 결과이다.
도 8은 비교예 1(비교예 1-6)에서 얻어진, 타깃 존재하에 있어서의 공지의 프라이머쌍 및 프로브를 이용한 핵산 증폭 반응(PCR)에 의한 검출 결과이다.
도 9는 비교예 1(비교예 1-7)에서 얻어진, 타깃 존재하에 있어서의 공지의 프라이머쌍 및 프로브를 이용한 핵산 증폭 반응(PCR)에 의한 검출 결과이다.
도 10은 실시예 3에서 얻어진, 프라이머 세트 3을 구성하는 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍의 최적 농도의 검정 결과이다.
도 11은 실시예 3에서 얻어진, 프라이머 세트 3을 구성하는 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍의 최적 농도의 검정 결과이다.
도 12는 실시예 3에서 얻어진, 프라이머 세트 3을 구성하는 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍의 최적 농도의 검정 결과이다.
<본 발명의 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하기 위한 프라이머 세트>
본 발명의 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하기 위한 프라이머 세트(이하, 본 발명의 프라이머 세트라고 약기하는 경우가 있다.)는,
(i) 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍(이하, 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍이라고 약기하는 경우가 있다),
(ii) 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍(이하, 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍이라고 약기하는 경우가 있다.)
및
(iii) 배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍(이하, 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍이라고 약기하는 경우가 있다.)을 포함하는 것이다.
[본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍]
본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍은, 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것이다.
배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머(GenbankID: CP023640.1, 염기 번호 889765~889784)와 배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머(GenbankID: CP023640.1, 염기 번호 889925~889946)는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스의 염기 배열 중, 배열 번호 7로 나타나는 염기 배열(GenbankID: CP023640.1, 염기 번호 889765~889946)로 각각 어닐링하는 것이다.
그 때문에, 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍과, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 유래의 DNA 등의 핵산 함유 시료를 이용하고, PCR 등의 핵산 증폭 반응에 제공하면, 상기 배열 번호 7로 나타나는 염기 배열이 증폭된다.
[본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍]
본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍은, 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것이다.
배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머(GenbankID: CP000479.1, 염기 번호 829817~829835)와 배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머(GenbankID: CP000479.1, 염기 번호 829684~829703)는, 마이코박테륨·아비움의 염기 배열 중, 배열 번호 8로 나타나는 염기 배열(GenbankID: CP000479.1, 염기 번호 829684~829835)로 각각 어닐링하는 것이다.
그 때문에, 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍과, 마이코박테륨·아비움 유래의 DNA 등의 핵산 함유 시료를 이용하고, PCR 등의 핵산 증폭 반응에 제공하면, 상기 배열 번호 8로 나타나는 염기 배열이 증폭된다.
[본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍]
본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍은, 배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것이다.
배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머(GenbankID: CP023149.1, 염기 번호 3015253~3015271)와 배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머(GenbankID: CP023149.1, 염기 번호 3015059~3015076)는, 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 염기 배열 중, 배열 번호 9로 나타나는 염기 배열(GenbankID: CP023149.1, 염기 번호 3015059~3015271)로 각각 어닐링하는 것이다.
그 때문에, 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍과, 마이코박테륨·인트라셀룰라레 유래의 DNA 등의 핵산 함유 시료를 이용하고, PCR 등의 핵산 증폭 반응에 제공하면, 상기 배열 번호 9로 나타나는 염기 배열이 증폭된다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어서의 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍, 아비움 검출용 프라이머쌍 및 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍의 농도(최종 농도)는, 하기 표 1에 나타내는 바와 같다.
또한, 상기 프라이머쌍의 농도(최종 농도)란, 프라이머쌍을 구성하는 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 각각의, PCR 등의 핵산 증폭 반응액 중에 있어서의 농도를 의미한다. 예를 들면, 프라이머쌍의 농도가 400nM인 경우, 당해 프라이머쌍을 구성하는 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머의 농도가 PCR 등의 핵산 증폭 반응액 중에 각각 400nM인 것을 의미한다. 이하, 본 명세서에서 동일하다.
[표 1]
Figure pct00001
또, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서의 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍, 아비움 검출용 프라이머쌍 및 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍의 농도 비율(최종 농도 비율)은, 하기 표 2에 나타내는 바와 같다.
또한, 하기 표 2는, 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍, 아비움 검출용 프라이머쌍 및 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍만으로 이루어지는 본 발명의 프라이머 세트에 있어서의 각 프라이머쌍의 농도 비율(최종 농도 비율)을 나타낸다.
상기 농도 비율(최종 농도 비율)이란, 전체의 농도를 100%로 했을 때의 각 프라이머쌍 각각이 차지하는 농도(%)를 나타낸 것이다. 또, 하기 표 중, "약"이란, 명기된 값의 +/-1%에 이르는 범위를 의미한다. 이하, 본 명세서에서 동일하다.
[표 2]
Figure pct00002
본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍, 아비움 검출용 프라이머쌍 및 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍(이하, 본 발명에 관한 프라이머쌍이라고 약기하는 경우가 있다.)을 구성하는 프라이머(이하, 본 발명에 관한 프라이머라고 약기하는 경우가 있다.)를 얻는 방법으로서는, 통상 이 분야에서 행해지고 있는 자체 공지의 방법에 근거하여 이루어지면 되고, 구체적으로는, 예를 들면, 포스포로아미다이트법 등의 화학 합성법에 의하여 조제하는 방법, 벡터 등을 이용하는 유전자 조작법에 의하여 얻는 방법 등을 들 수 있으며, 화학 합성법에 의하여 조제하는 방법이 바람직하다.
본 발명에 관한 프라이머는, 표지 물질로 표지된 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 표지 물질로 표지되어 있는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍이면, 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 표지 물질로 표지되어 있으면 된다. 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍이면, 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 표지 물질로 표지되어 있으면 된다. 또, 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍이면, 배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
본 발명에 관한 프라이머를 표지 물질로 표지하기 위하여 이용되는 표지 물질로서는, 통상 이 분야에서 이용되는 자체 공지의 것이면 어느 것이어도 되고, 구체적으로는, 예를 들면, 형광 물질, 방사성 동위체, 효소 등을 들 수 있으며, 형광 물질이 바람직하다.
상기 형광 물질로서는, 예를 들면, TAMRATM(씨그마 알드리치제), Alexa555, Alexa647(서모 피셔 사이언티픽제), Cyanine Dye계의 Cy3, Cy5(GE 헬스케어제), 플루오레세인 등을 들 수 있으며, TAMRATM이 바람직하다.
상기 방사성 동위체로서는, 예를 들면, 32P, 33P, 35S 등을 들 수 있다.
상기 효소로서는, 예를 들면, 알칼리포스파타제, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 등을 들 수 있다.
표지 물질로 표지된 본 발명에 관한 프라이머는, 표지 물질이 프라이머에 직접 결합하고 있어도 되고, 링커를 통하여 결합하고 있어도 된다. 링커로서는, 이 분야에서 통상 이용되는 것이면 되며, 구체적으로는, 예를 들면, 1~3염기의 핵산이 바람직하고, 1~3염기의 DNA가 보다 바람직하며, 2염기의 DNA가 더 바람직하고, 아데닌 (A)-아데닌 (A)의 2염기가 특히 바람직하다.
본 발명에 관한 프라이머를 형광 물질로 표지하는 방법으로서는, 통상 이 분야에서 행해지고 있는 자체 공지의 방법에 근거하여 이루어지면 되고, 구체적으로는, 예를 들면, 플루오레세인 표지한 뉴클레오타이드를 자체 공지의 방법에 따라, 프라이머에 혼입시키는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에 관한 프라이머를 방사성 동위체로 표지하는 방법으로서는, 통상 이 분야에서 행해지고 있는 자체 공지의 방법에 근거하여 이루어지면 되고, 구체적으로는, 예를 들면, 방사성 동위체로 표지된 뉴클레오타이드를 혼입시킴으로써 표지하는 방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 랜덤 프라이머법, 닉 트랜슬레이션법, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제에 의한 5' 말단 표지법, 터미널 데옥시뉴클레오티딜트랜스페라제에 의한 3' 말단 표지법 등을 들 수 있다.
본 발명에 관한 프라이머를 효소로 표지하는 방법으로서는, 통상 이 분야에서 행해지고 있는 자체 공지의 방법에 근거하여 이루어지면 되고, 구체적으로는, 예를 들면, 알칼리포스파타제, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 등의 효소 분자를, 표지하는 프라이머에 직접 공유 결합시키는 직접 표지법 등을 들 수 있다.
<본 발명의 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 검출 방법>
본 발명의 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 검출 방법(이하, 본 발명의 검출 방법이라고 약기하는 경우가 있다.)은, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 핵산 증폭 반응을 행하고(이하, 본 발명에 관한 증폭 공정이라고 약기하는 경우가 있다.), 얻어진 증폭 산물을 검출함(이하, 본 발명에 관한 검출 공정이라고 약기하는 경우가 있다.)으로써 이루어진다.
[본 발명에 관한 시료]
본 발명에 관한 시료로서는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레가 존재할 수 있는 생체 시료이면 어느 것이어도 되고, 구체적으로는, 예를 들면, 객담, 타액, 폐 세정액, 위액, 전혈, 혈장, 혈청, 요(尿), 분변, 피부, 췌액 등을 들 수 있으며, 객담, 타액, 폐 세정액 및 위액이 바람직하고, 객담이 보다 바람직하다.
본 발명에 관한 시료는, 본 발명의 검출 방법에 제공하기 전에, 당해 시료 중에 존재하는 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 농축, 분리나, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레로부터의 핵산의 추출, 정제 등의 조작을 행해도 된다.
상기 시료 중에 존재하는 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 농축, 분리나, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 농축 및 분리는, 통상 이 분야에서 행해지고 있는 자체 공지의 방법에 근거하여 이루어지면 되고, 구체적으로는, 예를 들면, 여과, 원심 분리 등을 들 수 있다.
상기 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 핵산의 추출 및 정제는, 통상 이 분야에서 행해지고 있는 자체 공지의 방법에 근거하여 이루어지면 되고, 구체적으로는, 예를 들면, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 세포벽을 파괴한 후, 페놀 및 클로로폼으로 처리하는 방법, 에탄올, 아이소프로판올 등의 알코올로 처리하는 방법을 들 수 있다.
또한, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 세포벽을 파괴하는 방법으로서는, 통상 이 분야에서 행해지고 있는 자체 공지의 방법에 근거하여 이루어지면 되고, 구체적으로는, 예를 들면, SDS 등의 계면활성제나, 구아니딘싸이오사이아네이트 등의 단백질 변성제를 이용하는 방법, 유리 비즈 등에 의하여 물리적으로 파쇄하는 방법 등을 들 수 있다.
[본 발명에 관한 핵산]
본 발명에 관한 핵산이란, 상기 시료 중에 존재하는 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레에서 유래하는 핵산이며, DNA 또는 RNA이고, 바람직하게는 DNA이다.
또한, 핵산이 RNA인 경우에는, 역전사 반응에 의하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성하고, 후술하는 본 발명에 관한 증폭 공정에 제공해도 된다.
[본 발명에 관한 증폭 공정]
본 발명에 관한 증폭 공정은, 통상 이 분야에서 행해지고 있는 자체 공지의 핵산 증폭 반응에 근거하여 이루어지면 되고, 구체적으로는, 예를 들면, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법 등을 들 수 있으며, PCR법이 바람직하다.
본 발명에 관한 증폭 공정에 이용되는 시약으로서는, 통상 이 분야에서 이용되고 있는 자체 공지의 것이면 어느 것이어도 되고, 구체적으로는, 예를 들면, Taq 폴리메라제 등의 핵산 합성 효소, dNTP 등의 핵산 합성 기질, Tris 완충액, TAPS 완충액 등의 완충액, MgCl2, KCl, (NH4)2SO4 등의 염 등을 들 수 있다.
또한, 상기 시약에 더하여, 폴리에틸렌글라이콜, Triton(다우 케미컬 컴퍼니제), Nonidet(쉘 케미컬제), CHAPS(도진 가가쿠제), Tween 등의 계면활성제, 프로클린 등의 방부제, BSA(소 혈청 알부민) 등의 폴리펩타이드 등도 이용할 수 있다.
본 발명에 관한 증폭 공정에 있어서는, 본 발명의 프라이머쌍에 더하여, 내부 컨트롤을 검출하기 위한 프라이머쌍을 이용하여, 증폭 반응을 행해도 된다.
당해 내부 컨트롤로서는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레 이외의 균이면 되고, 바실루스·서브틸리스, 바실루스·세레우스, 클로스트리듐·디피실 등의 균을 들 수 있으며, 바실루스·서브틸리스가 바람직하다. 당해 바실루스·서브틸리스를 검출하기 위한 프라이머쌍으로서는, 배열 번호 21로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 22로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것이 바람직하다.
또, 내부 컨트롤로서 선택하는 균을 검출하기 위한 프라이머쌍을 구성하는 프라이머는, 각각 표지 물질로 표지된 것이어도 된다. 구체적으로는, 예를 들면, 당해 프라이머쌍에 있어서의 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
또한, 표지 물질 및 표지 물질로 표지하는 방법은, <본 발명의 프라이머 세트>에서 설명한 바와 같으며, 구체예, 바람직한 예 등도 동일하다.
[본 발명에 관한 검출 공정]
본 발명에 관한 검출 공정은, 통상 이 분야에서 행해지고 있는 자체 공지의 방법에 근거하여 이루어지면 되고, 구체적으로는, 예를 들면, 엔드 포인트법, 리얼타임법 등을 들 수 있으며, 리얼타임법이 바람직하다.
엔드 포인트법이란, 본 발명의 프라이머쌍을 이용한 핵산 증폭 반응 후, 얻어진 증폭 산물을 분리·검출하는 방법이다.
한편, 리얼타임법이란, 본 발명의 프라이머쌍을 이용한 핵산 증폭 반응에 의하여 얻어지는 증폭 산물을 당해 핵산 증폭 반응 중에 리얼타임으로 검출하는 방법이다.
상기 엔드 포인트법 및 리얼타임법의 구체적인 방법으로서는, (a) 표지 프라이머법, (b) 인터칼레이터법 및 (c) 표지 프로브법을 들 수 있으며, (a) 표지 프라이머법이 바람직하다.
(a) 표지 프라이머법
(a) 표지 프라이머법은, 예를 들면, 하기와 같이 이루어지는 것이다.
"각 프라이머쌍 중 적어도 일방을 표지 물질로 표지한, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 행한다. 이어서, 핵산 증폭 반응 후, 얻어진 증폭 산물을 각각 분리하고, 당해 증폭 산물 중의 표지를 각각 검출하거나(엔드 포인트법), 또는 핵산 증폭 반응을 1~3사이클 행할 때마다 얻어진 증폭 산물 중의 표지를 각각 리얼타임으로 검출한다(리얼타임법).
그 결과, (i) 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물의 표지 유래의 형광이 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 양성이다"라고 판정한다.
(ii) 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물의 표지 유래의 형광이 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·아비움 양성이다"라고 판정한다.
(iii) 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물의 표지 유래의 형광이 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·인트라셀룰라레 양성이다"라고 판정한다."
표지 프라이머법에 있어서의 "리얼타임으로 검출하는" 방법으로서는, 핵산 증폭 반응 1~3사이클 행할 때마다 얻어진 증폭 산물을 일단 분리한 후, 당해 증폭 산물의 표지 유래의 형광을 검출해도 된다.
또한, 본 명세서에 있어서의 "표지를 검출한다"란, 표지 물질의 성질에 근거하여 표지 물질을 직접 또는 간접적으로 측정하는 것을 의미한다.
(a) 표지 프라이머법에 있어서의 분리로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 전기 영동, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)법 등의 자체 공지의 방법을 들 수 있으며, 전기 영동이 바람직하다.
상기 전기 영동으로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 캐필러리 전기 영동, 아가로스 젤 전기 영동, 폴리아크릴아마이드 젤 전기 영동(슬라브 전기 영동), 전분 젤 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 들 수 있으며, 캐필러리 전기 영동이 바람직하다.
또한, 캐필러리 전기 영동을 행하는 경우에는, 예를 들면, WO2007/027495, WO2011/118496, WO2008/075520 등에 기재된 자체 공지의 방법에 따라 행하면 된다.
(b) 인터칼레이터법
(b) 인터칼레이터법은, 엔드 포인트법으로 행하는 경우, 예를 들면, 하기와 같이 이루어지는 것이다.
"본 발명의 프라이머 세트를 이용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 행한다. 그 후, 얻어진 증폭 산물을 각각 분리한다. 이어서, 당해 증폭 산물을 인터칼레이터로 염색하여, 당해 인터칼레이터 유래의 형광을 검출한다.
그 결과, (i) 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물 중의 인터칼레이터 유래의 형광이 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 양성이다"라고 판정한다.
(ii) 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물 중의 인터칼레이터 유래의 형광이 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·아비움 양성이다"라고 판정한다.
(iii) 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물 중의 인터칼레이터 유래의 형광이 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·인트라셀룰라레 양성이다"라고 판정한다."
또, (b) 인터칼레이터법은, 리얼타임법으로 행하는 경우, 하기와 같이 이루어지는 것이다.
"본 발명의 프라이머 세트 및 인터칼레이터를 이용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 행한다. 이어서, 얻어진 증폭 산물의 증폭량과 상관하여 인터칼레이션하는 인터칼레이터 유래의 형광을 각각 검출한다.
그 결과, (i) 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물 중의 인터칼레이터 유래의 형광의 증대가 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 양성이다"라고 판정한다.
(ii) 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물 중의 인터칼레이터 유래의 형광의 증대가 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·아비움 양성이다"라고 판정한다.
(iii) 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물 중의 인터칼레이터 유래의 형광의 증대가 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·인트라셀룰라레 양성이다"라고 판정한다."
인터칼레이터법에 있어서의 분리로서는, (a) 표지 프라이머법에서 설명한 바와 같으며, 구체예, 바람직한 예 등도 동일하다.
인터칼레이터법에 있어서의 인터칼레이터로서는, 통상 이 분야에서 이용되고 있는 자체 공지의 것이면 어느 것이어도 되고, 구체적으로는, 예를 들면, WO2017/170376에 기재된 것을 들 수 있으며, 그중에서도 SYTOX(상표)계 색소[예를 들면, SYBR Gold(상표), SYBR Green I(상표), SYBR Green II(상표), SYTOX Green(상표), SYTOX Blue(상표), SYTOX Orange(상표)(모두 서모 피셔 사이언티픽제)]가 바람직하다.
(c) 표지 프로브법
(c) 표지 프로브법은, 엔드 포인트법으로 행하는 경우, 예를 들면, 하기와 같이 이루어지는 것이다.
"본 발명의 프라이머 세트를 이용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 행한다. 그 후, 얻어진 증폭 산물을 각각 분리한다. 이어서, 당해 증폭 산물을 수산화 나트륨 등의 염기성 용액으로 처리함으로써, 각각 1본쇄로 한다. 이어서, 당해 증폭 산물과, 당해 증폭 산물의 전부 또는 일부의 염기 배열과 상보적인 염기 배열을 갖는 표지 물질로 표지된 프로브를 하이브리다이즈시킴으로써, 하이브리드체를 형성시켜, 당해 하이브리드체 중의 표지를 각각 검출한다.
그 결과, (i) 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물과 하이브리다이즈하는 프로브에서 유래하는 표지가 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 양성이다."라고 판정한다.
(ii) 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물과 하이브리다이즈하는 프로브에서 유래하는 표지가 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·아비움 양성이다."라고 판정한다.
(iii) 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물과 하이브리다이즈하는 프로브에서 유래하는 표지가 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·인트라셀룰라레 양성이다."라고 판정한다."
표지 프로브법에 있어서의 표지 물질 및 표지 물질로 표지하는 방법으로서는, <본 발명의 프라이머 세트>에서 설명한 바와 같으며, 구체예, 바람직한 예 등도 동일하다.
또, (c) 표지 프로브법은, 리얼타임법으로 행하는 경우, 예를 들면, 하기와 같이 이루어지는 것이다.
"본 발명의 프라이머 세트 및 형광 표지 프로브를 이용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 행한다. 이어서, 얻어진 증폭 산물 중의 프로브 유래의 형광을 각각 검출한다.
그 결과, (i) 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물과 하이브리다이즈하는 프로브에서 유래하는 형광의 증대가 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 양성이다."라고 판정한다.
(ii) 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물과 하이브리다이즈하는 프로브에서 유래하는 형광의 증대가 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·아비움 양성이다."라고 판정한다.
(iii) 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물과 하이브리다이즈하는 프로브에서 유래하는 형광의 증대가 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·인트라셀룰라레 양성이다."라고 판정한다."
또한, 상기 형광 표지 프로브란, 본 발명에 관한 프라이머쌍을 이용한 핵산 증폭 반응에 의하여 증폭되는 영역에 하이브리다이즈하도록 설계되고, 또한, 그 5' 말단을 예를 들면, 형광 색소(리포터 형광 색소)로, 3' 말단을 예를 들면, ??처 색소로 표지한 것이다.
표지 프로브법에 있어서의 분리로서는, (a) 표지 프라이머법에서 설명한 바와 같으며, 구체예, 바람직한 예 등도 동일하다.
[본 발명의 검출 방법의 구체예]
본 발명의 검출 방법의 구체예에 대하여, 이하에 설명한다.
먼저, 시료(예를 들면, 객담)로부터, 자체 공지의 방법에 따라, 핵산(예를 들면, DNA)을 추출한다.
이어서, 화학 합성법(예를 들면, 포스포로아미다이트법)에 의하여, 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍, 아비움 검출용 프라이머쌍 및 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍을 각각 합성한다. 그 후, 자체 공지의 방법에 의하여, 상기 프라이머쌍 중 적어도 일방을 각각 표지 물질(예를 들면, 형광 물질)로 표지한다.
이어서, 상기 핵산 및 프라이머쌍을 이용하여, 하기와 같이 핵산 증폭 반응(예를 들면, PCR)을 행한다.
즉, 각 200nM~400nM의 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍을 구성하는 프라이머, 각 700nM~900nM의 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍을 구성하는 프라이머, 각 500nM~700nM의 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍을 구성하는 프라이머, 0.5mM~5mM의 염(예를 들면, MgCl2), 0.05mg/mL~10mg/mL의 폴리펩타이드(예를 들면, BSA), 각 0.1mM~2mM의 핵산 합성 기질(예를 들면, dATP, dCTP, dGT 및 dTTP) 및 0.5U/mL~100U/mL의 핵산 합성 효소(예를 들면, Taq 폴리메라제)를 함유하는 pH7~10의 1~300mM의 완충액(예를 들면, Tris 완충액 또는 TAPS 완충액)을 조제하고, 이것을 핵산 증폭 반응용 액으로 한다. 이어서, 이 반응액 5μL~100μL에, 상기 핵산을 0.01ng~1000ng 더하여, 이것을 핵산 증폭 반응용 시료로 한다.
이어서, 하기의 조건에서, 서멀 사이클러 등의 핵산 증폭 장치에 의하여, 핵산 증폭 반응(예를 들면, PCR법)을 행한다.
핵산 증폭 반응(예를 들면, PCR) 조건:
93℃~98℃, 10초~3분 가열한 후, (1) 93℃~98℃, 1초~30초→(2) 50℃~70℃, 5초~30초→(3) 60℃~80℃, 3초~30초를 1사이클로 하여, 30~50사이클을 행한다.
이어서, 핵산 증폭 반응을 1~3사이클 행할 때마다 얻어진 증폭 산물 중의 표지를 리얼타임으로 검출한다.
그 결과, (i) 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물의 표지 유래의 형광이 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 양성이다"라고 판정한다.
(ii) 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물의 표지 유래의 형광이 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·아비움 양성이다"라고 판정한다.
(iii) 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭된 증폭 산물의 표지 유래의 형광이 검출된 경우에 "그 시료는, 마이코박테륨·인트라셀룰라레 양성이다"라고 판정한다.
<본 발명의 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하기 위한 시약 키트>
본 발명의 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하기 위한 시약 키트(이하, 본 발명의 시약 키트라고 약기하는 경우가 있다.)는, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 것이다.
본 발명의 시약 키트는, (A) 본 발명의 프라이머 세트를 필수로 하는 것이지만, 예를 들면, 하기 (B), (C), (D), (E), (F) 또는/및 (G)를 포함하고 있어도 된다.
(B): 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍
(C): 살균액
(D): 핵산 추출 관련 시약
(E): 핵산 증폭 관련 시약
(F): 전기 영동 관련 시약
(G): 설명서
(B): 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍
(B) 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍이란, 내부 컨트롤로서 선택한 균을 검출하기 위하여 이용하는 것이고, 구체적으로는, 예를 들면, 바실루스·서브틸리스, 바실루스·세레우스, 클로스트리듐·디피실 등을 검출하기 위한 프라이머쌍을 들 수 있으며, 바실루스·서브틸리스를 검출하기 위한 프라이머쌍이 바람직하고, 배열 번호 21로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 22로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것이 보다 바람직하다.
(C): 살균액
(C) 살균액이란, 시료 중에 존재하는 마이코박테륨속(마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움, 마이코박테륨·인트라셀룰라레 등) 및 내부 컨트롤로서 선택한 균을 살균하기 위한 것이며, 구체적으로는, 예를 들면, 2-프로판올 등의 알코올을 함유하는 것이 바람직하다. 또, 상기 살균액 중에, 내부 컨트롤로서 선택한 균을 포함시키는 것이 바람직하다.
(D): 핵산 추출 관련 시약
(D) 핵산 추출 관련 시약이란, 시료 중에 존재하는 마이코박테륨속(마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움, 마이코박테륨·인트라셀룰라레 등)으로부터 핵산을 추출하기 위하여 사용하는 것이며, 핵산 결합액, 핵산 용출액, 핵산 세정액 등을 들 수 있다.
핵산 결합액으로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 구아니딘 염산염 등의 단백질 변성제, Tris 완충액, Tris/EDTA 완충액(TE 완충액) 또는/및 연어 정소 유래의 데옥시리보 핵산 나트륨염을 함유하는 것이 바람직하다.
핵산 용출액으로서는, 구체적으로는, 예를 들면, Tris 완충액 등의 완충액 또는/및 프로클린 등의 방부제를 함유하는 것이 바람직하다.
또, 핵산 세정액으로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 염화 나트륨 등의 염, Tris 완충액 등의 완충액, 에탄올 등의 알코올 또는/및 Tween 등의 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하다.
(E): 핵산 증폭 관련 시약
(E) 핵산 증폭 관련 시약이란, PCR 등의 핵산 증폭 반응을 행하기 위하여 이용하는 것이며, 구체적으로는, 예를 들면, Tris 완충액, TAPS 완충액 등의 완충액, 핵산 합성 기질, 핵산 합성 효소, 프로클린 등의 방부제, 또는/및 BSA 등의 폴리펩타이드 등이 바람직하다.
(F): 전기 영동 관련 시약
(F) 전기 영동 관련 시약이란, 핵산 증폭 반응에 의하여 얻어진 핵산 증폭 산물을 전기 영동에 제공하기 위하여 이용하는 것이며, 구체적으로는, 예를 들면, 전기 영동용 완충액, 폴리머 용액, 전기 영동용 마커 등을 들 수 있다.
전기 영동용 완충액으로서는, 구체적으로는, 예를 들면, MgCl2 등의 염, TAPS 등의 완충액, 글리세린 등의 알코올 또는/및 프로클린 등의 방부제가 바람직하다.
폴리머 용액으로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 폴리에틸렌글라이콜, 셀룰로스 유도체, 아가로스, 폴리아크릴아마이드, 다이메틸폼아마이드 유래의 모노머 단위를 갖는 폴리머 등의 고분자 폴리머를 함유하는 것이 바람직하다.
전기 영동용 마커로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 이미 알려진 분자량의 핵산(DNA 등)이 바람직하다.
(G): 설명서
(G) 설명서란, 본 발명의 검출 방법의 특징, 원리, 조작 수순, 판정 수순 등이 문장, 도표 등에 의하여 실질적으로 기재되어 있는 것이며, 구체적으로는, 예를 들면, 본 발명의 시약 키트 취급 설명서, 첨부 문서, 팸플릿 등이 바람직하다.
본 발명의 시약 키트로서는, 상기 (A)~(G)가 각각 개별의 용기(튜브 등)에 수용되어 있는 것이 바람직하다.
<본 발명에 관한 항산균증의 진단을 보조하는 방법>
본 발명에 관한 항산균증의 진단을 보조하는 방법(이하, 본 발명에 관한 보조 방법이라고 약기하는 경우가 있다.)은, 본 발명의 검출 방법의 결과에 근거하여, 피험자가 항산균증에 이환(罹患)하고 있는지 아닌지를 판정함(이하, 본 발명에 관한 판정 공정이라고 약기하는 경우가 있다.)으로써 이루어진다.
[본 발명에 관한 판정 공정]
본 발명에 관한 판정 공정은, 본 발명의 검출 방법의 결과에 근거하여, 예를 들면, 이하와 같이 이루어진다.
즉, (i) 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물에서 유래하는 시그널(형광 등)이 검출된 경우, "그 시료에서 유래하는 피검사자가 항산균증(결핵증)에 이환하고 있을 우려가 있거나, 혹은 항산균증(결핵증)에 이환하고 있을 우려가 높다" 등의 판정을 내리는 것이다. 또, (ii) 본 발명에 관한 투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물에서 유래하는 시그널(형광 등)이 검출되지 않았던 경우, "그 시료에서 유래하는 피검사자가 항산균증(결핵증)에 이환하고 있을 우려가 없거나, 혹은 항산균증(결핵증)에 이환하고 있을 우려가 낮다" 등의 판정을 내리는 것이다.
(i') 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물에서 유래하는 시그널(형광 등)이 검출된 경우, "그 시료에서 유래하는 피검사자가 항산균증(비결핵성 항산균증)에 이환하고 있을 우려가 있거나, 혹은 항산균증(비결핵성 항산균증)에 이환하고 있을 우려가 높다" 등의 판정을 내리는 것이다. 또, (ii') 본 발명에 관한 아비움 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물에서 유래하는 시그널(형광 등)이 검출되지 않았던 경우, "그 시료에서 유래하는 피검사자가 항산균증(비결핵성 항산균증)에 이환하고 있을 우려가 없거나, 혹은 항산균증(비결핵성 항산균증)에 이환하고 있을 우려가 낮다" 등의 판정을 내리는 것이다.
또, (i'') 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물에서 유래하는 시그널(형광 등)이 검출된 경우, "그 시료에서 유래하는 피검사자가 항산균증(비결핵성 항산균증)에 이환하고 있을 우려가 있거나, 혹은 항산균증(비결핵성 항산균증)에 이환하고 있을 우려가 높다" 등의 판정을 내리는 것이다. 또, (ii'') 본 발명에 관한 인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물에서 유래하는 시그널(형광 등)이 검출되지 않았던 경우, "그 시료에서 유래하는 피검사자가 항산균증(비결핵성 항산균증)에 이환하고 있을 우려가 없거나, 혹은 항산균증(비결핵성 항산균증)에 이환하고 있을 우려가 낮다" 등의 판정을 내리는 것이다.
본 발명에 관한 보조 방법에 의하면, 정확도(감도·특이도)가 높은 항산균증(결핵증 또는/및 비결핵성 항산균증)의 진단을 행할 수 있다.
<본 발명에 관한 항산균증을 치료하는 방법>
본 발명에 관한 항산균증을 치료하는 방법(이하, 본 발명에 관한 치료 방법이라고 약기하는 경우가 있다.)이란, 본 발명에 관한 보조 방법의 결과에 근거하여, 적절한 치료를 실시함(이하, 본 발명에 관한 치료 공정이라고 약기하는 경우가 있다.)으로써 이루어진다.
[본 발명에 관한 치료 공정]
본 발명에 관한 치료 공정에 대하여, (i) 피검사자가 결핵증에 이환하고 있을 우려가 있거나, 혹은 결핵증에 이환하고 있을 우려가 높다고 판정된 경우, (ii) 피검사자가 비결핵성 항산균증에 이환하고 있을 우려가 있거나, 혹은 비결핵성 항산균증에 이환하고 있을 우려가 높다고 판정된 경우, 또는 (iii) 피검사자가 결핵증 및 비결핵성 항산균증에 이환하고 있을 우려가 있거나, 혹은 결핵증 및 비결핵성 항산균증에 이환하고 있을 우려가 높다고 판정된 경우로 나누어, 이하에 각각 설명한다.
(i) 피검사자가 결핵증에 이환하고 있을 우려가 있거나, 혹은 결핵증에 이환하고 있을 우려가 높다고 판정된 경우
(i)의 경우, 본 발명에 관한 치료 공정으로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 리팜피신(일반명), 아이소나이아지드(하이드라자이드)(일반명), 스트렙토마이신(일반명), 에탐부톨(일반명), 피라지나미드(일반명) 등의 결핵증에 대하여 유효한 항생 물질을 투여함으로써 이루어지는 약물 요법, 외과적 요법 등을 들 수 있다.
(ii) 피검사자가 비결핵성 항산균증에 이환하고 있을 우려가 있거나, 혹은 비결핵성 항산균증에 이환하고 있을 우려가 높다고 판정된 경우
(ii)의 경우, 본 발명에 관한 치료 공정으로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 클라리스로마이신(일반명), 에탐부톨(일반명), 리팜피신(일반명) 등의 비결핵성 항산균증에 대하여 유효한 항생 물질을 투여함으로써 이루어지는 약물 요법, 외과적 요법 등을 들 수 있다.
(iii) 피검사자가 결핵증 및 비결핵성 항산균증에 이환하고 있을 우려가 있거나, 혹은 결핵증 및 비결핵성 항산균증에 이환하고 있을 우려가 높다고 판정된 경우
(iii)의 경우, 본 발명에 관한 치료 공정으로서는, 구체적으로는, 예를 들면, 상기 결핵증에 대하여 유효한 항생 물질 및 상기 비결핵성 항산균증에 대하여 유효한 항생 물질을 각각 투여함으로써 이루어지는 약물 요법, 외과적 요법 등을 들 수 있다.
본 발명에 관한 치료 방법에 의하면, 항산균증(결핵증 또는/및 비결핵성 항산균증)에 이환하고 있을 우려가 있거나, 혹은 항산균증(결핵증 또는/및 비결핵성 항산균증)에 이환하고 있을 우려가 높다고 판정된 피험자에 대하여, 적절한 치료를 실시할 수 있다.
<본 발명에 관한 항산균증의 진단을 보조하기 위한 장치>
본 발명에 관한 항산균증의 진단을 보조하기 위한 장치(이하, 본 발명에 관한 장치라고 약기하는 경우가 있다.)란, 적어도 (1) 핵산 증폭 반응부 및 (2) 검출부를 구비하고 있다. 또한, (3) 핵산 추출부, (4) 판정부, (5) 출력부 및 (6) 입력부를 구비하고 있어도 된다.
본 발명에 관한 장치에 있어서의 (1) 핵산 증폭 반응부는, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 핵산 증폭 반응을 행할 수 있도록 구성되어 있다.
본 발명에 관한 장치에 있어서의 (2) 검출부는, (1) 핵산 증폭 반응부에 있어서 얻어진 핵산 증폭 산물을 검출할 수 있도록 구성되어 있다.
또한, (1) 핵산 증폭 반응부 및 (2) 검출부는, 각각 독립적으로 구성되어 있어도 되고, 일체가 되어 구성되어 있어도 되며, 구체적으로는, 예를 들면, 일본 공개특허공보 2018-89611호 및 일본 공표특허공보 2015-514994호에 기재된 마이크로 유체 디바이스가 바람직하다.
본 발명에 관한 장치에 있어서의 (3) 핵산 추출부는, 시료로부터 핵산의 추출 또는/및 정제가 발생하도록 구성되어 있다. 구체적으로는, 예를 들면, WO2016/079981에 기재된 핵산의 추출 방법이나, WO2015/157650에 기재된 핵산의 정제 방법을 행할 수 있도록 구성되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 관한 장치에 있어서의 (4) 판정부는, (2) 검출부에서 얻어지는 결과에 근거하여 피험자가 항산균증(결핵증 또는/및 비결핵성 항산균증)에 이환하고 있는지 아닌지를 판정할 수 있도록 구성되어 있다.
본 발명에 관한 장치에 있어서의 (5) 출력부는, (1) 핵산 증폭 반응부, (2) 검출부, (3) 핵산 추출부 또는/및 (4) 판정부에서 얻어지는 결과를 출력할 수 있도록 구성되어 있다.
본 발명에 관한 장치에 있어서의 (6) 입력부는, (1) 핵산 증폭 반응부 또는/및 (3) 핵산 추출부에, 당해 (1) 핵산 증폭 반응부 또는/및 (3) 핵산 추출부를 작동시키기 위한 신호를 송신할 수 있도록 구성되어 있다.
본 발명에 관한 장치에 의하면, 본 발명에 관한 보조 방법을 간편하고, 단시간이며 또한 높은 정확도로 행할 수 있다.
이하, 실시예에 근거하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의하여 전혀 한정되지 않는다.
실시예
<실시예 1. 타깃 비존재하에 있어서의 프라이머 세트의 검토>
타깃 비존재하에 있어서의 각종 프라이머 세트를 이용한 핵산 증폭 반응을 행함으로써, 각종 프라이머 세트의 검토를 행했다.
(1) 프라이머 세트
하기 표 3에 나타내는 프라이머 세트를 이용했다.
[표 3]
Figure pct00003
(2) 시료(DNA)의 조제
연어 정자 유래 데옥시리보 핵산(씨그마 알드리치제)을 TE 완충액(pH8.0)(닛폰 진제)을 이용하여, 10mg/mL로 조제하고, 이것을 시료(DNA)로 했다.
(3) 핵산 증폭 반응·검출
상기 프라이머 세트 1에 있어서의 각 프라이머를 각각 400nM, 1.5mM MgCl2, 0.5mg/mL BSA, 각각 0.2mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 60U/mL KOD Exo(-)(도요보제)를 함유하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH8.0)을 조제하고, 이것을 PCR용 반응액으로 했다.
또, 프라이머 세트 1에 있어서의 각 프라이머 대신에, 프라이머 세트 2, 3 또는 4에 있어서의 각 프라이머를 이용하여, 동일한 PCR용 반응액을 조제했다.
이어서, 상기 (2)에서 조제한 DNA를 최종량 5μg이 되도록 상기 PCR용 반응액 25μL에 각각 현탁하고, 이것을 PCR용 시료로 했다.
상기 각 PCR용 시료를 96 well plate(서모 피셔 사이언티픽제)에 각각 넣고, StepOnePlusTM(서모 피셔 사이언티픽제)을 이용하여, PCR을 행했다.
또한, PCR은 97℃에서 30초 가열한 후, (1) 97℃에서 10초→(2) 65℃에서 20초→(3) 72℃에서 30초를 1사이클로 하여, 40사이클을 행했다.
PCR 종료 후, 얻어진 각 핵산 증폭 산물을, 전자동 마이크로칩형 캐필러리 전기 영동 장치 2100 바이오 애널라이저(애질런트 테크놀로지제)를 이용하여, 기기에 첨부된 프로토콜에 따라 캐필러리 전기 영동함으로써, 얻어진 증폭 산물의 분리·검출을 각각 행했다.
(4) 결과
상기 (3)에 의하여 얻어진 결과를 도 1에 나타낸다.
또한, 도 1에 있어서의 각 밴드는, 핵산 증폭 산물이 검출된 것을 나타낸다.
또, 상기 PCR용 시료에는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레에서 유래하는 DNA가 포함되어 있지 않다. 그 때문에, 핵산 증폭 산물이 검출된 것을 나타내는 밴드가 검출된 경우, 비특이적으로 핵산이 증폭되어 있는 것(비특이적 핵산 증폭 산물을 얻어진 것)을 나타낸다.
도 1로부터 명확한 바와 같이, 프라이머 세트 1, 프라이머 세트 2 및 프라이머 세트 4에서는, 비특이적인 핵산의 증폭을 나타내는 강도가 높은(진한) 밴드가 다수 검출되었다.
특히, 프라이머 세트 1에서 보이는 150염기쌍 부근에 존재하는 밴드는, 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물의 위치에 매우 가깝기 때문에, 위양성(僞陽性)이 될 가능성이 매우 높은 것을 알 수 있었다. 또, 프라이머 세트 2에서 보이는 200염기쌍 부근에 존재하는 밴드는, 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물의 위치에 각각 매우 가깝기 때문에, 위양성이 될 가능성이 매우 높은 것을 알 수 있었다. 또한, 프라이머 세트 4에서 보이는 180염기쌍 부근에 존재하는 밴드는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물의 위치에 각각 매우 가깝기 때문에, 위양성이 될 가능성이 매우 높은 것을 알 수 있었다.
한편, 프라이머 세트 3에서는, 비특이적인 핵산의 증폭을 나타내는 밴드는 검출되지 않고, 당연히, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍, 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물의 위치(150염기쌍~200염기쌍 부근)에 밴드는 존재하지 않았다.
이상의 결과로부터, 프라이머 세트 3에 의하면, 비특이적인 핵산의 증폭을 억제할 수 있기 때문에, 위양성이 될 가능성이 매우 낮은 것을 알 수 있었다.
<실시예 2. 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 검출>
실시예 1에 있어서의 프라이머 세트 3을 이용하여, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 검출을 행했다.
(1) 프라이머 세트
실시예 1의 프라이머 세트 3을 이용했다.
(2) 주형 DNA의 조제
마이코박테륨·투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis var. BCG), 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 자체 공지의 방법에 따라 배양한 후, 자체 공지의 핵산 정제법을 이용하여, 정제 게놈 DNA를 얻었다. 이어서, 각 정제 DNA의 카피수를 SYBRTM Premix Ex TaqTM II(다카라 바이오제)를 이용하여, 리얼타임 PCR 장치(StepOnePlusTM(서모 피셔 사이언티픽제))로 산출했다. 그 후, 상기 정제 DNA를 TE 완충액(pH8.0)(닛폰 진제)을 이용하여, 각각 마이코박테륨·투베르쿨로시스 DNA, 마이코박테륨·아비움 DNA 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레 DNA로 했다.
(3) 핵산 증폭 반응·검출
마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍(각 프라이머 300nM), 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍(각 프라이머 800nM), 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍(각 프라이머 600nM), 1.0mM MgCl2, 0.2mg/mL BSA, 각각 0.4mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1U/mL Takara Ex Taq(다카라 바이오제)를 함유하는 완충액을 조제하여, 이것을 PCR용 반응액으로 했다.
상기 (3)에서 조제한 주형 DNA를 하기 표 4에 나타내는 농도가 되도록 상기 PCR용 반응액 25μL에 각각 현탁하고, 이것을 PCR용 시료로 했다.
[표 4]
Figure pct00004
상기 PCR용 시료를 96 well plate(서모 피셔 사이언티픽 주식회사제)에 넣고, StepOnePlusTM(서모 피셔 사이언티픽 주식회사제)을 이용하여, PCR을 행했다. 반응은 97℃에서 30초 가열한 후, (1) 97℃에서 10초→(2) 64℃에서 10초→(3) 72℃에서 20초를 1사이클로 하여, 40사이클을 행했다.
PCR 종료 후, 얻어진 핵산 증폭 산물을, 전자동 마이크로칩형 캐필러리 전기 영동 장치 2100 바이오 애널라이저(애질런트 테크놀로지 주식회사제)를 이용하여, 기기에 첨부된 프로토콜에 따라 캐필러리 전기 영동함으로써, 얻어진 핵산 증폭 산물의 분리·검출을 각각 행했다.
(4) 결과
얻어진 전기 영동의 결과를 도 2에 나타낸다.
또한, 도 2에 있어서의 각 밴드는, 핵산 증폭 산물이 검출된 것을 나타낸다.
도 2로부터 명확한 바와 같이, 실시예 2-1~실시예 2-7 모든 경우에 있어서, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물(182염기쌍)의 밴드(밴드 a), 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물(152염기쌍)의 밴드(밴드 b) 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 의하여 증폭되는 산물(213염기쌍)의 밴드(밴드 c)가 각각 검출되었다.
특히, 실시예 2-2~2-7과 같이, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 사이에서 농도(카피수)의 차가 있었다고 해도, 이들 증폭 산물의 밴드가 각각 검출되었다.
따라서, 프라이머 세트 3을 이용함으로써, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하는 것이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
또한, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 사이에서 농도(카피수)의 차가 있었다고 해도, 이들을 검출 가능하다는 것을 알 수 있었다.
<비교예 1. 종래법에 의한 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 검출>
종래법(특허문헌 4의 방법)에 의한 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 검출을 행했다.
(1) 프라이머 세트 및 프로브
하기 표 5에 기재된 프라이머 세트 및 프로브를 이용했다.
또한, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프로브에 있어서, 배열 번호 18로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 프로브의 5' 말단을 형광 물질(FAM)로, 3' 말단을 형광 물질(TAMRATM)로 각각 표지했다.
마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프로브에 있어서, 배열 번호 19로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 프로브의 5' 말단을 형광 물질(FAM)로, 3' 말단을 형광 물질(TAMRATM)로 각각 표지했다.
또, 마이코박테륨·아비움 검출용 프로브에 있어서, 배열 번호 20으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 프로브의 5' 말단을 형광 물질(FAM)로, 3' 말단을 형광 물질(TAMRATM)로 각각 표지했다.
[표 5]
Figure pct00005
(2) 주형 DNA의 조제
실시예 2의 (2)와 동일하게 하여, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 DNA, 마이코박테륨·아비움 DNA 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레 DNA를 각각 조제했다.
(3) 핵산 증폭 반응·검출
각 프라이머 500nM, 각 프로브 280nM, 1.0mM MgCl2, 0.2mg/mL BSA, 각각 0.4mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1U/mL Takara Ex Taq(다카라 바이오제)를 함유하는 완충액을 조제하고, 이것을 PCR용 반응액으로 했다.
상기 (2)에서 조제한 DNA를 하기 표 6에 나타내는 농도가 되도록 상기 PCR용 반응액 25μL에 각각 현탁하고, 이것을 PCR용 시료로 했다.
[표 6]
Figure pct00006
이들 PCR용 시료를 96 well plate(서모 피셔 사이언티픽 주식회사제)에 넣고, StepOnePlusTM(서모 피셔 사이언티픽 주식회사제)을 이용하여, 리얼타임 PCR을 행하고, 핵산 증폭 산물을 리얼타임으로 검출했다. 반응은 97℃에서 30초 가열한 후, (1) 97℃에서 10초→(2) 64℃에서 10초→(3) 72℃에서 20초를 1사이클로 하여, 40사이클을 행했다.
(4) 결과
(3)의 리얼타임 PCR의 결과를, 도 3~9에 각각 나타낸다.
또한, 도 3~9에 있어서, 형광 강도의 증대가 목적의 핵산 증폭 산물이 검출된 것을 나타낸다. 또, 도 3~9에 있어서, 1-1a~1-7a는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스의 검출 결과를 나타내고, 1-1b~1-7b는, 마이코박테륨·아비움의 검출 결과를 나타내며, 1-1c~1-7c는, 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 검출 결과를 나타낸다.
도 3(비교예 1-1)의 결과로부터 명확한 바와 같이, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 농도가 동일한 경우, 각각 형광 강도의 증대가 확인되었다(도 3 중의 1-1a, 1-1b 및 1-1c). 따라서, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 각각 검출할 수 있었다.
도 4(비교예 1-2)~9(비교예 1-7)의 결과로부터 명확한 바와 같이, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레 사이에서 농도(카피수)의 차가 있었던 경우, 가장 고농도(400카피/μL)로 존재하고 있는 것 유래의 형광 강도의 증대는 확인되었지만, 가장 저농도(4카피/μL)로 존재하고 있는 것 유래의 형광 강도의 증대는 확인되지 않았다.
도 4(비교예 1-2)~9(비교예 1-7)로부터, 종래법(특허문헌 4의 방법)에서는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레에 있어서, 농도(카피수)의 차가 있었던 경우, 이들을 적절히 검출할 수 없는 것을 알 수 있었다. 환언하면, 종래법(특허문헌 4의 방법)에서는, 위음성이 발생해 버릴 가능성이 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 3. 프라이머 세트 3에 있어서의 각 프라이머쌍의 농도의 검토>
실시예 1에 있어서의 프라이머 세트 3을 구성하는 각 프라이머쌍의 최적 농도의 검토를 행했다.
(1) 프라이머 세트
실시예 1에서 이용한 프라이머 세트 3을 이용했다.
단, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍에 있어서, 배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 5' 말단을 표지 물질(TAMRATM)로 표지했다.
마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍에 있어서, 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머의 5' 말단에 링커(아데닌 (A)-아데닌 (A))를 부가하고, 또한 그 5' 말단을 표지 물질(TAMRATM)로 표지했다.
또, 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 있어서, 배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머의 5' 말단에 링커(아데닌 (A)-아데닌 (A))를 부가하고, 또한 그 5' 말단을 표지 물질(TAMRATM)로 표지했다.
또한, 내부 컨트롤(바실루스·서브틸리스) 검출용 프라이머쌍(포워드 프라이머: 배열 번호 21로 나타나는 염기 배열, 리버스 프라이머: 배열 번호 22로 나타나는 염기 배열)을 당해 프라이머 세트 3과 합하여 이용했다.
(2) 주형 DNA의 조제
실시예 1의 (2)와 동일하게 하여, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 DNA를 각각 조제했다.
(3) 핵산 증폭 반응·검출
하기 표 7에 나타내는 농도의 각 프라이머쌍, 1.5mM MgCl2, 0.5mg/mL BSA, 각각 0.2mM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 60U/mL Takara Ex Taq(다카라 바이오제)를 함유하는 10mM Tris-HCl 완충액(pH8.0)을 조제하고, 이것을 PCR용 반응액으로 했다.
또한, 하기 표 7 중의 농도 비율은, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍, 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍에 있어서의 각 프라이머쌍의 농도 비율(%)을 나타낸다.
[표 7]
Figure pct00007
이어서, 상기 (2)에서 조제한 DNA를, 0.08카피/μL가 되도록 상기 PCR용 반응액 25μL에 각각 현탁하고, 이것을 PCR용 시료로 했다.
그 후, 전자동 유전자 해석 장치 뮤타스 와코 g1(후지필름 와코 준야쿠제)을 이용하고, 장치의 취급 설명서에 따라, 상기 시료를 이용한 핵산 증폭 반응(PCR) 및 전기 영동을 행했다.
(4) 결과
(3)의 결과를 도 10~12에 각각 나타낸다. 도 10~12에 있어서의 세로축은, 동일 실시예를 합계 8회 측정했을 때에 양성이 된 비율(%)을 나타낸다. 또, 가로축은, 프라이머 세트에 있어서의 각 프라이머쌍의 농도 비율을 나타낸다.
또한, 각 실시예에 있어서, 동일한 반응계로 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 검출을 행했지만, 결과에 대해서는, 도 10(마이코박테륨·투베르쿨로시스), 도 11(마이코박테륨·아비움) 및 도 12(마이코박테륨·인트라셀룰라레)로 나누어 각각 기재했다.
또, 도 10~12에 있어서의 각 플롯의 번호가 실시예 3-1~3-7 중 어느 것을 나타내는지에 대해서는, 하기 표 8에 기재하는 바와 같다.
[표 8]
Figure pct00008
도 10(실시예 3-1~3-7), 도 11(실시예 3-1~3-7) 및 도 12(실시예 3-1~3-7)로부터 명확한 바와 같이, 프라이머 세트에 있어서의 각 프라이머쌍의 농도 비율이 상승함에 따라, 양성률이 높아지는 것을 알 수 있었다.
그중에서도, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 양성률이 동등해지는 임상상 이상의 조건은, 실시예 3-7의 조건인 것을 알 수 있었다.
즉, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍의 농도 비율이 약 18%(300nM)(도 10 중의 2), 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍의 농도 비율이 약 47%(800nM)(도 11 중의 6) 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍의 농도 비율이 약 35%(600nM)(도 12 중의 6)가 되는 조건이다. 이 조건이면, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 양성률이 각각 75%로 양호한 값을 나타내는 것을 알 수 있었다.
따라서, 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍의 농도 비율을 약 18%(300nM), 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍의 농도 비율을 약 47%(800nM) 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍의 농도 비율을 약 35%(600nM)로 설정함으로써, 실제의 임상 현장에서의 사용에 적합한 것이 시사되었다.
상기 실시예 1~3 및 비교예 1의 결과로부터, 프라이머 세트 3을 이용함으로써, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 유무를 특이적으로 양호한 정밀도로 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 사이에서 농도(카피수)의 차가 있었다고 해도, 이들을 특이적으로 양호한 정밀도로 검출할 수 있는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이것을 이용한 방법, 및 그를 위한 시약 키트에 의하면, 시료 중에 존재하는 마이코박테륨속(마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레)의 농도(카피수)에 차가 있었다고 해도, 이들을 검출할 수 있다.
배열표
C: \Users\17715150\Desktop\2148PCT.txt
SEQUENCE LISTING <110> FUJIFILM Corporation <120> A primer set for detecting Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare <130> 2148PCT <150> 2019-228461 <151> 2019-12-18 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 1 acctcaccta tgtgtcgacc 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 2 aacgtctttc aggtcgagta cg 22 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 3 gtggaagggc aaaaacacc 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 4 tggaaacagg gaacaagacc 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 5 gcaggagatc catcaggaa 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 6 cacgccagac caagacga 18 <210> 7 <211> 182 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 7 acctcaccta tgtgtcgacc tgggcagggt tcgcctacgt ggcctttgtc accgacgcct 60 acgctcgcag gatcctgggc tggcgggtcg cttccacgat ggccacctcc atggtcctcg 120 acgcgatcga gcaagccatc tggacccgcc aacaagaagg cgtactcgac ctgaaagacg 180 tt 182 <210> 8 <211> 152 <212> DNA <213> Mycobacterium avium <400> 8 tggaaacagg gaacaagacc gaaccgtatt ccgggctgga ctggcgatgc gcccagtggc 60 tgcatgacca cgaggtcgcc gcggtcgcct cggacaacct gcaggtcgaa gacccggtgt 120 ccggcgtcga cggggtgttt ttgcccttcc ac 152 <210> 9 <211> 213 <212> DNA <213> Mycobacterium intracellulare <400> 9 cacgccagac caagacgatc gacgaggtct tcaccggcaa gccgctgacc accatccccg 60 tcggcacggc cgaagacgtc gaagccgcct tcgccgaggc gcgcgcggcg caggccgact 120 gggcgaaccg tccggtcagc gagcgcgtcg atgtcatcag ccggtatcgc gacctggtcg 180 tcgagaaccg cgagttcctg atggatctcc tgc 213 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 10 tgggtagcag acctcaccta t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 11 cgagtacgct ttcttgttgg 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 12 cgcacggatg tgattggta 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 13 cggagtagtg gacgaagagg 20 <210> 14 <211> 178 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 14 tgggtagcag acctcaccta tgtgtcgacc tgggcagggt tcgcctacgt ggcctttgtc 60 accgacgcct acgctcgcag gatcctgggc tggcgggtcg cttccacgat ggccacctcc 120 atggtcctcg acgcgatcga gcaagccatc tggacccgcc aacaagaagg cgtactcg 178 <210> 15 <211> 145 <212> DNA <213> Mycobacterium avium <400> 15 cgcacggatg tgattggtac atccgcattt gatgagagaa gtaagtaaat ggcacaggga 60 actgtgaaat ggttcaacgg tgaaaagggc ttcggcttca tcacccctga cgacggcacg 120 aaggacctct tcgtccacta ctccg 145 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 16 cacatgcaag tcgaacggaa agg 23 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 17 gcccgtatcg cccgcacgct caca 24 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 18 acgggatgca tgtcttgtgg tggaaagcgc tttagc 36 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 19 tttaggcgca tgtctttagg tggaaagctt 30 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe <400> 20 tcaagacgca tgtcttctgg tggaaagctt ttgc 34 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 21 cgcaatagag ggaagtggtt cc 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 22 cagcctccat aaggcttagc c 21

Claims (6)

  1. (i) 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍,
    (ii) 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍
    및
    (iii) 배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍을 포함하는, 프라이머 세트.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 (i), (ii) 및 (iii)의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이, 각각 표지 물질로 표지되어 있는 것인, 프라이머 세트.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 표지 물질이, 형광 물질, 방사성 동위체 또는 효소로부터 선택되는 것인, 프라이머 세트.
  4. 청구항 1에 기재된 프라이머 세트를 이용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 핵산 증폭 반응을 행하고, 얻어진 핵산 증폭 산물을 검출함으로써 이루어지는, 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 또는/및 마이코박테륨·인트라셀룰라레의 검출 방법.
  5. (i) 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·투베르쿨로시스 검출용 프라이머쌍,
    (ii) 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·아비움 검출용 프라이머쌍
    및
    (iii) 배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 포워드 프라이머와 배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 마이코박테륨·인트라셀룰라레 검출용 프라이머쌍을 포함하는, 시약 키트.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 (i), (ii) 및 (iii)의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이, 각각 표지 물질로 표지되어 있는 것인, 시약 키트.
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