JP2003519466A - テロメラーゼ（ｈＴＣ）ｍＲＮＡおよび特異的プライマーおよびプローブに基づいたガンを検出するための自動化可能な迅速な試験 - Google Patents

テロメラーゼ（ｈＴＣ）ｍＲＮＡおよび特異的プライマーおよびプローブに基づいたガンを検出するための自動化可能な迅速な試験

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、テロメラーゼ（hTC） mRNAに基づきガンを検出するための自動化可能な迅速な試験、該試験に適するスターターヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドプローブ、対応する試験法および試験キットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、テロメラーゼ（hTC）mRNAに基づいたガンを検出するための自動化
可能な迅速な試験、この試験のための適当なスターター(starter)ヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチドプローブ、および対応する検出法および試験キットに
関する。
【０００２】 真核細胞の遺伝物質は、線状の染色体に分布している。このような遺伝単位の
末端は、ギリシャ語のテロス(telos：末端）およびメロス（meros：部分または
セグメント）に由来してテロメアと称する。ほとんどのテロメアは、チミンおよ
びグアニンから主に構築される短い反復配列から成る（Zakian,1995）。関連す
る生物のテロメア配列はしばしば類似し、そしてこれらの配列は進化系統樹的に
より離れている種間でも保存されている。テロメアは、これまで調査されたすべ
ての脊椎動物において配列TTAGGGから構築されているという事実は注目すべきで
ある（Meyne et al.,1989）。
【０００３】 テロメアは様々な重要な機能を発揮する。テロメアは染色体の融合を防止し（
McClintock,1941）、その結果、二中心性(dicentric)遺伝単位の形成を阻止する
。２つのセントロメアを保有するこの染色体の性質は、ヘテロ接合性の喪失ある
いは遺伝子の重複または損失からガンの発症を導き得る。
【０００４】 さらにテロメアは損傷した遺伝単位から完全な遺伝単位を識別する目的に役立
つ。すなわち酵母細胞は、テロメアを欠いた染色体を宿す時、分裂を止める（Sa
ndell and Zakian,1993）。
【０００５】 テロメアは、真核細胞においてDNA複製と関連して別の重要な仕事を行う。原
核細胞の環状ゲノムとは対照的に、真核細胞の線状の染色体はDNAポリメラーゼ
複合体により完全に複製されることができない。RNAプライマーがDNA複製を開始
するためには必要である。RNAプライマーが排除され、そしてオカザキ フラグメ
ントが延長され、そして連結された後、新たに合成されたDNA鎖はRNAプライマー
が５'末端の点でDNAより置き換わることができないので5'末端を欠く。この理由
から特別な保護的メカニズム無しで、染色体は細胞分裂毎に縮む（「末端−複製
の問題」；Harley et al.,1990）。非コードテロメア配列は、おそらく遺伝子の
損失を防止するための緩衝ゾーンを表すのだろう（Sandell and Zakian,1993）
。
【０００６】 さらにこの上に、テロメアは細胞の老化の調節に重要な役割を演じている（Ol
ovinkov,1973）。ヒトの体細胞は培養に於いて複製能力に限界を表し；特定の期
間の後に細胞は老化する。この状況において、細胞はたとえ成長因子により刺激
されたとしてももはや分裂しない：しかし細胞は死なず、代謝的には活性なまま
である（Goldstein,1990)。種々の観察から、細胞はそのテロメアの長さから細
胞が何回分裂できるかを決定するという仮説が支持されている（Allsopp et al.
,1992）。
【０００７】 まとめると結局、テロメアは細胞の老化および遺伝物質の安定化およびガンの
防止に中心的な機能を有する。酵素テロメラーゼはテロメアを合成する 上記のように、線状の染色体を有する生物は特別な保護メカニズム無しではそ
れらのゲノムを不完全に複製できるだけである。ほとんどの真核生物は特別な酵
素、すなわちテロメラーゼを使用してテロメア配列を再生する。テロメラーゼは
これまで調査された単細胞の生物中で構成的に発現される。対照的に、ヒトでは
テロメラーゼ活性は生殖細胞および腫瘍細胞中でのみ検出されたが、隣接する体
組織はいかなるテロメラーゼも含まなかった（Kim et al.,1994）。ヒトの腫瘍におけるテロメラーゼの活性化 ヒトでは、最初はテロメラーゼ活性を生殖細胞系においてのみ示すことが可能
であり、正常な体細胞では可能ではなかった（Hastie et al.,1994；Kim et al.
,1994）。より高感度な検出法が開発された後（Kim et al.,1994）、低レベルの
テロメラーゼ活性が造血細胞中でも検出された（Broccoli et al.,1995；Counte
r et al.,1995；Hiyama et al.,1995）。しかしこれらの細胞は、それにもかか
わらずテロメアにおける減少を現した（Vaziri et al.,1994；Counter et al.,1
995)。このような細胞中の酵素の量がテロメア損失を補償するために不十分であ
るのかどうか、あるいは測定されたテロメラーゼ活性が副次集団、例えば不完全
に分化したCD34+38+前駆体細胞に由来するのかどうかは、明らかにされなかった
（Hiyama et al.,1995）。この点を明らかにするために、単細胞中に存在したテ
ロメラーゼ活性を検出することが必要であった。
【０００８】 しかし興味深いことには、有意なテロメラーゼ活性が今日までに試験した多数
の腫瘍組織中で検出されたが（1734/2031、85％；Shay,1997）、正常な体組織で
活性は見いだされなかった（1/196、＜１％，Shay,1997）。さらに様々な調査で
、テロメアはウイルスのガンタンパク質で形質転換させた老化細胞中では収縮し
続け、そして成長の危機に生き残った副次集団中にテロメラーゼを見いだすこと
のみが可能であることが示された（Counter et al.,1992）。テロメアはこのよ
うな不死化細胞中でも安定であった（Counter et al.,1992）。マウスにおける
調査で導かれた同様な知見は（（Blasco et al.,1996）、テロメラーゼの再活性
化が腫瘍の再生の後期の出来事であるという仮定を支持している。
【０００９】 テロメラーゼ、そして特にヒトの触媒的テロメラーゼサブユニットおよびその
配列に関する詳細は、国際公開第98/14592号明細書（ゲノン社：Genon Corp）お
よび国際公開第98/59040号明細書（バイエル社：Bayer AG）に与えられている。 ガンを診断するためのテロメラーゼmRNAの検出 このような結果に基づき、テロメア配列の損失および細胞の加齢をテロメラー
ゼ活性およびガンの新生と関連づける「テロメラーゼ仮説」が生まれた。ヒトの
ような長く生きる種では、テロメアの収縮は腫瘍抑制メカニズムと見なすことが
できる。いかなるテロメラーゼも含まない分化した細胞は、テロメアが特定の長
さに達した時に分割を止める。そのような細胞が突然変異する場合、腫瘍は細胞
がテロメアを延長することができる場合にのみ細胞から発生することができる。
そうでなければ細胞はその染色体が不安定になり、そして最終的には死ぬまでテ
ロメア配列を失い続けるだろう。テロメラーゼの再活性化はおそらく、腫瘍細胞
がそれらのテロメアを安定化させるために配備する主要なメカニズムであろう。
【００１０】 このような考察および考えから、上昇したテロメラーゼの発現により腫瘍を診
断することが可能なはずである。テロメラーゼ活性は今日までに試験したほとん
ど全ての腫瘍組織で検出されたので、全ての種類のガンを診断するための遺伝子
試験を使用することが可能であう。この遺伝子試験はガン性の疾患の進行をモニ
タリングするために特に適しているが、予後試験としても、または特定のガン性
疾患の初期診断のためにも使用することができる。
【００１１】 遺伝子プローブ診断は特に増幅技術と組み合わせて、特別な遺伝子、遺伝子フ
ラグメントまたはDNA/RNAレベルでの１つの突然変異の早期の同定を可能とする
迅速で特異的で、しかも高度に感受性のある方法である。この技法は調査する材
料で直接行うことができる。これはDNA/RNAハイブリダイゼーション技法、すな
わちワトソン−クリック塩基対を形成する相補的な１本鎖核酸の特異的なインビ
トロ結合に基づく。形成したDNA/DNAまたはDNA/RNA二重鎖も、DNAハイブリッド
と呼ぶ。ハイブリダイゼーション反応による特異的なDNAまたはRNAの検出のため
に、相補的な配列−特異的遺伝子プローブを使用する。これらの遺伝子プローブ
は短く、化学的に合成された10〜200ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチ
ドプローブである。
【００１２】 光化学的に（N.Dattagupta,P.M.M.Rae,E.D.Huguenel,E.Carlson,A.Lyga,J.S.S
hapiro,J.P.Albarella,Analytical Biochem.177,85,1989）またはニックトラン
スレーションにより酵素的に(Rigby,P.W.J.et al.,J.Mol.Biol,113,237,1977)、
あるいはランダムプライマー（random primed）技法（Feinberg and Vogelstein
,Anal.Bioche,.132,6,1983）により、遺伝子プローブに放射活性または非放射活
性標識を提供することができる。この目的に適するのは、32P NTPを用いた標識
またはジゴキシゲニン-dUTP、ビオチン-dUTPを用いた非放射活性標識、あるいは
アルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素を用
いた直接標識である。
【００１３】 検出すべき核酸と特異的遺伝子プローブとの間の特異的なハイブリダイゼーシ
ョンについては、核酸を最初に変性（熱またはアルカリ処理）により１本鎖に分
離し、そして次いで温度、バッファーのイオン強度および有機溶媒により達成さ
れる緊縮条件下で大変特異的に一緒にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼー
ション条件が適当である時、遺伝子プローブは検出されるべきDNAまたはRNAの相
補的配列にのみ結合する。このハイブリダイゼーション反応は、例えばニトロセ
ルロースに結合した標的DNAまたは遺伝子プローブのような例えば支持体上の固
相ハイブリダイゼーションまたは液体ハイブリダイゼーションのような様々な試
験形式で行うことができる。評価（読みとり）は、上記のようなレポーター分子
で標識された遺伝子プローブの標識を介して、またはジゴキシゲニン-dUTPを用
いて増幅中に標識される標的DNAおよび磁気粒子に結合するためのフルオレセイ
ンで標識した遺伝子プローブを介して本明細書に記載する逆相-ハイブリダイゼ
ーション系で行う。標的DNAおよび標識した遺伝子プローブから成るハイブリダ
イゼーション複合体を、非結合遺伝子プローブを除去した後に、使用したレポー
ター分子を介して定量的に測定する。この読み取りは、蛍光標識または放射性標
識の場合は直接的に、あるいは酵素アッセイおよびアルカリホスファターゼのよ
うな酵素を用い、そして次いで発色反応または化学発光反応を可能とする抗体結
合物を用いた免疫学的法により間接的に行うことができる。
【００１４】 遺伝子プローブ診断を用いた試験感度は、１つの遺伝子の検出に基づき105〜1
06コピーの範囲である。この試験感度は、PCR（欧州特許第200362号明細書）、L
CR（欧州特許第320308号明細書）、NASBA（欧州特許第329822号明細書）、QB（P
CT87/06270号明細書）またはHAS技法（欧州特許第427074号明細書）のようなDNA
またはRNA増幅法を組み合わせることにより上げることができる。これらの技法
により、検出すべきDNAの109−倍の倍増度まで達成することが可能である。増幅
およびハイブリダイゼーションの組み合わせは、１つのDNA分子を検出すること
を可能とする。
【００１５】 本発明はさらに、ヒトの触媒的に活性なテロメラーゼサブユット（hTC）のmRN
Aを増幅そして検出するためのプライマーおよびプローブに関する。ヒトの触媒
的テロメラーゼサブユット（hTC）は国際公開第98/59040号明細書に記載され、
これは引用により本明細書に編入する。 −精製された状態のオリゴヌクレオチドは、hTCのmRNAの10〜500ヌクレオチドの
非中断(uninterrupted)配列と同一または正に相補的な配列を有する。 −そのようなオリゴヌクレオチドは、特にオリゴデオキシリボヌクレオチドまた
はオリゴリボヌクレオチドまたはペプチドヌクレオチド酸（PNA）であることが
できる。 −好ましくはＴ-モチーフ領域、５'領域および３'領域に由来するテロメラーゼ
のhTC mRNAと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。 −タンパク質hTCまたはこのタンパク質のフラグメントをコードするDNA配列また
はこの配列の縮重配列、あるいは標準的なハイブリダイゼーション条件下でDNA
配列にハイブリダイズするDNA配列。 −hTCまたはhTCのフラグメントとハイブリダイズするDNA配列またはこの配列の
縮重配列を含んで成る組換えポリヌクレオチドプローブ。
【００１６】 本発明はさらに患者の新生物疾患を検出するための方法に関し、特に細胞また
は細胞サンプル中のhTCタンパク質の存在を同定するための方法に関し、この方
法はhTCポリヌクレオチドの増幅またはhTCポリヌクレオチドのハイブリダイゼー
ション、プライマーまたはhTCポリヌクレオチドとのhTC−相補的配列に基づく。 この場合、この方法は以下の工程を含んで成る： Ａ．診断的値を得るために、細胞サンプル中にhTC mRNAを検出し； Ｂ．診断的値を試験サンプルと同じ種類の非−新生物細胞中のhTC mRNAの標準値
と比較し； Ｃ．標準的な比較値よりもかなり高い診断値は、新生物状態を示す。
【００１７】 本発明はさらに上記の試験原理に基づき、細胞サンプルおよび体液中のhTC mR
NAを検出するための試験キットに関する。この試験キットは好ましくはガン性疾
患を診断するために使用する。
【００１８】 試験キットは、特に： １対のヒトhTC ポリヌクレオチドPCRプライマーから成る組成物、このプライマ
ーは好ましくはヒトhTC mRNAの配列に相当するか、この配列に相補的な配列から
成り、かつ／またはヒトhTC遺伝子のポリヌクレオチドハイブリダイゼーション
プローブを含んで成る組成物、 このプローブはヒトhTC mRNAの配列に相当する
か、この配列に相補的な20〜36、例えば30の連続するヌクレオチドを含んで成る
、 を含んで成る。
【００１９】 オリゴ−またはポリ核酸の場合、機能的均等物はヌクレオチド配列は異なるが
同じタンパク質をコードする化合物を意味すると考える。これは例えば縮重した
遺伝子暗号の結果である。
【００２０】 本発明は特に、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号
７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０から成る群から選択されるヌク
レオチド配列を含んで成るスターターオリゴヌクレオチドに関する。
【００２１】 このスターターオリゴヌクレオチドは、好ましくは適当な対、すなわち以下の
セットで使用する： 配列番号１によるヌクレオチド配列を含んで成るスターターオリゴヌクレオチ
ドおよび配列番号２によるヌクレオチド配列を含んで成るスターターオリゴヌク
レオチドのセット。
【００２２】 配列番号４によるヌクレオチド配列を含んで成るスターターオリゴヌクレオチ
ドおよび配列番号５によるヌクレオチド配列を含んで成るスターターオリゴヌク
レオチドのセット。
【００２３】 配列番号７によるヌクレオチド配列を含んで成るスターターオリゴヌクレオチ
ドおよび配列番号８によるヌクレオチド配列を含んで成るスターターオリゴヌク
レオチドのセット。
【００２４】 配列番号９によるヌクレオチド配列を含んで成るスターターオリゴヌクレオチ
ドおよび配列番号１０によるヌクレオチド配列を含んで成るスターターオリゴヌ
クレオチドのセット。
【００２５】 本発明はさらに、配列番号３、配列番号６および配列番号１１から成る群から
選択されるヌクレオチド配列を含んで成り、場合により標識されたオリゴヌクレ
オチドプローブに関する。
【００２６】 本発明はさらに、 ａ）サンプル中で、テロメラーゼ（hTC）mRNAを請求項１に記載の１以上のスタ
ーターオリゴヌクレオチドを使用して増幅させ、そして ｂ）増幅結果を評価する、 ことを特徴とする、テロメラーゼ活性の上昇を検出する方法に関する。
【００２７】 本発明はさらに、１以上のスターターオリゴヌクレオチドを含む、テロメラー
ゼ活性の上昇を検出するための試験キットに関する。
【００２８】 本発明は、hTC−特異的mRNAに基づきガン性の疾患を検出するための自動化可
能な遺伝子試験を記載する。これまでに記載されたテロメラーゼのRNA成分に基
づくin situ試験は、腫瘍−特異的相関が顕著ではないことが欠点であった。TRA
P試験（Kim et al.,Science,266,2011-2015,1994）は、種々の悪性腫瘍中でテロ
メラーゼ活性が上昇することを示した。しかしこの試験の特異性および感度は、
これまで十分ではなく、しかも予防的または診断的使用には適切ではない（例え
ば膀胱ガンについて）。
【００２９】 本発明は、長さおよび配列および完全に自動化された読み取りに関して至適化
された特別な特異的プライマーを使用することにより、形成されたテロメラーゼ
アンプリコンの量を化学発光試験または比色試験を介して直接的に測定すること
を可能とし、このアンプリコンがテロメラーゼ発現またはテロメラーゼ活性の直
接的尺度として役立つという利点を有する。 hTCテロメラーゼが明らかにテロメ
ラーゼの触媒活性において律速段階であるので、この試験は核酸レベルで腫瘍組
織とテロメラーゼ活性との間の直接的相関を提供する。すなわち胃、腸、肺、胸
、卵巣、前立腺およびメラノーマおよび骨肉腫における種々の腫瘍は、強力に上
昇したテロメラーゼ値を示すことができ：対照的に肺、脳、腎臓、腸および血液
のような正常組織では、シグナルがほとんど検出されなかった。
【００３０】 RNA検出プローブをDNA/RNA抗体と組み合わせて使用することにより、さらにア
ンプリコンのシグナル強度を10の因子まで、そして通例のDNA試験と比べた試験
の感度を10〜100の因子まで増加させることが可能である。この理由から、必要
な試験材料の量をかなり減らし、そして試験にわずかな材料しか利用できない時
でもかなり強いシグナルのために、試験結果の信頼性をかなり向上させることが
可能であった。すでに開発された工程の自動化は、多数のサンプル（＞100）の
読み取りを20分以内で可能にする。
【００３１】 本発明は、hTC mRNAに基づきテロメラーゼ発現を迅速に検出するための特異的
プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにそれらの使用を記載す
る。実施例５および６に記載する方法に従い、磁気ビーズを用いた読み取りは、
例えばImmunol I バイエル ダイアグノスティックス（Bayer Diagnostics）、タ
リータウンを使用して試験を自動的に行うことを可能とする。記載したプライマ
ーおよびプローブを使用して、試験はTaqmanまたはLightcyclerでも行うことが
できる。
【００３２】 さらにこの試験は、多くのサンプル材料（例えばスメア）の細胞分析に、たと
えin situハイブリダイゼーションであっても特に適している。 I．プライマーはテロメラーゼ遺伝子の遺伝子配列から化学合成により調製した
。
【００３３】 本発明は、配列プロトコールに掲げた配列１−１１に従い、Ｔ−モチーフ領域
、開始コドンの5'-領域上流およびスプライス変異体の3'領域に由来する15〜40
（例えば15〜30）ヌクレオチドの長さを有するプライマーおよびプローブに関す
る。
【００３４】 好適なプライマーは以下の領域から選択した； ａ）テロメラーゼＴモチーフに特異的（プライマー１＋２ 配列番号１＋２） ｂ）5'領域（プロモーター領域）に特異的（プライマー４＋５ 配列番号４＋５
） ｃ）スプライス変異体を持つ3'スプライス領域に特異的（プライマー７＋８ 配
列番号７＋８または９＋１０）。 II．オリゴヌクレオチドプローブは、化学合成により調製した。 III．mRNAは特別なRNA単離法により臨床的サンプルから単離した。 IV．hTC mRNAの部分の増幅は、Ｔモチーフ、プロモーター領域またはスプライス
変異体領域から特異的プライマーを使用して行った。 V．アンプリコンの検出には、増幅したヌクレオチド領域にハイブリダイズする
補足プローブを使用する。 VI．増幅は既知の増幅技法、好ましくはRT-PCR増幅法（米国特許第5322770号明
細書）により行った。 VII．特異的な増幅生成物が以下により検出された ａ）アガロースゲル中での増幅生成物の直接的な電気泳動、そして臭化エチジウ
のようなインターカレート剤による染色による。 ｂ）増幅中に蛍光ヌクレオチドまたは蛍光−標識プライマーにより標識された増
幅生成物の蛍光を測定することによる。増幅生成物はさらに取り込まれたビオチ
ンを介して分離される（プライマーまたはヌクレオチド）。 ｃ）および好ましくは増幅中に、上記のフルオレセイン−標識オリゴヌクレオチ
ドプローブを用いて標識された（例えばジゴキシゲニンd-UTP）増幅生成物のハ
イブリダイゼーションにより検出する。ハイブリダイゼーション複合体は、フル
オレセイン抗体−コート磁気粒子により分離する。 ｄ）テロメラーゼ発現の尺度として形成されたハイブリダイゼーション複合体、
そしてすなわちテロメラーゼ活性の評価は、アルカリホスファターゼに結合した
抗ジゴキシゲニン抗体、およびアンプリコンに取り込まれたジゴキシゲニンとの
反応を用いた化学発光試験を使用して行う。
【００３５】 試験は各々の場合で、試験組織mRNAの混合物および正常な対照組織mRNAの混合
物を用いて行う。正常なテロメラーゼ遺伝子発現の場合は、特異的プライマーを
用いた増幅はわずかなアンプリコン、したがって小さい化学発光シグナルしか与
えない。新生物組織の場合は大量のアンプリコンが形成され、強い化学発光シグ
ナルを与える。
【００３６】 この試験の最大の利点は、増幅後にテロメラーゼmRNA濃度の上昇があるかどう
かを直接決定でき、この試験は自動化することができ、１回の増幅工程だけであ
るので大変迅速でしかもより少ない労働力および経費的様式で行うことができる
点にある。 プライマーの選択および合成 増幅生成物用の特異的プライマーのセットは、hTCテロメラーゼ遺伝子に特異
的であり、そして他のRTモチーフまたは他のRT配列との相同性を持たないテロメ
ラーゼ遺伝子の領域から選択した。配列番号１、２、４、５、７、８、９、１０
の配列を有するプライマーを合成し、これは特異的な増幅生成物をもたらす。適
当なプライマーは好ましくは15〜25塩基対、特に好ましくは17〜20塩基対を有す
る。
【００３７】 選択したプライマーは、S.L.Beaucage and M.Caruthers.Tetrahedron Letters
.22.1859,1981のホスホロアミダイト法により合成した。 オリゴヌクレオチドプローブの選択および合成 プライマーのセットの増幅生成物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、
hTCテロメラーゼ遺伝子に特異的であり、そして他のRTモチーフまたは他のRT配
列との相同性を持たず、そして他のRTモチーフまたは他のRT配列とハイブリダイ
ズしないテロメラーゼ遺伝子の領域から選択した。増幅生成物に特異的な配列番
号３、６、１１の配列を有する30〜36merを合成した。
【００３８】 適当なプローブは好ましくは20〜36塩基対、特に好ましくは25〜36、そして大
変特別に好ましくは30〜36塩基対の長さを有する。
【００３９】 適当なプローブは25〜30塩基対の長さを有することができる。
【００４０】 化学合成は、S.L.Beaucage and M.Caruthers.Tetrahedron Letters.22.1859,1
981のホスホロアミダイト法により行った。 hTCテロメラーゼに由来するmRNAの増幅 ヒトのテロメラーゼのmRNA配列の増幅には、ヒトのテロメラーゼmRNAの特異的
RT増幅のために、上記プライマーを各々の場合でプライマーのセットとして（プ
ライマー１＋２）、（プライマー４＋５）または（プライマー７＋８、９＋１０
）を使用した。それらはアガロースゲルにおいて、新生物細胞中のmRNAと可視の
増幅生成物を生じる。
【００４１】 RTPCRでは、４種のdNTP（デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン
三リン酸、デオキシシチジン三リン酸およびチミジン三リン酸）だけでなく、例
えばジゴキシゲニン-dUTPを増幅生成物に取り込むことが可能である。これは例
えばAMPPDを基質とした化学発光試験またはpNPPを用いた色素試験を介して、ア
ルカリフォスファターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体を用いた増幅生成物の
評価を可能とする。
【００４２】 別の可能性は、例えばフルオレセイン-dUTPまたはクマリン-dUTPのような蛍光
−標識ヌクレオシド三リン酸を増幅生成物に取り込み、そして臭化エチジウムよ
りもはるかに感度が高い増幅生成物を同定することである。ビオチン化プライマ
ーを使用して、この蛍光−標識したビオチン化増幅生成物を、ストレプトアビジ
ン−コート磁気粒子を介して取り出し、そして蛍光光度計で定量的に測定するこ
とが可能である。好ましくは本発明ではDNA補足プローブおよびジゴキシゲニン-
標識増幅生成物を使用する。補足プローブおよび検出プローブとして役立つフル
オレセイン-標識RNAプローブの状態で使用することも可能である。DNA/RNA抗体
を使用したこの遺伝子試験を用いて達成できる感度は、他の標的についての今日
の通例の遺伝子試験よりも明らかに良く、そして試験を行うために必要な出発材
料は大変少ない。 テロメラーゼ発現の検出 テロメラーゼ発現の検出 テロメラーゼの発現レベルは、htC mRNAの部分の増幅後に本発明に記載するプ
ライマーのセットにより任意の分析法を使用して、直接測定することができる。
【００４３】 １つの可能な読み取り法は、アガロースゲル電気泳動により分離した増幅生成
物を、臭化エチジウムのような挿入剤で染色することである。
【００４４】 別の可能性は蛍光−標識ヌクレオシド三リン酸を増幅生成物に取り込むことで
ある。これは試験の感度に明らかな改善を達成する。
【００４５】 さらなる可能性は、増幅用の蛍光−標識プライマーを使用すること、または末
端をビオチン化した蛍光−標識増幅生成物を生じ、そしてストレプトアビシン−
結合磁気粒子と結合させ、そして分離させることができ、そして蛍光を半定量的
に測定することができるようにビオチン化プライマーと蛍光ヌクレオシドを組み
合わせることである。
【００４６】 最も感度があり、しかも好適な方法は、増幅生成物と記載したオリゴヌクレオ
チドプローブとの記載したハイブリダイゼーション法である。例えば増幅中のジ
ゴキシゲニン-dUTPの取り込み、およびビオチン化または蛍光化オリゴヌクレオ
チドプローブの使用で、ハイブリダイゼーション複合体をストレプトアビシン／
フルオレセイン抗体コート磁気粒子で分離し、そしてアルカリホスファターゼに
結合した抗ジゴキシゲニン−抗体の使用で、基質としてAMPPDまたはCSPDを用い
た化学発光を介して半定量的に評価する。別の方法はマーカー分子を取り込まな
い増幅、そしてフルオレセイン−標識補足(captured)プローブおよび検出プロー
ブとしてさらなるRNAプローブとの、あるいは１つのフルオレセイン−標識RNA補
足および検出プローブとのハイブリダイゼーションによるアンプリコンの検出で
ある。この場合のハイブリダイズしたアンプリコンの検出は、DNA/RNA抗体を用
いて行う。この読み取りは高い感度をもたらし、そして自動Immuno Iおよびそれ
に続く装置において自動化された方法に特別に開発された。
【００４７】
【実施例】実施例１ スターターオリゴヌクレオチド（プライマー）の合成 選択したスターターオリゴヌクレオチド（プライマー）は、S.L.Beaucage and
M.Caruthers.Tetrahedron Letters.22.1859,1981のホスホロアミダイト法によ
り化学的に合成した。以下のヌクレオチド配列を合成した： テロメラーゼモチーフの検出： PCRプライマー１：配列番号１ PCRプライマー２：配列番号２ ５'領域の検出： PCRプライマー４＋５：配列番号４＋５ ３'領域の検出： PCRプライマー７＋８：配列番号７＋８ PCRプライマー９＋１０：配列番号９＋１０実施例２ オリゴヌクレオチドプローブの合成および選択 オリゴヌクレオチドプローブは、各々の場合で異なるプライマーセットの増幅
した配列を含むヌクレオチド領域から選択した。選択したオリゴヌクレオチドプ
ローブの化学合成は、S.L.Beaucage and M.Caruthers.Tetrahedron Letters.22.
1859,1981のホスホロアミダイト法により行った。 Ｔモチーフ領域：プローブ３ 配列番号３ ５'領域：プローブ６ 配列番号６ ３'領域：プローブ１１ 配列番号１１ 補足プローブは３'末端でBollum、酵素（The enzyme)、Boyer編集、第10巻、
第145頁、アカデミック出版（Academic Press）、ニューヨークの方法により標
識した。末端基の標識は、フルオレセイン-dUTPを用いて非放射的に行った（Cha
ng L.M.S.,Bollum T.J.,J.Biol.Chem.246,909、1971)。
【００４８】 10mlの反応バッファー（カコジル酸カリウム １モル/リットル；Tris/HCl 125
ミリモル/リットル；ウシ血清アルブミン 1.25mg/ml；pH 6.6：25℃）１〜２mg
のオリゴヌクレオチド、25単位のターミナルトランスフェラーゼ、CoCl2 2.5ミ
リモル/リットルおよび１mlのフルオレセイン-dUTP（１ミリモル/リットル）と
の50ml混合物で、約50％の３'標識が37℃で60分後に達成される。実施例３ RT-PCR法によるテロメラーゼ−特異的増幅 （Titan One Tube RT-PCシステム） mRNAまたは全RNAを希釈し、そして100ng、50ngおよび25ng(10μl)の濃度で使
用した。次いでサンプルを最初に加え、そして調製したミキサーを加えた（50μ
lの総容量/試験管）。DNAの混入を検査するために、酵素ミックスをTaqポリメラ
ーゼに置き換えた。 ミックス１ １μlのPCRヌクレオチドミックス（10mM） 200ngの前方プライマー（0.4〜１μm） 200ngの逆プライマー（0.4〜１μm） 2.5μlの100mM DTT 0.2μlのRNAsine（20単位） ２μlのMgCl2（25mM） 1.5μlのDig dUTP dil.1:10（25nM） 二重蒸留水、加えて15μl ミックス２ 10μlの５×RT-PCRバッファー 1.5μlの酵素ミックス、二重蒸留水、加えて25μl RNA(10μl)の希釈を含むPCR試験管を準備する。 各々の場合で25μlのミックス２＋15μlのミックス１を加える。 ＴモチーフのPCRプロフィール： 20'58℃/2'94℃//30"94℃ 1'54℃ 1'68℃ 30サイクル 7'68℃/4℃ ベーリンガー（Boehringer)：注文番号 1855476実施例４ 増幅生成物の直接的評価 DNA増幅生成物の直接的評価には、インターカレート剤である臭化エチジウム
を増幅後に使用した。
【００４９】 またビオチン-dUTPまたはジゴキシゲニン-dUTPを使用して、そして色素の読み
取りを酵素−結合アルカリホスファターゼを用いて行うことも可能である。また
、より低い感度には、適当に蛍光標識したプライマーを使用することも可能であ
る。
【００５０】 増幅生成物は0.8％アガロースゲルに乗せ、そして100mAで30分間、電気泳動し
た。蛍光シグナルはUVトランスイルミサーター下で直接評価した。実施例５ RT増幅生成物に関する遺伝子プローブ試験 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)(欧州特許第200362号明細書）、LCR（欧州特許第
320308号明細書）および遺伝子プローブ技法のような適当な標的増幅法を組み合
わせることにより、通例の遺伝子プローブ読み取り法に比べて感度に有意な上昇
を達成する。
【００５１】 液体ハイブリダイゼーション試験は、100ngのジゴキシゲニン化したアンプリ
コンおよび実施例３に従い蛍光化補足プローブを50μlの容量で用いて行った。
【００５２】 100℃で10分間加熱し、その後に０℃に冷却した後、50μlの２×ハイブリダイ
ゼーションミックス（50mlの20×SSC、１gのブロッキング剤（ベーリンガー）、
２mlの10％濃度のラウロイルサルコシン、200mlの20％濃度のSDSに二重蒸留した
H2Oを加えて100mlとした）を加え、そして37℃で５〜10分間ハイブリダイズした
（オリゴヌクレオチドプローブ）。磁気ビーズを１×ハイブリダイゼーションミ
ックスで前処理し、そして液体はマグネットを用いて分離した後にピペットで除
き、ハイブリダイゼーション混合物および100μlの１×ハイブリダイゼーション
ミックスを加え、そして混合物をゆるやかに撹拌しながら室温で５〜10分間イン
キューベーションした。結合したハイブリダイゼーション複合体をビーズを用い
て分離し、そして残る液体をピペットで除き、そして複合体をバッファーＢ（0.
1SSC：0.1％SDS）で１回洗浄した。
【００５３】 化学発光を介してハイブリダイゼーションを検出するために、ブロッキング反
応および抗体反応を続いて行った。DNAを付加したビーズを１×500μlのバッフ
ァー２（0.1M リンゴ酸；0.15M NaCl pH7.5；１％ブロッキング剤（ベーリンガ
ー））を用いて加えた。室温で５分間インキューベーションした後、分離し、ピ
ペットで取り出し、そして250μlの抗体結合溶液（バッファー２中のab１：2 50
0）を加え、そして室温で10分間インキューベーションし、次いで分離し、そし
てピペットで取り出し、そして500μlの洗浄バッファーで30秒間、２回、１×２
分間、ゆるやかに撹拌しながら処理した。次いでAMPPD 1:100（バッファー３中
）を含む検出溶液で37℃にて10分間インキューベーションし、そして次いで発光
光度計で477nmにて化学発光を測定した（ルマック(Lumacからの)Lumacounter）
。実施例６ DNA/RNA抗体読み取りを用いたDNA増幅生成物に関する遺伝子プローブ試験 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)（欧州特許第200362号明細書）、LCR(欧州特許第
320308号明細書）およびプローブ法のような適当な標的増幅法の組み合わせで、
通例の遺伝子プローブ読み取り法に比べて感度に有意な上昇を達成する。
【００５４】 液体ハイブリダイゼーション試験は、フルオレセイン-標識したRNAプローブお
よび実施例３に従い増幅したDNAを用いて50μlの容量で行った。
【００５５】 100℃で10分間加熱し、その後に０℃に冷却した後、50μlの２×ハイブリダイ
ゼーションミックス（50mlの20×SSC、１gのブロッキング剤（ベーリンガー）、
２mlの10％濃度のラウロイルサルコシン、200mlの20％濃度のSDSに二重蒸留した
H2Oを加えて100mlとした）を加え、そして37℃で５〜10分間ハイブリダイズした
（オリゴヌクレオチドプローブ）。磁気ビーズを１×ハイブリダイゼーションミ
ックスで前処理し、そして液体はマグネットを用いて分離し後にヒペットで除き
、ハイブリダイゼーション混合物および100μlの１×ハイブリダイゼーションミ
ックスを加え、そして混合物をゆるやかに撹拌しながら室温で５〜10分間インキ
ューベーションした。結合したハイブリダイゼーション複合体をビーズを用いて
分離し、そして残る液体をピペットで除き、そして複合体をバッファーＢ（0.1S
SC：0.1％SDS）で１回洗浄した。
【００５６】 化学発光を介してハイブリダイゼーションを検出するために、ブロッキング反
応および抗体反応を続いて行った。付加したビーズを１×500μlのバッファー２
（0.1M リンゴ酸；0.15M NaCl pH7.5；１％ブロッキング剤（ベーリンガー））
を用いて加えた。室温で５分間インキューベーションした後、分離し、ピペット
で除き、そして250μlの抗体結合溶液（バッファー２中のab１：2 500）を加え
、そして室温で10分間インキューベーションし、次いで分離し、そしてピペット
で除き、そして500μlの洗浄バッファーで30秒間、２回、１×２分間、ゆるやか
に撹拌しながら処理した。次いでAMPPD 1:100（バッファー３中）を含む検出溶
液で37℃にて10分間インキューベーションし、そして次いで発光光度計で477nm
にて化学発光を測定した（ルマック(Lumacからの)Lumacounter）。実施例７ キアジェン（Qiagen）からのOligotex Direct mRNA Micro キットを使用したmRN
Aの単離 ２×107細胞（全部）を2 500rpmで５分間遠心した。上清をデカントし、そし
てペレットを上部から乾燥させ、800μlの溶菌バッファーOL1に再懸濁し、そし
て氷上で３分間インキューベーションした。各々の場合でOL1で溶菌した400μl
のペレットを２つのホモジネーションカラムに乗せた。次いでカラムを13 000rp
mで１分間遠心し、そして捨てた。続いて800μlの希釈バッファーODBを加え、そ
して混合した後、サンプルを13 000rpmで５分間遠心し、そして上清をオートク
レーブにかけた２mlの反応容器に移し、そして30〜50μlのOligotex 懸濁液を加
えた（懸濁液を37℃まで10分間前加熱し、そして振盪し、そして氷上で保存した
）。次いで混合物をRTで10分間振盪した。13 000rpmで５分間遠心した後、上清
を捨て、そしてペレットを350μlの洗浄バッファーOW1中に再懸濁した。混合物
を13 000rpmで５分間遠心し、上清を捨て、そしてペレットを２回、洗浄バッフ
ァーOW2で洗浄した。２回目の洗浄後に、懸濁液をカラムに乗せ、そして遠心し
た。反応容器を捨て、そしてカラムは２μlのRNAsineを含む新たな反応容器に置
いた。125μlの溶出バッファーOEB（70℃）をカラムに添加し、ペレットと混合
し、そして13 000rpmで５分間で溶出した。２つの溶出物を合わせ、そしてODを2
60nmで測定した。実施例８ 臨床サンプル材料（正常／新生物組織）中のテロメラーゼmRNAの検出 mRNAは実施例７に記載した方法を使用して臨床サンプル材料から単離した。次
いでRNAライゼートは、実施例５に記載した適当な増幅法により、特異的なオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。増幅した核酸は次いで配列プロ
トコールに記載したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ、そして
緊縮条件下で形成した特異的なハイブリダイゼーション複合体をディナル(Dynal
)からの磁気粒子を使用して分離し、そして実施例６または好ましくは実施例７
に記載のように化学発光の読み取りにより定量的に調査した。
【００５７】 表１に掲げた種々の起源の腫瘍材料を、全RNAまたはm-RNAを単離するために使
用した。使用した他の陽性対照は、HeLa細胞またはHek細胞のような細胞培養物
であった。肺、脳、腎臓、腸および血液（白血球）に由来する正常組織は、陰性
対照として役立てた。RNAを処理した後、通常の熱循環器で最終点PCRとして、ま
たはLightcyclerまたはパーキン−エルマー（Perkin-Elmer) Taqmanでカイネテ
ィック(kinetic)PCRとしてRT-PCRを行った。
【００５８】 結果を表１にまとめる。プライマーのセットおよび新規テロメラーゼアッセイ
を使用して、すべての組織サンプルがHeLa細胞またはHek細胞中のシグナルに匹
敵する高いシグナルを与えた。対照的に、正常組織はたとえ最高のRNA濃度でも
大変低いバックグラウンドシグナルを与えただけであった。
【００５９】 また膀胱ガンの患者の尿または肺腫瘍の患者の唾液からテロメラーゼ活性の陽
性を同定することも可能であった。すなわち生検材料に加えて、上昇したテロメ
ラーゼ活性を試験するための出発材料として例えば尿、唾液および血液のような
種々の体液を使用することができる。
【００６０】
【表１】
【００６１】 増幅および検出は、１−または２−段階のRT-PCRおよび化学発光試験、蛍光又
は比色的読み取りをそれぞれ介して行った。
【００６２】
【表２】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ビク，マレサ ドイツ・デー−51065ケルン・アンドレア ス−グリフイウス−シユトラーセ26 (72)発明者 ツボフ，ドミトリ ドイツ・デー−51061ケルン・ロゲンドル フシユトラーセ59 Ｆターム(参考） 4B024 AA12 CA09 CA12 DA03 HA12 HA14 4B063 QA18 QA19 QQ02 QQ53 QR32 QR55 QR62 QS25 QS32 QS34

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番
    号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０から成る群から選択されるヌ
    クレオチド配列を含んで成るスターターオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 配列番号１に示すヌクレオチド配列を含んで成るスターター
    オリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すヌクレオチド配列を含んで成るスタ
    ーターオリゴヌクレオチドから成るセット。
  3. 【請求項３】 配列番号４に示すヌクレオチド配列を含んで成るスターター
    オリゴヌクレオチドおよび配列番号５に示すヌクレオチド配列を含んで成るスタ
    ーターオリゴヌクレオチドから成るセット。
  4. 【請求項４】 配列番号７に示すヌクレオチド配列を含んで成るスターター
    オリゴヌクレオチドおよび配列番号８に示すヌクレオチド配列を含んで成るスタ
    ーターオリゴヌクレオチドから成るセット。
  5. 【請求項５】 配列番号９に示すようなヌクレオチド配列を含んで成るスタ
    ーターオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０を含んで成るスターターオリゴヌ
    クレオチドから成るセット。
  6. 【請求項６】 配列番号３、配列番号６および配列番号１１から成る群から
    選択されるヌクレオチド配列を含んで成る、適当な場合には標識されたオリゴヌ
    クレオチドプローブ。
  7. 【請求項７】 ａ）サンプル中で、テロメラーゼ（hTC）mRNAを請求項１に記
    載の１以上のスターターオリゴヌクレオチドを使用して増幅させ、そして ｂ）増幅結果を評価する、 ことを特徴とする、上昇したテロメラーゼ活性を検出する方法。
  8. 【請求項８】 請求項６に記載の適当なオリゴヌクレオチドプローブを、テ
    ロメラーゼ（hTC）アンプリコンの特異的ハイブリダイゼーションおよび検出に
    使用することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載の１以上のスターターオリゴヌクレオチドを
    含んで成る、上昇したテロメラーゼ活性を検出するための試験キット。
  10. 【請求項１０】 さらに請求項６に記載の１以上のオリゴヌクレオチドプロ
    ーブを含んで成る、請求項９に記載の試験キット。
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