KR101860547B1 - 세포-유리형 dna의 암 질환의 진단 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 특정의 세포-유리형 DNA의 암 질환 진단에 관한 새로운 용도에 관한 것이다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 체액으로부터 쉽게 수득할 수 있으며 유전자 증폭 방법으로 용이하게 검출이 가능한 새로운 암 진단용 바이오 마커이다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 초기 단계의 암 진단, 암 진행의 평가, 암 치료용 항암제의 성능 및 적합성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 세포-유리형 DNA의 암 질환의 진단 용도에 관한 것이다.
세포-유리형 DNA(Cell-Free DNA, cfDNA)는 RNA과 microRNA에 비해 상온 보관이 가능하며 진단 검사에 적합하다고 보고되었다(Wong 등, 2013). cfDNA는 소아림프종(paediatric lymphomas)의 진단(Mussolin 등, 2013), 산전검사(Casadio, 2013; Gahan, 2013), 급성 관동맥 증후군(acute coronary syndrome)의 검사(Cui, 2013), 혈액 투석환자의 사망률 측정 및 염증, 철분대사 및 rhEPO 연관성 분석(Tovbin, 2012; Kohlova et al., 2013), 유방암 진단 및 모니터링(Dawson, 2013; Kirk, 2013), 간암 진단(Zhou, 2012) 및 HPV(human paillomavirus mutational insertion) 진단(Campitelli, 2012)에 응용된 사례가 보고되었다. 또한, 세포-유리형 DNA에서 점돌연변이(point mutations), 미소부수체 변형(microsatelite alteration), DNA 메틸화(DNA methylation) 및 이형접합성 상실(LOH, Loss of heterozygosity)를 확인하여 바이오마커로 응용한 보고가 있다(Ghorbian, 2012).
또한, 정상인에 비해 유방암 환자에서 세포-유리형 DNA 수준이 높게 관찰되었고, 악성 종양(malignant tumor) 크기와의 높은 연관성도 관찰되었다(Hashad, 2012). 비소세포폐암(Non-small-cell lung carcinoma) 환자에서 세포-유리형 DNA가 증가하였다는 보고도 있다(Catarino, 2012; Szpechcinski, 2012). 암 사망률이 높은 환자에서 세포-유리형 DNA 수준이 높게 관찰되었다(Perkins, 2012). 전립선암 환자의 세포-유리형 DNA를 분석하여 10번 염색체에서 DNA 결손을 관찰하였으며 치료에 대한 예후를 측정할 수 있었다(Cortese, 2012; Delgado, 2012). 유방암 환자에서 세포-유리형 DNA의 이형접합성 상실(LOH, Loss of heterozygosity)를 관찰하여 암 발생단계, 암 크기, 림프절 전이(lymph node metastasis), 양성 프로게스테론(positive progesterone) 및 HER2 수용체(receptor)와의 연관성을 보여주었다. (Schwarzenbach, 2012). 난소암 환자의 세포-유리형 DNA을 분석하여 6q와 10q 염색체의 LOH가 암 세포 전이와 생존과 연관성을 예측하였다(Kuhlmann, 2012). 신경교종(glial tumor) 환자에서 세포-유리형 DNA의 고메틸화가 관찰되었다(Majchrzak-Celiska, 2013). 직장암 환자의 세포-유리형 DNA에서는 히스톤 메틸화 마커(histone methylation marker)인 H3K9me3 수준이 낮게 관찰되며 암 발생과 연관성을 보여주었다(Gezer, 2013). Biofluid에서 메틸화 DNA와 microRNA을 분석하여 암 발생에 대한 후성적 바이오마커(epigenetic biomarkers)로 이용하였다(Ma et al., 2013).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
1. Campitelli M, et al., Human papillomavirus mutational insertion: specific marker of circulating tumor DNA in cervical cancer patients. PLoS One. 2012;7(8):e43393.
2. Casadio V, et al., Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed Res Int. 2013;2013:270457.
3. Catarino R, et al., Circulating DNA: diagnostic tool and predictive marker for overall survival of NSCLC patients. PLoS One. 2012;7(6):e38559.
4. Cortese R, et al., Epigenetic markers of prostate cancer in plasma circulating DNA. Hum Mol Genet. 2012 Aug 15;21(16):3619-31.
5. Cui M, et al., Cell-Free circulating DNA: a new biomarker for the acute coronary syndrome. Cardiology. 2013;124(2):76-84.
6. Dawson SJ et al., Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N Engl J Med. 2013 Mar 28;368(13):1199-209.
7. Delgado PO et al., Characterization of cell-free circulating DNA in plasma in patients with prostate cancer. Tumour Biol. 2013 Apr;34(2):983-6.
8. Gahan PB. Circulating nucleic acids in plasma and serum: applications in diagnostic techniques for noninvasive prenatal diagnosis. Int J Womens Health. 2013 Apr 17;5:177-86.
9. Gezer U et al., Characterization of H3K9me3- and H4K20me3-associated circulating nucleosomal DNA by high-throughput sequencing in colorectal cancer. Tumour Biol. 2013 Feb;34(1):329-36.
10. Ghorbian S, Ardekani AM. Non-Invasive Detection of Esophageal Cancer using Genetic Changes in Circulating Cell-Free DNA. Avicenna J Med Biotechnol. 2012 Jan;4(1):3-13.
11. Hashad D, Sorour A, Ghazal A, Talaat I. Free circulating tumor DNA as a diagnostic marker for breast cancer. J Clin Lab Anal. 2012 Nov;26(6):467-72.
12. Kirk R. Breast cancer: Circulating tumour DNA the better of the blood biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 2013 May;10(5):247. doi: 10.1038/nrclinonc.2013.48. Epub 2013 Mar 26.
13. Kohlova M et al., Circulating cell-free DNA levels in hemodialysis patients and its association with inflammation, iron metabolism, and rhEPO doses. Hemodial Int. 2013 Oct;17(4):664-7.
14. Kuhlmann JD et al., LOH at 6q and 10q in fractionated circulating DNA of ovarian cancer patients is predictive for tumor cell spread and overall survival. BMC Cancer. 2012 Jul 31;12:325.
15. Ma Y, Wang X, Jin H. Methylated DNA and microRNA in Body Fluids as Biomarkers for Cancer Detection. Int J Mol Sci. 2013 May 16;14(5):10307-31.
16. Majchrzak-CeliA et al., Detection of MGMT, RASSF1A, p15INK4B, and p14ARF promoter methylation in circulating tumor-derived DNA of central nervous system cancer patients. J Appl Genet. 2013 Aug;54(3):335-44.
17. Mussolin L et al., Plasma cell-free DNA in paediatric lymphomas. J Cancer. 2013 Apr 16;4(4):323-9.
18. Perkins G et al., Multi-purpose utility of circulating plasma DNA testing in patients with advanced cancers. PLoS One. 2012;7(11):e47020.
19. Schwarzenbach H et al., Loss of heterozygosity at tumor suppressor genes detectable on fractionated circulating cell-free tumor DNAas indicator of breast cancer progression. Clin Cancer Res. 2012 Oct 15;18(20):5719-30.
20. Szpechcinski A et al., Quantitative analysis of free-circulating DNA in plasma of patients with resectable NSCLC. Expert Opin Biol Ther. 2012 Jun;12 Suppl 1:S3-9.
21. Tovbin D et al., Circulating cell-free DNA in hemodialysis patients predicts mortality. Nephrol Dial Transplant. 2012 Oct;27(10):3929-35.
22. Wong D et al., Optimizing blood collection, transport and storage conditions for cell free DNA increases access to prenatal diagnostic testing. Clin Biochem. 2013 Apr 30. pii: S0009-9120(13)00163-X.
23. Zhou J, Shi YH, Fan J. Circulating cell-free nucleic acids: promising biomarkers of hepatocellular carcinoma. Semin Oncol. 2012 Aug;39(4):440-8.
본 발명자들은 혈액 내에 존재하는 생물학적 물질로부터 암 질환의 조기 진단에 유용한 새로운 바이오 마커를 발굴하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 혈액 내에 존재하는 특정의 세포-유리형(cell-free) DNA가 암 환자에게서 유의적으로 높은 수준으로 나타난다는 것을 실험적으로 확인하고 이의 암의 진단용 바이오마커로의 사용 가능성을 실험적으로 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 7, 8, 또는 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 “세포-유리형 DNA (cell-free DNA, cfDNA)”는 인간의 체액에서 순환하는 단편(fragment) DNA를 의미한다. 상기 세포-유리형 DNA는 대부분 이중가닥 DNA이며 핵단백질 복합체의 상태로 존재할 수 있다. 상기 세포-유리형 DNA는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 관찰되므로 질병의 진단 및 예후 예측 목적의 유용한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 7에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형 DNA(cell-free DNA)는 인간 20번 염색체에 위치한 ENTPD6 (ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 6) 유전자로부터 유래된 세포-유리형 DNA이다.
본 발명에서 상기 서열번호 8에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형 DNA(cell-free DNA)는 인간 1번 염색체에 위치한 FGR (FGR proto-oncogene, Src family tyrosine kinase) 유전자로부터 유래된 세포-유리형 DNA이다.
본 발명에서 서열번호 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형 DNA(cell-free DNA)는 인간 5번 염색체에 위치한 FER (FER tyrosine kinase) 유전자로부터 유래된 세포-유리형 DNA이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제제는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)이다.
본 명세서에서 용어 “상보적 (complementary)”은 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건하에서 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 상기 용어“상보적”은 완전히 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브가 상기 서열번호 5 내지 0에 개시된 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 상기 프로브는 바람직하게는 단일쇄이다. 바람직하게는, 본 발명의 프로브는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 상기 프로브는 자연발생(naturally occurring)의 dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 뉴클레오타이드 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다. 상기 프로브는 추가적으로 방사선 표지, 형광표지, 효소표지, 서열 택, 또는 바이오틴에 의해 표지될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있다. 프라이머 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명의 프라이머는 주형인 상기 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 본 발명의 프라이머는 추가적으로 방사선 표지, 형광 표지, 효소 표지, 서열 택, 또는 바이오틴에 의해 표지될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reaction)에 사용된다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소연쇄반응(ploymerase chain reaction), 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 실시간-중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 복구연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification), 자가 유지 뉴클레오타이드 서열 복제(self sustained sequence replication), 타깃 폴리뉴클레오티드 서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소연쇄반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction), 임의적 프라이밍 중합효소연쇄반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction), 핵산뉴클레오타이드 서열 기반증폭(nucleic acid sequence based amplification), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서의 상기 프로브는 마이크로어레이 칩(microarray chip)에 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 진단 대상암은 특정의 암으로 한정되지 않으며, 예를 들어 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 결장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 조성물을 포함하는 암의 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단용 키트는 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)용 키트 또는 마이크로어레이 칩(microarray chip)일 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응용 키트는 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 프로브는 마이크로어레이칩(microarray chip)에 사용될 수 있으며, 마이크로어레이칩에서 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 지지체(substrate) 상에 고정화된다. 상기 지지체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 지지체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 지지체에 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 7, 8, 또는 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 포함하는 암의 진단용 바이오 마커를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 서열번호 7, 8, 또는 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 생물학적 시료로부터 세포-유리형(cell-free) DNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리한 세포-유리형(cell-free) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 타액, 림프액, 뇌척수액, 활액, 낭종액(cystic fluid), 또는 복수이다.
이하에서 본 발명의 방법을 단계별로 설명한다.
생물학적 시료로부터 세포-유리형 DNA(cell-free DNA)를 분리하는 단계
먼저 세포-유리형 DNA의 분리를 위한 생물학적 시료를 준비한다. 상기 생물학적 시료는 체액이며, 상기 세포-유리형 DNA는 상기 체액내에 단독으로 존재할 수 있으며 분비체(exosome)에 포함되어 존재할 수도 있다. 상기 분비체는 DNA, RNA 또는 단백질을 포함하는 30nm-100nm 크기의 소포(vesicle)로서 세포에서 기원하여 체액으로 방출된다. 상기 체액은 혈액, 소변, 대변, 타액, 림프액, 뇌척수액, 활액, 낭종액(cystic fluid), 복수, 흉막 삼출액, 양수, 융모막 융모 샘플, 태반샘플, 기관 세척액(lavage), 간질액 또는 안구액(ocular fluid)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직하게는 상기 체액은 혈액, 혈장 또는 혈청이다. 상기 생물학적 시료로부터 세포-유리형 DNA를 분리한다. 상기 세포-유리형 DNA의 분리는 체액으로부터 분비체(exosome)을 분리하고, 분리된 분비체로부터 핵산을 추출, 분리 및 정제하는 방법을 통해 행할 수 있다.
세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법
세포-유리형 DNA를 분리 정제한 후 서열번호 7, 8, 또는 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출한다.
본 발명에서 상기 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법은 유전자 증폭 방식 또는 마이크로어레이 방식으로 실시될 수 있다.
세포-유리형 DNA의 검출이 유전자 증폭 방식으로 행해지는 경우 상기 분리한 세포-유리형(cell-free) DNA를 주형으로 하여, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트; 또는 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 행한 이후에 상기 PCR의 산물에 대하여 추가적으로 서열분석을 수행할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점은 다음과 같다.
(i) 본 발명은 특정의 세포-유리형 DNA의 암 질환 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 세포-유리형 DNA는 체액으로부터 쉽게 수득할 수 있으며 유전자 증폭 방법으로 용이하게 검출이 가능한 새로운 암 진단용 바이오 마커이다.
(ⅲ) 본 발명의 세포-유리형 DNA는 초기 단계의 암 진단, 암 진행의 평가, 암 치료용 항암제의 성능 및 적합성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 특정의 세포-유리형 DNA의 암 질환 진단에 관한 새로운 용도에 관한 것이다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 체액으로부터 쉽게 수득할 수 있으며 유전자 증폭 방법으로 용이하게 검출이 가능한 새로운 암 진단용 바이오 마커로 사용될 수 있다. 본 발명의 세포-유리형 DNA는 초기 단계의 암 진단, 암 진행의 평가, 암 치료용 항암제의 성능 및 적합성 평가에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 암 진단용 세포 유리형 DNA 바이오마커를 이용한 해리 용융점 실시간 핵산 증폭법 적용 결과을 보여준다. X 축: Melting 온도, Y 축: dF/dT(first derivative of the change in fluorescence).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 세포 유리형 DNA
바이오마커
검출용
프라이머의
디자인
세포 유리형 바이오 마커는 해리 용융점 실시간 핵산 증폭법(melting curve qPCR)를 이용하여 검출하였다. 먼저, 3가지 세포 유리형 DNA 바이오마커인 ENTPD6, FGR, RER 유전자의 세포 유리형 DNA 단편을 검출하기 위한 프라이머를 디자인하였다. Primer 3 프로그램을 이용하여 Tm 값 = 60℃, GC % = 50~55% 조건에서 프라이머를 디자인하였다. 아래 표 1은 암 진단용 세포 유리형 DNA 바이오 마커를 검출하기 위한 프라이머 서열을 나타낸다. 해리 용융점 실시간 핵산 증폭법(Melting curve qPCR)에서 정상적으로 증폭되었다고 판단하는 기준은 Ct = 30 이하, dF/dT= 0.5 이상, melting curve = 1 개로 설정하였다.
| Gene Symbol |
Gene Accession # | Forward Primer Sequence | Reverse Primer Sequence |
| ENTPD6 | NM_001114089.3 | CTGGGGCTCTCAGTAGTTGC (서열번호 1) |
TGGTGTTCCCAAACTGTTCA (서열번호 2) |
| FGR | NM_001042729.1 | AAAGGAAGGGACAGCTCTGC (서열번호 3) |
AAACAGCCAATCAAGGGACC (서열번호 4) |
| FER | NM_001308028.1 | TCCTGTCTAGCCGTCTGTTG (서열번호 5) |
GCACCAGGTACCGCTCTAG (서열번호 6) |
2. 검출하고자 하는 세포 유리형 DNA의 염기 서열 분석
상기 제작한 프라이머로 검출한 세포 유리형 DNA의 염기 서열을 분석하여, 아래 표 2 - 표 4에 각각 나타내었다.
| 유전자 이름 | ENTPD6 |
| 염색체번호 | chromosome 20 |
| 염색체상에서 검출되는 위치 |
25187257-25187316 |
| 염기서열 | CTGGGGCTCTCAGTAGTTGCCCAAGGGACGGAGTTTAAACCTTTCGAAAAGTAAATTGC CTGAATAGAAGTATAACTGAGGATTGAAAGACTGAATCAGATACGCGCTTCTGTTCCCATGAACAGTTTGGGAACACCA (서열번호 7) |
| 유전자 이름 | FGR |
| 염색체번호 | chromosome 1 |
| 염색체상에서 검출되는 위치 |
c27949011-27948812 |
| 염기서열 | GAAAAGGAAGGGACAGCTCTGCAGTGAGAGGAAAACCTATGGACCTGGGCCTCAGATGTCCCCTTGAGGGGGAATGGCCAGGCTAGAGTGGAGTCAGATGGGACAGAGCTGAGAACTAGGCTTTGCCATTTTCCTGCTGTGGGTCCCTTGATTGGCTGTTTAACCTCTCTGAGCCTCTATTAACTCATCTGTAATGTTGG (서열번호 8) |
| 유전자 이름 | FER |
| 염색체번호 | chromosome 5 |
| 염색체상에서 검출되는 위치 |
108382799-108382998 |
| 염기서열 | TTTATTGTCTACACCCTCGGAATCCTGTCTAGCCGTCTGTTGTATATTTTAAACATGACGGTGCAGTGCCTGCTATATGACAAACGTTGGTGATCCAGATGAGAAAGAGGAAACAGCTATGCAGGCAGTCCTTTAGAAGGTTTGACTATATCGAGGCTAAAGAGCTAGGGCAGCTGCTAGAGCGGTACCTGGTGCGGAGA (서열번호 9 |
3. 해리 용융점 실시간 핵산 증폭법을 이용한 위암의 진단
(1) 혈액에서 세포 유리형 DNA의 추출
혈액에서 3가지 ENTPD6, FGR, RER 유전자의 세포 유리형 DNA 단편을 해리 용융점 실시간 핵산 증폭 방법을 이용하여 검출하여 암을 진단할 수 있는 지 여부를 확인하였다. 먼저, 정상인 또는 위암 환자의 500μl 혈청 또는 혈장에 5μl Triton X-100 첨가한 뒤에 98℃, 5분 동안 변성 후에 얼음에 5분 동안 방치하였다. 3000x rpm, 10분 동안 원심분리 후에 5μl 상등액을 취하여 PCR 검사에 사용하였다.
(2) 해리 용융점 실시간 핵산 증폭 반응 조성물의 제조
해리 용융점 실시간 핵산 증폭방법에 사용하기 위한 PCR 반응 조성물을 아래 표 5와 같이 제조하였다.
| 반응 조성물 | 용량(μl) | 최종 농도 |
| 2× Master Mix | 12.5 | 1x |
| 2.5pmol ENTPD6 | 1.25 | 0.125pmol |
| 2.5pmol FGR | 1.25 | 0.125pmol |
| 2.5pmol FER | 1.25 | 0.125pmol |
| DNA | 5.0 | |
| ddH2O | 1.25 | |
| Total volume | 25.0 |
(3) 해리 용융점 실시간 핵산 증폭법에 사용되는 검출조건
해리 용융점 실시간 핵산 증폭방법은 아래 표 6의 조건으로 실시하였다.
| 온도 | 시간 | Cycle |
| 95℃ | 5 min | 1 |
| 95℃ | 10 sec | 40 |
| 55℃ | 30 sec | |
| 72℃ | 30 sec | |
| 77~86℃ | 해리용융점 관찰 | 1 |
(4) 실험 결과
실험 실시 결과, 세포 유리형 DNA 바이오마커(ENTPD6, FGR, FER)는 위암 환자군에서 피크(peak)가 일정한 형태로 모두 관찰되지만, 정상인에서는 전혀 증폭되지 않거나, 단일의 피크(peak)만 관찰되었다(도 1 참조). 따라서, 상기 세포 유리형 DNA 바이오마커(ENTPD6, FGR, FER)의 증폭 피크(peak)를 관찰함으로써 암 여부를 진단할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation
<120> Use of Cell-Free DNA for Diagnosing the Disease of Cancer
<130> PN160172
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 1
ctggggctct cagtagttgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 2
tggtgttccc aaactgttca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 3
aaaggaaggg acagctctgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 4
aaacagccaa tcaagggacc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 5
tcctgtctag ccgtctgttg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 6
gcaccaggta ccgctctag 19
<210> 7
<211> 138
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ctggggctct cagtagttgc ccaagggacg gagtttaaac ctttcgaaaa gtaaattgcc 60
tgaatagaag tataactgag gattgaaaga ctgaatcaga tacgcgcttc tgttcccatg 120
aacagtttgg gaacacca 138
<210> 8
<211> 200
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
gaaaaggaag ggacagctct gcagtgagag gaaaacctat ggacctgggc ctcagatgtc 60
cccttgaggg ggaatggcca ggctagagtg gagtcagatg ggacagagct gagaactagg 120
ctttgccatt ttcctgctgt gggtcccttg attggctgtt taacctctct gagcctctat 180
taactcatct gtaatgttgg 200
<210> 9
<211> 200
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
tttattgtct acaccctcgg aatcctgtct agccgtctgt tgtatatttt aaacatgacg 60
gtgcagtgcc tgctatatga caaacgttgg tgatccagat gagaaagagg aaacagctat 120
gcaggcagtc ctttagaagg tttgactata tcgaggctaa agagctaggg cagctgctag 180
agcggtacct ggtgcggaga 200
Claims (12)
- 서열번호 7에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA, 서열번호 8에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA 및 서열번호 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 위암 진단용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제제는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 프라이머는 유전자 증폭반응(amplification reaction)에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 유전자 증폭반응은 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 프로브는 마이크로어레이(microarray)에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 위암의 진단용 키트.
- 서열번호 7에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA, 서열번호 8에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA 및 서열번호 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 포함하는 위암의 진단용 바이오 마커.
- 위암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 서열번호 7에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA, 서열번호 8에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA 및 서열번호 9에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법은 유전자 증폭 방식 또는 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 세포-유리형(cell-free) DNA를 검출하는 방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 혈액 또는 혈장으로부터 세포-유리형(cell-free) DNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리한 세포-유리형(cell-free) DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 수행하는 단계. - 삭제
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