JP2022514397A - 変更されたローダミン染料及びバイオアッセイにおけるそれらの使用 - Google Patents

変更されたローダミン染料及びバイオアッセイにおけるそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン染料及び核酸検出におけるそれらの使用を検討する。特に、本開示は、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン染料の作製方法、及びＮ－保護ＮＨ－ローダミン染料の使用方法（例えば、ヒト認識）について検討する。本明細書で提供される特定の染料は、既存の染料セットを補完する独自のスペクトル特性を有し、マルチプレックスバイオアッセイに含めることができるレポータ染料の数を増やすために使用することができる。【選択図】図８

Description

検出標識として蛍光染料を使用することは、分子生物学、細胞生物学、及び分子遺伝学で広く使用されている。例えば、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用は、現在、ポリヌクレオチド配列決定、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、核酸アレイにおけるハイブリダイゼーションアッセイ、蛍光偏光研究、並びに蛍光プローブ及び／又はプライマを使用して実施されるポリメラーゼ鎖増幅アッセイを含む核酸増幅アッセイ等、様々な異なるアッセイで広まっている。
蛍光染料を利用した様々なマルチプレックスアッセイシステムが説明されている。例えば、ローダミン染料は、ヒト認識アッセイ（ＨＩＤ）における使用に関してＷＯ２０１２／０６７９０１に記載されるように、マルチプレックスアッセイシステムにおける使用に関して記載されてきた。残念ながら、ローダミン染料を含む既存の染料セットのスペクトル特性により、６種類を超える染料を組み合わせて使用する剛性で感度の高いアッセイシステムを開発する能力は限られる。このようなより高度なプレックスシステムを可能にするために、そのような代替のマルチプレックス染料セットの作製に独自に適したスペクトル特性を有する新しいローダミン染料の開発が必要である。
合成オリゴヌクレオチドを標識するために使用できる蛍光化合物が記載されている。一般に、化合物のクラスは次の構造で記載され、
Figure 2022514397000002
 式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、単独の場合、それぞれ独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、あるいは、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成し、
Ｒ4は、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、又は６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基であり、
ｎは、１～１０の範囲の整数であり、
式中、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3、及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
式中、Ｒbは、－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa－ＳＨ、－ＳＲa－ＮＨ2、－ＮＨＲa－ＮＲcＲc、－Ｎ+ＲcＲcＲcＸ-、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）2Ｒa、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲa、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcから選択され、
各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含み得る、５－８員の飽和又は不飽和の環を形成してもよく、
Ｒd及びＲeは、単独の場合、それぞれ、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、
Ｘはハロゲンであり、
ｎは、１～１０の範囲の整数である。上記構造において、Ｒd及びＲeを含む環は、構造中に点線で示される二重結合を含んでいてもよい。
一実施形態では、化合物は式（Ｉ）を有し、
Figure 2022514397000003
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、単独の場合、それぞれ互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、あるいは、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成し、
Ｒ4は、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、又は６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基であり、
ｎは、１～１０の範囲の整数であり、
式中、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3、及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
式中、Ｒbは、－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa－ＳＨ、－ＳＲa－ＮＨ2、－ＮＨＲa－ＮＲcＲc、Ｎ+ＲcＲcＲcＸ-、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、Ｓ（Ｏ）2Ｒa、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲa、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa 、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcから選択され、
各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含み得る、５－８員の飽和又は不飽和の環を形成してもよく、
Ｒd及びＲeは、単独の場合、それぞれ、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、
Ｘはハロゲンであり、
ｎは、１～１０の範囲の整数である。
別の態様では、本開示は標識部分を含むオリゴヌクレオチドを記載し、標識部分は固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを次式を有する試薬と反応させることによって製造され、
ＬＭ－Ｌ－ＰＥＰ
式中、ＰＥＰはリン酸エステル前駆体基であり、Ｌは標識部分をＰＥＰ基に結合させる任意のリンカーであり、ＬＭは式（Ｉ）のＮ－保護ＮＨ－ローダミン部分を含み、
Figure 2022514397000004
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、単独の場合、それぞれ互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ12、又はＲ13のうち１つは－Ｙ－の基を含み、式中Ｙは－Ｃ（Ｏ）－、Ｓ（Ｏ）2－、－Ｓ－及び－ＮＨ－からなる群から選択され、あるいは、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成し、
Ｒ4は、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、又は６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基であり、
ｎは、１～１０の範囲の整数であり、
式中、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3、及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
式中、Ｒbは、－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa－ＳＨ、－ＳＲa－ＮＨ2、－ＮＨＲa－ＮＲcＲc、Ｎ+ＲcＲcＲcＸ-、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、Ｓ（Ｏ）2Ｒa、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa 、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcから選択され、
各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含み得る、５－８員の飽和又は不飽和の環を形成してもよく、
Ｒd及びＲeは、単独の場合、それぞれ、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、
Ｘはハロゲンであり、
ｎは、１～１０の範囲の整数である。
別の態様では、オリゴヌクレオチドを標識するために有用な試薬であって、次の構造式の化合物であり、
ＬＭ－Ｌ－ＰＥＰ
式中、ＬＭはＮ－保護ＮＨ－ローダミン部分を含む標識部分を表し、ＰＥＰはホスホラミダイト基又はＨ－ホスホネート基を含むリン酸エステル前駆体基であり、Ｌは標識部分をリン酸エステル前駆体基に結合させる任意のリンカーであり、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分は構造（Ｉ）であり、
Figure 2022514397000005
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、単独の場合、それぞれ互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ12、又はＲ13のうち１つは－Ｙ－の基を含み、式中Ｙは－Ｃ（Ｏ）－、Ｓ（Ｏ）2－、－Ｓ－及び－ＮＨ－からなる群から選択され、あるいは、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成し、
Ｒ4は、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、又は６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基であり、
ｎは、１～１０の範囲の整数であり、
式中、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3、及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
式中、Ｒbは、－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa－ＳＨ、－ＳＲa－ＮＨ2、－ＮＨＲa－ＮＲcＲc、Ｎ+ＲcＲcＲcＸ-、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、Ｓ（Ｏ）2Ｒa、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa 、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcから選択され、
各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含み得る、５－８員の飽和又は不飽和の環を形成してもよく、
Ｒd及びＲeは、単独の場合、それぞれ、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、
Ｘはハロゲンであり、
ｎは、１～１０の範囲の整数である。
別の態様では、方法は、
核酸試料を複数の複数の増幅プライマ対と共増幅させて、複数の増幅産物を形成することであって、プライマ対のそれぞれの少なくとも１つは、構造式ＬＭ－Ｌ－ＰＥＰを有する標識ヌクレオチドを含み、各増幅産物は、製品は異なる遺伝子座を含む。
図１は、本明細書に記載の試薬を含む様々な異なる部分を互いに連結するために使用できる例示的なリンカーを提供する。
図２は、合成ハンドルを含まない非ヌクレオシド合成試薬の例示的な実施形態を提供する。
図３は、合成ハンドルを含まないヌクレオシド合成試薬の例示的な実施形態を提供する。
図４は、合成ハンドルを含む非ヌクレオシド合成試薬の例示的な実施形態を提供する。
図５は、合成ハンドルを含むヌクレオシド合成試薬の例示的な実施形態を提供する。
図６は、非ヌクレオシド固体支持体試薬の例示的な実施形態を提供する。
図７は、ヌクレオシド固体支持体試薬の例示的な実施形態を提供する。
図８は、ＮＨ－ローダミン染料によって５’－ヒドロキシルにおいて標識されたオリゴヌクレオチドを合成するための合成試薬の特定の実施形態の使用を表す。
図９は、エネルギー転移染料によって３’－ヒドロキシルにおいて標識されたオリゴヌクレオチドを合成するための合成試薬の特定の実施形態の使用を表す。
図１０Ａは、エネルギー転移染料によって５’ヒドロキシルにおいて標識されたオリゴヌクレオチドをｉｎ ｓｉｔｕで合成するための合成試薬の特定の実施形態の使用を表す。
図１０Ｂは、リンカーであるホスホラミダイト、及びエネルギー転移染料によって５’末端において標識されたオリゴヌクレオチドをｉｎ ｓｉｔｕで合成するための合成試薬の特定の実施形態の使用を表す。
図１１Ａは、マルチプレックスアッセイで使用される３種類の市販染料のスペクトルを示す。
図１１Ｂは、マルチプレックスアッセイで使用される３種類の市販の染料、及び構造Ｄ．１に示される非対称ローダミンであるＣｍｐＡのスペクトルを表す。
前述の概要及び以下の詳細な説明のいずれも、例示的であり、説明に過ぎず、本明細書に記載の組成物及び方法を制限するものではないことを理解されたい。本開示において、「又は」の使用は、別途記載されない限り、「及び／又は」を含む。同様に、表現「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定を意図するものではない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上、別途明確に指示されない限り、複数形照応を含む。更に、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草できることに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲要素の記載、又は「否定的な」制限の使用に関連して、「単独で」、「のみ」等の排他的な用語を使用するための先行詞として機能することを意図している。
本明細書で使用される場合、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、それらの広い、非限定的な意味で使用される。
より簡潔な説明を提供するために、ここで与えられた量的表現のいくつかは、用語「約」で修飾されていない。用語「約」が明示的に使用されているかどうかにかかわらず、本明細書に記載されている全ての量は、実際の所定の値を指すことを意味し、このような所定の値に関する実験的及び／又は測定条件により、同等なもの及び近いものを含む、一般的な当業者に基づいて合理的に推測されるような所定の値への近似値を指すことも意味することが理解される。収率が百分率として示される場合は常に、そのような収率は、特定の化学量論的条件下で得ることができる同じ実体の最大量に関して、収率が与えられる実体の量を指す。百分率で示される濃度は、別段の指示がない限り、質量比を指す。
４．１ 定義
本書で使用される以下の用語及び表現は、以下の意味を持つことを意図する。
「アルキル」は、それ自体又は別の置換基の一部として、親アルカン、アルケン、又はアルキンの単一の炭素原子から１個の水素原子を取り除くことによって誘導される、指定された数の炭素原子（すなわち、Ｃ１－Ｃ６は１～６個の炭素原子を意味する）を有する、飽和又は不飽和、分岐、直鎖又は環状の一価の炭化水素基を指す。典型的なアルキル基としては、限定されるものではないが、メチル；エタニル、エテニル、エチニル等のエチル；プロパン－１－イル、プロパン－２－イル、シクロプロパン－１－イル、プロプ－１－エン－１－イル、プロプ－１－エン－２－イル、プロプ－２－エン－１－イル、シクロプロプ－１－エン－１－イル等のプロピル；シクロプロプ－２－エン－１－イル、プロプ－１－イン－１－イル、プロプ－２－イン－１－イル等；ブタン－１－イル、ブタン－２－イル、２－メチル－プロパン－１－イル、２－メチル－プロパン－２－イル、シクロブタン－１－イル、ブト－１－エン－１－イル、ブト－１－エン－２－イル、２－メチル－プロプ－１－エン－１－イル、ブト－２－エン－１－イル、ブト－２－エン－２－イル、ブタ－１，３－ジエン－１－イル、ブタ－１，３－ジエン－２－イル、シクロブタ－１－エン－１－イル、シクロブタ－１－エン－３－イル、シクロブタ－１，３－ジエン－１－イル、ブト－１－イン－１－イル、ブト－１－イン－３－イル、ブト－３－イン－１－イル等のブチル；及び同類のものが挙げられる。特定の飽和レベルが意図される場合、以下に定義されるように、「アルカニル」、「アルケニル」及び／又は「アルキニル」という名称が使用される。本明細書で使用される、「低級アルキル」は、（Ｃ１－Ｃ８）アルキルを意味する。
「アルカニル」は、それ自体又は別の置換基の一部として、親アルカンの単一の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって誘導される、飽和、分岐、直鎖又は環状のアルキルを指す。典型的なアルカニル基には、限定されるものではないが、メタニル；エタニル；プロパン－１－イル、プロパン－２－イル（イソプロピル）、シクロプロパン－１－イル等のプロパニル；ブタン－１－イル、ブタン－２－イル（ｓｅｃ－ブチル）、２－メチル－プロパン－１－イル（イソブチル）、２－メチル－プロパン－２－イル（ｔ－ブチル）、シクロブタン－１－イル等のブタニル等；及び同類のものが挙げられる。本明細書で使用される「低級アルカニル」は、（Ｃ１－Ｃ８）アルカニルを意味する。
「アルケニル」は、それ自体又は別の置換基の一部として、親アルカンの 単一の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって誘導される、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する、不飽和、分岐、直鎖又は環状のアルキルを指す。この基は、二重結合（複数可）に関して、シス又はトランス構造のいずれかであり得る。典型的なアルケニル基には、限定されるものではないが、エテニル；プロプ－１－エン－１－イル、プロプ－１－エン－２－イル、プロプ－２－エン－１－イル、プロプ－２－エン－２－イル、シクロプロプ－１－エン－１等のプロペニル；シクロプロプ－２－エン－１－イル；ブト－１－エン－１－イル、ブト－１－エン－２－イル、２－メチル－プロプ－１－エン－１－イル、ブト－２－エン－１－イル、ブト－２－エン－２－イル、ブタ－１，３－ジエン－１－イル、ブタ－１，３－ジエン－２－イル、シクロブト－１－エン－１－イル、シクロブト－１－エン－３－イル、シクロブタ－１，３－ジエン－１－イル等のブテニル等；及び同類のものが挙げられる。本明細書で使用される「低級アルケニル」は、（Ｃ２－Ｃ８）アルケニルを意味する。
「アルキニル」は、それ自体又は別の置換基の一部として、親アルキンの単一の炭素原子から １個の水素原子を除去することによって誘導される、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する、飽和、分岐、直鎖又は環状のアルキルを指す。典型的なアルキニル基には、限定されるものではないが、エチニル；プロプ－１－イン－１－イル、プロプ－２－イン－１－イル等のプロピニル；ブト－１－イン－１－イル、ブト－１－イン－３－イル、ブト－３－イン－１－イル等のブチニル等；及び同類のものが挙げられる。本明細書で使用される「低級アルキニル」は、（Ｃ２－Ｃ８）アルキニルを意味する。
「アルキルジイル」は、それ自体又は別の置換基の一部として、親アルカン、アルケン又はアルキンの２つの異なる炭素原子のそれぞれから１個の水素原子を除去することによって、あるいは親アルカン、アルケン又はアルキンの単一の炭素原子から２個の水素原子を除去することによって誘導される、指定された数の炭素原子を有する（すなわち、Ｃ１－Ｃ６は１～６個の炭素原子を意味する）飽和又は不飽和、分岐、直鎖又は環状の二価炭化水素基を指す。２つの一価ラジカル中心又は二価ラジカル中心の各原子価は、同じ又は異なる原子と結合を形成することができる。典型的なアルキルジイル基には、限定されるものではないが、メタンジイル；エタン－１，１－ジイル、エタン－１，２－ジイル、エテン－１，１－ジイル、エテン－１，２－ジイル等のエチルジイル；プロパン－１，１－ジイル、プロパン－１，２－ジイル、プロパン－２，２－ジイル、プロパン－１，３－ジイル、シクロプロパン－１，１－ジイル、シクロプロパン－１，２－ジイル、プロパ－１－エン－１，１－ジイル、プロパ－１－エン－１，２－ジイル、プロパ－２－エン－１，２－ジイル、プロパ－１－エン－１，３－ジイル、シクロプロプ－１－エン－１，２－ジイル、シクロプロプ－２－エン－１，２－ジイル、シクロプロプ－２－エン－１，１－ジイル、プロパ－１－イン－１，３－ジイル等のプロピルジイル；ブタン－１－ジイル、ブタン－１，２－ジイル、ブタン－１，３－ジイル、ブタン－１，４－ジイル、ブタン－２，２－ジイル、２－メチル－プロパン－１，１－ジイル、２－メチル－プロパン－１，２－ジイル、シクロブタン－１，１－ジイル等のブチルジイル；シクロブタン－１，２－ジイル、シクロブタン－１，３－ジイル、ブト－１－エン－１，１－ジイル、ブト－１－エン－１，２－ジイル、ブト－１－エン－１，３－ジイル、ブタ－１－エン－１，４－ジイル、２－メチル－プロプ－１－エン－１，１－ジイル、２－メタニリデン－プロパン－１，１－ジイル、ブタ－１，３－ジエン－１，１－ジイル、ブタ－１，３－ジエン－１，２－ジイル、ブタ－１，３－ジエン－１，３－ジイル、ブタ－１，３－ジエン－１，４－ジイル、シクロブト－１－エン－１，２－ジイル、シクロブト－１－エン－１，３－ジイル、シクロブト－２－エン－１，２－ジイル、シクロブタ－１，３－ジエン－１，２－ジイル、シクロブタ－１，３－ジエン－１，３－ジイル、ブト－１－イン－１，３－ジイル、ブト－１－イン－１，４－ジイル、ブタ－１，３－ジイン－１，４－ジイル等；及び同類のものが挙げられる。特定レベルの飽和が意図される場合、アルカニルジイル、アルケニルジイル及び／又はアルキニルジイルの名称が使用される。２つの原子価が、同じ炭素原子上にあることが特に意図されている場合は、「アルキリデン」の名称が使用される。いくつかの実施形態において、アルキルジイル基は（Ｃ１－Ｃ８）アルキルジイルである。特定の実施形態には、ラジカル中心が末端炭素にある飽和非環状アルカニルジイル基、例えば、メタンジイル（メタノ）、エタン－１，２－ジイル（エタノ）、プロパン－１，３－ジイル（プロパノ）、ブタン－１，４－ジイル（ブタノ）等（以下に定義するアルキレノとも示される）が含まれる。本明細書で使用される「低級アルキルジイル」は、（Ｃ１－Ｃ８）アルキルジイルを意味する。
「アルキレン」は、それ自体又は別の置換基の一部として、直鎖又は分岐の親アルカン、アルケン又はアルキンの２つの末端炭素原子のそれぞれから１つの水素原子を取り除くことによって、又は親シクロアルキルの２つの異なる環状原子のそれぞれから、１つの水素原子を取り除くことによって誘導される２つの末端一価ラジカル中心を有する、直鎖、飽和又は不飽和アルキルジイル基を指す。特定のアルキレンに二重結合又は三重結合のロカントが存在する場合、角括弧で示される。典型的なアルキレン基には、限定されるものではないが、エタノ、エテノ、エチノ等のエチレン；プロパノ、プロプ［１］エノ、プロパ［１，２］ジエノ、プロプ［１］イノ等のプロピレン；ブタノ、ブト［１］エノ、ブト［２］エノ、ブタ［１，３］ジエノ、ブト［１］イノ、ブト［２］イノ、ブタ［１，３］ジイノ等のブチレン；及び同類のものが挙げられる。特定レベルの飽和が意図される場合、アルカノ、アルケノ及び／又はアルキノの名称が使用される。いくつかの実施形態において、アルキレン基は、（Ｃ１－Ｃ８）又は（Ｃ１－Ｃ３）アルキレンである。具体的な実施形態には、例えばメタノ、エタノ、プロパノ、ブタノ等の直鎖飽和アルカノ基が含まれる。本明細書で使用される、「低級アルキレン」は、（Ｃ１－Ｃ８）アルキレンを意味する。
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルカニル」、「ヘテロアルケニル」、「ヘテロアルキニル」、「ヘテロアルキルジイル」及び「ヘテロアルキレン」は、それら自体又は別の置換基の一部として、１つ又は複数の炭素原子が、それぞれ独立して、同じ又は異なるヘテロ原子又はヘテロ原子基で置き換えられる、アルキル、アルカニル、アルケニル、アルキニル、アルキルジイル及びアルキレン基のそれぞれを指す。炭素原子を置き換えることができる典型的なヘテロ原子及び／又はヘテロ原子基には、限定されるものではないが、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｏ－、－ＮＲ’－、－ＰＨ－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＳＯ２－、－Ｓ（Ｏ）ＮＲ’－、－ＳＯ２ＮＲ’－等、それらの組合せを含み、式中、Ｒ’は水素又は置換基、例えば（Ｃ１－Ｃ８）アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール又は（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキルである。
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」は、それ自体又は別の置換基の一部として、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」基の環状バージョンを指す。ヘテロアルキル基の場合、ヘテロ原子は、分子の残余部に結合する位置を占めることができる。典型的なシクロアルキル基には、限定されるものではないが、シクロプロピル；シクロブタニル及びシクロブテニル等のシクロブチル類；シクロペンタニル及びシクロペンテニル等のシクロペンチル類；シクロヘキサニル及びシクロヘキセニル等のシクロヘキシル類等；及び同類のものが挙げられる。典型的なヘテロシクロアルキル基には、限定されるものではないが、テトラヒドロフラニル（例えば、テトラヒドロフラン－２－イル、テトラヒドロフラン－３－イル等）、ピペリジニル（例えば、ピペリジン－１－イル、ピペリジン－２－イル等）、モルホリニル（例えば、モルホリン－３－イル、モルホリン－４－イル等）、ピペラジニル（例えば、ピペラジン－１－イル、ピペラジン－２－イル等）、及び同類のものが挙げられる。
「親芳香族環系」は、共役π電子系を有する不飽和の環式又は多環式環系を指す。「親芳香族環系」の定義に具体的に含まれるのは、環のうち１つ又は複数が芳香族であり、環のうち１つ又は複数が飽和又は不飽和である、例えばフルオレン、インダン、インデン、フェナレン、テトラヒドロナフタレン等の縮合環系である。典型的な親芳香族環系には、限定されるものではないが、アセアンスリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキシレン、インダセン、ｓ－インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピランスレン、ルビセン、テトラヒドロナフタレン、トリフェニレン、トリナフタレン等が挙げられる。
「アリール」は、それ自体又は別の置換基の一部として、親芳香族環系の単一炭素原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される、指定された数の炭素原子（すなわち、Ｃ６－Ｃ１４は６個～１４個の炭素原子を意味する）を有する一価の芳香族炭化水素基を指す。典型的なアリール基には、限定されるものではないが、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキシレン、ａｓ－インダセン、ｓ－インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピランスレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレン等、及びそれらの各種ヒドロ異性体から誘導される基が挙げられる。具体的な例示的アリールには、フェニル及びナフチルが含まれる。
「アリールアルキル」は、それ自体又は別の置換基の一部として、炭素原子、いくつかの実施形態では末端又はｓｐ３炭素原子に結合している水素原子の１つがアリール基で置き換えられている非環式アルキル基を指す。典型的なアリールアルキル基には、限定されるものではないが、ベンジル、２－フェニルエタン－１－イル、２－フェニルエテン－１－イル、ナフチルメチル、２－ナフチルエタン－１－イル、２－ナフチルエテン－１－イル、ナフトベンジル、２－ナフトフェニエタン－１－イル等が挙げられる。特定の飽和度を有するアルキル部分が意図される場合、アリールアルカニル、アリールアルケニル及び／又はアリールアルキニルの名称が使用される。例えば、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキルのように、定義された炭素原子の数が記載されている場合、その数は、アリールアルキル基を構成する炭素原子の総数を指す。
「親ヘテロ芳香族環系」は、１つ又は複数の炭素原子がそれぞれ独立して、同じ又は異なるヘテロ原子又はヘテロ原子基で置き換えられている親芳香族環系を指す。炭素原子を置換する典型的なヘテロ原子又はヘテロ原子基には、限定されるものではないが、Ｎ、ＮＨ、Ｐ、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｓｉ等が挙げられる。具体的に「親ヘテロ芳香族環系」の定義に含まれるのは、環のうち１つ又は複数が芳香族であり、環のうち１つ又は複数が飽和又は不飽和である、例えば、ベンゾジオキサン、ベンゾフラン、クロマン、クロメン、インドール、インドリン、キサンテン等の縮合環である。また、「親ヘテロ芳香族環系」の定義に含まれるのは、例えばベンゾピロン及び１－メチル－１，２，３，４－テトラゾール等の一般的な置換基を含む認識された環である。典型的な親ヘテロ芳香族環系には、限定されるものではないが、アクリジン、ベンズイミダゾール、ベンズイソキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール、ベンゾフラン、ベンゾピロン、ベンゾチアジアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾオキサキシン、ベンゾオキサゾール、ベンゾオキサゾリン、カルバゾール、β－カルボリン、クロマン、クロメン、シノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、イソチアゾール、イソキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナントロリン、フェナンジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサンテン等が挙げられる。
「ヘテロアリール」は、それ自体又は別の置換基の一部として、親芳香族環系の単一原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される、指定された数の環原子（例えば、「５－１４員」は５個～１４個の炭素原子を意味する）を有する一価の芳香族基を指す。典型的なヘテロアリール基には、限定されるものではないが、アクリジン、ベンズイミダゾール、ベンズイソキサゾール、ベンゾジオキサン、ベンゾジアソール、ベンゾフラン、ベンゾピロン、ベンゾチアジアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾトリアゾール、ベンズオキサジン、ベンゾオキサゾール、ベンゾオキサゾリン、カルバゾール、β－カルボリン、クロマン、クロメン、シノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、イソチアゾール、イソキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナンジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサンテン等、及びそれらの各種のヒドロ異性体から誘導される基が挙げられる。
「ヘテロアリールアルキル」は、それ自体又は別の置換基の一部として、炭素原子、いくつかの実施形態においては末端又はｓｐ３炭素原子に結合している水素原子の１つが、ヘテロアリール基で置き換えられている非環式アルキル基を指す。特定の飽和度を有するアルキル部分が意図される場合、ヘテロアリールアルカニル、ヘテロアリールアルケニル及び／又はヘテロアリールアルキニルの名称が使用される。例えば、６－２０員ヘテロアリールアルキルのように、定義された原子の数が記載されている場合、その数は、アリールアルキル基を構成する原子の総数を指す。
「ハロアルキル」は、それ自体又は別の置換基の一部として、水素原子の１つ又は複数がハロゲンで置換されたアルキル基を指す。したがって、用語「ハロアルキル」は、モノハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキル等からパーハロアルキルに至るまで含むことを意味する。例えば、「（Ｃ１－Ｃ２）ハロアルキル」という表現には、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、１－フルオロエチル、１，１－ジフルオロエチル、１，２－ジフルオロエチル、１，１，１－トリフルオロエチル、パーフルオロエチル等が含まれる。
上で定義された基は、当技術分野で一般的に使用される接頭辞及び／又は接尾辞を含んで、追加の十分に認識された置換基を作製することができる。非限定的な具体例として、「アルキルオキシ」及び／又は「アルコキシ」は式－ＯＲ’’の基を指し、「アルキルアミン」は式－ＮＨＲ’’の基を指し、「ジアルキルアミン」は式－ＮＲ’’Ｒ’’の基を指し、式中、各Ｒ’’はアルキルである。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、単離された核酸分子、ベクターＤＮＡ、及び染色体ＤＮＡ等の、当技術分野で理解されるような様々な形態のデオキシリボ核酸を指す。「核酸」は、任意の形態のＤＮＡ又はＲＮＡ（リボ核酸）を指す。本明細書で使用される用語「単離された核酸分子」１は、その本来の環境から除去された核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指す。単離された核酸分子のいくつかの例には、ベクターに含有される組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部分的又は実質的に精製された核酸分子、及び合成ＤＮＡ分子が含まれる。
「単離された」核酸は、核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡ中で、核酸に本来的に隣接する配列（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を含み得ない。更に、ｃＤＮＡ分子等の「単離された」核酸分子は、組換え技術によって生成される場合には、他の細胞材料若しくは培地を実質的に含まず、又は化学合成される場合には、化学的前駆体若しくは他の化学物質を含み得ない。
「短い縦列反復」又は「ＳＴＲ」遺伝子座は、短い反復配列要素を含むゲノムＤＮＡの領域を指す。繰り返される配列要素は、限定されるものではないが、通常、３～７塩基対の長さである。各配列要素は、ＳＴＲ内で少なくとも１回繰り返され、本明細書では「繰り返し単位」として示す。用語ＳＴＲは、配列の少なくとも１つが縦列で少なくとも２回繰り返されるという条件で、複数の反復単位が縦列で又は介在塩基によって繰り返される、ゲノムＤＮＡの領域を包含する。
「多型短い縦列反復遺伝子座」は、ゲノムＤＮＡの特定の領域における反復配列要素の数（及び配列の正味の長さ）が、対立遺伝子ごと、及び個体ごとに異なるＳＴＲ遺伝子座を指す。
本明細書で使用される「対立遺伝子ラダー」は、遺伝子座からの増幅された対立遺伝子からなる標準サイズのマーカを指す。「対立遺伝子」は、ＤＮＡのセグメントに関連する遺伝的変異、すなわち、同じ遺伝子座を占めるＤＮＡ配列の２つ以上の代替形態のうちの１つである。
「生化学的命名法」は、本明細書で使用される標準的な生化学的命名法を指し、ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、及びシトシン（Ｃ）として示される。対応するヌクレオチドは、例えば、デオキシグアノシン－５’－三リン酸（ｄＧＴＰ）である。
「ＤＮＡ多型」とは、ＤＮＡ配列中の異なる２つ以上のヌクレオチド配列が、同じ交配集団内で共存している状態を指す。
「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ又はｇｅｎｅｔｉｃ ｌｏｃｕｓ）」は、染色体上の具体的な物理的位置を指す。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体上の同一部位に位置する。
「遺伝子座特異的プライマ」は、少なくともその遺伝子座の対立遺伝子の１つについて、記載された遺伝子座の一部分又はその相補鎖と特異的にハイブリダイズし、増幅方法において使用される条件下で他のＤＮＡ配列と効率的にハイブリダイズしないプライマを指す。
「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、変性、プライマによるアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼ酵素による伸長の繰り返しサイクルを使用して、標的ＤＮＡ配列のコピー数を約１０6倍以上に増幅させる技術を指す。核酸を増幅するためのＰＣＲプロセスは、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号に含まれ、プロセスの説明のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。ＰＣＲの反応条件には、反応の化学成分とその濃度、反応サイクルで使用される温度、反応のサイクル数、及び反応サイクルの段階の期間が含まれる。
本明細書で使用される「増幅する」は、特定のヌクレオチド配列の量を酵素的に増加させるプロセスを指す。この増幅は、限定されるものではないが、一般的にはＰＣＲによって達成される。本明細書で使用される「変性」は、アニーリング状態からの２つの相補的ヌクレオチド鎖の分離を指す。変性は、例えば、緩衝剤のイオン強度、温度、又は塩基対相互作用を妨害する化学物質等の多くの要因によって引き起こされ得る。本明細書で使用される「アニーリング」は、ヌクレオチド鎖間の特異的相互作用を指し、ワトソン・クリック型塩基対によって決定される、鎖間の相補性に実質的に基づいて各鎖が互いに結合する。アニーリングを発生させるために、相補性が１００％である必要はない。本明細書で使用される「伸長」は、プライマオリゴヌクレオチド及び標的核酸がアニーリングした後の増幅サイクルを指し、ポリメラーゼ酵素は、標的核酸を複製鋳型として使用して、好適なサイズの断片へのプライマ伸長をもたらす。
「プライマ」は、プライマの３’ 末端が、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用して重合及び伸長の部位として作用できるように、遺伝子座のＤＮＡ鎖とハイブリダイズする、一本鎖オリゴヌクレオチド又はＤＮＡ断片を指す。「プライマ対」は、増幅されるＤＮＡ配列の一方の端の一本鎖にハイブリダイズするプライマ１と、増幅されるＤＮＡ配列の相補鎖のもう一方の端にハイブリダイズするプライマ２と、とを含む２つのプライマを指す。「プライマ部位」は、プライマがハイブリダイズする標的ＤＮＡの領域を指す。
「遺伝子マーカ」は、一般に、ＤＮＡタイピング等の分析対象の特性を備えたゲノムＤＮＡの対立遺伝子であり、個々はＤＮＡの変異に基づいて区別される。ほとんどのＤＮＡタイピング方法は、集団内で少なくとも２つの異なる形態又は対立遺伝子に現れることが知られているＤＮＡマーカのうち１つ又は複数の領域の長さ及び／又は配列の違いを検出及び分析するように設計されている。このような変異は「多型」と呼ばれ、そのような変異が発生するＤＮＡのいずれの領域も「多型遺伝子座」と呼ばれる。ＤＮＡタイピングを実行する可能な方法の１つは、ＰＣＲ増幅技術（ＫＢ Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号）を長さ変異多型の分析と合わせることに関与する。従来、ＰＣＲは比較的小さなＤＮＡセグメントを確実に増幅するためにのみ、すなわち、長さが３，０００塩基未満のＤＮＡセグメントを増幅するのみに使用することができた（Ｍ．Ｐｏｎｃｅ及びＬ．Ｍｉｃｏｌ（１９９２）、ＮＡＲ ２０（３）：６２３；Ｒ．Ｄｅｃｏｒｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）、ＤＮＡ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬ ９（６）：４６１４６９）。短縦列反復（ＳＴＲ）、ミニサテライト、可変数の縦列反復（ＶＮＴＲ）は、長さの変異の多型の例である。ミニサテライト又はＶＮＴＲを含むＤＮＡセグメントは、通常、ＰＣＲによって確実に増幅するには長すぎる。対照的に、増幅プロトコルを設計して、ＤＮＡの他の可変長領域から可能な生成物よりも小さな生成物を生成できるため、約３～７ヌクレオチドの繰り返し単位を含むＳＴＲは十分に短く、ＰＣＲ用途における遺伝子マーカとして有用である。
本明細書で使用される用語「キット」は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイに関して、そのような送達システムには、反応試薬（例えば、好適な容器内のオリゴヌクレオチド、酵素、プライマセット（複数可）等）及び／又は支持体材料（例えば、緩衝液、アッセイを行うための書面による指示等）の１つの場所から別の場所への貯蔵、輸送又は送達を可能にするシステムが含まれる。例えば、キットは、関連する反応試薬及び／又は支持体材料を含む１つ又は複数の収容器（例えば、箱）を含むことができる。本明細書で使用される用語「断片化キット」は、キットの全成分の各サブポーションを含む２つ以上の別個の容器を含む送達システムを指す。容器は、目的の受取人に一緒に又は別々に送達される。例えば、第１の容器はアッセイで使用する酵素を含み、第２の容器はオリゴヌクレオチドを含む。実際、キットの全成分の各サブポーションを含む２つ以上の別個の容器を含む任意の送達システムは、用語「断片化キット」に含まれる。対照的に、「組み合わせたキット」は、反応アッセイの全ての構成要素を単一の容器（例えば、所望の成分のそれぞれを収容する単一の箱）に含む送達システムを指す。用語「キット」には、断片化されたキット及び組み合わせたキットの両方が含まれる。
４．２ 例示的な実施形態
本開示は、ローダミン染料を含む標識部分を有するオリゴヌクレオチドを化学的に合成するために使用できる試薬を提供する。従来、部分的には、オリゴヌクレオチドの段階的化学合成において一般的に用いられる合成及び／又は脱保護条件に対して安定である、ローダミン含有合成試薬が有用性の欠如のために、ローダミン標識オリゴヌクレオチドを化学的に合成することは困難であった。今日では、ＮＨ－ローダミン染料の環外アミン基をアセチル基等の塩基不安定性保護基で保護することにより、オリゴヌクレオチドの固体合成で一般的に用いられる化学合成及び脱保護条件に対して安定なＮ－保護ＮＨ－ローダミン染料がもたらされることが発見された。結果として、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミンは、ローダミン染料を含む標識部分で標識されたオリゴヌクレオチドを合成するために使用することができる試薬に組み込むことができ、それにより、合成後に標識を付着させる必要がなくなる。合成中に標識が付けられるため、得られた標識オリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣを使用せずに精製して使用できる。
試薬は、オリゴヌクレオチドの段階的固体合成でよく知られている試薬の様々な特徴及び化学的性質を利用しており、オリゴヌクレオチド鎖の段階的固体合成中に、ヒドロキシル基に結合する合成試薬の形態、あるいは合成オリゴヌクレオチドを得るための段階的方式において、例えばヌクレオシドホスホラミダイト試薬等のヌクレオシドモノマー試薬及び／又は任意の他の試薬が結合する個体支持体試薬の形態をとることができる。
合成試薬及び個体支持体試薬は、ヌクレオシド部分を含むことができるという点で、本質的にヌクレオシド性であり得るか、又は本質的に非ヌクレオシド性であり得る。
標識部分を含む本明細書に記載の全ての試薬は、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン染料又は部分を含む。Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン染料は、標識部分を含む唯一の染料であることができ、あるいは、より大きな染料ネットワークを含む２つ以上の染料のうちの１つであることができる。固体支持体試薬は、固体支持体、及び追加の基が結合できる１つ又は複数の合成ハンドルを更に含む。合成試薬は、試薬を一級ヒドロキシル基に結合させるのに有用なＰＥＰ基を更に含み、任意に１つ又は複数の合成ハンドルを含んでもよい。試薬を含む様々な部分及び基は、それらが各機能を実施できるようにする任意の方式及び／又は方向で互いに連結することができる。これらの部分及び基は、この部分に含まれる結合基を介して互いに連結することができ、又はリンカーの補助により、互いに連結することができる。
本明細書に記載の試薬を含む様々な部分、基、及びリンカーは、以下により詳細に記載される。
４．３ リンカー及び結合基
本明細書に記載の試薬を含む様々な基及び部分は、典型的には、リンカーによって互いに連結されている。特定のリンカーの独自性は、部分的には、互いに連結している部分の独自性に依存するであろう。一般に、リンカーは、ホスファイトトリエステル法によるオリゴヌクレオチドの合成に一般的に使用される条件等、標識オリゴヌクレオチドの合成に使用される合成条件に対して安定である原子又は官能基の実質的に任意の組合せを含むことができるスペーシング部分を含み、リンカーは、構造が線状、分岐状、又は環状であるか、又は線状、分岐状及び／又は環状構造の組合せを含むことができる。スペーシング部分は、本質的にモノマーであり得るか、又は本質的にポリマーである領域であるか、又はそれを含み得る。スペーシング部分は、特定の条件下で開裂する能力、又は特定の程度の剛性、柔軟性、疎水性及び／又は親水性等の特定の特性を有するように設計することができる。
以下でより詳細に説明するように、本明細書に記載の試薬の多くの実施形態は、シントンを特定の方法で互いに凝縮して、所望の試薬を得ることによって合成される。各シントンは、典型的には、所望の結合を形成するのに好適な１つ又は複数の結合基を含む。一般に、結合基は、別の官能基Ｆzと反応するか、又は活性化されて反応して、共有結合Ｙ－Ｚを得ることができる、官能基Ｆyを含み、式中、Ｙは、Ｆyによって提供される結合部分を表し、ＺはＦzによって提供される部分を表す。このような基Ｆy及びＦzは、本明細書では「相補的官能基」と呼ばれる。
互いに共有結合を形成できる相補的官能基の対は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態において、Ｆy又はＦzのうち１つが、求核基を含み、Ｆy又はＦzのうち他方は、求電子基を含む。種々の合成及び他の条件に対して安定である、結合（又は結合を形成するために好適に活性化される、又は活性化され得るその前駆体）を形成するのに有用な相補的な求核基及び求電子基は、当技術分野で周知である。本明細書に記載の様々な試薬において結合を行うために使用できる好適な相補的な求核基及び求電子基の例、並びにこれらから形成される結果として生じる結合を、以下の表１に提供する。
Figure 2022514397000006
したがって、リンカーシントンは一般に式ＬＧ－Ｓｐ－ＬＧで表すことができ、式中、各ＬＧは他とは独立して結合基を表し、Ｓｐはスペーシング部分を表す。いくつかの実施形態において、リンカーシントンは、式Ｆz－Ｓｐ－Ｆzによって記載することができ、式中、各Ｆzは、上に記載したように、他とは独立して、相補的な求核基又は求電基の対の一員を表す。具体的な実施形態において、各Ｆzは、他とは独立して、上記の表１に列挙された群から選択される。このタイプのリンカーシントンは、式－Ｚ－Ｓｐ－Ｚ－のリンカー部分を形成し、式中、各Ｚは、他とは独立して、上記の結合の一部分を表す。本明細書に記載の試薬において、特定の基及び部分を互いに連結させるのに好適な特定のリンカーは、試薬の例示的な実施形態に関連してより詳細に議論されるであろう。本明細書に記載の試薬を含む様々な基及び部分を互いに連結させるために使用できるリンカーの非限定的な例示的実施形態を図２に示す。図２において、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ、互いに独立して、前述のように、官能基Ｆzによって提供される結合の一部分を表し、Ｋは、－ＣＨ－及び－Ｎ－から選択される。図２に示されるリンカーのいくつかの具体的な実施形態において、Ｚ1又はＺ2のうち一方は－ＮＨ－であり、他方は－Ｏ－、Ｃ（Ｏ）－及び－Ｓ（Ｏ）2－から選択される。
４．４ 標識部分
本明細書に記載の試薬は、特定の特性を有する保護基で環外アミン基の１つが保護されているＮＨ－ローダミン染料を含む標識部分を含むことができる。一般に、ローダミン染料は４つの主な特性、（１）親キサンテン環、（２）環外アミン置換基、（３）環外イミニウム置換基、及び（４）オルト位がカルボキシル基で置換されたフェニル基によって特性決定される。いくつかの実施形態において、本開示のＮＨ－ローダミン染料は、一般的に、式（Ｉａ）によって記載することができる。いくつかの実施形態において、環外アミン及び／又はイミニウム基は、典型的には、親キサンテン環のＣ３’及びＣ６’炭素原子に位置するが、親キサンテン環がＣ３’とＣ４’炭素及び／又はＣ５’とＣ６’炭素に縮合したベンゾ基を含む「伸長した」ローダミンも知られている。これらの伸長したローダミンでは、特徴的な環外アミン及びイミニウム基が、伸長したキサンテン環の対応する位置に位置する。
カルボキシル置換フェニル基は、親キサンテン環のＣ１炭素に結合している。オルトカルボキシル置換基の結果として、ローダミン染料は２つの異なる形態、（１）開いた酸形態、及び（２）閉じたラクトン形態で存在し得る。いずれの作業理論に束縛されることを意図するものではないが、本明細書に記載される例示的なＮ－保護ＮＨ－ローダミン染料のＮＭＲスペクトルは、染料の閉じたスピロラクトン形態と一致するため、本明細書に記載の試薬の標識部分を含むＮ－保護ＮＨ－ローダミン染料は、閉じたスピロラクトン形態であると考えられる。したがって、様々なローダミン、及びそれらの保護されていない対応物は、本明細書ではそれらの閉じたスピロラクトンの形態で示されている。しかし、これは単なる便宜上のものであり、本明細書に記載の様々な試薬をラクトン形態の染料に限定することを意図していないことに留意されたい。
閉じたスピロラクトン形態では、親キサンテン環のＡ及びＣ環は芳香族であり、Ｃ３’及びＣ６’置換基は両方ともアミンである。本明細書に記載の標識部分に含まれるローダミン染料の環外アミン基は、これらのアミン基が第一級又は第二級アミンであるように、非置換又は一置換のいずれかである。このようなローダミン染料は、本明細書では「ＮＨ－ローダミン」と呼ばれる。したがって、本明細書で使用される場合、「ＮＨ－ローダミン」は、一般に、以下の親ＮＨ－ローダミン環構造を含み、
Figure 2022514397000007
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14のそれぞれは、本明細書で定義される通りである。上に示した親 ＮＨ－ローダミン環では、ローダミン染料の閉じたスピロラクトン型に一般的に使用される番号付け規則から採用された任意の番号付け規則を使用して、様々な炭素原子が番号付けされる。この番号付けシステムは単なる便宜上のため使用されており、いかなる方法でも制限することを意図するものではない。
本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、例示的な標識部分は、
Figure 2022514397000008
又は、特に式
Figure 2022514397000009
又は、特に式
Figure 2022514397000010
 とすることができる。
驚くべきことに、本明細書に記載の標識部分が、バイオアッセイにおけるそれらの適用に有利な特性を有することが発見された。特に、式（ＩＩ．１）、（ＩＩ．２）、又は特に（ＩＩ．３）の標識部分が、より良好な分析及び高い感度を提供するアッセイ形式における用途を可能とするスペクトル特性を有することが発見された。
構造式（Ｉａ）のＮＨ－ローダミン環及び本明細書に記載の他の式において、Ｒ5は水素又はＲ5が結合している環外アミンを置換する置換基を表す。いくつかの実施形態において、Ｒ5は、置換又は非置換のアルキルアリール又はアリールアルキル基であり得る。いくつかの実施形態において、Ｒ5は保護基であり得る。
あるいは、Ｃ１’及びＣ２’置換基は一緒になって、置換又は非置換アリールブリッジを形成することができる。いくつか実施形態においてクエンチング置換が望ましい場合があるが、いくつかの実施形態において、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ４’、Ｃ５、Ｃ７’、及びＣ８’炭素を置換するために使用される基は、ローダミン染料のクエンチングを促進しない。ローダミン染料をクエンチングできる置換基には、カルボニル、カルボキシレート、重金属、ニトロ、ブロモ、及びヨードが含まれる。構造式（Ｉａ）の親ＮＨ－ローダミン環のＣ４、Ｃ５、Ｃ６及びＣ７位置の炭素原子も、互いに独立して、任意の置換基を含むことができる。これらの置換基は、上述の様々な置換基から選択することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ４及びＣ７位置の炭素原子は、親ＮＨ－ローダミン染料が、ＮＨ－４，７－ジクロロローダミン染料であるように、クロロ基で置換されている。本明細書に記載の試薬の標識部分に含めることができる構造式（Ｉａ）の親ＮＨローダミン環を含む膨大な数のローダミン染料は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第６，２４８，８８４号、米国特許第６，１１１，１１６号、米国特許第６，０８０，８５２号、米国特許第６，０５１，７１９号、米国特許第６，０２５，５０５号、米国特許第６，０１７，７１２号、米国特許５，９３６，０８７号、米国特許第５，８４７，１６２号、米国特許第５，８４０，９９９、米国特許第５，７５０，４０９号、米国特許第５，３６６，８６０号、米国特許第５，２３１、１９１号、米国特許第５，２２７，４８７号、国際公開第９７／３６９６０号、国際公開第９９／２７０２０号、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２４７１－２４８３；Ａｒｄｅｎ－Ｊａｃｏｂ、「Ｎｅｕｅ Ｌａｎｗｅｌｌｉｇｅ Ｘａｎｔｈｅｎ Ｆａｒｂｓｔｏｆｆｅ ｆｕｒ ＦｌｕｏｒｅｓｚｅｎＺＳｏｎｄｅｎ ｕｎｄ Ｆａｒｂｓｔｏｆｆ Ｌａｕｅｒ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９９３；Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ５：２４７－２６１；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２８１６ ２８２２；及びＲｏｓｅｎｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４５００ ４５０４に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。環外アミンが本明細書に記載の第一級又は第二級アミンであるこれらの参考文献に記載の染料、又はそのようなＮＨローダミン染料の４，７－ジクロロ類似体のいずれも、本明細書に記載の試薬の標識部分に含むことができる。
本明細書に記載の試薬は、標識オリゴヌクレオチドの化学合成に使用されるため、Ｒ5は、オリゴヌクレオチドの合成に使用される有機合成条件に対して安定な保護基であり得る。上記のように、Ｒ5は、アミドの形態でアミンを保護する保護剤、例えば、カルボキサミド、スルホンアミド又はホスホラミダイトであることができ、この方法で環外アミンを保護するものとして選択することができ、閉じたラクトンの形態で保護されたＮＨ－ローダミンを「ロック」して、本明細書に記載の試薬の安定性に寄与する。必須ではないが、合成オリゴヌクレオチドの核酸塩基の環外アミンを保護する基を除去するために使用される条件下で不安定なＲ5保護基を利用して、保護基を単一の工程で除去できると便利な場合がある。
合成オリゴヌクレオチドの合成及び脱保護に使用される条件は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．Ｉ、Ｂｅａｎｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．、Ｅｄｓに記載されている。Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、２００２に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。簡潔には、ホスホラミダイト試薬を使用する合成方法には、次の複数のラウンド、（ｉ）ジクロロメタンの２．５％又は３％のジ－又はトリクロロアセチル酸による処理によって行うことができる、遊離ヒドロキシル除去のためのＤＭＴ脱保護、（ｉｉ）０．４５Ｍ 又は０．５Ｍのテトラゾールを含むアセトニトリル中で行うことができる、ヌクレオシド又は他のホスホラミダイト試薬を、遊離ヒドロキシルに結合させること、（ｉｉｉ）Ｉ 2／２，６－ルチジン／Ｈ２Ｏで処理することにより行うことができる酸化、及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の６．５％無水酢酸で処理し、その後ＴＨＦ中の１０％１－メチルイミダゾール（ＭＩ）で処理することによって行われる結合が関与する。
合成の様々な工程を実行するための他の条件も当技術分野で知られている。例えば、ホスホラミダイト結合は、０．２５Ｍの５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、０．２５Ｍの４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）又は０．２５Ｍの５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）を含むアセトニトリル中で行うことができる。酸化は、ＴＨＦ／Ｈ2Ｏ／ピリジン（７：２：１）中、０．１Ｍ、０．０５Ｍ又は０．０２ＭのＩ2で行うことができる。キャッピングは、ＴＨＦ／ルチジン／無水酢酸で処理した後、ＴＨＦ中の１６％ＮＭＩによる処理、ＴＨＦ中６．５％のＤＭＡＰによって処理した後、ＴＨＦ中の１０％メルムによる処理、又はＴＨＦ中 １０％メルムで処理した後、ＴＨＦ中１６％ メルムで処理することによって行うことができる。
ヌクレオシドホスホラミダイト試薬は、濃縮水酸化アンモニウムを室温で４～１７時間処理するか、又は０．０５Ｍ炭酸カリウムのメタノール溶液で処理するか、又は２５％ ｔ－ブチルアミンのＨＯ／ＥｔＯＨ溶液で処理する等によって、穏やかな条件下で除去できる基で保護されているが、合成試薬からの保護基の除去及び開裂は、典型的には、濃縮水酸化アンモニウムで６０゜Ｃで１～１２時間処理することにより行うことができることも、当業者に知られている。当業者は、特定の合成及び脱保護及び／又は切開裂条件下での使用に好適な特性を有する保護基を容易に選択することができるであろう。例えば、Ｇｒｅｅｎｅ＆Ｗｕｔｓの’’Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ’’ ３ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９９（以下、’’Ｇｒｅｅｎ＆Ｗｕｔｓ’’）、例えば、３０９～４０５頁では、広範囲の様々なアミン保護基が教示されている。当業者であれば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｗｕｔｓで教示されているものの中から好適な特性を有する保護基 Ｒ5又はＲ10を容易に選択することができる。いくつかの実施形態において、保護基Ｒ5又はＲ10は、式－Ｃ（Ｏ）Ｒ15のアシル基であり、式中、Ｒ15は、水素、低級アルキル、メチル、－ＣＸ3、－ＣＨＸ2、－ＣＨ2Ｘ、－ＣＨ、Ｏd、及び低級アルキル、メチル、Ｘ、ＯＲd、シアノ又はニトロ基で任意に一置換されたフェニルから選択され、Ｒ’’は低級アルキル、フェニル、及びピリジルから選択され、各Ｘはハロ基、典型的には、フルオロ、又はクロロである。いくつかの実施形態において、Ｒ15はメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ15はトリフルオロメチルである。－Ｃ（Ｏ）Ｒ15によって定義されるもの等のアシル保護基は、当技術分野で周知のように、「塩基不安定」ホスホラミダイト試薬で合成されたオリゴスから保護基を除去するために使用される穏やかな条件を含む、様々な塩基条件下で、除去することができる。いくつかの実施形態において、Ｒ5は－Ｃ（Ｏ）Ｒ15であり、式中、Ｒ15は、水素、低級アルキル、－ＣＸ3、－ＣＨＸ2、－ＣＨ2Ｘ、－ＣＨ2－ＯＲd 、及び場合により低級アルキル、－Ｘ、－ＯＲd、シアノ又はニトロ基で一置換されたフェニルからなる群から選択され、式中、Ｒdは低級アルキル、フェニル及びピリジルからなる群から選択され、各Ｘはハロ基である。使用できる条件の例は、上で指定されている。後の部分でより詳細に説明するように、標識部分を含むＮ－保護ＮＨ－ローダミン部分は、他の基又は部分に結合することができる。例えば、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミンは、標識部分を含む別の染料、ＰＥＰ基、リンカー、合成ハンドル、クエンチング部分、塩基対相互作用を安定化するように機能する部分（例えば、挿入染料又はマイナーグルーブバインディング分子等）、又は他の部分に結合することができる。そのような結合は、典型的には、試薬の合成に使用されるＮ－保護ＮＨ－ローダミンシントンに結合した結合基ＬＧ（リンカーに関連して上に記載）を介して行われる。
結合基ＬＧは、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン シントンの利用可能な任意の炭素原子、又はこれらの炭素原子の１つに結合した置換基に結合することができる。結合基の位置は、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミンシントンが結合する基又は部分に、部分的に依存し得る。いくつかの実施形態において、結合基は、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミンシントンのＣ１’、Ｃ２’、Ｃ４’、Ｃ５’、Ｃ７’、Ｃ８’、Ｃ５、Ｃ６、又はＣ７位置に結合している。特定の実施形態において、結合基はＣ４’、Ｃ５’、Ｃ５又はＣ６位置で結合している。
Ｎ－保護ＮＨ－ローダミンシントンは、単一の結合基ＬＧを含むことができ、又は複数の結合基ＬＧを含むことができる。複数の結合基を使用する実施形態において、結合基は同じでも異なっていてもよい。互いに異なる複数の結合基 ＬＧ を含むＮ－保護ＮＨローダミンシントンは、直交化学を使用して、親ＮＨ－ローダミン環の異なる位置に結合した異なる基又は部分を有し得る。結合基の独自性は、場合によっては、親ＮＨ－ローダミン環上の結合基の位置に依存する。結合基ＬＧが親ＮＨ－ローダミン環のＣ４’－又はＣ５’－位置に結合しているいくつかの実施形態において、結合基ＬＧは、式－（ＣＨ）n－Ｆyの基であり、式中、ｎは０～１０の範囲の整数であり、Ｆyは本明細書に記載の通りである。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｆyは－ＮＨである。
結合基ＬＧが親ＮＨ－ローダミン環の５－位置又は６－位置に結合しているいくつかの実施形態において、結合基ＬＧは式（ＣＨ2）n、－Ｃ（Ｏ）ＯＲfの基であり、式中、Ｒfは、水素及び良好な脱離基から選択され、ｎは前に定義した通りである。いくつかの特定の実施形態において、結合基ＬＧは、ＮＨＳエステルを含む。いくつかの特定の実施形態において、ｎは０であり、ＲfはＮＨＳである。
いくつかの実施形態において、Ｎ－保護ＮＨローダミンは、本明細書に記載の様々な試薬の標識部分を含む。
上で議論したように、標識部分は、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン等の１つ又は複数の追加の染料を含むことができ、これは一度脱保護されると、より大きなエネルギー転移染料ネットワークの一員となる。このようなエネルギー転移染料ネットワークは、当技術分野で周知であり、スペクトル特性が一致し、及び／又は互いに相対距離が調整された蛍光染料の組合せを含み、ネットワーク内の１つの蛍光染料が、好適な波長の入射照射によって励起された際に、その励起エネルギーがネットワーク内の別の蛍光染料に転移され、次いでその励起エネルギーがネットワーク内の更に別の蛍光染料に転移され、ネットワーク内の最終的なアクセプタ染料による蛍光が生じる。染料ネットワークは、長いストークスシフトを有する標識部分を提供する。このようなネットワークでは、励起エネルギーをネットワーク内の別のフルオロフォアに転移又は供与するフルオロフォアを「ドナー」と呼ぶ。別のフルオロフォアから励起エネルギーを受け取る、又は受け入れるフルオロフォアは、「アクセプタ」と呼ばれる。２つの蛍光染料のみを含む染料ネットワークでは、一方がドナーとして機能し、もう一方がアクセプタとして機能する。３つ以上の蛍光染料を含む染料ネットワークでは、少なくとも１つの染料がドナーとアクセプタの両方として機能する。染料ネットワークがどのように機能するかの原理、並びにそのようなネットワークを作製するのに好適な個々の染料を選択及び結合させるための基準はよく知られており、例えば、Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２：７８－８８に記載されている。
染料ネットワークを含む本明細書に記載の標識部分において、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン染料は、一度脱保護されると、ドナー又はアクセプタ、あるいはドナーとアクセプタの両方として機能し、ネットワーク及び所望の入射を含む他の染料の独自性並びに蛍光波長に依存する。ＮＨ－ローダミン染料のドナー及び／又はアクセプタとして使用するのに好適な多くの染料が当技術分野で知られており、限定ではなく例として、キサンテン染料（例えば、フルオレセイン、ローダミン及びロードール染料）、ピレン染料、クマリン染料（例えば、ヒドロキシ及びアミノクマリン）、シアニン染料、フタロシアニン染料及びランテニド錯体が挙げられる。エネルギー転移染料ネットワークとの関連におけるこれらの染料の具体的、非限定的な例は、Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３８：１６５－１７０；Ｍｅｄｉｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（２６）：９６１２－９６１７；米国特許第５，８００，９９６号；Ｓｕｄｈａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２２：１４４３－１４４５；米国特許第６，３５８，６８４号；Ｍａｊｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．、２００５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５１：１１２３－１１４５；Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．８２（３）：２１１－２３１；Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．、２００１、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊ．８１（１）：５０１－５１５；Ｄｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ２７（１）：３－１９；及びＫｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１：２５１－２７４に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の原理に従って好適に保護することができるこれらの染料はいずれも、染料ネットワークを含む標識部分における、ドナー及びアクセプタ染料として使用することができる。いくつかの実施形態において、ネットワークを含むドナー及び／又はアクセプタ染料の１つ又は複数は、本明細書に記載のＮ－保護ＮＨ－ローダミン染料であり得る。ドナー及び／又はアクセプタ染料をローダミン染料に結合させて染料ネットワークを形成するための特定の位置、並びにそのような染料を結合させるのに有用な特定の結合及びリンカーは、当技術分野で周知である。具体的な例は、例えば、米国特許第６，８１１，９７９号、米国特許第６，００８，３７９号、米国特許第５，９４５，５２６号、米国特許第５，８６３，７２７号、及び米国特許第５，８００，９９６号に記載され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、ドナー染料とアクセプタ染料を結合させるリンカーは、米国特許第６，８１１，９７９号に記載されているアニオン性リンカーであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる（例えば、第１７欄の第２５行～第１８欄の第３７行及び図１～１７の開示を参照されたい）。
本明細書に記載の試薬のいくつかの実施形態において、標識部分は、ＮＨ－ローダミン染料に対するドナー染料を含む。いくつかの実施形態において、ドナー染料は、フルオレセイン又はローダミン染料、例えば、本明細書に記載のＮＨ－ローダミン染料のうちの１つである。特定の実施形態において、ドナー染料はフルオレセイン染料である。フルオレセイン染料はローダミン染料と構造が類似しているが、例外として親キサンテン環の３－位置と ６－位置（構造式（Ｉａ）のＮＨ－ローダミン環の３’－及び６’－位置に対応）がヒドロキシル基で置換されている。ローダミンと同様に、フルオレセインは、親キサンテン環のＣ３’及びＣ４’及び／又はＣ５’及びＣ６’位置の炭素原子が、ベンゾ基等のアリールブリッジに含まれる伸長環構造も有する。したがって、フルオレセインには、一般に、以下の構造式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）及び（ＩＶｃ）の化合物が含まれる。
Figure 2022514397000011
ＮＨ－ローダミンのように、構造式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）及び（ＩＶｃ）のフルオレセイン環の位置Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ２’’、Ｃ４’、Ｃ４’’、Ｃ５’、Ｃ５’’、Ｃ７’、Ｃ７’’、Ｃ８’、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６及びＣ７の炭素は、ＮＨ－ローダミンについて前述したような様々な異なる置換基で置換することができる。
本明細書に記載の標識部分に含まれる場合、Ｃ３’及びＣ６’位置のヒドロキシルは、上記のＮＨ－ローダミンの環外アミンを保護する基と同じ一般的特性を有する保護基で保護されるべきである。したがって、特定の実施形態において、保護基は、オリゴヌクレオチドを合成するために使用される条件、例えばホスファイトトリエステル法を介してオリゴヌクレオチドを合成及び酸化するために使用される条件に対して安定であり、例えば、室温又は５５°Ｃでの濃縮水酸化アンモニウム中でのインキュベーション等の、合成樹脂から合成オリゴヌクレオチドを脱保護及び／又は開裂するために典型的に使用される条件下では不安定である。
Ｃ３’及びＣ６’環外ヒドロキシルが保護基を含むフルオレセインは、本明細書では「Ｏ－保護フルオレセイン」と示す。構造式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）及び（ＩＶｃ）のフルオレセインにそれぞれ対応する、Ｏ－保護フルオレセインは、以下の構造式（Ｖａ）、（Ｖｂ）及び（Ｖｃ）として示され、
Figure 2022514397000012
式中、Ｒ5は保護基を表す。
好適に保護され、ＮＨ－ローダミン部分のドナーとして使用するために標識部分に組み込むことができる様々な異なるフルオレセイン染料が当技術分野で知られている。特定の例示的なフルオレセイン染料は、例えば、米国特許第６，２２１，６０４号、米国特許第６，００８，３７９号、米国特許第５，８４０，９９９号、米国特許第５，７５０，４０９号、米国特許第５，６５４，４４１号、米国特許第５，１８８，９３４号、米国特許第５，０６６，５８０号、米国特許第４，４８１，１３６号、米国特許第４，４３９，３５６号、国際公開第９９／１６８３２号、及び欧州特許第０，０５０，６８４号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。当業者であれば、特定のＮＨ－ローダミンのドナーとして使用するのに好適なスペクトル特性を有するフルオレセインを選択することができる。本明細書に記載の試薬の標識部分に組み込むことができる親フルオレセイン染料の特定の実施形態を図１Ｃに示す。
ドナー及びＮ－保護ＮＨ－ローダミンアクセプタは、直接又はリンカーの補助により、様々な方向で互いに結合することができる。ドナーがＯ－保護フルオレセイン又はＮ－保護ＮＨ－ローダミンであるいくつかの実施形態において、ドナーは、Ｃ２’－、Ｃ２’’－、Ｃ４’－、Ｃ５’－、Ｃ７’－、Ｃ７’’－、Ｃ５－又はＣ６－位置を介して、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミンアクセプタのＣ２’－、Ｃ４’－、Ｃ５’－、Ｃ７’－、Ｃ５－又はＣ６－位置に結合している。
以下の表２に、具体的な例示的結合方向を示す。
Figure 2022514397000013
表２のドナー－アクセプタ染料ネットワーク等の染料ネットワークを含む標識部分は、試薬の残りの任意の利用可能な位置に結合することができる。いくつかの実施形態において、頭部対頭部結合したアクセプタ／ドナー対を含む標識部分は、ドナー又はアクセプタ部分のＣ５又はＣ６位置を介して試薬の残余部に結合する。いくつかの実施形態において、頭部対尾部結合したアクセプタ／ドナー対を含む標識部分は、ドナー又はアクセプタ部分の利用可能なＣ４’－、Ｃ５’－、Ｃ５－又はＣ６－位置を介して試薬の残余部に結合する。いくつかの実施形態において、尾部対尾部結合したアクセプタ／ドナー対を含む標識部分は、ドナー又はアクセプタ部分のＣ４’－又はＣ５’－位置を介して試薬の残余部に結合する。いくつかの実施形態において、側部対側部結合したアクセプタ／ドナー対を含む標識部分は、ドナー又はアクセプタのＣ４’－、Ｃ５’－、Ｃ５－又はＣ６－位置を介して試薬の残余部に結合する。いくつかの実施形態において、側部対頭部結合したアクセプタ／ドナー対を含む標識部分は、ドナー又はアクセプタの利用可能なＣ４’－、Ｃ５’－、Ｃ５－又はＣ６－位置を介して試薬の残余部に結合する。いくつかの実施形態において、側部対尾部結合したアクセプタ／ドナー対を含む標識部分は、ドナー又はアクセプタの利用可能なＣ４’－、Ｃ５’－、Ｃ５－又はＣ６－位置を介して試薬の残余部に結合する。
これらの方向に関係なく、Ｏ－保護フルオレセイン又はＮ－保護ＮＨ－ローダミンドナー及びＮ－保護ＮＨ－ローダミンアクセプタは、典型的には、リンカーを介して互いに結合する。このようなドナー及びアクセプタ染料を、本質的に剛性及び／又は例えば、長さ約１２～２０オングストロームの範囲比較的長いリンカー（本明細書で使用される場合、リンカーの「長さ」は、部分間の最短の連続した経路を示す化学結合の長さの合計を計算することによって決定されるように、結合部分間の距離を指す）を介して、このようなドナー及びアクセプタ染料等を有利に結合させることができることが以前に発見された。いかなる作業理論にも束縛されることを意図するものではないが、発色団が互いに接触することなくドナー及びアクセプタを互いに近接して保持する傾向があるリンカーは、好適に効率的なエネルギー移行をもたらすと考えられる。この点で、リンカーの剛性及び長さは結合パラメータである。一般に、リンカーが短いほど（例えば、約５～１２オングストロームの長さを有するリンカー）、剛性の程度を高める必要がある。リンカーが長いほど、（例えば、約１５～３０オングストロームの範囲の長さを有するリンカー）、剛性の程度が低い、又は剛性がなくてもよい。短い非剛性（フロッピー）リンカーは避けるべきである。
剛性は、例えば、アリーレン又はヘテロアリーレン部分、並びに／あるいは二重結合及び／又は三重結合を含むアルキレン部分の使用を通して、その結合の周りに制限された回転角を有する基を使用することによって達成することができる。ローダミン及びフルオレセイン染料を、エネルギー転移染料との関連で互いに結合させるのに有用な様々なリンカーが、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８００，９９６号に記載されており、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｏ－保護フルオレセイン又はＮ－保護ＮＨ－ローダミンドナーを、本明細書に記載の標識部分のＮ－保護ＮＨ－ローダミンアクセプタに結合させるのに有用なリンカーの具体例としては、限定されるものではないが、例として、式、
（Ｌ．１）－Ｚ－（ＣＨ2）a－［（Ａｒ）b－（ＣＨ2）a］c－Ｚ－、
（Ｌ．２）－Ｚ－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ2）a］c－Ｚ－、
（Ｌ．３）－Ｚ－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）b］c－（ＣＨ2）a－Ｚ－、
（Ｌ．４）－Ｚ－（ＣＨ2）d－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－［（ＣＨ2）a－（Ａｒ）－（ＣＨ2）a－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ］c－（ＣＨ2）d－Ｚ－、及び
（Ｌ．５）－Ｚ－［ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ］f－ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ－
が挙げられ、
式中、各Ｚは、他とは独立して、前述のように、結合基Ｆzによって寄与される結合の一部分を表し、各ａは、他とは独立して、０～４の範囲の整数を表し、各ｂは、他とは独立して、１～２の範囲の整数を表し、各ｃは、他とは独立して、１～５の範囲の整数を表し、各ｄは、他とは独立して、１～１０の範囲の整数を表し、各ｅは、他とは独立して、１～４の範囲の整数を表し、各ｆは、他とは独立して、１～１０の範囲の整数を表し、各Ａｒは、他とは独立して、任意に置換された単環式又は多環式のシクロアルキレン、シクロヘテロアルキネン、アリーレン又はヘテロアリーレン基を表す。Ａｒの非限定的な例示的実施形態には、前述のように、低級シクロアルカン、低級シクロヘテロアルカン、親芳香族環系及び親ヘテロ芳香族環系から誘導される基が含まれる。Ａｒの特定の非限定的な例示的実施形態には、シクロヘキサン、ピペラジン、ベンゼン、ナフタレン、フェノール、フラン、ピリジン、ピペリジン、イミダゾール、ピロリジン及びオキサジゾールが含まれる。リンカーの特定の非限定的な例示的実施形態を図１に示す。図１において、Ｚ1及びＺ2はそれぞれ、互いに独立して、前述のように、官能基Ｆzによって寄与される結合の一部分を表し、Ｋは、－ＣＨ－及び－Ｎ－から選択される。図２に示されるリンカーのいくつかの特定の実施形態において、Ｚ1又はＺ2の一方は－ＮＨ－であり、他方は－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－及びＳ（Ｏ）2－から選択される。
いくつかの実施形態において、ドナー染料とアクセプタ染料を結合させるリンカーは、米国特許第６，８１１，９７９号に記載されているアニオン性リンカーであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる（例えば、第１７欄の第２５行～第１８欄の第３７行及び図１～１７の開示を参照されたい）。好適なアニオン性リンカーの特定の非限定的な例示的実施形態には、上記の式（Ｌ．１）～（Ｌ．４）のリンカーが含まれ、式中、Ａｒ基の１つ又は複数が、例えば、約ｐＨ７～約ｐＨ９の範囲のｐＨ等の使用条件下で負電荷を有する１つ又は複数の置換基で置換されている。好適な置換基の特定の非限定的な例には、リン酸エステル、硫酸エステル、スルホネート及びカルボキシレート基が含まれる。
いくつかの実施形態において、ドナー及びアクセプタ染料を結合させるリンカーは、米国特許第６，８１１，９７９号に記載されているアニオン性リンカーであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる（例えば、第１７欄の第２５行～第１８欄の第３７行及び図１～１７の開示を参照されたい）。好適なアニオン性リンカーの特定の非限定的な例示的実施形態には、上記の式（Ｌ．１）～（Ｌ．４）のリンカーが含まれ、式中、Ａｒ基の１つ又は複数が、例えば、約ｐＨ７～約ｐＨ９の範囲のｐＨ等の使用条件下で負電荷を有する１つ又は複数の置換基で置換されている。好適な置換基の特定の非限定的な例には、リン酸エステル、硫酸エステル、スルホネート及びカルボキシレート基が含まれる。
いくつかの実施形態において、標識部分は式（ＶＩ）であり、
Ａ－Ｚ1－Ｓｐ－Ｚ2－Ｄ（ＶＩ）
式中、ＡはＮ－保護ＮＨ－ローダミンアクセプタを表し、Ｄはドナー、例えばＮ－保護ＮＨ－ローダミン又はＯ－保護フルオレセインドナーを表し、Ｚ1及びＺ2は、前述のように、官能基Ｆzを含む結合部分によって提供される結合の一部分を表し、Ｓｐは、前述のように、スペーシング部分を表す。いくつかの特定の実施形態において、Ａは本明細書に記載のＮ－保護ＮＨ－ローダミン部分、及びＤは、構造式Ｄ．１、Ｄ．２、Ｄ．３、Ｄ．４、Ｄ．５、Ｄ．６、Ｄ．７、Ｄ．８、Ｄ．９、Ｄ．１０、Ｄ．１１、及びＤ．１２を有する部分からなる群から選択され、
Figure 2022514397000014
Figure 2022514397000015

Figure 2022514397000016

Figure 2022514397000017

Figure 2022514397000018
式中、Ｄ．１～Ｄ．１２のそれぞれにおいて、
Ｒ1’、Ｒ2’、Ｒ2’’、Ｒ4’、Ｒ4’’、Ｒ5’、Ｒ5’’、Ｒ7’、Ｒ7’’、及びＲ8’は、それぞれ、単独の場合、独立に、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、Ｒb及び－（ＣＨ2）x－Ｒbからなる群から選択され、式中、ｘは１～１０の値を有する整数であり、Ｒbは－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa－ＳＨ、－ＳＲa－ＮＨ2、－ＮＨＲa－ＮＲcＲc、Ｎ+ＲcＲcＲc、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）2Ｒa、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa 、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及びＣ（ＮＨ）ＮＲcＲcからなる群から選択され、式中、Ｘはハロであり、各 Ｒaは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール及び６－２０員のヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、各Ｒcは独立してＲaであるか、あるいは同じ窒素原子に結合している２つのＲcが前記窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含んでもよい５－８員飽和又は不飽和の環を形成することができ、
あるいは、Ｒ1’及びＲ2’又はＲ7’及びＲ8’は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換された（Ｃ６－Ｃ１４）アリールブリッジを形成し、並びに／あるいはＲ4’及びＲ4’’及び／又はＲ5’及びＲ5’’は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ベンゾ基を形成し、
各Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、及びＲ7は、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、６－１４員ヘテロアリール、７－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb及び－（ＣＨ2）x－Ｒbから選択され、
Ｅ1は、－ＮＨＲ9、－ＮＲ9Ｒ10及び－ＯＲ9bからなる群から選択され、
Ｅ2は、－ＮＨＲ9、－ＮＲ9Ｒ10及び－ＯＲ9bからなる群から選択され、
Ｒ9及びＲ10は、本明細書に記載されている通りであり、
Ｒ9bは、Ｒ9であり、
各Ｙ1a、Ｙ1b、Ｙ2a、Ｙ2b、Ｙ3a及びＹ3bは、独立に、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ－）及び－Ｓ（Ｏ）2からなる群から選択され、
但し、各Ｅ1及びＥ2が－ＯＲ9bである場合、Ｒ1’及びＲ2’及び／又はＲ7’及びＲ8’は、それらが結合している炭素原子とのみ一緒になって、任意に置換される（Ｃ６－Ｃ１４）アリールブリッジを形成することができる。本明細書で使用される「非対称ローダミン」は、Ｅ１及びＥ２が独立して、－ＮＨＲ９又は－ＮＲ９Ｒ１０であり、Ｅ１がＥ２と同じでない化合物である。
構造式（ＶＩ）の標識部分のいくつかの特定の実施形態において、Ｙ1a、Ｙ2a及びＹ3aは－ＮＨ－であり、Ｙ1b、Ｙ2b及びＹ3bは、－Ｃ（Ｏ）－及び－Ｓ（Ｏ）2－から選択され、Ｚ１は、－Ｃ（Ｏ）－及び－Ｓ（Ｏ）2－から選択され、Ｚ2は－ＮＨ－であり、Ｓｐは以下の基、
－（ＣＨ2）a－［（Ａｒ）b－（ＣＨ2）a］c－、（Ｓｐ1）
－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ2）a］c－、（Ｓｐ2）
－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）b］c－（ＣＨ2）a－、（Ｓｐ3）
－（ＣＨ2）d－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－［（ＣＨ2）a－（Ａｒ）－（ＣＨ2）a－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ］c－（ＣＨ2）d－（Ｓｐ4）、及び
－［ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ］f－ＣＨ2（ＣＨ2）－（Ｓｐ5）から選択され、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びＡｒは前に定義した通りである。
構造式（ＶＩ）の標識部分のいくつかの特定の実施形態において、Ｒ9は、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ3及びＣ（Ｏ）ＣＦ3から選択され、Ｒ9aは、－Ｃ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ3）3である。
４．５ ＰＥＰ基
本明細書に記載の試薬の多くの実施形態は、ＰＥＰ基（ＰＥＰ）を含む。標識オリゴヌクレオチドを合成するための段階的合成で使用される場合、ＰＥＰ基は、発生期の合成オリゴヌクレオチドの５’－ヒドロキシル基でもよい利用可能なヒドロキシル基に結合し、最終的に、必要な酸化及び／又は脱保護の工程後に、標識部分を合成オリゴヌクレオチドに結合させる結合に寄与する。形成される結合は、当技術分野で知られているようなリン酸エステル結合又は修飾リン酸エステル結合でもよい。
試薬を一級ヒドロキシル基に結合させて、リン酸エステル又は修飾リン酸エステル結合を得るのに好適な様々な異なる基は、当技術分野で周知である。特定の例には、限定するものではなく例として、ホスホラミダイト基（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９６９、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９１：３３５０－３３５５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、１９７５ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９７：３２７８；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５；Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；これらの開示が参照により本明細書に組み込まれる）、２－クロロフェニル－又は２，５－ジクロロフェニル－リン酸基（例えば、Ｓｐｒｏａｔ ＆ Ｇａｉｔ、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ，」、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｇａｉｔ、Ｅｄ．、１９８４、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ｐａｇｅｓ ８３－１１５、その開示が参照により本明細書に組み込まれる）、及びＨ－ホスホネート基（例えば、Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．、１９８５、Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒ．２５：２８０－２８２；Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．、１９８６、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４０５５－４０５８；Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．、１９８６、Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒ．２６：５９－６２；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ＆Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、１９８６、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４６９－４７２；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ、１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９－５４０７、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。特定の実施形態において、ＰＥＰ基は、式（Ｐ．１）のホスホラミダイト基であり、
Figure 2022514397000019
式中、Ｒ20は、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状、分岐状、又は環状の飽和又は不飽和のアルキル、２－シアノエチル、６～１０個の環炭素原子を含むアリール、及び６～１０個の環炭素原子及び１～１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルであり、
各Ｒ21及びＲ22は、互いに独立して、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状、分岐状、又は環状の飽和又は不飽和のアルキル、６～１０個の環炭素原子を含むアリール、及び６～１０個の環炭素原子及び１～１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルであり、又は代替として、Ｒ21及びＲ22は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５～６個の環原子を含む飽和又は不飽和の環を形成し、そのうちの１つ又は２つは、例示された窒素原子に加えて、Ｏ、Ｎ及びＳから選択されるヘテロ原子とすることができる。
特定の実施形態において、Ｒ20は２－シアノエチルであり、Ｒ21及びＲ22はそれぞれイソプロピルである。
４．６ 合成ハンドル
本明細書に記載の試薬の実施形態の多くは、好適な脱保護の後、必要に応じて、合成標識オリゴヌクレオチドへの追加の基又は部分の結合に使用できる部位を提供する、１つ又は複数の合成ハンドルを含む。標識オリゴヌクレオチドの合成過程中に、これらの基を合成ハンドルに結合させるか、あるいは合成後に合成ハンドルを脱保護して、追加の基又は部分が結合できる官能基を明らかにすることができる。例えば、合成ハンドルは、標識オリゴヌクレオチドの合成を施行するために使用される条件に対して安定な保護基で保護された一級アミン基を含むことができる。合成オリゴヌクレオチド上の様々な他の保護基の除去と同時又は別に、合成に続く保護基の除去により、追加の基及び／又は部分が結合できる一級アミノ基が提供される。
オリゴヌクレオチド合成における使用に好適な保護基で保護された様々な異なるタイプの反応基が当技術分野で知られており、限定するものではなく例として、アミノ基（例えば、トリフルオロアセチル又は４－モノメトキシトリチル基で保護される）、ヒドロキシル基（例えば、４，４’－ジメトキシトリチル基で保護される）、チオール基（例えば、トリチル又はアルキルチオール基で保護される）、及びアルデヒド基（例えば、アセタール保護基で保護される）が挙げられる。これらの保護された反応基は全て、本明細書に記載の試薬の合成ハンドルを含むことができる。
いくつかの実施形態において、合成ハンドルは、式－ＯＲkの保護された一級ヒドロキシルを含み、式中、Ｒkは、オリゴヌクレオチドを合成する過程で選択的に除去され得る酸不安定性保護基を表す。オリゴヌクレオチド合成に関して、一級ヒドロキシル基を保護するのに好適な酸不安定性保護基は、当技術分野で知られており、限定するものではなく例として、トリフェニルメチル（トリチル）、４－モノメトキシトリチル、４，４’－ジメトキシトリチル、４，４’，４’’－トリメトキシトリチル、ビス（ｐ－アニシル）フェニルメチル、ナフチルジフェニルメチル、ｐ－（ｐ’－ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル、９－アントリル、９－（９－フェニル）キサンテニル及び９－（９－フェニル－１０）－オキソ）アントリルが挙げられる。これらの基は全て、２．５％又は３％のジクロロ酸又はトリクロロ酸及びジクロロメタンでの処理等、弱酸で処理することによって除去できる。上に列挙した酸不安定性保護基で一級ヒドロキシル基を保護する方法は周知である。
４．７ 固体支持体
本明細書に記載の試薬の多くの実施形態は、他の部分及び／又は基が結合している固体支持体を含む。固体支持体は、典型的には、アミノ基又はヒドロキシル基等の官能基で活性化され、他の部分の結合に好適な結合基を有するリンカーが結合する。
様々な部分及びリンカーへの結合に適した官能基で活性化できる様々な材料、及び官能基を含むように材料を活性化する方法は、当技術分野で知られており、例として、制御された細孔ガラス、ポリスチレン、グラフト共重合体。これらの材料のいずれも、本明細書に記載の試薬における固体支持体として使用される。
４．８ 末端水酸基標識に有用な合成試薬
本明細書に記載される合成試薬のいくつかの実施形態は、構造式（ＶＩＩ）によって記載され、
ＬＭ－Ｌ－ＰＥＰ（ＶＩＩ）
式中、ＬＭは本明細書に記載の標識部分を表し、Ｌは本明細書に記載の任意のリンカーを表し、ＰＥＰは本明細書に記載のＰＥＰ基を表す。試薬は、合成ハンドル等の追加の基又は部分を含むことができる。いくつかの実施形態において、合成試薬は、標識部分及びＰＥＰ基を含み、追加の部分又は基を含まない。このような合成試薬は、オリゴヌクレオチドの段階的合成中にヒドロキシル基に結合することができ、とりわけ、標識部分を合成オリゴヌクレオチドの末端ヒドロキシル基、通常は５’－ヒドロキシルに結合させるのに有用である。
いくつかの実施形態において、標識部分は次式とすることができ、
Figure 2022514397000020
式中、Ｒ1－Ｒ14、及びＹは、本明細書で定義される通りである。
ＰＥＰ基は、標識部分に直接結合することができるか、又はリンカーの補助により標識部分に結合することができる。ＰＥＰ基は、一般に、好適な試薬を１級ヒドロキシル基に結合させることによって分子に結合するため、ＰＥＰ基が標識部分に直接結合する実施形態において、標識部分は、１級ヒドロキシル基を含む置換基を含むべきである。ＰＥＰ基がリンカーの補助によって標識部分に結合されている実施形態において、リンカーシントンは、標識部分シントン上の結合基と結合を形成するのに好適な結合基、及びＰＥＰ基への結合に好適な一級ヒドロキシル基を含むべきである。好適なリンカーシントンには、限定されるものではないが、式Ｆz－Ｓｐ－ＯＨのシントンが含まれ、式中、Ｆzは、標識部分シントン上の官能基に相補的な官能基であり、Ｓｐはスペーシング部分を表す。スペーシング部分は、標識合成オリゴヌクレオチドの合成及び脱保護に使用される条件に対して安定な原子及び／又は官能基の任意の組合せを含むことができる。非限定的な例示的リンカーは、図１に示されており、式中、Ｚ2はＯである。いくつかの実施形態において、Ｓｐは、１～１０個の鎖原子を含む任意に置換されたアルキレン鎖である。特定の実施形態において、Ｓｐは、１～９個の炭素鎖原子を含む非置換のアルキレン鎖である。
いくつかの実施形態において、合成試薬は、構造式（ＶＩＩ）の化合物であり、
式中、ＬＭは、上で具体的に例示した標識部分の実施形態の１つであり、
Ｌは、－Ｚ－（ＣＨ2）3-6－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）a－［（Ａｒ）b－（ＣＨ2）a］c－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ2）a］c－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）b］c－（ＣＨ2）a－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）d－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－［（ＣＨ2）a－（Ａｒ）－（ＣＨ2）a－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ］c－（ＣＨ2）d－Ｏ－、－Ｚ－［ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ］f－ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ－、及びＺ2がＯである図１に示されるリンカーのうち１つから選択され、
ＰＥＰは、例えば、上記の構造式Ｐ．１のホスホラミダイト基等のホスホラミダイト基である。いくつかの特定の実施形態において、リンカーＬのＺは－ＮＨ－である。
いくつかの実施形態において、構造式（ＶＩＩ）の合成試薬中のリンカーは、合成試薬がヌクレオシドであるようにヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオシド合成試薬は、構造式（ＶＩＩ．１）の化合物であり、
Figure 2022514397000021
 式中、ＰＥＰはリン酸エステル前駆体基を表し、Ｂは核酸塩基を表し、ＬＭは標識部分を表し、Ｌ２は核酸塩基ＢをリンカーＬＭに結合させるリンカーを表す。核酸塩基Ｂ及びリンカーＬの特徴及び特性については、以下でより詳細に記載する。構造式（ＶＩＩ．１）の非限定的な例示的ヌクレオシド合成試薬は、図３に示されている。
ＰＥＰ基が任意のリンカーを介して標識部分に結合している合成試薬の実施例を合成するための例示的なスキームを下記のスキーム（Ｉ）に提供し、式中、種々のＲ、Ｆy、Ｆz、Ｙ、Ｚ及びＳｐ基は、前に定義した通りである。
Figure 2022514397000022
スキーム（Ｉ）において、官能基Ｆyを含有する結合基を含む親ＮＨ－ローダミンシントン１００は、無水物１０１でアセチル化されて、Ｎ－アセチル保護ＮＨ－ローダミンシントン１０２を生成する。次いで、シントン１０２をリンカーシントン１０３に結合させて、化合物１０４を生成する。Ｆyの独自性に応じて、シントン１０２は、結合の前に活性化を必要とする場合がある。例えば、Ｆyがカルボキシル基である場合、結合の前に、ＮＨＳエステル等のエステルとして活性化することができる。化合物１０４において、－Ｙ－Ｚ－は、前述のように、相補的官能基Ｆy及びＦzによって形成される結合を表し、ＹはＦyによって寄与される一部分を表し、ＺはＦzによって寄与される一部分を表す。次いで、化合物１０４は、図示した特定の実施形態においてホスフィンであるＰＥＰシントン１０５と反応して、ホスホラミダイト合成試薬１０６を生成する。
４．９ 内部又は３’－末端標識に有用な合成試薬
本明細書に記載の合成試薬は、追加の基及び／又は部分の結合に有用な１つ又は複数の合成ハンドルを任意に含み得る。式－ＯＲkの合成ハンドルを含む合成試薬は、式中、Ｒkが、前述のように酸不安定性保護基を表し、追加のヌクレオチドが結合できる一級ヒドロキシル基を提供する。結果として、そのような合成ハンドルを含む合成試薬を使用して、合成オリゴヌクレオチドを５’－ヒドロキシル、３’－ヒドロキシル、又は１つ以上の内部位置で標識することができる。これらは、互いに、又は他のホスホラミダイト標識試薬と結合することもでき、複数の標識部分を含むオリゴヌクレオチドの合成を可能にする。
標識部分、ＰＥＰ基、及び合成ハンドル－ＯＲkは、合成試薬を含み、それらが各機能を施行できるようにする任意の方式及び／又は方向で一緒になることができる。具体的な例として、ＰＥＰ基及び合成ハンドルはそれぞれ、場合によりリンカーを介して標識部分に結合することができる。いくつかの実施形態において、このような合成試薬は、構造式（ＶＩＩＩ）の化合物であり、
ＲkＯ－Ｌ－ＬＭ－Ｌ－ＰＥＰ （ＶＩＩＩ）
式中、各Ｌは、他とは独立して、任意のリンカーを表し、ＬＭは標識部分を表し、ＰＥＰはＰＥＰ基を表す。好適な保護基Ｒk、リンカーＬ、標識部分ＬＭ及びＰＥＰ基の非限定的な例には、上で具体的に例示されたものが含まれる。
別の具体例として、ＰＥＰ基及び合成ハンドル－ＯＲkは、標識部分に結合する分岐リンカーに結合することができる。いくつかの実施形態において、このような合成試薬は、構造式（ＩＸ）の化合物であり、
Figure 2022514397000023
 式中、Ｌはリンカーを表し、ＬＭは標識部分を表し、ＰＥＰはＰＥＰ基を表す。
特定の実施形態において、構造式（ＩＸ）の合成試薬は、構造式（ＩＸ．１）の化合物であり、
Figure 2022514397000024
 式中、ＬＭは標識部分を表し、－Ｚ－はリンカー上の官能基 Ｆzによって寄与される結合の一部分を表し、Ｓｐ1、Ｓｐ2及びＳｐ3は同じか異なり、それぞれがスペーシング部分を表し、ＧはＣＨ、Ｎ、又はアリーレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、低級シクロアルキレン、シクロヘキシレン、及び／又は低級シクロヘテロアルキレンを含む基であり、ＰＥＰはＰＥＰ基を表す。いくつかの実施形態において、ＬＭは、上で具体的に例示された標識部分の実施形態の１つであり、Ｓｐ1、Ｓｐ2及びＳｐ3は、それぞれ、互いに独立して、１～９個の炭素原子を含むアルキレン鎖、Ｓｐ1、Ｓｐ2、Ｓｐ3、Ｓｐ4及びＳｐ5（上で定義）であり、及び／又はＰＥＰは、上記の構造式Ｐ．１のホスホラミダイト基である。構造式（ＩＸ．１）の例示的な合成試薬の非限定的な具体的実施形態は、図２及び３に示されている。
いくつかの実施形態において、合成ハンドル－ＯＲkは、合成試薬がヌクレオシドであるように、ヌクレオシドによって提供される。そのようなヌクレオシド合成試薬において、標識部分は、典型的には、リンカーを介してヌクレオシドの核酸塩基に結合し、及び標識オリゴヌクレオチドの合成に使用される条件下で反応性である核酸塩基上の環外官能基、例えば、環外アミンは保護される。例を図５に示す。
ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの合成に使用するために好適に保護できる任意のヌクレオシドでよく、２’－デオキシリボース糖部分、３’－デオキシリボース糖部分（２’－５’ヌクレオチド間結合を含む標識オリゴヌクレオチドを合成するのに有用である）、好適に保護されたリボース部分、これらのリボース部分のいずれかの置換されたバージョン、又は非リボース糖部分も含む。
いくつかの実施形態において、このようなヌクレオシド合成試薬は、構造式（ＩＸ．２）、（ＩＸ．３）、（ＩＸ．４）及び（ＩＸ．５）の化合物であり、
Figure 2022514397000025
式中、ＬＭは標識部分を表し、Ｂは好適に保護された核酸塩基を表し、Ｌ2は標識部分を核酸塩基に結合させるリンカーを表し、Ｒkは酸不安定性保護基を表し、ＰＥＰはＰＥＰ基を表し、Ｏは酸素原子を表し、構造式（ＩＸ．４）において、Ｒ16は２’－ヒドロキシル保護基を表す。
構造式（ＶＩＩ．１）、（ＩＸ．２）、（ＩＸ．３）、（ＩＸ．４）及び（ＩＸ．５）の合成試薬において、核酸塩基Ｂは、オリゴヌクレオチドに組み込むのに有用な実質的に任意の複素環とすることができる。例えば、核酸塩基は、遺伝的にコード化されたプリン（アデニン又はグアニン）のうちの１つ、遺伝的にコード化されたピリミジン（シトシン、ウラシル又はチミン）のうちの１つ、遺伝的にコード化されたプリン及び／又はピリミジンの類似体及び／又は誘導体（例えば、７－デアザデニン、７－デアザグアニン、５－メチルシトシン）、非遺伝的にコード化されたプリン及び／又はピリミジン（例えば、イノシン、キサンテン及びヒポキサンテン）、又は他のタイプの複素環であってもよい。オリゴヌクレオチドへの組込みに有用な広範囲の様々な複素環が当技術分野で知られており、例えば、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆａｓｍａｎ、Ｅｄ．、１９８９、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（例えば、３８５～３９３頁、及びその中に引用された参考文献）に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。これらの様々な複素環、及び後に発見される複素環は全て、本明細書に記載のヌクレオシド合成試薬に含めることができる。
構造式（ＶＩＩ．１）、（ＩＸ．２）、（ＩＸ．３）、（ＩＸ．４）及び（ＩＸ．５）の合成試薬において Ｂがプリンである場合、例示された糖部分は、典型的には、プリンのＮ９位置に結合し、Ｂがピリミジンである場合、例示された糖部分は、典型的には、ピリミジンのＮＩ位置に結合する。他の核酸塩基の結合部位は当業者には明らかであろう。
核酸塩基上の環外アミン又は他の反応基（複数可）は、標識オリゴヌクレオチドの合成に使用される合成条件に対して安定な保護基で保護されている。オリゴヌクレオチド合成に関して、ヌクレオシド核酸塩基の環外アミン基を保護するのに好適な様々な基は、このような保護されたヌクレオシドを調製する方法と同様、当技術分野で周知である。
例えば、アデニンの環外アミンを保護するために使用されてきた基には、ベンチオール（Ｂｚ）、フェノキシアセチル（Ｐａｃ）及びイソブチリル（ｉＢｕ）が含まれる。シトシンの環外アミンを保護するために使用されてきた基には、アセチル（Ａｃ）及びＢｚが含まれる。グアニンの環外アミンを保護するために使用されている基には、ｉＢｕ、ジメチルホルムアミド（Ｄｍｆ）、及び４－イソプロピル－フェノキシアセチル（ｉＰｒ－Ｐａｃ）が含まれる。これらの保護基は全て、水酸化アンモニウムで ５５～６５℃で ２～３時間処理することで除去できる。しかし、これらの保護基の中には、より穏やかな条件下で除去できるものもある。例えば、ＡiBU、ＡPac、ＣAc及びＧiPr-Pacからの保護基の開裂は、水酸化アンモニウム、又はメタノール中の０．０５Ｍ炭酸カリウムを用いて、室温で４～１７時間で行うことができ、又はＨ2Ｏ／ＥｔＯＨ中の２５％ ｔ－ブチルアミンの処理によって行うことができる。本明細書に記載の試薬を含むいくつかのＮＨ－ローダミン及び／又は他の染料は、他の保護基が必要とするより厳しい脱保護条件に対して安定でない可能性があるため、これらの穏やかな脱保護条件下で除去できる保護基を利用するヌクレオシド試薬が好ましい。
標識部分ＬＭを核酸塩基Ｂに結合させるリンカーＬ2は、核酸塩基の任意の位置に結合することができる。いくつかの実施形態において、Ｂがプリンの場合、リンカーはプリンの８位置に結合し、Ｂが７－デアザプリンの場合、リンカーは７－デアザプリンの７位置に結合し、Ｂがピリミジンの場合、リンカーはピリミジンの５位置に結合する。
いくつかの実施形態において、ＬＭを核酸塩基に結合させるのに有用なリンカーＬ2は、アセチレン又はアルケンアミノ結合、例えば、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ＝ＣＨ－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ2）1-6－ＮＨ－、及び－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ2）1-6－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－から選択される結合、例えば、式Ｃ－ＣＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－等を有するプロパルギル－１－エトキシアミノ結合、又は堅牢な結合、例えば、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－及び－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－から選択されるもの等を含み、式中、Ａｒは前に定義した通りである。
いくつかの実施形態において、ＬＭをプリン核酸塩基に結合させるのに有用なリンカーＬ2は、例えば、式－ＮＨ－（ＣＨ2）1-6－ＮＨ－の結合等のアルキルアミンを含む。
いくつかの実施形態において、ＬＭをプリン又はピリミジンヌクレオブスに結合させるのに有用なリンカーＬ2は、米国特許第６，８１１，９７９号に記載されているようなアニオン性リンカーであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる（例えば、第１７欄の第２５行～第１８欄の第３７行及び図１～１７の開示を参照されたい）。
本明細書に記載の試薬に組み込むのに好適な、上記のようなリンカーで誘導体化されたヌクレオシドを合成する方法は、例えば、Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：３４２０、米国特許第５，１５１，５０７号（Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ）、米国特許第５，９４８，６４８号（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ）及び米国特許第５，８２１，３５６号（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ）に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。以下により詳細に記載するように、誘導体化ヌクレオシドをシントンとして使用して、ヌクレオシド合成試薬を合成することができる。
本明細書に記載のヌクレオシド試薬を含み得るリンカー誘導体化核酸塩基の特定の例示的実施形態を以下に示す。
Figure 2022514397000026
Figure 2022514397000027

Figure 2022514397000028
ヌクレオシド合成試薬は、以下のスキーム（ＩＩ）に示すように、リンカー誘導体化ヌクレオシドシントンから調製できる。
Figure 2022514397000029
スキーム（ＩＩ）において、リンカー誘導体化ヌクレオシドシントン１１０は、酸不安定性保護基を用いて５’－ヒドロキシルで保護され、スキームでは例示的な塩化物試薬ＲkＣｌを用いて示され、Ｒkは先に定義した通りである。トリフルオロアセチル保護基を除去するための塩基による処理によって、シントン１１２を得る。シントン１１２と標識部分シントン１０２との反応（上記のスキーム（Ｉ）を参照）、続いてＰＥＰシントン１０５（この特定の例ではホスフィン（上記のスキーム（Ｉ）を参照）で処理）で処理すると、ヌクレオシド合成試薬１１４が得られる。上に示した様々な合成工程を実行するための特定の条件はよく知られている。図４に示すような、又は式－ＯＲkの合成ハンドルを含む非ヌクレオシド合成試薬は、スキーム（ＩＩ）の慣例的適用によって調製することができる。
４．１０ 固体支持試薬
本明細書に記載の試薬の多くの実施形態は、固体支持体を含む。そのような試薬は、一般に、固体支持体、本明細書に記載の標識部分、及び合成ハンドルを含み、追加の標識部分、クエンチング部分、とりわけオリゴヌクレオチド二本鎖の安定化に有用な合成ハンドル及び／又は基、例えば、塩基対間に挿入する薬剤（挿入剤）及び二本鎖副溝に結合する薬剤（マイナーグルーブバインディング、又はＭＧＢ、薬剤）等の追加の基又は部分を含んでよい。固体支持体、標識部分、合成ハンドル、及び任意の追加部分は、それらが各機能を果たすことを可能にする任意の方式又は方向で互いに結合され得る。
いくつかの実施形態において、固体支持体は、リンカーを介して試薬の残余部に結合している。試薬の残余部に固体支持体を結合させるリンカーは、典型的には、特定の条件下で選択的に切断可能な結合を含み、合成後、合成された標識オリゴヌクレオチドを固体支持体から放出することができる。いくつかの実施形態において、結合は、オリゴヌクレオチドが単一工程で固体支持体から脱保護及び切断されるような、合成標識オリゴヌクレオチドを脱保護するために使用される条件に対して不安定である。そのようなリンカーは、典型的にはエステル結合を含むが、例えば炭酸エステル、ジイソプロピルシロキシエーテル、修飾リン酸エステル等の他の結合を含んでもよい。
オリゴヌクレオチド合成に関連して有用な無数の選択的に切断可能なリンカーは、そのようなリンカーで固体支持体を誘導体化する方法と同様に、当技術分野で知られている。これらの様々なリンカーの全ては、本明細書に記載の固体支持試薬における使用に適合させることができる。合成オリゴヌクレオチドを脱保護するために使用される塩基性条件下で開裂可能な例示的なリンカーを含む固体支持体試薬の非限定的な例が、図６に示される。
合成試薬と同様に、固体支持試薬は、本質的に、非ヌクレオシド又はヌクレオシドであり得る。非ヌクレオシド固体支持体試薬の例示的な実施形態には、構造式（Ｘ）の試薬が含まれ、
Figure 2022514397000030
 式中、ＬＭは標識部分を表し、Ｌは選択的に開裂可能な任意選択のリンカーを表し、－ＯＲkは合成ハンドルを表し、式中、Ｒkは前述のように酸不安定性保護基である。
いくつかの実施形態において、構造式（Ｘ）の固体支持体合成試薬は、構造式（Ｘ．１）の非ヌクレオシド試薬であり、
Figure 2022514397000031
式中、Ｚ、ＬＭ、Ｇ、Ｓｐ1、Ｓｐ2及びＲkは、構造式（ＩＸ．１）に関連して先に定義した通りであり、Ｓｐ4は選択的に開裂可能なスペーシング部分を表す。いくつかの特定の実施形態において、選択的開裂可能なスペーシング部分Ｓｐ4は、エステル結合を含む。
いくつかの実施形態において、構造式（Ｘ）の固体支持体合成試薬は、構造式（Ｘ．２）、（Ｘ．３）、（Ｘ．４）又は（Ｘ．５）のヌクレオシド試薬であり、
Figure 2022514397000032
 式中、ＬＭ、Ｒk、Ｂ、及びＬ2は、構造式（Ｘ．２）、（Ｘ．３）、（Ｘ．４）及び／又は（Ｘ．５）について先に定義した通りであり、Ｒ16は構造式（ＩＸ．４）について先に定義した通りであり、Ｓｐ4は、上記のように、いくつかの実施形態において、エステル結合を含む、選択的に開裂可能なスペーシング部分を表す。（Ｘ．２）の具体例を図７に示す。
４．１１ 追加の例示的な実施形態
本開示全体に記載される様々な部分、基、及びリンカーの特定の実施形態は、本明細書に記載される試薬の全てに含まれ得ることが理解されるべきである。更に、特定の組合せが具体的に例示されたかのように、様々な特定の実施形態を任意の組合せで互いに組み合わせることができる。特定の例として、本明細書に記載の標識部分ＬＭの特定の実施形態のいずれか１つは、本明細書に記載の非ヌクレオシド及びヌクレオシド固体支持体及び合成試薬の具体的に例示された実施形態のいずれかに含めることができる。別の特定の例として、上記の構造式（Ｐ．１）のホスホラミダイト基等のＰＥＰ基ＰＥＰの特定の実施形態のいずれか１つを、本明細書に記載の合成試薬のいずれかに含めることができる。
４．１２ 試薬の使用
本明細書に記載の様々な試薬をオリゴヌクレオチドの段階的合成に使用して、合成樹脂上で直接ローダミン染料で標識したオリゴヌクレオチドを合成することができる。したがって、様々な試薬により、無数の異なるローダミンでオリゴヌクレオチドを合成的に標識する能力が有効になり、労力のかかる合成後の修飾の必要がなくなる。例示的な合成試薬を使用して、ＮＨローダミン染料で標識されたオリゴヌクレオチドを合成することが、図８に示されている。
当業者に理解されるように、ＮＨ－ローダミン染料のドナー、アクセプタ、又はクエンチャとして作用することができるホスホラミダイト試薬が利用できるため、本明細書に記載の試薬により、ｉｎ ｓｉｔｕで合成される、エネルギー転移染料及び／又はＮＨ－ローダミン－クエンチャ染料対で標識されるオリゴヌクレオチドを合成することができる。本明細書に記載の試薬によって提供される多用途性を示す、ＮＨ－ローダミン－フルオレセインエネルギー転移染料対で標識されたオリゴヌクレオチドの例示的な合成を、図９、図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。本明細書に記載の試薬により、実質的にあらゆるＮＨ－ローダミン染料を固体支持体及び／又は合成試薬に含めることができるため、特定の用途向けに調整されたスペクトル特性を有するエネルギー転移染料対で標識されたオリゴヌクレオチドは、合成後の修正の必要なしで、便宜にｉｎ ｓｉｔｕで合成することができる。更に、無数の異なるエネルギー転移染料対の組合せで標識されたオリゴヌクレオチドは、個々のモノマー試薬から合成できるため、特定の染料対を含む合成試薬を作製する必要がない。染料対の各部は、介在する連結部分の付加の有無にかかわらず、段階的な方式で新生オリゴヌクレオチドに結合することができる。
図８を参照すると、支持体結合合成オリゴヌクレオチドを酸で処理して、その５’－ヒドロキシルを保護しているＤＭＴ基を除去し、５’－脱保護された支持体結合オリゴヌクレオチドを生成する。Ｎ－保護ＮＨ－ローダミンホスホラミダイト試薬の結合とそれに続く酸化により、支持体結合ＮＨ－ローダミン標識オリゴヌクレオチドを得る。酸化は、ＮＨ－ローダミンを脱保護された開いたラクトン形態に変換する役割も果たす。濃縮水酸化アンモニウムで処理して保護基を除去し、合成オリゴヌクレオチドを固体支持体（樹脂）から開裂すると、ＮＨ－ローダミン染料で標識されたオリゴヌクレオチドが得られる。
図９を参照すると、標識部分として保護されたＮＨ－ローダミン－フルオレセインエネルギー転移染料対を含む固体支持体試薬は、３サイクルの合成を経て、標識された支持体結合オリゴヌクレオチドを生成することができる。固体支持体からの開裂により、脱保護された開いたラクトン形態の標識オリゴヌクレオチドが得られる。
図１０Ａを参照すると、発生期の支持体結合オリゴヌクレオチドは、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミンホスホラミダイト合成試薬を、オリゴヌクレオチドの５’－ヒドロキシルに結合させることにより、ｉｎ ｓｉｔｕで合成されたＮＨ－ローダミン－フルオレセイン染料対で標識することができ、酸化後にＮＨ－ローダミン標識オリゴヌクレオチドを得る。ＤＭＴ基を除去し、続いてＯ－保護ホスホラミダイト（示される具体的な例ではＦＡＭ－ホスホラミダイト）と結合すると、標識された支持体結合オリゴヌクレオチドが得られる。開裂及び脱保護によりオリゴヌクレオチドが得られ、これはＮＨ－ローダミン－ＦＡＭエネルギー転移染料ペアで標識され、ＮＨ－ローダミンは脱保護された開いたラクトン形態である。
ドナー及びアクセプタ染料を結合させる結合の長さと特性は、ホスホラミダイトリンカー試薬を使用して操作することもできる。この態様は、図１０Ｂに示されており、リンカーホスホラミダイトがローダミン標識オリゴヌクレオチドに結合して、試薬を得る。ＦＡＭ－ホスホラミダイトと結合し、続いて酸化、脱保護、及び開裂することによりオリゴヌクレオチドが生成され、ＮＨ－ローダミン－ＦＡＭエネルギー転移染料対で標識される。リンカーホスホラミダイトにおいて、「Ｓｐ」は、上で定義したようにスペーサである。例えば、「Ｓｐ」は、上に定義したように、（Ｓｐ1）、（Ｓｐ2）、（Ｓｐ3）、（Ｓｐ4）又は（Ｓｐ5）を表すことができる。
図１０Ｂに表されるスキームにおいて、ＮＨ－ローダミン及びＦＡＭ染料を結合させるリンカーの長さと特性は、ＦＡＭ－ホスホラミダイトと結合する前に、追加のリンカーホスホラミダイトと結合させることによって調整できる。リンカーのホスホスフォラマイトは、同じでも異なっていてもよい。このようにして、ドナー及びアクセプタ染料、並びにドナー及びアクセプタを結合させるリンカーが特定の目的に合わせて調整された、エネルギー移動染料対で標識されたオリゴヌクレオチドを、ｉｎ ｓｉｔｕで容易に合成することができる。
図１０Ａ及びＢは特定のＮ－保護ＮＨ－ローダミン試薬の使用を例示するが、当業者は、ＦＡＭのアクセプタとして機能する任意のＮ－保護ＮＨ－ローダミン試薬が使用できることを理解するだろう。更に、他の種類のホスホラミダイト染料と同様に、他のＯ－保護フルオレセインも使用できる。染料はモノマーとして添加されるため、利用可能なエネルギー移動染料標識の数は、それらの合成に必要なホスホルアミダイト試薬の数よりも多くなりる。例えば、９種類の異なるエネルギー転移染料対で標識されたオリゴヌクレオチドは、３種類のＮ保護ＮＨ－ローダミンホスホラミダイト試薬（試薬Ａ、Ｂ、及びＣ）及び３種類の異なるＯ－保護フルオレセイン ホスホラミダイト試薬（試薬１、２、及び３）、オリゴ－Ａ１、オリゴ－Ａ２、オリゴ－Ａ３、オリゴ－Ｂ１、オリゴ－Ｂ２、オリゴ－Ｂ３、オリゴ－Ｃ１、オリゴ－Ｃ２及びオリゴ－Ｃ３から合成できる。
細胞及び組織の機能性に関する現在の分析では、多くの場合、制限されている材料からできるだけ多くの情報を抽出する必要がある。例えば、腫瘍生検等の試料は得ることが困難であり、通常、使用可能な核酸は少量しか得られない。シングルプレックスアッセイと称される単一の標的分析物のＰＣＲ検出及び測定は、核酸レベルで臨床研究試料を分析するためのゴールドスタンダードであり、四半世紀以上にわたって生物学的知識の限界を拡大する上で貴重である。
しかし、臨床研究標本から得られる限られた量の核酸は、多くの場合、これらの貴重な試料をどのように利用するのが最も良いかについての選択を強いられる。更に、試料が限られている場合、分析できる遺伝子座の数も制限され、試料から抽出できる情報の量が低減する。最後に、複数のシングルアッセイ反応をセットアップするために必要な追加の時間及び材料は、複雑なプロジェクトの費用を大幅に増加させる可能性がある。
核酸のマルチプレックスＰＣＲ分析は、単一の試料アリコートから複数の標的を増幅及び定量化する戦略であり、これらの問題に対する魅力的なソリューションである。マルチプレックスＰＣＲでは、試料アリコートは、単一のＰＣＲ反応で蛍光染料を含む複数のプローブでクエリされる。これにより、その試料から抽出できる情報量が増加する。マルチプレックスＰＣＲにより、試料及び材料の大幅な節約を実現することができる。この方法の有用性を高めるために、遺伝子特異的プライマ及びプローブのいくつかの対を使用して、複数の標的配列を同時に増幅及び測定するマルチプレックスＰＣＲが開発された。マルチプレックスＰＣＲは、次の利点を提供する。１）効率：マルチプレックスＰＣＲは、いくつかのＰＣＲアッセイを単一の反応に組み合わせることによって、試料材料を節約し、ウェル間のばらつきを回避するのに役立つ。マルチプレックス化により、感度を損なうことなく複数のアリコートに分割できない稀な標的を含む試料等、限られた試料をより効率的に利用する。２）経済性：標的が一斉に増幅されても、蛍光シグナルに基づいて増幅を区別するために、独自のレポータ染料を備えた遺伝子特異的プローブを使用することによって、各々が独立して検出される。一旦最適化されると、マルチプレックスアッセイは、独立して増幅される同じアッセイよりも費用効果が高くなる。
しかし、現在、単一のマルチプレックスＰＣＲアッセイで分析できる標的の数には制限がある。マルチプレックスＰＣＲの実験計画は、単一反応の場合よりも複雑である。個々の標的を検出するために使用されるプローブは、別個のスペクトルを持つ独自のレポータ染料を含んでいなければならない。リアルタイム検出システムの励起フィルター及び発光フィルターの設定は、メーカーによって異なる。したがって、実験の最適化プロセスの一環として、各染料について機器を較正しなければならない。したがって、マルチプレックスＰＣＲアッセイの開発における１つの制限は、単一の反応で効果的に測定できるフルオロフォア、したがってプローブの数である。例えば、マルチプレックスＰＣＲでは、異なる蛍光レポータ間のシグナルクロストークが定量化を損なうか、又は偽陽性を引き起こす可能性がある。したがって、最小限のスペクトルの重複でフルオロフォアを選択することが不可欠である。追加として、フルオロフォア、特にそれらの発光スペクトル及び励起スペクトルは、使用されるＰＣＲ機器、特に各フィルターセットのバンドパス仕様とも互換性がなければならない。
更なる態様では、記載されるプローブを使用して、ｑＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ等のシングルプレックス又はマルチプレックスＰＣＲを実施するための方法が提供される。エンドポイントＰＣＲは、ＰＣＲの全てのサイクルが完了した後の分析である。テンプレートが２倍になると定量化が可能になるｑＰＣＲ（対数期）とは異なり、エンドポイント分析は、増幅の定常期に基づいている。
特に、複数の標的ＤＮＡ配列を増幅及び検出するための方法は、記載されるプローブを含む組成物又は反応混合物を提供することと、当該複数の標的配列の増幅が起こり得るように反応混合物を熱サイクリングプロトコルに供することと、複数の増幅サイクルの間に少なくとも１回、記載されるプローブの蛍光を検出することによって増幅をモニタリングすることと、を含む。
記載される方法の核酸標的（複数可）は、当業者に知られている任意の核酸標的であり得る。更に、標的は、低突然変異の領域又は高突然変異の領域であり得る。例えば、本明細書に開示される方法の１つの特に価値のある使用は、ＲＮＡウイルス遺伝子等の高度に突然変異した核酸、又は一塩基多型（ＳＮＰ）等の高い遺伝的可変性の領域を標的とすることを含む。いくつかの実施形態において、法医学試料及び／又は固定組織からの材料等の標的は、断片化又は分解され得る。標的は、増幅しやすい任意のサイズであり得る。本明細書で提供される方法及び組成物の１つの特に価値のある使用は、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ等の短い断片の同定を伴う。別の特に価値のある使用は、固定された試料又は環境に曝露された試料等、核酸が断片化及び／又は分解された可能性がある試料に対するものである。したがって、この方法は、例えば、生検組織及び法医学ＤＮＡに使用され得る。標的は、精製されていてもされていなくてもよい。標的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されてもよく（例えば、ｃＤＮＡ標的）、又は生物学的試料中に見出され得る（例えば、ＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）標的）。生体試料は、処理なしで使用することができるか、又は生体試料は、本明細書に開示される方法を妨害する可能性がある物質を除去するために処理することができる。
本明細書で提供されるプローブは、診断方法、例えば、ＳＮＰ検出、特定のバイオマーカの同定等で使用され得、それにより、プローブは、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、及び真菌を含むが、これらに限定されないヒト疾患の感染症因子の配列（例えば、ゲノム）に相補的であり、それにより患者からの核酸を有する試料中の感染性因子の存在を診断する。標的核酸は、ゲノム又はｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ又は合成、ヒト又は動物、又は微生物等のものであり得る。他の実施形態において、プローブを使用して、感染性因子によって引き起こされない疾患又は障害を診断又は予知することができる。例えば、プローブは、ヒト又は動物由来の試料中の突然変異、多型、又は対立遺伝子の存在を同定することによって、癌、自己免疫疾患、精神疾患、遺伝性障害等を診断又は予後診断するために使用され得る。いくつかの実施形態において、プローブは、突然変異又は多型を含む。更に、プローブは、疾患又は障害の治療の進行を評価又は追跡するために使用されてもよい。
マルチプレックス分析の恩恵を受けるもう１つの分野は、ヒト識別の分野における遺伝子マーカの使用である。遺伝子マーカは、一般に、ＤＮＡタイピング等の分析対象の特性を備えたゲノムＤＮＡに対立遺伝子を有する多型遺伝子座のセットであり、個々はＤＮＡの変異に基づいて区別される。ほとんどのＤＮＡタイピング方法は、集団内で少なくとも２つの異なる形態又は対立遺伝子に現れることが知られているＤＮＡマーカのうち１つ又は複数の領域の長さ及び／又は配列の違いを検出及び分析するように設計されている。このような変異は「多型」と呼ばれ、そのような変異が発生するＤＮＡの領域は「多型遺伝子座」と呼ばれる。ＤＮＡタイピングを実行する１つの可能な方法は、ＰＣＲ増幅技術（ＫＢ Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号）と長さ変異多型の分析との連結を含む。短縦列反復（ＳＴＲ）、ミニサテライト、可変数の縦列反復（ＶＮＴＲ）は、長さの変異の多型の例である。約３～７ヌクレオチドの繰り返し単位を含むＳＴＲは、ＤＮＡの他の可変長領域から可能な生成物よりも小さな生成物を生成するように増幅プロトコルを設計できるため、ＰＣＲアプリケーションにおいて遺伝子マーカとして有用であるために十分短い。
複数のＳＴＲ遺伝子座を含むいくつかのそのようなシステムが記載されている。例えば、ＡＭＰＦＬＳＴＲ（登録商標）ＳＧＭＰＬＵＳ（商標）ＰＣＲＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ ＵＳＥＲ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｐｐ．ｉ－ｘ及び１－１～１－１６（２００１）、ＡＭＰＦＬＳＴＲ（登録商標）ＩＤＥＮＴＩＦＩＬＥＲ（登録商標）ＰＣＲ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ ＵＳＥＲ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｐｐ．ｉ－ｘ及び１－１～１－１０（２００１）、ＪＷ Ｓｃｈｕｍｍ ｅｔ ａｌ、米国特許第７，００８，７７１号を参照されたい。
本教示の方法は、遺伝子座、プライマ、及び増幅プロトコルの好適なセットを選択して、複数の共増幅遺伝子座から増幅対立遺伝子（アンプリコン）を生成することを意図しており、サイズが重複しないように、及び／又はサイズが重複している異なる遺伝子座の対立遺伝子を区別できるように標識される。更に、これらの方法は、単一の増幅プロトコル内での使用に適合する複数のＳＴＲ遺伝子座の選択を意図している。
本明細書に開示されるものに加えて、成功的組合せは、例えば、遺伝子座の組合せの試行錯誤、プライマ対配列の選択、及び分析のための全ての遺伝子座を増幅できる平衡を特定するためのプライマ濃度の調整によって生成することができる。これらの教示の方法及び材料が開示されると、これらの教示の方法及びキットで使用するための遺伝子座、プライマ対、及び増幅技術を選択する様々な方法が当業者によって示唆される可能性が高い。そのような方法は全て、添付の特許請求の範囲内であることを意図する。
本教示に従って使用するための遺伝子座のセットを選択するために、多数の異なる技術のいずれも使用することができる。本教示の方法によって分析される遺伝子座を選択するためにどの方法が使用され得るかにかかわらず、様々な実施形態においてマルチプレックス分析のために選択される遺伝子座は、以下の特徴の１つ又は複数を共有する。（１）ＤＮＡの対立遺伝子評価を可能にするのに十分な増幅産物を産生する。（２）有効な標的遺伝子座の伸長中又は非特異的アンプリコンの生成中に追加の塩基が組み込まれるため、マルチプレックス増幅の工程中にアーティファクトが発生してもほとんど発生しない。（３）ポリメラーゼによる増幅反応の早期終了のため、アーティファクトが発生してもほとんど発生しない。例えば、ＪＷ Ｓｃｈｕｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、ＦＯＵＲＴＨ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ ＯＮ ＨＵＭＡＮ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ、ｐｐ．１７７～１８７、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．を参照されたい。
一般に、オリゴヌクレオチドプライマは化学合成することができる。プライマの設計及び選択は、ＰＣＲ最適化の所定の手順である。当業者は、対象の標的遺伝子座を増幅するための特異的プライマを容易に設計することができるか、又は本明細書で列挙した参考文献からプライマセットを得ることができる。これらのプライマは全て、本教示の範囲内である。
一例として、プライマは、増幅及び／又はマルチプレックスシステムを展開するための当技術分野で入手可能であり既知の様々なソフトウェアプログラムのいずれかを使用することによって選択することができる。例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ）を参照されたい。ソフトウェアプログラムの使用例では、対象の遺伝子座の領域からの配列情報をソフトウェアにインポートすることができる。次いで、ソフトウェアは様々なアルゴリズムを使用して、ユーザの仕様に最適なプライマを選択する。
ゲノムＤＮＡの試料は、本教示の方法で使用するために、その後のＤＮＡ増幅に適合する試料調製のための任意の手順を使用して調製することができる。そのような手順の多くは当業者に知られている。いくつかの例は、フェノール抽出によるＤＮＡ精製（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、ＳＥＣＯＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、ｐｐ．９．１４～９．１９）、及び塩沈殿による部分精製（Ｓ．Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）、ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤＳ ＲＥｓ．１６：１２１５）又はｃｈｅｌｅｘ（ＰＳ Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ １０：５０６－５１３；ＣＴ Ｃｏｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｊ．ＦＯＲＥＮＳＩＣ Ｓｅｒ、３９：１２５４）及び未処理の血液を使用した未精製物質の放出（Ｊ．Ｂｕｒｃｋｈａｒｄｔ（１９９４）、ＰＣＲＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ３：２３９－２４３；ＲＢＥ ＭｃＣａｂｅ（１９９１）、ＰＣＲ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ １：９９－１０６；Ｎｏｒｄｖａｇ（１９９２）、ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ １２：４ ｐｐ．４９０－４９２）である。
本教示の方法を使用して分析される少なくとも１つのＤＮＡ試料がヒトゲノムＤＮＡである場合、ＤＮＡは組織試料、例えば血液、精液、膣細胞、毛髪、唾液、尿、骨、頬側試料、胎盤細胞又は胎児細胞を含む羊水、絨毛膜絨毛、及び／又はこれらのいずれか又は他の組織の混合物のうち１つ又は複数等の組織試料から調製できる。
血液又は頬側試料を含む試料は、ＦＴＡ（登録商標）紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｂｏｄｅ Ｂｕｃｃａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、又は綿棒から直接処理することもできる。綿棒の例には、限定されるものではないが、Ｃｏｐａｎ ４Ｎ６ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｆｌｏｃｋｅｄ Ｓｗａｂ（Ｃｏｐａｎ、Ｐ／Ｎ３５２０ＣＳ０１、Ｍｕｒｒｉｅｔａ、ＣＡ）、Ｏｍｉ Ｓｗａｂ（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｃ．、Ｐ／Ｎ１０００５）、及びＰｕｒｉｔａｎ Ｃｏｔｔｏｎ ｓｗａｂ（Ｐｕｒｉｔａｎ、Ｐ／Ｎ２５－８０６ １ＷＣ ＥＣ、ｖａｒｉｏｕｓ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ）が挙げられる。
一旦ゲノムＤＮＡの試料が調製されると、本教示のマルチプレックス増幅工程において標的遺伝子座を共増幅することができる。遺伝子座を増幅するために任意の多くの様々な増幅方法、例えば、ＰＣＲ（ＲＫ Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５）、ＳＣＩＥＮＣＥ ２３０：１３５０－１３５４）、転写ベースの増幅（ＤＹ Ｋｗｏｈ ａｎｄ ＴＪ Ｋｗｏｈ（１９９０）、ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、１９９０年１０月）及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）（ＧＴ Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｅｒ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３９２－３９６）等を使用できる。本教示のいくつかの実施形態において、マルチプレックス増幅は、ＰＣＲを介して行うことができ、ＤＮＡ試料は、マルチプレックスの各遺伝子座に特異的なプライマ対を使用して増幅される。標準的なＰＣＲの化学成分は、一般に、溶媒、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、オリゴヌクレオチドプライマ、二価金属イオン、及びＰＣＲ増幅の標的（複数可）を含むと予想されるＤＮＡ試料を含む。水は、緩衝剤及びＫＣＬ等の非緩衝塩を含む典型的なＰＣＲの溶媒として一般的に使用することができる。緩衝剤は当技術分野で知られているいずれの緩衝剤でもよく、限定されるものではないが、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ等であり、ＰＣＲの結果を最適化するための所定の実験によって異なり得る。当業者は、最適な緩衝条件を容易に決定することができる。ＰＣＲ緩衝剤は、増幅に使用する特定の酵素に応じて最適化できる。
ＰＣＲにおいて、ヌクレオチド三リン酸を重合して増幅産物にする酵素は、いずれのＤＮＡポリメラーゼでもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、当技術分野で知られている任意の耐熱性ポリメラーゼであり得る。本教示において使用できるいくつかのポリメラーゼの例は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ等の生物由来のＤＮＡポリメラーゼである。酵素は、例えば、供給源の細菌から単離する、組換えＤＮＡ技術によって製造する、又は商業的な供給源から購入したもの等のいくつかの可能な方法のいずれかによって入手できる。そのような市販のＤＮＡポリメラーゼのいくつかの例には、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｒＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及びｒＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＸＬ（全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．によって製造）が挙げられる。好適なポリメラーゼの他の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＴｎｅ、Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓからのＶｅｎｔ及びＶｅｎｔ Ｅｘｏ－、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａからのＴｍａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐからのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ及びＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ Ｅｘｏ－、並びに上記の変異体、及び誘導体が挙げられる。
マルチプレックス反応でプライマの蛍光標識を使用する場合、通常、少なくとも３つの異なる標識を使用して、異なるプライマを標識することができる。サイズマーカを使用してマルチプレックス反応の産物を評価する場合、サイズマーカの調製に使用するプライマは、反応において対象の遺伝子座を増幅するプライマとは異なる標識で標識することができる。自動化された蛍光イメージング及び分析の出現により、マルチプレックス増幅産物のより迅速な検出及び分析を達成することができる。
本教示のいくつかの実施形態において、フルオロフォアを使用して、例えば、プライマに共有結合して、蛍光標識プライマを作製することによってマルチプレックス増幅の少なくとも１つのプライマを標識することができる。いくつかの実施形態において、マルチプレックス内の異なる標的遺伝子座に対するプライマを、異なるフルオロフォアで標識することができ、各フルオロフォアは、フルオロフォアの発光波長に応じて異なる着色産生物を産生する。これらの様々に標識されたプライマは、同じマルチプレックス反応で使用することができ、その後、それぞれの増幅産物を一緒に分析する。特定の遺伝子座を増幅する対のフォワードプライマ又はリバースプライマのいずれかを標識できるが、フォワードがより頻繁に標識される場合が多い。
ＰＣＲ産物は、ふるい分け又は非ふるい分けの培地で分析できる。これらの教示のいくつかの実施形態において、例えば、ＰＣＲ産物を電気泳動、例えば、Ｈ．Ｗｅｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、ＧＥＮＯＭＥ ＲＥ．８：６９－８０に記載されるようなキャピラリ電気泳動（Ｅ．Ｂｕｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｊ．ＦＯＲＥＮＳＩＣ ＳＣＩ．４３：（１）、ｐｐ．１６４－１７０）も参照されたい）、又はＭ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）、ＳＣＡＮＤ．Ｊ．ＣＬＩＮ．ＬＡＢ．ＩＮＶＥＳＴ．５９（３）：１６７－１７７に記載されるようなスラブゲル電気泳動、又は変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）、ｉｎ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、ＳＥＣＯＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、ｐｐ．１３．４５－１３．５７を参照されたい）によって分析することができる。電気泳動におけるＤＮＡフラグメントの分離は、主にフラグメントサイズの区別に基づいている。増幅産物は、クロマトグラフィ、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって分析することができる。
一旦増幅された対立遺伝子が分離されると、これらの対立遺伝子及び、例えばゲル又はキャピラリ（例えば、ＤＮＡ サイズマーカ又は対立遺伝子ラダー）内の他のＤＮＡ を視覚化して分析することができる。多くの場合、マルチプレックス遺伝子座の検出方法は蛍光によるものである。例えば、ＪＷ Ｓｃｈｕｍｍ ｅｔ ａｌ．ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ ＦＲＯＭ ＴＨＥ ＥＩＧＨＴＨ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ ＯＮ ＨＵＭＡＮ ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ、ｐｕｂ．１９９８、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ｐｐ．７８－８４；Ｅ．Ｂｕｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）前出を参照されたい。マルチプレックス反応において各遺伝子座を検出するために蛍光標識プライマを使用する場合、増幅の後に、蛍光検出器を使用して、標識産物の検出を行うことができる。
ＤＮＡ試料の各遺伝子座に存在する対立遺伝子のサイズは、既知のサイズのＤＮＡ マーカ等、電気泳動におけるサイズ標準と比較することによって決定できる。２つ以上の多型ＳＴＲ遺伝子座を含むマルチプレックス増幅の評価のためのマーカは、評価される各遺伝子座に対する遺伝子座特異的対立遺伝子ラダー又は対立遺伝子ラダーの組合せも含み得る。例えば、Ｃ．Ｐｕｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、ＡＭ．Ｊ．ＨＵＭ．ＧＥＮＥＴ．５３：９５３－９５８；Ｃ．Ｐｕｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、ＧＥＮＯＭＩＣＳ ２３：２６０－２６４を参照されたい。ＳＴＲ遺伝子座の検出に使用するのに好適ないくつかの対立遺伝子ラダー、及び本明細書で開示されているラダー構築のいくつかの方法の説明に関して、米国特許第５，５９９，６６６号、第５，６７４，６８６号、及び第５，７８３，４０６号も参照されたい。個々の遺伝子座の対立遺伝子ラダーの構築に続いて、増幅産物と同時に、ラダーを電気泳動することができる。各対立遺伝子ラダーは、対応する遺伝子座から対立遺伝子と一緒に移動する。
本教示のマルチプレックス反応の産物は、内部レーン標準を使用して評価することもできる。すなわち、例えば増幅産物と同じキャピラリ中で電気泳動されるように構成された特殊なタイプのサイズマーカである。内部レーン標準は、既知の長さの一連のフラグメントを含むことができる。内部レーン標準は、増幅反応において他の染料と区別できる蛍光染料で標識することもできる。ゲル電気泳動の異なるレーン又はキャピラリ電気泳動の異なるキャピラリでの移動を比較するために、レーン標準を、増幅試料又はサイズ標準／対立遺伝子ラダーと混合できる。内部レーン標準の移動の変動は、分離媒体の性能の変動を示す機能を果たす。この差の定量化及び対立遺伝子ラダーとの相関は、異なるレーン又はキャピラリで電気泳動された増幅産物の較正、及び未知の試料中の対立遺伝子のサイズ決定における補正を提供できる。
蛍光染料が増幅産物の標識に使用される場合、電気泳動及び分離された産物は、蛍光検出装置、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０又は３ ｌ３０ｘｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ、又はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）；又はＨｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ（商標）ＩＩ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｌｔｄ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ）を使用して分析できる。本教示の様々な実施形態において、ＰＣＲ産物は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１３０ｘｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等の電気泳動機器と組み合わせたキャピラリゲル電気泳動プロトコルによって分析することができ、電気泳動増幅産物の対立遺伝子分析は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（登録商標）ＩＤ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．２によって行うことができる。他の実施形態において、増幅産物は、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ用に調製された、約４．５％、２９：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミド、８Ｍ尿素ゲル中での電気泳動によって分離することができる。
本教示は、上記のプロセスを利用するキットにも向けられている。いくつかの実施形態において、基本キットは、１つ又は複数の遺伝子座及び特異的プライマを有する容器を含むことができる。キットは、任意に使用説明書も含むことができる。キットは、他の任意のキット成分、例えば、特定の遺伝子座のそれぞれに向けられた１つ又は複数の対立遺伝子ラダー、増幅に十分な量の酵素、増幅を促進するための増幅緩衝剤、酵素活性を促進する二価カチオン溶液、増幅中の鎖伸長のためのｄＮＴＰｓ、電気泳動のための増幅された物質調製のためのローディング溶液、テンプレートコントロールとしてのゲノムＤＮＡ、分離媒体中で予想される通りに物質が移動することを保証するサイズマーカ、及びユーザを教育し、使用におけるエラーを制限するプロトコル及びマニュアルを含む。キット内の様々な試薬の量も、プロセスの最適な感度等の多くの要因に応じて変更できる。手動アプリケーションで使用するための試験キット、又は自動化された検出器又は分析器で使用するための試験キットを提供することは、これらの教示の範囲内である。
臨床設定では、ＳＴＲマーカを使用して、例えば、骨髄移植におけるドナーの移植の程度をモニタリングすることができる。病院では、これらのマーカは標本の照合と追跡にも役立つ。これらのマーカは、ヒトの人種及び民族群の違いに関する集団生物学（ＤＢ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｅｒ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：６７２３－６７２７）、進化と種の多様性、及び動植物分類における変化（ＭＷ Ｂｒｕｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、ＣＵＲＲ．ＢＩＯＬ．３：９３９－９４３）等の科学の別の分野にも参入している。
ｍｉｎｉ－ＳＴＲ（約２００塩基対未満の遺伝子座）の増幅により、参照により本明細書に組み込まれている、ＭＤ Ｃｏｂｌｅ（２００５）、Ｊ．ＦＯＲＥＮＳＩＣ ＳＣＩ ５０（１）：４３－５３で証明されるように、高度に分解されたＤＮＡのプロファイリング分析が可能となった。表１（表１の２０１０年１１月１５日出願の米国特許出願第６１／４１３，９４６号、及び２０１１年８月２２日出願の米国特許出願第６１／５２６，１９５号を参照されたい）は、プライマ増幅セット内のＳＴＲマーカを増幅するために使用されるプライマの位置に応じたｍｉｎｉ－ＳＴＲとみなすことができる遺伝子座も提供する。
ＤＮＡ濃度は、当業者に知られているＤＮＡ定量化の標準的な方法を使用して、本教示の方法で使用する前に測定することができる。そのような定量化方法には、例えば、上記Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）、Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｅ．５によって記載されている分光光度測定，又はＣ Ｆ Ｂｒｕｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９７９）、ＡＮＡＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．９２：４９７－５００によって説明されているような測定技術を使用した蛍光測定法が含まれる。ＤＮＡ濃度は、Ｊ Ｓ Ｗａｙｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、Ｊ．ＦＯＲＥＮＳＩＣ ＳＣＩ．３６：１１９８－１２０３（１９９１）によって記述されているようなヒト特異的プローブと ＤＮＡ標準のハイブリダイゼーションの量を比較することによって測定できる。増幅反応で使用するテンプレートＤＮＡが多すぎると、正確な対立遺伝子を表さない増幅アーティファクトが生じる可能性がある。
マルチプレックス反応において、プライマの蛍光標識が使用される場合、一般に、少なくとも３つの異なる標識、少なくとも４つの異なる標識、少なくとも５つの異なる標識、少なくとも６つの異なる標識が使用される。例えば、既存の市販のアッセイでは、６つの独自の染料標識（ＶｅｒｉＦｉｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する。マルチプレックス蛍光染料ベースの反応の分析に使用される機器は、蛍光染料を励起するために放出できる波長に制限があり、検出できる染料から放出される光の波長に制限がある。少なくとも８つの標識、少なくとも１０つの標識、又は少なくとも１６つの標識を使用するマルチプレックスアッセイを設計するには、重複がほとんどない、互いに独自のスペクトルを持つ一連の染料が必要である。更に、蛍光染料標識は全て、励起波長の特定のセットを生成することができ、検出可能な特定の範囲の発光波長を有する機器上で、検出可能でなければならない。本明細書に記載のローダミン誘導体のクラスは、既存の染料化合物では利用できない独自のスペクトル特性を備えた染料標識を提供し、したがって、現在のマルチプレックスアッセイで一般に使用される既存のレーザー技術を使用する、最大８、１０、１２、１６以上の異なる標識とのマルチプレックス反応において使用される蛍光染色標識の数を増加させる可能性を開く。機器の性能の改善により、８ を超える標識（例えば、少なくとも１０、少なくとも １２、又は少なくとも１６の異なる標識）を実行するするマルチプレックスアッセイが、異なるプライマを標識するのに使用できることが想定される。サイズマーカを使用してマルチプレックス反応の産物を評価する場合、サイズマーカの調製に使用するプライマは、反応において対象の遺伝子座を増幅するプライマとは異なる標識で標識することができる。自動化された蛍光イメージング及び分析の出現により、マルチプレックス増幅産物のより迅速な検出及び分析を達成することができる。
以下は、当技術分野で周知であり、複数の蛍光標識を使用するアッセイを提供するために、本教示に記載の化合物と組み合わせて使用するのに好適である、可能なフルオロフォアのいくつかの例である。このリストは例示を目的としたものであり、網羅しているものではない。いくつかの可能なフルオロフォアとしては、最大４９２ｎｍで吸収し、最大５２０ｎｍで放出する、フルオレセイン（ＦＬ）；最大５５５ｎｍで吸収し、最大５８０ｎｍで放出する、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標））；最大４９５ｎｍで吸収し、最大５２５ｎｍで放出する、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ（商標））；最大５２５ｎｍで吸収し、最大５５５ｎｍで放出する、２’，７’－ジメトキシ－４’，５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ（商標））；最大５８５ｎｍで吸収し、最大６０５ｎｍで放出する、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ（商標））；最大５５２ｎｍで吸収し、最大５７０ｎｍで放出する、ＣＹ３（商標）；最大６４３ｎｍで吸収し、最大６６７ｎｍで放出する、ＣＹ５（商標）；最大５２１ｎｍで吸収し、最大５３６ｎｍで放出する、テトラクロロ－フルオレセイン（ＴＥＴ（商標））；及び最大５３５ｎｍで吸収し、最大５５６ｎｍで放出する、ヘキサクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ（商標））；最大５４６ｎｍで吸収し、最大５７５ｎｍで放出する、ＮＥＤ（商標）；最大約５２０ｎｍで放出する、６－ＦＡＭ（商標）；最大約５５０ｎｍで放出する、ＶＩＣ（登録商標）；最大約５９０ｎｍで放出する、ＰＥＴ（登録商標）；最大約６５０ｎｍで放出する、ＬＩＺ（商標）が挙げられる。Ｓ Ｒ Ｃｏｔｉｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．による米国特許第６，７８０，５８８；ＡＭＰＦＬＳＴＲ（登録商標）ＩＤＥＮＴＩＦＩＬＥＲ（商標）ＰＣＲ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ ＵＳＥＲ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ、ｐｐ．１－３、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（２００１）を参照されたい。上記の発光及び／又は吸収波長は典型的なものであり、一般的なガイダンスの目的にのみ使用できることに注意し、実際のピーク波長は、アプリケーションや条件によって異なる場合がある。当業者に知られており、以下に提供されるように、所望の吸収及び発光スペクトル並びに色のために追加のフルオロフォアを選択することができる。
Figure 2022514397000033
Figure 2022514397000034

Figure 2022514397000035
本明細書に記載の非対称ローダミン化合物は、マルチプレックスアッセイにおいて、１つ又は複数の追加の蛍光標識と組み合わせて使用することができる。本教示の様々な実施形態は、少なくとも８つの異なる染料を含む単一のマルチプレックス反応を含み得る。少なくとも８つの染料は、上に挙げた染料のうちの任意の８つ又は当技術分野で知られている任意の他の８つの材料を含んでもよい。他の実施形態において、少なくとも１０、少なくとも１２、又は少なくとも１６の異なる染料含む単一のマルチプレックス反応を使用してもよい。
記載されるプローブを含む、反応混合物又はマスターミックスなどの組成物も提供される。一実施形態において、リアルタイム又は定量的ＰＣＲ、又はエンドポイントＰＣＲ等のＰＣＲ用の組成物は、記載されるプローブのうちの少なくとも１つを含む。一実施形態において、ＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ、又はエンドポイントＰＣＲ）のための組成物又は反応混合物又はマスターミックスは、４つの標的核酸の検出を可能にするプローブと、第５及び／又は第６の標的核酸の少なくとも１つの検出を可能にする記載されるプローブ（複数可）とを含み、記載されるプローブの各々は、ＦＲＥＴドナー部分、すなわちフルオロフォア、及びＦＲＥＴアクセプタ部分、すなわちクエンチャからなり、フルオロフォアは、約６５０～７２０ｎｍの発光極大を有する。本明細書に記載されるクエンチャの吸収極大は、６６０～６６８ｎｍである。本明細書に記載されるクエンチャの吸光度範囲は、５３０～７３０ｎｍである。代替実施形態において、記載されるフルオロフォア及びクエンチャを選択したオリゴヌクレオチドにコンジュゲートするための標識試薬が提供される。
更に、そのような組成物又は反応混合物又はマスターミックスは、次のリスト、ポリメラーゼ連鎖反応に適用可能な緩衝剤、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、５’～３’のエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも一対又は数対の増幅プライマ及び／又は追加のプローブから選択される１つ又はいくつかの化合物及び試薬を含む場合がある。
いくつかの実施形態において、提供される方法は、増幅産物を使用して標的ポリヌクレオチドの遺伝子型を決定することを更に含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、増幅産物を使用して標的ポリヌクレオチドのコピー数を決定することを更に含む。
参考文献、特許、特許出願、科学文献及び他の印刷された刊行物、並びにＧｅｎ Ｂａｎｋデータベース配列への登録番号は、本明細書において引用され、参照によりその全体が全て本明細書に組み込まれる。
当業者が理解するように、本教示の意図から逸脱することなく、本教示の様々な実施形態に多数の変更及び修正を加えることができる。そのような変更は全て、これらの教示の範囲内であることを意図する。
別段に言及しない限り、本実施形態の方法及び技術は、一般的には、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、かつ本明細書全体を通して引用及び議論される様々な一般的及びより具体的な参照文献に記載されるように行われる。例えば、Ｌｏｕｄｏｎ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００２、ｐｐ．３６０－３６１、１０８４－１０８５；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ、Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００１を参照されたい。
本明細書に記載の化合物の名称は、一般に、市販のＡＣＤ／Ｎａｍｅ ２０１４（ＡＣＤ／Ｌａｂｓ）又はＣｈｅｍＢｉｏＤｒａｗ Ｕｌｔｒａ １３．０（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して導出されている。
明確にするために、別個の実施形態に関して記載される本開示の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことを理解されたい。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態に関して記載される本開示の様々な特徴は、別個に、又は任意の好適な副組合せで提供されてもよい。変数によって表される化学基に関連する実施形態の全ての組合せは、本開示に具体的に包含され、各組合せ全てが個別に明示的に開示されたかのように、そのような組合せが安定な化合物である化合物を包含する限りにおいて、本明細書に開示される。（すなわち、生物活性について単離、特性決定、及び試験することができる化合物）。更に、そのような変数を説明する実施形態に列挙された化学基の副組合せも、本開示に具体的に包含され、化学基のそのような副組合せのそれぞれが全て個別に明示的に本明細書に開示されるかのように、本明細書に開示される。
化学合成
記載の方法において有用な例示的な化学物質は、以下の一般的調製及び以下の特定の実施例の説明的合成スキームを参照することにより記載される。当業者であれば、本明細書の様々な化合物を得るために、所望される産物を得るために好適な保護の有無にかかわらず、出発物質を好適に選択して、反応スキームを通して最終的に所望される置換を実施するであろう。あるいは、最終的に望まれる置換の代わりに、反応スキームを通して好適な基を実施し、必要に応じて所望の置換基で置き換えることが必要又は望ましい場合もある。更に、当業者は、以下のスキームに示される変換が、特定のペンダント基の機能性に適合する任意の順序で実行され得ることを認識するであろう。
一般的な化学物質は全て、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｃｒｏｓ、又はＡｌｆａ Ａｅｓａｒ等の市販の化学薬品会社から購入した。順相フラッシュクロマトグラフィには、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのシリカゲル（２２０～４００メッシュ）を使用した。ＪＴ Ｂａｋｅｒのオクタデシル官能化シリカゲルを使用して逆相クロマトグラフィを実施した。全てのクロマトグラフィ溶媒勾配は段階的であった。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）は、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅのアルミニウム支持シリカゲルスライドで実施した。逆相 ＴＬＣは、ＡｎａｌｔｅｃｈのＨＰＴＬＣ ＲＰ１８Ｆ Ｕｎｉｐｌａｔｅプレートで実施した。発生したスポットを、長波長と短波長の両方のＵＶ 照射で可視化した。
ＮＭＲスペクトルは、溶媒ピークを基準として Ｖａｒｉａｎ ４００ＭＨｚ ＮＭＲで測定した。ＨＰＬＣは、ダイオードアレイ検出器及び複数のチャネル波長を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣで実施した。典型的な溶出は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｉｔ Ｃ８ １５０ｘ４．６ｍｍ ５μカラムを通して、アセトニトリル及び０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）のグラジエントを用いて１ｍｌ／分で実施した。ＬＣＭＳデータは、ＰＥ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ １５０ＥＸ質量分析計に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ＬＣシステムを使用して得た。ＭＳデータは、ＡＰＩ Ｓｃｉｅｘ ４０００質量分析計に直接注入して得た。
無水溶媒は、オーブンで乾燥させた注射器を使用して、窒素存在下で操作した。本明細書で使用される場合、用語「水性後処理」は、以下の工程、規定の有機溶媒に反応混合物を溶解又は希釈する工程、規定の水溶液又は水で洗浄する工程、組み合わせた有機層を飽和ＮａＣｌで１回洗浄する工程、溶液を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させる工程、乾燥剤を濾過し、ｉｎ ｖａｃｕｏで溶媒を除去する工程を含む精製方法を指す。
実施例１：非対称ローダミン染料の調製。
Figure 2022514397000036
工程１：１－ベンジル－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン－７－オール、２の調製
１，２，３，４－テトラヒドロキノリン－７－オール、１（１０．００ｇ、０．０６７０ｍｏｌ、Ｇ．Ｆｉｅｌｄ、Ｐ．Ｒ．Ｈａｍｍｏｎｄ、ＰＴＯ５２８３３３６）を無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解した。無水Ｋ2ＣＯ3（２７．７９ｇ、０．１３８ｍｏｌ）及び臭化ベンジル（９．６ｍＬ、０．０８０４ｍｏｌ）を加え、混合物を６０゜Ｃで２時間加熱し、次いで室温で一晩撹拌した。混合物を濾過し、ＤＣＭで洗浄した。濾液を濃縮し、次いでＤＣＭに溶解し、水で４回洗浄し、後処理して茶色の粗製固体を得た。これをシリカゲルフラッシュフラッシュカラムクロマトグラフィによって精製し、０％～５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出して、１－ベンジル－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン－７－オール、２（１２．２７ｇ、７６％）をくすんだ白色の固体として得た（Ｃ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＷＯ２００３／０７２５６６）、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ2Ｃｌ2）７．３７（ｍ、２Ｈ）、７．２９（ｍ、３Ｈ）、６．８２（ｄ、１Ｈ）、６．０４（ｄｄ、１Ｈ）、５．９６（ｄ、１Ｈ）、４．５３（ｓ、１Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、３．４１（ｔ、２Ｈ）、２．７６（ｔ、２Ｈ）、２．０２（ｍ、２Ｈ）、ＭＳ：計算値 ２４０．３３、実測値 ２４０．２（ＭＨ+）。
工程２：２－（１－ベンジル－７－ヒドロキシ－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン－６－カルボニル）－３，６－ジクロロ－４－（イソプロポキシカルボニル）安息香酸、４／５の調製
化合物２（１７．３９ｇ、７２．６５ｍｍｏｌ）、３，６－ジクロロトリメレト酸イソプロピルエステル、３（２２．０２ｇ、７２．６５ｍｍｏｌ、３は、３の調製に関して参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００２／３０９４４に記載される方法で調製した）、及びトルエン（１００ｍｌ）を、窒素の存在下で激しく撹拌しながら６．５時間還流した。氷浴で冷却した後、混合物を濾過し、回収した紫黄色の固体をトルエンで洗浄し、乾燥させて、黄色の固体（３０．８１ｇ、７８％）としてケトン異性体４／５を得た。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ3Ｃ（Ｏ）ＣＤ3）、δ７．９５（ｓ／ｓ、１Ｈ）、７．２５－７．４０（ｍ、５Ｈ）、６．７９－６．８０（ｓ／ｓ、１Ｈ）、５．９９（ｓ、１Ｈ）、５．２５（ｍ、１Ｈ）、４．６８（ｓ、１Ｈ）、３．５４（ｔ、２Ｈ）、２．６０（ｍ、２Ｈ）、１．９５（ｍ、２Ｈ）、１．３９（ｍ、６Ｈ）、ＭＳ：計算値 ５０２．１、実測値 ５０２．４（ＭＨ+）。
工程３：非対称ローダミン染料６の調製
オキシ塩化リン（１０．９ｍｌ、１１７．２ｍｍｏｌ）を、クロロホルム（４００ｍｌ）内で、ケトン異性体混合物４／５（２１．１８ｇ、３０．４３ｍｍｏｌ）に添加し、５分間撹拌した。３－（ジベンジルアミノ）フェノール（８．８１ｇ、３９．０５ｍｍｏｌ、３－（ジベンジルアミノ）フェノールの調製に関して参照によって本明細書に組み込まれるＡ．Ｂｕｔａ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ、２０１５、５８ ４４４９に記載される方法によって調製される）を、クロロホルム（１５０ｍｌ）に溶解し、混合物に添加した。溶液は直ちに水色に変化した。溶液を３時間撹拌しながら還流した。得られた濃青色の溶液を濃縮し、乾燥させた。固体を臭化水素酸（４００ｍｌ）と共に４５分間激しく撹拌しながら還流し、次いで氷上に注いだ。得られた微細な青色沈殿物を、遠心分離により回収し、濾過し、水で洗浄した。固体を２ＭＴＥＡＡと共に一晩撹拌し、Ｃｅｌｉｔｅ５４５を通して濾過した。保持された固形物を全て回収し、ＭｅＯＨを使用してｃｅｌｉｔｅから分離し、次いで濃縮し、１０％ＭｅＯＨ／ＴＥＡＡ０．１Ｍと混合し、Ｃｅｌｉｔｅ５４５を通して再び濾過した。濾液を合わせ、大容量の濾液を、０．１ＭのＴＥＡＡで平衡化した大型逆相クロマトグラフィカラムの上部にロードした。異性体は、２５％、－３５％、－４０％、ＭｅＯＨ／０．１ＭのＴＥＡＡで溶出して分離した。断片をＨＰＬＣで分析し、染料６（ＨＰＬＣ及びＲＰ－ＴＬＣによる第２の溶出染料）を同量の水で希釈し、Ｃ１８の大型パッド上で脱塩した。固体を、１％ＴＦＡ／ＤＣＭで洗浄し、濾過し、乾燥させることにより更に精製して、染料６（５．７７ｇ、２５％）をＴＥＡ塩として得た。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）：δ９．５７（ｓ、１Ｈ）、９．１５（ｄ．１Ｈ）、８．９６（ｓ、１Ｈ）、８．７３（ｄ／ｄ、１Ｈ）、８．６４（ｄ、１Ｈ）、８．５３（ｓ、１Ｈ）、５．３６（ｍ、１Ｈ）、５．２６－５．１３（ｍ／ｑ７Ｈ）、４．８２（メートル、１Ｈ）、４．７２（メートル、１Ｈ）、３．８９（メートル、２Ｈ）、３．２９（ｔ、９Ｈ）、ＭＳ：計算値 ４８３．０５、実測値 ４８３．０５（ＭＨ+）、最大吸収波長５３７ｎｍ。
工程３：非対称ローダミン染料７の調製
染料６（４．２１ｇ、７．２０ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（５００ｍｌ）に溶解し、ＴＥＡ（２０．１ｍｌ、１４４ｍｍｏｌ）と混合した。無水トリフルオロ酢酸（２０．０ｍｌ、１４４ｍｍｏｌ）を滴下で添加し、溶液を０．５時間撹拌した。今では無色の溶液を濃縮し、ＤＣＭに再溶解し、１ＮのＨＣｌで洗浄し、後処理して化合物７を得た。
実施例２
Ｎ－保護非対称ローダミン７ホスホラミダイト、１０の調製
Figure 2022514397000037
工程１：非対称ローダミン染料活性化エステル８の調製
化合物７を無水ＤＣＭ（３００ｍｌ）に再溶解し、Ｎ－ヒドロキシスクシミド（１．６６ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）、及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、２．７６ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）と混合し、４５分間撹拌した。溶液を水で２回洗浄し、後処理した。残渣を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィにより精製して、５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出して、化合物８を得た。ＭＳ：ｃａｌｃｄ ７２２．０３、ｏｂｓｅｒｖｅｄ ７７２．０。
工程２：Ｎ－保護６－アミノ－２－ＤＭＴヘキサン－１－オールのリンカー非対称ローダミン染料９
化合物８を無水ＤＣＭ（２５０ｍｌ）及び６－アミノ－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）ヘキサン－１－オール（３．８８ｇ、８．６４ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．００ｍｌ、７．２０ｍｍｏｌ、ＴＥＡ）を滴下で添加し、４５分間撹拌した。得られた溶液を濃縮し、次いでシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィを使用して２．５％～５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出することで精製して、淡黄白色固体（５．４５ｇ、６８％）として９を得た。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ2Ｃｌ2）：δ８．３９（ｓ、１Ｈ）、７．７４（ｓ、１Ｈ）、７．７３（ｄ、１Ｈ）、７．４２（ｍ、２Ｈ）、７．３４－７．２０（ｍ、７Ｈ）、６．９０（ｄ／ｄ、１Ｈ）、６．８３（ｍ、４Ｈ）、６．７３（ｓ、１Ｈ）、６．２０（ｔ、１Ｈ）、３．９０（ｍ、１Ｈ）、３．８２－３．７０（ｍ／ｓ、７Ｈ）、３．６３（ｍ、２Ｈ）、３．４２（ｍ、２Ｈ）、３．２５（ｍ、１Ｈ）、３．０９（ｍ、１Ｈ）、２．１６（ｔ、１Ｈ）、２．０４（ｍ、２Ｈ）、１．７９（ｍ、１Ｈ）、１．５８（ｍ、２Ｈ／Ｈ2Ｏ）、１．３５（ｍ、４Ｈ）、ＬＣＭＳ：計算値 １１０４．３、実測値 １１０４．８（Ｍ－Ｈ-）。
工程３：Ｎ－保護非対称ローダミン７ホスホラミダイト、１０の調製
化合物９（５．３２ｇ、４．８１ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（２００ｍｌ）に溶解し、３Ａモレキュラーシーブ（１５ｇ）を添加した。２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２．１７ｇ、７．２１ｍｍｏｌ）、続いてテトラゾールアミン（０．４１２ｇ、２．４０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を窒素存在下、室温で１時間撹拌した。反応混合物を、２０％ＴＥＡ／ＤＣＭ、続いて２％ＴＥＡ／ＤＣＭで予め平衡化した逆相クロマトグラフィカラムを通して溶出した。次いで、プール及び濃縮された粗生成物を、最小限のＤＣＭに溶解し、体積比１：２０でヘプタンに数回沈殿させた。得られた固体をＤＣＭ中で数回濃縮して、溶媒を除去し、次いで完全に乾燥させた。依然として不純な場合は、ＤＣＭを用いて中性酸化アルミニウムパッドを通して生成物を溶出して、生成物を更に精製した。染料ホスホラミダイト１０は、白／淡琥珀色の固体として得られた（４．９５、７９％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ2Ｃｌ2）：δ７．７５（ｍ、３Ｈ）、７．４６（ｄ、２Ｈ）、７．２０－７．３５（ｍ、８Ｈ）、６．９４（ｄ、１Ｈ）、６．８３（ｄ、４Ｈ）、６．７７（ｓ、１Ｈ）、３．９１（ｍ、１Ｈ）、３．６５－３．８３（ｍ／ｓ、１１Ｈ）、３．５８（ｍ、２Ｈ）、３．４４（ｑ、２Ｈ）、３．１１（ｍ、２Ｈ）、２．７５（ｍ、２Ｈ）、２．５８（ｑ、２Ｈ）、２．０５（ｍ、２Ｈ）、１．９０（ｍ、１Ｈ）、１．６２（ｍ、２Ｈ／Ｈ2Ｏ）、１．４６（ｍ、２Ｈ）、１．３５（ｍ、２Ｈ）、１．１５（ｄ／ｄ、１２Ｈ）、31Ｐ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ2Ｃｌ2）：δ１４７．３（ｓ、１Ｐ）、ＬＣＭＳ：計算値 １３０６．４、実測値 １３０６．８（ＭＨ+）。
実施例３：Ｂｉｇ Ｄｙｅの非対称ローダミン標識オリゴヌクレオチドの固相合成
Figure 2022514397000038
Figure 2022514397000039

Figure 2022514397000040
Ｎ－保護対称ローダミンホスホラミダイト合成試薬で標識されたオリゴヌクレオチドは、Ｂｉｏｌｙｔｉｃ ３９００ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒの標準操作条件を使用して、ポリスチレン固体支持体上で合成した。Ｎ－保護対称ローダミンホスホラミダイト１０は、結合反応のためにアセトニトリル溶媒に溶解され、Ｎ－保護対称ローダミン染料付加物は、トリクロロアセチル酸によるＤＭＴの除去、ヌクレオチドホスホラミダイトモノマーの付加、無水酢酸との結合、及びインターヌクレオチドホスホジエステル結合を生成するためのイオジンによる酸化を使用する繰返し合成サイクルに対して安定である。このクラスの非対称ローダミンは、固体支持体から合成標識オリゴヌクレオチドを脱保護及び開裂させるために使用される条件（ｔ－ブチルアミン／メタノール／水を含む溶液で、６５゜Ｃにおいて５時間処理）に対しても安定であることが見出された。標識オリゴヌクレオチドの合成に使用される全体的なスキームは、上のスキームに示されている。このプロセスにより、ビスＴＦＡ－非対称ローダミンＤＭＴホスホラミダイト１０は、支持体結合オリゴヌクレオチドの５’－ヒドロキシルに結合して、酸化及びＤＭＴ基の除去後にホスホジエステル中間体１１を得た。ＰＥＧ二量体ホスホラミダイトを中間体１１の遊離ヒドロキシルに結合させて、酸化及びＤＭＴの除去後に中間体１２を得た。フルオレセインホスホラミダイト（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）は、中間体１２の遊離ヒドロキシルに結合した。得られた標識オリゴを酸化し、開裂し、支持体から脱保護して標識オリゴヌクレオチド１３を得た。オリゴ１３を、標準のクロマトグラフィプロトコルを使用して精製した。
本開示は、以下の番号付けされた条項によって更に説明することができる。
１．次式の化合物であって、
Figure 2022514397000041
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、単独の場合、それぞれ互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、あるいは、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成し、
Ｒ4は、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、又は６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基であり、
ｎは、１～１０の範囲の整数であり、
式中、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3、及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
式中、Ｒbは、－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa－ＳＨ、－ＳＲa－ＮＨ2、－ＮＨＲa－ＮＲcＲc、Ｎ+ＲcＲcＲcＸ-、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、Ｓ（Ｏ）2Ｒa、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲa、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa 、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcから選択され、
各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含み得る、５－８員の飽和又は不飽和の環を形成してもよく、
Ｒd及びＲeは、単独の場合、それぞれ、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、
Ｘはハロゲンであり、
ｎは、１～１０の範囲の整数である、化合物。
２．スピロラクトン環が開いた酸形態であり、アミン基が保護されていない、条項１に記載の化合物。特定の実施形態において、化合物の開いた酸形態は、化合物の閉じたスピロラクトン形態と比較して蛍光性である（又は蛍光の増加を示す）。本明細書に記載の化合物のアミン基は、閉じたスピロラクトンの形態で保護可能であり、核酸の標識の高収率及び高純度のためのホスホラミダイトとする、及びホスホラミダイトとして使用することができる。したがって、本明細書で提供されるのは、脱保護された条項１の化合物を含む蛍光標識核酸プローブ及びプライマである。アミン基の脱保護及び固体支持体からの核酸の開裂の後の開いたラクトン形態である、条項１の化合物の代表的な例を図８、９、１０Ａ及び１０Ｂに示す。
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｏｆｆｅｒｓ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＨＩＤ）は、５つのレポータ染料（すなわち、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＤ、ＴＡＺ、及びＳＩＤ）で核酸を標識するための試薬及びサイズ標準ＬＩＺ（ＮＧＭ Ｄｅｔｅｃｔ（商標）ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を含む。本明細書で提供される特定の染料は、既存の染料セットを補完する独自のスペクトル特性を持ち、ＨＩＤ アプリケーションに含めることができるレポータ染料の数を増やすために使用できる。特に、条項１に記載されている特定の非対称ローダミンは、既存の市販の染料セット内の他の染料から分解できるように、ピーク発光波長及び狭いスペクトル幅を示すことが見出された。例えば、ピーク発光波長（例えば、～５５９ｎｍ）を示す代表的な化合物は、構造Ｄ．１に示す非対称ローダミン化合物のクラスに属する。このような化合物は、既存の染料セット（図１１Ａ）において、ＦＡＭ（～５１７）及びＴＥＤ（～５８０ｎｍ）の隣接する発光ピークから良好に分離される。出願人は更に、ＶＩＣを２つの新しい染料で置き換えることにより、既存のＨＩＤ染料セットを拡張して７つ以上のレポータ染料を含めることができることを発見した（図１１Ｂ）。特定の実施形態において、Ｄ．１に記載の構造を有する非対称ローダミン及びＴＥＴ（～５３７ｎｍ）が、ＦＡＭ、ＴＥＤ、ＴＡＺ、及びＳＩＤを更に含むキットにおいて、ＶＩＣの代替として使用される。したがって、本明細書で提供される特定のキットは、～５５９ｎｍの発光を有する、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＴＥＤ、ＴＡＺ、及びＳＩＤの条項１に記載の化合物（例えば、構造Ｄ．１を有する化合物）で標識された核酸（又は核酸を標識するための試薬）を含む。
３．固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを次式の構造を有する試薬と反応させることによって製造される標識部分を含むオリゴヌクレオチドであって、
ＬＭ－Ｌ－ＰＥＰ
式中、ＰＥＰはリン酸エステル前駆体基であり、Ｌは前記標識部分をＰＥＰ基に結合させる任意のリンカーであり、ＬＭは式（Ｉ）のＮ－保護ＮＨ－ローダミン部分を含み、
Figure 2022514397000042
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、単独の場合、それぞれ互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ12、又はＲ13のうち１つは－Ｙ－の基を含み、式中Ｙは－Ｃ（Ｏ）－、Ｓ（Ｏ）2－、－Ｓ－及び－ＮＨ－からなる群から選択され、あるいは、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成し、
Ｒ4は、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、又は６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基であり、
ｎは、１～１０の範囲の整数であり、
式中、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3、及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
式中、Ｒbは、－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa－ＳＨ、－ＳＲa－ＮＨ2、－ＮＨＲa－ＮＲcＲc、Ｎ+ＲcＲcＲcＸ-、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、Ｓ（Ｏ）2Ｒa、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa 、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcから選択され、
各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含み得る、５－８員の飽和又は不飽和の環を形成してもよく、
Ｒd及びＲeは、単独の場合、それぞれ、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、
Ｘはハロゲンであり、
ｎは、１～１０の範囲の整数である、試薬。
４．スピロラクトン環が開いた形態であり、アミン基が保護されていない、条項３に記載の標識部分を含むオリゴヌクレオチド。
５．次式の構造式の化合物である、オリゴヌクレオチドを標識するのに有用な試薬であって、
ＬＭ－Ｌ－ＰＥＰ（ＸＸ）
式中、ＬＭはＮ－保護ＮＨ－ローダミン部分を含む標識部分を表し、ＰＥＰはホスホラミダイト基又はＨ－ホスホネート基を含むリン酸エステル前駆体基であり、Ｌは前記標識部分を前記リン酸エステル前駆体基に結合させる任意のリンカーであり、ここで次式の前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分は、
Figure 2022514397000043
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、単独の場合、それぞれ互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ12、又はＲ13のうち１つは－Ｙ－の基を含み、式中Ｙは－Ｃ（Ｏ）－、Ｓ（Ｏ）2－、－Ｓ－及び－ＮＨ－からなる群から選択され、あるいは、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成し、
Ｒ4は、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、又は６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基であり、
ｎは、１～１０の範囲の整数であり、
式中、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3、及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
式中、Ｒbは、－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa－ＳＨ、－ＳＲa－ＮＨ2、－ＮＨＲa－ＮＲcＲc、Ｎ+ＲcＲcＲcＸ-、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、Ｓ（Ｏ）2Ｒa、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa 、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcから選択され、
各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含み得る、５－８員の飽和又は不飽和の環を形成してもよく、
Ｒd及びＲeは、単独の場合、それぞれ、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、
Ｘはハロゲンであり、
ｎは、１～１０の範囲の整数である、オリゴヌクレオチドを標識するのに有用である試薬。
６．スピロラクトン環が開いた酸形態であり、アミン基が保護されていない、条項５に記載の試薬。

Claims (147)

  1. 次式の化合物であって、
    Figure 2022514397000044
     式中、
    Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、単独の場合、それぞれ互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、あるいは、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成し、
    Ｒ4は、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、又は６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
    Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基であり、
    ｎは、１～１０の範囲の整数であり、
    式中、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3、及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
    式中、Ｒbは、－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa、－ＳＨ、－ＳＲa、－ＮＨ2、－ＮＨＲa、－ＮＲcＲc、Ｎ+ＲcＲcＲcＸ-、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）2Ｒa、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲa、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcから選択され、
    各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含み得る、５－８員の飽和又は不飽和の環を形成してもよく、
    Ｒd及びＲeは、単独の場合、それぞれ、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、
    Ｘはハロゲンであり、
    ｎは、１～１０の範囲の整数である、化合物。
  2. 各Ｒ11及びＲ14がハロである、請求項１に記載の化合物。
  3. 前記ハロが、フルオロ又はクロロである、請求項２に記載の化合物。
  4. 前記ハロがクロロである、請求項２に記載の化合物。
  5. Ｒ13が、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、Ｃ（Ｏ）ＯＲa-、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、又は－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcである、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
  6. Ｒ11が、Ｃ（Ｏ）ＯＲa又は－Ｃ（Ｏ）ＯＨである、請求項５に記載の化合物。
  7. Ｒ11が、－Ｃ（Ｏ）ＯＨである、請求項５に記載の化合物。
  8. Ｒ5が保護基である、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. 前記保護基が－Ｃ（Ｏ）Ｒ15であり、式中、Ｒ15は、水素、低級アルキル、－ＣＸ3、－ＣＨＸ2、－ＣＨ2Ｘ、－ＣＨ2－ＯＲd 、及び低級アルキル、－Ｘ、－ＯＲd、シアノ又はニトロ基で任意に一置換されたフェニルからなる群から選択され、式中、Ｒdは、低級アルキル、フェニル及びピリジルからなる群から選択され、各Ｘはハロ基である、請求項８に記載の化合物。
  10. Ｒ13が、－ＣＸ3、－ＣＨＸ2、－ＣＨ2Ｘである、請求項９に記載の化合物。
  11. Ｒ13が、－ＣＸ3である、請求項１０に記載の化合物。
  12. 前記保護基の前記Ｘが、フルオロ又はクロロである、請求項８～１１のいずれか一項に記載の化合物。
  13. 前記保護基の前記Ｘが、フルオロである、請求項８～１２のいずれか一項に記載の化合物。
  14. Ｒ1及びＲ2が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成する、請求項１に記載の化合物。
  15. 前記ベンゾ環上の前記任意の置換が、－Ｘ、－Ｃ１－Ｃ６アルキル、－Ｃ２－Ｃ６アルケニル、－Ｃ２－Ｃ６アルキニル、－ＯＨ、－ＯＲa、－ＳＨ、－ＳＲa、－ＮＨ2、－ＮＨＲa、－ＮＲcＲc、－Ｎ+ＲcＲcＲc、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）2Ｒa、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲa、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcのうち少なくとも１つを含み、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、代わりに、同じ窒素原子に結合している２つのＲcが、その窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含んでもよい５－８員飽和又は不飽和の環を形成することができる、請求項１又は１４に記載の化合物。
  16. 前記ベンゾ環上の前記任意の置換が、Ｃ１－Ｃ６アルキルである、請求項１５に記載の化合物。
  17. Ｒ1がＨである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の化合物。
  18. Ｒ2がＨである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の化合物。
  19. Ｒ6がＨである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の化合物。
  20. Ｒ8がＨである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の化合物。
  21. Figure 2022514397000045
     が単結合である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の化合物。
  22. Ｒd及びＲeがＨである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の化合物。
  23. Ｒd及びＲeが低級アルキルである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の化合物。
  24. 前記ベンゾ環上の前記任意の置換が、少なくとも２つの－Ｃ１－Ｃ６アルキルを含む、請求項１又は１３に記載の化合物。１８．次式を有し、
    Figure 2022514397000046
     式中、
    Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基であり、
    Ｒ13は、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、及び（ＣＨ２）n－Ｒbからなる群から選択され、
    式中、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3、及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
    式中、Ｒbは、－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa－ＳＨ、－ＳＲa、－ＮＨ2、－ＮＨＲa、－ＮＲcＲc、－Ｎ+ＲcＲcＲc、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）2Ｒa、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＲa、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcから選択され、
    各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含み得る、５－８員の飽和又は不飽和の環を形成してもよい、請求項１に記載の化合物。
  25. 次式を有し、
    Figure 2022514397000047
     式中、
    Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基である、請求項１に記載の化合物。
  26. 次式を有する、請求項１に記載の化合物。
    Figure 2022514397000048
  27. 次式を有し、
    Figure 2022514397000049
     式中、
    Ｒ5は保護基である、請求項１に記載の化合物。
  28. 固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを次式の構造を有する試薬と反応させることによって製造される標識部分を含むオリゴヌクレオチドであって、
    ＬＭ－Ｌ－ＰＥＰ
    式中、ＰＥＰはリン酸エステル前駆体基であり、Ｌは前記標識部分をＰＥＰ基に結合させる任意のリンカーであり、ＬＭは式（Ｉ）のＮ－保護ＮＨ－ローダミン部分を含み、
    Figure 2022514397000050
     式中、
    Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、単独の場合、それぞれ互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ12、又はＲ13のうち１つは－Ｙ－の基を含み、式中Ｙは－Ｃ（Ｏ）－、Ｓ（Ｏ）2－、－Ｓ－及び－ＮＨ－からなる群から選択され、あるいは、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成し、
    Ｒ4は、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、又は６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
    Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基であり、
    ｎは、１～１０の範囲の整数であり、
    式中、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3、及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
    式中、Ｒbは、－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa－ＳＨ、－ＳＲa、－ＮＨ2、－ＮＨＲa、－ＮＲcＲc、－Ｎ+ＲcＲcＲcＸ-、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）2Ｒa、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcから選択され、
    各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含み得る、５－８員の飽和又は不飽和の環を形成してもよく、
    Ｒd及びＲeは、単独の場合、それぞれ、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、
    Ｘはハロゲンであり、
    ｎは、１～１０の範囲の整数である、オリゴヌクレオチド。
  29. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が次式を有し、
    Figure 2022514397000051
     式中、Ｒ13が、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）2－、Ｓ、及び－ＮＨ－からなる群から選択される、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
  30. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が次式を有し、
    Figure 2022514397000052
     式中、Ｒ3が、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）2－、－Ｓ－、及び－ＮＨ－からなる群から選択される、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
  31. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が次式を有し、
    Figure 2022514397000053
     式中、Ｒ3が、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）2－、－Ｓ－、及び－ＮＨ－からなる群から選択される、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
  32. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が次式を有し、
    Figure 2022514397000054
     式中、Ｒ8が、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）2－、－Ｓ－、及び－ＮＨ－からなる群から選択される、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
  33. Ｒ11及びＲ14がそれぞれハロである、請求項２８～３２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  34. 前記ハロが、フルオロ又はクロロである、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。
  35. 前記ハロが、クロロである、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。
  36. Ｒ13が、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、Ｃ（Ｏ）ＯＲa、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲC、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa 、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、又は－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcである、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド。
  37. Ｒ13が、－Ｃ（Ｏ）ＯＲa又は－Ｃ（Ｏ）ＯＨである、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
  38. Ｒ5が保護基である、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の化合物。
  39. 前記保護基が－Ｃ（Ｏ）Ｒ15であり、式中、Ｒ15は、水素、低級アルキル、－ＣＸ3、－ＣＨＸ2、－ＣＨ2Ｘ、－ＣＨ2ＯＲd、及び低級アルキル、－Ｘ、－ＯＲd、シアノ又はニトロ基で任意に一置換されるフェニルからなる群から選択され、式中、Ｒdは、低級アルキル、フェニル及びピリジルからなる群から選択され、各Ｘはハロ基である、請求項３８に記載の化合物。
  40. 存在する場合、Ｒ10が保護基である、請求項２８～３９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  41. 前記保護基が、－Ｃ（Ｏ）Ｒ15であり、式中、Ｒ15は、水素、低級アルキル、－ＣＸ3、－ＣＨＸ2、－ＣＨ2Ｘ、ＣＨ2－ＯＲd、及び低級アルキル、－Ｘ、－ＯＲd、シアノ又はニトロ基で任意に一置換されたフェニルからなる群から選択され、式中、Ｒdは、低級アルキル、フェニル及びピリジルからなる群から選択され、各Ｘはハロ基である、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド。
  42. Ｒ15が、－ＣＸ3、－ＣＨＸ2、－ＣＨ2Ｘである、請求項３９又は４１に記載のオリゴヌクレオチド。
  43. Ｒ15が、－ＣＸ3である、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド。
  44. 前記保護基中の前記Ｘが、存在する場合、フルオロ又はクロロである、請求項３９～４３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  45. 前記保護基中の前記Ｘが、存在する場合、フルオロである、請求項３９～４３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  46. Ｒ1及びＲ2が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成する、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
  47. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が次式を有する、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
    Figure 2022514397000055
  48. Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、及びＲ8がそれぞれ－Ｈである、請求項４７に記載のオリゴヌクレオチド。
  49. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が次式を有する、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
    Figure 2022514397000056
  50. Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、及びＲ8がそれぞれ－Ｈである、請求項４９に記載のオリゴヌクレオチド。
  51. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が次式を有する、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
    Figure 2022514397000057
  52. Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、及びＲ8がそれぞれ－Ｈである、請求項５１に記載のオリゴヌクレオチド。
  53. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が次式を有する、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
    Figure 2022514397000058
  54. Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、及びＲ8がそれぞれ－Ｈである、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
  55. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が次式を有する、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
    Figure 2022514397000059
  56. 前記標識部分が、前記オリゴヌクレオチドの３’－又は５’－ヒドロキシルに結合している、請求項２８～５５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  57. 前記標識部分が、前記オリゴヌクレオチドの核酸塩基に結合している、請求項２８～５６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  58. 前記オリゴヌクレオチドが、前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分に対するドナー及び／又はアクセプタ部分で更に標識されている、請求項２８～５７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  59. 前記オリゴヌクレオチドが、クエンチャ部分で更に標識されている、請求項２８～５７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  60. 前記オリゴヌクレオチドが、マイナーグルーブバインディング部分で更に標識されている、請求項２８～５７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  61. 前記標識部分が、前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分に対するドナー部分又はアクセプタ部分を更に含む、請求項２８～５７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  62. 前記標識部分が、前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分に対するドナー部分を更に含む、請求項６１に記載のオリゴヌクレオチド。
  63. 前記ドナー部分が、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分又はＯ－保護フルオレセイン部分を含む、請求項６２に記載のオリゴヌクレオチド。
  64. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、前記ドナー部分の２’－、２’’－、４’－、５’－、７’－、７’’－、５－又は６－位置に結合している、請求項６３に記載のオリゴヌクレオチド。
  65. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、頭部対頭部の方向で結合している、請求項６３に記載のオリゴヌクレオチド。
  66. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、頭部対尾部の方向で結合している、請求項６３に記載のオリゴヌクレオチド。
  67. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、尾部対尾部の方向で結合している、請求項６３に記載のオリゴヌクレオチド。
  68. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、側部対側部の方向で結合している、請求項６３に記載のオリゴヌクレオチド。
  69. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、側部対頭部の方向で結合している、請求項６３に記載のオリゴヌクレオチド。
  70. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、側部対尾部の方向で結合している、請求項６３に記載のオリゴヌクレオチド。
  71. 前記標識部分が、構造式（ＶＩ）を有し、
    Ａ－Ｚ1－Ｓｐ－Ｚ2－Ｄ （ＶＩ）
    式中、Ａは、前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分を表し、Ｄは前記ドナー部分を表し、Ｚ1及びＺ2は同じでも異なっていてもよく、官能基Ｆzを含む結合部分によって提供される結合の一部分を表し、Ｓｐはスペーシング部分を表す、請求項６３に記載のオリゴヌクレオチド。
  72. Ａが前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分であり、Ｄが構造式Ｄ．１、Ｄ．２、Ｄ．３、Ｄ．４、Ｄ．５、Ｄ．６、Ｄ．７、Ｄ．８、Ｄ．９、Ｄ．１０、Ｄ．１１、及びＤ．１２を有する部分からなる群から選択され、
    Figure 2022514397000060
    Figure 2022514397000061

    Figure 2022514397000062

    Figure 2022514397000063
    式中、Ｄ．１～Ｄ．１２のそれぞれにおいて、
    Ｒ1’、Ｒ2’、Ｒ2’’、Ｒ4’、Ｒ4’’、Ｒ5’、Ｒ5’’、Ｒ7’、Ｒ7’’、及びＲ8’は、それぞれ、単独の場合、独立に、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、Ｒb及び－（ＣＨ2）x－Ｒbからなる群から選択され、式中、ｘは１～１０の値を有する整数であり、Ｒbは－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa、－ＳＨ、－ＳＲa、－ＮＨ2、－ＮＨＲa、－ＮＲcＲc、－Ｎ+ＲcＲcＲc、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）2Ｒa、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcからなる群から選択され、式中、Ｘはハロであり、各Ｒaは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール及び６－２０員ヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、各Ｒcは独立してＲaであるか、あるいは同じ窒素原子に結合している２つのＲcが前記窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含んでもよい５－８員飽和又は不飽和の環を形成することができ、
    あるいは、Ｒ1’及びＲ2’又はＲ7’及びＲ8’は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換された（Ｃ６－Ｃ１４）アリールブリッジを形成し、並びに／あるいはＲ4’及びＲ4’’及び／又はＲ5’及びＲ5’’は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ベンゾ基を形成し、
    各Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、及びＲ7は、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、６－１４員ヘテロアリール、７－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb及び－（ＣＨ2）x－Ｒbから選択され、
    Ｅ1は、－ＮＨＲ9、－ＮＲ9Ｒ10及び－ＯＲ9bからなる群から選択され、
    Ｅ2は、－ＮＨＲ9、－ＮＲ9Ｒ10及び－ＯＲ9bからなる群から選択され、
    Ｒ9は、単独の場合、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、又はＲ7及びＲ9は、それらが結合している原子と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクロアルキル基、任意に置換されたヘテロシクロアルケニル基、又は任意に置換されたヘテロアリール基を形成し、
    Ｒ10は、Ｈ又は保護基であり、又はＲ8及びＲ10は、それらが結合している原子と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクロアルキル基、任意に置換されたヘテロシクロアルケニル基、又は任意に置換されたヘテロアリール基を形成し、
    Ｒ9bは、Ｒ9であり、
    各Ｙ1a、Ｙ1b、Ｙ2a、Ｙ2b、Ｙ3a及びＹ3bは、独立に、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ－）及び－Ｓ（Ｏ）2からなる群から選択され、
    但し、各Ｅ1及びＥ2が－ＯＲ9bである場合、Ｒ1’及びＲ2’及び／又はＲ7’及びＲ8’は、それらが結合している炭素原子とのみ一緒になって、任意に置換された（Ｃ６－Ｃ１４）アリールブリッジを形成してもよい、請求項７１に記載のオリゴヌクレオチド。
    ７０．前記試薬の前記Ｌが、－Ｚ－（ＣＨ2）3-6－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）a－［（Ａｒ）b－（ＣＨ2）a］c－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ2）a］c－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）b］c－（ＣＨ2）a－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）d－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－［（ＣＨ2）a－（Ａｒ）－（ＣＨ2）a－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ］c－（ＣＨ2）d－Ｏ－、及び－Ｚ－［ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ］f－ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ－から選択され、式中、
    各Ｚは、他とは独立して、官能基Ｆzによって寄与される結合の一部分を表し、
    各ａは、他とは独立して、０～４の範囲の整数を表し、
    各ｂは、他とは独立して、１～２の範囲の整数を表し、
    各ｃは、他とは独立して、１～５の範囲の整数を表し、
    各ｄは、他とは独立して、１～１０の範囲の整数を表し、
    各ｅは、他とは独立して、１～４の範囲の整数を表し、
    各ｆは、他とは独立して、１～１０の範囲の整数を表し、
    各Ａｒは、他とは独立して、任意に置換された単環式又は多環式のシクロアルキレン、シクロヘテロアルキネン、アリーレン又はヘテロアリーレン基を表す、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。
    ７１．Ｌの各Ａｒが、他とは独立して、シクロヘキサン、ピペラジン、ベンゼン、ナフタレン、フェノール、フラン、ピリジン、ピペリジン、イミダゾール、ピロリジン又はオキサジゾールから誘導される基である、請求項７０に記載のオリゴヌクレオチド。
    ７２．前記試薬が、アミノ、ヒドロキシル、チオール、及びアルデヒドからなる群から選択される反応基、並びにａ）前記オリゴヌクレオチド合成過程中に追加部分の付加に前記反応基をもたらすために除去されるように構成される保護基、又はｂ）前記オリゴヌクレオチド合成過程中は安定であり、前記オリゴヌクレオチド合成後に、追加部分の付加に前記反応基をもたらすために除去されるように構成される保護基を含む、好適に保護された合成ハンドルを更に含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。
  73. 前記試薬が、構造式（ＶＩＩＩ）の化合物であって、
    ＲkＯ－Ｌ－ＬＭ－Ｌ－ＰＥＰ （ＶＩＩＩ）
    式中、Ｒkは酸不安定性保護基を表し、各Ｌは、他とは独立して、任意のリンカーを表し、ＬＭは前記標識部分を表し、ＰＥＰは前記リン酸エステル前駆体基を表す、請求項７２に記載のオリゴヌクレオチド。
  74. 前記試薬が構造式（ＩＸ）の化合物であって、
    Figure 2022514397000064
     式中、Ｒkは酸不安定性保護基を表す、請求項７２に記載のオリゴヌクレオチド。
  75. 前記試薬が構造式（ＩＸ．１）の化合物であって、
    Figure 2022514397000065
     式中、－Ｚ－は官能基Ｆz、Ｓｐ1、Ｓｐ2及びＳｐ3によって寄与される結合の一部分を表し、これらは同じでも異なってもよく、それぞれがスペーシング部分を表し、ＧはＣＨ、Ｎ、あるいはアリーレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、低級シクロアルキレン、シクロヘキシレン、及び／又は低級シクロヘテロアルキレンを含む基を表す、請求項７４に記載のオリゴヌクレオチド。
  76. Ｓｐ1、Ｓｐ2及びＳｐ3が、それぞれ互いに独立して、１～１０個の炭素原子を含むアルキレン鎖、－（ＣＨ2）a－［（Ａｒ）b－（ＣＨ2）a］c－、－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ2）a］c－、－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）b］ c－（ＣＨ2）a－、－（ＣＨ2）d－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－［（ＣＨ2）a－（Ａｒ）－（ＣＨ2）a－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ］c－（ＣＨ2）d－、及び－［ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ］f－ＣＨ2（ＣＨ2）－から選択され、各ａは、他とは独立して、０～４の範囲の整数を表し、
    各ｂは、他とは独立して、１～２の範囲の整数を表し、
    各ｃは、他とは独立して、１～５の範囲の整数を表し、
    各ｄは、他とは独立して、１～１０の範囲の整数を表し、
    各ｅは、他とは独立して、１～４の範囲の整数を表し、
    各ｆは、他とは独立して、１～１０の範囲の整数を表し、Ａｒは、他とは独立して、任意に置換された単環式又は多環式のシクロアルキレン、シクロヘテロアルキレン、アリーレン又はヘテロアリーレン基を表す、請求項７５に記載のオリゴヌクレオチド。
  77. 前記試薬が構造式（ＩＸ．２）、（ＩＸ．３）、（ＩＸ．４）又は（ＩＸ．５）の化合物であって、
    Figure 2022514397000066
     式中、Ｂは好適に保護された核酸塩基を表し、Ｌ2は標識部分ＬＭを核酸塩基Ｂに連結させるリンカーを表し、構造（ＩＸ．４）において、Ｒ16は保護基を表し、
    前記核酸塩基は、アデニン、７－デアザグアニン、グアニン、７－デアザグアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンテン及びヒポキサンテンから選択される、請求項７２に記載のオリゴヌクレオチド。
  78. 前記試薬のＢが、ＡiBu、ＡPac、ＣAc、ＧiPr-Pac、Ｔ及びＵから選択される、請求項７７に記載のオリゴヌクレオチド。
  79. 前記試薬のＬ2が、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ＝ＣＨ－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ2）1-6－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ2）1-6－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ＝ＣＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－及び－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－から選択され、式中、Ａｒは、他とは独立して、任意に置換された単環式又は多環式のシクロアルキレン、シクロヘテロアルキネン、アリーレン又はヘテロアリーレン基を表す、請求項７７に記載のオリゴヌクレオチド。
  80. 前記ＰＥＰ基がホスホラミダイト基及びＨ－ホスホネート基を含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。
  81. 前記リン酸エステル前駆体基が式（Ｐ．１）のホスホラミダイトを含み、
    Figure 2022514397000067
     式中、
    Ｒ20は、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状、分岐状、又は環状の飽和又は不飽和のアルキル、２－シアノエチル、６～１０個の環炭素原子を含むアリール、及び６～１０個の環炭素原子及び１～１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルであり、
    各Ｒ21及びＲ22は、互いに独立して、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状、分岐状、又は環状の飽和又は不飽和のアルキル、６～１０個の環炭素原子を有するアリール、及び６～１０個の環炭素原子及び１～１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルであり、又は代替として、Ｒ21及びＲ22は、それらが結合している前記窒素原子と一緒になって、５～６個の環原子を含む飽和又は不飽和の環を形成し、そのうちの１つ又は２つは、例示された窒素原子に加えて、Ｏ、Ｎ及びＳから選択されるヘテロ原子とすることができる、請求項８０に記載のオリゴヌクレオチド。
  82. Ｒ20がβ－シアノエチルであり、Ｒ21及びＲ22が、それぞれイソプロピルである、請求項８０に記載のオリゴヌクレオチド。
  83. 前記合成ハンドルが式－ＯＲkを有し、式中、Ｒkが酸不安定性保護基である、請求項８２に記載のオリゴヌクレオチド。
  84. 前記酸不安定性保護基が、トリフェニルメチル（トリチル）、４－モノメトキシトリチル、４，４’－ジメトキシトリチル、４，４’，４’’－トリメトキシトリチル、ビス（ｐ－アニシル）フェニルメチル、ナフチルジフェニルメチル、ｐ－（ｐ’－ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル、９－アントリル、９－（９－フェニル）キサンテニル及び９－（９－フェニル－１０－オキソ）アントリルからなる群から選択される、請求項８３に記載のオリゴヌクレオチド。
  85. 次の構造式の化合物である、オリゴヌクレオチドを標識するのに有用な試薬であって、
    ＬＭ－Ｌ－ＰＥＰ （ＸＸ）
    式中、ＬＭはＮ－保護ＮＨ－ローダミン部分を含む標識部分を表し、ＰＥＰはホスホラミダイト基又はＨ－ホスホネート基を含むリン酸エステル前駆体基であり、Ｌは前記標識部分を前記リン酸エステル前駆体基に結合させる任意のリンカーであり、ここで次式の前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分は、
    Figure 2022514397000068
     式中、
    Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、及びＲ14は、単独の場合、それぞれ互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ12、又はＲ13のうち１つは－Ｙ－の基を含み、式中Ｙは－Ｃ（Ｏ）－、Ｓ（Ｏ）2－、－Ｓ－及び－ＮＨ－からなる群から選択され、あるいは、Ｒ1及びＲ2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換されるベンゾ基を形成し、
    Ｒ4は、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、又は６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
    Ｒ5及びＲ10は、それぞれ独立して、Ｈ又は保護基であり、
    ｎは、１～１０の範囲の整数であり、
    式中、各Ｒaは、他とは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、－ＣＸ3、及び６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、
    式中、Ｒbは、－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa、－ＳＨ、－ＳＲa、－ＮＨ2、－ＮＨＲa、－ＮＲcＲc、－Ｎ+ＲcＲcＲcＸ-、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）2Ｒa、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcから選択され、
    各Ｒcは、他とは独立して、Ｒaであるか、又は、同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含み得る、５－８員の飽和又は不飽和の環を形成してもよく、
    Ｒd及びＲeは、単独の場合、それぞれ、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb、又は－（ＣＨ２）n－Ｒbから選択され、
    Ｘはハロゲンであり、
    ｎは、１～１０の範囲の整数である、試薬。
  86. 前記試薬の前記Ｌが、－Ｚ－（ＣＨ2）3-6－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）a－［（Ａｒ）b－（ＣＨ2）a］c－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ2）a］c－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）b］c－（ＣＨ2）a－Ｏ－、－Ｚ－（ＣＨ2）d－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－［（ＣＨ2）a－（Ａｒ）－（ＣＨ2）a－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ］c－（ＣＨ2）d－Ｏ－、及び－Ｚ－［ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ］f－ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ－から選択され、式中、
    各Ｚは、他とは独立して、官能基Ｆzによって寄与される結合の一部分を表し、
    各ａは、他とは独立して、０～４の範囲の整数を表し、
    各ｂは、他とは独立して、１～２の範囲の整数を表し、
    各ｃは、他とは独立して、１～５の範囲の整数を表し、
    各ｄは、他とは独立して、１～１０の範囲の整数を表し、
    各ｅは、他とは独立して、１～４の範囲の整数を表し、
    各ｆは、他とは独立して、１～１０の範囲の整数を表し、
    各Ａｒは、他とは独立して、任意に置換された単環式又は多環式のシクロアルキレン、シクロヘテロアルキネン、アリーレン又はヘテロアリーレン基を表す、請求項８５に記載の試薬。
  87. Ｌの各Ａｒが、他とは独立して、シクロヘキサン、ピペラジン、ベンゼン、ナフタレン、フェノール、フラン、ピリジン、ピペリジン、イミダゾール、ピロリジン又はオキサジゾールから誘導される基である、請求項７０に記載のオリゴヌクレオチド。
  88. 構造式（ＶＩＩ．１）の化合物であって、
    Figure 2022514397000069
     式中、Ｂは好適に保護された核酸塩基を表し、Ｌ2は核酸塩基Ｂを標識部分ＬＭに結合させるリンカーを表す、請求項８５に記載の試薬。
  89. 前記核酸塩基が、アデニン、７－デアザグアニン、グアニン、７－デアザグアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンテン及びヒポキサンテンから選択される、請求項８８に記載の試薬。
  90. ＢがＡiBu、ＡPac、ＣAc、ＧiPr-Pac、Ｔ及びＵから選択される、請求項８９に記載の試薬。
  91. Ｌ2が、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ＝ＣＨ－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ2）1-6－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ2）1-6－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ≡ＣＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－及び－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－から選択され、Ａｒは請求項８６で定義した通りである、請求項８８に記載の試薬。
  92. －Ｂ－Ｌ2－が、以下のものからなる群から選択される、請求項８８に記載の試薬。
    Figure 2022514397000070
    Figure 2022514397000071

    Figure 2022514397000072
  93. 好適に保護された合成ハンドルを更に含む、請求項８６に記載の試薬。
  94. 次式（ＶＩＩＩ）を有し、
    ＲkＯ－Ｌ－ＬＭ－Ｌ－ＰＥＰ （ＶＩＩＩ）
    式中、Ｒkは酸不安定性保護基を表し、各Ｌは、他とは独立して、任意のリンカーを表し、ＬＭは前記標識部分を表し、ＰＥＰは前記リン酸エステル前駆体基を表す、請求項９３に記載の試薬。
  95. 前記試薬が構造式（ＩＸ）の化合物であって、
    Figure 2022514397000073
     式中、Ｒkは酸不安定性保護基を表す、請求項９３に記載の試薬。
  96. 前記試薬が構造式（ＩＸ．１）の化合物であって、
    Figure 2022514397000074
     式中、－Ｚ－は官能基Ｆz、Ｓｐ1、Ｓｐ2及びＳｐ3によって寄与される結合の一部分を表し、これらは同じでも異なってもよく、それぞれがスペーシング部分を表し、ＧはＣＨ、Ｎ、あるいはアリーレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、低級シクロアルキレン、シクロヘキシレン、及び／又は低級シクロヘテロアルキレンを含む基を表す、請求項９５に記載の試薬。
  97. Ｓｐ1、Ｓｐ2及びＳｐ3が、それぞれ互いに独立して、１～１０個の炭素原子を含むアルキレン鎖、－（ＣＨ2）a－［（Ａｒ）b－（ＣＨ2）a］c－、－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ2）a］c－、－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）b］c－（ＣＨ2）a－、－（ＣＨ2）d－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－［（ＣＨ2）a－（Ａｒ）－（ＣＨ2）a－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ］c－（ＣＨ2）d－、及び－［ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ］f－ＣＨ2（ＣＨ2）－から選択され、各ａは、他とは独立して、０～４の範囲の整数を表し、
    各ｂは、他とは独立して、１～２の範囲の整数を表し、
    各ｃは、他とは独立して、１～５の範囲の整数を表し、
    各ｄは、他とは独立して、１～１０の範囲の整数を表し、
    各ｅは、他とは独立して、１～４の範囲の整数を表し、
    各ｆは、他とは独立して、１～１０の範囲の整数を表し、Ａｒは、他とは独立して、任意に置換された単環式又は多環式のシクロアルキレン、シクロヘテロアルキレン、アリーレン又はヘテロアリーレン基を表す、請求項９６に記載の試薬。
  98. 前記試薬が、構造式（ＩＸ．２）、（ＩＸ．３）、（ＩＸ．４）又は（ＩＸ．５）の化合物であって、
    Figure 2022514397000075
     式中、Ｂは好適に保護された核酸塩基を表し、Ｌ2は標識部分ＬＭを核酸塩基Ｂに結合させるリンカーを表し、構造（ＩＸ．４）において、Ｒ16は保護基を表す、請求項９５に記載の試薬。
  99. 前記核酸塩基が、アデニン、７－デアザグアニン、グアニン、７－デアザグアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンテン及びヒポキサンテンから選択される、請求項９８に記載の試薬。
  100. 前記試薬のＢが、ＡiBu、ＡPac、ＣAc、ＧiPr-Pac、Ｔ及びＵから選択される、請求項９９に記載のオリゴヌクレオチド。
  101. 前記試薬のＬ2が、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ＝ＣＨ－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ2）1-6－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ2）1-6－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ＝ＣＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－及び－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－から選択され、式中、Ａｒは、他とは独立に、任意に置換された単環式又は多環式のシクロアルキレン、シクロヘテロアルキネン、アリーレン又はヘテロアリーレン基を表す、請求項９８に記載の試薬。
  102. －Ｂ－Ｌ2－が、以下のものからなる群から選択される、請求項９８に記載の試薬。
    Figure 2022514397000076
    Figure 2022514397000077

    Figure 2022514397000078
  103. 前記リン酸エステル前駆体基が、ホスホラミダイト基及びＨ－ホスホネート基を含む、請求項８６～１０２のいずれか一項に記載の試薬。
  104. 前記リン酸エステル前駆体基が式（Ｐ．１）のホスホラミダイトを含み、
    Figure 2022514397000079
     式中、
    Ｒ20は、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状、分岐状、又は環状の飽和又は不飽和のアルキル、２－シアノエチル、６～１０個の環炭素原子を含むアリール、及び６～１０個の環炭素原子及び１～１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルであり、
    各Ｒ21及びＲ22は、互いに独立して、１～１０個の炭素原子を含む直鎖上、分岐状、又は環状の飽和又は不飽和のアルキル、６～１０個の環炭素原子を含むアリール、並びに６～１０個の環炭素原子及び１～１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルであり、又は代替として、Ｒ21及びＲ22は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５～６個の環原子を含む飽和又は不飽和の環を形成し、そのうちの１つ又は２つは、例示された窒素原子に加えて、Ｏ、Ｎ及びＳから選択されるヘテロ原子とすることができる、請求項１０３に記載の試薬。
  105. Ｒ20がβ－シアノエチルであり、Ｒ21及びＲ22が、それぞれイソプロピルである、請求項１０４に記載の試薬。
  106. 固体支持体及び好適に保護された合成ハンドルを更に含む、請求項８５に記載の試薬。
  107. 構造式（Ｘ）の化合物であって、
    Figure 2022514397000080
     式中、ＬＭは標識部分を表し、Ｌは任意選択的に開裂可能なリンカーを表し、Ｒkは酸不安定性保護基を表す、請求項１０３に記載の試薬。
  108. 構造式（Ｘ．１）の化合物であって、
    Figure 2022514397000081
     式中、Ｚ、Ｇ、Ｓｐ1、Ｓｐ2及びＷは、請求項１４で先に定義された通りであり、Ｓｐ4は、選択的に開裂可能なスペーシング部分を表す、請求項１０７に記載の試薬。
  109. Ｓｐ1及びＳｐ2は、それぞれ互いに独立して、１～１０個の炭素原子を含むアルキレン鎖、－（ＣＨ2）a－［（Ａｒ）b－（ＣＨ2）a］c－、－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ2）a］c－、－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）b］c－（ＣＨ2）a－、－（ＣＨ2）d－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－［（ＣＨ2）a－（Ａｒ）－（ＣＨ2）a－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ］c－（ＣＨ2）d－及び［ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ］f－ＣＨ2（ＣＨ2）－から選択され、式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及びＡｒは請求項４で定義された通りであり、Ｓｐ4はエステル結合を含む、請求項１０３に記載の試薬。
  110. 構造式（Ｘ．２）、（Ｘ．３）、（Ｘ．４）又は（Ｘ．５）の化合物であって、
    Figure 2022514397000082
     式中、Ｂ、Ｌ2及びＲ16は、請求項１６で先に定義した通りである、請求項１０７に記載の試薬。
  111. 前記核酸塩基が、アデニン、７－デアザグアニン、グアニン、７－デアザグアニン、シトシン、ウラシル、チミン、イノシン、キサンテン及びヒポキサンテンから選択される、請求項１１０に記載の試薬。
  112. Ｂが、ＡiBu、ＡPac、ＣAc、ＧiPr-Pac、及びＵから選択される、請求項１１０に記載の試薬。
  113. Ｌ2が、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ＝ＣＨ－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ2）1-6－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ2）1-6－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ≡ＣＨ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－、－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－及び－Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）1-2－Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2－［Ｏ－ＣＨ2ＣＨ2］0-6－ＮＨ－から選択され、Ａｒは請求項４で定義した通りである、請求項１１０に記載の試薬。
  114. －Ｂ－Ｌ2－が以下のものから選択される、請求項１１０に記載の試薬。
    Figure 2022514397000083
    Figure 2022514397000084

    Figure 2022514397000085
  115. Ｒkが４’，４’’－ジメトキシトリチルである、請求項９４～１１４のいずれか一項に記載の試薬。
  116. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が以下の構造式から選択される構造を含み、
    Figure 2022514397000086
     式中、Ｒ5及びＲ10は、それぞれ互いに独立して、水素又は保護基から選択される、請求項８５～１１５のいずれか一項に記載の試薬。
  117. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が以下の構造式から選択される構造を含み、
    Figure 2022514397000087
     式中、Ｒ1～Ｒ14、及びＹは先に定義した通りである、請求項８５～１１５に記載の試薬。
  118. 前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、以下から選択される１つ又は複数の適用可能な特徴を有し、
    （ｉ）Ｙは、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）2－、－Ｓ－及び－ＮＨ－から選択される、
    （ｉｉ）Ｒ11及びＲ14はそれぞれクロロである、
    （ｉｉｉ）Ｒ1及びＲ6はそれぞれ水素である、
    （ｉｖ）Ｒ1及びＲ2が一緒になって、ベンゾ基を形成する、
    （ｖ）Ｒ2は、水素又は低級アルキルである、
    （ｖｉ）Ｒ5は保護基である、請求項１１６又は１１７に記載の試薬。
  119. Ｒ5が式－Ｃ（Ｏ）Ｒ15のアシル基であり、式中、Ｒ10は水素、低級アルキル、メチル、－ＣＸ3、－ＣＨＸ2、ＣＨ2Ｘ、ＣＨ2ＯＲd及び低級アルキル、メチル、－Ｘ、－ＯＲd、シアノ又はニトロ基で任意に一置換されたフェニルから選択され、式中、Ｒdは低級アルキル、フェニル及びピリジルから選択され、各Ｘはハロ基である、請求項８５～１１８に記載の試薬。
  120. Ｒ15がメチル及びトリフルオロメチルから選択される、請求項１１９に記載の試薬。
  121. 前記標識部分が、前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分に対するドナー及び／又はアクセプタ部分を更に含む、請求項８５～１２０のいずれか一項に記載の試薬。
    １２１．前記標識部分が、前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分に対するドナー部分を更に含む、請求項８５～１２０のいずれか一項に記載の試薬。
  122. 前記ドナー部分が、Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分又はＯ－保護フルオレセイン部分を含む、請求項１２１に記載の試薬。
  123. 前記ドナー部分の２’－、２’’－、４’－、５’－、７’－、７’’－、５－又は６－位置が、前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分のＲ3、Ｒ12、又はＲ13に結合している、請求項１２２に記載の試薬。
  124. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、頭部対頭部の方向で結合している、請求項１２３に記載の試薬。
  125. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、頭部対尾部の方向で結合している、請求項１２３に記載の試薬。
  126. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、尾部対尾部の方向で結合している、請求項１２３に記載の試薬。
  127. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、側部対側部の方向で結合している、請求項１２３に記載の試薬。
  128. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、側部対頭部の方向で結合している、請求項１２３に記載の試薬。
  129. 前記ドナー部分及び前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分が、側部対尾部の方向で結合している、請求項１２３に記載の試薬。
  130. 前記標識部分が構造式（ＶＩ）を含み、
    Ａ－Ｚ1－Ｓｐ－Ｚ2－Ｄ （ＶＩ）
    式中、Ａは、前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分を表し、Ｄは前記ドナー部分を表し、Ｚ1及びＺ2は同じでも異なっていてもよく、官能基Ｆzを含む結合部分によって提供される結合の一部分を表し、Ｓｐはスペーシング部分を表す、請求項１２３に記載の試薬。
  131. Ａが前記Ｎ－保護ＮＨ－ローダミン部分であり、Ｄが構造式Ｄ．１、Ｄ．２、Ｄ．３、Ｄ．４、Ｄ．５、Ｄ．６、Ｄ．７、Ｄ．８、Ｄ．９、Ｄ．１０、Ｄ．１１及びＤ．１２から選択され、
    Figure 2022514397000088
    Figure 2022514397000089

    Figure 2022514397000090

    Figure 2022514397000091
    式中、Ｄ．１～Ｄ．１２のそれぞれにおいて、
    Ｒ1’、Ｒ2’、Ｒ2’’、Ｒ4’、Ｒ4’’、Ｒ5’、Ｒ5’’、Ｒ7’、Ｒ7’’、及びＲ8’は、それぞれ、単独の場合、独立に、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキル、Ｒb及び－（ＣＨ2）x－Ｒbからなる群から選択され、式中、ｘは１～１０の値を有する整数であり、Ｒbは－Ｘ、－ＯＨ、－ＯＲa、－ＳＨ、－ＳＲa、－ＮＨ2、－ＮＨＲa、－ＮＲcＲc、－Ｎ+ＲcＲcＲc、パーハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）2、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲa）、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）2、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＨ）、－Ｓ（Ｏ）2ＯＨ、－Ｓ（Ｏ）2Ｒa、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｒa、－Ｃ（Ｓ）Ｘ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（Ｓ）ＮＨ2、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲa、－Ｃ（Ｏ）ＮＲcＲc、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、－Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲa、及び－Ｃ（ＮＨ）ＮＲcＲcからなる群から選択され、式中、Ｘはハロであり、各Ｒaは独立して、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール及び６－２０員ヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、各Ｒcは独立してＲaであるか、あるいは同じ窒素原子に結合している２つのＲcがその窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される同じ又は異なる環ヘテロ原子のうち１つ又は複数を任意に含んでもよい５－８員飽和又は不飽和の環を形成することができ、
    あるいは、Ｒ1’及びＲ2’又はＲ7’及びＲ8’は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、任意に置換された（Ｃ６－Ｃ１４）アリールブリッジを形成し、並びに／あるいはＲ4’及びＲ4’’及び／又はＲ5’及びＲ5’’は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ベンゾ基を形成し、
    各Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、及びＲ7は、互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、６－１４員ヘテロアリール、７～２０員ヘテロアリールアルキル、－Ｒb及び－（ＣＨ2）x－Ｒbから選択され、
    Ｅ1は、－ＮＨＲ9、－ＮＲ9Ｒ10及び－ＯＲ9bからなる群から選択され、
    Ｅ2は、－ＮＨＲ9、－ＮＲ9Ｒ10及び－ＯＲ9bからなる群から選択され、
    Ｒ9は、単独の場合、水素、低級アルキル、（Ｃ６－Ｃ１４）アリール、（Ｃ７－Ｃ２０）アリールアルキル、５－１４員ヘテロアリール、６－２０員ヘテロアリールアルキルから選択され、又はＲ7及びＲ9は、それらが結合している原子と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクロアルキル基、任意に置換されたヘテロシクロアルケニル基、又は任意に置換されたヘテロアリール基を形成し、
    Ｒ10は、Ｈ又は保護基であり、又はＲ8及びＲ10は、それらが結合している原子と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクロアルキル基、任意に置換されたヘテロシクロアルケニル基、又は任意に置換されたヘテロアリール基を形成し、
    Ｒ9bは、Ｒ9であり、
    各Ｙ1a、Ｙ1b、Ｙ2a、Ｙ2b、Ｙ3a及びＹ3bは、独立に、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－及び－Ｓ（Ｏ）2からなる群から選択され、
    但し、Ｅ1及びＥ2がそれぞれ－ＯＲ9bである場合、Ｒ1’及びＲ2’及び／又はＲ7’及びＲ8’は、それらが結合している炭素原子とのみ一緒になって、任意に置換された（Ｃ６－Ｃ１４）アリールブリッジを形成してもよい、請求項１３０に記載の試薬。
  132. Ｄ．１～Ｄ．１２が、以下のものから選択される１つ又は複数の適用可能な特徴を有する、請求項１３１に記載の試薬。
    （ｉ）Ｙ1a、Ｙ2a及びＹ3aは、それぞれ互いに独立して、－Ｃ（Ｏ）－及びＳ（Ｏ）2－から選択される。
    Ｙ1b、Ｙ2b及びＹ3bは－ＮＨ－である。
    （ｉｉｉ）Ｒ4及びＲ7はそれぞれクロロである。
    （ｉｖ）Ｒ1’及びＲ8はそれぞれ水素である。
    （ｖ）Ｒ1’及びＲ2’又はＲ7’及びＲ8’は一緒になって、ベンゾ基を形成する。
    （ｖｉ）Ｒ2’及びＲ7’は、それぞれ水素又は低級アルキルである。
  133. Ｙ1a、Ｙ2a及びＹ3aが－ＮＨ－であり、Ｙ1b、Ｙ2b及びＹ3bが、－Ｃ（Ｏ）－及び－Ｓ（Ｏ）2－から選択され、Ｚ1は、－Ｃ（Ｏ）－及び－Ｓ（Ｏ）2－から選択され、Ｚ2は、－ＮＨ－であり、Ｓｐは－（ＣＨ2）a－［（Ａｒ）b－（ＣＨ2）a］c－、－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（ＣＨ2）a］c－、－（ＣＨ2）a－［Ｃ≡Ｃ－（Ａｒ）b］c－（ＣＨ2）a－、－（ＣＨ2）d－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－［（ＣＨ2）a－（Ａｒ）－（ＣＨ2）a－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ］c－（ＣＨ2）d－、及び－［ＣＨ2（ＣＨ2）eＯ］f－ＣＨ2（ＣＨ2）－から選択され、式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、及びＡｒは、請求項４で前に定義された通りである、請求項１３１に記載の試薬。
  134. 構造式Ｄ．１～Ｄ．１２において、Ｒ1’及びＲ2’及び／又はＲ7’及びＲ8’が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ベンゾブリッジを形成している、請求項１３１～１３３に記載の試薬。
  135. Ｅ1及びＥ2がそれぞれ－ＯＲ9bである、請求項１３１～１３４に記載の試薬。
  136. Ｒ9bが式－Ｃ（Ｏ）Ｒ15のアシル基であり、Ｒ15が低級アルキルである、請求項１３５に記載の試薬。
  137. Ｒ15がｔ－ブチルである、請求項１３６に記載の試薬。
  138. Ｒ9が式－Ｃ（Ｏ）Ｒ15のアシル基であり、式中、Ｒ15は水素、低級アルキル、メチル、－ＣＸ3、－ＣＨＸ2、ＣＨ2Ｘ、ＣＨ2ＯＲd及び低級アルキル、メチル、－Ｘ、－ＯＲd、シアノ又はニトロ基で任意に一置換されたフェニルから選択され、式中、Ｒdは低級アルキル、フェニル及びピリジルから選択され、各Ｘはハロ基である、請求項１３１～１３７に記載の試薬。
  139. Ｒ15がメチル及びトリフルオロメチルから選択される、請求項１３８に記載の試薬。
  140. 複数の遺伝子座を同時に増幅及び分析する方法であって、
    複数の増幅プライマ対を用いて核酸試料を増幅して、複数の増幅産物を形成することであって、前記プライマ対のそれぞれの少なくとも１つが、請求項２８に記載の標識ヌクレオチドを含み、前記増幅産物のそれぞれが異なる遺伝子座を含む、形成することを含む、複数の遺伝子座を同時に増幅及び分析する方法。
  141. 請求項２８に記載の前記標識ヌクレオチドが、少なくとも３つのプライマ対を標識するために使用される、請求項１４０に記載の方法。
  142. 請求項２８に記載の標識ヌクレオチドが、３～８つのプライマ対を標識するために使用される、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記核酸試料が、全血、組織生検、リンパ、骨、骨髄、歯、皮膚、例えば指紋に含まれる皮膚細胞、骨、歯、胎盤細胞を含む羊液、及び胎児細胞を含む羊液、毛髪、皮膚、精液、肛門分泌物、糞便、尿、膣分泌物、汗、唾液、頬側スワブ、様々な環境試料（例えば、農業、水、及び土壌）、一般研究試料、一般精製試料、及び溶解した細胞から単離される、請求項１４０に記載の方法。
  144. 分析される、少なくとも１つの核酸試料の遺伝子座のセットを共増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマを含むキットであって、前記遺伝子座のセットは、共増幅することができ、前記プライマの少なくとも１つは、請求項２８に記載の標識ヌクレオチドを含み、前記プライマは、１つ又は複数の容器内にある、キット。
  145. 前記キット中の前記オリゴヌクレオチドプライマの全てが１つの容器に入っている、請求項１４４に記載のキット。
  146. 少なくとも１つのマルチプレックス増幅反応のための
    試薬、及び少なくとも１つのサイズ基準を持つ
    容器の少なくとも１つを更に含む、請求項１４４に記載のキット。
  147. 前記オリゴヌクレオチドプライマの少なくとも１つが標識ヌクレオチドを含み、前記標識ヌクレオチドが請求項２８に記載の標識ヌクレオチドとは異なるスペクトル特性を有する、請求項１４４に記載のキット。
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