DE60007982T2 - Erweiterte rhodaminverbindungen verwendbar als fluoreszierende markierungsmittel - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft allgemein fluoreszierende Farbstoffverbindungen. Insbesondere betrifft die Erfindung erweiterte Rhodaminfarbstoffe, die als fluoreszierende Markierungsreagenzien verwendbar sind.
  • HINTERGRUND
  • Der nicht-radioaktive Nachweis von biologischen Analyten unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern ist eine wichtige Technologie in der modernen Molekularbiologie. Durch eine Beseitigung des Bedarfs für radioaktive Markierungen wird die Sicherheit erhöht und die Umweltbelastung und Kosten, die mit einer Entsorgung der Reagenzien verbunden sind, werden stark vermindert. Beispiele für Verfahren, bei denen ein derartiger nicht-radioaktiver Fluoreszenznachweis eingesetzt wird, umfassen die automatische DNA-Sequenzierung, Oligonukleotid-Hybridisierungsverfahren, Nachweis von Polymerase-Kettenreaktionsprodukten, Immunoassays und dergleichen.
  • In vielen Anwendungen ist es von Vorteil, mehrere spektral unterscheidbare Fluoreszenzmarker einzusetzen, um einen unabhängigen Nachweis einer Vielzahl von räumlich überlappenden Analyten, d. h. einen Multiplex-Fluoreszenznachweis, zu erreichen. Beispiele für Verfahren, bei denen ein Multiplex-Fluoreszenznachweis eingesetzt wird, umfassen Multiplex-DNA-Sonden-Tests in einem einzigen Röhrchen und automatische DNA-Sequenzierung mit mehreren Farben. Im Fall der Multiplex-DNA-Sonden-Tests kann durch Einsatz eines Multiplex-Fluoreszenznachweises die Anzahl an Reaktionsröhrchen gesenkt werden, wodurch die experimentellen Protokolle vereinfacht werden und die Herstellung von anwendungsspezifischen Reaktionskits erleichtert wird. Im Fall von automatischer DNA-Sequenzierung mit mehreren Farben ermöglicht ein Multiplex-Fluoreszenznachweis die Analyse von mehreren Nukleotidbasen in einer einzigen Elektrophoresespur, wodurch der Durchsatz gegenüber Verfahren mit einer einzigen Farbe erhöht wird und Unsicherheiten, die mit Veränderungen der elektrophoretischen Mobilität zwischen den Spuren verbunden sind, gesenkt werden.
  • Ein Zusammenbau eines Satzes an mehreren spektral unterscheidbaren Fluoreszenzmarkern, die für einen Multiplex-Fluoreszenznachweis geeignet sind, ist problematisch. Ein Multiplex-Fluoreszenznachweis behaftet die Auswahl von Komponenten-Fluoreszenzmarkern mit mindestens sechs ernsthaften Beschränkungen, insbesondere im Fall von Anwendungen, bei denen eine einzige Anregungsstrahlungsquelle, eine elektrophoretische Auftrennung und/oder eine Behandlung mit Enzymen erforderlich ist, z. B. bei der automatischen DNA-Sequenzierung. Zum einen ist es schwierig, einen Satz an strukturell ähnlichen Farbstoffen zu finden, deren Emissionsspektren spektral aufgelöst werden, da die typische Emissionsbanden-Halbwertsbreite für organische Fluoreszenzfarbstoffe etwa 40–80 Nanometer (nm) beträgt. Zweitens, selbst wenn Farbstoffe mit nicht-überlappenden Emissionsspektren identifiziert werden, kann der Satz immer noch ungeeignet sein, wenn die jeweiligen Fluoreszenz-Quantenausbeuten zu gering sind. Drittens, wenn mehrere Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig verwendet werden, wird eine gleichzeitige Anregung schwierig, da die Absorptionsbanden der Farbstoffe gewöhnlich weit voneinander getrennt sind. Viertens dürfen die Ladung, Molekülgröße und Konformation der Farbstoffe nicht die elektrophoretischen Mobilitäten des Analyten nachteilig beeinflussen. Fünftens müssen die Fluoreszenzfarbstoffe mit der Chemie kompatibel sein, die für die Herstellung oder Manipulation des Analyten eingesetzt wird, wie DNA-Synthese-Lösungsmittel und -Reagenzien, Puffer, Polymeraseenzyme, Ligaseenzyme und dergleichen. Sechstens muss der Farbstoff eine ausreichende Fotostabilität aufweisen, um einer Laseranregung Widerstand zu leisten.
  • Gegenwärtig machen verfügbare Multiplex-Farbstoff-Sätze, die für eine Verwendung bei automatischen DNA-Sequenzierungsanwendungen mit vier Farben geeignet sind, blaues oder blau-grünes Laserlicht erforderlich, um ausreichend Fluoreszenzemissionen aller Farbstoffe auszulösen, die in dem Satz enthalten sind, z. B. Argon-Ionenlaser. Die Verwendung solcher Laser in käuflich verfügbaren automatisierten DNA-Sequenzierungssystemen ist aufgrund ihrer hohen Kosten und begrenzten Lebensdauer nachteilig.
  • M. Kamel et al., "Zur Kenntnis der Dibenzoxantyliumsalze", Helv. Chim. Acta 43, 1960, 594–600, beschreiben manche Mitglieder von erweiterten Rhodaminfarbstoffen. Es wird nicht erwähnt, dass diese Verbindungen für eine automatische DNA-Sequenzierung mit vier Farben geeignet sein könnten.
  • Die US-PS 5,847,162 beschreibt eine Klasse von 4,7-Dichlorrhodaminverbindungen, die als Polynukleotid-Markierungsreagenzien geeignet sind. 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffe werden vorzugsweise mit Strahlung einer Wellenlänge von 488–550 nm unter Verwendung eines Argon-Ionenlasers angeregt.
  • Die US-PS 543 333 beschreibt manche pentacyclische Verbindungen, die besonders für eine Verwendung als Absorptions- oder Fluoreszenzfarbstoffe für Hapten/- und Antikörper/Protein-Konjugate geeignet sind. Manche der in der US-PS 543 333 beschriebenen Verbindungen könnten als Rhodamin-Derivate betrachtet werden, wobei Stickstoffatome Mitglieder zusätzlicher Ringstrukturen sind.
  • Somit besteht ein Bedarf für Fluoreszenzfarbstoffverbindungen, die die vorstehend beschriebenen Beschränkungen nicht aufweisen und mit Laserlicht einer Wellenlänge von über etwa 630 nm anregbar sind.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Die Erfindung betrifft das Auffinden einer Klasse von erweiterten Rhodaminfarbstoffverbindungen, die für die Bereitstellung von Sätzen an spektral auflösbaren Fluoreszenzmarkern geeignet sind, die für einen Multiplex-Fluoreszenznachweis verwendbar sind. Die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen sind besonders gut für eine Verwendung in automatischen DNA-Sequenzierungssystemen auf Fluoreszenzbasis unter Verwendung einer Anregungsstrahlenquelle mit einer Wellenlänge von mehr als etwa 630 nm, wie einem Helium-Neongas-Laser oder einem Festkörper-Diodenlaser, geeignet.
  • In einem ersten Aspekt umfasst die Erfindung eine erweiterte Rhodaminverbindung mit der Struktur
    Figure 00040001
    worin die Zusammensetzung der Reste R1 bis R11, R13 und Y1 bis Y4 wie folgt ist. Für sich genommen sind R1 bis R7, R9 bis R11 und R13 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR. Jede R-Gruppe kann hier und in diesem gesamten Abschnitt "Zusammenfassung" unabhängig -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl oder Verbindungsgruppe sein und jede Z1-Gruppe kann unabhängig eine Gruppe sein, ausgewählt aus -R, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O oder -OR.
  • R8 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhän gig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Für sich genommen sind die Stickstoffsubstituenten Y1 bis Y4 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Alternativ können die Substituenten R1 bis R7, R9 bis R11, R13, Y1 bis Y4 in verschiedenen ausgewählten Kombinationen zusammengenommen werden im Gegensatz dazu, dass sie für sich genommen werden. Insbesondere kann R1 mit R2, Y1 oder Y2 zusammengenommen werden, R2 kann mit R1 zusammengenommen werden, R3 kann mit R4 zusammengenommen werden, R4 kann mit R3, Y3 oder Y4 zusammengenommen werden, R5 kann mit R6, Y3 oder Y4 zusammengenommen werden, R6 kann mit R5, R7, Y3 oder Y4 zusammengenommen werden, R7 kann mit R6 zusammengenommen werden, R9 kann mit R10 zusammengenommen werden, R10 kann mit R9 oder R11 zusammengenommen werden, R11 kann mit R10, Y1 oder Y2 zusammengenommen werden, R13 kann mit Y1 oder Y2 zusammengenommen werden, Y1 kann mit R1, R11 oder Y2 zusammengenommen werden, Y2 kann mit R1, R11 oder Y1 zusammengenommen werden, Y3 kann mit R4, R5, R6, R13 oder Y4 zusammengenommen werden oder Y4 kann mit R4, R5, R6, R13 oder Y3 zusammengenommen werden.
  • In einem zweiten Aspekt umfasst die Erfindung Zwischenverbindungen, die für die Synthese der erweiterten Rhodaminverbindungen des ersten Aspekts geeignet sind, wie Zwischenverbindungen mit der Struktur
    Figure 00060001
    worin die Zusammensetzung der Reste R1, R2, R9 bis R12, Y1 und Y2 wie folgt ist. Für sich genommen sind R1, R2, R9, R10 und R11 jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR.
  • R12 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H und -C(O)R8, worin R8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Für sich genommen sind die Stickstoffsubstituenten Y1 und Y2 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Alternativ können die Gruppen R1, R2, R9, R10, R11, Y1 und Y2 in verschiedenen ausgewählten Kombinationen zusammengenommen werden, im Gegensatz dazu, dass sie für sich genommen werden. Insbesondere kann R1 mit R2, Y1 oder Y2 zusammengenommen werden, R2 kann mit R1 zusammengenommen werden, R9 kann mit R10 zusammengenommen werden, R10 kann mit R9 oder R11 zusammengenommen werden, R11 kann mit R10, Y1 oder Y2 zusammengenommen werden, Y1 kann mit R1, R11 oder Y2 zusammengenommen werden, Y2 kann mit R1, R11 oder Y1 zusammengenommen werden.
  • In einem dritten Aspekt umfasst die Erfindung Nukleotidverbindungen, die mit den erfindungsgemäßen erweiterten Rhodaminfarbstoffen markiert sind, wobei solche Nukleotide die Struktur NUC-L-D aufweisen, worin NUC ein Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon ist, L eine Verbindung ist und D eine erweiterte Rhodaminfarbstoffverbindung des ersten Aspekts ist. Wenn NUC eine Purinbase umfasst, ist die Verbindung an die 8-Position des Purins gebunden, wenn NUC eine 7-Deazapurinbase umfasst, ist die Verbindung an die 7-Position des 7-Deazapurins gebunden und, wenn NUC eine Pyrimidinbase umfasst, ist die Verbindung an die 5-Position des Pyrimidins gebunden.
  • In einem vierten Aspekt umfasst die Erfindung ein Fragment-Analyseverfahren, das die Schritte eines Ausbildens eines oder mehrerer markierter Polynukleotidfragmente, wobei die Fragmente mit einer erweiterten Rhodaminverbindung des ersten Aspekts markiert sind, ein Auflösen des einen oder der mehreren markierten Polynukleotidfragmente und einen Nachweis der aufgelösten markierten Polynukleotidfragmente umfasst.
  • Verschiedene Aspekte und/oder Ausführungsformen der vorstehend beschriebenen Erfindung können einen oder mehrere der nachstehenden wichtigen Vorteile gegenüber bekannten Fluoreszenzfarbstoffverbindungen, die für einen Multiplex-Fluoreszenznachweis geeignet sind, erreichen: (1) Die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen können wirksam mit einem kostengünstigen Rotlichtlaser unter Verwendung von Wellenlängen bei oder über 630 nm angeregt werden, (2) die Emissionsspektren der erfindungsgemäßen Farbstoffverbindun gen können durch kleinere Veränderungen in der Art und Position von Stickstoff- und/oder Arylsubstituenten moduliert werden, was eine Herstellung von Farbstoffsätzen ermöglicht, die ähnliche Absorptionseigenschaften, jedoch spektral auflösbare Fluoreszenzemissionsspektren aufweisen, (3) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen können einfach an Nukleoside/tide oder Polynukleotide gebunden werden, ohne dass ihre günstigen Fluoreszenzeigenschaften beeinträchtigt werden, (4) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen haben enge Emissions-Bandbreiten, d. h. die Emissions-Bandbreite weist eine voll Breite bei halbmaximaler Emissionsintensität von weniger als etwa 70 nm auf, (5) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen sind in gepufferter wässriger Lösung hochgradig löslich, während sie eine gute Quantenausbeute beibehalten, (6) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen sind verhältnismäßig fotostabil und (7) die erfindungsgemäßen Farbstoffverbindungen weisen relativ große Extinktionskoeffizienten auf, d. h. größer als etwa 50 000.
  • Diese und andere erfindungsgemäße Merkmale und Vorteile werden unter Verweis auf die nachstehende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Ansprüche besser verständlich.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEM
  • Es wird nun detailliert auf erfindungsgemäße bevorzugte Ausführungsformen Bezug genommen, wobei Beispiele davon in den beigefügten Zeichnungen gezeigt sind. Obwohl die Erfindung in Verbindung mit den bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wird, sind diese nicht beschränkend für die Erfindung zu verstehen. Im Gegensatz dazu soll die Erfindung Alternativen, Modifikationen und Äquivalente abdecken, die innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen, wie er durch die beigefügten Ansprüche definiert ist.
  • Im Allgemeinen umfasst die Erfindung eine neue Klasse an erweiterten Rhodaminfarbstoffverbindungen, die als Fluoreszenzmarker geeignet sind, Verfahren und Zwischenverbindungen für eine Synthese solcher Farbstoffe, Reagenzien, die solche Farbstoffe verwenden, und Verfahren, bei denen solche Farbstoffe und Reagenzien in dem Bereich der analytischen Biotechnologie eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen finden insbesondere Einsatz in dem Gebiet der Fluoreszenz-Nukleinsäureanalyse wie in der automatischen DNA-Sequenzierung und Fragmentanalyse, dem Nachweis von Sonden-Hybridisierung in Hybridisierungsanordnungen, dem Nachweis von Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten und dergleichen.
  • I. DEFINITIONEN
  • Wenn nicht anders angegeben, haben die nachstehenden Begriffe und Ausdrücke hier die folgenden Bedeutungen:
  • "Alkyl" betrifft einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten, geradkettigen oder cyclischen monovalenten Kohlenwasserstoffrest, der durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Kohlenstoffatom eines Stamm-Alkans, -Alkens oder -Alkins abgeleitet ist. Typische Alkylgruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Methylgruppe (-CH3), Ethylgruppen wie Ethanylgruppe (-CH2-CH3), Ethenylgruppe (-CH=CH2), Ethinylgruppe (-C≡CH), Propylgruppen wie Propan-1-yl-gruppe (-CH2-CH2-CH3), Propan-2-yl-gruppe, Cyclopropan-1-yl-gruppe, Prop-1-en-1-yl-gruppe (-CH=CH-CH3), Prop-1-en-2-yl-gruppe, Prop-2-en-1-yl-gruppe (-CH2-CH=CH2), Prop-2-en-2-yl-gruppe, Cycloprop-1-en-1-yl-gruppe, Cycloprop-2-en-1-yl-gruppe, Prop-1-in-1-yl-gruppe (-C≡C-CH3), Prop-2-in-1-yl-gruppe (-CH2-C≡CH), usw., Butylgruppen wie Butan-1-yl-gruppe (-CH2-CH2-CH2-CH3), Butan-2-yl-gruppe, Cyclobutan-1-yl-gruppe, But-1-en-1-yl-gruppe (-CH=CH-CH2-CH3), But-1-en-2-yl-gruppe, But-2-en-1-yl-gruppe (-CH2-CH=CH-CH3), But-2-en-2-yl-gruppe, Buta-1,3-dien-1-yl-gruppe (-CH=CH-CH=CH2), Buta-1,3-dien-2-yl-gruppe, Cyclobut-1-en-1-yl-gruppe, Cyclobut-1-en-3-yl-gruppe, Cyclobuta-1,3-dien-1-yl-gruppe, But-1-in-1-yl-gruppe (-C≡C-CH2-CH3), But-1-in-3-yl-gruppe, But-3-in-1-yl-gruppe (-CH2-CH2-C≡CH), usw. und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Alkylgruppen (C1-C6)-Alkylgruppen, wobei (C1-C3)-Gruppen besonders bevorzugt sind.
  • "Alkyleno" betrifft einen gesättigten oder ungesättigten, geradkettigen oder verzweigten acyclischen Kohlenwasserstoff-Brückenrest, der sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von jedem der zwei terminalen Kohlenstoffatome eines acyclischen Stamm-Alkans, -Alkens oder -Alkins ableitet. Typische Alkylenogruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Methanogruppe (-CH2-), Ethylenogruppen wie Ethanogruppe (-CH2-CH2-), Ethenogruppe (-CH=CH-), Ethinogruppe (-C≡C-), Propylenogruppen wie Propanogruppe (-CH2-CH2-CH2-), Prop[1]enogruppe (-CH=CH-CH2-), Prop[2]enogruppe (-CH2-CH=CH-), Prop[1]inogruppe (-C≡C-CH2-), Prop[1]inogruppe (-CH2-C≡C-), usw., Butyleno gruppen wie Butanogruppe (-CH2-CH2-CH2-CH2-), But[1]enogruppe (-CH=CH-CH2-CH2-), But[2]enogruppe (-CH2-CH=CH-CH2-); Buta[1,3]dienogruppe (-CH=CH-CH=CH-), But[1]inogruppe (-C≡C-CH2-CH2-), But[2]inogruppe (-CH2-C≡C-CH2-), But[1,3]diinogruppe (-C≡C-C≡C-), usw. und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkylenogruppe eine (C2-C6)-Alkylenogruppe, wobei (C2-C3)-Gruppen besonders bevorzugt sind. Auch bevorzugt sind geradkettige gesättigte Alkanoreste wie Ethano-, Propano-, Butanoreste und dergleichen.
  • "Substituiertes Alkyl" und "substituiertes Alkyleno" betreffen Alkyl- bzw. Alkylenoreste, in denen ein oder mehrere Wasserstoffatome jeweils unabhängig voneinander durch einen anderen Substituenten ersetzt sind. Typische Substituenten umfassen in nicht-begrenzender Weise -X, -R, -O–, -OR, -SR, -S–, -NRR, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)2O–, -S(O)2OH, -S(O)2R, -P(O)(O–)2, -P(O)(OH)2, -C(O)R, -C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O–, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR und -C(NR)NRR, worin jedes X unabhängig ein Halogenatom ist und jede R-Gruppe unabhängig -H, Alkyl, Aryl, Arylalkyl, Heteroaryl oder Heteroarylalkyl ist. Besonders bevorzugte Substituenten sind Halogenatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • "Heteroalkyl" und "Heteroalkyleno" betreffen Alkyl- und Alkylenoreste, in denen ein oder mehrere Kohlenstoffatome unabhängig voneinander mit dem gleichen oder verschiedenen Heteroatomen ersetzt sind. Typische Heteroatome für eine Ersetzung des Kohlenstoffatoms oder der Kohlenstoffatome umfassen in nicht-begrenzender Weise N, P, O, S, Si, usw.
  • "Substituiertes Heteroalkyl" und "substituiertes Heteroalkyleno" betreffen Heteroalkyl- und Heteroalkylenoreste, in denen ein oder mehrere Wasserstoffatome jeweils unabhängig voneinander durch einen anderen Substituenten ersetzt sind. Typische Substituenten umfassen in nicht-begrenzender Weise -X, -R, -O–, -OR, -SR, -S–, -NRR, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)2O–, -S(O)2OH, -S(O)2R, -P(O)(O–)2, -P(O)(OH)2, -C(O)R, -C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O–, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR und -C(NR)NRR, worin jedes X unabhängig ein Halogenatom ist und jede R-Gruppe unabhängig -H, Alkyl, Aryl, Arylalkyl, Heteroaryl oder Heteroarylalkyl ist. Besonders bevorzugte Substituenten sind Halogenatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • "Aryl" betrifft einen ungesättigten cyclischen oder polycyclischen monovalenten Kohlenwasserstoffrest mit einem konjugierten n-Elektronensystem, der sich durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzelnen Kohlenstoffatom eines aromatischen Stamm-Ringsystems ableitet. Spezifisch umfasst von "aromatischen Ringsystemen" sind kondensierte Ringsysteme, in denen ein oder mehrere Ringe aromatisch sind und ein oder mehrere Ringe gesättigt oder ungesättigt sind, wie beispielsweise Indan, Inden, Phenalen, usw. Ebenfalls umfasst von "aromatischen Ringsystemen" sind nicht-kondensierte Ringsysteme, in denen zwei oder mehrere identische oder nicht-identische cyclische oder polycyclische aromatische Ringsysteme direkt miteinander durch eine Einfachbindung verbunden sind, wobei die Anzahl an solchen direkten Ringverbindungen um eins weniger ist als die Anzahl an beteiligten aromatischen Ringsystemen. Typische Arylgruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Reste, die von Aceanthrylen, Acenaphthylen, Acephenanthrylen, Anthracen, Azulen, Benzol, Chrysen, Coronen, Fluoranthen, Flouoren, Hexacen, Hexaphen, Hexalen, as-Indacen, s-Indacen, Indan, Inden, Naphthalen, Octacen, Octaphen, Octalen, Ovalen, Penta-2,4-dien, Pentacen, Pentalen, Pentaphen, Perylen, Phenalen, Phenanthren, Picen, Pleiaden, Pyren, Pyranthren, Rubicen, Triphenylen, Trinaphthalen, Biphenyl, Triphenyl, Phenyl-Naphthyl, Binaphthyl, Biphenyl-Naphthyl und dergleichen abgeleitet sind. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Arylgruppe eine (C5-C20)-Arylgruppe, wobei (C5-C10)-Gruppen besonders bevorzugt sind.
  • "Aryleno" betrifft einen bivalenten cyclischen oder polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoff-Brückenrest, einschließlich Arylresten, der durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von jedem zweier benachbarter Kohlenstoffatome eines cyclischen oder polycyclischen aromatischen Stamm-Ringsystems abgeleitet ist. Typische Arylenogruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Aceanthryleno-, Acenaphthyleno-, Acephenanthryleno-, Anthraceno-, Azuleno-, Benzeno-, Chryseno-, Coroneno-, Fluorantheno-, Fluoreno-, Hexaceno-, Hexapheno-, Hexaleno-, as-Indaceno-, s-Indaceno-, Indeno-, Naphthaleno-, Octaceno-, Octapheno-, Octaleno-, Ovaleno-, Penta-2,4-dieno-, Pentaceno-, Pentaleno-, Pentapheno-, Peryleno-, Phenaleno-, Phenanthreno-, Piceno-, Pleiadeno-, Pyreno-, Pyranthreno-, Rubiceno-, Triphenyleno-, Trinaphthalenogruppe und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Arylenogruppe eine (C5-C20)-Arylenogruppe, wobei (C5-C10)-Gruppen besonders bevorzugt sind.
  • "Substituiertes Aryl und Aryleno" betreffen einen Aryl- oder Arylenorest, in dem ein oder mehrere Wasserstoffatome jeweils unabhängig voneinander durch einen anderen Substituenten ersetzt sind. Typische Substituenten umfassen in nicht-begrenzender Weise -X, -R, -O–, -OR, -SR, -S–, -NRR, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)2O–, -S(O)2OH, -S(O)2R, -P(O)(O–)2, -P(O)(OH)2, -C(O)R, -C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O–, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR und -C(NR)NRR, worin jedes X unabhängig ein Halogenatom ist und jede R-Gruppe unabhängig -H, Alkyl, Aryl, Arylalkyl, Heteroaryl oder Heteroarylalkyl ist. Besonders bevorzugte Substituenten sind Halogenatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • "Heteroaryl" betrifft einen ungesättigten cyclischen oder polycyclischen heteroaromatischen Rest mit einem konjugierten π-Elektronensystem, der durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von einem einzigen Atom eines heteroaromatischen Stamm-Ringsystems abgeleitet ist. Spezifisch umfasst von "heteroaromatischen Ringsystemen" sind kondensierte Ringsysteme, in denen ein oder mehrere Ringe aromatisch sind und ein oder mehrere Ringe gesättigt oder ungesättigt sind, wie beispielsweise Arsindol, Chroman, Chromen, Indol, Indolin, Xanthen, usw. Typische Heteroatome umfassen in nicht-begrenzender Weise N, P, O, S, Si, usw. Typische Heteroarylgruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Reste, die von Acridin, Arsindol, Carbazol, β-Carbolin, Chroman, Chromen, Cinnolin, Furan, Imidazol, Indazol, Indol, Indolin, Indolizin, Isobenzofuran, Isochromen, Isoindol, Isoindolin, Isochinolin, Isothiazol, Isoxazol, Naphthyridin, Oxadiazol, Oxazol, Perimidin, Phenanthridin, Phenanthrolin, Phenazin, Phthalazin, Pteridin, Purin, Pyran, Pyrazin, Pyrazol, Pyridazin, Pyridin, Pyrimidin, Pyrrol, Pyrrolizin, Chinazolin, Chinolin, Chinolizin, Chinoxalin, Tetrazol, Thiadiazol, Thiazol, Thiophen, Triazol, Xanthen und dergleichen abgeleitet sind. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Heteroarylgruppe eine 5-20-gliedrige Heteroarylgruppe, wobei 5-10-gliedrige Heteroarylgruppen besonders bevorzugt sind.
  • "Heteroaryleno" betrifft eine cyclische oder polycyclische heteroaromatische Brücke, die durch die Entfernung eines Wasserstoffatoms von jedem zweier benachbarter Atome eines heterocyclischen Stamm-Ringsystems abgeleitet ist. Typische Heteroarylenogruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Acridino-, Carbazolo-, β-Carbolino-, Chromeno-, Cinnolino-, Furano-, Imidazolo-, Indazoleno-, Indoleno-, Indolizino-, Isobenzofurano-, Isochromeno-, Isoindoleno-, Isochinolino-, Isothiazoleno-, Isoxazoleno-, Naphthyridino-, Oxadiazoleno-, Oxazoleno-, Perimidino-, Phenanthridino-, Phenanthrolino-, Phenazino-, Phthalazino-, Pteridino-, Purino-, Pyrano-, Pyrazino-, Pyrazoleno-, Pyridazino-, Pyridino-, Pyrimidino-, Pyrroleno-, Pyrrolizino-, Chinazolino-, Chinolino-, Chinolizino-, Chinoxalino-, Tetrazoleno-, Thiadiazoleno-, Thiazoleno-, Thiopheno-, Triazoleno-, Xanthenogruppe und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Heteroarylenogruppe eine 5-20-gliedrige Heteroarylenogruppe, wobei 5-10-gliedrige Heteroarylenogruppen besonders bevorzugt sind.
  • "Substituiertes Heteroaryl" und "substituiertes Heteroaryleno" betreffen einen Heteroaryl- oder Heteroarylenorest, bei dem ein oder mehrere Wasserstoffatome jeweils unabhängig voneinander durch einen anderen Substituenten ersetzt sind. Typische Substituenten umfassen in nicht-begrenzender Weise -X, -R, -O–, -OR, -SR, -S–, -NRR, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)2O–, -S(O)2OH, -S(O)2R, -P(O)(O–)2, -P(O)(OH)2, -C(O)R, -C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O–, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR und -C(NR)NRR, worin jedes X unabhängig ein Halogenatom ist und jede R-Gruppe unabhängig -H, Alkyl, Alkanyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Arylalkyl, Heteroaryl oder Heteroarylalkyl wie hier definiert ist. Besonders bevorzugte Substituenten sind Halogenatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • "Arylalkyl" betrifft eine acyclische Alkylgruppe, in der eines der Wasserstoffatome, die an ein terminales Kohlenstoffatom gebunden sind, durch eine Arylgruppe ersetzt ist. Typische Arylalkylgruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise Benzyl-, 2-Phenylethan-1-yl-, 2-Phenylethen-1-yl-, Naphthylmethyl-, 2-Naphthylethan-1-yl-, 2-Naphthylethen-1-yl-, Naphthobenzyl-, 2-Naphthophenylethan-1-ylgruppe und dergleichen. Wenn spezifische Alkylgruppen beabsichtigt sind, wird die Nomenklatur Arylalkanyl-, Arylalkenyl- und/oder Arylalkinylgruppe verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Arylalkylgruppe eine (C6-C26)-Arylalkylgruppe, d. h. der Alkanyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest der Arylalkylgruppe ist (C1-C6) und der Arylrest ist (C5-C20). In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Arylalkylgruppe eine (C6-C13)-Gruppe, d. h. der Alkanyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest der Arylalkylgruppe ist (C1-C3) und der Arylrest ist (C5-C10).
  • "Substituiertes Arylalkyl" betrifft einen Arylalkylrest, bei dem ein oder mehrere Wasserstoffatome jeweils unabhängig voneinander durch einen anderen Substituenten ersetzt sind. Typische Substituenten umfassen in nicht-begrenzender Weise -X, -R, -O–, -OR, -SR, -S–, -NRR, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)2O–, -S(O)2OH, -S(O)2R, -P(O)(O–)2, -P(O)(OH)2, -C(O)R, -C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O–, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR und -C(NR)NRR, worin jedes X unabhängig ein Halogenatom ist und jede R-Gruppe unabhängig -H, Alkyl, Alkanyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Arylalkyl, Heteroaryl oder Heteroarylalkyl wie hier definiert ist. Besonders bevorzugte Substituenten sind Halogenatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • "Heteroarylalkyl" betrifft eine acyclische Alkylgruppe, bei der eines der Wasserstoffatome, die an ein terminales Kohlenstoffatom gebunden sind, durch eine Heteroarylgruppe ersetzt ist. Wenn spezifische Alkylgruppen gemeint sind, wird die Nomenklatur Heteroarylalkanyl-, Heteroarylalkenyl- und/oder Heteroarylalkinylgruppe verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Heteroarylalkylgruppe eine 6-26-gliedrige Heteroarylalkylgruppe, d. h. der Alkanyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest der Heteroarylalkylgruppe ist (C1-C6) und der Heteroarylrest ist ein 5-20-gliedriger Heteroarylrest. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Heteroarylalkylgruppe eine 6-13-gliedrige Heteroarylalkylgruppe, d. h. der Alkanyl-, Alkenyl- oder Alkinylrest ist (C1-C3) und der Heteroarylrest ist ein 5-10-gliedriger Heteroarylrest.
  • "Substituiertes Heteroarylalkyl" betrifft einen Heteroarylalkylrest, bei dem ein oder mehrere Wasserstoffatome jeweils unabhängig voneinander durch einen anderen Substituenten ersetzt sind. Typische Substituenten umfassen in nicht-begrenzender Weise -X, -R, -O–, -OR, -SR, -S–, -NRR, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)2O–, -S(O)2OH, -S(O)2R, -P(O)(O–)2, -P(O)(OH)2, -C(O)R, -C(O)X, -C(S)R, -C(O)OR, -C(O)O–, -C(S)OR, -C(O)SR, -C(S)SR, -C(O)NRR, -C(S)NRR und -C(NR)NRR, worin jedes X unabhängig ein Halogenatom ist und jede R-Gruppe unabhängig -H, Alkyl, Alkanyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Arylalkyl, Heteroaryl oder Heteroarylalkyl wie hier definiert ist. Besonders bevorzugte Substituenten sind Halogenatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • "Spektrale Auflösung" in Bezug auf einen Satz von Farbstoffen bedeutet, dass die Fluoreszenz-Emissionsbanden der Farbstoffe ausreichend verschieden sind, d. h. ausreichend nicht-überlappend sind, so dass Reagenzien, an die der Satz von Farbstoffen gebunden ist, z. B. Polynukleotide, auf der Basis der Fluoreszenz-Emissionsbanden, die durch jedes der einzelnen Mitglieder des Satzes an Farbstoffen erzeugt werden, unter Verwendung von Standard-Fotodetektionssystemen wie bei einer Verwendung eines Systems von Bandfiltern und Fotomultipliern, ladungsgekoppelten Vorrichtungen und Spektrographen oder dergleichen, wie beispielsweise die Systeme, die in den US-PSen 4,230,558, 4,811,218 oder in Wheeless et al., Seiten 21–76, in Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis (Academic Press, New York, 1985) beschrieben sind, voneinander unterschieden werden können.
  • "Verbindungsgruppe" bedeutet eine Gruppe, die zur Umsetzung mit einer "komplementären Funktionalität" fähig ist, um eine "Verbindung" herzustellen. Eine Verbindungsgruppe und ihre assoziierte komplementäre Funktionalität werden hier als "Verbindungspaar" bezeichnet.
  • Der Begriff "Nukleosid" betrifft eine Verbindung, die eine Purin-, Deazapurin- oder Pyrimidinnukleobase wie Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanosin und dergleichen umfasst, die an der 1'-Position an eine Pentose gekoppelt ist. Wenn die Nukleosidbase Purin oder 7-Deazapurin ist, ist die Pentose an die Nukleobase an der 9-Position des Purins oder Deazapurins gebunden und, wenn die Nukleobase Pyrimidin ist, ist die Pentose an die Nukleobase an der 1-Position des Pyrimidins gebunden (vgl. z. B. Kornberg und Baker, DNA Replication, 2. Auflage (Freeman, San Francisco, 1992)). Der Begriff "Nukleotid" betrifft hier einen Phosphatester eines Nukleosids wie einen Triphosphatester, wobei die häufigste Veresterungsstelle die Hydroxylgruppe ist, die an die C-5-Position der Pentose gebunden ist. Der Begriff "Nukleosid/tid" betrifft hier einen Satz an Verbindungen, einschließlich sowohl Nukleoside als auch Nukleotide.
  • Der Begriff "Polynukleotid" betrifft Polymere von Nukleotidmonomeren, einschließlich Analoga solcher Polymere, und beinhaltet doppel- und einzelsträngige Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide, α-anomere Formen davon und dergleichen. Monomere sind durch "Internukleotidbindungen" wie Phoshodiesterbindungen miteinander verknüpft, wobei der Begriff "Phosphodiesterbindung" hier Phosphodiesterbindungen oder Bindungen, die Phosphat-Analoga davon beinhalten, einschließlich assoziierter Gegenionen wie H+, NH4 +, Na+, wenn solche Gegenionen vorhanden sind, betrifft. Wenn ein Polynukleotid durch eine Sequenz von Buchstaben dargestellt ist, wie "ATGCCTG", sind die Nukleotide in 5'- zu 3'-Richtung von links nach rechts dargestellt und "A" bezeichnet Desoxyadenosin, "C" bezeichnet Desoxycytidin, "G" bezeichnet Desoxyguanosin und "T" bezeichnet Desoxythymidin, wenn nicht anders angegeben.
  • "Analoga" in Bezug auf Nukleoside/tide und/oder Polynukleotide umfasst synthetische Analoga mit modifizierten Nukleobase-Anteilen, modifizierten Pentose-Anteilen und/oder modifizierten Phosphat-Anteilen und im Fall von Polynukleotiden modifizierten Internukleotidbindungen wie anderenorts allgemein beschrieben (vgl. z. B. Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York (1980), Englisch, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 613–29 (1991), Agrawal, Protocols for Polynucleotides and Analogs, Humana Press (1994)). Im Allgemeinen umfassen modifizierte Phosphat-Anteile Analoga von Phosphat, worin das Phosphoratom sich in der +5-Oxidationsstufe befindet und ein oder mehrere Sauerstoffatome durch einen Nicht-Sauerstoffatom-Rest wie ein Schwefelatom ersetzt sind. Beispiele für Phosphat-Analoga umfassen in nicht-begrenzender Weise Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Phosphoroselenoat, Phosphorodiselenoat, Phosphoroanilothioat, Phoshoranilidat, Phosphoramidat, Borphosphate, einschließlich assoziierter Gegenionen wie H+, NH4 +, Na+, wenn solche Gegenionen vorhanden sind. Beispiele für modifizierte Nukleobase-Anteile umfassen in nicht-begrenzender Weise 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin, Pseudouridin, C-5-Propin, Isocytosin, Isoguanin, 2-Thiopyrimidin und andere derartige Analoga. Besonders bevorzugte Nukleobasen-Analoga sind Iso-C- und Iso-G-Nukleobasen-Analoga, die von Sulfonics, Inc., Alachua, FL, verfügbar sind (vgl. z. B. Benner et al., US-PS 5,432,272 ). Beispiele für modifizierte Pentose-Anteile umfassen in nicht-begrenzender Weise 2'- oder 3'-Modifikationen, bei denen die 2'- oder 3'-Position Wasserstoffatom, Hydroxy-, Alkoxygruppe wie Methoxy-, Ethoxy-, Allyloxy-, Isopropoxy-, Butoxy-, Isobutoxy- und Phenoxygruppe, Azido-, Amino- oder Alkylaminogruppe, Fluor-, Chlor-, Bromatom und dergleichen ist. Modifizierte Internukleotidbindungen umfassen Phosphat-Analoga, Analoga mit achiralen und ungeladenen Bindungen zwischen den Untereinheiten (vgl. z. B. Sterchak, E. P. et al., Organic Chem. 52: 4202 (1987)) und ungeladene Morpholino-basierende Polymere mit achiralen Bindungen zwischen den Untereinheiten (vgl. z. B. US-PS 5,034,506 ). Eine besonders bevorzugte Klasse von Polynukleotid-Analoga, bei denen eine herkömmliche Zucker- und Internukleotidbindung durch ein 2-Aminoethylglycinamid-Rückgrat-Polymer ersetzt wurde, ist Peptid-Nukleinsäure (PNA) (vgl. z. B. Nielsen et al., Science 254: 1497–1500 (1991), Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 1895–1897 (1992)).
  • Der Begriff "Primer-Verlängerungsreagenz" betrifft hier ein Reagenz, das Bestandteile umfasst, die notwendig sind, um eine enzymatische Matrizen-vermittelte Verlängerung eines Polynukleotid-Primers zu bewirken. Primer-Verlängerungsreagenzien umfassen (1) ein Polymerase-Enzym wie ein thermostabiles DNA-Polymerase-Enzym, z. B. Taq-Polymerase, (2) einen Puffer, (3) ein oder mehrere Ketten-Verlängerungs-Nukleotide wie Desoxynukleotidtriphosphate, z. B. Desoxyguanosin-5'-triphosphat, 7-Deazadesoxyguanosin-5'-triphosphat, Desoxyadenosin-5'-triphosphat, Desoxythymidin-5'-triphosphat, Desoxycytidin-5'-triphosphat, und gegebenenfalls im Fall von DNA-Sequenzierungsreaktionen des Sanger-Typs (4) ein oder mehrere Ketten-terminierende Nukleotide wie Didesoxynukleotidtriphosphate, z. B. Didesoxyguanosin-5'-triphosphat, 7-Deazadidesoxyguanosin-5'-triphosphat, Didesoxyadenosin-5'-triphosphat, Didesoxythymidin-5'-triphosphat und Didesoxycytidin-5'-triphosphat.
  • "Terminator" betrifft eine chemische Einheit, die, wenn sie in das 3'-Ende eines Primer-Verlängerungsprodukts eingebaut wird, die weitere Verlängerung eines solchen Primer-Verlängerungsprodukts verhindert. Im Fall von Nukleotid-Terminatoren darf, wenn der Nukleotid-Terminator einen Ribofuranose-Zucker-Anteil beinhaltet, die 3'-Position keine Hydroxygruppe aufweisen, die in der Lage ist, darauf folgend durch eine Polymerase für einen Einbau weiterer Nukleotide verwendet zu werden. Alternativ könnte ein Ribofuranose-Analogon wie Arabinose verwendet werden. Beispiele für Nukleotid-Terminatoren umfassen 2',3'-Didesoxy-β-D-ribofuranosyl, β-D-Arabinofuranosyl, 3'-Desoxy-β-D-arabinofuranosyl, 3'-Amino-2',3'-didesoxy-β-D-ribofuranosyl und 2',3'-Didesoxy-3'-fluor-β-D-ribofuranosyl (Chidgeavadze et al., Nucleic Acids Research 12: 1671–1686 (1984) und Chidgeavadze et al., FEB. Lett. 183: 275–278 (1985)). Nukleotid-Terminatoren beinhalten auch reversible Nukleotid-Terminatoren (Metzker et al., Nucleic Acids Research 22(20): 4259 (1994)).
  • "Wasserlösende Gruppe" betrifft einen Substituenten, der die Löslichkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen in wässriger Lösung erhöht. Beispiele für wasserlösende Gruppen umfassen in nicht-begrenzender Weise geladene oder polare Gruppen wie quaternäre Amin-, Sulfat-, Sulfonat-, Carboxylat-, Phosphat-, Polyether-, Polyhydroxyl- und Boronatgruppe.
  • Der Fachmann wird erkennen, dass viele der durch die hier beschriebenen Formeln umfassten Verbindungen chirale Zentren enthalten. Des weiteren können die verschiedenen Verbindungen die Phänomene der Tautomerie, konformellen Isomerie oder geometrischen Isomerie aufweisen. Da die Formelzeichnungen innerhalb dieser Beschreibung nur eine der möglichen tautomeren, konformell isomeren, enantiomeren oder geometrisch isomeren Formen darstellen können, soll verstanden werden, dass die Erfindung jegliche tautomere, konformell isomere, enantiomere oder geometrisch isomere Formen der Verbindungen umfasst, die die hier beschriebenen gewünschten Aktivitäten und/oder Eigenschaften aufweisen. Des weiteren sollen alle hier entweder über Diagramme oder mittels Terminologie beschriebenen molekularen Strukturen alle Protonierungszustände und assoziierten Gegenionen davon umfassen.
  • II. ERWEITERTE RHODAMINFARBSTOFFVERBINDUNGEN
  • In einem ersten Aspekt umfasst die Erfindung eine neue Klasse von erweiterten Rhodaminverbindungen mit der unmittelbar nachstehend in der Formel I gezeigten allgemeinen Struktur.
  • Figure 00190001
    FORMEL I
  • Die Gruppe R1 in den Strukturen der Formel I für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogenatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • In seiner Verwendung hier und in dieser gesamten Beschreibung ist der Substituent Z1 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -R, Halogenatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R1 mit R2, Y1 oder Y2 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe R2 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R2 mit R1 zusammengenommen werden, wobei der gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe R3 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R3 mit R4 zusammengenommen werden, wobei der gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe R4 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • R4 kann mit R3, Y3 oder Y4 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe R5 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Grup pen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R5 mit R6, Y3 oder Y4 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe R6 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R6 mit R5, R7, Y3 oder Y4 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Der Substituent R7 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R7 mit R6 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe R8 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist R8 Alkyl, unabhängig substituiert mit einem oder mehreren Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogenatom, -C(O)R und -S(O)2R, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist R ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -OH, -O-Alkyl, -NH2, -N-Alkyl und Verbindungsgruppe.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R8 -CF3.
  • In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R8
    Figure 00240001
    worin Z26 und Z27 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -NC(O)R, R und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe und X1, X2, X3, X4 und X5 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, -Cl, -Br und -F. Die Indizes n und m sind ganze Zahlen, die jeweils unabhängig 0 bis 5 betragen. In zwei besonders bevorzugten Ausführungsformen sind X1 und X2 jeweils -H oder alternativ sind X1, X2, X4 und X5 jeweils -F.
  • In einer besonders wichtigen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen weist R8 die Struktur
    Figure 00240002
    auf, worin Z21, Z22, Z23, Z24 und Z25 jeweils für sich genommen Z1 sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind Z21, Z22, Z23, Z24 und Z25 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Halogen, C1- bis C3-Alkyl, -C(O)OR, -C(O)R, -S(O)2OR, -S(O)2R und -CH2OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform sind eine oder mehrere der Gruppen Z21, Z22, Z23, Z24 oder Z25 -F oder -Cl. In einer noch weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist Z21 -C(O)OH. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist Z21 -C(O)OH und eine der Gruppen Z23 oder Z24 ist -C(O)OH. In einer noch weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform sind Z22 und Z25 jeweils -Cl. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform sind Z22, Z23, Z24 und Z25 alle -F oder -Cl. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist Z21 -S(O)2OH und eine der Gruppen Z23 oder Z24 ist -C(O)OH. In einer noch weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist Z21 -C(O)OR und eine der Gruppen Z22, Z23 oder Z24 ist eine Verbindungsgruppe.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R8 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
    Figure 00250001
    worin LG eine Verbindungsgruppe ist.
  • Die Gruppe R9 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R9 mit R10 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • R10 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ ist, wenn R10 mit R9 oder R11 zusammengenommen wird, der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • R11 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R11 mit R10, Y1 oder Y2 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • R13 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R13 mit Y3 oder Y4 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind eine oder mehrere der Gruppen R1, R4, R5, R6, R7, R9, R10, R11 und R13 jeweils unabhängig voneinander -S(O)2OH oder jeweils unabhängig voneinander -F oder -Cl oder jeweils unabhängig von einander Aryl oder Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Y1 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Alternativ kann Y1 mit R1, R11 oder Y2 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe Y2 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Alternativ kann Y2 mit R1, R11 oder Y1 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Y3 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Alternativ kann Y3 mit R4, R5, R6, R13 oder Y4 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Y4 fehlt oder Y4 ist für sich genommen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Anstelle dessen kann Y4 mit R4, R5, R6, R13 oder Y3 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens eine der Gruppen Y1, Y2, Y3 oder Y4 für sich genommen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Aryl und Arylalkyl.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen wird Y1 mit R1 oder R11 zusammengenommen und ist C2- oder C3-Alkyleno oder Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, oder Y2 wird mit R1 oder R11 zusammengenommen und ist C2- oder C3-Alkyleno oder Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, oder Y3 wird mit R4 oder R5 oder R6 oder R13 zusammengenommen und ist C2- oder C3-Alkyleno oder Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, oder Y4 wird mit R4 oder R5 oder R6 oder R13 zusammengenommen und ist C2- oder C3-Alkyleno oder Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die C2- oder C3-substituierte Alkylenogruppe mit C1- bis C3-Alkylgruppe, am meisten bevorzugt Methylgruppe gem-disubstituiert.
  • Mehrere beispielhafte bevorzugte Strukturen werden unmittelbar nachstehend gezeigt.
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • III. AMINOHYDROXYNAPHTHYL-ZWISCHENVERBINDUNGEN
  • In einem zweiten Aspekt umfasst die Erfindung eine neue Klasse von Aminohydroxynaphthyl-Zwischenverbindungen, die für die Herstellung der vorstehend beschriebenen erweiterten Rhodaminverbindungen geeignet sind, wobei deren allgemeine Struktur unmittelbar nachstehend gezeigt ist.
  • Figure 00320001
    FORMEL II
  • Die Gruppe R1 ist für sich genommen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ ist, wenn R1 mit R2, Y1 oder Y2 zusammengenommen wird, der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe R2 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1- Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R2 mit R1 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe R9 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R9 mit R10 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe R10 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R10 mit R9 oder R11 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe R11 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  • Alternativ kann R11 mit R10, Y1 oder Y2 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind eine oder mehrere der Gruppen R1, R2, R9, R10 und R11 jeweils unabhängig voneinander -S(O)2OH. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind eine oder mehrere der Gruppen R1, R2, R9, R10 und R11 jeweils unabhängig voneinander -F oder -Cl. In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform sind eine oder mehrere der Gruppen R1, R2, R9, R10 und R11 jeweils unabhängig voneinander Aryl oder Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe R12 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H und -C(O)R8, worin R8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe Y1 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Alternativ kann Y1 mit R1, R11 oder Y2 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Die Gruppe Y2 für sich genommen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Alternativ kann Y2 mit R1, R11 oder Y1 zusammengenommen werden, wobei der sich ergebende gemeinsame Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens eine der Gruppen Y1 oder Y2 für sich genommen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Aryl und Arylalkyl.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird Y1 mit R1 oder R11 zusammengenommen und ist C2- oder C3-Alkyleno oder Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, oder Y2 wird mit R1 oder R11 zusammengenommen und ist C2- oder C3-Alkyleno oder Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen. Vorzugsweise ist die C2- oder C3-substituierte Alkylenogruppe mit C1- bis C3-Alkyl, am meisten bevorzugt Methyl gem-disubstituiert.
  • Mehrere beispielhafte bevorzugte Strukturen gemäß dieser Ausführungsform sind unmittelbar nachstehend gezeigt.
  • Figure 00370001
  • IV. SYNTHESE VON ERWEITERTEN RHODAMINFARBSTOFFVERBINDUNGEN UND AMINOHYDROXYNAPHTHYL-ZWISCHENPRODUKTEN
  • A. Synthese von erweiterten Rhodaminfarbstoffen
  • Mehrere Syntheseverfahren sind für die Synthese der erfindungsgemäßen erweiterten Rhodaminfarbstoffe verfügbar.
  • Ein erstes bevorzugtes Syntheseverfahren ist nachstehend in Schema 1 zusammengefasst. Dieses erste Verfahren ergibt einen symmetrisch substituierten erweiterten Rhodaminfarbstoff, d. h. einen Farbstoff, in dem die Gruppen R1 und R4 gleich sind, die Gruppen R2 und R3 gleich sind, die Gruppen R11 und R5 gleich sind, die Gruppen R10 und R6 gleich sind, die Gruppen R9 und R7 gleich sind, die Gruppen Y1 und Y3 gleich sind und die Gruppen Y2 und Y4 gleich sind. In diesem ersten bevorzugten Verfahren wird ein Äquivalent eines Aminonaphthol-Zwischenprodukts 1 und ein Äquivalent eines Aminonaphthol-Zwischenprodukts 2, wobei die Gruppen R1, R2, R11, R10, R9, Y1 und Y2 des Zwischenprodukts 1 zu den Gruppen R4, R3, R5, R6, R7, Y3 bzw. Y4 des Zwischenprodukts 2 gleich sind, mit einem Äquivalent eines Carbonsäure-Zwischenprodukts 3 in Gegenwart einer starken Säure wie Schwefelsäure, Methansulfonsäure oder Trifluormethansulfonsäure oder alternativ einer Lewis-Säure wie Aluminiumchlorid oder Zinkchlorid vereinigt. Mindestens 3 molare Äquivalente an Säure, basierend auf den molaren Äquivalenten des Zwischenprodukts 3, werden verwendet. Die Umsetzung erfolgt in einem inerten Lösungsmittel wie Methylenchlorid oder Nitrobenzol oder in keinem Lösungsmittel außer der Säure. Das Reaktionsgemisch wird auf Temperaturen von etwa 50°C bis etwa 200°C etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden unter einer inerten Atmosphäre von Stickstoff, Helium, Argon oder einem anderen nicht-reaktiven Gas erhitzt. Die Kondensation ergibt den erweiterten Rhodaminfarbstoff 4 in einem einzigen Schritt. Die Säure wird durch Auflösen des Reaktionsgemisches in einem wasserunlöslichen Lösungsmittel wie Methylendichlorid und Extraktion der Säure mit Wasser entfernt. Das Produkt kann von den Nebenprodukten und Ausgangsmaterialien durch Chromatographie auf Silicagel mit beispielsweise einem ternären Lösungsmittelsystem wie Methylendichlorid : Methanol : Essigsäure in Verhältnissen von etwa 200 : 20 : 5 bis etwa 20 : 20 : 5 isoliert werden.
  • Schema 1
    Figure 00390001
  • Ein zweites bevorzugtes Syntheseverfahren ist nachstehend in den Schemata 2a und 2b zusammengefasst. Dieses zweite Verfahren kann entweder einen symmetrisch substituierten oder einen nicht-symmetrisch substituierten erweiterten Rhodaminfarbstoff ergeben. In diesem zweiten bevorzugten Verfahren wird ein Äquivalent eines Aminonaphthol-Zwischenprodukts 1 mit einem Äquivalent einer aktivierten Form des Carbonsäure-Zwischenprodukts 3, z. B. in Form des Säurechlorid-Derivats des Zwischenprodukts 3, in Gegenwart eines Lewis-Säure-Katalysators wie Aluminiumchlorid in einem Lösungsmittel wie Nitrobenzol umgesetzt, um ein Aminonaphtholketon-Zwischenprodukt 5 zu ergeben. Das Keton 5 wird durch Auflösen des Reaktionsgemisches in einem wasserunlöslichen Lösungsmittel wie Methylendichlorid und Extraktion von Aluminiumsalzen mit wässriger Säure wie HCl isoliert. Das Ketonprodukt kann von Verunreinigungen und Ausgangsmaterialien durch Chromatographie auf Silicagel mit beispielsweise einem ternären Lösungsmittelsystem wie Methylendichlorid : Methanol : Essigsäure in Verhältnissen von etwa 200 : 20 : 5 bis etwa 20 : 20 : 5 isoliert werden. Das aufgereinigte Keton 5 wird sodann mit einem Äquivalent ei nes zweiten Aminonaphthol-Zwischenprodukts 2 in Gegenwart einer starken Säure wie Schwefelsäure, Methansulfonsäure oder Trifluormethansulfonsäure oder einer Lewis-Säure wie Aluminiumchlorid oder Zinkchlorid umgesetzt. Mindestens 3 molare Äquivalente an Säure, basierend auf den molaren Äquivalenten des Zwischenprodukts 2, werden in einem inerten Lösungsmittel wie Methylenchlorid oder Nitrobenzol oder keinem Lösungsmittel außer dem Säure-Katalysator verwendet. Die Reaktion wird auf etwa 50°C bis etwa 200°C etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden unter einer inerten Atmosphäre wie Stickstoff, Helium, Argon oder einem anderen nicht-reaktiven Gas erhitzt. Die Säure wird sodann durch Auflösen des Reaktionsgemisches in einem wasserunlöslichen Lösungsmittel wie Methylendichlorid und Extratkion der Säure mit Wasser entfernt. Das Produkt kann von den Nebenprodukten und Ausgangsmaterialien durch Chromatographie auf Silicagel mit beispielsweise einem ternären Lösungsmittelsystem wie Methylendichlorid : Methanol : Essigsäure in Verhältnissen von etwa 200 : 20 : 5 bis etwa 20 : 20 : 5 isoliert werden; Schema 2a. Alternativ wird das Keton 5 mit einem Äquivalent eines meta-Hydroxyanilins 70 unter den gleichen Reaktionsbedingungen und unter Verwendung der gleichen Isolierungsverfahren, wie sie für Schema 2a beschrieben wurden, umgesetzt, um den Hybrid-Rhodaminerweiterten Rhodaminfarbstoff 71, wie in Schema 2b gezeigt, zu ergeben.
  • Schema 2a
    Figure 00410001
  • Schema 2b
    Figure 00420001
  • Ein drittes Syntheseverfahren, das entweder einen symmetrischen oder einen unsymmetrischen Farbstoff 4 ergeben kann, ist nachstehend in Schema 3 zusammengefasst. In diesem Verfahren wird, wenn keine der Gruppen Y1, Y2, Y3 und Y4 Wasserstoffatom ist, ein Diarylether 7 durch eine Kondensation des Zwischenprodukts 1 mit dem Zwischenprodukt 6, wobei A Brom, Iod, Triflat oder eine andere Gruppe ist, die hinsichtlich einer Katalyse mit Übergangsmetallen aktiv ist, synthetisiert. Zum Beispiel werden, wenn A Bromid oder Iodid ist, das Zwischenprodukt 1 und das Zwischenprodukt 6 unter Bedingungen einer Ullmann-Reaktion mit Natriumhydroxid bei Temperaturen von 150°C bis 200°C in inerten Lösungsmitteln wie N-Methylpyrrolidon in Gegenwart von Cu(I)-Salzen kondensiert. Alternativ erfolgt die Kondensation mit den gleichen Zwischenpro dukten unter Verwendung von Cäsiumcarbonat bei 80°C bis 100°C in Toluol in Gegenwart von Palladium. Wenn jedoch Y1 oder Y2 in 7 Wasserstoffatom ist oder Y3 oder Y4 in 6 Wasserstoffatom ist, müssen vor der Kondensationsreaktion die assoziierten Stickstoffatome geschützt werden. Ein Beispiel für eine Stickstoff-Schutzgruppe, die gegenüber den für die Übergangsmetall-Katalysatoren verwendeten basischen Bedingungen stabil ist, ist t-Butylcarbamat, das aus Chlor-t-butylcarbonat und dem Aminonaphthol-Zwischenprodukt 1 und/oder dem Naphthylamin-Zwischenprodukt 6 hergestellt wird. Die Schutzgruppe wird sodann von der Verbindung 7 mit Hilfe einer starken Säure wie Trifluoressigsäure entfernt. Nach der Kondensationsreaktion wird der Ether 7 sodann mit einem passend substituierten Zwischenprodukt 3 in Gegenwart einer Säure umgesetzt und erhitzt, um den Farbstoff 4 zu ergeben.
  • Schema 3
    Figure 00440001
  • B. Synthese der Zwischenverbindungen
  • Verbindung 3. Zwei bevorzugte allgemeine Strukturen (8 und 9) der Verbindung 3 sind unmittelbar nachstehend gezeigt. Der Substituent B von 8 oder 9 kann -OH, ein Halogenatom wie -F, -Cl, -Br, -OS(O)2OH oder -C(O)OH sein. Alternativ ist, wenn B mit Z25 der Verbindung 8 oder Z26 der Verbindung 9 zusammengenommen wird, die Kombination vorzugsweise -C(O)O- oder -S(O)O- oder eine jegliche andere Gruppe, die für eine Aktivierung einer Carbonsäure geeignet ist. Vorzugsweise sind X, Z21, Z22, Z23, Z24, Z25, Z26 und Z27 wie vorstehend beschrieben.
  • Figure 00450001
  • Verbindung 19. Verbindung 19 kann in 12 Schritten aus dem substituierten Naphthalen 10, wie nachstehend in Schema 5 gezeigt, hergestellt werden. Verbindung 10 wird in ihr Triflat 11 durch Umsetzen mit Trifluoromethansulfonylchlorid in Pyridin umgewandelt. Sodann wird die Verbindung 11 mit 2-Natriumdimethylmalonat in Gegenwart eines Palladium-Katalysators umgesetzt, um das Malonat-Derivat 12 zu ergeben. Die Methylester von 12 werden mit Natriumhydroxid in Methanol zu Dicarboxylaten hydrolysiert und die Disäure nach Neutralisieren mit einer starken Säure wie HCl erhalten. Die Disäure wird bei einer erhöhten Temperatur decarboxyliert, um das Essigsäure-Derivat 13 zu erhalten. Die Carbonsäure 13 wird in ihr Säurechlorid mit Oxalylchlorid in einem inerten Lösungsmittel wie Methylendichlorid umgewandelt. Das Säurechlorid wird durch Entfernen des Lösungsmittels und des überschüssigen Oxalylchlorids durch Verdampfen isoliert und in das Amid 14 durch Umsetzen mit einem Amin in einem inerten Lösungsmittel wie Methylendichlorid umgewandelt. Die Methylgruppe von 14 wird mit HBr entfernt, um das Phenol 15 zu ergeben, und 15 wird sodann in das Triflat 16 mit Trifluoromethansulfonylchlorid in Pyridin umgewandelt. Das Amid-Wasserstoffatom wird durch Umsetzen mit Natriumhydrid entfernt, gefolgt von einer Verdrängung des Triflats mit dem Amidanion, katalysiert mit Palladium in einem Lösungsmittel wie Toluol, um das Lactam 17 zu ergeben. Der Amidcarbonyl-Anteil von 17 wird durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid in einem Ether-Lösungsmittel wie Diethylether entfernt, was das cyclische Amin 18 ergibt. Die Nitrogruppe von 18 wird zu einer primären Aminogruppe durch Reduktion mit einem Palladium-Katalysator und Wasserstoffgas in einem Lösungsmittel, das gegenüber einer Hydrierung inert ist, wie Methanol reduziert. Die primäre Aminogruppe wird in ihr Diazoniumsalz mit salpetriger Säure in Wasser umgewandelt und die Diazogruppe durch eine Hydroxidgruppe durch Behandeln mit wässrigem Natriumhydroxid verdrängt, um das Aminonaphthol-Farbstoffzwischenprodukt 19 zu erhalten. Das Zwischenprodukt 19 wird durch Neutralisieren des Reaktionsgemisches mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion von 19 aus dem wässrigen Gemisch in ein organisches Lösungsmittel wie Methylendichlorid isoliert.
  • Verbindung 23. Das Nitrolactam 17 in Schema 5 wird in seinen Imidatester 20 durch Umsetzen mit Trimethyloxoniumtetrafluoroborat in Methylenchlorid umgewandelt. Die Methoxygruppe des Imidatesters wird sodann durch eine Methylgruppe unter Verwendung von Methyllithium in Toluol ersetzt, um das gem-Dimethyl-cyclische Amin 21 zu ergeben. Die Nitrogruppe von 21 wird zu einer Aminogruppe durch Reduktion mit Palladium und Wasserstoffgas in einem Lösungsmittel, das gegenüber einer Hydrierung inert ist, z. B. Methanol, reduziert. Die Aminogruppe wird sodann in ihr Diazoniumsalz mit salpetriger Säure in Wasser umgewandelt, um 22 zu ergeben, und die Diazogruppe wird durch eine Hydroxidgruppe durch Behandeln mit wässrigem Natriumhydroxid ersetzt, um das Aminonaphthol-Farbstoffzwischenprodukt 23 zu ergeben. Das Zwischenprodukt 23 wird durch Neutralisieren des Reaktionsgemisches mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion von 23 aus dem wässrigen Gemisch in ein organisches Lösungsmittel wie Methylenchlorid isoliert. Es wird angemerkt, dass der Substituent R in Schema 5 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Schema 5
    Figure 00470001
  • Verbindung 27. Verbindung 27 kann in drei Schritten aus Aminophenol 24, wie nachstehend in Schema 6 gezeigt, hergestellt werden. Aminonaphthol 24 wird an dem Stickstoffatom mit 2-Bromacetylchlorid in Pyridin acyliert, was das Amid 25 ergibt. Das Amid 25 wird durch Behandeln mit einer Lewis-Säure wie Aluminiumchlorid in einem inerten Lösungsmittel wie Nitrobenzol cyclisiert, was das Lactam 26 ergibt. Der Amidcarbonyl-Anteil von 26 wird durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid in einem Ether-Lösungsmittel wie Diethylether entfernt, was das cyclische Amin 27 ergibt. Das Farbstoffzwischenprodukt 27 wird durch Neutralisieren der Aluminiumsalze mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion in ein organisches Lösungsmittel wie Methylendichlorid isoliert. Es wird angemerkt, dass der Substituent R in Schema 6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Verbindung 30. Verbindung 30 kann in 3 Schritten aus Aminonaphthol 24, wie nachstehend in Schema 6 gezeigt, hergestellt werden. Aminonaphthol 24 wird an dem Stickstoffatom mit 2-Brom-2-methylpropanoylchlorid in Pyridin acyliert, was das Amid 28 ergibt. Das Amid 28 wird durch Behandeln mit einer Lewis-Säure wie Aluminiumchlorid in einem inerten Lösungsmittel wie Nitrobenzol cyclisiert, was das Lactam 29 ergibt. Der Amidcarbonyl-Anteil von 29 wird durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid in einem Ether-Lösungsmittel wie Diethylether entfernt, was das cyclische Amin 30 ergibt. Das Farbstoffzwischenprodukt 30 wird durch Neutralisieren der Aluminiumsalze mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion in ein organisches Lösungsmittel wie Methylendichlorid isoliert.
  • Schema 6
    Figure 00490001
  • Verbindung 39. Verbindung 39 kann in 14 Schritten aus dem substituierten Naphthalen 11, sie nachstehend in Schema 7 gezeigt, hergestellt werden. Das Triflat 11 wird in einen Aldehyd durch Ersetzen der Triflatgruppe mit Kohlenmonoxid in Gegenwart von Wasserstoffgas unter Verwendung eines Palladium-Katalysators in einem für eine Hydrierung inerten Lösungsmittel wie Methanol umgewandelt. Der Aldehyd wird zu einem Alkohol mit einem Hydrid-Reduktionsmittel wie Lithiumaluminiumhydrid in einem Ether-Lösungsmittel oder Natriumborhydrid in einem Alkohol-Lösungsmittel wie Ethanol reduziert. Der Alkohol wird in das Bromid 31 durch Umsetzen mit HBr in Wasser umgewandelt. Die Verbindung 31 wird mit 2-Natriumdimethylmalonat in einem Lösungsmittel, das das Malonatnatriumsalz ohne Austausch des Natriumkations solubilisieren wird, wie Methanol umgesetzt, um das Malonat-Derivat 32 zu ergeben. Die Methylester von 32 werden zu Dicarboxylaten mit Natriumhydroxid in Methanol hydrolysiert und die Disäure wird nach Neutralisieren mit einer starken Säure wie HCl erhalten. Die Disäure wird bei einer erhöhten Temperatur decarboxyliert, um das Essigsäure-Derivat 33 zu ergeben. Die Carbonsäure 33 wird in ihr Säurechlorid mit Oxalylchlorid in einem inerten Lösungsmittel wie Methylendichlorid umgewandelt. Das Säurechlorid wird durch Entfernen des Lösungsmittels und des überschüssigen Oxalylchlorids durch Verdampfen isoliert und in das Amid 34 durch Umsetzen mit einem Amin in einem inerten Lösungsmittel wie Methylendichlorid umgewandelt. Die Methylgruppe von 34 wird mit wässrigem HBr entfernt, um das Phenol 35 zu ergeben. Die Verbindung 35 wird sodann in das Triflat 36 mit Trifluormethansulfonylchlorid in Pyridin umgewandelt. Ein Entfernen des Amid-Wasserstoffatoms mit Natriumhydrid, gefolgt von einem Ersetzen des Triflats mit dem Amidanion, katalysiert durch Palladium, wie in Schema 5 gezeigt, ergibt das Lactam 37. Der Amidcarbonyl-Anteil von 37 wird durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid in einem Ether-Lösungsmittel wie Diethylether entfernt, was das cyclische Amin 38 ergibt. Die Nitrogruppe von 38 wird in eine primäre Aminogruppe durch Reduktion mit einem Palladium-Katalysator und Wasserstoffgas in einem Lösungsmittel, das keine Hydrierung durchläuft, wie Methanol reduziert. Die primäre Aminogruppe wird in ihr Diazoniumsalz mit salpetriger Säure in Wasser umgewandelt und die Diazogruppe wird mit Hydroxid durch Behandeln mit wässrigem Natriumhydroxid ersetzt, um das Aminohydroxylnaphthyl-Farbstoffzwischenprodukt 39 zu ergeben. Das Zwischenprodukt 39 wird durch Neutralisieren des Reaktionsgemisches mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion von 39 aus dem wässrigen Gemisch in ein organisches Lösungsmittel wie Methylendichlorid isoliert. Es wird angemerkt, dass der Substituent R in Schema 7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Verbindung 43. Das Nitrolactam 37 in Schema 7 wird in seinen Imidatester 40 durch Umsetzen mit Trimethyloxoniumtetrafluoroborat in Methylenchlorid umgewandelt. Die Methoxygruppe des Imidatesters wird sodann mit einer Methylgruppe unter Verwendung von Methyllithium in Toluol ersetzt, um das gem-Dimethyl-cyclische Amin 41 zu ergeben. Die Nitrogruppe von 41 wird zu einer primären Aminogruppe durch Reduktion mit Palladium und Wasserstoffgas in einem Lösungsmittel, das keine Hydrierung durchläuft, wie Methanol reduziert. Die primäre Aminogruppe wird sodann in ihr Diazoniumsalz mit salpetriger Säure in Wasser umgewandelt, um 42 zu ergeben, und die Diazogruppe wird mit Hydroxid durch Behandeln mit wässrigem Natriumhydroxid ersetzt, um das Aminohydroxylnaphthyl-Farbstoffzwischenprodukt 43 zu ergeben. Das Zwischenprodukt 43 wird durch Neutralisieren des Reaktionsgemisches mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion von 43 aus dem wässrigen Gemisch in ein organisches Lösungsmittel wie Methylendichlorid isoliert.
  • Schema 7
    Figure 00520001
  • Verbindung 46. Verbindung 46 kann in 3 Schritten aus Aminonaphthol 24, wie nachstehend in Schema 8 gezeigt, hergestellt werden. Aminonaphthol 24 wird an dem Stickstoffatom mit 3-Chlorpropanoylchlorid in Pyridin acyliert, was das Amid 44 ergibt. Das Amid 44 wird durch Behandeln mit einer Lewis-Säure wie Aluminiumchlorid in einem inerten Lösungsmittel wie Nitrobenzol cyclisiert, was das Lactam 45 ergibt. Der Amidcarbonyl-Anteil von 45 wird durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid in einem Ether-Lösungsmittel wie Diethylether entfernt, was das cyclische Amin 46 ergibt. Das Farbstoffzwischenprodukt 46 wird durch Neutralisieren der Aluminiumsalze mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion in ein organisches Lösungsmittel wie Methylendichlorid isoliert. Es wird angemerkt, dass der Substituent R in Schema 8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Verbindung 48. Verbindung 48 kann in 2 Schritten aus dem Lactam 45, wie nachstehend in Schema 8 gezeigt, hergestellt werden. Das Lactam 45 in Schema 8 wird in seinen Imidatester 47 durch Umsetzen mit Trimethyloxoniumtetrafluoroborat in Methylenchlorid umgewandelt. Die Methoxygruppe des Imidatesters wird sodann mit einer Methylgruppe unter Verwendung von Methyllithium in Toluol ersetzt, um das gem-Dimethyl-cyclische Amin 48 zu ergeben. Das Farbstoffzwischenprodukt 48 wird durch Neutralisieren der Lithiumsalze mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion in ein organisches Lösungsmittel wie Methylendichlorid isoliert.
  • Schema 8
    Figure 00540001
  • Verbindungen 51 und 54. Wie in Schema 9 gezeigt, kann ausgehend von dem Zwischenprodukt 30 eine bicyclische Struktur 51 mit zwei 5-gliedrigen Ringen in 3 Schritten synthetisiert werden. Aminonaphthol 30 wird an dem Stickstoffatom mit 2-Bromacetylchlorid in Pyridin acyliert, was das Amid 49 ergibt. Das Amid 49 wird durch Behandeln mit einer Lewis-Säure wie Aluminiumchlorid in einem inerten Lösungsmittel wie Nitrobenzol cyclisiert, was das Lactam 50 ergibt. Der Amidcarbonyl-Anteil von 45 wird durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid in einem Ether-Lösungsmittel wie Diethylether entfernt, was das cyclische Amin 51 ergibt. Das Farbstoffzwischenprodukt 51 wird durch Neutralisieren der Aluminiumsalze mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion in ein organisches Lösungsmittel wie Methylendichlorid isoliert. Es wird angemerkt, dass der Substituent R in Schema 9 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen.
  • Wie in Schema 9 gezeigt, kann eine bicyclische Struktur 54 mit sowohl einem 5- als auch einem 6-gliedrigen Ring in 3 Schritten aus 30 hergestellt werden. Aminonaphthol 30 wird an dem Stickstoffatom mit 3-Chlorpropanoylchlorid in Pyri din acyliert, was das Amid 52 ergibt. Das Amid 52 wird durch Behandeln mit einer Lewis-Säure wie Aluminiumchlorid in einem inerten Lösungsmittel wie Nitrobenzol cyclisiert, was das Lactam 54 ergibt. Der Amidcarbonyl-Anteil von 54 wird durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid in einem Ether-Lösungsmittel wie Diethylether entfernt, was das cyclische Amin 51 ergibt. Das Farbstoffzwischenprodukt 51 wird durch Neutralisieren der Aluminiumsalze mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion in ein organisches Lösungsmittel wie Methylendichlorid isoliert.
  • Schema 9
    Figure 00550001
  • Verbindungen 57 und 60. Wie in Schema 10 gezeigt, kann ausgehend von dem Zwischenprodukt 48 eine bicyclische Struktur 57 mit einem 5-gliedrigen Ring und einem 6-gliedrigen Ring in 3 Schritten synthetisiert werden. Aminonaphthol 48 wird an dem Stickstoffatom mit 2-Bromacetylchlorid in Pyridin acyliert, was das Amid 55 ergibt. Das Amid 55 wird durch Behandeln mit einer Lewis-Säure wie Aluminiumchlorid in einem inerten Lösungsmittel wie Nitrobenzol cyclisiert, was das Lactam 56 ergibt. Der Amidcarbonyl-Anteil von 56 wird durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid in einem Ether-Lösungsmittel wie Diethylether entfernt, was das cyclische Amin 57 ergibt. Das Farbstoffzwischenprodukt 57 wird durch Neutralisieren der Aluminiumsalze mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion in ein organisches Lösungsmittel wie Methylendichlorid isoliert.
  • Wie in Schema 10 gezeigt, kann eine bicyclische Struktur 60 mit zwei 6-gliedrigen Ringen aus 48 in 3 Schritten hergestellt werden. Aminonaphthol 48 wird an dem Stickstoffatom mit 3-Chlorpropanoylchlorid in Pyridin acyliert, was das Amid 58 ergibt. Das Amid 58 wird durch Behandeln mit einer Lewis-Säure wie Aluminiumchlorid in einem inerten Lösungsmittel wie Nitrobenzol cyclisiert, was das Lactam 59 ergibt. Der Amidcarbonyl-Anteil von 59 wird durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid in einem Ether-Lösungsmittel wie Diethylether entfernt, was das cyclische Amin 60 ergibt. Das Farbstoffzwischenprodukt 60 wird durch Neutralisieren der Aluminiumsalze mit einer starken Säure wie HCl und Extraktion in ein organisches Lösungsmittel wie Methylendichlorid isoliert.
  • Schema 10
    Figure 00570001
  • V. KONJUGATE VON ERWEITERTEN RHODAMINFARBSTOFFVERBINDUNGEN
  • A. Farbstoff-Konjugat-Verbindungschemie
  • Erfindungsgemäße Farbstoffe können gegebenenfalls eine Verbindungsgruppe aufweisen, die mindestens eine Gruppe -L1-Rx umfasst, worin Rx eine reaktive Gruppe ist, die an den Farbstoff D durch eine kovalente Bindung L1 gebunden ist. In bestimmten Ausführungsformen umfasst L1 mehrere dazwischen liegende Atome, die als ein Abstandshalter dienen, während in anderen Ausführungsfor men L1 einfach eine Bindung ist, die Rx mit dem Farbstoff verbindet. Farbstoffe mit einer Verbindungsgruppe können mit einer großen Vielzahl von organischen oder anorganischen Substanzen Sc umgesetzt werden, die funktionelle Gruppen mit einer geeigneten Reaktivität, d. h. einer komplementären Funktionalität -L2-Ry, enthalten oder derartig modifiziert sind, dass sie solche funktionelle Gruppen enthalten. In bestimmten Ausführungsformen umfasst L2 mehrere dazwischen liegende Atome, die als ein Abstandshalter dienen, während in anderen Ausführungsformen L2 einfach eine Bindung ist, die Ry mit der Substanz Sc verbindet. Eine Umsetzung der Verbindungsgruppe und der komplementären Funktionalität führt zu einer chemischen Bindung des Farbstoffs an die konjugierte Substanz Sc, dargestellt durch D-L-Sc, worin L die Verbindung ist, die durch die Umsetzung der Verbindungsgruppe mit der komplementären Funktionalität gebildet wird.
  • Eine der Gruppen Ry oder Rx umfasst typischerweise ein Elektrophil, während die andere typischerweise ein Nukleophil umfasst, so dass die Umsetzung des Elektrophils und des Nukleophils eine kovalente Bindung zwischen dem Farbstoff und der konjugierten Substanz bereitstellt.
  • Alternativ umfasst eine der Gruppen Ry oder Rx typischerweise eine fotoaktivierbare Gruppe und wird nur nach Bestrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge chemisch reaktiv.
  • Ausgewählte Beispiele für Elektrophile und Nukleophile, die in Verbindungsgruppen verwendbar sind, und komplementäre Funktionalitäten sind in Tabelle 2 gezeigt, wobei die Umsetzung einer elektrophilen Gruppe mit einer nukleophilen Gruppe eine kovalente Bindung ergibt.
  • TABELLE 1 Beispiele für einige Wege, die zu geeigneten kovalenten Bindungen führen
    Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Die kovalente Bindung L bindet den Farbstoff an die konjugierte Substanz Sc entweder direkt (d. h. L ist eine Einfachbindung) oder über eine Kombination von stabilen chemischen Bindungen. Beispielsweise kann L Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, sein.
  • Die Gruppe -Rx ist vorzugsweise mit dem Farbstoff über den Linker L1 bei R1, R4–R11 oder Y1–Y4 verbunden. Mehr bevorzugt ist die Verbindungsgruppe -L-Rx mit dem Farbstoff bei R8 oder Y1–Y4 verbunden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindungsgruppe -L-Rx mit dem Farbstoff bei R8 verbunden.
  • Die Auswahl der Verbindungsgruppe, die für eine Bindung des Farbstoffs an die konjugierte Substanz verwendet wird, hängt typischerweise von der komplementären Funktionalität auf der zu konjugierenden Substanz ab. Die Arten von komplementären Funktionalitäten, die typischerweise an den konjugierten Substanzen Sc vorliegen, umfassen in nicht-begrenzender Weise Amine, Thiole, Alkohole, Phenole, Aldehyde, Ketone, Phosphate, Imidazole, Hydrazine, Hydroxylamine, disubstituierte Amine, Halogenide, Epoxide, Sulfonatester, Purine, Pyrimidine, Carbonsäuren oder eine Kombination dieser Gruppen. Ein einzelner Typ einer reaktiven Stelle kann auf der Substanz verfügbar sein (typischerweise im Fall von Polysacchariden) oder eine Vielzahl von Stellen kann vorhanden sein (wie Amine, Thiole, Alkohole, Phenole), wie es für Proteine typisch ist. Eine konjugierte Substanz kann mit mehr als einem Farbstoff konjugiert werden, die gleich oder verschieden sein können, oder sie kann mit einer Substanz konjugiert werden, die zusätzlich durch ein Hapten modifiziert ist. Obwohl etwas Selektivität durch eine sorgfältige Steuerung der Reaktionsbedingungen erhalten werden kann, wird eine Selektivität einer Markierung am besten dadurch erhalten, dass ein geeigneter reaktiver Farbstoff ausgewählt wird.
  • B. Farbstoffkonjugate
  • Eine Vielzahl von Farbstoffkonjugaten kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Farbstoffe hergestellt werden, wie Konjugate mit der allgemeinen Struktur D-L-Sc, worin D ein erfindungsgemäßer erweiteter Rhodaminfarbstoff ist, L eine kovalente Bindung ist und Sc eine konjugierte Substanz ist. Erfindungsgemäße Farbstoffkonjugate umfassen Konjugate von Antigenen, Steroiden, Vitaminen, Arzneimitteln, Haptenen, Metaboliten, Toxinen, umweltverschmutzenden Stoffen, Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Nukleinsäure-Polymeren, Kohlenhydraten, Lipiden und Polymeren. In einer weiteren Ausführungsform ist die konjugierte Substanz ein Polysaccharid, Nukleotid, Oligonukleotid, Phospholipid, Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Liposom, lipophiles Polymer, polymeres Mikropartikel, eine biologische Zelle oder ein Virus. In einem erfindungsgemäßen Aspekt ist die konjugierte Substanz mit einer Vielzahl von erfindungsgemäßen Farbstoffen markiert, die gleich oder verschieden sein können.
  • Die am meisten bevorzugten konjugierten Substanzen sind Konjugate von Haptenen, Nukleotiden, Oligonukleotiden, Nukleinsäure-Polymeren, Proteinen oder Polysacchariden. Am meisten bevorzugt ist die konjugierte Substanz eine Nukleinsäure oder eine Substanz, die in einer spezifischen Weise mit Nukleinsäuren wechselwirkt, wie DNA-bindende Proteine.
  • In einer Ausführungsform ist die konjugierte Substanz Sc eine Aminosäure (einschließlich derjenigen, die geschützt sind oder durch Phosphate, Kohlenhydrate oder C1- bis C22-Carbonsäuren substituiert sind) oder sie ist ein Polymer von Aminosäuren wie ein Peptid oder Protein. Bevorzugte Konjugate von Peptiden enthalten mindestens 5 Aminosäuren, mehr bevorzugt 5 bis 36 Aminosäuren. Bevorzugte Peptide umfassen in nicht-begrenzender Weise Neuropeptide, Cytokine, Toxine, Proteasesubstrate und Proteinkinasesubstrate. Auch bevorzugt sind Peptide, die als Organellen-Lokalisierungspeptide dienen, d. h. Peptide, die dazu dienen, den konjugierten Farbstoff zum Zweck einer Lokalisierung innerhalb einer bestimmten zellulären Unterstruktur durch zelluläre Transportmechanismen zu lotsen. Bevorzugte Proteinkonjugate umfassen Enzyme, Antikörper, Lectine, Glykoproteine, Histone, Albumine, Lipoproteine, Avidin, Streptavidin, Protein A, Protein G, Phycobiliproteine und andere fluoreszierende Proteine, Hormone, Toxine und Wachstumsfaktoren. Typischerweise ist das konjugierte Protein ein Antikörper, ein Antikörperfragment, Avidin, Streptavidin, ein Toxin, ein Lectin oder ein Wachstumsfaktor. Bevorzugte Haptene umfassen Biotin, Digoxigenin und Fluorophore.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die konjugierte Substanz Sc ein Kohlenhydrat oder Polyol, das typischerweise ein Polysaccharid ist, wie Dextran, FICOLL, Heparin, Glykogen, Amylopectin, Mannan, Inulin, Stärke, Agarose und Cellulose, oder sie ist ein Polymer wie ein Poly(ethylenglykol). Bevorzugte Polysaccharidkonjugate sind Dextran- oder FICOLL-Konjugate.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die konjugierte Substanz Sc ein Lipid (typischerweise mit 6 bis 25 Kohlenstoffatomen), einschließlich Glykolipide, Phospholipide und Sphingolipide. Alternativ ist die konjugierte Substanz ein Lipidvesikel wie ein Liposom oder sie ist ein Lipoprotein (vgl. nachstehend). Manche lipophilen Substituenten sind für eine Erleichterung eines Transports des konjugierten Farbstoffs in Zellen oder zelluläre Organellen geeignet.
  • In einer noch weiteren Ausführungsform sind die Konjugate Farbstoffkonjugate von Polymeren, polymeren Partikeln, polymeren Mikropartikeln, einschließlich magnetischer und nicht-magnetischer Mikrosphären, polymeren Membranen, leitenden und nicht-leitenden Metallen und Nicht-Metallen und Glas- und Plastikoberflächen und -partikeln.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die konjugierte Substanz Sc ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars, das für den Nachweis eines Analyten verwendet werden kann. Alternativ zeigt das Auftreten des markierten spezifischen Bindungspaar-Mitglieds die Lokalisierung des komplementären Mitglieds dieses spezifischen Bindungspaars an, wobei jedes spezifische Bindungspaar-Mitglied einen Bereich auf der Oberfläche oder in einer Höhlung aufweist, der spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation des anderen bindet und damit komplementär ist. Beispiele für spezifische Bindepaare sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • TABELLE 3 Beispiele für spezifische Bindepaare
    Figure 00630001
  • Eine besonders bevorzugte Klasse von konjugierten Substanzen umfasst Nukleoside/tide, in die die erfindungsgemäßen Farbstoffe eingebaut werden. Solche Nukleosid/tid-Konjugate sind besonders im Zusammenhang einer Markierung von Polynukleotiden geeignet, die durch eine enzymatische Synthese hergestellt werden, wie Nukleotidtriphosphate, die im Zusammenhang mit einer PCR-Amplifikation, Sanger-Typ-Polynukleotidsequenzierung und Nick-Translationsreaktionen eingesetzt werden.
  • Im Allgemeinen ist die Struktur des markierten Nukleosid/tid-Reagenzes NUC-L-D worin NUC ein Nukleosid/tid oder Nukleosid/tid-Analogon ist, D eine erfindungsgemäße erweiterte Rhodaminfarbstoffverbindung ist und L eine kovalente Bindung ist. Alternativ entspricht die Struktur eines Nukleotids, das eine Verbindungsgruppe umfasst, die bisher nicht mit einer komplementären Funktionalität umgesetzt wurde, der Struktur NUC-L1-Rx worin Rx und L1 wie vorstehend definiert sind.
  • Vorzugsweise ist, wenn NUC eine Purinbase enthält, die Bindung zwischen NUC und D an die N8-Position des Purins gebunden, und, wenn NUC eine 7-Deazapurinbase enthält, ist die Bindung an die N7-Position des 7-Deazapurins gebunden, und, wenn NUC eine Pyrimidinbase enthält, ist die Bindung an die N5-Position des Pyrimidins gebunden.
  • Eine Nukleosid/tid-Markierung kann mit Hilfe einer jeglichen einer großen Anzahl an bekannten Nukleosid/tid-Markierungstechniken unter Verwendung bekannter Bindungen, Verbindungsgruppen und assoziierter komplementärer Funktionalitäten wie vorstehend beschrieben erfolgen. Im Allgemeinen sollte die Verbindung, die den Farbstoff mit dem Nukleosid verbindet, (i) nicht mit einer Oligonukleotid-Ziel-Hybridisierung interferieren, (ii) mit relevanten Enzymen wie Polymerasen, Ligasen und dergleichen kompatibel sein und (iii) nicht gegenteilig die Fluoreszenzeigenschaften des Farbstoffs beeinflussen. Beispielhafte Nukleosid/tid-Markierungsverfahren, die in Verbindung mit der Erfindung geeignet sind, umfassen die nachstehenden: Gibson et al., Nucleic Acids Research 15: 6455–6467 (1987), Gebeyehu et al., Nucleic Acids Research 15: 4513–4535 (1987), Haralambidis et al., Nucleic Acids Research 15: 4856–4876 (1987), Nelson et al., Nucleosides and Nucleotides 5(3): 233–241 (1986), Bergstrom et al., JACS 111: 374–375 (1989) und die US-PSen 4,855,225, 5,231,191 und 5,449,767.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung L, die den Farbstoff mit dem Nukleosid/tid verbindet, eine acetylenische Bindung, eine Amido- oder alkenische Amidobindung, wobei die Verbindung zwischen dem Farbstoff und dem Nukleosid/tid durch Umsetzen eines aktivierten N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Esters des Farbstoffs mit einer Alkinylamino- oder Alkenylamino-derivatisierten Base eines Nukleosids/tids gebildet wird. Mehr bevorzugt ist die resultierende Verbindung 3-(Carboxy)amino-1-propin-1-yl mit der Struktur
  • Figure 00650001
  • Alternative bevorzugte Verbindungen umfassen substituierte Propargylethoxyamido-Verbindungen mit der Struktur NUC-C≡C-CH2OCH2CH2NR3X-D worin X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
    Figure 00650002
    worin n 1 bis 5 beträgt,
    Figure 00650003
    worin n 1 bis 5 beträgt,
    Figure 00650004
    worin R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Niederalkyl- und Schutzgruppe und R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H und Niederalkylgruppe; vgl. Khan et al., US-PS 5,770,716 .
  • Die Synthese von Alkinylamino-derivatisierten Nukleosiden wird von Hobbs et al. in der EP-A-87305844.0 und Hobbs et al., J. Org. Chem. 54: 3420 (1989) beschrieben. Zusammengefasst werden die Alkinylamino-derivatisierten Nukleotide dadurch hergestellt, dass das geeignete Halogendidesoxynukleosid (gewöhnlich 5-Iodpyrimidin- und 7-Iod-7-deazapurindidesoxynukleoside wie von Hobbs et al. (vorstehend zitiert) beschrieben) und Cu(I) in ein Gefäß gegeben werden, mit Argon gespült wird, um Luft zu entfernen, und trockenes DMF hinzugegeben wird, gefolgt von einer Zugabe eines Alkinylamins, von Triethylamin und Pd(0). Das Reaktionsgemisch wird mehrere Stunden gerührt oder bis eine Dünnschichtchromatographie einen Verbrauch des Halogendidesoxynukleosids anzeigt.
  • Wenn ein ungeschütztes Alkinylamin verwendet wird, kann das Alkinylaminonukleosid durch Konzentrieren des Reaktionsgemisches und chromatographische Auftrennung auf Silicagel unter Verwendung eines Elutionslösungsmittels, das Ammoniumhydroxid enthält, um das in der Kopplungsreaktion gebildete Hydrohalogenid zu neutralisieren, isoliert werden. Wenn ein geschütztes Akinylamin verwendet wird, kann Methanol/Methylenchlorid zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt werden, gefolgt von der Bicarbonatform eines stark basischen Anionenaustauscherharzes. Die Aufschlämmung kann sodann etwa 45 Minuten gerührt, abfiltriert und das Harz mit weiterem Methanol/Methylenchlorid gespült werden. Die vereinigten Filtrate können einkonzentriert und durch Flash-Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung eines Methanol/Methylenchlorid-Gradienten aufgereinigt werden. Die Triphosphate werden in an sich bekannter Weise erhalten.
  • Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Nukleoside/tide sind nachstehend gezeigt
    Figure 00660001
    worin B eine Nukleosid/tid-Base wie Uracil, Cytosin, Deazaadenin oder Deazaguanosin ist, W1 und W2 für sich genommen -OH oder eine Gruppe sind, die zur Blockierung einer Polymerase-vermittelten Matrizen-gerichteten Polymerisation fähig ist, wie -H, Fluor und dergleichen, W3 OH oder Mono-, Di- oder Triphosphat oder ein Phosphat-Analogon ist, D eine erfindungsgemäße Farbstoffverbindung ist und L eine kovalente Bindung ist, die den Farbstoff mit dem Nukleosid/tid verbindet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Nukleotide Didesoxynukleotidtriphosphat-Terminatoren mit der nachstehend bezeichneten Struktur, einschließlich assoziierter Gegenionen, wenn vorhanden.
  • Figure 00660002
  • Markierte Didesoxynukleotide wie die vorstehend gezeigten sind besonders als Ketten-terminierende Mittel in Sanger-Typ-DNA-Sequenzierverfahren unter Verwendung von Fluoreszenznachweis anwendbar.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Nukleotide Didesoxynukleotidtriphosphate mit der nachstehend gezeigten Struktur.
  • Figure 00670001
  • Markierte Desoxynukleotide wie die vorstehend gezeigten sind besonders als Reagenzien für eine Markierung von Polymerase-Verlängerungsprodukten wie in der Polymerase-Kettenreaktion oder Nick-Translation einsetzbar.
  • In einer noch weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die konjugierte Substanz Sc Polynulleotide, die mit den erfindungsgemäßen Farbstoffen markiert sind. Solche markierten Polynukleotide sind in einer Reihe von wichtigen Zusammenhängen verwendbar, einschließlich als DNA-Sequenzier-Primer, PCR-Primer, Oligonukleotid-Hybridisierungssonden, Oligonukleotid-Ligationssonden und dergleichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform beinhalten die erfindungsgemäßen markierten Polynukleotide mehrere Farbstoffe, die derart positioniert sind, dass ein Fluoreszenzenergietransfer zwischen einem Donor-Farbstoff und einem Akzeptor-Farbstoff stattfindet. Solche Energietransfer-Polynukleotide mit mehreren Farbstoffen sind als spektral-abstimmbare Sequenzier-Primer (vgl. z. B. Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4347–4351 (1995)) und als Hybridisierungssonden (vgl. z. B. Lee et al., Nucleic Acids Research 21: 3761–3766 (1993)) einsetzbar.
  • Markierte Polynukleotide können entweder enzymatisch, z. B. unter Verwendung einer DNA-Polymerase oder Ligase wie in Stryer, Biochemistry, Kapitel 24, W. H. Freeman and Company (1981) beschrieben, oder durch chemische Synthese wie durch das Phosphoramidit-Verfahren, das Phosphittriester-Verfahren und dergleichen, wie in Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (1990) beschrieben, synthetisierbar. Marker können während einer enzymatischen Synthese unter Verwendung markierter Nukleotidtriphosphatmonomere, wie vorstehend beschrieben, oder während einer chemischen Synthese unter Verwendung markierter Nicht-Nukleotid- oder Nukleotidphosphoramidite, wie vorstehend beschrieben, eingebracht werden oder können nach einer Synthese eingebracht werden.
  • Im Allgemeinen kann, wenn das markierte Polynukleotid unter Verwendung einer enzymatischen Synthese hergestellt wird, das nachstehende Verfahren verwendet werden. Eine Matrizen-DNA wird denaturiert und ein Oligonukleotid-Primer wird an die Matrizen-DNA hybridisiert. Ein Gemisch von Desoxynukleotidtriphosphaten wird zu dem Gemisch hinzugefügt, einschließlich dGTP, dATP, dCTP und dTTP, worin mindestens ein Teil der Desoxynukleotide mit einer erfindungsgemäßen Farbstoffverbindung, wie vorstehend beschrieben, markiert ist. Sodann wird ein Polymeraseenzym unter Bedingungen hinzugefügt, bei denen das Polymeraseenzym aktiv ist. Ein markiertes Polynukleotid wird durch den Einbau der markierten Desoxynukleotide während einer Polymerase-vermittelten Strangsynthese gebildet. In einem alternativen enzymatischen Syntheseverfahren werden zwei Primer anstellte von einem verwendet, wobei ein Primer zu dem +-Strang komplementär ist und der andere zu dem –-Strang des Ziels komplementär ist, die Polymerase eine thermostabile Polymerase ist, und die Reaktionstemperatur wird zwischen einer Denaturierungstemperatur und einer Verlängerungstemperatur verändert, wodurch exponentiell ein markiertes Komplement zu der Zielsequenz durch PCR synthetisiert wird; vgl. z. B. PCR Protocols, Innis et al., Hrsg., Academic Press (1990).
  • Markierte Polynukleotide können unter Verwendung des Phosphoramidit-Verfahrens chemisch synthetisiert werden. Eine detaillierte Beschreibung der Chemie, die für eine Herstellung von Polynukleotiden durch das Phosphoramidit-Verfahren verwendet wird, ist an anderer Stelle bereitgestellt; vgl. z. B. Caruthers et al., US-PSen 4,458,066 und 4,415,732, Caruthers et al., Genetic Engineering 4: 1–17 (1982), Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, Seiten 6–1 bis 6–22, Applied Biosystems, Teil-Nr. 901237 (1991). Das Phosphoramidit-Verfahren zur Polynukleotidsynthese ist aufgrund seiner wirksamen und schnellen Kopplung und der Stabilität der Ausgangsmaterialien das bevorzugte Verfahren. Die Synthese erfolgt bei einer Bindung der wachsenden Polynukleotidkette an einem Festträger, so dass überschüssige Reagenzien, die sich in der Flüssigphase befinden, leicht durch Filtration entfernt werden können, wodurch eine Notwendigkeit für Aufreinigungsschritte zwischen den Synthesezyklen beseitigt wird.
  • Nachstehend werden kurz die Schritte eines typischen Polynukleotid-Synthesezyklus unter Verwendung des Phosphoramidit-Verfahrens beschrieben. Zuerst wird ein Festträger, der ein geschütztes Nukleotidmonomer enthält, mit Säure wie Trichloressigsäure behandelt, um eine 5'-Hydroxyl-Schutzgruppe zu entfernen, wodurch die Hydroxylgruppe für eine darauf folgende Kopplungsreaktion freigesetzt wird. Ein aktiviertes Zwischenprodukt wird sodann durch gleichzeitige Zugabe eines geschützten Phosphoramidit-Nukleosidmonomers und einer schwachen Säure wie Tetrazol zu der Reaktion gebildet. Die schwache Säure protoniert das Stickstoffatom des Phosphoramidits, wodurch ein reaktives Zwischenprodukt gebildet wird. Eine Anfügung der Nukleoside ist innerhalb von 30 s abgeschlossen. Sodann erfolgt ein "Capping"-Schritt, der jegliche Polynukleotidketten, die kein Anfügen von Nukleosiden durchlaufen haben, terminiert. Ein "Capping" erfolgt vorzugsweise mit Essigsäureanhydrid und 1-Methylimidazol. Die Internukleotidbindung wird sodann von dem Phosphit in den stabileren Phosphotriester durch Oxidation unter Verwendung von Iod als dem bevorzugten Oxidationsmittel und Wasser als Sauerstoff-Donor umgewandelt. Nach einer Oxidation wird die Hydroxyl-Schutzgruppe mit einer protischen Säure wie Trichloressigsäure oder Dichloressigsäure entfernt und der Zyklus wird wiederholt, bis die Kettenverlängerung abgeschlossen ist. Nach einer Synthese wird die Polynukleotidkette von dem Träger unter Verwendung einer Base wie Ammoniumhydroxid oder t-Butylamin abgespalten. Die Abspaltungsreaktion entfernt auch jegliche Phosphat-Schutzgruppen wie Cyanethylgruppen. Schließlich werden die Schutzgruppen an den exocyclischen Aminen der Basen und die Hydroxyl-Schutzgruppen an den Farbstoffen durch Behandeln der Polynukleotidlösung in einer Base bei einer erhöhten Temperatur wie 55°C entfernt.
  • Jegliche der Phosphoramidit-Nukleosidmonomere können farbstoffmarkierte Phosphoramidite wie vorstehend beschrieben sein. Wenn die 5'-terminale Position des Nukleotids markiert wird, kann ein erfindungsgemäßes markiertes nicht-nukleotidisches Phosphoramidit während des abschließenden Kondensationsschritts verwendet werden. Wenn eine innere Position des Oligonukleotids markiert wird, kann ein erfindungsgemäßes markiertes nukleotidisches Phosphoramidit während eines jeglichen der Kondensationsschritte verwendet werden.
  • Nach der Synthese kann das Polynukleotid an einer Reihe von Positionen markiert werden, einschließlich des 5'-Terminus, wie in Oligonucleotides and Analogs, Eckstein, Hrsg., Kapitel 8, IRL Press (1991) und Orgel et al., Nucleic Acids Research 11(18): 6513 (1983), US-PS 5,118,800 beschrieben, des Phosphodiester-Rückgrats, wie an angegebener Stelle in Kapitel 9 beschrieben, oder des 3'-Terminus, wie in Nelson, Nucleic Acids Research 20(23): 6253–6259, und in den US-PSen 5,401,837 und 5,141,813 beschrieben. Hinsichtlich eines umfassenden Überblicks von Oligonukleotid-Markierungsverfahren wird auf R. Haugland in Excited States of Biopolymers, Steiner, Hrsg., Plenum Press, NY (1983), verwiesen.
  • In einem bevorzugten chemischen Markierungsverfahren nach der Synthese wird ein Farbstoff, der eine Carboxy-Verbindungsgruppe enthält, in den N-Hydroxysuccinimidester durch Umsetzen mit etwa 1 Äquivalent 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid und etwa 3 Äquivalenten N-Hydroxysuccinimid in trockenem Ethylacetat für 3 Stunden bei Raumtemperatur umgewandelt. Das Reaktionsgemisch wird mit 5%iger HCl gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und zu einem Feststoff einkonzentriert, der in DMSO erneut suspendiert wird. Die DMSO-Farbstoffstammlösung wird sodann in einem Überschuss (10- bis 20-fache Menge) zu einem Aminohexyl-derivatisierten Oligonukleotid in 0,25 M Bicarbonat/Carbonat-Puffer bei pH 9,4 gegeben und 6 Stunden umgesetzt; vgl. z. B. US-PS 4,757,141 . Das farbstoffmarkierte Oligonukleotid wird von nicht-umgesetztem Farbstoff mittels Durchleiten durch eine Größenausschluss-Chromatographiesäule abgetrennt, wobei mit Puffer wie 0,1 molarem Triethylaminacetat (TEAA) eluiert wird. Die Fraktion, die das markierte Roh-Oligonukleotid enthält, wird weiter durch HPLC mit reverser Phase aufgereinigt, wobei eine Gradientenelution verwendet wird.
  • Im Allgemeinen ergeben sich Konjugate typischerweise aus einem Mischen von geeigneten reaktiven Farbstoffen und der zu konjugierenden Substanz in einem geeigneten Lösungsmittel, in dem beide löslich sind, wobei bekannte Verfahren verwendet werden, gefolgt von einer Trennung des Konjugats von jeglichem nicht-umgesetzten Farbstoff und Nebenprodukten. Im Fall derjenigen reaktiven Farbstoffe, die fotoaktiviert werden, wird bei der Konjugation eine Bestrahlung des Reaktionsgemisches erforderlich, um den reaktiven Farbstoff zu aktivieren. Das Farbstoffkonjugat wird in Lösung oder lyophilisiert verwendet und für eine spätere Verwendung gelagert.
  • VI. ANWENDUNGEN DER ERWEITERTEN RHODAMINFARBSTOFFVERBINDUNGEN UND DER ERWEITERTEN RHODAMINFARBSTOFFKONJUGATE
  • Die erfindungsgemäßen Farbstoffe und Konjugate sind für ein jegliches Verfahren gut geeignet, bei denen ein Fluoreszenznachweis verwendet wird, insbesondere Verfahren, die den gleichzeitigen Nachweis von mehreren räumlich überlappenden Analyten erfordern. Erfindungsgemäße Farbstoffe und Reagenzien sind besonders gut für eine Identifizierung von Polynukleotidklassen geeignet, die einem biochemischen Trennverfahren wie Elektrophorese unterzogen wurden oder die über Positionen in einer räumlich adressierbaren Nukleinsäure-Hybridisierungsanordnung verteilt wurden.
  • In einer bevorzugten Kategorie von Verfahren, die hier als "Fragmentanalyse"- oder "genetische Analyse"-Verfahren bezeichnet werden, werden markierte Polynukleotidfragmente durch Matrizen-gerichtete enzymatische Synthese unter Verwendung von markierten Primern, Sonden oder Nukleotiden wie durch Ligation oder Polymerase-gerichtete Primer-Verlängerung hergestellt. Die Fragmente werden durch ein größenabhängiges Auftrennverfahren wie Elektrophorese oder Chromatographie oder durch Hybridisieren an eine räumlich adressierbare Nukleinsäure-Hybridisierungsanordnung aufgelöst und die aufgelösten Fragmente werden nach dem Auftrenn- oder Hybridisierungsschritt z. B. durch Laserinduzierte Fluoreszenz nachgewiesen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden mehrere Klassen von Polynukleotiden gleichzeitig aufgelöst und die verschiedenen Klassen werden durch spektral auflösbare Marker unterschieden.
  • Ein derartiges Fragmentanalyseverfahren, das als amplifiziertes Fragment-Längenpolymorphismus-Nachweis (AmpFLP) bekannt ist, basiert auf Längenpolymorphismen von amplifizierten Fragmenten, d. h. Restriktions-Fragmentlängenpolymorphismen, die durch PCR amplifiziert werden. Diese amplifizierten Fragmente verschiedener Größen dienen als gekoppelte Marker für eine Verfolgung mutierter Gene in Familien. Je näher das amplifizierte Fragment zu dem mutierten Gen auf dem Chromosom ist, desto größer ist die Verwandtschaftsbeziehung. Da Gene für viele genetische Erkrankungen nicht identifiziert wurden, dienen diese Kopplungsmarker dazu, die Bewertung eines Krankheitsrisikos oder einer Vaterschaft zu unterstützen. In der AmpFLP-Technik können die Po lynukleotide mit Hilfe eines markierten Polynukleotid-PCR-Primers oder markierter Nukleotidtriphosphate in der PCR markiert werden.
  • In einem weiteren derartigen Fragmentanalyseverfahren, das als Nick-Translation bekannt ist, wird eine enzymatische Polymerisationsreaktion verwendet, um unmarkierte Nukleosidtriphosphate in einem doppelsträngigen DNA-Molekül mit markierten zu ersetzen. Freie 3'-Hydroxylgruppen werden innerhalb der unmarkierten DNA durch Brüche ("Nicks") gebildet, die durch Desoxyribonuklease I (DNase I)-Behandlung verursacht werden. DNA-Polymerase I katalysiert sodann die Anfügung eines markierten Nukleotids an den 3'-Hydroxylterminus des Bruchs. Zur gleichen Zeit beseitigt die 5'- zu 3'-Exonuklease-Aktivität dieses Enzyms die Nukleotideinheit von dem 5'-Phosphorylterminus des Bruchs. Ein neues Nukleotid mit einer freien 3'-OH-Gruppe wird an der Position des ursprünglichen ausgeschnittenen Nukleotids eingebaut und der Bruch wird um eine Nukleotideinheit in der 3'-Richtung verschoben. Diese 3'-Verschiebung wird zu einer sequenziellen Anfügung von neuen markierten Nukleotiden an die DNA unter Entfernung bestehender unmarkierter Nukleotide führen. Das Nicktranslatierte Polynukleotid wird sodann unter Verwendung eines Auftrennungsverfahrens wie Elektrophorese analysiert.
  • Ein weiteres beispielhaftes Fragmentanalyseverfahren basiert auf einer veränderlichen Anzahl an Tandem-Wiederholungen oder VNTRs. VNTRs sind Bereiche von doppelsträngiger DNA, die benachbarte mehrfache Kopien einer bestimmten Sequenz enthalten, wobei die Anzahl an sich wiederholenden Einheiten veränderlich ist. Beispiele für VNTR-Loci sind pYNZ22, pMCT118 und Apo B. Eine Untergruppe von VNTR-Verfahren sind diejenigen Verfahren, die auf dem Nachweis von Mikrosatelliten-Wiederholungen oder kurzen Tandem-Wiederholungen (STRs), d. h. Tandem-Wiederholungen von DNA, charakterisiert durch eine kurze (2–4 Basen) wiederholte Sequenz, basieren. Eine der häufigsten eingestreuten repetitiven DNA-Familien bei Menschen ist die (dC-dA)n--(dG-dT)n-Dinukleotid-Wiederholungsfamilie (auch als (CA)n-Dinukleotid-Wiederholungsfamilie bezeichnet). Man vermutet, dass 50 000 bis 100 000 (CA)n-Wiederholungsregionen in dem menschlichen Genom vorhanden sind, typischerweise mit 15–30 Wiederholungen pro Block. Viele dieser Wiederholungsregionen sind in ihrer Länge polymorph und können daher als geeignete genetische Marker dienen. Vorzugsweise wird in den VNTR- oder STR-Verfahren eine Markierung in die Polynukleotidfragmente durch Verwendung eines farbstoffmarkierten PCR-Primers eingebracht.
  • In einem besonders bevorzugten Fragmentanalyseverfahren werden erfindungsgemäß identifizierte Klassen hinsichtlich ihrer terminalen Nukleotide definiert, so dass eine Übereinstimmung zwischen den vier möglichen terminalen Basen und den Mitgliedern eines Satzes an spektral auflösbaren Farbstoffen erstellt wird. Solche Sätze werden einfach aus den erfindungsgemäßen Farbstoffen durch Messen von Emissions- und Absorptionsbandbreiten mit käuflich verfügbaren Spektrophotometern zusammengestellt. Mehr bevorzugt treten die Klassen im Zusammenhang der chemischen Verfahren oder Ketten-Terminationsverfahren einer DNA-Sequenzierung auf und mehr bevorzugt treten die Klassen im Zusammenhang mit den Ketten-Terminationsverfahren, d. h. der Didesoxy-DNA-Sequenzierung oder Sanger-Typ-Sequenzierung, auf.
  • Eine Sanger-Typ-Sequenzierung umfasst die Synthese eines DNA-Strangs durch eine DNA-Polymerase in vitro unter Verwendung einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen DNA-Matrize, deren Sequenz bestimmt werden soll. Eine Synthese wird an einer definierten Stelle, basierend darauf, wo ein Oligonukleotid-Primer an die Matrize hybridisiert, eingeleitet. Die Synthesereaktion wird durch Einbau eines Nukleotid-Analogons abgebrochen, das keine fortgesetzte DNA-Verlängerung unterstützt, d. h. eines Terminators. Beispiele für Terminatoren umfassen die 2',3'-Didesoxynukleosid-5'-triphosphate (ddNTPs), denen die 3'-OH-Gruppe fehlt, die für eine 3'- zu 5'-DNA-Kettenverlängerung notwendig ist. Wenn richtige Anteile an dNTPs (2'-Desoxynukleosid-5'-triphosphate) und einem der vier ddNTPs verwendet werden, wird eine enzymatisch katalysierte Polymerisation in einer Fraktion der Population von Ketten an jeder Stelle abgebrochen werden, an der das ddNTP eingebaut wird. Wenn markierte Primer oder markierte ddNTPs für jede Reaktion verwendet werden, kann die Sequenzinformation durch Fluoreszenz nach Auftrennung durch hochauflösende Elektrophorese nachgewiesen werden. In dem Ketten-Terminationsverfahren können erfindungsgemäße Farbstoffe an entweder Sequenzier-Primer oder Didesoxynukleotide gebunden werden. Farbstoffe können an ein 5'-Ende eines Primers beispielsweise gemäß der Beschreibung in Fung et al., US-PS 4,757,141 , an die Base eines Primers oder an die Base eines Didesoxynukleotids, beispielsweise über die von Hobbs et al., supra, beschriebenen Alkinylamino-Bindungsgruppen, gebunden werden.
  • Gemische von markierten Polynukleotiden können mit Hilfe eines elektrophoretischen Auftrennverfahrens aufgelöst werden; vgl. z. B. Gould und Matthews, supra, Rickwood und Hames, Hrsg., Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach, IRL Press Limited, London, 1981, Osterman, Methods of Protein and Nucleic Acid Research, Bd. 1, Springer-Verlag, Berlin, 1984 oder US-PSen 5,374,527, 5,624,800 und/oder 5,552,028. Vorzugsweise erfolgt die Elektrophorese mittels Kapillarelektrophorese; vgl. z. B. Capillary Electrophoresis Theory and Practice, Grossman und Colburn, Hrsg., Academic Press (1992). Vorzugsweise ist der Typ einer elektrophoretischen Matrix vernetztes oder unvernetztes Polyacrylamid mit einer Konzentration (Gewicht zu Volumen) von etwa 2–20 Gew.-%. Mehr bevorzugt beträgt die Polyacrylamidkonzentration etwa 4–8%. Vorzugsweise enthält im Zusammenhang mit DNA-Sequenzierung insbesondere die Elektrophoresematrix ein Denaturierungsmittel wie Harnstoff, Formamid und dergleichen. Detaillierte Verfahren zum Herstellen solcher Matrizen sind in Maniatis et al., in Methods in Enzymology 65: 299–305 (1980), Maniatis et al., Biochemistry 14: 3787–3794 (1975), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Seiten 179–185 (1982) und ABI PrismTM 377 DNA Sequencer User's Manual, Rev. A, Januar 1995, Kapitel 2 (p/n 903433, The Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA) beschrieben. Die optimalen Elektrophoresebedingungen wie Polymerkonzentration, pH-Wert, Temperatur, Konzentration von Denaturierungsmittel, die in einer bestimmten Auftrennung eingesetzt werden, hängen von vielen Faktoren ab, einschließlich des Größenbereichs der zu trennenden Nukleinsäuren, deren Basenzusammensetzungen, davon, ob sie einzelsträngig oder doppelsträngig sind, und der Art der Klassen, für die eine Information durch Elektrophorese angestrebt wird. Dementsprechend kann eine Anwendung der Erfindung vorläufige Standardtests erforderlich machen, um Bedingungen für bestimmte Auftrennungen zu optimieren.
  • Alternativ können Gemische von markierten Polynulcleotiden durch Hybridisierung an eine räumlich adressierbare Nukleinsäure-Hybridisierungsanordnung aufgelöst werden. Solche Anordnungen können mit Hilfe eines jeglichen einer Reihe von verschiedenen bekannten Herstellungsverfahren hergestellt werden. Beispiele für Herstellungsverfahren umfassen strahlungsgerichtete in situ-Synthese (vgl. z. B. Fodor et al., US-PS 5,744,305 und verwandte Patente) und Roboter-Fleckenbildungsverfahren (vgl. z. B. Cheung et al., Nature Genetics 21: 15–19 (1999), Brown et al., US-PS 5,807,522 , Cantor, US-PS 5,631,134 ). Wenn Fleckenbildungstechniken verwendet werden, kann die trägergebundene Abfang- Nukleinsäure eine Größe aufweisen, die von einem kurzen Oligonukleotid, z. B. einer Länge von 3 bis 10 Nukleotiden, über ein cDNA-Fragment bis zu einem gesamten Genom reicht. Verfahren, die für eine Durchführung des Hybridisierungsverfahrens verwendet werden, sind bekannt und werden abhängig von der Art der trägergebundenen Abfang-Nukleinsäure und der Nukleinsäure in Lösung variieren (vgl. z. B. Bowtell, Nature Genetics 21: 25–32 (1999), Brown und Botstein, Nature Genetics 21: 33–37 (1999)).
  • Nach einer Auftrennung oder Hybridisierung werden die Farbstoff-Polynukleotidkonjugate vorzugsweise durch Messen der Fluoreszenzemission von den farbstoffmarkierten Polynukleotiden nachgewiesen. Um einen derartigen Nachweis durchzuführen, werden die markierten Polynukleotide in an sich bekannter Weise bestrahlt, wie mit Quecksilberdampflampen mit einer hohen Intensität, Lasern oder dergleichen. Vorzugsweise ist das Bestrahlungsmittel ein Laser mit einem Strahl einer Wellenlänge von über etwa 600 nm. Mehr bevorzugt werden die Farbstoff-Polynukleotide durch Laserstrahlung bestrahlt, die durch einen He-Ne-Gaslaser oder einen Festkörper-Diodenlaser erzeugt wird. Die Fluoreszenz wird sodann durch einen strahlungssensitiven Detektor wie einem Fotomultiplier, einer ladungsgekoppelten Vorrichtung oder dergleichen nachgewiesen. Beispiele für Nachweissysteme sind an anderer Stelle beschrieben (vgl. z. B. US-PSen 5,543,026, 5,274,240, 4,879,012, 5,091,652 und 4,811,218, Guo et al., Nucleic Acids Research 22(24): 5456–5465 (1994), Gette und Kreiner, American Laboratory, März 1997, Seiten 15–17 (1997)).
  • VII. BEISPIELE
  • Die Erfindung wird weiter durch die nachstehenden Beispiele erläutert, die rein beispielhaft für die Erfindung und in keinster Weise begrenzend zu verstehen sind.
  • Beispiel 1
  • Synthese der Verbindungen 62 und 63 (Schema 11)
  • Synthese der Verbindung 62. Eine Lösung von 6-Amino-1-naphthol 61 (8 g, 0,05 mol), Iod (0,5 g, 2 mmol) und Aceton (200 ml) wurde auf 110°C (Ölbad) 18 Stunden erhitzt. Die Reaktion wurde abgestoppt (wässriges Na2S2O3) und mit Hexan : Ethylacetat (9 : 1) extrahiert. Der organische Extrakt wurde gewaschen (Kochsalzlösung), getrocknet (Na2SO4-Pulver) und durch ein kleines Silicagel- Kissen eluiert. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rest wurde mit Hexan : Ethylacetat (3 : 7) chromatographisch aufgetrennt, um die Verbindung 62 (10,63 g, 88,6%) als gelblich-orangen Feststoff zu ergeben. 1H-NMR δ 1,28 (s, 6H), 2,38 (s, 3H), 5,26 (s, 1H), 5,40 (s, 1H), 5,58 (s, 1H), 6,54 (t, 1H), 6,74 (dd, 1H), 7,18 (m, 1H), 7,78 (dd, 1H), 7,96 (t, 1H).
  • Synthese der Verbindung 63. Eine Lösung der Verbindung 62 (4,82 g, 0,02 mol), Pd/C (10%, 0,5 g) und MeOH (30 ml) wurde unter H2 (60 Pfund/in2) in einem Parr-Hydrierapparat 18 Stunden geschüttelt. Nach Filtration des Reaktionsgemisches wurde das Filtrat verdampft und der unbehandelte Rest mit Hexan : Ethylacetat (3 : 7) chromatographisch aufgetrennt, um die Verbindung 63 (4,1 g, 84%) als schwach braunen Feststoff zu ergeben. 1H-NMR δ 1,20 (s, 3H), 1,35 (s, 3H), 1,44 (d, 3H), 1,77 (dd, 1H), 2,08 (1H), 3,48 (sept, 1H), 6,54 (d, 1H), 6,73 (d, 1H), 7,23 (t, 1H), 7,38 (d, 1H), 7,87 (d, 1H).
  • Schema 11
    Figure 00760001
  • Beispiel 2
  • Synthese der Verbindungen 65, 67 und 69 (Schema 12)
  • Synthese des Farbstoffs 65. Eine Lösung der Verbindung 63 (0,3209 g, 1,33 mmol), Trimellithsäureanhydrid (64) (0,1845 g, 0,96 mmol) und Trifluormethansulfonsäure (3 ml) wurde bei 140–145°C unter Argon 3 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde in eine Lösung aus Kochsalzlösung (150 ml) und H2SO4 (5%, 10 ml) geschüttet und mit CH2Cl2 : MeOH (4 : 1) extrahiert. Der organische Extrakt wurde gewaschen (gesättigte Kochsalzlösung) und sodann unter vermindertem Druck verdampft. Der unbehandelte Rest wurde mit CH2Cl2 : MeOH (von 9 : 1 bis 1 : 9) chromatographisch aufgetrennt, um 65 als zwei Isomere zu ergeben.
  • Synthese des Farbstoffs 67. Eine Lösung der Verbindung 63, Dichlortrimellithsäureanhydrid 66 und Trifluormethansulfonsäure wurde umgesetzt und in einer zu der Synthese von Verbindung 65 identischen Weise aufge arbeitet. Das Farbstoffprodukt 67 wurde als zwei Isomere durch Chromatographie mit CH2Cl2 : MeOH isoliert.
  • Synthese des Farbstoffs 69. Eine Lösung der Verbindung 63, Tricarballylsäure 68 und Trifluormethansulfonsäure wurde umgesetzt und in einer zu der Synthese von Verbindung 65 identischen Weise aufgearbeitet. Das Farbstoffprodukt 69 wurde durch Chromatographie mit CH2Cl2 : MeOH isoliert.
  • Schema 12
    Figure 00770001
  • Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung zitiert sind, sind hier durch eine Referenz in dem gleichen Maß umfasst, wie wenn für jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln angegeben wäre, dass sie durch eine Referenz einbezogen ist.

Claims (31)

  1. Verlängerte Rhodaminverbindung mit der Struktur
    Figure 00790001
    worin R1 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe oder R1 zusammen genommen mit R2, Y1 oder Y2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, R2 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe oder R2 zusammen genommen mit R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, R3 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe oder R3 zusammen genommen mit R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1- Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, R4 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe oder R4 zusammen genommen mit R3, Y3 oder Y4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, R5 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe oder R5 zusammen genommen mit R6, Y3 oder Y4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, R6 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe oder R6 zusammen genommen mit R5, R7, Y3 oder Y4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, R7 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe oder R7 zusammen genommen mit R6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, R8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, R9 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe oder R9 zusammen genommen mit R10 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, R10 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe oder R10 zusammen genommen mit R9 oder R11 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, R11 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe oder R11 zusammen genommen mit R10, Y1 oder Y2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, R13 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl, Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe oder R13 zusammen genommen mit Y3 oder Y4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Y1 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, oder Y1 zusammen genommen mit R1, R11 oder Y2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Y2 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, oder Y2 zusammen genommen mit R1, R11 oder Y1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Y3 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, oder Y3 zusammen genommen mit R4, R5, R6, R13 oder Y4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Y4 fehlt oder für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, oder Y4 zusammen genommen mit R4, R5, R6, R13 oder Y3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyleno, Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyleno, Heteroalkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryleno, Aryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryleno und Heteroaryleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, und Z1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -R, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe, mit der Maßgabe, dass, wenn die verlängerte Rhodaminverbindung die Struktur (I) aufweist, a) in dem Fall, dass R1–R6, R8, R10, R11, Y1 und Y3 H sind und R7 und R9 SO3H sind, dann Y2 und Y4 nicht H oder C6H5 sind, b) in dem Fall, dass R1–R7, R9–R11 H sind und R8 C6H5 ist, dann Y1–Y4 nicht H sind und c) in dem Fall, dass R1–R4, R6, R7, R9, R10 H sind, R5 und R11 SO3H sind und R8 p-C6H4Cl ist, dann Y1–Y4 nicht H sind.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, worin Y1 mit R1 oder R11 zusammen genommen wird und C2- oder C3-Alkyleno oder Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, ist oder Y2 mit R1 oder R11 zusammen genommen wird und C2- oder C3-Alkyleno oder Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, ist oder Y3 mit R4 oder R5 oder R6 oder R13 zusammen genommen wird und C2- oder C3-Alkyleno oder Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, ist oder Y4 mit R4 oder R5 oder R6 oder R13 zusammen genommen wird und C2- oder C3-Alkyleno oder Alkyleno, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 2, worin die C2- oder C3-substituierte Alkylenogruppe mit C1- bis C3-Alkylgruppe gem-disubstituiert ist.
  4. Verbindung nach Anspruch 3, worin die C2- oder C3-substituierte Alkylenogruppe mit Methylgruppe gem-disubstituiert ist.
  5. Verbindung nach Anspruch 1, worin R8 Alkyl ist, unabhängig substituiert mit einem oder mehreren Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, -C(O)R und -S(O)2R, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, O-Alkyl, -NH2, N-Alkyl und Verbindungsgruppe.
  6. Verbindung nach Anspruch 1, worin R8 -CF3 ist.
  7. Verbindung nach Anspruch 1, worin R8
    Figure 00870001
    ist, worin Z26 und Z27 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -NC(O)R, R und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe und X1, X2, X3, X4 und X5 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, -Cl, -Br und -F, worin n und m ganze Zahlen sind, die jeweils unabhängig 0 bis 5 betragen.
  8. Verbindung nach Anspruch 7, worin X1 und X2 -H sind.
  9. Verbindung nach Anspruch 7, worin X1, X2, X4 und X5 jeweils -F sind.
  10. Verbindung nach Anspruch 1, worin R8 Aryl oder Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, ist.
  11. Verbindung nach Anspruch 1, worin R8 die Struktur
    Figure 00880001
    aufweist, worin Z21, Z22, Z23, Z24 und Z25 jeweils getrennt voneinander Z1 sind.
  12. Verbindung nach Anspruch 11, worin Z21, Z22, Z23, Z24 und Z25 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -H, Halogen, C1- bis C3-Alkyl, -C(O)OR, -C(O)R, -S(O)2OR, -S(O)2R und -CH2OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  13. Verbindung nach Anspruch 11, worin eine oder mehrere der Gruppen Z21, Z22, Z23, Z24 oder Z25 -Cl oder -F sind.
  14. Verbindung nach Anspruch 11, worin Z21 -C(O)OH ist.
  15. Verbindung nach Anspruch 11, worin Z21 -C(O)OH ist und eine der Gruppen Z23 oder Z24 -C(O)OH ist.
  16. Verbindung nach Anspruch 11, worin Z22 und Z25 jeweils -Cl sind.
  17. Verbindung nach Anspruch 11, worin Z22, Z23, Z24 und Z25 jeweils -F sind.
  18. Verbindung nach Anspruch 11, worin Z21 -S(O)2OH ist und eine der Gruppen Z23 oder Z24 -C(O)OH ist.
  19. Verbindung nach Anspruch 11, worin Z21 -C(O)OR ist und eine der Gruppen Z22, Z23 oder Z24 eine Verbindungsgruppe ist.
  20. Verbindung nach Anspruch 1, worin R8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
    Figure 00890001
    worin LG eine Verbindungsgruppe ist.
  21. Verbindung nach Anspruch 1, worin mindestens eine der Gruppen Y1, Y2, Y3 oder Y4 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Aryl und Arylalkyl.
  22. Verbindung nach Anspruch 1, worin eine oder mehrere der Gruppen R1, R4, R5, R6, R7, R9, R10, R11 und R13 jeweils unabhängig -S(O)2OH sind.
  23. Verbindung nach Anspruch 1, worin eine oder mehrere der Gruppen R1, R4, R5, R6, R7, R9, R10, R11 und R13 jeweils unabhängig -F oder -Cl sind.
  24. Verbindung nach Anspruch 1, worin eine oder mehrere der Gruppen R1, R4, R5, R6, R7, R9, R10, R11 und R13 jeweils unabhängig Aryl oder Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, sind.
  25. Verbindung nach Anspruch 1 mit der Struktur
    Figure 00900001
    worin R8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
    Figure 00900002
    worin LG eine Verbindungsgruppe ist.
  26. Verbindung nach Anspruch 1 mit der Struktur
    Figure 00900003
    worin R8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
    Figure 00910001
    worin LG eine Verbindungsgruppe ist.
  27. Verbindung nach Anspruch 1 mit der Struktur
    Figure 00910002
    worin R8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
    Figure 00910003
    Figure 00920001
    worin LG eine Verbindungsgruppe ist.
  28. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 27, worin die Verbindungsgruppe ein N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester ist.
  29. Verbindungen, die für die Synthese von verlängerten Rhodaminverbindungen geeignet sind, mit den Strukturen
    Figure 00920002
    worin Y1 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, und Z1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -R, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  30. Verbindungen, die für die Synthese von verlängerten Rhodaminverbindungen geeignet sind, mit den Strukturen:
    Figure 00930001
    worin Y1 für sich genommen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Alkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroalkyl, Heteroalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Aryl, Aryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroaryl, Heteroaryl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Arylalkyl, Arylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, Heteroarylalkyl und Heteroarylalkyl, unabhängig substituiert mit einer oder mehreren Z1-Gruppen, und Z1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -R, Halogen, -OS(O)2OR, -S(O)2OR, -S(O)2R, -S(O)2NR, -S(O)R, -OP(O)O2RR, -P(O)O2RR, -C(O)OR, -NRR, -NRRR, -NC(O)R, -C(O)R, -C(O)NRR, -CN, -O und -OR, worin R unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -H, Alkyl, Heteroalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl und Verbindungsgruppe.
  31. Verbindungen nach Anspruch 30 mit den Strukturen:
    Figure 00940001
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