JP2002525072A - 多重シーケンス法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸の比較的短い部分に対するラン−オフシケーンス反応を使用した核酸の同定方法を提供する。本方法は、たとえば、ESTの小片のみからESTを同定するために利用でき、またヌクレオチドの多型性の解析に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【背景】

発明の分野 本発明は、核酸の比較的短い部分に対するラン−オフシケーンス反応を使用し
た核酸の同定方法を提供する。本方法は、たとえば、ESTの部分のみからESTを同
定するために利用でき、またヌクレオチドの多型性の解析に利用することができ
る。前記反応は、データの読み出し能力を増大するために多重化することができ
る。

【０００２】 発明の背景 DNAシーケンスの解析効率を増大するためのいくつかの方法が開発されてきた
。これらには、１）スペクトルが重複しない一連のターミネーター及び／又はダ
イプライマーの染色剤をDNAシーケンスレーンに多重化する方法、２）ゲノムシ
ーケンス反応物をフィルターに転写し、その後にハイブリダイゼーションを行う
方法、３）3つまたは4つのシーケンス反応が行われるレーンにローディングを多
重化する方法が含まれる。これらの方法は、主に長く（新規に数百塩基以上）読
むことが望まれる場合に適用されてきた。

【０００３】 本発明は、同じレーンで多重的に短い配列を読む（およそ16塩基）ための簡単
な方法の開発である。我々がこの方法を適用する用途は、我々のハイスループッ
ト酵母ツーハイブリット解析（Buckholz, Stuart, Judelson and Weiner）であ
る。この解析で、我々は相互作用タンパク質の短い領域をシーケンスすることを
望み、そして、ヒットした同定物を決定するために大規模なデータベースを使用
することを望む。解析したベイトのそれぞれに、ほぼ100ヒット発生するため、
我々は解析の効率を増加する方法の開発を必要とした。

【０００４】

【発明の詳細な記載】

我々は、一連の多重DNA塩基の呼び出し（basa-calling）のために、ヌクレオ
チド塩基呼び出し装置（たとえばポリアクリルアミド電気泳動、又はキャピラリ
ー電気泳動）に繰り返しローディングして使用する方法を開発した。一例では、
ラン−オフシーケンス反応を使用して、エンドヌクレアーゼ認識部位から下流の
塩基をシーケンスする。この方法では、認識部位の外側のヌクレオチドがDNAの
制限断片に含まれるように、そして短いランでラン−オフシーケンス反応がシー
ケンスされるように、選択されるエンドヌクレアーゼは、その認識部位の数塩基
下流を切断するものである。短いシーケンス反応物は、30以下の塩基数、たとえ
ば30塩基、25塩基、20塩基、19塩基、18塩基、17塩基、16、15、14、13、12、11
、10、9、8、7、6、又は5塩基のものであってよい。たとえば、我々が「BpmIシ
ーケンス」と呼ぶ特殊例では、タイプIISエンドヌクレアーゼのBpmI認識部位の
下流16塩基をシーケンスするために、ラン−オフシーケンス反応が行われる。

【０００５】 この方法のために、ライブラリーは、該ライブラリーのインサートが、ライブ
ラリーベクター内で、選択された酵素（酵素はその認識部位の下流を切断する酵
素）の認識部位と非常に近接して位置し、該インサートが該インサート内で前記
酵素によって切断されるように構築される。たとえば、ライブラリーは、選択さ
れた酵素の認識部位を提供するリンカーに連結されたインサートから構築するこ
とができる。その他の例では、ライブラリーが構築されるベクターは、ラン−オ
フシーケンス反応のテンプレートを作るために使用されるように、そのマルチク
ローニングサイト内に選択されたエンドヌクレアーゼの認識部位を含むことがで
きる。また、ライブラリーのインサートは、該インサートが選択された酵素によ
って切断されるように、選択された酵素の認識部位に十分近接してクローン化す
ることができる。さらに、制限反応及びシーケンス反応の前に、単離されたライ
ブラリーのサブクローンを増幅させるようにプライマーを設計して、選択された
エンドヌクレアーゼの制限認識部位が増幅された領域に保持されるようにするこ
ともできる。

【０００６】 本発明の利点の一つは、シーケンス反応が短い配列を生じるので、この反応を
解析装置上で多重化できることである。しかし、決定された配列は、配列のデー
タベースと比較し、単離された核酸を同定するためには十分である。従って、た
とえば、二、三、四、又はそれ以上の配列を解析装置上に連続して流すことがで
き、データを得るための時間と費用を著しく低減することを可能にする。

【０００７】 この方法の一つの有用性は、シーケンスされたcDNA配列をcDNAデータベース、
たとえばGenBankと比較することにある。このような包括的なcDNAデータベース
が与えられれば、ESTのほんの小片の解析からESTの同定を決定することが可能に
なる。我々はこの技術を、既知の融合ベイトタンパク質と発現されたcDNAライブ
ラリーの相互作用をテストする酵母ツーハイブリット(Y2H)において、タンパク
質タンパク質相互作用の解析に適用している。BpmIシーケンス法をテストするた
めに、我々は、BpmI制限エンドヌクレアーゼの認識部位を取り込んだアダプター
を使用して、酵母ツーハイブリットcDNAベクター内にマクロファージcDNAをラン
ダムに入れてクローン化した。クローンをライブラリーから単離し、BpmIをシー
ケンスした後の正確な遺伝子の呼び出し(call)をテストした。クローニング部位
に隣接したDNAの、ほんの短い領域のシーケンシングによって、DNAシーケンス反
応を多重化することができ、それによって多くの解析法で遺伝子読み出し能力を
増大する。

【０００８】 本発明の有用性の他の例は、SNP解析に対して適用される多重シーケンスラン
での使用であり、興味のある領域の、短いPCR産物を同じウェル/キャピラリーチ
ューブに繰りかえしローディングし、連続して解析する使用である。

【０００９】 ラン−オフDNAシーケンスのための本方法は、単一ゲルのシーケンス能力を数
倍に増加するために使用できる。たとえば、ラン−オフDNAシーケンスのためのB
pmI法は、単一ゲルのシーケンス能力を少なくとも4倍増加するために使用できる
。クローンの一端から16塩基対の解読は、多くのクローンを正確に同定するため
に使用できる。サンプル探索ソフトウエア、並びに順向き及び逆向きのBLASTの
結果を合併する手段などのバイオインフォーマティクス的手法の実施において、
この方法論はハイスループットな環境でY2Hを支援することに使用できる。

【００１０】 シーケンシングのための核酸サンプルを切断するために利用される酵素は、そ
の認識部位の少なくとも1塩基下流を切断する酵素であり、そのためラン−オフ
シーケンスを行うと、該酵素による制限部位までの、ライブラリーのインサート
のヌクレオチド配列を含む核酸データを提示する。従って、該酵素は制限エンド
ヌクレアーゼでもよい。さらにここで例示された、酵素認識部位の16塩基下流を
切断するBpmIに加え、他の非パリンドロームエンドヌクレアーゼ、たとえばBsgI
（16/14）及びEco57I（16/14）は、ラン−オフシーケンスのためのリンカーの設
計に容易に使用できる。さらなる例として、BcgI、FokI、又はさらに長い解読が
可能であろうその他の酵素、MmeI（20/18）が利用できるであろう。前記酵素は
、特定の目的のために望ましい配列データの塩基数を考慮して選択することがで
きる。

【００１１】 本技術はさらに最適化することができる。クローニング部位のより近くを解読
するためにシーケンスプライマーを再設計することは、さらに短いシーケンスの
解読を可能とし、ゲルの多重化能を増大するであろう。さらに、ABI377XLのより
長いラン時間には利点があるであろう。さらに、ABI310のようなサンプルのロー
ディングが自動化された特徴を持つシステムが利用できる。

【００１２】 解析は、望まれるあらゆる方法で行ってよい。たとえば、ゲル電気泳動の解析
、キャピラリー装置での解析、又はマススペクトロメトリーによる解析を行うこ
とができる。

【００１３】 また、シーケンス反応の多重解析を行うためのキットであって、：選択された
酵素の認識部位の少なくとも1塩基下流を切断する酵素；及び選択された酵素の
認識部位を含むオリゴヌクレオチドのセットを含むキットも提供される。たとえ
ば、酵素はBpmI、BsgI、Eco57、もしくはMmeI、又はその組み合わせでよい。該
キットはさらに、たとえばライブラリーを構築するためのベクターであって、た
とえば、本方法での使用に適したクローニング部位を持つベクターを含んでいて
よい。該キットはさらに、使用される解析方法によって、選択されたシーケンス
反応産物の多重化を容易にする成分を含んでいてよい。

【００１４】

【実施例】

cDNAライブラリーの構築 ポリアデニル化RNAを、FastTrack2.0(Invitrogen, San Diego, CA)を使用して
5×107THP1細胞から単離した。ランダムオリゴーマープライマーによるcDNAライ
ブラリーは、Copy Kit(Invitrogen)を使用して、5μgのポリAで選択されたmRNA
から構築した。長さが900塩基の産物の合成を増産するために、大腸菌DNAライゲ
ースを第二鎖の合成反応から除去した。次に、BpmIリンカー (5’ -AATTCGGCTCG
AGCTGGAG- 3’及び5’ -CTCCAGCTCGAGCCG- 3’)を、T4 DNAライゲースを使用し
て、平滑末端化されたcDNA断片の末端に付加した。リンカーの付加後、断片をリ
ン酸化し（T4 DNAリン酸化酵素）、Chromaspin400カラム(clontech, Palo Alta,
CA)を使用してサイズ分画した。クローニングベクターpYesTrp2(Invitrogen)は
、制限エンドヌクレアーゼEcoRIを使用して37℃で消化した。ゲルで精製する前
に、一本鎖化されたベクターを、エビアルカリフォスファターゼ（SAP, Boehrin
ger Mannheum）で脱リン酸化した。cDNAインサートと、処置されて一本鎖化され
たベクターDNAをクローニングベクターにライゲーションし、ライゲーション産
物をエレクトロマックスDH10Bコンピテント細胞（LIfe Technologies Inc., Gai
thersburg, MD）に形質導入した。コロニーは、アンピシリンを含むLBアガープ
レートで選択した。

【００１５】 BpmIシーケンシング プラスミドDNAはR.E.A.L.prep(Qiagen, Valencia, CA)を使用して単離した。1
μgのプラスミドDNAを、2UのBpmI（New England Biolabs, Beverly, MA）で少な
くとも2時間37℃で消化した。反応物を、酢酸カリウムとエタノールで沈殿し、3
K RPMでSorvall RC3B 遠心ローターにより30分間ペレットにした。シーケンス
反応の前に、上清を捨て、ペレットを70％エタノールで洗って乾燥した。標準的
な条件を使用し、500ngの消化したDNAを、3.2pMのプライマーpYesTripFまたはpY
esTripR(Invitrogen)、及びBig Dye Terminators(PE Biosystems, Foster City,
CA)を使用したサイクルシーケンシングを行った。過剰のプライマーとヌクレオ
チドは、ゲル濾過遠心を使用して除去した。産物は、製造者によって示された条
件下で、ABI337又はABI310自動シーケンサーのいずれかで解析し、GenBankデー
タベースに対しするBLAST解析の目的に用いた（表1）。

【００１６】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 未処理及びBpmI処理のシーケンス反応。詳細は本文を参照。

【図１Ｂ】 未処理及びBpmI処理のシーケンス反応。詳細は本文を参照。

【図２】 ローディング時間の機能による分離。BpmI処置したPCR断片を、第一のローデ
ィング後、示した時間に1、2、及び3回ローディングして、ABI3777でシーケンス
し、多重化した。

【図３Ａ】 シーケンスゲルの多重ローディング。なお、このクロマトグラムは、示したゲ
ルからのレーンではない。

【図３Ｂ】 一本の多重化レーンのクロマトグラム。なお、このクロマトグラムは、示した
ゲルからのレーンではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓ ｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇ ｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａ ｉｎ (72)発明者 バーンズ、ダニエル・キース アメリカ合衆国、ノース・カロライナ州 27709 リサーチ・トライアングル・パー ク、ピー・オー・ボックス 13398、ファ イブ・ムーア・ドライブ、グラクソ・ウェ ルカム・インコーポレイテッド内（番地な し) (72)発明者 ウェイナー、マイケル・フィリップ アメリカ合衆国、ノース・カロライナ州 27709 リサーチ・トライアングル・パー ク、ピー・オー・ボックス 13398、ファ イブ・ムーア・ドライブ、グラクソ・ウェ ルカム・インコーポレイテッド内（番地な し) Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA04 EA04 HA09 HA19 4B063 QA13 QQ42 QR08 QR14 QR33 QR35 QR59 QR62 QS05 QS16 QS26 QS36 QX02 【要約の続き】

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シーケンスゲルの同じレーンに連続してローディングされた
   一連の二以上の短いシーケンス反応産物に対してゲル又はキャピラリーで電気泳
   動を行うことを含み、第一のシーケンス反応産物は最初のローディング時にロー
   ディングされ、第二の短いシーケンス反応産物は第二のローディング時にローデ
   ィングされる核酸を同定する方法であって、前記第一のローディング時及び前記
   第二のローディング時が、前記第一のシーケンス反応産物と前記第二のシーケン
   ス反応産物を電気泳動で分離するために十分な時間だけ離されている方法。
2. 【請求項２】 請求項1に記載の方法であって、前記シーケンス反応産物が
   、SNP（一塩基多型）を含む領域から産生される方法。
3. 【請求項３】 請求項1に記載の方法であって、前記シーケンス反応産物が
   、EST（発現シーケンスタグ）を含む領域から産生される方法。
4. 【請求項４】 請求項1に記載の方法であって、前記短いシーケンス反応産
   物の長さが、約20塩基以下である方法。
5. 【請求項５】 請求項1に記載の方法であって、前記短いシーケンス反応産
   物が、ラン−オフシーケンス反応産物である方法。
6. 【請求項６】 核酸の選択された部分のヌクレオチド配列を決定する方法で
   あって、 a) 認識部位の少なくとも1塩基下流を切断する選択された酵素の認識部位を含
   む核酸ライブラリーから核酸を単離し、前記認識部位がは前記ライブラリーのイ
   ンサートの1塩基に位置することと； b) 前記核酸を増幅すること； c) 該増幅された核酸を選択された酵素で消化すること； d) 前記認識部位またはその上流で増幅された断片領域とハイブリダイズする
   プライマーを使用してラン−オフシーケンス反応を行い、第一のシーケンス反応
   生成物を形成すること；及び e) 前記第一のシーケンス反応産物を解析すること を含む方法。
7. 【請求項７】 請求項6に記載の方法であって、第二のシーケンス反応産物
   が前記第一のシーケンス反応産物と同じ解析ラン(run)で連続して解析される方
   法。
8. 【請求項８】 請求項6に記載の方法であって、前記選択された酵素が制限
   酵素である方法。
9. 【請求項９】 請求項8に記載の方法であって、前記選択された制限酵素がB
   pmIである方法。
10. 【請求項１０】 請求項6に記載の方法であって、前記行われた解析がゲル
    電位泳動である方法。
11. 【請求項１１】 請求項6に記載の方法であって、前記行われた解析がキャ
    ピラリー装置による方法。
12. 【請求項１２】 請求項6に記載の方法であって、前記行われた解析がマス
    スペクトロフォトメトリーである方法。
13. 【請求項１３】 シーケンス反応の多重解析を行うためのキットであって、 a) 選択された酵素の認識部位の少なくとも1塩基下流を切断する酵素、；及び b) 選択された酵素の認識部位を含むオリゴヌクレオチドリンカーのセット、
    を含むキット。