KR20040092013A

KR20040092013A - 유전자의 발현양상 분석방법

Info

Publication number: KR20040092013A
Application number: KR1020030025820A
Authority: KR
Inventors: 박한오; 이주원; 이수의; 서신원; 최영철
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2003-04-23
Filing date: 2003-04-23
Publication date: 2004-11-03

Abstract

본 발명은 각 조직에서 추출된 mRNA를 cDNA화 하여 각 조직에서의 유전자의 발현양상을 모든 mRNA를 대상으로하여 상대적으로 비교, 분석하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 각 조직에서 추출한 mRNA를 cDNA로 전환하여 이를 선택적으로 증폭하여 서로 다른 각 조직의 유전자의 염기서열에 대한 정보 없이도 각 조직의 유전자의 발현 양상을 전사체(Transcriptome) 수준에서 상대적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.

Description

유전자의 발현양상 분석방법{Gene Expression Profile Analyzing Method by Differential Analysis of Restriction Fragment Array}

본 발명은 두 개의 조직 또는 세포에서 추출된 mRNA를 cDNA화 하여 각 조직에서의 유전자의 발현양상을 모든 mRNA를 대상으로 분석하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 두 개의 조직 또는 세포에서 추출한 mRNA를 cDNA로 전환하여 이를 선택적으로 증폭하여 서로 다른 각 조직 또는 세포내의 유전자에 대한 어떠한 염기서열 정보 없이도 유전자의 발현 양상을 모든 mRNA를 대상으로 분석하는 방법에 관한 것이다.

분자 생물학 실험 기법의 발달은 새로운 개념의 접근 방법을 만들어 내었고, 이는 실제 밝혀지고 있는 유전체 정보와 더불어 상보적인 정보들을 제공하고 있다. 이른바 HTS(High Throughput Screening)라 명명되는 대량 실험 방법은 기존의 하나하나 밝혀내던 분자 생물학적인 접근 방법과는 달리 전체적인 관점에서 시스템적 해석방법을 요구하고 있다.

세포 내의 central dogma중, 세포 내 전체 RNA발현 정도를 관찰할 수 있는 DNA Micro Array, 전체 단백질 발현 정도를 관찰할 수 있는 단백질체학

(proteomics)은 실제 대량의 분석 데이터를 얻어낼 수 있고, 그 해석방법은 그 하나하나의 유전자 발현, 단백질 발현을 알아낸다고 하기보다는 전체적인 관점에서 모든 유전자, 단백질의 패턴이 어떻게 변화하느냐를 관찰하는 것이다. 최근 DNA Micro Array에 2만개 정도의 cDNA를 올려놓을 수 있고 단백질체학(proteomics)에서는 만 개 이상의 스팟(spot)을 관찰할 수 있기에 이들 많은 데이터들이 세포 주기(Cell Cycle), 약물 치료 변화, 병세 변화 등 외부 환경에 어떻게 변화하는지의 패턴을 연구하게 되면 클러스터링(clustering)방법 등을 통해서, 이로부터 유전적 네트워크(Genetic Network), 대사경로(Metabolic Pathway), 신호전달(Signal Transduction) 등의 정보들을 뽑아낼 수 있다.

인간 게놈(Human Genome)의 약 2/3는 유전자와는 상관없는 외인성DNA(extragenic DNA)가 차지하고 있고, 나머지 1/3도 90% 정도는 비해독성DNA(noncoding DNA)로 이루어져 있다. 따라서 인간 게놈의 3% 정도 만이 단백질 코딩에 쓰이는 엑손(exon)에 해당되는 것으로 추정된다. 인간 게놈 프로젝트(Human Genome Project)가 완성되어 기능 유전체학(Functional Genomics)의 관점에서 일차적인 관심은 엑손(exon) 부위를 찾는 일이라 할 것이다.

이의 방법으로는 Exon-Trapping 과 EST(Expression Sequencing Taq)가 있다. 세포 또는 유기체의 유전자 발현 양상은 생물학적 특성을 규정하는 기본적이고 중요한 요소이므로, 발현되는 유전자에 관한 정보는 일차적인 관심사이다.

전형적인 내부 엑손(internal exon)은 대개 20 - 200 bp정도 (평균130bp)로 비교적 작으며 5'쪽으로는 3'splice 부위 즉, splice acceptor에 접해 있고, 3' 쪽으로는 5'splice부위 즉, splice donor에 접해 있다. 상기 Exon Trapping(a rapid approach for screening large stretches of cloned DNA for expressed sequences)은 Buckler et al(1991)에 의해 개발 되었고, Church et al(1994)에 의해 변경된 분자 생물학적 실험법이다. 이는 엑손 부위를 찾는 기법으로, 먼저 게놈 DNA(Genomic DNA)를 제한효소로 절단한 단편을 trapping 벡터에 subcloning한 후 Cos-7과 같은 포유동물 세포에 형질도입(transfection)시킨다. 여기에서 trapping벡터는 잘 알려진 유전자의 두 엑손 사이에 multi cloning site(MCS)를 갖고 있는 구조이다. 따라서, 내부 유전자(internal gene)가 포함된 DNA단편이 MCS에 들어 있을 경우 RNA Splicing 이 일어나서 알려진 유전자의 두 엑손 사이에 새로이 클로닝된 엑손이 연결된 Hybrid mRNA가 만들어진다. 이때 알려진 두 엑손이 미지의 엑손과 접한 부위의 서열을 프라이머로 써서 역전사 PCR(RT PCR)을 수행하면 미지의 엑손 만을 증폭할 수 있고 이를 다른 플라스미드에 클로닝하면 엑손 클론 만을 얻을 수가 있다.

한편, 원핵 세포의 경우 게놈의 대부분이 단백질이나 기능성 RNA를 암호화하는 기능적 염기 서열들로 구성되어 있으므로 게놈의 염기서열만 있으면 유전자 암호화 부위를 유추할 수 있다. 반면, 진핵세포의 경우 RNA Splicing 에 의해 엑손(exon)사이에 인트론(intron)이 삽입되어 있으므로 게놈 염기서열들로부터 유전자의 기능적 부위를 확인하기 위해서는 다른 접근법이 요구되며, 그 대안들 중 하나가 EST이다. 이는 특정 조직으로부터 유래한 전체 cDNA로부터 염기서열 분석을 통해 mRNA 해독서열(mRNA coding sequence)을 규명하고 이를 데이터베이스화한 것이다. 이는 최근 인간 게놈 프로젝트가 완성됨으로써 발현 게놈 부위(Expressed Genome Region)와 비발현 게놈 부위(Non-Expressed Genome Region)를 구분하는데 유용하게 이용되었다. 이 EST는 엑손(exon)을 대변하는 것이므로 상기 Exon-trapping 처럼 유전자 기능 분석에 필요한 핵심적 DNA염기서열을 제공하는 과정에 해당된다. 또한 EST는 대개 cDNA library를 무작위적으로 screening 하거나 또는cDNA library를 기능적으로 분류하여 추출한 클론 들을 선별적으로 확인하여 얻어지는데, 후자의 경우 특정한 세포 기능과 관련하여 발현 변화가 일어나는 EST들을 염기서열로 확인하였을 때 그 중에 포함된 이미 알려진 유전자들의 공통적인 기능적 특성을 바탕으로 하여 이들과 같은 부류로 분류된 신규 유전자들의 기능을 유추할 수 있다는 장점이 있다. 또한 DNA micro array에 심을 유전자원으로써도 중요한 의미를 지니며, 대량 염기서열 기능분석(Large Scale Sequencing)에 필수적인요소라 할 수 있다. 상기 방법에 의해 찾은 엑손(exon)은 유전자 발현 양상에 기초한 기능 분석 방법인 Northern Blot, Western Blot, Reverse Northern Hybridization(DNA Micro Array), RNA Protection Assay, Reverse Transcription PCR, In Situ Hybridization 및 ImmunoHistoChemistry으로 분석할 수 있다. 또한, 유전자 구조 및 발현 양상의 비교분석에 기초한 기능 분석 방법에는 Differential Display Polymerase Chain Reaction(DD PCR), Representative Difference Analysis(RDA), Serial Analysis of Gene Expression(SAGE), 및 DNA micro Array 등이 있다.

상기 방법들에 있어서, DD PCR(Differential Display Polymerase Chain Reaction)은 서로 다른 시스템에서 발현이 유도된 mRNA를 역전사한 후 임의의 프라이머를 이용하여 PCR반응으로 증폭하고, 젤 전기영동을 통하여 분획한 다음 그 결과를 비교하여, 두 시스템에서의 발현양상이 다른 유전자들을 동정해 내는 분자 생물학적 실험 방법이다. DD-PCR은 두 시스템에서 다르게 발현되는 유전자들을 클로닝하는 목적으로 많이 이용되어 왔으나, 세포에 어떤 유전자를 발현시켰을 때 유전학적으로 이보다 downstream에서 작용하는 유전자들을 확인함으로써, 원래 유전자의 기능을 파악하는 목적으로도 활용된다. 이는 매우 적은 샘플 RNA농도로도 수행이 가능하고 상대적으로 저렴한 방법으로 간단히 이용할 수 있는 기술로 많이 애용되어 왔으나, 위양성이 높고, 부분적인 발현유전자의 것만 표현할 수 있고 결과 데이터가 정량적이라기 보다는 정성적이며, Microarray나 SAGE데이터에 비해 에러확률이 좀 높은 문제점이 있다.

한편, Serial Analysis of Gene Expression(SAGE)은 유전자 발현산물인 Transcript의 모든 염기서열을 결정하는 대신, 각 transcript에서 이를 대표하는 일부의 염기서열만을 확인함으로써 특정세포나 조직에서 발현되는 유전자의 종류와 출현빈도를 알 수 있는 고용량(High Throughput) 분자 생물학적 실험 방법이다. 이는 발현된 transcript를 대표하는 sequence tag (10-14bp)의 작출, sequence tag이 결합된 concatamer 작출 및 concatamer의 염기서열 결정과 데이터 분석의 방법으로 수행된다. 본 방법에 의해 유전자 출현빈도가 cDNA library에서의 출현빈도와 상관 관계가 있다는 것이 실험적으로 검증되었는데, 최근 Polyak등은 본 기법을 이용하여 P⁵³-induced Apoptosis에 관여하는 일련의 유전자를 성공적으로 규명한 바 있다. SAGE는 어떤 유전자의 발현에 따르는 downstream 유전자군의 분석을 가능케 하여 본래 유전자의 기능을 유추할 수 있게 할 뿐만 아니라, 미지의 downstream 유전자들을 대량 분리하는 수단으로도 쓰일 수 있다. 여기서 얻게 되는 10 - 14bp의 서열은 거의 유전자 특이적이다고 할 수 있다. 4¹⁰이 백만이므로, 인간 유전자가 많아야 10⁴임을 고려한다면 그럴 만도 하다. 다만, 워낙 짧은 서열이기 때문에 서열의 정확도가 중요한데 한 문자의 base calling error는 200 bp의 cDNA의 10% base calling error에 비해 현저하게 전사 동정의 오류(transcript misidentification)가 발생할 확률이 높다. 그리고 각 tag를 동정(identification)하기 위해서는 데이터베이스 내에 해당 서열이 있어야 하는 단점이 있다.

한편, 상기 방법 중 DNA칩(DNA chip)은 유리, 실리콘 혹은 나일론 등의 재질로 된 작은 기판 위에 DNA 생물 분자들을 결합시켜 유전자 발현 양상, 유전자 결함, 반응 양상 등을 분석해낼 수 있는 생물학적 마이크로칩(biological microchip)을 말한다.

이러한 DNA칩은 과학 기술 연구와 신약개발 프로세스, 임상진단 등의 분야에 혁신적 변화를 일으킬 것으로 주목 받고 있다. DNA칩은 만드는 방식에 따라 보통 500~5000개의 염기로 이루어진, 미리 준비한 cDNA(complementary DNA:mRNA에 상보적인 DNA)를 유리와 같은 고체 표면에 붙이고 여기에 붙는 mRNA(단백질 합성의 틀이 되는 핵산)를 분석하는 형태의 칩이다. 고밀도로 DNA를 기판에 집적하는 기술이 지속적으로 개발되고 있는데 잉크젯이나 버블젯 프린터의 기술을 응용한 방법이 사용되고 있다. 또 다른 방식은 20~80개의 염기로 이루어진 올리고뉴클레오타이드나 펩타이드 핵산을 염기 하나씩 합성해 붙이는 방법으로 96년 미국의 Affymetrix사에 의해 상업화 되었다. 최근 이를 획기적으로 개선한 DNA칩 제조기술이 미국 위스콘신대학 나노테크놀로지 센터(Nanotechnology Center)에서 개발됐다. 이 칩은 합성시간이 12 - 24시간 이내이며 약 5만개의 유전자를 하나의 칩에서 분석할 수 있어 기존 Affymetrix사의 GeneChip시스템보다 훨씬 경제적인 것으로 나타났다. 하지만, 상기 유전자 칩 기술 또한 각 tag를 동정(identification)하기 위해서는 데이터베이스 내에 해당 서열이 있어야 하는 단점이 있다.

이에 각 조직에서 추출한 mRNA를 cDNA로 전환하여 이를 선택적으로 정확하게 증폭하여 서로 다른 각 조직에서의 유전자에 대한 어떠한 염기서열에 대한 정보 없이도 유전자의 발현 양상을 전사체(Transcriptome) 수준에서 분석하는 방법을완성하게 되었다.

따라서, 고등생물체의 각 조직에서 특이적인 유전자 발현양상을 비교할 수 있는 방법 뿐 아니라 세포 주기(Cell Cycle), 약물 치료 변화, 병세 변화 등 외부 환경에 대한 변화 패턴을 연구하는 클러스터링(clustering)방법 등을 통해 유전적 네트워크(Genetic Network), 대사경로(Metabolic Pathway), 신호전달(Signal Transduction) 등의 정보들을 획득할 수 있는 정확한 방법을 제공할 수 있게 되었다.

이에 본 발명의 목적은 각각의 조직 또는 세포에서 추출된 mRNA를 cDNA화 하여 각각의 조직 또는 세포간의 유전자의 발현양상을 모든 mRNA를 대상으로 상대적으로 비교, 분석하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 목적은 세포 주기(Cell Cycle), 약물 치료 변화, 병세 변화 등 외부 환경에 대한 변화패턴을 연구하는 clustering방법 등을 통해 유전적 네트워크(Genetic Network), 대사경로(Metabolic Pathway), 신호전달(Signal Transduction) 등의 정보들을 획득할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 인체(Human)의 비장(spleen) 및 소장(small intestine)의 두 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자 탐색을 하기 위해 본 발명의 수행한 결과를 도시한 것이다. 여기에서, No.1 및 No.2 밴드는 비장 특이적 단편(spleen specific fragment)을, No.3 및 No.4 밴드는 소장 특이적 단편(small intestine specific fragment) 에 대한 조직 특이적 발현 결과를 나타낸 도이다.

도 2는 인체(Human)의 비장(spleen) 및 소장(small intestine)의 두 조직에서 특이적으로 발현되는 각각의 up-regulated 유전자에 대한 real-time PCR 분석 결과, 상대 발현량을 2차 검증한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 각각의 조직 또는 세포에서 추출된 mRNA를 cDNA화 하여 각각의 조직 또는 세포 간의 유전자의 발현양상을 모든 mRNA를 대상으로 하여 상대적으로 분석하는 방법으로서, 보다 상세하게는 각 조직에서 추출한 mRNA를 cDNA로 전환하여 이를 선택적으로 증폭하여 서로 다른 조직 간의 유전자에 대한 어떠한 염기서열 정보 없이도 유전자의 발현 양상을 전사체(Transcriptome) 수준에서 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명은 공지되어 있는 cDNA 제작방법을 사용하여 조직 샘플로부터 정제된 mRNA를 쌍가닥 cDNA로 전환하여 이들을 증폭한 후 제한효소를 사용하여 cDNA들을 단일 가닥의 점착성 말단을 갖는 수 개의 절편들로 자르는 단계 및 이와는 독립적으로, 이러한 DNA절편의 단일 가닥의 점착성 말단과 상보적으로 결합할 수 있는 단일 가닥의 점착성 말단과 머리핀 고리 부분으로 이루어진 어댑터를 준비하는 단계; 상기의 DNA절편과 상기 머리핀 고리 구조를 갖는 어댑터를 DNA 리가아제를 사용하여 결합시키는 단계; 상기 DNA 리가아제에 의한 결합 반응에 참여하지 않은 DNA 절편 및 머리핀 고리 구조를 갖는 어댑터를 엑소뉴클레아제를 사용하여 제거하는 단계; 선택적 단계로서, 알칼리 용액, RNA 분해효소(RNase) 또는 단일 가닥 선택성 엔도뉴클레아제를 사용하여 머리핀 구조를 제거하는 단계; 상기 어댑터의 머리핀 고리 부분만의 제거 이후에 잔류하는 부위에 상보적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 DNA절편들을 증폭하는 단계; 상기 증폭된 산물을 젤 상에서 분리하는 단계; 및 각 세포에서 발현되는 유전자의 발현양상을 상대적으로 비교하는 단계를 포함하는 유전자의 발현양상을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 세포는 포유동물의 조직세포, 식물조직세포, 포유동물의 장기세포, 암세포, 돌연변이세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.

상기 방법에서 머리핀 어댑터 세트의 배열은 예를 들어, 7행이 CG이고 3열이 AG인 경우에 단일 가닥 점착성 말단 부위가 CG의 서열을 갖는 어댑터와 단일 가닥 점착성 말단 부위가 AG의 서열을 갖는 어댑터로 해당 반응웰에 혼합시켜 넣는다. 단일 가닥 점착성 말단을 구성하는 염기의 개수가 2 개인 경우에는 이때 필요로 하는 반응웰의 개수는 112개가 된다. 만약, 단일 가닥 말단 부위를 구성하는 염기의 개수가 N 이라면, 머리핀 고리 어댑터의 종류는 (4²ⁿ- 2 x 4ⁿ)/2가지가 된다. 또한 DNA 절편의 5', 3' 말단과 어댑터의 5', 3'말단이 상보적으로 결합하는 것들이어야 한다. 위에서 기술한 바와 같이, 각 어댑터들을 반응웰에 분배한 다음에 제한효소로 절단된 DNA 절편들을 각 시험관들에 대해 적당량씩 혼합한다. 이에 대한 자세한 방법이 본 출원인에 의한 한국특허출원 제10-2001-0025637호에 상세히 기재되어 있다.

그 다음 라이게이션 반응을 진행시킨다. 라이게이션 반응이 완료되면, 결합반응에 참여하지 않은 DNA절편 및 어댑터는 엑소뉴클라아제를 사용하여 제거한다. 이 때, 말단이 머리핀 고리 구조를 갖는 어댑터가 라이게이션된 DNA 절편들은 엑소뉴클레아제에 의해 절단되지 아니한다. 알칼리 용액, RNase, 또는 단일 가닥 선택성 엔도뉴클레아제로 처리하여 머리핀 고리 부분만을 분해함으로써, 일반적인 형태의 이중가닥 DNA절편으로 만든다. 이렇게 머리핀 고리를 제거한 이후에 상기 이중 가닥 DNA절편에 잔류하는 어댑터의 일부에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행한다. 그리고 중합효소 연쇄 반응 산물을 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 등의 방법으로 젤 상에서 분리하고, 각 조직 또는 세포로부터 유래된 젤의 각 밴드 양상을 비교함으로써 각 조직 또는 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 발현양상을 상대적으로 비교하는 단계로 이루어지는 유전자의 발현양상을 분석하는 방법을 제공한다. 젤의 각 밴드로부터 얻어진 DNA는 더욱 DNA 염기서열 분석을 위하여 사용되어 질 수 있다.

상기의 과정들을 인식 부위가 서로 다른 제한효소를 사용하여 반복하여 동일하게 수행한다. 서로 다른 두 가지, 또는 그 이상의 제한효소를 사용하여 얻어진 염기 서열을 서로 중첩시켜서, 생물체가 가지는 전체 DNA의 염기서열을 얻어낼 수 있다.

상기한 방법을 이용하여, 본 발명을 통하여 각각의 조직 또는 세포에서 추출된 mRNA를 사용하여 각각의 조직 또는 세포 간의 유전자의 발현양상을 모든 mRNA를 대상으로 상대적으로 분석할 수 있다.

이하, 본 발명의 방법을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하여 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.

실시예. 인체(Human)의 비장(spleen) 및 소장(small intestine) 에서 추출한 조직 특이적 발현 유전자 검출 및 분석

1. PCR cDNA library 증폭 및 제작 단계

(1) mRNA 추출

인체(Human)의 비장(spleen) 및 소장(small intestine) 전체 RNA 300 ㎍ 에서 mRNA를 추출하기 위하여 전체 1 ㎍/㎕ 이하가 되도록 RNase-free 증류수 500 ㎕를 첨가하였다. 상기 첨가된 부피와 동일한 양의 Binding buffer 500 ㎕ 와Oligotex 현탁액(Suspension) 20 ㎕를 첨가한 후, vortex로 완전히 혼합하여 70℃의 진탕기(water-bath)에서 3 분간 보관한 후, 20∼30℃의 상온에서 10 분간 두었다. 이를 상온에서 14,000-18,000 rpm으로 2분간 원심분리하여 피펫으로 조심스럽게 상등액을 제거한 후, 펠렛에 세척 완충액(Washing buffer) 400 ㎕ 첨가하고 피펫으로 재현탁하여 혼합하였다. 이러한 혼합액을 spin column에 첨가한 후, 상온의 14,000-18,000 rpm에서 1 분간 원심분리한 다음, 새로운 2 ㎖ 튜브에 칼럼을 옮기고 세척 완충액(washing buffer) 400 ㎕를 첨가한 후, 상온에서 14000-18000 rpm, 1 분간 원심분리를 수행하였다.

이를 새로운 1.5 ㎖ 튜브칼럼에 옮기고 칼럼에 희석 완충액(Elution buffer) 50 ㎕를 첨가한 후, 피펫으로 재현탁하여 혼합하고 14000-18000 rpm 에서 1 분간 원심분리하였다. 이러한 과정을 통해 mRNA 50 ㎕를 확보한 다음, 실험의 편의성을 위하여 진공으로 하여 mRNA 농도가 100ng/㎕가 되도록 조절하였다.

(2) cDNA Library 제작

상기 추출된 mRNA(100 ng/㎕) 3 ㎕에 Oligo dT₂₀primer(50 pmol/㎕) 1 ㎕,RNase free 증류수 1 ㎕ 첨가하여 총 5㎕가 되도록 제조하여 70 ℃의 진탕기에서 10분간 반응하여 변성시켰다. 상기 변성된 mRNA에 5 × reverse transcriptase buffer 4 ㎕, 100 mM DTT 2 ㎕, 2.5 mM dNTP 8 ㎕, reverse transcriptase (50u/㎕) 1 ㎕를 첨가하여 PCR 기기 또는 진탕기에서 42 ℃에서 60 분간 활성반응한 후, 94 ℃에서 10분간 불활성 반응시켰다 . 이때, 반응이 완료된 20 ㎕의 시료에 10×DNA polymerase buffer 10 ㎕, RNase H(1 unit/㎕) 1 ㎕,E.coliDNApolymerase I (4u/㎕) 5 ㎕, 증류수 66 ㎕를 첨가하여 총시료 100 ㎕ 를 PCR 기기 또는 진탕기에서 12 ℃에서 120 분간 활성 반응시킨 후, 70 ℃에서 10분간 불활성 반응시켰다. 상기 반응이 완료된 시료에E.coliDNA ligase I (60u/㎕) 2 ㎕, 25mM NAD 3 ㎕를 첨가하여 상온에서 15 분간 반응시켰다. 이 후 반응이 완료된 시료에 T4 DNA polymerase (4u/㎕) 2 ㎕, 0.1 % BSA 1 ㎕ 및 증류수 2 ㎕를 첨가하여 조제된 시료 110 ㎕를 상온에서 15 분간 반응시켰다.

(3) 제작된 cDNA library 정제

상기 시료와 동일 부피의 Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol 110 ㎕첨가하여 vortex로 완전 혼합한 후, 이를 상온에서 13000 rpm, 5 분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상기 상층액과 동일 부피의 클로로포름(Chloroform) 을 첨가하여 vortex로 완전 혼합한 후, 상온에서 13000 rpm, 5 분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상기 상층액과 동일한 부피의 4M 암모늄아세테이트(Ammonium Acetate)를 첨가하여 혼합하고, 이 혼합액과 동일 부피의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 영하 20 ℃에서 30 분간 냉동보관한 다음 상기 보관된 시료를 4℃에서 14000rpm -18000rpm으로 10 분간 원심분리하였다. 침전된 펠렛에 80% 에탄올(EtoH)로 두 차례 세척한 후 진공 건조 과정을 거쳤다.

(4) 어댑터 라이게이션(Adaptor Ligation)

상기 건조된 시료에 증류수 6 ㎕를 첨가하여 녹인 다음 reverse primer용 어댑터와 cap primer용 어댑터로 이루어진 cassette adaptor (10pmol/㎕) 2 ㎕, 2Xligase buffer 10 ㎕ 및 ligase (30U/㎕) 2 ㎕ 를 첨가하여 상온(20∼30℃)에서 2시간 반응시켜서 DNA 양 말단에 어댑터를 결합시켰다. 반응이 완료된 시료에 동일 부피의 4M 암모늄 아세테이트(Ammonium Acetate) 25 ㎕를 첨가하여 혼합하고 상기 혼합액과 동일 부피의 이소프로판올(isopropanol )을 50 ㎕ 첨가한 후, 영하 20℃에서 30 분간 냉동 보관하였다. 그 다음 4℃에서 14000rpm - 18000 rpm으로 10 분간 원심분리하였다. 이렇게 하여 침전된 펠렛에 80% 에탄올(EtoH)로 2회 반복 세척한 후, 진공 건조 과정을 거쳤다.

(5) PCR 증폭을 통한 PCR cDNA library 제작

상기 건조한 시료에 증류수 20 ㎕를 첨가하여 녹인 다음 10 ×Taq polymerase buffer 5 ㎕, dNTP 4 ㎕, reverse primer(100p/㎕) 0.5 ㎕, cap primer(100p/㎕) 0.5 ㎕, Taq polymerase (5u/㎕) 0.2 ㎕ 및 증류수 20.8 ㎕를 첨가하여 총 부피가 50 ㎕가 되도록 하였다. 그 다음 하기 방법에 의해 상기 시료의 1, 2차 중합효소연쇄반응(이하, 'PCR' 이라 한다) 과정을 수행하였다.

1차 PCR 반응의 조건은 전 변성단계 94 ℃에서 1 분간 1 회, 94 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초, 72℃에서 3 분간 35 회 반복 수행한 다음, 후 확장단계로 72℃에서 5 분간 1 회 반응하였다. 그 다음 상기 1 차 반응이 완료된 반응물을 주형으로 하여 2차 PCR 반응을 수행하였다. 이때 상기 1 차 반응물 3㎕에 reverse primer(100pmol/㎕) 0.1 ㎕, cap primer(100pmol/㎕) 0.1 ㎕, Taq polymerase(5u/㎕) 0.2 ㎕, dNTP 5 ㎕, 완충액(buffer) 5㎕ 및 증류수 36.6 ㎕를 첨가하여 총 부피가 50 ㎕이 되도록 하며 동일한 튜브를 16개 준비하여 수행하였다. 2차 PCR 반응의 조건은 전변성단계 94 ℃에서 1 분간 1 회를 거쳐 94 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초, 72℃에서 3 분간 35 회 반복 수행한 다음, 후 확장단계로 72℃에서 5 분간 1회 반응시켰다.

상기 PCR 반응이 완료된 반응액 800㎕를 1.5 mL 튜브에 400 ㎕씩 나누어 동일 부피의 Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol 400 ㎕를 첨가하여 vortex로 혼합하였다. 이를 상온에서 13000 rpm, 5 분간 원심분리하여 얻은 상등액의 0.1 부피의 3M 아세트산 나트륨(sodium acetate)을 첨가하여 혼합하였다. 혼합액의 2 배 부피의 100% 에탄올(EtOH)을 첨가한 후, 영하 20℃에서 30분간 냉동 보관하였다. 상기 보관된 반응물을 13000 rpm 에서 10 분간 원심분리하여 얻은 펠렛에 80% 에탄올(EtoH)을 이용하여 2회 반복 세척한 후 진공 건조 과정을 거쳤다.

2. 조직 특이적 발현 유전자 검출 및 분석

(1) 제한효소 반응 및 정제 단계

2차 PCR이 완료된 반응물에 증류수를 첨가하여 정량값이 100ng/㎕가 되도록 조절한 다음, 2차 PCR 반응물 (100 ng/㎕) 300 ㎕(30 ㎍), 10× Hpy188III buffer 40 ㎕, 100× BSA 4 ㎕, Hpy188III (10U/㎕) 3 ㎕(30u) 및 증류수 53 ㎕를 첨가하여 37℃ 진탕기(water-bath)에서 12 내지 16시간 반응시켰다. 상기 반응이 완료되면 동일 부피의 Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol 400 ㎕를 첨가하여 vortex로 혼합하였다. 이를 상온에서 13000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 얻은 상등액의 0.1 부피의 3M 아세트산 나트륨(sodiume acetate)을 첨가하여 혼합하였다. 상기 혼합액의 2 배 부피의 100% 에탄올(EtOH)을 첨가한 후, 30 분간 영하 20℃에서 냉동보관하였다. 상기 보관된 반응물을 13000rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 펠렛에 80% 에탄올(EtoH)을 이용하여 2회 반복 세척한 후 진공 건조 과정을 거쳤다.

(2) 어댑터 연결 반응(Adapter Ligation Reaction) 단계

건조된 반응물에 증류수를 첨가하여 정량값이 200ng/㎕가 되도록 조절하였다. Hpy188III로 처리되어 정제된 반응물(200ng/㎕) 1 ㎕ 에 두 종류의 어댑터(adaptor) 20pmol을 각각 0.5 ㎕씩 첨가하고, 10 × T4 DNA 리가아제 buffer 1 ㎕, T4 DNA 리가아제(150u/㎕) 0.026 ㎕(4u), 증류수 7 ㎕을 첨가한 반응액 10 ㎕를 25℃에서 PCR 기기 또는 진탕기로 2시간 반응시켰다.

(3) ExoNuclease III 처리 단계

상기 단계 (2)에 의한 반응이 완료된 반응물 10 ㎕에 10× ExoNuclease III buffer 2 ㎕, ExoNuclease III(100u/㎕) 0.1 ㎕, 증류수 8 ㎕를 첨가한 반응액 20 ㎕를 37℃ 에서 PCR 기기 또는 진탕기로 1시간 반응시켰다.

(4) PCR 반응 및 전기영동 단계

상기 반응물 2 ㎕를 주형으로 하여 어댑터에 상보적인 두 종류의 Final primer(100pmol/㎕)를 각각 0.5 ㎕씩 첨가하고, Taq polymerase(5u/㎕) 1 ㎕, dNTP 10 ㎕, 10×buffer 10 ㎕, 10×stabilizer 5 ㎕ 및 증류수 21 ㎕를 첨가하여 총 부피가 50 ㎕가 되도록 한 후, 다음과 같은 조건으로 PCR 반응을 수행하였다. 1단계로 94℃에서 5 분 , 53℃에서 50 초, 72℃에서 50 초간 1 회 수행하고, 2단계로 94℃에서 50 초, 53℃에서 50 초, 72℃에서 50초간 10 회 수행한 다음, 3단계로 94℃에서 50 초, 43℃에서 50 초, 72℃에서 50 초간 30회 수행한다. 마지막 4단계는 94℃에서 50 초, 43℃에서 50 초,72 ℃에서 5 분간 수행한다. 반응이 종료된 다음 상기 PCR 반응물 5 ㎕에 stop solution 2 ㎕를 첨가하여 PCR 기기를 이용하여 99℃에서 7분간 변성시킨 다음 PAGE gel에 2 ㎕씩 로딩하였다. 이 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 Human의 비장과 소장의 두 조직 사이의 특이적으로 발현되는 유전자를 탐색 하고자 두 조직의 mRNA를 cDNA library로 제작하여 본 발명의 방법을 통해 denaturing 폴리아크릴아미드 젤을 이용하여 유전자 발현 양상을 비교한 것으로, 전체 120개의 어댑터 세트 중 5 세트 만을 나타낸 것으로 총 4개의 유전자(No.1, No.2, No.3, No.4)를 탐색하였다. 도 1에서 sp.는 Human의 spleen에서 추출한 mRNA를 이용하여 본 발명의 방법을 수행한 결과이며, In.는 Human의 small intestine의 mRNA를 이용하여 본 발명의 방법을 수행한 결과를 나타낸다. 레인 1내지 5는 각각의 5 종류의 어댑터 세트를 나타내며, 같은 어댑터에 따른 두조직을 비교한 것으로서, 레인 1은 CT adaptor와 TT adaptor 를 이용하여 수행한 결과, 레인 2는 GA adaptor 와 TC adaptor 를 이용하여 수행한 결과, 레인 3은 GA adaptor 와 TT adaptor 를 이용하여 수행한 결과, 레인 4는 GC adaptor 와 TC adaptor 를 이용하여 수행한 결과, 레인 5는 GA adaptor 와 TC adaptor 를 이용하여 수행한 결과를 나타낸다. 또한 도 1에서 NO.1 밴드는 1 레인에서 spleen specific fragment를, NO.2 밴드는 3 레인에서 spleen specific fragment를, NO.3 밴드는 5 레인에서 small intestine specific fragment를, NO.4 밴드는 3 레인에서 small intestine specific fragment를 나타낸다. 도 1에서 나타난 4개의 발현 유전자 단편(up-regulated fragment)을 젤 상에서 회수하여 reamplifying primer를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후 염기서열분석을 수행하였다. 각 단편의 염기서열분석 결과를 토대로 Blast search를 통해 각 fragment의 original mRNA sequence를 확보하고 확보된 original mRNA sequence를in silico실험을 통해 비교한 결과 사용된 고리구조 어댑터 세트(hair-pin adaptor set)가 유전자의 크기와 정확히 일치함을 확인할 수 있었다(표 1 참조).

Human spleen과 Human small intestine에서 특이적으로 발현되는 유전자의 염기서열분석을 통한 동정

Fragment No.	NCBI acc. No.	Fragment length (base pair)	Adaptor set
1	AF015812(Homo sapiens RNA helicase p68(HUMp68) gene	535	CT+TT
2	AB21288(Homo sapiens mRNA for beta2-microglobulin)	493	GA+TT
3	AK026320(Human sapiens small intestine cDNA to mRNA FLJ22667)	515	GA+TC
4	U09813(Human mitochondrial ATP synthase subunit 9, p3 gene copy, mRNA nuclear gene incoding mitochondrial protein)	318	GA+TT

도 2는 각각의 up-regulated 유전자에 대한 real-time PCR 분석을 통해 상대 발현량을 2차 검증한 결과를 나타낸다. 도 2에서 붉은선은 Human spleen에서 추출된 mRNA를 이용하여 GAPDH 유전자에 대한 primer를 제작하여 internal control로 사용하여 얻은 그래프이며, 연두색선은 Human small intestine 에서 추출된 mRNA를 이용하여 GAPDH 유전자에 대한 primer를 제작하여 internal control로 사용하여 얻은 그래프이다. 또한 푸른색선은 Human spleen에서 추출된 mRNA 이용하여 4 개의

(NO.1 - NO.4) 단편의 primer에 대한 그래프이며, 노란색선은 Human small intestine의 mRNA를 추출하여 4 개의 fragment의 primer에 대한 그래프이다. 도 2에 도시한 바와 같이, 각각의 발현된 유전자(up-regulated gene) 에 대한 실시간 핵산증폭반응(real-time PCR) 분석을 통해 발현양상을 정량적으로 검증한 결과 도 1의 상대적인 밴드의 강도와 일치하는 것을 알 수 있었다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 의하면 각각의 조직에서 추출된 mRNA를 cDNA화 하여 각 조직 간의 유전자의 발현양상을 모든 mRNA를 대상으로 상대적으로 분석하는 방법을 제공함으로써 고등생물의 각 조직에서의 유전자 발현양상을 정확히 비교할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 주기(Cell Cycle), 약물 치료 변화, 병세 변화 등 외부 환경에 대한 변화 패턴을 연구하는 클러스터링(clustering)방법을 위해서도 사용할 수 있어 이를 통해 유전적 네트워크(Genetic Network), 대사경로(Metabolic Pathway), 신호전달(Signal Transduction) 등의 정보들을 정확하게 획득할 수 있다.

Claims

(i) 각 세포로부터 추출된 mRNA를 cDNA화 하는 단계;

(ii)제한효소를 사용하여 상기 DNA를 단일 가닥의 점착성 말단을 갖는 수 개의 절편들로 자르는 단계 및 이와는 독립적으로, 이렇게 절단된 DNA 절편의 양 말단과 상보적으로 결합할 수 있는 단일 가닥 점착성 말단을 갖는 머리핀 고리 어댑터를 준비하는 단계;

(iii)상기 DNA 절편과 머리핀 고리 구조 어댑터를 DNA 리가아제 사용하여 결합시키는 단계;

(iv)상기 DNA 리가아제에 의한 결합 반응에 참여하지 않은 DNA 절편과 머리핀 고리 구조 어댑터를 엑소뉴클레아제를 사용하여 제거하는 단계;

(v)상기 머리핀 구조 어댑터의 일부분에 상보적으로 결합하는 프라이머와 DNA 중합효소를 사용하여 DNA 절편을 증폭하는 단계;

(vi) 상기 증폭된 산물들을 젤 상에서 분리하는 단계; 및

(vii) 각 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자 발현양상을 상대적으로 비교하는 단계로 이루어지는 유전자의 발현양상을 분석하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)에서 제조되는 머리핀 고리 어댑터와 결합된 DNA 절편으로부터 머리핀 고리 부분만을 제거하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자의 발현양상을 분석하는 방법.
제 2항에 있어서, 알칼리용액, RNase, 단일가닥 선택성 엔도뉴클레아제로 구성된 그룹으로부터 선택된 것을 이용하여 상기 머리핀 고리 부분만을 제거하는 것을 특징으로 하는 유전자의 발현양상을 분석하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제한 효소가 Type IIs 또는 Type IIIp 제한효소인 것을 특징으로 하는 유전자의 발현양상을 분석하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 세포는 포유동물의 조직세포, 식물조직세포, 포유동물의 장기세포, 암세포, 돌연변이세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자의 발현양상을 분석하는 방법.