DE3501306A1 - Verfahren fuer die elektrophoretische analyse von dna - fragmenten - Google Patents

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weick-mann, Dipl.-Phys; Dr'. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Hüber Dr.-Ing. H. LisKA, Dipl.-Phys. Dr. J. Prechtel

fc-

16. Jan. 1985

H/TMF/Va

8000 MÜNCHEN 86 POSTFACH 860 820

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Verfahren für die elektrophoretische Analyse von

DNA-Fragmenten

Beschreibung

Die Entwicklung von zuverlässigen Methoden zur Sequenzanalyse von DNA (Desoxyribinukleinsäure) und RNA (Ribonukleinsäure) war einer der Schlüssel für die erfolgreiche Rekombination von DNA und der Gentechnologie. Wird die Nukleinsäuresequenzierung zusammen mit anderen Techniken der modernen Molekularbxologie benützt, so kann man damit die Zerlegung und Analyse von tierischen, pflanzlichen und viralen Genomen bis hinunter in diskrete Gene mit definierten chemischen Strukturen durchführen. Da die Funktion eines biologischen Moleküls durch seine Struktur vorbestimmt ist, ist die genaue Kenntnis der Struktur eines Gens bei der eventuellen Manipulation dieser Grundeinheit der Erbinformation immer wichtig. In dem Moment, in dem Gene isoliert und auch charakterisiert werden können, können sie auch modifiziert werden, um dadurch ganz bestimmte, gewünschte Veränderungen in ihrer Struktur zu erreichen. Dies erlaubt die Herstellung von Genprodukten - Proteinen - mit anderen Eigenschaften, als die, die Originalproteine besitzen.

Mikroorganismen, in welche die natürlichen und synthetischen Gene eingebracht werden, können als chemische Fabriken fungieren, um große Mengen menschlicher Proteine wie z. B. Interferon, Wachstumshormone oder Insulin herzustellen. In Pflanzen können bestimmte genetische Informationen übertragen werden, die es ihnen erlauben, auch unter unwirtlichen Umweltbedingungen zu überleben oder sich ihre eigenen Nährstoffe herzustellen.

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Die Entwicklung der modernen Sequenzierungsmethoden von Nukleinsäuren schloß die parallele Entwicklung einer Vielzahl von Arbeitstechniken mit ein.

Eine davon war notwendigerweise eine einfache und zuverlässige Methode für das Klonieren von kleinen bis mittelgroßen DNA-Bruchstücken in bakteriellen Plasmiden, Bakteriophagen und kleinen Tierviren. Dies erlaubte die Herstellung reiner DNA in ausreichender Menge um eine chemische Analyse durchzuführen. Eine weitere Voraussetzung war die annähernde Perfektion von hochauflösenden elektrophoretischen Methoden bei der Trennung von Oligonukleotiden nach ihrer Größe. Der wesentliche Entwicklungsschritt war die Einführung von Methoden, um ganze Pakete (size-nested sets) von Fragmenten aus klonierter, gereinigter DNA herzustellen, welche auf ihrer Kettenlänge die nötigen Informationen enthalten um damit die Nukleotidsequenz des ursprünglichen DNA-Moleküls zu bestimmen. Im allgemeinen werden zwei verschiedene Methoden benützt, um diese Fragmentpakete herzustellen. Eine wurde von Sanger entwickelt, (F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson, PNAS USA T_±, 5463 (1977 und A.J.H. Smith, Methods in Enzymology 65, 56-580 (1980)); die andere Methode wurde von Maxam und Gilbert entwickelt (A. M. Maxam, W. Gilbert, Methods in Enzymology, (S5_, 499-559 (1980) .

Die Sanger'sehe Methode wird als die Didesoxyketten-Abbruchmethode bezeichnet. Bei der am häufigsten benützten Variante dieses Verfahrens wird ein DNA-Bruchstück in einen Phagen mit einer Einzelstrang-DNA kloniert, wie z. B. der Phage Ml3. Diese Phagen-DNA's können als Matritzen für die "geprimte Synthese" des komplementären Stranges mit den Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I verwendet werden.

Der Primer ist entweder ein synthetisches Oligonukleotid oder ein Restriktionsfragment, welches von der ursprünglichen rekombinierten DNA isoliert wurde und welches bevorzugt an eine Stelle des 3'-Endes des eingeschobenen geklonten Stückes im Ml3 Vektor hybridisiert.

In jeder der vier Sequenzierungsreaktionen wird die durch einen Primer gestartete Synthese in der Gegenwart von ausreichender Menge des Didesoxy-Analogons von einem der vier möglichen Desoxynukleotiden durchgeführt. Auf diese Weise wird das DNA-Kettenwachstum an einer willkürlichen Stelle durch den Einbau dieser "Deadend-Nukleotide" abgebrochen. Das Verhältnis der Konzentrationen der Didesoxy zur Deoxyform wird so gewählt, daß sich der Kettenabbruch über alle möglichen DNA-Längen erstreckt, die durch die Gelelektrophorese aufgetrennt werden können. Die Produkte aus jeder der vier "geprimten" Synthesereaktionen werden dann individuell auf Polyacrylamidgelen elektrophoretisch getrennt.

Mit Hilfe radioaktiver Marker, welche in die wachsende Kette eingebaut wurden, wurde ein Autoradiogramm erstellt, welches den DNA-Aufbau in jedem der Elektrophoresebahnen zeigte.

Die Sequenz der Desoxynukleotide in der klonierten DNA wird durch eine Auswertung der Banden auf den vier verschiedenen Elektrophoreselinien bestimmt.

Die Methode von Maxam und Gilbert behandelt gereinigte DNA auf chemische Weise, um so in Analogie zur Sanger Methode ein Paket von DNA-Fragmenten zu erhalten. Mit

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dieser Methode können sowohl Einzelstrang-DNA als auch Doppelstrang-DNA, die entweder an 3'- oder 5'-Enden mit radioaktivem Phosphat markiert sind, sequenziert werden. In vier Reaktionswegen wird ein Kettenbruch an einer oder zwei der vier verschiedenen Nukleobasen durch chemische Behandlung ausgelöst. Der Bruch besteht aus einem 3-Schritte-Prozeß: Modifizierung der Base, Abspalten der modifizierten Base vom Zuckerrest und dem Ablösen des Zuckerrestes vom Strang. Die Reaktionsbedingungen werden so gewählt, daß die Mehrzahl der endmarkierten Fragmente in der Größenordnung ist, die von der Gelelektrophorese aufgelöst werden kann (normalerweise 1 bis 400 Nukleotide).

Die Elektrophorese, die Autoradiographie und die Analyse des Bandenmusters wird im wesentlichen wie bei der Sangermethode durchgeführt. (Obwohl bei der chemischen Fragmentierung jedesmal zwei DNA-Bruchstücke entstehen, enthält nur ein Ende die endständige Markierung, welche im Autoradiogramm entdeckt wird).

Beide dieser Methoden zur DNA-Sequenzierung werden weitverbreitet angewendet, und für jede gibt es verschiedene Variationsmöglichkeiten. Bei allen wird die Länge der Sequenz, die durch einen einzelnen Satz von Reaktionen erhalten werden kann, im wesentlichen durch die Auflösung des Polyacrylamidgels der Elektrophoresebahnen bestimmt. Im allgemeinen können 200 bis 400 Basen aus einem einzelnen Satz von Gelbahnen der Elektrophoreselängen abgelesen werden. Obwohl beide Methoden sehr erfolgreich sind, so haben sie doch auch entschiedene Nachteile, besonders durch die Probleme, welche mit der Elektrophorese zusammenhängen. Eines davon ist, daß der Gebrauch von Radiomarkern als Etiketten für das

Auffinden der DNA-Banden in den Gelen notwendig ist. Man muß sich mit der kurzen Halbwertszeit von ³²P begnügen und der damit einhergehenden Instabilität der radiomarkierenden Reagenzien; dazu kommen noch die Probleme der Handhabung und der Beseitigung des radioaktiven Abfalls. Noch wichtiger aber ist, daß die natürlichen Eigenschaften der Autoradiographie (das Abbild der radioaktiven Banden auf dem Film ist breiter als die Bande selber) und der Vergleich von Bandenpositionen zwischen vier verschiedenen Gelbahnen (welche durchaus manchmal Unterschiede bei der Wanderung von Banden aufweisen) die beobachtbare Auflösung der Banden begrenzen können, und damit auch die Länge der Sequenz, die von den Gelen abgelesen werden kann. Hinzu kommt noch, daß die Unregelmäßigkeiten zwischen den Gelbahnen ein automatisches Abtasten der Autoradiogramme unmöglich machen. Auch heute noch kann das menschliche Auge solche Unregelmäßigkeiten bedeutend besser ausgleichen, als dies ein Computer kann. Die Notwendigkeit des manuellen Ablesens von Autoradiogrammen ist zeitraubend, umständlich und eine Quelle für Fehler. Außerdem kann man die Gelmuster nicht lesen, so lange die Elektrophorese noch läuft. Daher kann man die Elektrophorese auch nicht in dem Moment beenden, in dem die Auflösung zwischen benachbarten Banden ungenügend wird, sondern man muß nach einer standartisierten Zeit aufhören und auf die Entwicklung des Autoradiogramms warten, ehe mit dem Ablesen der Sequenz begonnen werden kann.

Die Erfindung bezieht sich auf diese und andere Probleme, die mit dem Elektrophoreseschritt der DNA-Sequenzierung einhergehen und stellt einen wesentlichen Fortschritt dar.

Dies Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur elektrophoretischen Analyse von DNA-Fragmenten, die bei Sequenzierungsarbeiten entstehen. Dabei wird ein Satz von vier farbgebenden oder fluoreszierenden Substanzen an die DNA-Bruchstücke angehängt. Auf diese Weise können die Fragmente noch während ihrer Auftrennung in der Gelelektrophorese entdeckt und charakterisiert werden. Der Detektor besteht aus einem Absorptions- oder Fluoreszenzphotometer, das die markierten Banden während ihrer Wanderung durch das Gel aufzeichnen kann.

Dies Erfindung umfaßt auch ein neues System zur Analyse von DNA-Bruchstücken und beinhaltet:

- eine Quelle von farbgebenden oder fluoreszierenden, an DNA-Fragmente angehängte Substanzen, wobei die DNA-Stücke unterschiedlich markiert sind,

- einen Bereich der das Elektrophoresegel enthält,

- eine Vorrichtung, um die beschriebenen, markierten DNA-Fragmente in den besagten Elektrophoresebereich einzuleiten, und

- eine photometrische Vorrichtung, welche die markierten DNA-Fragmente aufzeichnet oder erkennt, wenn sie bei ihrer Wanderung durch das Gel aufgetrennt werden.

Ein Ziel dieser Erfindung ist es, ein neuartiges Verfahren zur Sequenzanalyse von DNA-Fragmenten zur Verfügung zu stellen.

Insbesondere ist es Ziel der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Sequenzanalyse der DNA zu schaffen.

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Sowohl diese als auch andere Ziele und Vorteile der vorgelegten Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen ersichtlich.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 beschreibt eine Technik zur endständigen Markierung von DNA-Bruchstücken mit einem fluoreszierenden Anhang. Pst. I und T.-DNA-Ligase sind Enzyme, die regelmäßig zur Rekombination in der DNA-Forschung verwendet werden.

Fig. 2 ist ein Blockdiagramm eines automatisierten DNA-Sequenzators und dem Gelelektrophorese-System.

Fig. 3 ist ein schematisches Diagramm der Anordnung des optischen Systems in der Detektoreinheit. Dabei sind: P, die Lichtquelle; Ll, die Objektivlinse; L2, die Kollektivlinsen; Fl, der UV-Filter; F2 der Hitzefilter; F3, ein Bandfilter für die Anregung; F4, ein Breitbandfilter für die Emission; DM, ein dikroischer Spiegel; C, ein Polyacrylamidgel; PMT, eine Photomultiplierröhre.

Fig. 4 ist ein schematisches Diagramm einer anderen optischen Anordnung für die Detektoreinheit.

Fl bis F4 sind Bandpaßfilter, deren mittlere Durchlässigkeit auf das Emissionsmaximum der verschiedenen Farben eingestellt ist. Pl bis P4 sind Photomultiplierröhren. Die Wellenlänge der Anregung ist so gewählt, daß für sie die die Filter Fl bis F4 nicht durchlässig sind.

Fig. 5 zeigt einen Vergleich der Ergebnisse der DNA-Sequenzierungen nach der alten Methode und nach dem neuen Verfahren, wie in Fig. 1 beschrieben.

Fig. 6 ist ein Blockdiagramm eines DNA-Sequenzators nach dem Anspruch dieser Verbindung.

In den herkömmlichen Verfahren der DNA-Sequenzanalyse, einschließlich derjenigen Methoden, die auf den Sanger'-sehen Dideoxykettenabbruchverfahren beruhen, wird ein einziger radioaktiver Marker benützt, um alle Banden im Gel zu erkennen. Dies setzt voraus, daß die Sätze aus den vier Synthesereaktionen auf unterschiedlichen Gelbahnen getrennt werden und führt zu den Problemen, welche beim Vergleich der Wanderung von Banden auf verschiedenen Gelbahnen einhergehen. Dieses Problem wird in der vorgelegten Erfindung überwunden und zwar durch den Gebrauch eines Satzes von vier farbgebenden und fluoreszierenden Substanzen, die ein unterschiedliches Absorptions oder Fluoreszenzmaximum haben. Jeder dieser Anhänger wird chemisch an das Primerstückchen gekoppelt, welches benützt wird, um die Synthese der Fragmentstränge einzuleiten. Im Gegenstück wird jeder so markierte Primer mit den Dideoxynukleotiden gepaart und in den geprimten Synthesereaktionen mit den Klenow-Fragmenten der DNA-Polymerase benützt. Die Primer müssen die folgenden Eigenschaften haben:

1. sie müssen eine freie 3'-Hydroxylgruppe besitzen, die eine Kettenverlängerung durch die Polymerase erlaubt.

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2. Sie müssen komplementär zu einer einheitlichen Region des 3'-Endes im geklonten Einschub sein.

3. Sie müssen ausreichend lang sein, um zu einem einheitlichen stabilen Doppelstrang hybridisieren zu können.

4. Die farbgebenden und fluoreszierenden Substanzen dürfen nicht die Hybridisierung behindern oder die Kettenverlängerung am 3'-Ende durch die Polymerase verhindern.

Den oben aufgeführten Bedingungen 1, 2 und 3 wird durch verschiedene synthetische Polynukleotid-Primerstücke, die auch im allgemeinen bei der Sanger-Methode mit Ml3-Vektoren benützt werden, Rechnung getragen. Ein solcher Primer ist der 12 mer 5¹TCA CGA CGT TGT 3' wo A, C, G und T für die vier unterschiedlichen Nukleotidkomponenten der DNA stehen; A, Adenosin; C, Cytosin; G, Guanosin; T, Thymidin.

Die chemische Grundlage für die Verknüpfung der farbgebenden oder fluoreszierenden Marker wird in dem Patentantrag, der einreichenden Partei mit der Serien-Nummer 565,010, eingereicht am 20.12.1983, beschrieben. Diese Entdeckung wird hier ausdrücklich durch ihre Erwähnung aufgenommen. Die Strategie, die dafür benützt wird, ist die Einführung einer aliphatischen Aminogruppe am 5'-Ende als letzter Additionsschritt in der Synthese von Oligonukleotidprimer. Diese reaktive Aminogruppe kann dann sofort mit einer großen Vielfalt von aminoreaktiven, farbgebenden und/oder fluoreszierenden Substanzen verknüpft werden. Dieser Weg erlaubt es, daß die markierten Primerstücke die oben zitierte Bedingung 4 nicht verletzen.

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Die vier verwendeten Farbstoffe müssen einen hohen Extinktionskoeffizienten besitzen und/oder eine hohe Quantenausbeute für die Fluoreszenz ergeben. Sie müssen außerdem gut aufgelöste Absorptionsmaxima und/oder Emmisionsmaxima besitzen. Ein repräsentativer Satz aus vier solchen aminoreaktiver Farbstoffe ist:

Fluorescein Isothiocyanat (FITC,^^Ex = 495,;\,^Em = 520,

max max

<f₄₉₅ -8 χ 10⁴), Eosin Isothiocyanat (EITC, A^Ex = 522,

max

= 543,£₂₂~8 χ 10 ), Tetramethyl Rhodamin Isothiomax

cyanat (TMRITC,A^Em = 550, ^^Em = 578, £550^4 χ ΙΟ⁴) ,

max max

und substituiertes Rhodamin Isothiocyanat (XRITC,

l^Ex = 580, ^^Ex = 604, (f_₈₀ ^8 χ 10⁴) , dabei bedeutete max max

die Wellenlänge in Nanometer, Ex die Anregung, Em die Emission, max bedeutet Maximum und \ ist der molare Extinktionskoeffizient.

Diese Farben wurden mit dem Ml3 Primerstück verknüpft und die so verbundenen Paare auf einem 20%igen PoIyacrylamidgel der Elektrophorese unterworfen. Die markierten Primer sind sowohl durch ihre Absorption als auch durch ihre Fluoreszenz im Gel sichtbar. Alle vier markierten Primer haben identische elektrophoretische Eigenschaften. Die mit dem Farbstoff verbundenen Primer behalten ihre Fähigkeit bei, an spezifische DNA-Stücke

zu hybridisieren. Dies wird dadurch gezeigt, daß sie die Fähigkeit besitzen, nicht derivatisierte Oligonukleotide, wie sie normalerweise bei Sequenzierungsreaktionen benützt werden, zu ersetzen.

Endmarkierung der DNA bei Anwendung der Maxam/Gilbert-Methode

Beim Maxam/Gilbert-Verfahren der DNA-Sequenzanalyse muß das Ende des DNA-Stückes, dessen Sequenz bestimmt werden soll, markiert werden. Dies wird normalerweise enzymatisch mit Hilfe radioaktiver Nukleotide durchgeführt. Um die Maxam/Gilbert-Methode zusammen mit dem in dieser Erfindung beschriebenen Farbnachweises benützen zu können, muß das DNA-Stück mit Farbstoffen markiert werden. Eine Möglichkeit, mit der dies durchgeführt werden kann, wird in Fig. 1 gezeigt. Bei verschiedenen Restriktionsendonukleasen entsteht als Produkt der DNA-Spaltung der bekannte 3'-Überhang. Diese Enzyme schaffen damit ein "klebriges Ende" (sticky end), der aus einem kurzen Stück eines einzelnen Stranges aus DNA am Ende einer Doppelstrang-DNA besteht. Dieses Ende wird sich an ein komplementäres DNA-Stück anlagern und kann mit Hilfe von Ligaseenzymen kovalent mit der Doppelstrang-DNA verknüpft werden. Auf diese Weise wird ein Strang kovalent mit der nachweisbaren Gruppe verknüpft. Diese Molekülgruppe kann ein Farbstoff, eine Aminogruppe oder eine geschützte Aminogruppe sein (bei der die Schutzgruppe abgespalten und die anschließend chemisch mit einem Farbstoff verknüpft werden kann).

Sequenzierungsreaktion. Die Dideoxy-Sequenzierungsreaktionen werden nach der Standardvorschrift von Smith, A.J.H., Methods in Enzymology 65, 56—580 (1980),

durchgeführt, allerdings mit der Ausnahme, daß die
(Empfindlichkeits)-Skala, wenn notwendig, erhöht werden kann, um eine ausreichende Signalintensität zum Nachweis jeder Bande zu erhalten. Die Schritte werden mit unterschiedlich gefärbten Primern für jede einzelne
unterschiedliche Reaktion durchgeführt, zum Beispiel, PITC für die ¹¹A"-Reaktion, EITC für die "C"-Reaktion, TMRITC für die "G"-Reaktion und XRITC für die ¹¹T"-Reaktion. Für die Sequenzierungsreaktion werden keine radiomarkierten Nukleosidtriphosphate benötigt.

Die Maxam/Gilbert Sequenzierungsreaktionen werden in
der üblichen Weise durchgeführt (S. F. Gill, Aldrichimica Acta ]J5 (3) , 59-61 (1983) mit dem Unterschied, daß die endständige Markierung entweder eine oder vier Farbsubstanzen darstellt bzw. eine freie oder geschützte Aminogruppe ist, die anschließend mit einem
Farbstoff umgesetzt werden kann.

Gelelektrophorese. Jeweils gleiche Mengen aus den Sequenzierungsreaktionen werden vereinigt und auf ein
5%iges Polyacrylamidgel gegeben (Säule 10 der Abbildung 2 vom oberen Pufferreservoir 12 ausgehend). Die Mischung aus den vier verschiedenen Reaktionen wird so eingestellt, daß die verschiedenen DNA-Konjugate annähernd ein gleich starkes Fluoreszenz- oder Absorptionssignal geben. Auf diese Weise können die Unterschiede in den Extinktionskoeffizienten der Farbstoffe ausgeglichen
werden, ebenso die Unterschiede in anderen Faktoren wie die Quantenausbeute der Fluoreszenz, Detektorempfindlichkeiten usw. Um die markierten DNA-Fragmente auf dem Gel der Elektrophorese zu unterziehen, wird eine Hochspannung entlang der Säule 10 angelegt. Die markierten

DNA-Segmente, die sich in ihrer Länge nur durch ein einziges Nukleotid unterscheiden, werden bei der Elektrophorese durch diese Gelmatrix aufgetrennt. Am oder nahe am Ende des Geles der Säule 10 werden die DNA-Banden voneinander aufgetrennt und durchlaufen den Detektor 14, der im nächsten Abschnitt vollständig beschrieben wird. Der Detektor 14 findet die fluoreszierenden oder farbgebenden Banden der DNA auf dem Gel und bestimmt ihre Farbe, und damit um welches Nukleotid es sich handelt. Die Summe dieser Informationen ergibt die DNA-Sequenz.

Der Detektor. Es gibt sehr viele Möglichkeiten, um markierte Moleküle zu entdecken, nachdem sie mit Hilfe eines Polyacrylamidgeles durch Elektrophorese nach ihrer Größe getrennt worden sind. Anschließend werden vier anschauliche Beispiele beschrieben. Diese sind, i) Bestimmung der Fluoreszenz durch Anregung mit

Licht verschiedener Wellenlängen für die unterschiedlichen Farbstoffe,
ii) Bestimmung der Fluoreszenz durch Anregung mit

Licht der gleichen Wellenlänge für die verschiedenen Farbstoffe,
iii) Elution der Moleküle vom Gel und Bestimmung durch

Chemilumineszenz, und
iv) Bestimmung der Lichtabsorption durch die Moleküle.

Bei den Beispielen i) und ii) sollte der Fluoreszenzdetektor die folgenden Bedingungen erfüllen: a) Die Höhe des Lichtstrahles für die Anregung sollte nicht wesentlich größer sein als die Höhe einer Bande. Dies liegt normalerweise im Bereich von 0,1 bis 0,5 mm. Durch den Gebrauch eines solch engen Anregungsstrahls läßt sich eine maximale Auflösung der Banden erreichen, b) Die Anregungswellenlänge kann so variiert werden, daß sie zu den Absorptionsmaxima von jeder der verschiedenen Farbstoffe paßt.

Sie kann aber auch aus einem einzelnen engen, sehr lichtintensiven Wellenlängenbereich bestehen, der alle vier fluoreszierenden Marker anregt. Allerdings sollte sich dieser Wellenbereich nicht mit demjenigen der Fluoreszenzemission überlappen, c) Die optische Einheit sollte die Streuung und Reflektion des anregenden Lichtes zum Photodetektor 14 minimieren. Die optischen Filter, die die Aufgabe haben, die Lichtstreuung und Reflektion der Anregung zu verhindern, werden analog der Anregungswellenlänge variiert, d) Der Photodetektor 14 sollte einen geringen Rauschpegel haben und ein gutes Wirkungsspektrum und seine gute Quantenausbeute über den Emissionsbereich der Farben besitzen (500 bis 600 nm für die oben angeführten Farbstoffe). e) Das optische System für den Auffang der emitierten Fluoreszenz sollte eine hohe numerische Appertur besitzen. Dadurch wird das Fluoreszenzsignal maximiert. Darüberhinaus sollte die Tiefenschärfe der Sammellinsen die ganze Breite der Säulenmatrix umfassen.

Zwei anschauliche Beispiele für Fluoreszenzbeobachtungs systeme sind in den Figuren 3 und 4 dargestellt. Das System in Fig. 3 läßt sowohl die Anregung mit einer einzelnen Wellenlänge oder mit mehreren Wellenlängen zu. Bei der Anregung mit nur einer Wellenlänge besteht der Filter F4 nur aus einem der vier Bandpaßfilter, die auf die Wellenlänge des Emissionspegels von jedem der Farbstoffe eingestellt sind. Diese Filter werden in Zyklen von wenigen Sekunden ausgetauscht um eine kontinuierliche Aufzeichnung von jedem der vier fluoreszierenden Farbstoffe zu ermöglichen. Bei der Anregung mit mehreren Wellenlängen werden die optischen Teile F3 (Anregungsfilter), DM (dichroischer Spiegel), und F4 (Sperrfilter) jeweils zusammen ausgetauscht. Auf diese

Weise wird sowohl das Anregungslicht als auch das beobachtete Emissionslicht variiert. Das System in Fig. 4 ist eine gute Anordnung für das Beispiel der Anregung mit nur einer Wellenlänge. Dieses System hat den Vorteil, daß keine beweglichen Teile notwendig sind und die Fluoreszenz von allen vier Farbstoffen kann simultan und kontinuierlich aufgenommen werden. Eine dritte Beobachtungsmöglichkeit (oben als iii bezeichnet) besteht aus der Elution der markierten Moleküle am Ende des Geles und anschließendem Mischen mit einem Agens zur Anregung von Chemilumineszenz wie zum Beispiel 1,2-Dioxetandion (S. K. Gill, Aldrichimica Acta 16 (3) , 59-61 (1983); Liq. Chrom 6(9), 1603-1616 (1983), danach wird die Mischung sofort in einen Detektor geleitet, der das emittierte Licht bei vier verschiedenen Wellenlängen messen kann (dieser Detektor ist demjenigen von Fig. 4 ähnlich, allerdings braucht er keine Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung). Das Hintergrundsignal der Chemilumineszenz ist wesentlich geringer als dasjenige der Fluoreszenz. Daher erhält man ein höheres Signal-Rauschverhältnis und eine erhöhte Empfindlichkeit. Schließlich kann die Bestimmung auch durch das Messen der Lichtabsorption durchgeführt werden (oben als iv angeführt). In diesem Falle wird ein Lichtstrahl mit variierbarer Wellenlänge durch das Gel geleitet. Gemessen wird die Verringerung der Stärke des Lichtstrahles, der durch die Absorption von Licht durch die markierten Moleküle herrührt. Bei der Messung der Lichtabsorption bei verschiedenen, dem Absorptionsmaxxmum der vier Farbstoffen entsprechenden Wellenlängen ist es möglich, die Art des Farbstoffmoleküles im Lichtweg zu bestimmen. Ein Nachteil dieser Meßmethode ist die wesentlich geringere Empfindlichkeit der Absorptionsmessung, verglichen mit der Fluoreszenzmessung.

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Das oben beschriebene Beobachtungssystem ist an einen Computer 16 angeschlossen. Zu jedem Zeitintervall der Messung erhält der Computer 16 ein Signal, welches proportional zu derjenigen Signalintensität ist, die zu diesem Zeitpunkt für jedes der vier Farbstoffmarker gemessen wird. Diese Information gibt Auskunft darüber, welches Nukleotid am Ende desjenigen DNA-Fragmentes steht, welches aufgrund seiner Länge sich gerade zu dieser Zeit im Meßbereich befindet. Die zeitliche Folge des Erscheinens der gefärbten Banden ergibt die DNA-Sequenz. In Fig. 5 werden die Ergebnisse dargestellt, wie sie nach herkömmlichen Methoden und wie sie nach der verbessernden Methode der Erfindung erhalten werden. Das folgende Beispiel soll lediglich die Erfindung veranschaulichen.

Beispiel

Fig. 5 zeigt ein Blockdiagramm eines DNA-Sequenators für den Gebrauch mit nur einem Farbstoff pro Zeit. Der Lichtstrahl eines Argonlasers 100 (4880 A) wird mit Hilfe eines Strahlenleiters 104 durch die Polyacrylamidgelröhre (Probe) 102 geführt. Die Fluoreszenz, die durch den Lichtstrahl angeregt wird, wird mit Hilfe einer Linse 106 mit kleiner f-Nummer gesammelt und durch eine geeignete Anordnung von optischen Filtern 108 und 110 geleitet um Streuungen der Anregung auszufiltern. Danach wird das Licht mit der Photomultiplierröhre (PMT) 112 gemessen. Das Signal wird von einem Schreiber mit Millimeterpapier aufgezeichnet. Die DNA-Sequenzierungsreaktionen werden mit einem fluoreszeinmarkierten Oligonukleotidprimer durchgeführt. Die Peaks

— ITS —

auf dem Millimeterpapierstreifen entsprechen den Fragmenten aus fluoreszeinmarkierter DNA von verschiedener Länge, die in den Sequenzierungsreaktionen entstanden sind und auf dem Elektrophoresegel aufgetrennt wurden. Jeder Peak enthält die Größenordnung von 10 bis 10 Mol Fluoreszein, welches ungefähr der DNA-Menge entspricht, die eine Bande eines vergleichbaren Sequenzanalysegels bei der radioisotopen Methode entspricht. Dies bezeugt, daß der Fluoreszenzmarker nicht vom Oligonukleotidprimer während der Sequenzierungsreaktionen abgespalten oder abgebaut wird. Dieses Beispiel zeigt ebenfalls, daß die Nachweisempfindlichkeit völlig ausreichend ist, um eine DNA-Sequenzanalyse nach dieser Methode durchzuführen.

Claims (13)

Patentansprüche

1. Verfahren zur verbesserten DNA-Sequenzanalyse nach der Kettenabbruchmethode, oder der chemischen Abbaumethode, dadurch gekennzeichnet , daß der Olinukleotidprimer mit einem Farbstoffmarker versehen ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Oligonukleotidprimer mit einem Fluoreszenzmarker versehen ist.

3. Verfahren zur verbesserten DNA-Sequenz ana Iy se ifach ^, der Kettenabbruchmethode oder der chemischen € Abbaumethode, dadurch i gekennzeichnet , daß bei Verwendung der Kettenabbruchmethode an den für die Sequenzierungsreaktionen, A, C, G und T verwendeten Oligonukleotidprimer ein Farbstoffmarker geknüpft ist, Mengen der genannten Sequenzreaktionen vereinigt werden, zusammen der Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel unterworfen werden und nach der Trennung auf diesem Gel nachgewiesen werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei Anwendung der chemischen Abbaumethode die DNA-Moleküle mit verschiedenen Farbanhängern markiert werden, eine verschiedenfarbig markierte DNA in jeder der chemischen Modifizierungsreaktionen verwendet wird und entsprechende Mengen der genannten Sequenzreaktionen zusammen der Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel unterworfen werden und nach

der Trennung auf diesem Gel nachgewiesen werden. *

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Moleküle mit einem verschieden fluoreszierenden Anhänger markiert sind.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß die DNA-Moleküle mit einer Aminogruppe markiert sind, welche nach den erfolgten Sequenzierungsreaktionen mit einem Farbstoffmolekül verknüpft werden kann.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die DNA-Moleküle mit einer geschützten Aminogruppe markiert werden, die Schutzgruppe nach den Sequenzierungsreaktionen abgespalten und mit einem Farbstoffmolekül verknüpft wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Produkte aus jeder der verschiedenen Sequenzierungsreaktionen mit einem unterschiedlichen Farbstoff verknüpft werden.

9. System zur Analyse von DNA- Fragmenten, gekennzeichnet durch eine Quelle von färb- oder fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmenten, einen Bereich, der ein Elektrophoresegel enthält, Mittel um die erwähnten, markierten DNA-Fragmente in den besagten Bereich einzuführen, und eine photometrische Vorrichtung, um die erwähnten markierten DNA-Fragmente zu beobachten, wenn sie durch das besagte Gel wandern.

10. System nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch ein Absorptionsphotometer als photometrische Vorrichtung.

11. System nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch ein
Fluoreszenzphotometer als photometrische Vorrichtung.

12. System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß die DNA-Frag mente mit einer Aminogruppe markiert sind, welche zur Verknüpfung mit einem Farbstoffmolekül
bestimmt ist.

13. System nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß die DNA-Fragmente mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind.