SE456348B - Forfarande for elektroforetisk analys av dna fragment - Google Patents

Description

456 348 att tillåta kemisk analys. En annan metod var den nära perfek- tionen av gelelektroforetiska metoder för högupplösnings- separation av oligonukleotider på basis av deras storlek.

Emellertid utgjordes den begreppsmässiga nyckelutvecklingen av införandet av metoder för att alstra storleksanordnade (size-nested) uppsättningar av fragment av klonad, renad DNA som i sin längdkollektion innehåller den information som erfordras för att definiera nukleotidsekvensen innefattande moder-DNA-molekylerna. Två skilda metoder för att alstra dessa fragment-set användes i stor utsträckning, varav den ena är utvecklad av Sanger; Sanger, F., Nicklen, S. och Coulson, A.

R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977) och Smith, A.

J. H., Methods in Enzymology 65, 56-580 (1980): och den andra av Maxam och Gilbert; Maxam, A. M. och Gilbert, W., Methods in Enzymology 65, Q99-559 (l980).

Metoden utvecklad av Sanger benämnes dideoxikedjetermineríngs- metoden. I den mest använda variationen av denna metod klonas ett DNA-segment i en enkelsträngad DNA-fag, såsom Ml3. Dessa fag-DNA kan tjäna som templater för den primade syntesen av den komplementära strängen med Klenow-fragmentet av DNA- polymeras I. Primern är antingen en syntetisk oligonukleotid eller ett restriktionsfragment isolerat från moder-rekombi- nant-DNA, som specifikt hybridiserar till en region av Ml3- vektorn nära 3'-änden av den klonade infällningen. I var och en av de fyra sekvenseringsreaktionerna genomföres den primade syntesen i närvaro av en tillräcklig mängd av dideoxianalogen av en av de fyra möjliga deoxinukleotiderna, så att de växande kedjorna slumpvis termineras genom införlivandet av dessa “dead-end"-nukleotider. Den relativa koncentrationen av di- deoxi- till deoxi-former justeras för att ge en spridning av terminationsutfall motsvarande alla tänkbara kedjelängder som kan upplösas genom gelelektrofores. Produkterna från var och en av de fyra primade syntesreaktionerna separeras därefter på individuella band av polyakrylamidgeler genom elektroforesen.

Radioaktiva markörer införlívade i de växande kedjorna användes för att framkalla en autoradiogrambild av mönstret av DNA i 456 348 varje elektroforesband. Sekvensen av deoxinukleotiderna i den klonade DNA bestämmes genom undersökning av mönstret av banden i de fyra gångerna.

Metoden utvecklad av Maxam och Gilbert använder kemisk behand- ling av renad DNA för att alstra storleksanordnade set av DNA-fragment analoga med de producerade enligt Sanger-metoden.

Enkel- eller dubbelsträngad DNA, märkt med radioaktivt fosfat vid antingen 3'- eller 5'-änden, kan sekvenseras enligt detta förfarande. I fyra reaktionsomgångar induceras spjälkning vid en eller två av de fyra nukleotidbaserna genom kemisk behand- ling. Spjälkningen utgöres av ett trestegsförfarande: modifie- ring av basen, avlägsnande av den modifierade basen från dess socker och strängsplittring vid detta socker. Reaktionsbe- tingelserna justeras så att huvuddelen av de alstrade ändmärk- ta fragmenten är i den storleksordning (i allmänhet l till 400 nukleotider) som kan upplösas genom gelelektrofores. Elektro- fores, autoradiografi och mönsteranalys genomföres huvudsak- ligen enligt Sanger-metoder. (Fastän den kemiska fragmenta- tionen var gång den sker nödvändigtvis ger två DNA-bitar, detekteras endast den bit, som innehåller ändmärkningen, på autoradiogrammet.) Båda dessa DNA-sekvenseringsmetoder användes i stor utsträck- ning och var och en har många variationer. Vid varje metod begränsas sekvenslängden som kan erhållas från en enkel omgång reaktioner primärt genom upplösningsförmågan hos polyakryl- amidgelerna som användes för elektroforesen. I allmänhet kan 200 till 400 baser avläsas från en enkel uppsättning gelband. Även om de är framgångsrika, har båda metoderna allvarliga nackdelar, problem primärt associerade med det elektrofore- tiska förfarandet. Ett problem är att radíomärkning måste användas som en markör för lokalisering av DNA-banden i gelerna, vilket medför svårigheter på grund av den korta hal- veringstiden för fosfor-32 och den därav följande instabi- liteten hos de radiomärkta reagensen samt problem med förstö- ring och hantering av radioaktivt avfall. Av större betydelse 456 348 är att autoradiografins natur (filmbilden av ett radioaktivt gelband är bredare än bandet i sig självt) och jämförelsen av bandpositionerna mellan fyra olika gelband (som kan uppträda enhetligt eller icke-enhetligt ur bandmobilitetssynpunkt) kan begränsa den observerade upplösningen av banden och därmed sekvenslängden som kan avläsas från gelen. Vidare gör band- -till-band (track-to-track)-ojämnheter automatisk scanning av autoradiogrammen svår - det mänskliga ögat kan för närvarande kompensera dessa oregelbundenheter mycket bättre än datorer.

Detta behov av manuell "läsning" av autoradiogrammen är tids- krävande, tröttsamt och ger lätt fel resultat. Dessutom kan man inte avläsa gelmönstren under det att elektroforesen genomföres, för att kunna avsluta elektroforesen så snart upp- lösningen blir otillräcklig för att separera närliggande band, utan man måste avsluta elektroforesen vid någon standardiserad tidpunkt och vänta på att autoradiogrammet skall framkallas innan sekvensavläsningen kan börja.

Föreliggande uppfinning avhjälper dessa och andra problem som är förenade med elektroforessteget i DNA-sekevenseringsförfa- randena och utgör ett väsentligt framsteg inom tekniken.

Sammanfattningsvis innefattar föreliggande uppfinning ett nytt förfarande för elektroforetisk analys av DNA-fragment framställda i DNA-sekvenseringsförfaranden, vari minst en kromofor eller fluorofor användes för att märka DNA-frag- menten alstrade genom sekvenseringskemin och möjliggör detek- tion och karaktärisering av fragmenten när de uppspjälkas genom elektrofores genom en gel. Detektionen använder sig av en absorptions- eller fluorescensfotometer med förmåga att moni- torera de märkta banden, när de rör sig genom gelen.

Föreliggande uppfinning innefattar även elektroforetisk ana- lys av DNA-fragment framställda vid DNA-sekvenseringsförfaran- den innefattande att man: .- 456 348 - etablerar en källa av kromofor- eller fluorescensmärkta DNA-fragment från sekvenseringsförfarandena, - etablerar en zon för att innehålla en elektroforesgel, - etablerar anordningar för att införa nämnda märkta DNA- fragment i nämnda zon, - etablerar en fotometrisk anordning för att monitorera"nämnda märkta DNA-fragment när de rör sig genom nämnda gel, och - monitorerar nämnda märkta DNA-fragment när de införes i nämnda zon och rör sig genom nämnda gel.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett nytt förfarande för sekvensanalys av DNA.

Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är att till- handahålla ett nytt system för analys av DNA-fragment.

Ett särskilt ändamål med föreliggande uppfinning är att till- handahålla ett förbättrat förfarande för sekvensanalys av DNA.

Dessa och övriga ändamål och fördelar med föreliggande upp- finning framgår av följande detaljerade beskrivning i kombina- tion med de bifogade ritningarna.

Med hänvisning till ritningarna: Figur l är en illustration av en anordning för änd-märkning av ett DNA-fragment med en fluorescerande markör. Pst. I och T4 DNA- ligas är enzymer som vanligen användes inom rekombinant-DNA- -forskning.

Figur 2 är ett blockdiagram av en automatiserad DNA-sekvena- tor, gelelektroforessystem.

Figur 3 är ett schematiskt diagram av en optisk konfiguration i detektorenheten. P, lampkälla; Ll, objektivlins; L2, kolli- 456 348 mationslins; Fl, UV-blockerande filter; P2, värmeblockerande filter; F3, “band pass excitation“-filter; F4, “long pass emission"-filter: DM, dikroisk spegel; C, polyakrylamidgel; PMT, fotomultiplikatorrör.

Figur 4 är ett schematiskt diagram av en annan optisk konfigu- ration i detektorenheten. Fl till F4 är "bandpass"-filter centrerade vid emissionsmaximum för de olika färgerna. Pl till P4 är fotomultiplikatorrör. Excitationsljuset är av sådan våglängd att det inte transmitteras genom något av filtren Fl till F4.

Figur 5 är en jämförelse av de dataslag som erhålles vid DNA- sekvensering av sekvensen visad i figur l.

Figur 6 är ett blockdiagram av en föredragen DNA~sekvenator enligt föreliggande uppfinning.

Design av märkta primers för användning vid Sanger-metoden.

Vid de tidigare metoderna för DNA-sekvensering, innefattande de baserade på Sanger-dideoxikedjeterminationsmetoden, användes enkel radioaktivt märkt fosfor-32 för att identifiera alla band på gelerna. Detta gör det nödvändigt att fragment- uppsättningarna alstrade i de fyra syntesreaktionerna köres på separata gelband och medför de problem som är förenade med jämförbara bandmobiliteter i de olika banden. Dessa problem övervinnes enligt föreliggande uppfinning genom användning av en uppsättning av fyra kromoforer eller fluoroforer med olika absorptions- respektive fluorescensmaxima. Var och en av dessa markörer är kemiskt kopplad till den primer, som användes för att initiera syntesen av fragmentsträngarna. Varje märkt primer paras därefter i sin tur med en av dideoxinukleotiderna och användes i den primade syntesreaktionen med K1enow-frag- mentet av DNA-polymeras. 456 348 Primerna måste ha följande karaktäristika. l) De måste ha en fri 3'-hydroxylgrupp för att möjliggöra kedjeextension genom polymerasen. 2) De måste vara komplementära till en unik 3'- region av den klonade infällningen. 3) De måste vara tillräck- ligt långa för att hybridisera till bildning av ett unikt, stabilt duplex. 4) Kromoforen eller fluoroforen får inte interferera med hydridiseringen eller förhindra 3'-änd-exten- sion genom polymerasen.

De ovan angivna betingelserna l, 2 och 3 uppfylles av flera syntetiska oligonukleotidprimers, som allmänt användes för sekvensering av Sanger-typ med användning av N13-vektorer. En sådan primer är 12 mer 5'TCA CGA CGT TGT 3', där A, C, G och T representerar de fyra olika nukleosidkomponenterna i DNA; A, adenosin; C, cytosin; G, guanosin; T, Lymidin.

Kemin för kopplingen av de kromofora eller fluorofora markörerna beskrives i sökandens svenska patentansökan nr 8406484-9 (inlämnad l9 december 1984), vars innehåll uttryckligen inbe- gripes häri. Den strategi som användes är att införa en alifa- tisk aminogrupp vid 5'~änden som sista addition i syntesen av oligonukleotidprimern. Denna reaktiva aminogrupp kan sedan lätt kopplas med en mångfald aminoreaktiva kromoforer och/- eller fluoroforer. Detta tillvägagångssätt bidrager till kompatibilitet hos de märkta primerna med betingelse 4 ovan.

De använda fyra färgämnena måste ha höga extinktionskoeffi- cienter och/eller skäligt höga kvantitativa utbyten för fluorescens. De måste ha väl upplösta absorptionsmaxima och/eller emissíonsmaxima. En representativ uppsättning av fyra sådana aminoreaktiva färgämnen är: fluoresceinisotio- cyanat (FITC, Äššx = 495, Äšïx = 520, E495 f 8 x l04), eosin- isotiøcyanat (EITC, Äššx = 522, Äšrâx = 533, 6522 e* s X 104), tetrametylrodaminisotiocyanat (TMRITC,'Ää:x = 550, Äââx = 578, O 5 4 x 104), och substituerat rodaminisotiocyanat (XRITC, X _ 580, Äšïx = 604, 5580 =' s x 104), där k representerar våglängden i nanometer, Ex är excitation, Em är emission, max s 456 348 är maximum och 5 är den molära extinktionskoefficienten.

Dessa färgämnen fästes till Ml3-primern och konjugaten elek- troforeras på en 20 % polyakrylamidgel. De märkta primerna är synliga både genom sin absorption och fluorescens i gelen.

Samtliga fyra märkta primers har identisk elektroforetisk mobilitet. De färgade konjugerade primerna bibehåller sin förmåga att specifikt hybridisera till DNA, vilket åskådlig- göres av deras förmåga att ersätta den icke-deriverade (underivitized) oligonukleotiden som normalt användes i sekvenseringsreaktionerna. Ändmärkning av DNA för användning vid Maxam/Gilbert-metoden.

Vid Maxam/Gilbert-metoden för DNA-sekvensering måste änden av den DNA-bit, vars sekvens skall bestämmas, märkas. Detta sker konventionellt enzymatiskt med användning av radioaktiva nukleosider. För att använda Maxam/Gilbert-metoden i samband med färgdetektionsschemat som beskrives i samband med denna uppfinning måste DNA-biten märkas med färgämnen. Ett sätt varpå detta kan ske visas i figur l. Vissa restriktions- endonukleaser alstrar det som är känt som ett 3'~överhäng som produkten av DNA-spjälkning. Dessa enzymer ger en "sticky end", en kort sträcka av enkelsträngad DNA vid änden av en bit av dubbelsträngad DNA. Detta område kommer att fästas (anneal) till en komplementär sträcka av DNA, som kan kovalent samman- fogas med duplex-DNA medelst enzymligasen. På detta sätt bindes kovalent en av strängarna till en spårbar grupp. Denna grupp kan vara ett färgämne, en aminogrupp eller en skyddad aminogrupp (från vilken skyddsfunktionen kan avlägsnas och som kan reagera med färgämne efter de kemiska reaktionerna).

Sekvenseringsreaktioner.

Dideoxisekvenseringsreaktionerna genomföres på standardsätt enligt Smith, A. J. H., Methods in Enzymology 65, 56-580 (1980), utom att skalan om så erfordras kan ökas för att ge en 456 548 adekvat signalintensitet i varje band för detektion. Reaktio- nerna utföres med användning av en annan färgprimer för varje särskild reaktion, t.ex. FITC för "A"-reaktionen, EITC för "C"-reaktionen, TMRITC för "G"-reaktionen och XRITC för "T"- reaktionen. Inget radiomärkt nukleosidtrifosfat behöver inklu- deras i sekvenseringsreaktionen.

Maxam/Gilbert-sekvenseringsreaktionerna genomföras på vanligt sätt, Gill, S. F., Aldrichimica Acta l6(3), 59-61 (1983), utom att ändmärket är antingen ett eller fyra färgade färgämnen eller en fri eller skyddad aminogrupp, som efteråt kan omsät- tas med färgämnet.

Gelelektrofores.

Prov från sekvenseringsreaktionerna kombineras och satsas på en 5 % polyakrylamidkolonn l0 visad i figur 2 från den övre behållaren 12. De relativa mängderna från fyra olika reaktio- ner i blandningen justeras empiriskt för att ge ungefär samma fluorescens eller absorptiva signalintensitet från vart och ett av de färgade DNA-konjugaten. Detta möjliggör kompensation för skillnader i färgextinktionskoefficienter, färgfluores- censkvantumutbyten, detektorsensitivitet och så vidare. En hög spänning anbringas tvärs över kolonnen 10 för att elektrofo- rera de märkta DNA-fragmenten genom gelen. De märkta DNA-seg- menten, som skiljer i längd med en singelnukleotid, separeras genom elektrofores i denna gelmatris. Vid eller nära botten av gelkolonnen 10 upplöses DNA-banden från varandra och passerar genom detektorn 14 (närmare beskriven i nästa avsnitt). Detek- torn 14 detekterar de fluorescerande eller kromofora banden av DNA i gelen och bestämmer deras färg, och därigenom mot vilken nukleotid de svarar. Denna information ger DNA-sekvensen.

Detektion.

Det finns många olika sätt för att detektera de märkta moleky- lerna, som separerats på längden med användning av polyakryl- 456 548 amídgel-elektrofores. Fyra illustrerande sätt beskrives nedan.

Dessa är i) detektion av fluorescensen exciterad genom ljus av olika våglängd för de olika färgämnena, ii) detektion av fluo- rescens exciterad genom ljus av samma våglängd för de olika färgämnena, iii) eluering av molekylerna från gelen och detek- tion genom kemiluminescens och iv) detektion genom absorption av ljus genom molekylerna. I sätten i) och ii) skall fluores- censdetektorn uppfylla följande fordringar. a) Excitations- ljusstrålen skall inte ha en höjd som är väsentligt större än höjden av ett band. Detta ligger normalt i området 0,1 till 0,5 m. Användningen av en sådan snäv excitationsstråle möj- liggör att maximal upplösning av banden erhålles. b) Excita- tionsvåglängden kan varieras för att matcha absorptionsmaxima för vart och ett av de olika färgämnena eller kan vara ett enda snävt ljusband med hög intensitet, som exciterar alla fyra fluoroforer och inte överlappar något av fluorescens- emissionen. C) Den optiska konfigurationen bör minimera flödet av spritt och reflekterat excitationsljus till fotodetektorn l4. De optiska filtren, som blockerar spritt och reflekterat excitationsljus, varieras allt eftersom excitationsvåglängden varieras. d) Fotodetektorn 14 bör ha en förhållandevis låg störningsnivå och ett gott spektralsvar samt en mängdeffek- tivitet inom hela emissionsomrädet för färgämnena (500 till 600 nm för de ovan angivna färgämnena). e) Det optiska sys- temet för uppsamling av emitterad fluorescens bör ha en hög numerisk öppning (aperture). Detta maximerar fluorescens- signalen. Vidare bör fältdjupet för optikkollektionen inklu- dera hela vidden av kolonnmatrisen.

Två illustrerande fluorescensdetektionssystem anges i figu- rerna 3 och 4. Systemet i figur 3 är kompatibelt med antingen enkelvåglängdsexcitation eller multipelvåglängdsexcitation.

För enkelvåglängdsexcitation är filtret F4 ett av fyra "band pass"-filter centrerade vid emissionsvåglängdtoppen för vart och ett av färgämnena. Detta filter kopplas om med några sekunders intervall för att möjliggöra kontinuerlig monitore- ring av var och en av de fyra fluoroforerna. För multipelvåg- L 456 348 ll längdsexcitation kopplas de optiska elementen F3 (exci- tationsfilter), DM (dikroisk spegel) och F4 (barriärfilter) tillsammans. På detta sätt varieras både excitationsljuset och det observerade emissionsljuset. Systemet i figur 4 är en bra anordning för enkelvâglängdsexcitation. Detta system har för- delen att inga rörliga delar erfordras och fluorescens från alla de fyra färgämnena kan monitoreras samtidigt och konti- nuerligt. Ett tredje sätt (iii ovan) att detektera är att eluera de märkta molekylerna i botten av gelen, kombinera dessa med ett medel för excitation av kemiluminescens, såsom 1,2-dioxetandion, Gill, S. K., Aldrichimica Acta l6(3), 59-61 (1983): Mellbin, G. J., Liq. Chrom. 6(9), 1603-1616 (1983), och flöda blandningen direkt in i en detektor, som kan mäta det emitterade ljuset vid fyra separata våglängder (denna detektor liknar den visad i figur 4 men kräver inte någon excitationsljuskälla). Bakgrundssignalen vid kemiluminescens är mycket lägre än vid fluorescens, vilket resulterar i högre signal till störningsförhållanden och ökadfkänslíghet. Slut- ligen kan mätningen utföras genom mätningar av ljusabsorp- tionen (iv ovan). I detta fall föres en ljusstråle av varier- bar våglängd genom gelen, och minskningen i strålningsinten- sitet beroende på ljusabsorption av de märkta molekylerna mätes. Genom mätning av ljusabsorptionen vid olika våglängder motsvarande absorptionsmaximum för de fyra färgämnena är det möjligt att bestämma vilken färgmolekyl, som finns i ljus- vägen. En olägenhet vid denna typ av mätning är att absorp- tionsmätningarna i sig är mindre känsliga än fluorescens- mätningar.

Det ovan beskrivna detektionssystemet är anpassat till en dator 16. vid varje undersökt tidsintervall erhåller datorn 16 en signal proportionell till den uppmätta signalintensiteten vid denna tidpunkt för vart och ett av de fyra färgade märkena.

Denna information talar om vilken nukleotid, som terminerar DNA-fragmentet av den speciella längden i observationsfönstret vid denna tidpunkt. Den tidsmässiga sekvensen av färgade band ger DNA-sekvensen. I figur 6 visas den typ av data som erhål- 456 343 12 les enligt konventionella metoder liksom den typ av data som erhålles genom de förbättringar som beskrives enligt före- liggande uppfinning.

Följande exempel avser endast att åskådliggöra uppfinningen.

EXEMPEL Figur 6 visar ett blockdiagram av en DNA-sekvenator att an- vändas med ett färgämne åt gången. Strålen (4880 Å) från en argonjonlaser 100 riktas in i polyakrylamidgelröret (prov) 102 med hjälp av en strålstyrare 104. Fluorescens exciterad av strålen samlas med användning av en låg f-nummerlins 106, föres genom en lämplig uppsättning optiska filter 108 och ll0 för att eliminera spritt excitationsljus och detekteras med användning av ett fotomultiplikatorrör (PMT) ll2. Signalen detekteras lätt på en remsskrivare. DNA-sekvenseringsreaktio- nerna genomföres med användning av en fluoresceinmärkt oligo- nukleotidprimer. Topparna på skrivaren motsvarar fragment av fluoresceinmärkt DNA av varierande längder syntetiserade i sekvenseringsreaktionerna och separerade i gelröret genom elektrofores- Varje topp innehåller fluorescein i storleks- ordningen l0_l5 till 10-16 mol, vilket är ungefär lika med mängden DNA som erhålles per band i en ekvivalent sekvense- ringsgel med användning av radioisotopdetektion. Detta visar att fluoresoensmärket inte avlägsnats eller nedbrutits från oligonukleotidprimern i sekvenseringsreaktionerna. Det visar även att detektionssensitiviteten är fullt adekvat för att genomföra DNA-sekvensanalys på detta sätt. a)

Claims (19)

456 348 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för elektroforætisk analys av DNA-fragment framställda vid DNA-sekvenseringsförfaranden, k ä n n e - t e c k n a t därav, att man tillhandahåller märkta DNA- fragment med minst en kromofor eller fluorofor framställd genom sekvenseringskemi och detekterar nämnda fragment när de uppspjälkas genom elektrofores genom en gel.

2. Sätt för DNA-sekvensering enligt kedjetermineringsmetoden enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att en primeroligonukleotid märkt med en färgad markör användes.

3. Sätt för DNA-sekvensering enligt kedjetermineringsmetoden enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att en primeroligonukleotid märkt med en fluorescerande markör an- vändes.

4. Sätt för DNA-sekvensering enligt den kemiska nedbrytnings- metoden enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att DNA-molekyler märkta med en färgad markör användes.

5. Sätt för DNA-sekvensering enligt den kemiska nedbrytninge- metoden enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att DNA-molekyler märkta med en fluorescerande markör använ- des.

6. Sätt för DNA-sekvensering enligt patentkravet l, k ä n n e- t e c k n a t därav, att en uppsättning av fyra kromoforer eller fluoroforer användes för att märka nämnda DNA-fragment framställda enligt sekvenseringskemin.

7. Sätt för DNA-sekvensering enligt kedjetermineringsmetoden, k ä n n e t e c k n a t därav, att den primeroligonukleotid som användes i var och en av de fyra sekvenseringsreaktionerna A, C, G och T har en olikfärgad markör fäst till denna och att 456 348 É W prov av de ovannämnda sekvenseringsreaktionerna kombineras och elektroforeras tillsammans på polyakrylamidgel och detekteras efter deras separation på gelen.

8. Sätt för DNA-sekvenseríng enligt kedjetermineringsmetoden, k ä n n e t e c k n a t därav, att primeroligonukleotiden an- vänd i var och en av de fyra sekvenseringsreaktionerna A, C, G och T har en särskild fluorescerande markör fäst till denna och att prov av de ovannämnda sekvenseringsreaktionerna kombineras och elektroforeras tillsammans på polyakrylamidgel och detekteras efter deras separation på gelen.

9. Sätt för DNA-sekvensering enligt den kemiska nedbrytnings- metoden, k ä n n e t e c k n a t därav, att DNA-molekylerna märks med olikfärgade markörer och att en olika färgad DNA an- vändes i var och en av de kemiska modifikationsreaktionerna och att prov av de ovannämnda sekvenseringsreaktionerna kom- bineras och elektroforeras tillsammans på en polyakrylamidgel och detekteras efter deras separation på gelen.

10. l0. Sätt för DNA-sekvensering enligt den kemiska nedbrytnings- metoden, k ä n n e t e c k n a t därav, att DNA-molekyler mär- kes med olika fluorescerande markörer och att olika fluore- scerande DNA anvândes i var och en av de kemiska modifika- tionsreaktionerna och att prov av de ovannämnda sekvenserings- reaktionerna kombineras och elektroforeras tillsammans på en polyakrylamidgel och detekteras efter deras separation på gelen.

11. ll. Sätt för DNA-sekvensering enligt den kemiska nedbrytnings- metoden, k ä n n e t e c k n a t därav, att DNA-molekyler förses med en aminogrupp, som kopplas till en färgmolekyl efter sekvenseringsreaktionen.

12. l2. Sätt för DNA-sekvensering enligt den kemiska nedbrytnings- metoden, k ä n n e t e c k n a t därav, att DNA-molekyler förses med en skyddad aminogrupp, som deblockeras och kopplas till en färgmolekyl efter sekvenseringsreaktionerna. 456 348 I5

13. Sättet enligt patentkravet ll, k ä n n e t e c k n a t därav, att produkterna av var och en av de olika sekvense- ringsreaktionerna kopplas med ett olika färgat färgämne, att prov av nämnda färgmärkta reaktionsprodukter kombineras och elektroforeras på en polyakrylamidgel och detekteras efter deras separation på gelen.

14. l4. Sättet enligt patentkravet 12, k ä n n e t e c k n a t därav, att produkterna av var och en av de olika sekvense- ringsreaktionerna kopplas med ett olika färgat färgämne, att prov av de färgmärkta reaktionsprodukterna kombineras och elektroforeras på en polyakrylamidgel och detekteras efter deras separation på gelen.

15. Elektroforetisk analys av DNA-fragment framställda vid DNA-sekvenseringsförfaranden innefattande att man: etablerar en källa av kromofor- eller fluorescentmärkta DNA- fragment från sekvenseringsförfaranden, etablerar en zon för att innehålla en elektroforesgel, etablerar anordningar för att införa nämnda märkta DNA~frag- ment i nämnda zon, etablerar fotometríska anordningar för att monitorera nämnda DNA-fragment när de rör sig genom nämnda gel, och monitorerar nämnda märka DNA-fragment när de införes i nämnda zon och rör sig genom nämnda gel.

16. Det nya förfarandet enligt patentkravet 15, k ä n n e- t e c k n a t därav, att den fotometriska anordningen är en absorptíonsfotometer.

17. Det nya förfarandet enligt patentkravet 15, k ä n n e - t e c k n a t därav, att den fotometriska anordningen är en fluorescensfotometer.

18. Det nya förfarandet enligt patentkravet 15, k ä n n e - t e c k n a t därav, att DNA-fragmenten märkes med en amino- grupp som kopplas till en färgmolekyl. 456 348 W

19. Det nya förfarandet enligt patentkravet 15, k ä n n e - t e c k n a t därav, att en uppsättning av fyra kromoforer eller fluoroforer är närvarande-för att märka nämnda DNA-frag- ment från sekvenseringsförfarandet_