JP2013509863A - 定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング(qNPS) - Google Patents
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Abstract
本発明は、シークエンシングが直面している幾つかの難題に取り組むための新規アプローチ、定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング(qNPSTM)を提供し、研究および診断用途に改善をもたらす。この方法は、溶解(ヌクレアーゼのみ)保護アッセイを用いて、シークエンシング用の核酸、例えばDNAプローブを作成するものであり、該プローブを遺伝子特異的タグにカップリングさせて、該ヌクレアーゼ保護プローブ自体のシークエンシングを必要とすることなく、遺伝子の同定を可能にすることができ、および/または該プローブを実験特異的タグにカップリングさせることができ、それによって異なる患者からのサンプルを単一ランに統合することができる。本開示qNPSは、固定されたかまたは不溶性のサンプルのシークエンシングを可能にし、研究および発見ツールとしてならびに診断試験として利用可能にする。
Description
本発明は、一般に、核酸ターゲットの同定および検出の際に定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング(qNPS)を行うための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、シークエンシングを用いて生物学的サンプルからの核酸を分析するための組成物および方法を提供する。
本発明は、シークエンシングが直面している幾つかの難題に取り組むための新規アプローチ、定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング(qNPSTM)を提供し、研究および診断用途に改善をもたらす。この方法は、溶解(ヌクレアーゼのみ)保護アッセイを用いて、シークエンシング用のDNA(または他の合成)プローブを作成するものであり、該プローブをそれら自体シークエンシングすることができ、または(a)遺伝子特異的タグにカップリングさせて、該ヌクレアーゼ保護プローブ自体のシークエンシングを必要とすることなく、遺伝子の同定を可能にすることができ、および/もしくは(b)実験特異的タグにカップリングさせて、異なる患者からのサンプルを単一ランに統合させることができる。本開示qNPSは、固定されたまたは不溶性のサンプルならびにすべてのタイプの他のサンプルのシークエンシングを可能にし、研究および発見ツールとしてならびに診断試験として利用可能にする。
現行のシステム(例えば、454、Solexa、SOLID)および次世代プラットホーム(例えば、一分子シークエンシング)でのシークエンシング方法をさらに開示する。qNPSは、数ある中でも、i)低コスト/少ないサンプルをもたらす;ii)高いサンプルスループットをもたらす;iii)シークエンシングラン時間を短縮し、データ分析を単純化する;iv)他のバックグラウンド(例えば宿主からの病原体)遺伝子からの干渉を伴わないターゲット遺伝子の効率的なシークエンシングを可能にする;v)バイオマーカーとして有用である遺伝子発現、発現される一塩基多型(SNP)、DNA SNP、DNAメチル化、rRNA、miRNA、突然変異などのシグネチャセットの正確な測定の仕方を提供する;vi)すべてのサンプルタイプからの、特に、固定された組織、例えばホルマリン固定組織、または固定され細胞内染色され分類されたサンプル、からのシークエンシングを可能にする;およびvii)シークエンシングされるサンプルの複雑さを遺伝子全体からヌクレアーゼ保護プローブまたはそのプローブによって保護されたターゲット配列だけへと大きく単純化する、研究および診断のための的を絞ったまたは目標を定めたシークエンシング能力を提供する。
動物組織および臨床サンプルは、概して、パラフィン包埋ホルマリン固定(FFPE)組織の形態での固定により保存される。従って、組織遺伝子発現およびDNAの商業的に実現可能な診断アッセイは、FFPEを使用できなければならない。さらに、何百万ものそのようなサンプルが診療センターおよび病院に保管されており、対応する処置様式および臨床転帰は公知である。従って、FFPEサンプルは、診断バイオマーカーを迅速かつ効率的に同定する、そしてその後、予後判定および診断アッセイを開発および検証するための、非常に貴重な資源に相当する。
幾つかの難題に研究および診断用途のシークエンシングは直面している。本開示定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング(qNPS)法は、溶解(ヌクレアーゼのみ)保護アッセイを用いて、シークエンシング用の(例えばDNA)プローブを作成するものであり、該プローブを直接シークエンシングすることができ、または例えば、(i)遺伝子特異的タグにカップリングさせて、該ヌクレアーゼ保護プローブ自体のシークエンシングを必要することなく測定される遺伝子配列の同定を可能にすることができ、および/もしくは(ii)実験特異的タグ、別個のサンプルそれぞれについて1つの一意的タグ、にカップリングさせて(異なる患者からの、または異なる治療もしくは実験からの)異なるサンプルを単一シークエンシングランに統合することができるが、シークエンシングした後にそれらのサンプルは依然として区別可能である。qNPSは、数ある中でも、i)低コスト/少ないサンプルをもたらす;ii)高いサンプルスループットをもたらす;iii)シークエンシングラン時間を短縮し、データ分析を単純化する;iv)非ターゲット遺伝子または遺伝子配列のバックグラウンドからの干渉を伴わないターゲット遺伝子の効率的なシークエンシング(例えば、宿主組織からの病原体遺伝子のシークエンシング、または宿主組織ゲノムの干渉を伴わない移植組織のシークエンシングを含む)を可能にする;v)バイオマーカーとして有用である遺伝子発現、発現される一塩基多型(SNP)、DNA SNP、DNAメチル化、すべてのRNA(miRNA、rRNAを含む)、突然変異または他のヌクレオチドターゲットのシグネチャセットの正確な測定の仕方を提供する;vi)すべてのサンプル(特に、固定された組織、例えばホルマリン固定組織、またはヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色組織、またはグルタルアルデヒド固定組織、例えば固定され細胞内染色され分類された細胞を含む)からのシークエンシングを可能にする;およびvii)シークエンシングされるサンプルの複雑さを遺伝子全体からヌクレアーゼ保護プローブだけへと大きく単純化する、シークエンシング能力を提供する。
1つの態様において、本発明は、例えば454、SolidおよびSolexaシークエンサーの現世代のための、ならびに一分子シークエンサーおよびそれ以降の次世代のためのプローブおよび方法を提供する。これらのシステムの多くは、多数のサンプルを並行してシークエンシングさせる多数のチャンネルを有するが、シークエンシングラン1回あたりのコストは、$7,000から$9,000であり、このランは少なくとも数日続き得る。PacBioなどの一分子シークエンサーは、$100から$200/サンプルの範囲でコストを提示し得るが、サンプル調製コストを加えると、これはまだ高い。サンプルあたりのコストを下げてサンプルスループットを増す方策は、それぞれの実験からシークエンシングされる分子を同定するためにシークエンシング可能な「タグ」−「実験用タグ」と呼ぶ−を使用して、マルチチャンネルシークエンサーのそれぞれのチャンネル内で、それぞれのシークエンシングランで多数のサンプルを試験する方策である。配列読み取り長さを短くすることで効率を増すことができる。遺伝子全体もしくは遺伝子フラグメントではなくヌクレアーゼ保護プローブだけのシークエンシング、またはターゲット配列を同定するための短い一意的遺伝子タグの使用により、シークエンシングを用いて遺伝子レベルまたは存在を同定および定量する(しかし遺伝子配列内の未知の差を同定しない)用途について、この効率が達成される。遺伝子タグの使用は、ヌクレアーゼ保護プローブ設計も単純化する。シークエンシングに利用できる端が一意的である必要がないからである。しかし、ヌクレアーゼ保護プローブまたは該プローブによって保護されるターゲットオリゴヌクレオチドを、遺伝子タグを使用せずに直接シークエンシングしてもよい。この場合、ターゲット配列内の変異の存在も、それらが結果としてヌクレアーゼ保護プローブのS1切断または部分的加水分解を生じさせ、その結果、部分的プローブ配列パターンが生ずる場合、または前記ターゲットオリゴヌクレオチドの保護された部分がシークエンシングされるとき、同定することができる。このプロセスを、突然変異(単数または複数)の同定を含むように設計することもできる。このことをここでさらに論ずる。
シークエンシングは、人に一定の疾患の素因を与え得るまたは有害な薬物代謝を警告し得るゲノムDNAの差を同定するために非常に効果的である。しかし、例えば、臨床的に意義のあるサンプルタイプからの遺伝子発現、miRNAレベルならびにDNAメチル化状態および他の突然変異の評定を必要とするであろう、患者の状態を同定するおよび治療に対する応答を予測する診断に有用なシークエンシング方法を実現するために、まだ大量の開発が残っている。遺伝子シークエンシング会社は、ますます低コストでゲノムのシークエンシングを提供するという彼らの商業的探究の中でこの領域に的を絞ってこなかった。
固定、例えばパラフィン包埋ホルマリン固定(FFPE)、組織からのシークエンシングは、問題が多く、困難であるとされてきたが、臨床サンプルは、概して固定のよりFFPE組織の形態で保存される。従って、関心が、推定バイオマーカーもしくは疾患および薬物メカニズムを同定することであるにせよ、または組織遺伝子発現およびDNAの商業的に実現可能な診断アッセイのための基礎の開発およびその後の適用であるにせよ、そのアッセイは、FFPEを使用できなければならない。さらに、何百万ものそのようなサンプルが診療センターおよび病院に保管されており、対応する処置様式およびFFPEドナーの臨床患者転帰は公知である。従って、FFPEおよび他の固定サンプルは、薬物ターゲット、疾病マーカーおよび経路ならびに診断バイオマーカーを迅速かつ効率的に同定する、そしてその後、予後判定および診断アッセイを開発および検証するための、または疾患進行もしくは薬物活性と関連づけられる遺伝子およびメチル化状態発現の変化または突然変異を同定するための、非常に貴重な資源に相当する。FFPEからのDNAおよびRNAのシーケンシングは、シークエンシングにとって問題があるばかりでなく、アレイベースの方法およびPCRにとっても問題があり、おそらく同じ理由のため−−ゲノムDNAの有意な部分、およびトランスクリプトームRNAは、組織に架橋される。プロセッシングおよび分析のために、この架橋を逆転させ、ターゲット遺伝子を回収しなければならない。FFPEから回収される全RNAは、固定に起因するにせよ、FFPEからのRNAの抽出プロセスに起因するにせよ、概して一部は分解される。研究の場では、分析のために分解されすぎるサンプルは単に廃棄される場合があるが、診断の場では、患者のサンプルの廃棄は許容され得ない。従って、シークエンシング力を認識した上で、研究の場または特に診断の場でFFPEに適用することは、かなり難題である。研究からのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織についてのそれぞれの情報内容は、正確かつ単純な分析法を待って、これらのサンプルの膨大な保管庫の中にしまい込まれたままである。上述のことすべてが、核酸、DNA、RNA、tRNA、rRNA、miRNAなどおよびこれらの配列内の突然変異、すべてにあてはまる。
シークエンシング用途に突きつけられるもう1つの難題は、サンプルあたりのコストである。現在、シークエンシングランには$7,000から$10,000の費用がかかり得る。要求が、異なる患者サンプルのシークエンシングであるにせよ、異なる実験からのサンプルのシークエンシングであるにせよ、それぞれ別々に試験すると、たとえ異なるサンプルを(例えば、454またはSolexa)計器のそれぞれのチャンネルで試験したとしても、サンプルあたりのコストは、〜$1,000である。本開示発明は、それぞれの分子に取り付けた実験用タグを用いて、異なる実験または患者サンプルを同じ計器チャンネル内での単一ランに統合する能力を提供する。これらをシークエンシングして、互いから単一のシークエンシングサンプルに統合された単一の実験または患者サンプルそれぞれからのすべての分子を一意的に同定する。例えば、100人の患者のサンプル(異なる一意的実験用タグでそれぞれにマークを付けた、それぞれの患者サンプルからのqNPS生成物)を単一の、例えば3日のランに統合することにより、サンプルあたりのシークエンシングコストは、たった〜$10となる。100の遺伝子/サンプルを測定するためのこのレベルでのコストであれば、サンプルをプロセッシングする(例えば、それを採集する、それをプロセッシングするなど)コストを加えた後でさえ、診断試験および日常的実験またはスクリーニングアッセイは手の届くものになる。
実験用タグの使用は、コスト/サンプルを低減するばかりでなく、例えば、単一チャンネル内での単一ランでシークエンシングされる100または1,000の異なる実験を可能にすることにより、高いサンプルスループットも可能にする。例えば、1チャンネルにつき100のサンプルをプールすると、8,000のサンプルを8チャンネルシークエンサーの単一ランで試験することができるだろう。これは、例えば、多くの遺伝子ターゲット/サンプルにわたって、ハイスループットスクリーニングの適用を可能にする。
qNPSプロセスのもう1つの利点は、結果として生ずる単純化されたデータ分析である。ターゲット分子のみをヌクレアーゼ保護プローブにハイブリダイズさせるため、サンプル中の残存ゲノムDNAおよびRNAは、破壊され、(例えば、それらにライゲートされたシークエンシングアダプター分子を有さないことにより)シークエンシングに利用不能にされ、その結果、シークエンシングされるヌクレアーゼ保護プローブまたはそれらの保護ターゲットオリゴヌクレオチドの定量的セットのみが残る。これらのプローブおよびターゲットの配列は公知であるため、参照配列データベースは、もっぱらこれらの配列から成ればよく、ゲノム全体から成る必要はない。さらに、遺伝子識別子タグの標準セットがシークエンシングされるNPP付加生成物に組み込まれている場合には、シークエンシング情報のデコンボリューションがさらにいっそう単純化される。本質的に、配列分析を、合成ヌクレアーゼ保護プローブおよび誘導されるシークエンシング可能付加生成物またはターゲットオリゴヌクレオチドの同定既知配列または部分配列それぞれの数の「計数」、および該ターゲットオリゴヌクレオチドの配列内の任意の差の同定に縮小することができる。
これのさらなる利点は、微量分子をシークエンシングすることができる点、または例えば、病原体からのターゲット分子を、宿主ゲノムの煩わしいシークエンシングを伴わずに宿主組織からシークエンシングすることができる点である。まさに同じく重要なこととして、シークエンシングを用いて発現遺伝子レベルを定量的に測定するとき、細胞1個につき1つだけのコピーというレベルで測定される遺伝子ばかりでなく何千ものコピー/細胞というレベルで発現される遺伝子を測定できることが重要である。ゲノム全体のバックグラウンドを排除すること、および関心のあるターゲット遺伝子にのみ的を絞ること、および実際にターゲット遺伝子自体を短い配列(例えば、50塩基のヌクレアーゼ保護プローブ)にまたはさらに短い遺伝子識別子タグに短縮することによって、シークエンシングの効率を増加させ、存在度が非常に異なる遺伝子を測定するダイナミックレンジを増加させる。
ヌクレアーゼ保護プローブのみのシークエンシング、または遺伝子識別子タグの使用は、読み取り時間を短縮して、シークエンシング結果をはるかに速く得ることを可能にする。
また、qNPSプロトコルは、サンプルの溶解を利用し、抽出または(例えば、遺伝子発現のために)逆転写を必要としないため、それを完全にかつ簡単に自動化することができる。これは、ハイスループットスクリーニングにとって必要不可欠であり、診断アッセイまたは一般的な実験室アッセイに役立つものでもある。さらに、溶解サンプルは、すべてのターゲット分子、例えばすべてのmRNAおよびすべてのmiRNA、を含有する。抽出プロトコルは、これらのうちの一方もしくは他方の一部を失うことが多く、またはDNAからのRNAの分離を必要とする。明瞭であるように、qNPSを、(例えば)精製されたRNA、miRNA、DNAまたはcDNAをはじめとする、任意のサンプルで行うことができる。
すべてのタイプのターゲット分子をqNPSによって測定することができる。例は、DNA、DNA一塩基多型(SNP)、メチル化DNAレベル、mRNA発現、mRNASNP、miRNAレベル、rRNAレベル、siRNA、tRNA、遺伝子融合または他の突然変異、タンパク質結合DNAまたはRNA、およびまたcDNAなどである。たとえターゲット分子自体を決してシークエンシングすることができず、多くの場合、最も好ましくはそれらが破壊されるとしても、ヌクレアーゼ保護プローブをハイブリダイズさせるように設計することができるあらゆるものをシークエンシングによって定量および同定することができる。ヌクレアーゼ保護プローブは、ターゲット分子をシークエンシングのためにヌクレアーゼから保護するので、遺伝子タグおよび実験用タグをヌクレアーゼ保護プローブにではなくターゲット分子に取り付けてもよい。いずれにせよ、ターゲット分子は、その後は場合により重要でなく、NPPも同様である。
シークエンシング
本明細書において用いる場合の「シークエンシング」は、非分岐生体高分子の一次構造(または一次配列)を決定することを意味する。シークエンシングは、シークエンシングされる分子、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチド、の大量の原子レベル構造を簡潔に要約する配列として知られている記号線形描写をもたらす。分子が、ポリヌクレオチド、例えばRNAまたはDNAなどである場合、シークエンシングを用いて、ヌクレオチドレベルでその分子についての情報を得ることができ、その後、その情報を、分子それ自体および/またはそれによってコードされたポリペプチドについての様々な二次情報の解読に用いることができる。
本明細書において用いる場合の「シークエンシング」は、非分岐生体高分子の一次構造(または一次配列)を決定することを意味する。シークエンシングは、シークエンシングされる分子、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチド、の大量の原子レベル構造を簡潔に要約する配列として知られている記号線形描写をもたらす。分子が、ポリヌクレオチド、例えばRNAまたはDNAなどである場合、シークエンシングを用いて、ヌクレオチドレベルでその分子についての情報を得ることができ、その後、その情報を、分子それ自体および/またはそれによってコードされたポリペプチドについての様々な二次情報の解読に用いることができる。
ポリヌクレオチドがRNA分子であるとき、その分子の不安定性およびヌクレアーゼ(例えば、RNase)分解しやすいその傾向のため、サンプルを先ず逆転写してDNAフラグメントを作成することが従来望ましく、その後、本明細書において説明する方法のいずれかによってそれらをシークエンシングすることができる。これは、依然として本発明の選択肢である。しかし、qNPSは、逆転写の必要を無くし、その代り、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ活性によりターゲットRNA配列を相補的DNAプローブ配列に変換する。当該技術分野において承知されているように、RNAをコードする遺伝子配列ではなくRNA分子をシークエンシングすることが時として望ましい。RNA分子は、それらのDNAテンプレートと必ずしも共線でないからである。また、一部の生物はRNA、例えばRNAウイルス、である。例えば、イントロン切り出しおよびスプライシングは、2つのポリヌクレオチド種間の非線形性の一因となる2つの事象である。本発明の他の実施形態では、当該技術分野において公知であるさらなる方法を用いて、細胞または組織の全トランスクリプトームを分析することができる。
任意のシークエンシング方法を本発明において用いることができる。
DNAシークエンシングは、所定のDNAフラグメントのヌクレオチド順序を決定するプロセスである。今までのところ、殆どのDNAシークエンシングは、(Frederick Sangerによって開発された)連鎖停止法を用いて行われている。この技術は、修飾ヌクレオチド基質を使用するDNA合成反応の配列特異的停止を用いる。チェーン・ターミネーター・シークエンシングでは、テンプレートDNA上の特定の部位で、そのテンプレートのその領域に相補的な短いオリゴヌクレオチド「プライマー」を使用することによって、伸長を開始する。DNAポリメラーゼ(DNAを複製する酵素)を使用してそのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する。前記プライマーおよびDNAポリメラーゼを用いて、4つのデオキシヌクレオチド塩基(DNA結合性ブロック)を低濃度の連鎖停止性ヌクレオチド(最も一般的にはジ−デオキシヌクレオチド)と一緒に含める。DNAポリメラーゼによる連鎖停止性ヌクレオチドの制限組み込みは、結果として、その特定のヌクレオチドを用いる位置だけが停止されている一連の関連DNAフラグメントを生じさせる。その後、それらのフラグメントを、スラブポリアクリルアミドゲルでの電気泳動、またはより一般的に今は、粘稠ポリマーが充填された細いガラス管(キャピラリー)での電気泳動によってサイズ分けする。
プライマーの標識付けの代案は、代わりにターミネーターを標識付けすることであり、「ダイ・ターミネーター・シークエンシング」と一般に呼ばれる。このアプローチの主な利点は、標識プライマーアプローチで必要とされる4つではなく、単一の反応で完全シークエンシングセットを行うことができる点である。これは、異なる波長で蛍光を発する別個の蛍光色素でそれぞれのジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーターを標識することによって果たされる。この方法は、ダイプライマーアプローチより容易であり、安価であり、迅速である。
パイロシークエンシングは、数ある中でもBiotage(ロー・スループット・シークエンシング用)および454 Life Sciences(ハイ・スループット・シークエンシング用)によって商品化されている。後者のプラットホームは、単一の機械を用いて7時間のランでおおよそ100メガ塩基をシークエンシングする。(454 Life Sciencesによって商品化されている)アレイベースの方法では、一本鎖DNAをビーズにアニールし、EmPCRによって増幅する。その後、これらのDNA結合ビーズをATPの存在下で光を生じさせる酵素と共に光ファイバーチップ上のウエルに配置する。このチップ上の遊離ヌクレオチドを洗浄すると、ヌクレオチドがそれらの相補的塩基対と連結してATPが作成されるので、光が生成される。1つ(以上)のヌクレオチドの付加の結果、光シグナルを発生させる反応が生じ、この光シグナルがその計器内のCCDカメラによって記録される。シグナル強度は、1回のヌクレオチドフローで組み込まれるヌクレオチド、例えばホモポリマーストレッチ、の数に比例する。
現行シークエンサー(Solexa、454、Solid)は、シークエンシングチップまたはビーズ上にターゲット配列を捕捉して増幅した後、シークエンシングする。次世代一分子シークエンシングは、捕捉後の増幅を用いない。アダプター配列またはポリAテールを捕捉に用いる。あるいは、捕捉工程がないことがある。その代り、(例えば、)捕捉されたポリメラーゼを使用して、通過オリゴヌクレオチドを捕捉し、シークエンシングすることができる。
454またはSolexaによるシークエンシングは、DNAのランダムフラグメント化によって果たされるライブラリー調製、続いて共通アダプター配列のインビトロライゲーションを概して含む。qNPSについては、DNAのランダムフラグメント化工程を迂回することができ、アダプター配列のインビトロライゲーションは、ヌクレアーゼ保護プローブへのものである場合もあり、またはヌクレアーゼ保護プローブのため遺伝子タグもしくは実験用タグへのものである場合もある。ShendureおよびJi(2008)は、シークエンシング方法を総説しており、以下は、454およびSolexaシステムの簡単な要約である。454およびSolexaについては、それぞれエマルジョンPCRまたはブリッジPCRを用いる、シークエンシングフィーチャーとして役立つクローン的クラスター化アプリコンの作成。これらの方法に共通することは、任意の所定の単一ライブラリー分子に由来するPCRアンプリコンが、最終的に、平面支持体上の単一の位置(Solexa、インサイチューポロニー、ブリッジPCR)、または回収してアレイにすること(エマルジョンPCR)ができるマイクロメートルスケールのビーズの表面(454、エマルジョンPCR)、いずれかに空間的にクラスター化されることである。前記シークエンシングプロセス自体は、酵素由来の生化学と画像化に基づくデータ獲得との交互サイクルから成る。これらのプラットホームは、合成によるシークエンシング、すなわちプライマー処理テンプレートの連続伸長、に依存する。酵素的インターロゲーションと画像化の連続反復を用いて、それぞれのアレイフィーチャーについての連続シークエンシング読み取りを蓄積する。それぞれのサイクルでの全アレイの(例えば、ポリメラーゼによって組み込まれた蛍光標識ヌクレオチドの)画像化によって、データを獲得する。
454については、シークエンシングプライマーを万能アダプターに、未知配列またはqNPSシークエンシング可能付加生成物、例えばヌクレアーゼ保護プローブまたは遺伝子もしくは実験用タグ、の始点に隣接する適切な位置および配向でハイブリダイズさせる。アンプリコン担持ビーズをBacillus stearothermophilus(Bst)ポリメラーゼおよび一本鎖結合タンパク質と共にプレインキュベートし、その後、ピコリットルスケールウエルの微細化アレイ上にウエルあたり一ビーズで置き、それによってこの生化学をアレイベースのシークエンシングと互換性のあるものにする。パイロシークエンシングにも必要とされる固定化酵素(ATPスルフリラーゼおよびルシフェラーゼ)を担持する、より小さいビーズも添加する。シークエンシング中、その準順序アレイの一方の側面は、シークエンシング試薬を導入および除去するためのフローセルとして機能する。他方の側面は、CCDベースのシグナル検出のための光ファイバー束に結合している。それぞれのサイクルで、一種類の非標識ヌクレオチドを導入する。この導入が組み込みを生じさせる結果となる配列については、ピロリン酸塩がATPスルフリラーゼおよびルシフェラーゼによって遊離されて光のバーストを発生させ、それをCCDによって特定のアレイ座標について検出する。多数のサイクルにわたって、検出される組み込み事象のパターンが、個々のビーズによって表されるテンプレートの配列を明らかにする。
Solexaについては、増幅シークエンシングフィーチャーをブリッジPCRによって作成する。フォワードPCRプライマーとリバースPCRプライマーの両方がフレキシブルリンカーによって固体支持体に係留されるので、増幅中にいずれの単一テンプレート分子から生ずるすべてのアンプリコンもアレイ上の単一の物理的位置に固定化され、クラスター化されたままである。ブリッジPCRは、Bstポリメラーゼでの伸長とホルムアミドでの変性の交互サイクルに依存する点で、多少、非従来的である。結果として生ずる「クラスター」は、それぞれ、〜1,000のクローナルアンプリコンから成る。数百万のクラスターを、単一のフローセル上にある8つの独立した「レーン」内の区別可能な位置に増幅することができる(ので、8つの独立した実験を同じ計器ラン中に並行してシークエンシングすることができる)。クラスター作成後、アンプリコンは線形化であり、シークエンシングプライマーが、関心のある領域に隣接する万能アダプター配列にハイブリダイズされる。それぞれの配列インターロゲーションサイクルは、修飾DNAポリメラーゼおよび4つのヌクレオチドの混合物での一塩基伸長から成る。これらのヌクレオチドは、3’ヒドロキシル位置の化学的切断可能部分が、それぞれのサイクルにおいて一塩基組み込みのみを発生させる点、および同じく化学的切断可能な4つの蛍光標識のうちの1つが、それぞれのヌクレオチドの素性に対応する点で、「可逆的ターミネーター」である。一塩基伸長および4チャンネルでの画像の獲得後、両方のグループの化学的切断が次のサイクルのために構成する。36bp以下の読み取り長さが、現在、日常的に実行されている。これは、qNPS付加生成物についてのターゲット長を規定する(7シークエンシング開始および実験用タグ塩基、10から15塩基のジェネリック捕捉配列2、および5遺伝子タグ塩基)。
他のシークエンシング方法が開発されるまたは開発されるであろうが、当業者には、qNPSプローブ、遺伝子タグおよび実験用タグならびに類似のシークエンシング可能付加生成物(下で論ずるとおり)がこれらのシステムでのシークエンシングに適するであろうことがわかるはずである。
qNPS
qNPSは、ヌクレアーゼ保護工程、ならびに(必要に応じて)保護しているターゲット分子からヌクレアーゼ保護プローブを解離させる、およびRNAの場合にはRNAターゲットを加水分解する、塩基での処理を用いることにより、組織溶解産物(または精製されたRNAもしくはDNA)からの不安定なRNAまたは他のターゲット分子を、架橋されているときでさえ、捕捉または分離を伴わずに溶解状態で回収することができる安定な一本鎖DNAターゲット(ヌクレアーゼ保護プローブ)に化学量論的に変換するために定量的ヌクレアーゼ保護アッセイを用いる、シークエンシングに対する基本的に異なるアプローチである。S1ヌクレアーゼ加水分解後に残存するヌクレアーゼ保護プローブの量を、その後、シークエンシングによって決定し、このシークエンシングは、該プローブ自体のシークエンシングおよび言及した部分的プローブ配列の検出を含む場合がある。現在、このヌクレアーゼ保護アッセイの生成物(一般に、qNPATMと呼ばれる、H.T.G.,Inc.、Tucson、AZ 85706)は、高感度のアレイベースの読み出しを用いて測定されており、このようにしてそれぞれのターゲット遺伝子のレベルの測定値を提供している。例えば、米国特許第6,232,066号、米国特許第6,238,869号、WO 2008−121927を参照のこと(これらは、それら全体が参照により本明細書に援用されている)。多数の出版物にもqNPAの用途が記載されている(Altarら、2208および2009、Krisら、Martelら2002および2004、Robertsら、Rimszaら、Sawadaら、ならびにSeligmannら)。qNPSアッセイを多くの異なる方策で構成することができるが、すべてが、シークエンシングされる中心的付加生成物としてヌクレアーゼ反応(例えば、S1消化)を生き残るNPPを生成する概念、またはNPPもしくは言及した残存ヌクレアーゼ保護プローブ配列および従ってターゲット遺伝子を特異的に同定および定量するためにその一部もしくはすべてをシークエンシングすることができる付加生成物を生産する概念を用いる。前記プロセスは、ヌクレアーゼ保護プローブによって測定されるターゲット遺伝子部分のまたは同じ遺伝子をターゲットにする多数のヌクレアーゼ保護プローブ間の任意の変化の存在も同定する。
qNPSは、ヌクレアーゼ保護工程、ならびに(必要に応じて)保護しているターゲット分子からヌクレアーゼ保護プローブを解離させる、およびRNAの場合にはRNAターゲットを加水分解する、塩基での処理を用いることにより、組織溶解産物(または精製されたRNAもしくはDNA)からの不安定なRNAまたは他のターゲット分子を、架橋されているときでさえ、捕捉または分離を伴わずに溶解状態で回収することができる安定な一本鎖DNAターゲット(ヌクレアーゼ保護プローブ)に化学量論的に変換するために定量的ヌクレアーゼ保護アッセイを用いる、シークエンシングに対する基本的に異なるアプローチである。S1ヌクレアーゼ加水分解後に残存するヌクレアーゼ保護プローブの量を、その後、シークエンシングによって決定し、このシークエンシングは、該プローブ自体のシークエンシングおよび言及した部分的プローブ配列の検出を含む場合がある。現在、このヌクレアーゼ保護アッセイの生成物(一般に、qNPATMと呼ばれる、H.T.G.,Inc.、Tucson、AZ 85706)は、高感度のアレイベースの読み出しを用いて測定されており、このようにしてそれぞれのターゲット遺伝子のレベルの測定値を提供している。例えば、米国特許第6,232,066号、米国特許第6,238,869号、WO 2008−121927を参照のこと(これらは、それら全体が参照により本明細書に援用されている)。多数の出版物にもqNPAの用途が記載されている(Altarら、2208および2009、Krisら、Martelら2002および2004、Robertsら、Rimszaら、Sawadaら、ならびにSeligmannら)。qNPSアッセイを多くの異なる方策で構成することができるが、すべてが、シークエンシングされる中心的付加生成物としてヌクレアーゼ反応(例えば、S1消化)を生き残るNPPを生成する概念、またはNPPもしくは言及した残存ヌクレアーゼ保護プローブ配列および従ってターゲット遺伝子を特異的に同定および定量するためにその一部もしくはすべてをシークエンシングすることができる付加生成物を生産する概念を用いる。前記プロセスは、ヌクレアーゼ保護プローブによって測定されるターゲット遺伝子部分のまたは同じ遺伝子をターゲットにする多数のヌクレアーゼ保護プローブ間の任意の変化の存在も同定する。
qNPSアッセイのためのサンプルからのヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)の生成は、qNPAについて発表された方法(Robertsら、2007;Martelら2002および2004)と同様の、図1に図示するように行われる。このアッセイは、異なるターゲットそれぞれに対して特異的であるように設計された1つ以上の異なるヌクレアーゼ保護プローブを含む。従って、100の遺伝子の測定には、100の異なるヌクレアーゼ保護プローブ、遺伝子1つにつき1つ、または数百の異なるNPP、幾つか/遺伝子、の設計および合成が必要である。これらは、最も好ましくはDNAから構成され、長さが約10から約100または約200以上の塩基であり得るが、さらに好ましくは長さが20から75塩基、および最も好ましくは長さが20から50塩基であり得る。図1工程1は、サンプルとヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)への溶解試薬の大過剰での添加を図示する。この図には、一種類のターゲット分子(RNA)およびヌクレアーゼ保護プローブしか図示されていないが、1つのRNAターゲット分子は組織に架橋しているように(「X」により)示されており、もう1つは可溶性であるように示されている。抽出された(または精製された)RNAまたは他のターゲット分子でこのアッセイをランすることもできる。前記プローブは、ターゲット分子に特異的であり、同様のTmを有するが、シークエンシングによってこれらのプローブを区別することを可能にするために十分一意的な配列を有するように、または遺伝子タグを取り付けるための特異的ハイブリダイゼーションを支持するように設計される。サンプルを好ましくは95℃付近または約105℃でおおよそ10分間加熱してターゲット分子を変性させ、それによってそれらを一本鎖にし、ハイブリダイゼーションに利用できるようにする。温度とバッファー組成物の組み合わせが一本鎖ターゲットDNAまたはRNAの形成につながらない限り、異なる変性溶液を使用してこの変性温度を変更することができる。次に、サンプルを指定温度で一定の期間(例えば、50−merヌクレアーゼ保護プローブについては、60℃で6時間)インキュベートして、ターゲット分子へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする。ヌクレアーゼ(例えば、S1ヌクレアーゼ)またはヌクレアーゼのカクテルを添加し、インキュベーションを(例えば、50−merヌクレアーゼ保護プローブについては50℃で60分間)行い、この時間の間に、ヌクレアーゼは、ターゲット分子にハイブリダイズしていない(および従って未保護である)すべての過剰なヌクレアーゼ保護プローブ、サンプル中のすべての非ターゲット分子(例えば、RNAまたはDNA)、およびターゲット分子のオーバーハング一本鎖領域を破壊し、ならびに所望される場合には、ターゲット配列と対合していない塩基でそのプローブを切断し、それによって理論量のターゲット分子/ヌクレアーゼ保護プローブデュプレックス(工程2)または部分的プローブデュプレックス(言及した非対合が存在する場合)が残る。下記参照。この図において、「X」は、固定から起こる組織へのターゲット分子の架橋を表す。ヌクレアーゼ保護プローブは、架橋を逆転させる必要なく架橋ターゲット分子にハイブリダイズする。非対合塩基をもたらす単一ヌクレオチドの差が切断されないように条件を選択することができ、またはハイブリダイズしたヌクレアーゼ保護プローブの端までの非対合塩基だけを切断するヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼを使用することができる。
ヌクレアーゼ処理後、前記プローブは、架橋ターゲット分子配列と依然として会合していることがある。しかし、工程3において塩基を添加し、サンプルを95℃に加熱する。これは、ターゲット分子/ヌクレアーゼ保護プローブ二量体を解離させ、その結果、ヌクレアーゼ保護プローブが一本鎖状態で残り、およびRNAの場合にはRNAターゲット分子を加水分解する。
qNPSの場合、この時点の後の工程は、ヌクレアーゼ保護プローブがどのようにシークエンシングされることになるのかによって、様々であり得る。NPPから形成される異なる付加生成物を連続図で図示する。遺伝子タグおよび実験用タグを使用すべきでない場合には、プローブを、シークエンシングシステムに適するアダプター分子と直接ライゲートすることができ(または例えばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Tdt、を使用して、ポリAテールを付加させることができ)、およびシークエンシングに用いることができる(図2A)。図1(工程4から8)および図2は、ハイブリダイゼーションを可能にする温度でのそれぞれのヌクレアーゼ保護プローブに対して過剰量のタグリンカーの添加(およびとのインキュベーション)を図示する。幾つかの可能なシークエンシング可能付加生成物をタグリンカーの使用に基づいて形成することができる。例えば、タグリンカーの25塩基を、1つの特異的ヌクレアーゼ保護プローブの3’末端と相補的であるように設計することができ、従って、それらはそのプローブにハイブリダイズすることとなる(工程4)。前記タグリンカーの残部を、遺伝子タグ配列(図2B)および/または(場合により)実験用タグ配列のジェネリック(もしくは実験特異的配列)部分(図2C)、または実験用タグのジェネリック(もしくは特異的)部分のみ(図2D)を、過剰量のこれらのタグの添加(図1工程5)、続いての、タグリンカーへのそれらのハイブリダイゼーションを可能にする温度でのインキュベーションの後にハイブリダイズする(および従って、ヌクレアーゼ保護プローブの3’末端に捕捉する)ように設計することができる。これらの工程を組み合わせることができ、または別々に行うことができることに留意すること。シークエンサーが、シークエンシングすべき分子の一端または両端にアダプター捕捉配列を必要とする場合、タグリンカーをヌクレアーゼ保護プローブの完全長に、およびさらにその(例えば、5’)アダプター配列に相補的である配列を含むように、伸長することができる。しかし、さらに好ましくは、ヌクレアーゼ保護プローブの5’末端にハイブリダイズする、および5’アダプター配列に相補的である配列を含有する、第二アダプターリンカーを付加させ(工程6)、その後、そのアダプター配列を付加させる(工程7)。この同じ場合、遺伝子タグまたは実験用タグを、どちらが3’の最後から二番目の(pent−ultimate)配列であろうと、シークエンシングのために3’アダプター配列と共に合成することができる。完全付加生成物を一緒にハイブリダイズした後、角矢印によって図1(工程8)および図2に図示するように、例えばT4 DNAリガーゼ(または例えばPinoら、Lutayら、Schabarovaら、または米国特許第7,033,753号によって記載されているような、非酵素的化学)を用いて、配列を互いにライゲートして、完全シークエンシング可能付加生成物を形成することができる。この方法において、シークエンシングされることとなるターゲットRNA、DNAなどに由来するすべてのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションおよび(例えば、酵素的または非酵素的)ライゲーションによって組み立てされたならびにアダプター配列または(例えば酵素的)ポリアデニル化によってシークエンシングチップ上への捕捉用に調製された合成物である。図示されているシークエンシング可能付加生成物はNPPを含有するが、当業者には、その代わりにタグリンカー含有付加生成物をシークエンシングされる付加生成物として調製(シークエンシング可能付加生成物として調製)できること、または破壊されないならば、ターゲットオリゴヌクレオチドをシークエンシング可能付加生成物として調製できることがわかるであろう。ターゲットオリゴヌクレオチドが、シークエンシングされる、またはシークエンシング可能付加生成物を含む場合には、NPPは、シークエンシング不能成分(non sequencible component)、例えばLNA、アミノ酸、ペプチド、ペプチド核酸、アプタマーなど、から成り得る。両端にアダプターを有するシークエンシング可能付加生成物を、それが(例えば、第二ヌクレアーゼ反応によって)切断されると2つのシークエンシング可能付加生成物をもたらすように、調製することができる。
シークエンシング可能付加生成物にポリA(またはポリT)捕捉配列を取り付ける方策は非常に沢山ある。1つは、(例えば、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Tdt、を使用して)酵素的にである。もう1つは、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションによる。三番目は、単純に、シークエンシング可能付加生成物を停止させる3’オリゴヌクレオチド上への合成による。理想的には、シークエンシング可能付加生成物のみをシークエンシング媒体に結合させ、副生成物を削除する。例えば、図3または4に図示するアダプター配列は、ポリAであり得、クリーンアップは、ゲルまたはヌクレアーゼ(例えば、S1)により得る。ヌクレアーゼクリーンアップの場合、保護用配列は、ポリTを含有するだろう。
実験用タグの使用は、あるサンプルと別のものとの区別である。工程1から5は、それぞれのサンプルについて別個のアッセイ(例えば、マイクロプレートの別個のウエル)の中で行われるだろうが、タグリンカーは、実験用タグのジェネリック配列も捕捉するように設計されており(図2C参照)、該実験用タグ(例えば、3’アダプター配列も含有する)は、工程5の後に付加されることとなり、その後、工程6から8まではすべて、別個の実験または別個の患者サンプルをはっきり区別する別個の反応容器内で行われる。それぞれの実験用タグに付加されるジェネリック配列ではなく特定の実験用タグ配列に対する相補的配列を含有する種々のタグリンカーを実験用タグごとに合成し、それによって実験用タグの長さをちょうどその実験特異的配列に短縮することができることは、当業者にはわかるはずである。実験用タグ(または遺伝子タグと実験用タグ)のライゲーション後、実験用タグの配列により、そのシークエンシングされた付加生成物がどの反応に、またはどの患者に由来するかが同定されるであろうから、別個のサンプルを併せることができ、そのため、ゲル精製(または実際の分離を必要としない他の精製またはクリーンアップ方法)の場合には、シークエンシングラン1回につき1つのゲル(またはクリーンアップまたは精製反応またはプロセス)しかランする必要がない。
T4 DNAリガーゼでのライゲーションは、作用する5’リン酸塩を必要とする。概して、オリゴヌクレオチドは5’リン酸塩なしで合成されるが、合成中に5’リン酸塩を付加させることができる。従って、アダプターリンカーおよびタグリンカーを、互いに接しているが5’リン酸塩がないように合成すると、それらは互いにライゲートされることとならず、その結果、例えばその後のクリーンアップが助長される。(合成に加えて)リン酸塩をオリゴヌクレオチドに付加させるもう1つの方策は、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよびATPの使用である。
非酵素的方法をはじめとする他のライゲーション方法を用いてもよい。しかし、ライゲーションは、必須工程ではない。NPPのタグリンカーおよびタグとのハイブリダイゼーション(すなわち、ヌクレアーゼ保護プローブの一部として組み込まれたタグを相補的オリゴヌクレオチド(oligonucoeotide)によって保護することができる場合)が、ヌクレアーゼ耐性であるまたは精製可能である複合体を形成する場合、ライゲーションは必要ない。前記タグが既にNPPに組み込まれており、NPPおよび従ってターゲットDNAまたはRNAの量を反映することとなるからであり、ならびにNPPが、および従って、シークエンシングされたときはターゲットDNA/RNAが、シークエンシングの時点でそれがNPPから分離されていなかったとしても、前記タグにより同定されることとなるからである。
前の工程すべてが、ゲル精製または他の分離方法(分離が必要または所望される場合)まで分離のない、試薬添加およびインキュベーションを表す。過剰量のそれぞれの試薬が反応混合物中に残存し(例えば、図1のそれぞれの成長付加生成物の左側に図示するとおり)、不完全付加生成物、例えば、ヌクレアーゼ保護プローブではなくタグ分子とタグリンカーのハイブリダイゼーションからの結果、またはアダプター分子のアダプターリンカーへの、しかしまたヌクレアーゼ保護プローブを含まない複合体での、ハイブリダイゼーションからの結果、も残存する。この時点で、幾つかの次の工程が可能であり、それらのうちの1つだけを図示する(ゲル精製)。
好ましい次の工程は、シークエンシングビーズまたはチップ上への捕捉前の混合物のクリーンアップである。ヌクレアーゼ保護プローブにハイブリダイズするアダプターリンカーおよびタグリンカーの配列を幾つかの塩基によって分離する場合(付加生成物組み立て後に酵素的にリン酸塩を付加させる場合)、またはそれらが(それらが互いに接していたとしても)リン酸化されない場合、それらは互いにライゲートされないだろう。その後、すべての実験物または患者サンプルの反応混合物を一緒にプールし、加熱してまたは別様に変性させて一本鎖オリゴヌクレオチドを作り、そのシークエンシング可能付加生成物を、例えばその相当長い長さに基づいてゲル電気泳動によって、精製することができる。当該技術分野において公知のまたは当該技術分野から適応されるクリーンアップを果たすための他の手段を利用することもできる。
図2Bから2Eは、アダプター配列を有する付加生成物の調製を図示する。代わりに、それらをこれらの配列を用いず、シークエンシングチップ上への何らかの他の捕捉形態、またはシークエンシングのための調製を用いて調製してもよい。例えば、代わりに、ポリAテールをシークエンシング可能付加生成物の3’末端に合成してもよい。相補鎖をポリアデニル化しないことを所望する場合には、例えば、3’アミノ残基または3’炭素(例えば、C3)スペーサーを有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、その配列の3’末端をブロックすることができる。これは、シークエンシング可能付加生成物の一部としてのターゲットそれ自体またはターゲットの生合成誘導体ではなく、シークエンシング可能付加生成物を調製するために合成配列を使用することの利点である。一部のシークエンシングシステムは、例えば、係留されたポリメラーゼもしくはオリゴヌクレオチド結合部分によって、あるいは化学的または電気もしくは電気化学的手段によって、シークエンシング可能付加生成物を直接捕捉することができ、従って、このシークエンシング可能付加生成物は、特異的アダプターまたは捕捉配列もしくは部分を必要としない。
シークエンシングのための反応生成物の好ましいクリーンアップ方法は、第二ヌクレアーゼ消化を、例えば再びS1ヌクレアーゼの使用により、行う方法である。実験用タグ/アダプター配列をライゲーション前に付加させる1つの事例において、ならびにアダプターリンカーおよびタグリンカー(一方の5’末端がリン酸化されている)を互いに接するように設計し、相補的3’実験用タグ/アダプター配列を、実験用タグ/3’アダプター配列へのハイブリダイゼーション後にそれをタグリンカーにライゲートすることができるように付加させる場合、ヌクレアーゼ保護プローブ含有付加生成物とリンカー/保護用相補的配列(それぞれ)の両方が、該リンカーが該ヌクレアーゼ保護プローブを会合すると、互いにライゲートして、互いにハイブリダイズした2つの完全付加生成物を形成することとなる(図3A)。これら2つの付加生成物より短いすべての付加生成物の解離をもたらす温度でのS1ヌクレアーゼでの処理は、すべての他の化学種(それらの一部を図3Aに図示する)を破壊し、その結果、ヌクレアーゼ保護プローブを含有するシークエンシング可能付加生成物、およびリンカー付加生成物だけが残る。変性されると、適切な捕捉アダプター配列を有する付加生成物(ヌクレアーゼ保護プローブ付加生成物)のみがシークエンシングチップまたはビーズ上に捕捉されることとなり、リンカー含有付加生成物は、洗い落されることとなる。この「二重S1」アプローチの利点は、付加生成物がシークエンシングビーズまたはチップ上に捕捉されるまで分離工程がない点である。図4Aは、タグリンカーが、実験用タグ(ET)可変配列(VS)(シークエンシングされたときにそのウエルまたは実験を一意的に同定する配列)に相補的な残基にイノシンを含有し、および次に3’アダプターに相補的な配列(3’Acomp)を含有する、シークエンシング可能NPP付加生成物を形成するための異なるスキームを図示する。この同じイノシン含有リンカーを、上で説明したシークエンシング可能付加生成物(図1および2)を形成するために、および(アダプター配列の使用ではなく)ポリアデニル化を必要とする場合に、あるいはゲル精製または他の分離もしくは精製方法を用いる場合に、使用することができるだろう。図4Bは、ライゲーションを必要としない、および合成により作製することができる、5’アダプタータグ/タグリンカー/3’アダプター相補的配列を兼備する単一合成物の使用を図示する。Helicos一分子シークエンシング法などの、増幅を必要としないシステムを用いるシークエンシングの場合、ポリAテールを取り付ける必要があり得る。図4CおよびDは、クリーンアップのためにゲル精製を(例えば、ポリアデニル化前に)用いることができる、または図示されているようにポリアデニル化、捕捉およびシークエンシング前にクリーンアップのためにヌクレアーゼ工程を用いることができる、このプロセスについてのスキームを図示する。両方の場合、NPP自体をシークエンシングしないので、適切な遺伝子タグおよび実験用タグをNPPにハイブリダイズさせてそれらを互いにライゲートできるようにするためにタグリンカーしか必要としない。ヌクレアーゼ工程後、ポリAテール(trail)を3’末端に酵素的に合成する。これは、結果として、タグリンカーの3’末端でポリAテールを合成させることができるので、それもシークエンシングされることとなり、またはタグリンカーの3’末端がブロックされている場合には、ポリAテールがNPP含有付加生成物上でのみ合成されることとなる。NPPを全部または一部シークエンシングして、ターゲット遺伝子を同定する場合;ポリAテールまたはアダプター(必要に応じて)をNPPに直接取り付けることができ、または実験用タグおよび/またはタグリンカーによって取り付けてそれらのシークエンシングを可能にすることができる。NPPがターゲット(例えば)DNAにハイブリダイズする場合、およびそのシステムがNPPの直接シークエンシングを用いる場合、NPP保護(例えば、DNA)ターゲット配列もシークエンシングすることができ、ならびにNPPと同時におよび同じ様式でのシークエンシングのために修飾することができる。同様に、NPPを含有するシークエンシング可能付加生成物を形成するように構築された一切の相補的リンカーを並行して処理することができ、シークエンシング可能付加生成物に変換することもできる。これらの事例では、その後2つの相補的配列を検出、同定および計数することとなり、その結果、プロセスに一定のレベルの冗長性がもたらされる。
当業者は、シークエンシング前に反応混合物をクリーンアップするための他の方法、例えば、ゲル精製、またはビオチン/アビジン捕捉および遊離、またはキャピラリー電気泳動、または多数の分離もしくはクリーンアップ方法のいずれかの使用、を考え出すことができる。例えば、シークエンシングのために、ヌクレアーゼ保護プローブをビオチン化しまたはヌクレアーゼ保護プローブに他のハプテン(haptan)を取り付け、アビジンまたは抗ハプテン(haptan)被覆ビーズまたは表面に捕捉し、洗浄し、その後、遊離させることができる。同様に、シークエンシングのために、ライゲートされたヌクレアーゼ保護プローブ付加生成物を相補的オリゴヌクレオチド上に捕捉し、洗浄し、その後、遊離させることができる。前記捕捉オリゴヌクレオチドは、特に特異的である必要はない。qNPSプロセスは、ゲノムまたはトランスクリプトームの大部分を排除し、ターゲットにハイブリダイズされたNPPのみを残すからであり、および特異性がシークエンシングレベルで決定されることとなるためである。
当業者は、ヌクレアーゼ保護プローブを含有する付加生成物ではなく、リンカー複合体をクリーンアップし、シークエンシングできることもわかるはずである。従って、シークエンシング可能付加生成物は、NPPにハイブリダイズするものである場合があり、またはNPPに由来する。これらの付加生成物の2つの例を図5に図示するが、他のものを構成してもよい。図5Aは、前の図および論述と同じNPPを使用を図示するものであるが、この場合は、3’アダプターとNPPに対する相補的配列とオーバーハング遺伝子タグ配列とを含有するオリゴヌクレオチドを付加させ、このオーバーハング遺伝子タグ配列は、ジェネリック配列内で終わり、そしてまたそのジェネリック配列が実験用タグリンカーを捕捉する。そしてまた、この実験用タグリンカーが、5’アダプター配列も含有する実験用タグを捕捉する。ヌクレアーゼクリーンアップを用いることとなる場合、保護用5’アダプター配列プローブを付加させる必要がある。ポリAテールをシークエンシングに必要とする場合には、前記アダプター配列を必要としないので、含める必要がない。図5Bは、3’から5’へのものであるヌクレアーゼ保護プローブの使用を図示する。この構築物は、前の図に図示した、または前の論述の中で説明した、および後で言及する、任意の付加生成物のために用いることができる。遺伝子タグを使用するのではなく、NPPにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド(例えば、リンカー)の部分をシークエンシングして遺伝子を同定してもよい。当業者には、NPPを含有するまたはしないシークエンシング用の付加生成物いずれかを生じさせる結果となるプローブのこれらの配置に関する非常に多くの変形および組み合わせがあることがわかるであろう。
シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)は、ヌクレアーゼ反応を生き残る生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物をテンプレートとして用いる。シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)は、ヌクレアーゼ反応を生き残る生成物であって第二ヌクレアーゼ反応からの生成物である生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物をテンプレートとして用いる。シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)は、1つ以上のヌクレアーゼ反応の生成物である、または該生成物に由来する。シークエンシング可能付加生成物を含む、またはシークエンシング可能付加生成物の組み立てに使用される、合成オリゴヌクレオチドを、ポリA配列のライゲーションまたは付加などの酵素的または非酵素的修飾を可能にするように、または可能にしないように、調製することができる。それらは、天然または非天然ヌクレオチド(例えば、ロックド核酸、またはLNA、またはペプチド核酸、またはPNAなど)を含有する場合がある。シークエンシング前にそれらを溶液中でのもしくは表面上での増幅に付すことができ、またはヌクレアーゼ保護工程の前に増幅を行うことができる。
454またはSolexaプラットホームでのシークエンシングについては、シークエンシング可能付加生成物を、先ず、捕捉および増幅しなければならない。これは、概して、ポリメラーゼ反応を必要とする。qNPSに使用される典型的な溶解バッファーは、S1活性を可能にする上に、ヌクレアーゼを変性してRNAの破壊を防止するように、およびハイブリダイゼーションを助長するように設計されたものである。このタイプの溶液は、ポリメラーゼ活性を阻害することができ、従って、チップを最初に洗浄しない限り増幅を阻害することができる。洗浄を用いて、捕捉アダプター配列を有さないヌクレオチドを除去することもできる。
シークエンシングが捕捉のためにポリAテールを利用する場合、これは、3’末端でポリA残基を伸長するターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Tdt)を使用してクリーンアップ後に合成することができる。リンカー含有付加生成物、またはシークエンシングを意図していない付加生成物、の3’末端がポリAテールで伸長されないようにするために、タグリンカーの3’残基を、ポリアデニル化を支持しない残基または修飾残基で修飾することができる(図4Cおよび4D)。
ヌクレアーゼ保護プローブを含有する適切に設計された付加生成物および他の情報含有配列でのリバースシークエンシングを用いることができること、または前記ヌクレアーゼ保護プローブ含有付加生成物の代わりに、ヌクレアーゼ保護プローブに対する相補的配列(場合によっては「リンカー」と呼ばれる)および付加生成物構築物を、該相補的付加生成物が適切に設計されている限り(例えば、図5参照)、または例えば本出願において前記ヌクレアーゼ保護プローブ含有付加生成物について記載するように、シークエンシングすることができることは、当業者にはわかるはずである。
95℃での(例えばqNPA)溶解バッファー中でのインキュベーションは、RNAをハイブリダイゼーションに利用できるようにするが、この溶解産物のPCRは、結果としてDNAの増幅を生じさせる場合があり、これは、溶解産物中にゲノムDNAがある場合があり、まさしく、NPPのハイブリダイゼーションのために十分に変性されないことを明示する。105℃でのインキュベーションは、ゲノムDNAをNPPプローブハイブリダイゼーションに利用できるようにする。105℃でインキュベーション後のS1(ヌクレアーゼ)プロセッシングは、すべてのハイブリダイズしていないDNAならびにハイブリダイズしていなRNAおよびNPPを破壊する。NPPの3’または5’配列に相補的な配列を有する適切に設計されたリンカープローブの使用により、アダプターを一本鎖NPPにハイブリダイズし、ライゲートするため、S1加水分解を逃れるいずれの(例えば、二本鎖)DNA(またはさらに言えばRNA)も、それらにライゲートされたアダプターを有するはずがなく、従って、454およびSolexaタイプのシークエンサーによって用いられるシークエンシングビーズまたはチップ上に捕捉されないだろうし、シークエンシングされないだろう。NPP相補的オリゴヌクレオチドをシークエンシングする場合には、少なくとも1つのアダプターをその配列の一部として直接組み込むことができ、従って、アダプター配列が、S1加水分解を逃れたかもしれないDNAにライゲートされる可能性はない。ゲル(または他の)精製では、DNAを、ライゲートされた付加生成物から分離することができ、従って、シークエンシングの前に除去することができる。ポリAテールを実験用タグに(または実験用タグを使用しない場合には遺伝子タグに、または実験用タグおよび遺伝子タグを使用しない場合にはNPPに)付加させる一分子シークエンシングについては、いずれのDNAも、シークエンシング付加生成物のゲル精製を用いる場合のようにそれが最初に(ポリアデニル化前に)分離されない限り、または例えば、例えば105℃での溶解、続いてNPPハイブリダイゼーションおよびその後、適切な条件下でのヌクレアーゼ(例えば、S1)工程を用いる場合のように最初に破壊されない限り、ポリアデニル化することができる。このプロトコルでは、NPPがmRNAのスプライス接合部をターゲットにできるため、(mRNAの測定に干渉し得る)DNAは測定されないだろう。
miRNA(またはsiRNA)も測定できるが、この場合、NPPは、miRNA長にマッチする(例えば)約22塩基の長さしかないであろう。メチル化が起こったまたは起こっていない部位に塩基ミスマッチを作ることにより、および相補的イノシン残基の賢明な使用により、ミスマッチ塩基残基を切断するさらなるヌクレアーゼまたは制限酵素の使用により、DNAメチル化ばかりでなくDNAおよび発現されたSNPも測定することができる。NPPによって保護されたこれらの付加生成物の直接シークエンシングも可能である。例えば、SNPが発生し得る配列に対するNPPの使用;一塩基ミスマッチが切断されない条件、およびその後、生き残ったDNAターゲット配列をハイブリダイゼーションのTmより上でのインキュベーションによりNPPから解離させることができる条件下でのS1で処理;続いて、ターゲットDNAにハイブリダイズしてアダプターの適切な付加を可能にする大過剰のリンカーの添加(解離されたNPPは、この大過剰のリンカーによって再会合が競合的に防止されることとなる)などによって、DNA SNPをシークエンシングして、ターゲットDNA自体を、所望される場合には実験用タグと共に、含むシークエンシング可能付加生成物を作ることができる。この修飾では、NPPは、第一ヌクレアーゼ工程中、ターゲットDNAを確実に保護するために保護された配列内にSNP部位または多数のSNPもしくは突然変異部位に相補的なイノシン(単数もしくは複数)を含有することがあり、および同様に、ヌクレアーゼクリーンアップ工程を用いる場合、リンカーオリゴヌクレオチドは、確実に保護するためにイノシンを含有することがある。あるいは、突然変異している可能性のある塩基(単数または複数)を有するNPPプローブを使用することができる。加えて、野生型配列NPPをヌクレアーゼによりSNPまたは突然変異ミスマッチで切断するとき、NPPの特定の配列をプロセッシングし、シークエンシングして、突然変異の存在および位置を同定することができる。いずれのミスマッチも(例えば、エキソヌクレアーゼを使用して、またはエンドヌクレアーゼであまりストリンジェントでない条件により、または決断に多数の隣接ミスマッチを必要とするヌクレアーゼを使用することにより)切断および加水分解されない条件下で、ターゲット(例えば、DNA)含有突然変異領域を選択するためにNPPを使用する場合には、そのターゲット(例えば、DNA)をプロセッシングし、シークエンシングして、その突然変異を正確に決定することができる。
シークエンシングチップ上への捕捉を可能にするためにアダプターとして使用することができる、または遺伝子タグもしくは実験用タグとして役立つ、非ターゲットオリゴヌクレオチド配列をNPPに、それを合成する際に、直接組み込むことも可能である。この非ターゲット配列は、ターゲットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズせず、通常はヌクレアーゼによって切断されるだろう。しかし、NPPのこの非ターゲット配列と相補的オリゴヌクレオチドを(ヌクレアーゼ工程の前だが、ターゲットオリゴヌクレオチドを含有するサンプルにNPPを付加させる前、付加させると同時、または付加させた後、いずれかに)ハイブリダイズさせる場合には、ヌクレアーゼで処理するとき、すべての塩基が相補的塩基にハイブリダイズされるので、非ターゲットNPP配列を保護し、NPPは、インタクトなままであろう。NPPの核酸ターゲット配列と非ターゲット配列の間に単一のハイブリダイズされていない塩基があったとしてもこれが当てはまるように、条件を修飾することができる。この方法は、ライゲーション反応を一切用いずにシークエンシングチップ上に捕捉し、シークエンシングすることができる直接シークエンシング可能なNPP付加生成物を、必要とされるアダプター配列を取り付けて、生産することができる。当業者は、短い非ターゲット配列/相補的配列デュプレックスを除去するためにシークエンシング前に反応をクリーンアップする方法を設計することができる。例えば、塩基中でヌクレアーゼ後サンプルを加熱してデュプレックスを解離させ、その後、NPPの非ターゲット配列と核酸ターゲット特異的配列の一部(例えば、最初の25塩基)とに相補的である、過剰なオリゴヌクレオチドを添加する。その後、この長いほうのオリゴヌクレオチドはハイブリダイズできるが、短いほうの非ターゲット配列相補的オリゴヌクレオチドはできない温度でハイブリダイズを行うと、第二ヌクレアーゼ反応後、核酸ターゲットにハイブリダイズしたNPPのみを含有する調製品が得られる。その後、これを加熱してその解離を生じさせて、シークエンシングチップに付加させることができ、そこでそのアダプター配列によってそれを捕捉し、シークエンシングすることができる。
感度増加が望まれる場合、ターゲットオリゴヌクレオチドまたはそれに由来する生成物を増幅することができ、またはNPP生成物を先ずPCRもしくは他の形態の酵素的増幅に付すことができる。その後、その得られた生成物を、非増幅NPP生成物と同じ様式でシークエンシング用に調製することができ、または増幅プロセス中に遺伝子タグおよび/もしくは実験用タグ、および/もしくはアダプター配列を、例えばプライマーおよび伸長構築物の一部として組み込むことができる。増幅を必要としないときであっても、1または2サイクルのPCRまたは酵素的反応を行って、遺伝子タグ、および/または実験用タグ、および/またはアダプターを取り付けることができる。その後の生合成工程(単数または複数)によってNPPから作成される付加生成物も、シークエンシング可能NPP付加生成物またはNPPに相補的な付加生成物の作成について説明したものなどのハイブリダイゼーション反応によって、完成させることができる。クリーンアップは、ゲルもしくは他の精製方法による場合があり、あるいは十分に保護して、その後のS1(もしくは他のヌクレアーゼ)反応または当該技術分野において公知のもしくは当該技術分野から適応される他の手段による場合がある。
もう1つのタイプのNPPは、Padlock(PadP)または環状DNAプローブに類似した(例えば、BanerらまたはPrinsらによって記載されている構築物に類似した)、環状プローブである。PadPシークエンシング可能付加生成物を図9に図示する。このPadP構築物は、サンプル中のターゲットへのプローブのハイブリダイゼーション後に(例えば)エキソヌクレアーゼを使用しても切断されない、アダプターおよびタグを含有するように構築することができる。例えば、PadPプローブは、5’アダプターを含有し、およびターゲットにハイブリダイズする約10から約30または約50または約100または約200塩基をその3’末端に含有するように合成することができる。スペーサー領域、次に制限ヌクレアーゼ部位、次に5’遺伝子タグ、次に、ライゲーションを支持するためにその5’末端がリン酸化されている、ターゲット(別の約10、または約30、または約50または約100または約200塩基)にハイブリダイズするPadPプローブの残部があり得る。従って、ターゲットにハイブリダイズすると(工程1)PadPプローブの2つの半分がライゲートされて環状DNAを形成することができる。サイクリングにより、これを増幅することができる(工程2)。ライゲーション後、そのミックスを約95℃に加熱して、環状プローブをターゲット(例えば、RNA)から解離させることができ、その後、温度を低下させて、過剰なプローブを、この場合は増幅テンプレートとして役立つターゲット(例えば、RNA)に再びハイブリダイズさせることができ、その後、ライゲーションの後、温度を再び上昇させて、約30サイクルの1シリーズにつき約30コピーの環状プローブ/ターゲットテンプレートRNAを生成する。工程3では、エキソヌクレアーゼを使用して、過剰なPadPを含めてすべての線状DNA(および例えばターゲットRNA)を破壊し、環状PadPプローブのみを残す。工程4は、所望される場合には実験用タグを付けるプロセスを開始し、先ず制限酵素で処理して環状DNAプローブを開き、次にタグリンカーを使用して実験用タグをハイブリダイズし、ライゲートさせる。PadPプローブを形成するために用いる実験条件は説明した。
直接シークエンシングすることができるNPP構築物を設計することができる、「直接ヌクレアーゼプローブシークエンシング(DNPS)」と呼ばれる方法。1つのそのような構築物を図1に図示する。ヌクレアーゼ保護プローブを直接シークエンシングする場合であって、シークエンシングのためにアダプター配列を付加させるまたはポリAテールもしくは他の捕捉分子を付加させる現行の商業的方法を用いる場合、S1生成物を直接シークエンシングすることができる。しかし、リンカーの使用によって付加生成物をライゲートする場合、アダプター、遺伝子タグ、実験用タグまたは他の配列の付加のために、過剰なタグプローブ、アダプターまたはリンカーをシークエンシング前に「クリーンアップ」工程で排除する必要があり得る。幾つかの戦略を用いることができる。最も簡単な戦略は、シークエンシングすることとなるライゲートされた付加生成物(例えば、プローブと検出リンカーと実験用タグと遺伝子タグと必要に応じてアダプターとの複合体)の融解温度(Tm)より下だが、完全付加生成物自体ではなく、リンカーおよび該付加生成物の成分と複合体を形成しているリンカーの融解温度より上の温度でのインキュベーションである。このようにして、それらは融解分離し、ハイブリダイズされていないリンカー、実験用および遺伝子タグと共に、S1(または他のヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼカクテル)によって破壊される。その後、例えば95℃への加熱により、またはプロテイナーゼKの使用により酵素的に、または阻害剤の使用により、(例えば)S1活性を破壊する。この「2工程」ヌクレアーゼ保護アプローチは、シークエンシング表面に捕捉する時点まで、一切の分離工程を伴わない添加のみのプロセスであるプロトコルをもたらす結果となる。
遺伝子のシークエンシング、およびヌクレアーゼ保護プローブのシークエンシングによる存在度の決定を、ヌクレアーゼ保護プローブ全体をシークエンシングすることなく行うことができる。末端2から約7または約25塩基の組み合わせが、測定されるそれぞれの遺伝子について一意的な配列を表すようにヌクレアーゼ保護プローブの3’末端を選択する場合には、これが、遺伝子を同定するためにシークエンシングを必要とするヌクレアーゼ保護プローブのすべてであり、およびシークエンシングされたそのような付加生成物の数を計数することにより、サンプル中のそれぞれの遺伝子の量である。実験用タグ(実験ごとに異なるもの)をヌクレアーゼ保護プローブに追加して、多数の実験物のqNPA生成物をシークエンシングのために一緒にプールすることを可能にすることができる。
スプライス接合部、エキソンおよび突然変異をシークエンシングおよび定量することができる方法の例、ならびにヌクレアーゼ保護工程完了後の結果を図6Aに図示する。一塩基多型(SNP)およびメチル化DNAをシークエンシングすることができる方法の例を図6Bに図示する。これらの一塩基修飾は、発現されたSNPを検出するためにRNaseなどのさらなる酵素の活性を利用することにより、またはメチル化DNA部位を検出するために重亜硫酸塩処理、その後のウラシルDNAグリコシル化の併用効果を利用することによって検出することができる。当業者には、DNA SNPをシークエンシングによって同様に検出および測定することができる方法がわかるはずである。それぞれの場合、ターゲット遺伝子またはターゲット遺伝子のすべての変異体に共通の対照配列を、関心のある(突然変異またはメチル化している可能性のある)部位に特異的なプローブと共に設計する。特定のスプライス接合部、欠失されることがある特定のエキソン、または特定の遺伝子融合体にハイブリダイズするようにプローブを設計することもできる。赤色「x」は、保護されていない、従って、例えばS1によって分解されるプローブ配列、またはターゲット配列が切断される、従ってヌクレアーゼ保護プローブが融解して外れ、S1によって破壊されるであろう場所を示す。単一のミスマッチ塩基のみの場合、例えば、RNaseなどのS1に、または単一塩基を切断する別の酵素の使用に、さらなる酵素(単数または複数)を加える必要があり得る。当業者には、これらの切断を行うために単独で使用するまたは併用することができる非常に多くの酵素、修飾酵素、または分子が分かるであろう。ヌクレアーゼ保護プローブを(本発明の他の箇所で説明する方法を用いて)実験用タグの付加によりさらに修飾して、多数の実験からのサンプルを単一シークエンシングランに統合させることができる。シークエンシングアダプター配列をヌクレアーゼ保護プローブに(または、実験用タグを用いる場合、その実験用タグ自体がその3’末端にアダプター配列を有するように合成されていないならば、その実験用タグにも)ライゲートすることができる。ヌクレアーゼ保護プローブの5’末端をその合成中にリン酸化することができ、その後、そのヌクレアーゼ保護プローブの5’塩基(例えば、25塩基)にハイブリダイズするリンカーであって、5’アダプター配列にハイブリダイズする相補的配列を有するリンカーを使用し、このようにして、(例えば、T4 DNAリガーゼを使用して)それを共にライゲートすることができるアダプターをヌクレアーゼ保護プローブの5’末端に追加することができる。あるいは、ATPの付加および適切なDNAリガーゼ(例えば、T4 DNAリガーゼ)の使用により、自己リン酸化およびライゲートすることができる。3’アダプターについては、アダプター自体をリン酸化することができ、ならびにリンカーを、ヌクレアーゼ保護プローブの3’塩基(例えば、25塩基)にハイブリダイズするように、および3’アダプターに対する相補的配列を含有するように設計することができるので、そのリンカーがヌクレアーゼ保護プローブの3’末端に、該プローブへのそのライゲーションを可能にする様式で、ハイブリダイズされ、並置される。適切な条件下では、代りに、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよびATPを使用して5’末端をリン酸化し、その後、T4 DNAリガーゼを使用してライゲートすることができる。他の適切な条件下では、T4 DNAリガーゼ自体をリン酸化してライゲートすることができる。ポリAテールをヌクレアーゼ保護プローブの3’末端に付加させることが必要な場合は、Tdtを使用してそれを付加させることができる。
好ましい方法では、野生型と変異体の間で相同であるターゲット遺伝子の配列を測定する、またはDNAメチル化を測定する場合にはメチル化を受けない、1つ(以上)のヌクレアーゼ保護プローブがあり、そして次に、突然変異またはDNAメチル化部位に対して設計された第二プローブがある。従って、全レベルを決定することができ、突然変異の割合も決定することができる。
ターゲット遺伝子の様々な領域に対するプローブを作製し、その後、qNPA反応からそれらのプローブをシークエンシングすることにより、qNPSを使用して未知の変異体を簡単に検出することもできる。実験用タグを含む構築物に前記プローブを組み込むことができ、シークエンシングのためにその付加生成物にアダプター配列を組み込むことができる。ミスマッチしている塩基を切断するためにおよび所望される場合にはSNPを検出するために1つの酵素または酵素の組み合わせのヌクレアーゼ活性を利用することができる。それらの塩基が、ヌクレアーゼ保護プローブの端のほうに位置する場合には、切断温度ですべての短い鎖が融解してなくなり、破壊されて、短縮されたプローブ配列が残ることとなる。プローブの中央のほうの場合には、すべての配列が融解分解し、破壊されることとなるように条件を常例的に設計することができる。あるいは、SNPまたは幾つかのミスマッチ塩基がヌクレアーゼ保護プローブの中央領域内に位置する場合、ヌクレアーゼ保護プローブを切断するが融解して外れない条件を用いることができ、このときはシークエンシングによって特定の突然変異部位が同定されることとなる。同じ遺伝子に対して多数のプローブを使用することにより、プローブ数を比較して、突然変異が存在する場所を同定することができる。このシナリオでは、必要アダプターのライゲーションを、それぞれのプラットホームでのシークエンシングに今日用いられている様式で行うことができる。残存するヌクレアーゼ保護プローブ端の配列が判らず、従って、アダプターリンカー配列を設計することはできない。あるいは、イノシン配列にハイブリダイズするヌクレアーゼ保護プローブ端を有するアダプターを使用することができる−この場合、該ヌクレアーゼ保護プローブの末端の特定の組成を知る必要はない。あるいは、アダプター修飾プロセスを、他の箇所で説明するように行うことができる。アダプターがインタクトNPPに正確にライゲートされ、従って、これらだけがシークエンシングされることとなる。
与えるすべての実施例において、少しでも必要があれば、これらの実施例において様々な事例に関して説明するリンカーおよびプロセスを使用せずに、当該技術分野において公知のまたはシークエンシングのために実施されている方法を用いて、アダプター配列、ポリA配列、または他の必要捕捉分子(単数もしくは複数)を遺伝子タグまたは実験用タグと共にNPPまたは付加生成物に付加させることができる。
一分子シークエンサーについては、アダプター配列を全く必要とせずに、または3’末端のアダプター(もしくは捕捉)配列のみを用いて、実験用および遺伝子タグを有するもしくは有さないヌクレアーゼ保護プローブ、または3’捕捉配列を取り付けたプローブをシークエンシングすることができる。実験識別子および遺伝子識別子タグを取り付けるために、ライゲーション工程(例えば、T4DNAリガーゼを使用)、続いてクリーンアップ、およびその後、必要に応じて(例えば、Helicosなどの次世代シークエンサーのために)、1つだけのアダプター配列の(例えば、3’末端での)取り付け、またはポリAテールの取り付けまたは合成が必要であることがあり、シークエンシングチップ上への捕捉を可能にするために、(例えば)ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Tdt)を(例えば)使用するポリAテールの3’末端での伸長、または別の万能捕捉配列もしくは分子の取り付けが必要とされる。本発明においてここおよび他の箇所で説明する構築物は、すべて、そのような機器使用でのシークエンシングのために調製することができる。図2、4および5は、シークエンサーの同じラン/チャンネル内での実験を多重化するために、および遺伝子識別子タグを使用して、必要とされる読み取り長さを縮小するために設計された構築物を図示する。タグを取り付けるために、ヌクレアーゼ保護工程3から5を行った後に(例えば、T4DNAリガーゼを使用する)ライゲーション工程、続いてクリーンアップ、およびその後、必要に応じて(例えば、Helicosなどの次世代シークエンサーのために)、シークエンシングチップ上への捕捉を可能にするためのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Tdt)、または適切なアダプター分子を使用する、ポリAテールの3’末端での伸長が必要である。溶解バッファーがこれらの工程のいずれかを阻害する場合には、逆転写およびPCRを可能にする希釈バッファーを使用できることに留意すること。アレイベースのアッセイの検出リンカーを使用して、ヌクレアーゼ保護プローブに実験用タグを連結させる。その後、T4 DNAリガーゼを使用して、前記プローブおよびタグを互いにライゲートする。遺伝子識別子タグも組み込むことができ、ことによると配列読み取りを10塩基(ちょうど2つのタグ)に低減することができる。あるいは、ヌクレアーゼ保護プローブの3’末端がそれぞれの遺伝子について一意的である(例えば、3’末端の5から7塩基の配列が一意的である)ようにターゲット遺伝子配列領域を選択することにより、測定したそれぞれの遺伝子を同定するためにシークエンシングしなければならないのはこの領域だけである。
ターゲットDNAまたはRNAに相補的でないタグを(例えば、合成により)NPPに直接組み込むことができ、ヌクレアーゼ工程の間に相補的オリゴヌクレオチド配列によって保護することができ、そのためそれは加水分解されないであろうし、またはヌクレアーゼによる加水分解に対して耐性でありさらに依然としてシークエンシング可能である配列からそれを構成することができる。ターゲット配列までの隣接するオリゴヌクレオチドのタグシークエンシングによって、NPP構築物中に非対合塩基がない限り、ヌクレアーゼ切断を防止することができる。
シークエンシングによりqNPAアッセイの検出工程を行うことの利点としては、例えば組織などの固相からの、抽出なしでの素性のシークエンシング;多数のサンプルのそれぞれについての別々の検出操作の必要の回避−すべてを1つの溶液で同時に行うことができる;プローブ間の弱い交差反応の回避、例えば、高濃度の検出リンカーの使用のため;SNP決定向上;などが挙げられる。
1つの実施形態において、本発明は、以下の態様に備えるものである:
態様1:シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)は、ターゲットオリゴヌクレオチドを含有しない。
態様1:シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)は、ターゲットオリゴヌクレオチドを含有しない。
態様2:シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)は、ターゲットオリゴヌクレオチドを含有せず、生合成工程を用いて形成されたものでもない。
態様3:シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)は、ヌクレアーゼ反応を生き残った生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物のテンプレートとして使用される。
態様4:シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)は、ヌクレアーゼ反応を生き残った生成物であって第二ヌクレアーゼ反応の生成物である生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物のテンプレートとして使用される。
態様5:シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)は、1つ以上のヌクレアーゼ反応の生成物である、または該生成物に由来する。
態様6:シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)は、合成オリゴヌクレオチドの使用によって形成する。
態様7:シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)は、合成オリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーション反応の使用によって形成する。
態様8:7におけるようなシークエンシング可能付加生成物であって、該シークエンシング可能付加生成物を含むまたは該シークエンシング可能付加生成物を組み立てるために用いられるライゲーション反応の使用からさらに形成されるものであるシークエンシング可能付加生成物。
態様9:NPPに基づいて組み立てられたまたはNPPが組み込まれているシークエンシング可能付加生成物を含むまたは該シークエンシング可能付加生成物を組み立てるために使用される合成オリゴヌクレオチド。
態様10:酵素的修飾、例えばポリA配列のライゲーションまたは付加、を可能にするようにまたは可能にしないように調製されたおよび非天然ヌクレオチド(例えば、ロックド核酸またはペプチド核酸など)を含有するまたは含有しないシークエンシング可能付加生成物を含むまたは該シークエンシング可能付加生成物を組み立てるために使用される合成オリゴヌクレオチド。
態様11:シークエンシング前に溶液中または表面上での増幅に付されるNPPを含有するまたはNPPに基づいて組み立てられたシークエンシング可能付加生成物。
態様12:シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)であって、ターゲットオリゴヌクレオチドの量を定量的に反映する量のシークエンシング可能付加生成物の生成後に取り付けられる配列を含有し、この配列(例えば、遺伝子タグ)を使用して該付加生成物を同定することができ、従って該ターゲットオリゴヌクレオチドを同定することができるものであるシークエンシング可能付加生成物(単数または複数)。
態様13:シークエンシング可能付加生成物(単数または複数)であって、ターゲットオリゴヌクレオチドの量を定量的に反映する量のシークエンシング可能付加生成物の生成後に取り付けられる配列を含有し、(この配列、例えば実験用タグ)を使用して、該ターゲットオリゴヌクレオチドを含有する反応を同定することができ、従って、多数の反応物をプールすることおよび同時にシークエンシングすることを可能にするものであるシークエンシング可能付加生成物(単数または複数)。
本発明の様々な特徴および付随の利点は、添付の図面と共に考慮するとよりよく判るようになるので、さらに十分に理解されるであろう。該図面中の同様の参照記号は、幾つかの図を通して同じまたは同様の部分を示し、および該図面は、下記のとおりのものである。
図1は、定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング(qNPS)アッセイのためのサンプルからのヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)の生成の概略図である。任意の必要アクセプター配列(青色)を有する遺伝子(または実験用)タグを取り付けるためのリンカー(緑色)の使用を図示し、後に最終的にライゲートされる、NPPの他端にアダプター(赤色)を付加させるための別のリンカー(紫色)の使用も図示する。それぞれの場合、シークエンシング可能付加生成物が形成されるばかりでなく、過剰なリンカー、アダプターおよびタグ配列も蓄積する。そのシークエンシング可能付加生成物を他の短い配列から分離するためのゲル精製の使用を図示する。
図2は、シークエンシングのためのNPPのプロセッシングを図示する。図2Aは、ポリA付加またはアダプター配列付加を含む、後のプロセッシングにおける2つの可能性を図示する。図2Bから2Eは、遺伝子タグ、実験用タグ、およびまたはアダプター配列を有する付加生成物の調製を図示する。
図3は、qNPSプローブ、およびシークエンシングに有用である付加生成物のタグ付け、およびクリーンアップのためのヌクレアーゼ工程の使用の概略を示す。曲がり矢は、ライゲーション点を示す。シークエンシング可能NPP付加生成物およびその相補体を作成する。略語表は、シークエンシング可能付加生成物を形成するために使用する異なるオリゴヌクレオチドを定義するものである。
図4は、シークエンシング可能付加生成物の代替組み立て方法を図示する。図4Aは、シークエンシング可能NPP付加生成物を形成するための異なるスキームを図示しており、この場合、タグリンカーは、実験用タグ(ET)可変配列(VS)(シークエンシングしたときにウエルまたは実験を一意的に識別する配列)に相補的な残基にイノシンを含有し、次に3’アダプターに相補的な配列(3’Acomp)を含有する。図4Bは、ライゲーションを必要としない、および合成により作製することができる、5’アダプタータグ/タグリンカー/3’アダプター(acaptor)相補的配列を兼備する単一合成物の使用を図示する。図4CおよびDは、クリーンアップのためにゲル精製を(例えば、ポリアデニル化前に)用いることができる、または図示されているようにポリアデニル化、捕捉およびシークエンシング前にクリーンアップのためにヌクレアーゼ工程を用いることができる、このプロセスについてのスキームを図示する。
図5は、NPPを含有するおよび含有しないシークエンシング可能付加生成物を図示する。
図6は、スプライス接合部、エキソンおよび突然変異をシークエンシングおよび定量することができる方法の描写を提供する。図6A凡例。遺伝子のすべての変異体に共通である領域でmRNAを測定するためのプローブ。(共通エキソン1)および2つのエキソン間のスプライス接合部を測定するための(エキソン1/2接合部)、この接合部は、エキソン1からエキソン2までである場合があり、またはエキソン1からエキソン3までである場合がある;またはエキソンを測定するための(2および3)、これらのうちの一方(エキソン2)が欠失されることがある;を、野生型(左)および突然変異(この場合はエキソン2が欠失している)について図示する。赤色「x」S1によって示す、エキソン2の欠失が、エキソン2についてのプローブのS1による完全破壊、およびエキソン1/2スプライス接合部についてのプローブのエキソン2に特異的な半分の破壊を生じさせる結果となることに留意すること。一塩基多型(SNP)およびメチル化DNAをシークエンシングすることができる方法の例を図6Bに図示する。図6B凡例。発現SNPを測定するためのプローブ(左パネル)またはメチル化DNA部位を測定するためのプローブ(右パネル)を図示する。発現SNPの場合、2つの可能性、野生型またはSNP、を図示する。2つのプローブ、対照領域のためのもの(1)、そのプローブの中央に位置するSNPを有するもの(2)、を使用する。RNase(Rnase)での処理によりSNPにおけるミスマッチを切断し、その後、プローブ(今はそれぞれの端にちょうど25塩基)はS1反応に用いる50−mer Tmで融解して外れ、S1によって破壊される。メチル化DNAについて、同じ2プローブ戦略を用いるが、最初に重亜硫酸塩を用いてメチル化されていないCをUに変換してミスマッチを作り、次にウラシルDNAグリコシラーゼを用いてそのDNAを切断するため、プローブは融解して外れ、S1によって破壊されることとなる。
図6は、スプライス接合部、エキソンおよび突然変異をシークエンシングおよび定量することができる方法の描写を提供する。図6A凡例。遺伝子のすべての変異体に共通である領域でmRNAを測定するためのプローブ。(共通エキソン1)および2つのエキソン間のスプライス接合部を測定するための(エキソン1/2接合部)、この接合部は、エキソン1からエキソン2までである場合があり、またはエキソン1からエキソン3までである場合がある;またはエキソンを測定するための(2および3)、これらのうちの一方(エキソン2)が欠失されることがある;を、野生型(左)および突然変異(この場合はエキソン2が欠失している)について図示する。赤色「x」S1によって示す、エキソン2の欠失が、エキソン2についてのプローブのS1による完全破壊、およびエキソン1/2スプライス接合部についてのプローブのエキソン2に特異的な半分の破壊を生じさせる結果となることに留意すること。一塩基多型(SNP)およびメチル化DNAをシークエンシングすることができる方法の例を図6Bに図示する。図6B凡例。発現SNPを測定するためのプローブ(左パネル)またはメチル化DNA部位を測定するためのプローブ(右パネル)を図示する。発現SNPの場合、2つの可能性、野生型またはSNP、を図示する。2つのプローブ、対照領域のためのもの(1)、そのプローブの中央に位置するSNPを有するもの(2)、を使用する。RNase(Rnase)での処理によりSNPにおけるミスマッチを切断し、その後、プローブ(今はそれぞれの端にちょうど25塩基)はS1反応に用いる50−mer Tmで融解して外れ、S1によって破壊される。メチル化DNAについて、同じ2プローブ戦略を用いるが、最初に重亜硫酸塩を用いてメチル化されていないCをUに変換してミスマッチを作り、次にウラシルDNAグリコシラーゼを用いてそのDNAを切断するため、プローブは融解して外れ、S1によって破壊されることとなる。
図7は、qNPAプロセスの最後に生成される溶解およびハイブリダイゼーションバッファー溶液にスパイクされた転写産物のシークエンシング成功を図示する。図7凡例。Sangerシークエンシング法、ABI 3700、を用いた。線状DNAサンプル(〜2.5kb PCR)をシークエンシングのための必要プライマー(T7F)と共にアリゾナ大学コアシークエンシング施設(University of Arizona core sequencing facility)に付託した。希釈バッファー(qDil)の添加を伴うまたは伴わないqNPA溶解バッファーを2倍から20倍希釈した。qDilを1:1添加し、2倍希釈物を生じさせた。それぞれの希釈を2回繰り返した。同じ希釈をリバースプライマーでも繰り返した(結果は示さない)。シークエンシングのために、2.5μLの50ng/μLのDNAを15μLの総反応混合物量で混合した。これにより6倍希釈が説明される。赤色、配列なし、薄緑色50〜100bp配列、濃緑色500〜600bp配列。
図8は、CT値の等価性を実証するために抽出RNAに対してマッチした溶解産物を測定したPCRの結果を図示する。この場合、サンプルから精製したRNAまたは同じサンプルからのqLysis産物のPCRを行って、異なる細胞サンプル混合物の大きなセットにわたって3つの遺伝子とハウスキーパー遺伝子GAPDHを測定した。それぞれのデータ点は、3回の反復試験の平均である。それぞれの混合物を3回の異なる実験で試験した。GAPDHについてのCT値を引くことによって、CT値を正規化した。精製されたRNAは、qLysisサンプルに求められる希釈率に合わせたものであり、およびPadPシークエンシング可能プローブを作成するために必要な工程の順序を示す。遺伝子タグおよび5’アダプターは、制限部位と共に、原PadPプローブの一部である。そのプローブをターゲットRNA全体にわたってライゲートして、環状DNAを形成し、その後、これを開き、実験用タグおよび3’アダプターをハイブリダイズし、ライゲートし、それによってシークエンシングのための付加生成物を調製する。
図9は、PadPシークエンシング可能付加生成物の作成方法の代表図を示す。遺伝子タグおよび5’アダプターは、制限部位と共に、原線状プローブの一部である。このプローブは、該プローブの5’および3’末端が隣接塩基にハイブリダイズされるようにターゲット核酸にハイブリダイズし、従って、核酸テンプレート上で互いにライゲートされて環状(例えば、DNA)プローブを形成することができる。その後、ヌクレアーゼ(例えば、エキソヌクレアーゼ)を添加して、ハイブリダイズされていない核酸ターゲットおよび過剰な線状プローブを破壊する。その後、プローブを核酸ターゲットから(例えば、塩基中で加熱して)分離し、ヌクレアーゼ活性を破壊する。その環状プローブを開き、所望される場合には実験用タグおよび必要に応じて3’アダプターをハイブリダイズおよびライゲートし、それによってシークエンシングのための付加生成物を調製する。線状プローブの核酸ターゲットへのハイブリダイゼーション、環状プローブを形成するためのライゲーション、および核酸ターゲットからの解離というプロセスを、循環加熱によって多サイクル繰り返して、解離を生じさせる。過剰な線状プローブのため、温度が降下すると線状プローブはハイブリダイズし、そしてまたライゲートされ、その後、次の高温サイクルによって遊離され得る。このようにして環状プローブ量を増幅させた後、ヌクレアーゼ加水分解工程を行う。
さらに詳述せずとも、当業者は、前の説明を用いて、以下の本発明をその最大範囲まで利用できると考えられる。従って、以下の特定の好ましい実施形態は、単なる例証と解釈され、いかなる点においても、本開示の残部を制限するものとは解釈されない。
(実施例1)
qNPAアッセイのために用いる溶解バッファーを、酵素を不活性化し、RNAの分解を防止するが、ハイブリダイゼーション希釈バッファーへの制限希釈後、それがS1活性を可能にし、ストリンジェントな特異性を有するハイブリダイゼーションを可能にするように設計する。しかし、溶解バッファー成分は、逆転写およびポリメラーゼ活性を阻害する。ポリメラーゼ活性の阻害は、例えば、そのバッファーが除去されない限り、または阻害活性が希釈されてなくならない限り、または阻害活性が中和されない限り、PCR成功を妨げ得る。希釈バッファーを、ヌクレアーゼアッセイが完了した後に添加して、溶解および他のバッファーの阻害活性を中和することができる。図7は、qNPAプロセスの最後に生成される、溶解およびハイブリダイゼーションバッファー溶液にスパイクされた転写産物のシークエンシング成功を図示する。水への10倍希釈が、シークエンシングの成功を可能にする。しかし、水ではなく、中和希釈バッファー(qDil)を希釈に用いると、水からシークエンシングされた転写産物の場合と同じシークエンシング結果(500から600塩基対の読み取り長さ)を生じさせるために4倍の希釈しか必要としない。しかし、中和qDil希釈バッファーの使用は、ちょうど2倍希釈後にシークエンシングを可能にしたが、その読み取り長さは50から100塩基対に低減され、従って、成功はしたが、溶解およびハイブリダイゼーションバッファーによる影響を受けた。ターゲットDNAのPCRをシークエンシング前に必要とするシステムについて、溶解およびハイブリダイゼーションバッファーからの干渉もあり得ることを認識することにより、本発明者らは、細胞から調製したcDNAを、同じ細胞から調製しqDil希釈バッファーで希釈した溶解産物に対して使用して、PCRの効率を試験した。GAPDHに正規化した3つの遺伝子を測定したところ、混合物全体にわたって差はなかった(図8)。相関は、0.97であった。
qNPAアッセイのために用いる溶解バッファーを、酵素を不活性化し、RNAの分解を防止するが、ハイブリダイゼーション希釈バッファーへの制限希釈後、それがS1活性を可能にし、ストリンジェントな特異性を有するハイブリダイゼーションを可能にするように設計する。しかし、溶解バッファー成分は、逆転写およびポリメラーゼ活性を阻害する。ポリメラーゼ活性の阻害は、例えば、そのバッファーが除去されない限り、または阻害活性が希釈されてなくならない限り、または阻害活性が中和されない限り、PCR成功を妨げ得る。希釈バッファーを、ヌクレアーゼアッセイが完了した後に添加して、溶解および他のバッファーの阻害活性を中和することができる。図7は、qNPAプロセスの最後に生成される、溶解およびハイブリダイゼーションバッファー溶液にスパイクされた転写産物のシークエンシング成功を図示する。水への10倍希釈が、シークエンシングの成功を可能にする。しかし、水ではなく、中和希釈バッファー(qDil)を希釈に用いると、水からシークエンシングされた転写産物の場合と同じシークエンシング結果(500から600塩基対の読み取り長さ)を生じさせるために4倍の希釈しか必要としない。しかし、中和qDil希釈バッファーの使用は、ちょうど2倍希釈後にシークエンシングを可能にしたが、その読み取り長さは50から100塩基対に低減され、従って、成功はしたが、溶解およびハイブリダイゼーションバッファーによる影響を受けた。ターゲットDNAのPCRをシークエンシング前に必要とするシステムについて、溶解およびハイブリダイゼーションバッファーからの干渉もあり得ることを認識することにより、本発明者らは、細胞から調製したcDNAを、同じ細胞から調製しqDil希釈バッファーで希釈した溶解産物に対して使用して、PCRの効率を試験した。GAPDHに正規化した3つの遺伝子を測定したところ、混合物全体にわたって差はなかった(図8)。相関は、0.97であった。
(実施例2)
スプライス接合部またはエキソン、ならびにターゲット遺伝子の他の領域に特異的なNPPを設計したので、それぞれの場合、該プローブは、トランスクリプトーム中の単一遺伝子においてしか見いだされない配列に対して特異的である。ヌクレアーゼ保護プローブまたは該プローブの一部分についての直接シークエンシング(直接ヌクレアーゼ保護プローブシークエンシング、またはDNPS)を可能にするために、理想的には、最初の5、10、20または30の3’塩基は、それらのシークエンシングによって1つだけの遺伝子が一意的に同定されるほどに特異的である。ヌクレアーゼ反応後、残存プローブを、前に説明したおよび下で説明するような必要アダプターまたは捕捉配列または分子を含有するシークエンシング付加生成物にそれらを組み込むことによって、シークエンシング用に調製する。代替方法では、実験用タグを3’末端に付加させる。さらにもう1つの方法では、遺伝子タグを3’末端に付加させるので、ヌクレアーゼ保護プローブ配列自体をシークエンシングする必要がなく、プローブの3’末端がトランスクリプトーム中の1つだけの遺伝子に特異的である必要もない。さらにもう1つのプロトコルでは、遺伝子タグおよび実験用タグ両方を付加生成物に組み込んでシークエンシングする。さらにもう1つの実施例では、NPPに対する相補的配列、およびシークエンシング可能付加生成物を、前に説明したおよび下で説明する方法によって調製する。
スプライス接合部またはエキソン、ならびにターゲット遺伝子の他の領域に特異的なNPPを設計したので、それぞれの場合、該プローブは、トランスクリプトーム中の単一遺伝子においてしか見いだされない配列に対して特異的である。ヌクレアーゼ保護プローブまたは該プローブの一部分についての直接シークエンシング(直接ヌクレアーゼ保護プローブシークエンシング、またはDNPS)を可能にするために、理想的には、最初の5、10、20または30の3’塩基は、それらのシークエンシングによって1つだけの遺伝子が一意的に同定されるほどに特異的である。ヌクレアーゼ反応後、残存プローブを、前に説明したおよび下で説明するような必要アダプターまたは捕捉配列または分子を含有するシークエンシング付加生成物にそれらを組み込むことによって、シークエンシング用に調製する。代替方法では、実験用タグを3’末端に付加させる。さらにもう1つの方法では、遺伝子タグを3’末端に付加させるので、ヌクレアーゼ保護プローブ配列自体をシークエンシングする必要がなく、プローブの3’末端がトランスクリプトーム中の1つだけの遺伝子に特異的である必要もない。さらにもう1つのプロトコルでは、遺伝子タグおよび実験用タグ両方を付加生成物に組み込んでシークエンシングする。さらにもう1つの実施例では、NPPに対する相補的配列、およびシークエンシング可能付加生成物を、前に説明したおよび下で説明する方法によって調製する。
(実施例3)
遺伝子タグおよび実験用タグを有するNPP含有付加生成物の構築。この方法の利点は、タグハイブリダイゼーション工程が、すべての未変性物(例えば、RNA)を破壊するS1および塩基工程の後に続くため、正しいタグがそれ自体の相補体にハイブリダイズし、別のタグの相補体にハイブリダイズしないことを保証する特異性しか必要とされない点である。同様に、ヌクレアーゼ保護プローブしかターゲット特異的である必要がない。プローブ自体をシークエンシングしない。代わりに、遺伝子タグを、遺伝子を同定するためにシークエンシングされるエンティティーである付加生成物に組み込み、その後、該遺伝子タグが特異的にハイブリダイズするその特異的ヌクレアーゼ保護プローブによって該遺伝子を測定する。FFPEを用いてqNPAを行う標準的なプロトコル(3、4)に従って、ヌクレアーゼ保護プローブのカクテルの存在下、プロテイナーゼkを添加した溶解バッファーでサンプルを溶解する。30分間、37℃での初期インキュベーション後、サンプルを95℃に加熱し、その後、冷却し、55℃で2時間インキュベートして、プローブをそれらのそれぞれのターゲットmRNAにハイブリダイズさせる。その後、S1ヌクレアーゼを添加して、ターゲットにハイブリダイズしていない過剰なプローブ、およびプローブにハイブリダイズしていないRNAを加水分解し、ターゲット/プローブデュプレックスを残す。60分のインキュベーション後、塩基を添加し、サンプルを95℃で10分間加熱して、プローブ/RNAデュプレックスを解離させ、ターゲットRNA配列を加水分解する。そのサンプルを中和し、その後、3’タグリンカーのカクテルを添加し、該リンカーは、それぞれが、1つの特異的プローブの3’25塩基配列に相補的な特異的25塩基配列を有し、および1つの遺伝子識別子タグに特異的な配列を含有する。第二の事例では、前記タグリンカーは、1セットの実験用タグに共通の5’末端配列に特異的にハイブリダイズする、ジェネリックである遺伝子タグ配列に対して3’側に配列も含有した。前記遺伝子タグ配列は、多数の設計から成り得るが、この事例では、シークエンシングされない遺伝子タグの5’末端配列に相補的であった配列、および次に、それぞれの遺伝子タグに一意的であり、それぞれの遺伝子を同定するためにシークエンシングされるそれぞれの遺伝子タグの3’末端配列である、7塩基タグ配列から成った。前記タグリンカーの3’末端配列が実験用タグにもハイブリダイズする場合、その実験用タグの5’相補的配列は、すべての実験用タグについて同じである。それぞれの異なる実験用タグを添加して、個々の実験ヌクレアーゼ保護反応を分離する(例えば、サンプルを別々にアッセイする)ので、「誤った」実験用タグがハイブリダイズする可能性がない。この場合、それぞれのサンプルをマイクロプレートの別個のウエルで調製し、異なる実験用タグを各ウエルに添加する。タグリンカー、遺伝子タグおよび実験用タグの添加は連続的であり得るが、この実施例ではすべてを一緒に添加し、タグリンカーを、S1ヌクレアーゼ保護反応を生き残るように、ヌクレアーゼ保護プローブに対して過剰に添加するが、すべてのタグリンカーがそのタグ配列自体で飽和されるように、添加する遺伝子タグおよび添加する実験用タグの量に対しては制限濃度で添加する。遺伝子タグおよび実験用タグを、すべて、それらの5’末端でリン酸化する。加えて、実験用タグは、Solexaシークエンシングチップ上の3’捕捉配列に相補的なアダプター配列をその3’末端に含有する。ヌクレアーゼ保護プローブの5’末端もリン酸化する。3’タグリンカーおよびタグを添加すると同時に5’アダプターリンカーのカクテルを添加し、このリンカーは、それぞれのプローブの5’末端に相補的な遺伝子配列とSolexaシークエンシングチップの5’捕捉配列によって捕捉される5’アダプター配列に相補的な5’配列とを含有する配列から構成される。同時に、5’アダプター配列自体を5’アダプターリンカーより多く添加する。50℃でのインキュベーション後、すべてについて適切なハイブリダイゼーションを行って、図2Exxに図示する付加生成物を形成し、その後、(T4 DNAリガーゼを使用して)ライゲーション反応を行う。その後、反応混合物をゲルで泳動させ、高分子量バンドを切り出し、Solexaチップに適用し、増幅し、シークエンシングする。この実施例において、遺伝子タグは、2つの同一遺伝子同定配列から成り、その結果、それぞれの遺伝子の同定のためにシークエンシングの冗長性をもたらされる。加えて、タグリンカーのハイブリダイゼーションに使用する実験用タグの5’末端は、1つ置きの位置にLNAを含有し、その結果、この配列内のそれらの多数の塩基のためにより高いTmをもたらされるので、実験用タグおよび遺伝子タグをシークエンシングするために必要とされる読み取り長さができる限り短くなるようにそれをできるだけ短く保つ。
遺伝子タグおよび実験用タグを有するNPP含有付加生成物の構築。この方法の利点は、タグハイブリダイゼーション工程が、すべての未変性物(例えば、RNA)を破壊するS1および塩基工程の後に続くため、正しいタグがそれ自体の相補体にハイブリダイズし、別のタグの相補体にハイブリダイズしないことを保証する特異性しか必要とされない点である。同様に、ヌクレアーゼ保護プローブしかターゲット特異的である必要がない。プローブ自体をシークエンシングしない。代わりに、遺伝子タグを、遺伝子を同定するためにシークエンシングされるエンティティーである付加生成物に組み込み、その後、該遺伝子タグが特異的にハイブリダイズするその特異的ヌクレアーゼ保護プローブによって該遺伝子を測定する。FFPEを用いてqNPAを行う標準的なプロトコル(3、4)に従って、ヌクレアーゼ保護プローブのカクテルの存在下、プロテイナーゼkを添加した溶解バッファーでサンプルを溶解する。30分間、37℃での初期インキュベーション後、サンプルを95℃に加熱し、その後、冷却し、55℃で2時間インキュベートして、プローブをそれらのそれぞれのターゲットmRNAにハイブリダイズさせる。その後、S1ヌクレアーゼを添加して、ターゲットにハイブリダイズしていない過剰なプローブ、およびプローブにハイブリダイズしていないRNAを加水分解し、ターゲット/プローブデュプレックスを残す。60分のインキュベーション後、塩基を添加し、サンプルを95℃で10分間加熱して、プローブ/RNAデュプレックスを解離させ、ターゲットRNA配列を加水分解する。そのサンプルを中和し、その後、3’タグリンカーのカクテルを添加し、該リンカーは、それぞれが、1つの特異的プローブの3’25塩基配列に相補的な特異的25塩基配列を有し、および1つの遺伝子識別子タグに特異的な配列を含有する。第二の事例では、前記タグリンカーは、1セットの実験用タグに共通の5’末端配列に特異的にハイブリダイズする、ジェネリックである遺伝子タグ配列に対して3’側に配列も含有した。前記遺伝子タグ配列は、多数の設計から成り得るが、この事例では、シークエンシングされない遺伝子タグの5’末端配列に相補的であった配列、および次に、それぞれの遺伝子タグに一意的であり、それぞれの遺伝子を同定するためにシークエンシングされるそれぞれの遺伝子タグの3’末端配列である、7塩基タグ配列から成った。前記タグリンカーの3’末端配列が実験用タグにもハイブリダイズする場合、その実験用タグの5’相補的配列は、すべての実験用タグについて同じである。それぞれの異なる実験用タグを添加して、個々の実験ヌクレアーゼ保護反応を分離する(例えば、サンプルを別々にアッセイする)ので、「誤った」実験用タグがハイブリダイズする可能性がない。この場合、それぞれのサンプルをマイクロプレートの別個のウエルで調製し、異なる実験用タグを各ウエルに添加する。タグリンカー、遺伝子タグおよび実験用タグの添加は連続的であり得るが、この実施例ではすべてを一緒に添加し、タグリンカーを、S1ヌクレアーゼ保護反応を生き残るように、ヌクレアーゼ保護プローブに対して過剰に添加するが、すべてのタグリンカーがそのタグ配列自体で飽和されるように、添加する遺伝子タグおよび添加する実験用タグの量に対しては制限濃度で添加する。遺伝子タグおよび実験用タグを、すべて、それらの5’末端でリン酸化する。加えて、実験用タグは、Solexaシークエンシングチップ上の3’捕捉配列に相補的なアダプター配列をその3’末端に含有する。ヌクレアーゼ保護プローブの5’末端もリン酸化する。3’タグリンカーおよびタグを添加すると同時に5’アダプターリンカーのカクテルを添加し、このリンカーは、それぞれのプローブの5’末端に相補的な遺伝子配列とSolexaシークエンシングチップの5’捕捉配列によって捕捉される5’アダプター配列に相補的な5’配列とを含有する配列から構成される。同時に、5’アダプター配列自体を5’アダプターリンカーより多く添加する。50℃でのインキュベーション後、すべてについて適切なハイブリダイゼーションを行って、図2Exxに図示する付加生成物を形成し、その後、(T4 DNAリガーゼを使用して)ライゲーション反応を行う。その後、反応混合物をゲルで泳動させ、高分子量バンドを切り出し、Solexaチップに適用し、増幅し、シークエンシングする。この実施例において、遺伝子タグは、2つの同一遺伝子同定配列から成り、その結果、それぞれの遺伝子の同定のためにシークエンシングの冗長性をもたらされる。加えて、タグリンカーのハイブリダイゼーションに使用する実験用タグの5’末端は、1つ置きの位置にLNAを含有し、その結果、この配列内のそれらの多数の塩基のためにより高いTmをもたらされるので、実験用タグおよび遺伝子タグをシークエンシングするために必要とされる読み取り長さができる限り短くなるようにそれをできるだけ短く保つ。
(実施例4)
ゲル精製を用いなかったことを除き、実施例3において説明した同じプロセスを行った。代わりに、図3に図示するように、5’リン酸化アダプターリンカーおよび5’リン酸化タグリンカーを使用し、ならびにその反応に加える実験用タグおよび3’アダプター配列に相補的であるオリゴヌクレオチドをそれぞれの反応に加える。従って、ライゲーション工程を行うと、この短いオリゴヌクレオチドはタグリンカーにライゲートされるため、完全にハイブリダイズされ、ライゲートされた付加生成物には、100塩基より短い配列はない。その後、「クリーンアップ」反応として、その反応混合物をS1ヌクレアーゼと共に65℃でインキュベートする。このインキュベーション温度で、その完全付加生成物の成分のTmは、いずれの部分も融解して外れずS1によって加水分解されないようなTmであるが、過剰なタグリンカーとそれぞれのタグ(ライゲートされたタグは50塩基未満であるので)および過剰な5’アダプターとアダプターリンカーの間のハイブリダイゼーションにより、それらはS1によって加水分解するほどに融解される。その後、このS1反応を生き残った付加生成物を95℃に加熱して、それを融解して保護リンカーからなくし、S1活性を破壊し、その後、その付加生成物をSolexaチップ上に捕捉し、増幅し、シークエンシングする。
ゲル精製を用いなかったことを除き、実施例3において説明した同じプロセスを行った。代わりに、図3に図示するように、5’リン酸化アダプターリンカーおよび5’リン酸化タグリンカーを使用し、ならびにその反応に加える実験用タグおよび3’アダプター配列に相補的であるオリゴヌクレオチドをそれぞれの反応に加える。従って、ライゲーション工程を行うと、この短いオリゴヌクレオチドはタグリンカーにライゲートされるため、完全にハイブリダイズされ、ライゲートされた付加生成物には、100塩基より短い配列はない。その後、「クリーンアップ」反応として、その反応混合物をS1ヌクレアーゼと共に65℃でインキュベートする。このインキュベーション温度で、その完全付加生成物の成分のTmは、いずれの部分も融解して外れずS1によって加水分解されないようなTmであるが、過剰なタグリンカーとそれぞれのタグ(ライゲートされたタグは50塩基未満であるので)および過剰な5’アダプターとアダプターリンカーの間のハイブリダイゼーションにより、それらはS1によって加水分解するほどに融解される。その後、このS1反応を生き残った付加生成物を95℃に加熱して、それを融解して保護リンカーからなくし、S1活性を破壊し、その後、その付加生成物をSolexaチップ上に捕捉し、増幅し、シークエンシングする。
(実施例5)
例えばHelicoseシステム用の、シークエンシング媒体上にシークエンシング可能付加生成物を捕捉するためにポリAテールを利用するシステムでのシークエンシングのための付加生成物を構築する実施例を行う。3’アダプターのない、図2Cに図示する付加生成物を構築する。ゲル精製クリーンアップ後に、Tdtを使用してこの付加生成物をその3’末端でポリアデニル化する。この同じ付加生成物を調製し、Tdt反応前にS1ヌクレアーゼによってクリーンアップし、その後、シークエンシングする。あるいは、Tdtを使用して実験用タグの一部として合成したポリA3’アダプターを有する、図2Cに図示する付加生成物を構築し、この生成物をゲル精製によってクリーンアップした後、シークエンシングする。ポリT相補的配列を使用して、ポリAテールを保護し、S1ヌクレアーゼを利用してその付加生成物をクリーンアップした後、シークエンシングする。
例えばHelicoseシステム用の、シークエンシング媒体上にシークエンシング可能付加生成物を捕捉するためにポリAテールを利用するシステムでのシークエンシングのための付加生成物を構築する実施例を行う。3’アダプターのない、図2Cに図示する付加生成物を構築する。ゲル精製クリーンアップ後に、Tdtを使用してこの付加生成物をその3’末端でポリアデニル化する。この同じ付加生成物を調製し、Tdt反応前にS1ヌクレアーゼによってクリーンアップし、その後、シークエンシングする。あるいは、Tdtを使用して実験用タグの一部として合成したポリA3’アダプターを有する、図2Cに図示する付加生成物を構築し、この生成物をゲル精製によってクリーンアップした後、シークエンシングする。ポリT相補的配列を使用して、ポリAテールを保護し、S1ヌクレアーゼを利用してその付加生成物をクリーンアップした後、シークエンシングする。
(実施例6)
サンプルとして全血を使用して、実施例4の実験を行う。この全血を2x(二倍濃度)溶解バッファーと1:1混合し、10分間95℃に加熱し、その後、微量遠心管で遠心分離して集塊を除去する。その後、実施例4において説明したようなqNPSに上清を付す。
サンプルとして全血を使用して、実施例4の実験を行う。この全血を2x(二倍濃度)溶解バッファーと1:1混合し、10分間95℃に加熱し、その後、微量遠心管で遠心分離して集塊を除去する。その後、実施例4において説明したようなqNPSに上清を付す。
(実施例7)
ウイルスに感染したヒト細胞のサンプルを使用して、実施例4を行う。使用するプローブを、ウイルス遺伝子を測定するために設計する。結果は、望ましくない配列情報によるシークエンシングしたサンプルの干渉または「クラッター」なしに他の種の混合物の中の任意の種からの遺伝子を測定する一例として、ヒト遺伝子のバックグラウンドでウイルス遺伝子を選択的に測定する能力を明示する。
ウイルスに感染したヒト細胞のサンプルを使用して、実施例4を行う。使用するプローブを、ウイルス遺伝子を測定するために設計する。結果は、望ましくない配列情報によるシークエンシングしたサンプルの干渉または「クラッター」なしに他の種の混合物の中の任意の種からの遺伝子を測定する一例として、ヒト遺伝子のバックグラウンドでウイルス遺伝子を選択的に測定する能力を明示する。
(実施例8)
未分化Thp−1細胞ならびに分化およびLPS刺激Tph−1細胞からの溶解産物の混合物から成る一連のサンプルを使用して、実施例4の実験を行う。
未分化Thp−1細胞ならびに分化およびLPS刺激Tph−1細胞からの溶解産物の混合物から成る一連のサンプルを使用して、実施例4の実験を行う。
(実施例9)
サンプルを溶解し、95℃でインキュベートし、続いてNPPとハイブリダイズさせ、S1で処理し、タグリンカー、遺伝子タグ、実験用タグを付加させ、ハイブリダイズさせ、ライゲートし、その後、105℃でインキュベートし、続いて実験用タグを添加して、LNAを含有する配列を保護し、37℃でインキュベートして、20塩基以上のライゲートされた付加生成物相補的オリゴヌクレオチド配列(過剰なタグリンカー、遺伝子タグ、および実験用タグ、および実験用タグ保護配列がまだ存在するだろう)を再びハイブリダイゼーションさせ、続いて、S1で加水分解し、その後、ポリアデニル化し、最後にゲル電気泳動によってクリーンアップ、その後、シークエンシングする。(タグリンカーをハイブリダイズさせることができる)相補的DNAの1つだけのコピーをシークエンシングし、これは、実験用または遺伝子タグを含有しない。そのため100の遺伝子を測定する場合、この相補的DNAの100分子/細胞のみをバックグラウンドとしてシークエンシングし、これらの配列は、一切遺伝子タグまたは実験用タグ配列情報を含有しない。
サンプルを溶解し、95℃でインキュベートし、続いてNPPとハイブリダイズさせ、S1で処理し、タグリンカー、遺伝子タグ、実験用タグを付加させ、ハイブリダイズさせ、ライゲートし、その後、105℃でインキュベートし、続いて実験用タグを添加して、LNAを含有する配列を保護し、37℃でインキュベートして、20塩基以上のライゲートされた付加生成物相補的オリゴヌクレオチド配列(過剰なタグリンカー、遺伝子タグ、および実験用タグ、および実験用タグ保護配列がまだ存在するだろう)を再びハイブリダイゼーションさせ、続いて、S1で加水分解し、その後、ポリアデニル化し、最後にゲル電気泳動によってクリーンアップ、その後、シークエンシングする。(タグリンカーをハイブリダイズさせることができる)相補的DNAの1つだけのコピーをシークエンシングし、これは、実験用または遺伝子タグを含有しない。そのため100の遺伝子を測定する場合、この相補的DNAの100分子/細胞のみをバックグラウンドとしてシークエンシングし、これらの配列は、一切遺伝子タグまたは実験用タグ配列情報を含有しない。
(実施例10)
ターゲット核酸に相補的な塩基の配列に加えて、シークエンシングチップ上に捕捉するための捕捉アダプター配列としての役割を果たすことができる非ターゲット配列、または遺伝子タグとしての役割を果たすことができる配列、または実験用タグとしての役割を果たすことができる配列、またはこれらの機能の幾つかを組み込む配列を含有する、NPPを合成する。このNPPを、このNPPの非ターゲット配列に相補的である過剰なオリゴヌクレオチドと併せ、それらを互いにハイブリダイズさせることができるようにインキュベートする。その後、この混合物を、ターゲット核酸を含有するサンプルに添加し、ハイブリダイゼーションの後、S1ヌクレアーゼで処理して、標準的qNPAプロトコルを行う。塩基であって、それらにハイブリダイズした相補的塩基を、NPPの核酸ターゲットにハイブリダイズした部分と非ターゲット相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした部分の間に有さない塩基が無いため、核酸ターゲットにハイブリダイズしたNPPは、S1ヌクレアーゼによって切断されず、むしろインタクトのままであり、ターゲットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていないそのNPPは、保護された非ターゲット配列の地点まで加水分解される。塩基中で加熱した後、非ターゲット配列とターゲットオリゴヌクレオチド配列の一部分の両方にわたる相補的オリゴヌクレオチドを添加し、NPP含有相補的ヌクレアーゼターゲット配列のみがハイブリダイズし、より短い非ターゲット配列保護オリゴヌクレオチドも生き残っている非配列NPP配列フラグメントもハイブリダイズすることができない温度で、競合的にNPPにハイブリダイズさせる。その後、第二S1ヌクレアーゼ処理を行い、そしてその後、シークエンシングチップへの捕捉のために必要な配列を有する、生き残っているNPPを、シークエンシングすることができる。このプロトコルは、アダプター配列を取り付けるためのライゲーションを一切必要としない。それが合成NPP付加生成物の一部であるからである。
ターゲット核酸に相補的な塩基の配列に加えて、シークエンシングチップ上に捕捉するための捕捉アダプター配列としての役割を果たすことができる非ターゲット配列、または遺伝子タグとしての役割を果たすことができる配列、または実験用タグとしての役割を果たすことができる配列、またはこれらの機能の幾つかを組み込む配列を含有する、NPPを合成する。このNPPを、このNPPの非ターゲット配列に相補的である過剰なオリゴヌクレオチドと併せ、それらを互いにハイブリダイズさせることができるようにインキュベートする。その後、この混合物を、ターゲット核酸を含有するサンプルに添加し、ハイブリダイゼーションの後、S1ヌクレアーゼで処理して、標準的qNPAプロトコルを行う。塩基であって、それらにハイブリダイズした相補的塩基を、NPPの核酸ターゲットにハイブリダイズした部分と非ターゲット相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした部分の間に有さない塩基が無いため、核酸ターゲットにハイブリダイズしたNPPは、S1ヌクレアーゼによって切断されず、むしろインタクトのままであり、ターゲットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていないそのNPPは、保護された非ターゲット配列の地点まで加水分解される。塩基中で加熱した後、非ターゲット配列とターゲットオリゴヌクレオチド配列の一部分の両方にわたる相補的オリゴヌクレオチドを添加し、NPP含有相補的ヌクレアーゼターゲット配列のみがハイブリダイズし、より短い非ターゲット配列保護オリゴヌクレオチドも生き残っている非配列NPP配列フラグメントもハイブリダイズすることができない温度で、競合的にNPPにハイブリダイズさせる。その後、第二S1ヌクレアーゼ処理を行い、そしてその後、シークエンシングチップへの捕捉のために必要な配列を有する、生き残っているNPPを、シークエンシングすることができる。このプロトコルは、アダプター配列を取り付けるためのライゲーションを一切必要としない。それが合成NPP付加生成物の一部であるからである。
前記実施例を、前記実施例において用いたものの代わりに本発明の一般的にまたは具体的に説明した反応体および/または操作条件を用いることによって繰り返して、同様に成功することができる。
上述の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に突きとめることができ、ならびに本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および修飾を施して本発明を様々な使用法および条件に適応させることができる。引用したすべての出版物および特許は参照により本明細書に援用されている。
Claims (71)
- 生物学的サンプル中の少なくとも1つのターゲットを検出する方法であって、
(i)該サンプルと該ターゲットに特異的に結合する少なくとも1つのヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)とを接触させる工程、
(ii)任意の結合していないNPPを排除するために有効である条件下で、該サンプルを1つ以上の試薬に曝露する工程、
(iii)該結合したNPPを該ターゲットから場合により分離する工程、および
(iv)該NPP、その相補体、または該NPPもしくは該相補体が組み込まれている分子をシークエンシングする工程
を含む、方法。 - 前記NPPを結合形態または遊離形態で検出する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲットが、固定されているか、または架橋されているか、または不溶性である、請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲットが、核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸分子が、リボ核酸(RNA)分子もしくはデオキシリボ核酸(DNA)分子、または非天然塩基を場合により含有するアンチセンスヌクレオチドを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記RNAが、メッセンジャーRNA(mRNA)、リボソームRNA(rRNA)、トランスファーRNA(tRMA)、マイクロRNA(miRNA)、siRNA、およびアンチセンスRNA、またはウイルスRNA(vRNA)である、請求項5に記載の方法。
- 前記DNAが、ゲノムDNA(gDNA)、ミトコンドリアDNA(mtDNA)、葉緑体DNA(cpDNA)、またはウイルスDNA(vDNA)、cDNA、またはトランスフェクトDNAである、請求項5に記載の方法。
- 前記NPPが、前記ターゲットに特異的に結合する核酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記NPPが、DNA分子を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記NPPが、一本鎖DNA(ssDNA)もしくは分岐DNA(bDNA)分子であるか、または非天然塩基を含むLNAもしくはPNAもしくはポリヌクレオチドを含有する、請求項9に記載の方法。
- 前記NPPが、前記ターゲットに特異的に結合する核酸であり、かつ工程(ii)が、任意の結合していないNPPを有効に排除するためのヌクレアーゼまたはヌクレアーゼカクテルでの処理を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲットが、核酸である、請求項11に記載の方法。
- 前記ターゲットが、非天然塩基を場合により含むRNA分子、マイクロRNA、siRNAまたはアンチセンスRNAである、請求項11に記載の方法。
- 前記ターゲットRNA分子が、完全NPP分子またはその一部分にハイブリダイズする、請求項13に記載の方法。
- 前記NPPが、一本鎖(ssDNA)DNAまたは分岐(bDNA)DNAである、請求項11に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、DNAase、RNAase、またはそれらの組み合わせである、請求項11に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、エンドヌクレアーゼ、およびエキソヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項11に記載の方法。
- 前記NPPが、DNA分子であり、かつ前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、DNAaseおよびRNAaseである、請求項11に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、S1ヌクレアーゼである、請求項11に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、エキソヌクレアーゼである、請求項11に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、固定されている、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、ターゲット分子の架橋を生じさせる薬剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲットが、架橋されている、請求項1に記載の方法。
- 生物学的サンプル中の少なくとも1つの核酸ターゲットを検出するための方法であって、
(i)該サンプルと該核酸ターゲットに特異的にハイブリダイズする核酸分子である少なくとも1つのヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)とを、該ターゲットの該NPPへの結合を助長するために十分な条件下で、接触させる工程、
(ii)任意の結合していないNPPを排除するために有効である条件下で、該サンプルを1つ以上のヌクレアーゼに曝露する工程、
(iii)該結合したNPPを該ターゲットから場合により分離する工程、
(v)該NPP、または該NPPを含有する付加生成物を増幅する工程、および
(v)該NPPをシークエンシングする工程
を含む、方法。 - 前記ターゲットが、不溶性であるか、または固定されている、請求項24に記載の方法。
- 前記不溶性核酸が、架橋mRNA、miRNAまたはvRNAである、請求項25に記載の方法。
- 前記NPPが、ssDNAまたはbDNAまたはアプタマーである、請求項24に記載の方法。
- 前記NPPが、DNAであり、かつ工程(ii)における前記ヌクレアーゼが、DNAase、RNAase、またはそれらの組み合わせを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記NPPが、DNAであり、かつ工程(ii)における前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項24に記載の方法。
- 工程(ii)における前記ヌクレアーゼが、S1ヌクレアーゼを含む、請求項24に記載の方法。
- Solexaシークエンシング、454シークエンシング、連鎖停止シークエンシング、ダイターミネーションシークエンシング、またはパイロシークエンシングを含む、請求項24に記載の方法。
- 一分子シークエンシングを含む、請求項24に記載の方法。
- PCR増幅を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記ターゲット分子が、抽出を伴わずに検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲット分子が、可溶化を伴わずに検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲット分子をテンプレートとして使用して、NPPを生合成により生産させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記NPPまたはその一部分に特異的に結合するオリゴヌクレオチドをシークエンシングする工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記NPPまたはその一部分に特異的に結合するオリゴヌクレオチドをシークエンシングする工程を含む、請求項24に記載の方法。
- 生物学的サンプル中の少なくとも1つのターゲットを検出する方法であって、
(i)該サンプルと該ターゲットに特異的に結合する少なくとも1つのヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)とを接触させる工程、
(ii)任意の結合していないNPPおよび該NPPにハイブリダイズされないターゲットを排除するために有効である条件下で、該サンプルを1つ以上の試薬に曝露する工程、
(iii)該結合したNPPを該ターゲットから場合により分離する工程、
(iv)該NPP、または該NPPに対する相補体、または該ターゲット、または該NPPもしくは該ターゲットもしくは該NPPに対する該相補体を含有する付加生成物を場合により増幅する工程、および
(v)該NPP、または該ターゲット、または該NPPに対する該相補体、または該NPPもしくは該ターゲットもしくは該NPPに対する該相補体を含有する該付加生成物をシークエンシングする工程
を含む、方法。 - 前記ターゲット分子が、リボ核酸(RNA)分子、またはデオキシリボ核酸(DNA)分子、または非天然塩基を場合により含有するアンチセンスヌクレオチドを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記RNAが、メッセンジャーRNA(mRNA)、リボソームRNA(rRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、マイクロRNA(miRNA)、siRNA、およびアンチセンスRNA、またはウイルスRNA(vRNA)である、請求項39に記載の方法。
- 前記DNAが、ゲノムDNA(gDNA)、ミトコンドリアDNA(mtDNA)、葉緑体DNA(cpDNA)、またはウイルスDNA(vDNA)、cDNA、またはトランスフェクトDNAである、請求項39に記載の方法。
- 前記NPPが、前記ターゲットに特異的に結合する核酸を含むか、または部分的にもしくは完全にペプチド核酸により構成されるか、または部分的にもしくは完全にLNAもしくは非天然塩基もしくは修飾塩基から構成される、請求項39に記載の方法。
- 前記NPPが、シークエンシング不能成分を含む、請求項39に記載の方法。
- 生物学的ターゲットにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)と、
第一タグであって、該NPPの3’末端から該タグ配列の5’末端を経て伸びるポリヌクレオチド配列を含む、第一タグと、場合により、
該第一タグの3’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含む第二タグと
を含む、シークエンシング可能付加生成物。 - 請求項45に記載のシークエンシング可能付加生成物であって、前記NPPの遊離3’末端から伸びるかもしくは前記第一および前記第二タグ配列を含有するNPP付加生成物の3’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含むアダプターをさらに含むか、または該付加生成物の最後から二番目のタグ配列の3’末端を含む、シークエンシング可能付加生成物。
- 前記第一タグおよび前記第二タグが、独立して、遺伝子タグおよび実験用タグである、請求項45に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 前記遺伝子タグおよび前記アダプターを含む、請求項45に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 前記遺伝子タグ、前記実験用タグおよび前記アダプターを含む、請求項45に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 実験用タグを含む、請求項45に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 実験用タグと前記アダプターとの両方を含む、請求項45に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 前記NPPもしくは1つ以上のタグ配列を含有する前記NPP付加生成物の遊離5’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含むアダプター、および/または該NPPもしくは該NPP付加生成物の3’末端におけるアダプターをさらに含む、請求項45に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 前記遺伝子タグおよび前記アダプターを含む、請求項52に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 前記遺伝子タグ、前記実験用タグおよび前記アダプターを含む、請求項52に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 前記実験用タグおよび前記アダプターを含む、請求項52に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 両方のアダプターを有する付加生成物を含む、請求項52に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 請求項45に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
前記ヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)の3’末端に対する相補的配列を有し、かつ前記第一タグの5’末端に対する相補的配列を有するリンカーを、該NPPにハイブリダイズさせる工程;
遺伝子タグ配列または実験用タグ配列を該相補的配列にハイブリダイズさせる工程;
該第一タグ、および存在する場合には前記第二タグを該NPPに場合によりライゲートして該シークエンシング可能付加生成物を作る工程
を含む、方法。 - 前記最後から二番目のタグが、シークエンシングプラットホーム上への捕捉のために3’末端にアダプター配列を含有する、請求項56に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 請求項45に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
前記ヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)の3’末端に対する相補的配列を有し、かつ前記第一タグに対する相補的配列および前記第二タグの5’末端に対する相補的配列を有するリンカーを、該NPPにハイブリダイズさせる工程;
該第一タグ配列および該第二タグ配列を該相補的配列にハイブリダイズさせる工程;
該第一タグ配列を該NPPに、該第二タグ配列を該第一タグ配列に、場合によりライゲートして該シークエンシング可能付加生成物を作る工程
を含む、方法。 - 前記最後から二番目のタグが、シークエンシングプラットホーム上への捕捉のために3’末端にアダプター配列を含有する、請求項59に記載のシークエンシング可能付加生成物。
- 請求項59に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
5’末端に前記ヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)の5’末端に対する相補的配列を有し、かつ3’末端にアダプター配列の3’末端に対する相補的配列を有するリンカーを、ハイブリダイズさせる工程;
該アダプター配列を該リンカーの該相補的配列にハイブリダイズさせる工程;
該アダプター配列を該NPPにライゲートして該シークエンシング可能付加生成物を作る工程
をさらに含む、方法。 - 請求項57に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
(i)前記NPPまたは前記ターゲットを該NPPに対する第一プライマーを使用して増幅する工程;
(ii)該第一増幅工程の生成物に第二プライマーを場合によりハイブリダイズさせる工程であって、該第二プライマーは、アダプター配列を場合により含む、工程、および
(iii)(ii)の生成物をさらに増幅してシークエンシング可能付加生成物を生成させる工程
をさらに含む、方法。 - 線状NPPの一部として遺伝子タグ配列をさらに含む、請求項62に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
- 線状NPPの一部として実験用タグ配列をさらに含む、請求項62に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
- 線状NPPの一部としてアダプター配列をさらに含む、請求項62に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
- 線状NPPの一部として1つ以上のタグ配列および/またはアダプター配列をさらに含む、請求項62に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
- 線状NPPにライゲートされる実験用タグをさらに含む、請求項62に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
- 前記ターゲットに対して相補的でないが、前記ヌクレアーゼ工程中に相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるので、該ターゲットに結合しているNPPから加水分解も切断もされない配列を有するNPPをさらに含む、請求項62に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
- 請求項62に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、ライゲーション工程後に、該シークエンシング可能付加生成物以外の付加生成物を除去するために精製またはヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼのカクテルとのインキュベーションをさらに含む、方法。
- 生物学的サンプル中の少なくとも1つのターゲットを検出する方法であって、
(i)該サンプルと少なくとも1つの線状ヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)とを接触させる工程であって、該NPPの末端は、該ターゲットに特異的に結合し、ここで、該NPPの5’末端および3’末端は、該ターゲットの隣接塩基にハイブリダイズされる、工程、
(ii)該NPPをライゲートして、環状オリゴヌクレオチドを形成する工程、
(iii)該環状NPPを場合により解離させ、線状NPPの第二分子を該ターゲットにハイブリダイズさせ、ライゲートする工程、
(iv)(iv)を連続サイクルで場合により繰り返す工程、
(v)ヌクレアーゼを添加して、該サンプル中のすべての線状一本鎖オリゴヌクレオチドを破壊する工程、
(vi)該環状NPPを切断して、該NPPを線状化する工程、および
(vii)該線状NPPをシークエンシングする工程
を含む、方法。 - 生物学的サンプル中の少なくとも1つのターゲットを検出する方法であって、
(i)該サンプルと、該ターゲットに特異的に結合する少なくとも1つのヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)とを接触させる工程;
(ii)任意の結合していないNPPおよび該NPPにハイブリダイズされないターゲットを排除するために有効である条件下で、該サンプルを1つ以上の試薬に曝露する工程;
(iii)該結合したNPPを該ターゲットから場合により分離する工程;
(iv)該NPP、または該NPPに対する相補体、または該ターゲット、または
生物学的ターゲットにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)と、
第一タグであって、該NPPの3’末端から該タグ配列の5’末端を経て伸びるポリヌクレオチド配列を含む、第一タグと、場合により
該第一タグの3’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含む第二タグと
を含む付加生成物を、場合により増幅する工程;および
(v)該NPP、または該ターゲット、または該NPPに対する該相補体、または該付加生成物をシークエンシングする工程
を含む、方法。
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