KR101554173B1 - 형광분석기반 효소 활성 검출 방법 - Google Patents

형광분석기반 효소 활성 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101554173B1
KR101554173B1 KR1020100060339A KR20100060339A KR101554173B1 KR 101554173 B1 KR101554173 B1 KR 101554173B1 KR 1020100060339 A KR1020100060339 A KR 1020100060339A KR 20100060339 A KR20100060339 A KR 20100060339A KR 101554173 B1 KR101554173 B1 KR 101554173B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
double
fluorescent dye
stranded
activity
Prior art date
Application number
KR1020100060339A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120000156A (ko
Inventor
민달희
여운석
김동은
장홍제
김영관
이지언
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020100060339A priority Critical patent/KR101554173B1/ko
Publication of KR20120000156A publication Critical patent/KR20120000156A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101554173B1 publication Critical patent/KR101554173B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B32/00—Carbon; Compounds thereof
    • C01B32/20—Graphite
    • C01B32/21—After-treatment
    • C01B32/23—Oxidation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Geology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

본 발명은 산화그래핀을 이용한 형광분석기반 효소 활성 검출 용액 및 방법에 관한 것으로서 상기 효소는 엔도뉴클레아제, 헬리카제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된 것이고, 간단하고, 빠르며, 저비용으로 효소 활성을 실시간으로 정량적 모니터할 수 있고, 다수 시료의 형광 변화를 지켜봄으로써 병렬적(parallel), 고효율고속(high-throughput) 스크리닝의 구현이 가능한 핵산 기질 효소 활성 검출 용액 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 활성 검출 용액 및 방법을 이용하여, 핵산 기질 효소를 이용하는 임의의 연구, 및 항바이러스를 포함하는 항미생물 치료, 항암치료에 있어 약물 후보물질로서의 효소 억제제의 스크리닝에 손쉽게 적용할 수 있을 것이다.

Description

형광분석기반 효소 활성 검출 방법{A fluorescence-based method for assay of enzyme activity}
본 발명은 산화그래핀을 이용한 형광분석기반 효소 활성 검출 방법 및 키트에 관한 것이다.
DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 기질로 하는 여러가지 효소는 거의 모든 세포 과정 및 외부 바이러스/미생물의 복제, 유전자 발현과 연관되어 있어, 외부 바이러스/미생물, 및 내부 암세포 등을 억제하는 후보 약물의 타겟이 될 수 있다.
그 중, 헬리카제는 뉴클레오시드 3인산(NTP) 가수분해로부터 얻은 에너지를 이용하여 핵산 포스포디에스테르 주쇄(backbone)를 따라 이동하면서 이중 가닥의 핵산을 단일 가닥으로 푸는 효소로서, DNA 복제, 재조합, 회복, RNA 전사, 번역 및 리보솜 생합성을 포함하는 거의 모든 세포 과정 및 바이러스 복제에 연관되어 있다. 헬리카제는 DNA 이중나선 또는 분자 내 결합된(self-annelaed) RNA 가닥을 분리하기위하여 이용된다. 특히, 바이러스 복제 및 증식에서의 헬리카제의 중요한 역할 때문에, 헬리카제는 많은 바이러스성 질환들의 치료를 위한 타겟이 되어 왔다. 실제로, 바이러스의 헬리카제 억제제는 C형 간염 및 단순 포진 바이러스 감염의 치료에 있어 성공적인 치료약물 후보물질인 것으로 나타났다.
엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오타이드 사슬의 끝에서 포스포디에스테르 결합을 자르는 엑소뉴클레아제와 달리, 폴리뉴클레오타이드 사슬 내에서 특정 염기서열을 인식하여 포스포디에스테르 결합을 자르는 효소이다. 작용 메커니즘에 따라 타입 I, II, III로 나누어진다. 그 중, 타입 II 경우 인식부위와 절단부위가 동일하여 분자생물학 연구에 주로 이용되고 있다. 특히, 미생물, 식물 또는 동물 세포안으로 도입하기 위한 재조합 DNA 제조시 주로 이용된다. RNA-유도된 유전자 침묵(silencing) 복합체의 형성을 개시하는 다이서(dicer) 효소와 같은 엔도뉴클레아제는 RNA 에 작용하기도 한다(엔도리보뉴클레아제).
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNA MTase)는 DNA의 특정염기에 메틸기(-CH3)를 치환시키는 효소로서, S-아데노실 메티오닌(SAM)을 메틸기 공여자로서 이용한다. DNA는 메틸화를 통해 반응성이 낮아지는 동시에 안정성이 높아지기 때문에 DNA 메틸화는 유전자발현 또는 크로마틴 구조의 변화를 조절하는 기작 중 하나로 알려져 있다. 따라서, 메틸트랜스퍼라제는 항미생물제 또는 항암제의 타겟으로 주목받고 있다.
그러므로, 간단하고 빠르며 비용 효율이 높은 방법으로 상기 효소들의 활성을 검출하여 상기 효소들의 활성제 또는 억제제를 스크리닝할 수 있는 방법의 마련이 중요하다.
헬리카제의 DNA 또는 RNA 풀림(unwinding) 활성을 평가하기 위한 종래 방법은 기질로서 32P로 방사능 표지된 이중 가닥 핵산을 이용하였다. 헬리카제에 의한 기질의 풀림 정도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 이후 수반되는 방사성 동위 원소의 시각화를 이용하여 측정될 수 있다(P. Borowski, A. Niebuhr, O. Mueller, M. Bretner, K. Felczak, T. Kulikowski, H. Schmitz, J. Virol. 2001, 75, 3220). 그러나, 종래 분석법은, 제한된 저장 기간을 가지는 방사능 표지된 기질을 준비하고 PAGE 수행하는데에 긴 시간이 소요되어 비능률적이다. 또한, 종래 방법은, 풀어진 단일 가닥의 DNA(ssDNA)가 상보적인 가닥과 재결합(reanealing)을 수행할 가능성 및, 트랩 DNA(trap DNA)와 재결합된 이중 가닥의 DNA(dsDNA)가 기질로서 헬리카제 반응에 이용될 가능성을 생각하지 않는다(R. L. Eoff, K. D. Raney, Nat. Struct. Mol. Biol. 2006, 13, 242). 따라서, 전반적으로, 종래 분석법은 다중턴오버(multiple-turnover) 헬리카제 반응 또는 병렬적(parallel) 활성 스크리닝에 적당하지 않다.
위와 같은 종래의 동위원소로 표지된 기질 이용 방법의 문제를 해결하고자, 효소결합 면역흡착검사(ELISA)(O. Artsaenko, K. Tessmann, M. Sack, D. Haussinger, T. Heintges, J. Gen. Virol. 2003, 84, 2323), 형광공명 에너지이동(FRET)(I. Rasnik, S. Myong, T. Ha, Nucl. Acids. Res. 2006, 34, 4225), 또는 화학발광(L. T. Zhang, G. Schwartz, M. O'Donnell, R. K. Marrison, Anal. Biochem. 2001, 293, 31)을 기초로 하여 헬리카제 활성 분석을 위한 몇몇의 다른 전략들이 개발되어 왔다. 그러나, 여전히 높은 비용 및 수고로운 과정 등 일상적인 수행이 어려운 문제를 가지고 있다.
엔도뉴클레아제의 DNA 절단 활성을 검출하기 위하여 종래에는 겔 전기영동 분석 시스템을 이용하여 왔다. 그러나, 이러한 시스템은 시간과 노력이 소모되고, 실시간 모니터링이 불가능한 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 해결하고자, 한쪽 5' 말단은 비오틴, 한쪽 5' 말단은 플루오레세인 등으로 표지된 DNA 기질을 사용하는 비 방사성 효소결합 면역흡착검사(ELISA)(Jeltsch et al., Anal. Biochem. 213:234-240(1993)), 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 기질로 이용하는 형광공명 에너지 이동(FRET) 기술이 제안되었으나, 여전히 불연속적이고 검출을 위하여 많은 시료를 처리하는 수고로운 과정이 필요하거나 정확성이 떨어지는 문제점이 있다.
DNA 메틸트랜스퍼라제의 활성을 검출하기 위하여 종래에는 메틸기의 공여자인 S-아데노실 메티오닌(SAM)를 이용하여 DNA 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸기가 치환된 S-아데노실호모시스테인(S-adenosylhomocysteine)의 양을 측정하는 방법이 이용되어 왔다. S-아데노실호모시스테인은 여러 타 효소반응 후 최종적으로 과산화수소와 요산염(Urate)을 생성하게 되고, 비색분석 또는 형광분석방법을 통하여 생성물질의 양을 측정함으로써 DNA 메틸트랜스퍼라제의 활성을 분석하였다(Dorgan, K.M., Wooderchak, W.L., Wynn, D.P., et al., Anal Biochem, 2006, 350, 249). 그러나, 상기와 같은 종래의 방법은 활성을 측정하기 위하여 다른 효소들과 시약을 사용해야 하기 때문에 높은 비용과 시간이 소모된다. 또한 메틸기가 치환되는 반응이외에도 연속적으로 다른 효소반응을 보내야하므로 정확성이 떨어지며, 실시간 검출이 어렵다는 단점이 있다.
한편, 산화그래핀은, 그래핀처럼, 단분자 두께의 시트 형태를 가진 물질로서, 산화된 흑연(graphite)을 염기수용액 내에 분산시켜 생성된 박편을 분리하여 종이 제조하는 것과 같이 누름으로써 제조할 수 있다. 이렇게 형성된 산화그래핀 페이퍼는 32GPa 의 인장모듈러스를 가진다. 산화그래핀의 두께는 1.1±0.3nm 이고, 각 층의 모서리는 카르복실 및 카르보닐기로 종결된다.
본 발명자들은 산화그래핀(GO)이 이중가닥 핵산에 비하여 단일가닥 핵산에 선택적인 결합을 하고 이에 의하여 단일가닥 핵산에 결합된 형광 염료의 형광을 켄칭(quenching)하는 특성을 이용하여 주요 핵산 기질 효소의 활성, 특히 헬리카제가 이중가닥 핵산을 단일가닥 핵산으로 푸는 활성, 엔도뉴클레아제가 이중가닥 핵산을 절단하는 활성, 또는 DNA 메틸트랜스퍼라제가 DNA에 메틸기를 치환시키는 활성을 간단하고 빠르며 저비용으로 검출할 수 있다는 것을 밝혀내고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 간단하고, 빠르며, 저비용으로 핵산 기질 효소의 활성을 실시간으로 정량적 모니터할 수 있는 효소 활성 검출 방법으로서, 산화그래핀을 이용한 형광분석기반 효소 활성 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 엔도뉴클레아제, 헬리카제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된 효소, 단일가닥 말단에 형광염료를 포함하는 이중가닥 핵산 및 산화그래핀을 포함하는 효소 활성 검출 용액을 제공한다.
본 발명에서 "산화그래핀(graphene oxide)"은 단분자 두께(대략 1.1±0.3nm)의 단일층 시트 형태를 가진 산화흑연(graphite oxide)의 일종으로서, 산화된 흑연(graphite)을 염기수용액 내에 분산시켜 생성된 박편을 분리하여 종이 제조하는 것과 같이 누름으로써 제조되는 물질을 말한다. 본 발명에서 산화그래핀은 공지된 방법(L. J. Cote, F. Kim, J. X. Huang, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 1043)에 의하여, 천연 흑연으로부터 제조될 수 있고, 또한 기제조된 시판품의 사용이 가능하다.
본 발명에서 "헬리카제"는 뉴클레오시드 삼인산(NTP) 가수분해로부터 얻은 에너지를 이용하여 핵산 포스포디에스테르 주쇄(backbone)를 따라 이동하면서 이중 가닥의 핵산을 단일 가닥으로 푸는 효소를 말한다. 본 발명에서 헬리카제는 바이러스, 원핵생물 또는 진핵생물의 헬리카제일 수 있으며, 공지된 방법에 따라 대장균 등의 숙주 내에서 과발현시켜 정제하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 이중가닥의 핵산은 DNA-DNA 이중가닥, RNA-RNA 이중가닥 또는 DNA-RNA 이중가닥일 수 있다.
본 발명에서 "엔도뉴클레아제"는 폴리뉴클레오타이드 사슬 내에서 특정 염기서열을 인식하여 포스포디에스테르 결합을 자르는 효소를 말하고, 바람직하게는, 인식부위와 절단부위가 동일한 타입 II 엔도뉴클레아제를 말하지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서 엔도뉴클레아제는 바이러스, 원핵생물 또는 진핵생물의 엔도뉴클레아제일 수 있으며, 공지된 방법에 따라 대장균 등의 숙주 내에서 과발현시켜 정제하여 사용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드 사슬은 DNA 또는 RNA 일 수 있다.
본 발명에서 "DNA 메틸트랜스퍼라제(DNA MTase)"는 DNA의 특정염기에 메틸기(-CH3)를 치환시키는 효소로서, S-아데노실 메티오닌(SAM)을 메틸기 공여자로서 이용하는 효소이다. 본 발명에서 DNA 메틸트랜스퍼라제는 원핵생물 또는 진핵생물의 엔도뉴클레아제일 수 있으며, 공지된 방법에 따라 대장균 등의 숙주 내에서 과발현시켜 정제하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 "효소 활성"은 헬리카제 활성, 엔도뉴클레아제 활성 또는 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 의미하며, "헬리카제 활성"은 뉴클레오시드 삼인산(NTP) 가수분해로부터 얻은 에너지를 이용하여 핵산 포스포디에스테르 주쇄(backbone)를 따라 이동하면서 이중 가닥의 핵산을 단일 가닥으로 푸는 활성을 말하고, "엔도뉴클레아제 활성"은 폴리뉴클레오타이드 사슬 내에서 특정 염기서열을 인식하여 포스포디에스테르 결합을 자르는 활성을 말하고, "DNA 메틸트랜스퍼라제 활성"은 S-아데노실 메티오닌(SAM)을 메틸기 공여자로서 이용하여 DNA의 특정염기에 메틸기(-CH3)를 치환시키는 활성을 말한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 엔도뉴클레아제 또는 DNA 메틸트랜스퍼라제의 활성을 검출하는 경우, 엔도뉴클레아제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함하고; 단일가닥 말단에 형광염료를 포함하는 이중가닥 핵산에서, 상기 형광염료를 포함하는 단일가닥(제1가닥)이 형광염료를 포함하지 않은 상보적인 단일가닥(제2가닥)보다 짧으며; 상기 이중가닥 핵산의 이중가닥 부분은 엔도뉴클레아제의 인식 염기서열을 포함하거나, 또는 DNA 메틸트랜스퍼라제의 인식 염기서열 및 엔도뉴클레아제의 인식 염기서열을 포함하는 효소 활성 검출 용액을 제공한다. 상기 핵산에서 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 길거나 짧을 수 있는데, 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 긴 경우, 상기 제1가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계에 위치한 제1가닥의 말단에 형광염료가 결합되는 것이 바람직하고(도 2b), 상기 핵산에서 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 짧은 경우, 상기 제1가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계와 반대 방향에 위치한 제1가닥의 말단에 형광염료가 결합되는 것이 바람직하다(도 2a).
하나의 양태로서, 본 발명은 엔도뉴클레아제, 헬리카제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된 효소, 단일가닥 말단에 형광염료를 포함하는 이중가닥 핵산 및 산화그래핀(graphene oxide)의 혼합물로부터 형광 방출량을 일정한 시간 간격으로 측정하는 단계를 포함하는, 산화그래핀(graphene oxide)을 이용하여 엔도뉴클레아제, 헬리카제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된 효소의 활성을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서, 상기 산화그래핀은 단일가닥 핵산에 선택적 결합하여 결합된 핵산에 포함된 형광염료로부터 방출되는 형광을 켄칭(quenching)함으로써, 측정되는 형광 방출량이 변화하는 원리를 이용하여 효소의 활성을 검출한다.
산화그래핀의 6각형의 셀(cell)과 핵산의 염기 내 링 구조 간의 파이-스태킹 상호작용(pi-stacking interaction)에 의하여 단일가닥 핵산과 강하게 상호작용할 수 있는데 반하여, 이중가닥 핵산은 음전하로 하전된 인산염 골격에 의하여 염기가 차폐되어 산화그래핀 표면 상에 이중가닥 핵산이 안정적으로 흡착될 수 없다.
형광 염료의 여기 상태로부터 그래핀의 파이(pi) 시스템으로 공명 에너지 전이가 일어나고 그 속도는 거리 의존적이므로, 산화그래핀은 근처의 유기 염료의 형광을 효과적으로 켄칭할 수 있으나, 이중가닥 핵산은 산화그래핀 상의 음전하(산화그래핀의 제타 퍼텐셜: -24.89 mV)와 핵산의 음으로 하전된 인산염 골격이 반발적인 상호작용을 가져 산화그래핀 근처에 위치하지 못하고, 결과적으로 형광의 켄칭이 어렵다.
상기 방법에서, 헬리카제의 활성을 검출하는 방법인 경우, 헬리카제에 의하여 이중가닥 핵산이 풀려서 단일가닥 핵산이 생성됨에 따라, 단일가닥 핵산에 산화그래핀이 선택적 결합한다. 상기 산화그래핀이 결합된 단일가닥 핵산에 포함된 형광염료로부터 방출되는 형광을 산화그래핀이 켄칭(quenching)함으로써, 측정되는 형광 방출량이 감소하는 원리를 이용하여 헬리카제의 이중가닥의 핵산을 단일 가닥으로 푸는 활성을 검출한다(도 1).
상기 방법에서, 엔도뉴클레아제의 활성을 검출하는 방법인 경우, 두 가지 방법을 이용할 수 있다(도 2). 먼저, 형광염료를 포함하는 단일가닥(제1가닥)과 형광염료를 포함하지 않는 단일가닥(제2가닥)을 이용하여 이중가닥 핵산을 형성하는데, 이 때, 제1가닥이 제2가닥보다 짧고, 제1가닥이 제2가닥의 한쪽 끝과 상보적이도록 한다. 그 결과, 하나의 이중가닥 핵산에서 이중가닥 부분과 단일가닥 부분이 함께 존재하는 "부분이중가닥 핵산"이 형성되는데, 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 짧을 수도 있고 길 수도 있다. 상기 이중가닥 부분은 엔도뉴클레아제의 인식 염기서열을 포함한다.
a) 상기 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 짧은 경우, 제1가닥에서 형광염료가 결합하는 부분은, 제1가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계와 반대방향에 위치한 제1가닥의 말단에 형광염료가 결합되는 것이 바람직하다(도 2a). 이 경우, 상기 핵산은 단일가닥 부분에 의해 산화그래핀 표면에 결합한다. 그 결과, 제1가닥 말단에 결합된 형광염료도 역시 비교적 산화그래핀과 근접한 곳에 존재하기 때문에 산화그래핀에 의하여 형광이 켄칭된다.
상기 이중가닥 부분에 존재하는 염기서열을 인식하는 엔도뉴클레아제를 이용하여 이중가닥 부분을 절단하면, 그 결과, 이중가닥 핵산과 부분이중가닥 핵산이 형성된다. 상기 이중가닥 핵산은 형광염료를 포함하고, 부분이중가닥 핵산은 형광염료를 포함하지 않고 단일가닥 부분이 이중가닥 부분보다 길다. 분리된 이중가닥 핵산은 산화그래핀과의 인력이 약해져서 산화그래핀으로부터 멀어지고, 그 결과 형광염료의 형광이 다시 나타나게 된다.
따라서, 엔도뉴클레아제 반응이 일어나기 전 형광이 켄칭된 상태로부터 형광이 증가되는 정도를 측정하여 엔도뉴클레아제의 활성을 분석할 수 있다.
b) 상기 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 긴 경우, 제1가닥에서 형광염료가 결합하는 부분은, 제1가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계에 위치한 제1가닥의 말단에 형광염료가 결합되는 것이 바람직하다(도 2b). 이 경우, 이중가닥 부분이 단일가닥 부분에 비하여 길기 때문에, 상기 핵산은 전체적으로 산화그래핀과의 인력이 크게 작용하지 못하여, 산화그래핀 표면과 멀리 떨어진 상태로 존재하고, 그 결과 형광염료의 형광이 켄칭되지 않고 존재한다.
상기 이중가닥 부분에 존재하는 염기서열을 인식하는 엔도뉴클레아제를 이용하여 이중가닥 부분을 절단하면, 그 결과, 이중가닥 핵산과 부분이중가닥 핵산이 형성된다. 상기 이중가닥 핵산은 형광염료를 포함하지 않고, 부분이중가닥 핵산은 형광염료를 포함하고 단일가닥 부분이 이중가닥 부분보다 길다. 분리된 부분이중가닥 핵산은 단일가닥 부분에 의해 산화그래핀 표면에 결합하고, 형광염료도 산화그래핀과 근접한 곳에 존재하기 때문에 산화그래핀에 의하여 형광이 켄칭된다.
따라서, 엔도뉴클레아제 반응이 일어나기 전 형광의 세기로부터 형광이 감소되는 정도를 측정하여 엔도뉴클레아제의 활성을 분석할 수 있다.
상기 방법에서, DNA 메틸트랜스퍼라제의 활성을 검출하는 방법인 경우, 두 가지 방법을 이용할 수 있다(도 3). 먼저, 형광염료를 포함하는 단일가닥(제1가닥)과 형광염료를 포함하지 않는 단일가닥(제2가닥)을 이용하여 이중가닥 핵산을 형성하는데, 이 때, 제1가닥이 제2가닥보다 짧고, 제1가닥이 제2가닥의 한쪽 끝과 상보적이도록 한다. 그 결과, 하나의 이중가닥 핵산에서 이중가닥 부분과 단일가닥 부분이 함께 존재하는 "부분이중가닥 핵산"이 형성되는데, 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 짧을 수도 있고 길 수도 있다.
엔도뉴클레아제가 인식하는 특정 염기서열의 염기에 DNA 메틸트랜스퍼라제를 이용하여 메틸화를 시켜주게 되면 엔도뉴클레아제에 의하여 DNA가 절단되는 것을 억제된다. 이러한 원리를 이용하여 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 측정할 수 있다. 따라서, 상기 이중가닥 부분은 DNA 메틸트랜스퍼라제의 인식 염기서열 및 엔도뉴클레아제의 인식 염기서열을 포함할 수 있다.
a) 상기 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 짧은 경우, 제1가닥에서 형광염료가 결합하는 부분은, 제1가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계와 반대방향에 위치한 제1가닥의 말단에 형광염료가 결합되는 것이 바람직하다(도 3a). 이 경우, 상기 핵산은 단일가닥 부분에 의해 산화그래핀 표면에 결합한다. 그 결과, 제1가닥 말단에 결합된 형광염료도 역시 비교적 산화그래핀과 근접한 곳에 존재하기 때문에 산화그래핀에 의하여 형광이 켄칭된다.
상기 이중가닥 부분에 존재하는 염기서열을 인식하는 엔도뉴클레아제를 이용하여 이중가닥 부분을 절단하면, 그 결과, 이중가닥 핵산과 부분이중가닥 핵산이 형성된다. 상기 이중가닥 핵산은 형광염료를 포함하고, 부분이중가닥 핵산은 형광염료를 포함하지 않고 단일가닥 부분이 이중가닥 부분보다 길다. 분리된 이중가닥 핵산은 산화그래핀과의 인력이 약해져서 산화그래핀으로부터 멀어지고, 그 결과 형광염료의 형광이 다시 나타나게 된다.
DNA 메틸트랜스퍼라제를 처리하여 DNA에 메틸기를 치환시킨 후, 엔도뉴클레아제로 DNA를 절단하는 실험군 및, 엔도뉴클레아제만 처리하는 대조군을 준비하여DNA 메틸트랜스퍼라제의 활성을 측정한다. 대조군은 엔도뉴클레아제에 의해 이중가닥 부분이 잘리게 되어 상기 설명된 바와 같이 형광이 다시 나타나게 되는 반면, 실험군의 경우 메틸화때문에 엔도뉴클레아제에 의한 절단이 일어나지 않으므로, 형광의 세기에는 변화가 일어나지 않는다. 따라서, 대조군에서 측정된 형광방출량이 실험군에서 측정된 형광방출량에 비하여 증가된 정도에 따라 DNA 메틸트랜스퍼라제가 DNA에 메틸기를 치환시키는 활성을 결정할 수 있다.
b) 상기 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 긴 경우, 제1가닥에서 형광염료가 결합하는 부분은, 제1가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계에 위치한 제1가닥의 말단에 형광염료가 결합되는 것이 바람직하다(도 3b). 이 경우, 이중가닥 부분이 단일가닥 부분에 비하여 길기 때문에, 상기 핵산은 전체적으로 산화그래핀과의 인력이 크게 작용하지 못하여, 산화그래핀 표면과 멀리 떨어진 상태로 존재하고, 그 결과 형광염료의 형광이 켄칭되지 않고 존재한다.
상기 이중가닥 부분에 존재하는 염기서열을 인식하는 엔도뉴클레아제를 이용하여 이중가닥 부분을 절단하면, 그 결과, 이중가닥 핵산과 부분이중가닥 핵산이 형성된다. 상기 이중가닥 핵산은 형광염료를 포함하지 않고, 부분이중가닥 핵산은 형광염료를 포함하고 단일가닥 부분이 이중가닥 부분보다 길다. 분리된 부분이중가닥 핵산은 단일가닥 부분에 의해 산화그래핀 표면에 결합하고, 형광염료도 산화그래핀과 근접한 곳에 존재하기 때문에 산화그래핀에 의하여 형광이 켄칭된다.
DNA 메틸트랜스퍼라제를 처리하여 DNA에 메틸기를 치환시킨 후, 엔도뉴클레아제로 DNA를 절단하는 실험군 및, 엔도뉴클레아제만 처리하는 대조군을 준비하여DNA 메틸트랜스퍼라제의 활성을 측정하면, 대조군은 엔도뉴클레아제에 의해 이중가닥 부분이 잘리게 되어 상기 설명된 바와 같이 형광이 켄칭되는 반면, 실험군의 경우 메틸화때문에 엔도뉴클레아제에 의한 절단이 일어나지 않으므로, 형광의 세기에는 변화가 일어나지 않는다. 따라서, 대조군에서 측정된 형광방출량이 실험군에서 측정된 형광방출량에 비하여 감소된 정도에 따라 DNA 메틸트랜스퍼라제가 DNA에 메틸기를 치환시키는 활성을 결정할 수 있다.
본 발명에서, 형광염료는 공지의 형광염료를 사용할 수 있고, 그 예로서, FAM, HEX™, NED™, ROX™, Texas Red™ 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 실시예에서, 형광염료 결합된 이중가닥 핵산은 산화그래핀의 존재와 관계없이 520 nm 근처에서 강한 형광을 보여주었으나, 형광염료 결합된 단일가닥 핵산과 산화그래핀의 혼합물은 산화그래핀과 단일가닥 핵산의 강한 상호작용으로 인하여 실온에서 10 분 후에 ~92%까지 형광 켄칭을 나타낸 것을 확인하였다(도 5a). 형광염료 결합된 이중가닥 핵산 포함 혼합물에서도 시간이 지남에 따라 형광 켄칭이 일어나긴 했으나, 10 분 이후에 비교적 높은 수준에서 안정 상태에 달하였다(도 5b). 따라서, 산화그래핀이 단일가닥 핵산에 선택적으로 결합하고, 결합된 단일가닥 핵산의 형광 켄칭이 일어남을 확인하였다. 또한, 본 발명의 실시예에서, 특히 다양한 헬리카제 농도 및 다양한 ATP 농도를 이용하여 실험한 결과, 측정된 형광 켄칭 정도가 헬리카제의 이중가닥 핵산 풀기 활성에 의한 것임을 재확인할 수 있었다(도 6).
하나의 양태로서, 본 발명의 방법은 측정된 형광방출량의 감소 속도 또는 감소량에 따라 엔도뉴클레아제, 헬리카제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된 효소의 활성을 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에서, 특히 다양한 농도의 헬리카제 억제제, 다양한 농도의 헬리카제, 다양한 농도의 ATP 등의 조건에 따라 측정된 형광방출량의 단위시간당 감소량(감소 속도) 또는 총 감소량(안정상태(plateau)의 수준)을 이용하여, 헬리카제 억제 동력학 및 헬리카제에 의한 이중가닥 핵산 풀림의 상대 속도가 계산될 수 있다(도 7b).
하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 효소 활성 검출 용액을 포함하는 효소 억제제 스크리닝 키트를 제공한다. 상기 효소는 엔도뉴클레아제, 헬리카제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 키트를 이용하여 본 발명의 방법에 따라, 산화그래핀을 포함하는 효소 반응 혼합물에 스크리닝하고자 하는 효소 억제제 후보물질을 첨가하여, 반응 혼합물로부터 형광 방출량을 일정한 시간 간격으로 측정함으로써 효소 억제제를 스크리닝할 수 있다.
상기 효소 억제제는 바이러스성, 박테리아성, 진균성 감염, 세포 성장 및 조절 장애 질환 등의 약물 후보물질일 수 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 효소 활성 검출 용액 및 효소 억제제 후보물질의 혼합물을 두 세트 이상 포함하고, 각 세트의 혼합물에는 각각 상이한 효소 억제제 후보물질 또는 각각 상이한 농도의 동일 효소 억제제 후보물질이 포함되어 있고, 혼합물로부터 형광 방출량을 일정한 시간 간격으로 측정하는 단계를 포함하는 효소 억제제 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법에 의하여, 두 가지 이상의 효소 억제제의 다양한 농도를 포함하는 다수의 반응 혼합물을 다중-웰 플레이트에서 한꺼번에 형광이미지 측정하여 효소 억제제의 병렬적(parallel), 고효율고속(high-throughput) 스크리닝을 수행할 수 있다. 상기 효소는 엔도뉴클레아제, 헬리카제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 "헬리카제 억제제"란 헬리카제의 이중가닥 핵산을 단일가닥 핵산으로 푸는 활성 및/또는 속도에 방해가 되는 모든 물질을 말한다. 본 발명의 실시예에서, 5'-아데닐이미도디포스페이트(AMP-PNP)와 독소루비신을 헬리카제 억제제 화합물로서 선택하여 본 발명의 방법이 헬리카제 억제제를 스크리닝할 수 있다는 것을 확인하였다. 구체적으로, 측정된 형광방출량의 감소 정도에 따라 결정된 헬리카제 활성의, 대조군 대비 억제 정도에 기초하여 헬리카제 억제제의 효과를 결정할 수 있다. 본 발명에서 "엔도뉴클레아제 억제제"란 엔도뉴클레아제의 폴리뉴클레오타이드 사슬 내에서 특정 염기서열을 인식하여 포스포디에스테르 결합을 자르는 활성 및/또는 속도에 방해가 되는 모든 물질을 말한다. 본 발명에서 "DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제"란 S-아데노실 메티오닌(SAM)을 메틸기 공여자로서 이용하여 DNA의 특정염기에 메틸기(-CH3)를 치환시키는 활성 및/또는 속도에 방해가 되는 모든 물질을 말한다.
본 명세서에서 인용된 모든 문헌은 참조로서 본 명세서의 내용에 포함된다.
본 발명의 효소 활성 검출 용액 및 방법은 다음과 같은 효과를 나타낸다. 첫째, 임의의 추가적인 단계 또는 시약의 필요없이 단지 형광 변화를 지켜봄으로써 효소 활성을 실시간으로 정량적 모니터할 수 있다. 둘째, 값비싼 동위원소 표지 및 트랩 DNA를 필요로 하는 종래 분석법에 비해 비용 효율적이다. 셋째, 제조된 산화그래핀은 대기 조건 하에서 현탁 수용액의 형태로 수개월 동안, 또는 분말 형태로 상당히 더 길게 저장될 수 있으므로, 반감기가 단지 14일인 32P에 비해 훨씬 더 긴 저장 기간을 가진다. 넷째, 임의의 추가적인 정제 또는 용해 단계의 필요 없이 다수 시료의 형광 변화를 지켜봄으로써 병렬적(parallel), 고효율고속(high-throughput) 스크리닝의 구현이 가능하다. 본 발명의 효소 활성 검출 방법을 이용하여, 상기 핵산 기질 효소를 이용한 임의의 연구, 및 항바이러스를 포함하는 항미생물 치료, 항암 치료에 있어 약물 후보물질로서의 효소 억제제의 스크리닝에 손쉽게 적용할 수 있을 것이다.
도 1은 산화그래핀(GO)을 이용하여 헬리카제의 이중가닥 핵산(dsDNA) 풀기 활성을 분석하기 위한 원리를 나타내는 모식도이다.
도 2는 산화그래핀(GO)을 이용하여 엔도뉴클레아제의 활성을 분석하기 위한 원리를 나타내는 모식도이다.
도 3은 산화그래핀(GO)을 이용하여 DNA 메틸트랜스퍼라제의 활성을 분석하기 위한 원리를 나타내는 모식도이다.
도 4는 산화그래핀(GO)의 형성을 확인하는 데이터로서, a) AFM 이미지; b) 산화그래핀의 높이 프로파일; c) 산화그래핀의 IR 스펙트럼; d) 산화그래핀의 라만 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 5는 산화그래핀(GO)에 의한 FAM 형광 켄칭(quenching)을 나타내는 그래프로서, a) 10 분 동안 산화그래핀(GO)과 함께 배양한 후의 형광결합된 이중가닥 핵산(F-dsDNA) 및 형광결합된 단일가닥 핵산(F-ssDNA)의 형광 스펙트럼; b) 다양한 시간 간격으로 520 nm에서 측정된 산화그래핀(GO) 존재 하 F-ssDNA 및 F-dsDNA의 형광 세기를 나타낸다.
도 6은 a) 다양한 농도의 SCV 헬리카제 및 b) 다양한 농도의 ATP에서 수행된, 형광결합된 이중가닥 핵산 풀기 활성 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 헬리카제 억제제의 용량 의존적 억제 측정 결과를 나타내는 그래프로서, a) AMP-PNP(가수분해 불가능한 ATP 유도체)에 의한 헬리카제 억제 및 IC50 값; b) 독소루비신(antracycline 항암제)에 의한 헬리카제 억제 및 IC50 값을 나타내고; c) 다양한 농도의 헬리카제 및 헬리카제 억제제 하에서 얻은 헬리카제, 형광결합된 이중가닥 핵산, 및 산화그래핀(GO)의 반응 혼합물의 형광 이미지를 나타낸다. 첫번째 줄의 이미지는 이중 가닥의 DNA 풀림이 헬리카제 농도에 의존적임을 보여준다. 두 번째 및 세 번째 줄의 이미지는 형광 이미저(fluorescence imager)를 사용하여 AMP-PNP 및 독소루비신의 정량적 억제 분석 결과로서, 병렬적(parallel), 고효율고속(high-throughput) 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 8은 종래 32P-기초의 헬리카제 활성 검출 방법 및 본 발명의 방법을 비교한 것으로서, a상단) dsDNA 기질의 헬리카제 활성의 네이티브 겔 쉬프트 분석(native-gel shift assay) 결과로서, 네이티브-PAGE 상에서 풀린(unwound) DNA를 영동(resolve)시키고 포스포이미저(phosphorimager)로 가시화한 결과이다. (레인 1: 기질 dsDNA; 레인 2: 열-변성된 대조군; 레인 3 및 5: 10 분 동안의 풀림 반응; 레인 4 및 6: 30 분 동안의 풀림 반응); a하단) dsDNA 기질의 헬리카제 활성 검출방법을 종래 방법과 비교하여 수행한 결과로서, 트랩 DNA 없이도 형광이 10 분 이내에 완전히 켄칭됨을 확인할 수 있다; b) 다양한 농도의 AMP-PNP에 의한 헬리카제 억제를 헬리카제 농도 변화에 따라 정량적으로 측정한 결과로서, 속도상수(k')는 단위 시간당 이중가닥 핵산의 어느 정도의 부분이 헬리카제의 풀림 작용에 의하여 변화되고 있는지를 의미한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1 : 산화그래핀(GO)의 제조 및 확인>
먼저, 수정된 Hummer's 방법에 따라 산화그래핀 나노시트(GO)를 제조하였다(L. J. Cote, F. Kim, J. X. Huang, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 1043). 먼저, 0.5g의 천연 흑연(FP 99.95%, Graphit Kropfmuhl AG (Hauzenberg, Germany)), 0.5g의 NaNO3(Junsei (Japan)), 및 23mL의 H2SO4(삼천 화학(Seoul, Korea))를 얼음수조(ice bath) 내에서 격렬하게 교반하면서 혼합하였다. 그 다음, 3g의 KMnO4(Sigma-Aldrich (MO, USA))를 천천히 첨가하였다. 첨가 후, 혼합된 용액을 교반하면서 1 시간 동안 35 ℃ 물 수조로 옮겼다. 그 다음, 40 mL의 증류수를 첨가하고 수조 온도를 30 분 동안 90 ℃까지 올렸다. 100mL의 증류수를 추가로 첨가하였다. 그 후, 3mL의 30% H2O2(Junsei (Japan))를 한방울씩 첨가시켜 상기 용액의 색을 진한 갈색으로부터 노란색으로 변화시켰다. 합성된 산화그래핀 용액을 뷰흐너 깔대기로 여과시키고 증류수로 적어도 4회 세척하였다. 여과 침전물을 데시케이터 내에서 건조시키고 증류수 내로 재분산시켰다.
결과
단일 층의 GO 시트의 성공적인 형성을 확인하기 위하여, 제조된 GO를 원자간력현미경(atomic force microscopy, AFM)으로 분석하였다. GO의 시트 크기와 두께는 대략 폭이 0.1~3 ㎛(소수의 시트는 4 ㎛보다 더 큼)이고 높이가 1.4 nm였다(도 4a, b). GO의 화학적 구조는 적외선 및 라만 분광법 모두에 의하여 확인하였다. 각각 C=O 스트레칭과 C-O 스트레칭에 의한 1716 cm-1 및 1079 cm-1의 피크를 포함하는, 산소를 함유하는 작용기의 몇몇 특징적인 피크가 GO의 적외선 스펙트럼에서 관찰되었다(도 4c). 1350 cm-1의 강한 D-밴드 흡수가 GO의 라만 스펙트럼에서 나타났다(도 4d). 이러한 데이터를 통하여, 단일 층의 GO 시트가 성공적으로 제조되었다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 2 : 산화그래핀의 이중가닥 핵산 및 단일가닥 핵산에의 선택적 결합, 산화그래핀에 결합된 핵산의 형광 켄칭 확인>
플루오레세인 기반 염료인 FAM을 이용하여, FAM 이 단일가닥에 결합된 이중가닥 핵산(F-dsDNA) 또는 FAM이 결합된 단일가닥 핵산(F-ssDNA)을 GO(0.5 ㎍/㎖)와 함께 혼합하여 혼합물을 헬리카제 반응 완충용액(50 mM Tris-HCl(Fisher (NJ, USA)), 50 mM NaCl(Junsei (Japan)), 0.25 mM EDTA(BIO-RAD (CA, USA)), 0.65 mM MgCl2(Junsei (Japan)), 및 10% 글리세롤(Bio Basic Inc. (ON, Canada))을 함유하는 pH 8.0 완충용액) 내에 첨가하고, 상기 각 혼합물의 형광 방출 스펙트럼을 시간에 따라 측정하였다.
결과
F-dsDNA는 GO의 존재와 관계없이 520 nm 근처에서 강한 형광을 보여주었으나, F-ssDNA와 GO의 혼합물은 GO와 ssDNA의 강한 상호작용으로 인하여 실온에서 10 분 후에 ~92%까지 형광 켄칭을 나타냈다(도 5a). F-dsDNA 포함 혼합물에서도 시간이 지남에 따라 형광 켄칭이 일어나긴 했으나, 10 분 이후에 비교적 높은 수준에서 안정 상태에 달하였다(도 5b). 이와 대조적으로, F-ssDNA 포함 혼합물에서는 GO가 ssDNA와 선택적인 상호작용을 함으로써 F-ssDNA의 거의 모든 형광을 켄칭하였다. 따라서, GO가 단일가닥 핵산에 선택적으로 결합하고, 결합된 단일가닥 핵산의 형광 켄칭이 일어남을 확인하였다.
<실시예 3: 다양한 농도의 헬리카제 및 다양한 농도의 ATP를 이용한, 헬리카제 활성 검출방법의 평가>
중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, SARS-CoV, SCV) 헬리카제 nsP13을 사용하여 실험을 진행하였다. SARS CoV 헬리카제는 이전에 보고된 바와 같이 대장균 내에서 과발현시켜 정제하여 사용하였다(K. J. Jang, N. R. Lee, W. S. Yeo, Y. J. Jeong, D. E. Kim, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 366, 738). SARS는 독감과 같은 증상을 발병시키고 높은 사망률을 가지는 치명적인 감염 질환으로서, SCV 헬리카제는 SARS에 대한 항바이러스 약물의 개발을 위한 잠재적인 타겟으로서 알려져 왔다. SCV 헬리카제의 dsDNA 기질은 12 μL의 10 μM 상부 가닥 DNA 5'-TTT TTT TTT TTT TTT GAG CGG ATT ACT ATA CTA CAT TAG AAT TCC -3' 및 형광 염료 표지된 6 μL의 10 μM 하부 가닥 5'-FAM-GGA ATT CTA ATG TAG TAT AGT AAT CCG CTC -3' (Genotech (Daejon, Korea))을 50 mM Tris-HCl 및 50 mM NaCl(1x 완충용액)을 함유하는 pH 8.0 완충용액 내에서 어닐링시켰다 (Y. J. Jeong, M. K. Levin, S. S. Patel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 7264).
먼저, 다양한 농도의 헬리카제를 이용하여 GO 존재 하에 기질로서 F-dsDNA를 사용하여 SCV 헬리카제 활성을 측정하였다. 아데노신 5'-삼인산염(ATP, 10 mM)(Sigma-Aldrich (MO, USA))을 함유하는 반응 완충용액 내 0.1 uM F-dsDNA, GO 및 다양한 농도의 SCV 헬리카제의 혼합물을 제조하고 37 ℃에서 배양하였다. 그 후, 520 nm에서의 형광 방출량을 형광계 SynergyMx (BioTek, Potton, Bedfordshire, UK)을 사용하여 다양한 시간 간격으로 측정하였다. 그 결과, 측정된 형광 켄칭 정도가 헬리카제 농도에 의존한다는 것을 확인할 수 있었다(도 6a).
상기 측정된 형광 켄칭 정도가 헬리카제의 F-dsDNA 풀기 활성에 의한 것임을 확인하기 위하여, 헬리카제의 농도를 10 nM로 일정하게 유지하는 동안 헬리카제 활성의 에너지원인 ATP의 농도를 변화시켜 형광 방출량을 측정하였다. 그 결과, 형광 켄칭 정도가 ATP 농도가 증가함에 따라 실제로 증가하였고(도 6b), 따라서, 측정된 형광 켄칭 정도가 헬리카제의 F-dsDNA 풀기 활성에 의한 것임을 확인할 수 있었다.
<실시예 4 : 헬리카제 억제제 분석 수행>
본 발명의 일실시예에 따른 방법을 이용하여 헬리카제 억제제 분석을 수행해보았다. 5'-아데닐이미도디포스페이트(AMP-PNP)(Sigma-Aldrich (MO, USA))와 독소루비신(히드록시다우노루비신으로도 알려짐)(Sigma-Aldrich (MO, USA))을 헬리카제 억제제 화합물로서 선택하였다. 가수분해 불가능한 ATP 유사체인 AMP-PNP는 ATP와 ATP 결합 부위를 두고 경쟁함으로써 헬리카제 활성을 억제하는 것으로 이전에 보고되었다. 항암제인 독소루비신은 이중 나선의 DNA 사이에 끼워 넣어져 dsDNA의 풀림을 감속시킨다.
헬리카제 반응 완충용액 내 헬리카제(10 nM), F-dsDNA(100 nM), GO(1 ㎍/㎖), ATP(10 mM) 및 다양한 농도의 억제제를 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다. 독소루비신의 경우, 다른 성분으로부터의 방해 없이 독소루비신이 F-dsDNA 사이에 끼어들어가는 것을 확실히 하기 위하여 다른 시약을 혼합하기 전에 F-dsDNA와 독소루비신의 혼합물을 제조하고 실온에서 20 분 동안 배양하였다. 그 후 520 nm에서의 형광 세기의 변화를 각각의 반응 혼합물에 대해 37 ℃에서 30 분 동안 측정하였다.
상기 방법에서는, 두 가지 헬리카제 억제제의 다양한 농도를 포함하는 다수의 반응 혼합물을 다중-웰 플레이트에서 한꺼번에 형광이미지 측정하여 헬리카제 억제제의 병렬적(parallel), 고효율고속(high-throughput) 스크리닝을 수행하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트에서 수행하고, 형광 이미지는 IVIS 이미징 시스템(Xenogen, Alameda, CA, USA)을 이용하여 플레이트 내 반응 혼합물로부터 얻었다.
결과
AMP-PNP 및 독소루비신의 IC50 값(half maximal inhibitory concentration, IC50은 어떤 화합물이 생물학 또는 생화학적 기능을 억제하는 효과를 측정하기 위하여 사용되는 것으로서, 해당 생물학적 기능을 절반만큼 억제하기 위하여 특정 화합물이 얼마나 많이 필요한가를 측정하는 것이다)은 각각 480.9 mM 및 31.3 mM인 것으로 확인되었다(도 7a, b). 상기 결과에 따르면, AMP-PNP 및 독소루비신 모두 헬리카제 억제제로서 효과가 있고, 독소루비신이 AMP-PNP에 비하여 강력한 헬리카제 억제제라는 것을 알 수 있다. 또한, 병렬적 다중 분석 결과로서 AMP-PNP 및 독소루비신에 의한 헬리카제 활성의 억제가 명확히 가시화되었으며, 헬리카제 활성 억제에 대한 AMP-PNP 및 독소루비신의 용량 의존성이 형광 이미지에서 분명하게 관찰되었다(도 7c).
<실시예 5 : 종래 방법과의 비교>
1. 종래 방법
32P-표지된 dsDNA를 이용하여 종래 PAGE 플랫폼에 의한 헬리카제 활성 분석을 수행하였다. 구입한 단일 가닥의 DNA(Integrated DNA Technologies (IA, USA))를 변성(denaturing) (8M 우레아) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 통해 정제하였다. DNA 농도를 260 nm에서의 흡광도 및 이의 흡광계수로 측정하였다. 짧은 DNA 가닥(30nts) 기질을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(New England Biolabs (MA, UK)) 및 [γ-32P] ATP(Amersham Biosciences (NJ, USA))를 사용하여 32P로 말단 표지하였다. 5'-돌출된 32P-표지된 이중 나선의 DNA 기질을 제조하기 위하여, 32P-표지된 하부 가닥 DNA를 2배 과량의 상보적인 DNA(45nts, 상부 가닥)와 혼합한 다음 5 분 동안 95 ℃로 가열함으로써 어닐링한 뒤 30 분 이상 실온에서 천천히 냉각시켰다.
상기와 같이 제조된 32P-표지된 dsDNA(10 nM), 헬리카제(100 nM), 및 트랩 DNA(10μM)를 함유하는 반응 혼합물을 반응 완충용액 내에서 제조하였다. 트랩 DNA(비표지된 하부 가닥 DNA)는 풀어진 표지된 DNA 생성물의 재결합을 방지하기 위하여 과량으로 필요하였다. 다양한 시간 간격에서 표본을 취하고 동일한 부피의 켄치(quench) 완충용액(pH 8.0의 100 mM EDTA, 0.4 % SDS, 20 % (v/v) 글리세롤, 및 1 % 브로모페놀 블루)을 첨가함으로써 반응을 종결(quenching)하였다. 2.5% 글리세롤을 함유하는 1x Tris-붕산염-EDTA (pH 7.0)으로 완충된, 비변성(nondenaturing) 10% 폴리아크릴아미드 겔 내에서의 전기영동을 통해 10μL의 반응종결된 시료를 즉시 분석하였다 (도 8a 상단). 또한, 이중 나선의 DNA 기질(10 nM)을 5 분 동안 95 ℃에서 1,000배 과량의 트랩 DNA과 함께 가열시킴으로써, 최대의 풀어진 생성물을 측정하기 위한 열-변성된 대조구를 제조하였다. 방사능은 Cyclone (PerkinElmer)을 이용하여 측정하였고 OptiQuant/Cyclone software (Packard Instrument Company)로 정량화하였다.
결과
얻은 겔 이미지는 각 시료 내의 dsDNA와 ssDNA의 상대적인 양을 나타낸다. 트랩 DNA의 부재 시와 트랩 DNA의 존재 시를 대비하였을 때 동일한 시간 간격에서의 이중가닥 풀림에도 불구하고 동일한 양의 단일가닥 핵산(ssDNA) 생성량을 나타내지 않으므로, 상기 데이터는 트랩 DNA가 반드시 필요함을 보여준다. 또한, 겔 기초 분석법은 단지 반응이 종료된 이후에 분석될 수 있는 종점 분석법(endpoint assay)이자 완전히 풀어진 ssDNA 생성물만을 보고하는 일괄법(all-or-none method)이므로, 실시간의 이중가닥 핵산 풀림의 동적인 연구에 부적절하다.
이와는 대조적으로, 본 발명의 일실시예에 의한 방법을 이용한 경우(도 8a 하단), dsDNA의 풀림이 트랩 DNA의 부재 시에도 유사한 조건 하에서 10 분 이내에 완성되었음을 보여준다. 이러한 결과는 본 발명의 일실시예에 의한 방법이, 트랩DNA의 부재 시에도, 풀어져서 분리된 ssDNA를 효과적으로 포획함으로써 풀어진 ssDNA의 재결합을 방지하기 위한 조건을 구현시킴을 나타낸다.
본 발명의 일실시예에 의한 방법을 이용한 경우, 억제제로서 AMP-PNP를 사용하여 다양한 농도의 헬리카제 및 AMP-PNP를 함유하는 반응 혼합물의 형광 세기를 시간에 따라 모니터함으로써 헬리카제 억제 동력학을 측정할 수 있다. 본 방법에 근거하여, 헬리카제에 의한 dsDNA의 풀림의 상대 속도가 계산될 수 있다(도 8b).

Claims (17)

  1. 엔도뉴클레아제, 헬리카제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된 효소, 단일가닥 말단에 형광염료를 포함하는 이중가닥 핵산 및 산화그래핀을 포함하는 효소 활성 검출 용액.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산화그래핀은 단일층의 시트 형인 효소 활성 검출 용액.
  3. 제1항에 있어서, 상기 이중가닥 핵산은 DNA-DNA 이중가닥, RNA-RNA 이중가닥 또는 DNA-RNA 이중가닥인 효소 활성 검출 용액.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 엔도뉴클레아제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소이고,
    상기 단일가닥 말단에 형광염료를 포함하는 이중가닥 핵산에서, 상기 형광염료를 포함하는 단일가닥이 형광염료를 포함하지 않은 상보적인 단일가닥보다 짧으며,
    상기 이중가닥 핵산의 이중가닥 부분은 엔도뉴클레아제의 인식 염기서열을 포함하거나, 또는 DNA 메틸트랜스퍼라제의 인식 염기서열 및 엔도뉴클레아제의 인식 염기서열을 포함하는 효소 활성 검출 용액.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 핵산에서 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 길고,
    상기 형광염료를 포함하는 단일가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계에 위치한, 상기 단일가닥의 말단에 형광염료가 결합된 것인 효소 활성 검출 용액.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 핵산에서 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 짧고,
    상기 형광염료를 포함하는 단일가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계와 반대 방향에 위치한, 상기 단일가닥의 말단에 형광염료가 결합된 것인 효소 활성 검출 용액.
  7. 엔도뉴클레아제, 헬리카제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된 효소, 단일가닥 말단에 형광염료를 포함하는 이중가닥 핵산 및 산화그래핀(graphene oxide)의 혼합물로부터 형광 방출량을 일정한 시간 간격으로 측정하는 단계를 포함하는, 산화그래핀(graphene oxide)을 이용하여 엔도뉴클레아제, 헬리카제 및 DNA 메틸트랜스퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된 효소의 활성을 검출하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 산화그래핀은 단일가닥 핵산에 선택적으로 결합하여 결합된 핵산에 포함된 형광염료로부터 방출되는 형광을 켄칭(quenching)하는 것인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 효소는 헬리카제이고,
    측정된 형광방출량의 감소 정도에 따라 헬리카제가 이중가닥 핵산을 단일가닥 핵산으로 푸는 활성을 결정하는 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 효소는 엔도뉴클레아제이고,
    상기 단일가닥 말단에 형광염료를 포함하는 이중가닥 핵산에서, 상기 형광염료를 포함하는 단일가닥이 형광염료를 포함하지 않은 상보적인 단일가닥보다 짧으며, 상기 이중가닥 핵산의 이중가닥 부분은 엔도뉴클레아제의 인식 염기서열을 포함하고,
    측정된 형광방출량의 증가 정도 또는 감소 정도에 따라 엔도뉴클레아제가 이중가닥 핵산을 절단하는 활성을 결정하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 핵산에서 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 길고,
    상기 형광염료를 포함하는 단일가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계에 위치한, 상기 단일가닥의 말단에 형광염료가 결합되며,
    측정된 형광방출량의 감소 정도에 따라 엔도뉴클레아제가 이중가닥 핵산을 절단하는 활성을 결정하는 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 핵산에서 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 짧고,
    상기 형광염료를 포함하는 단일가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계와 반대 방향에 위치한, 상기 단일가닥의 말단에 형광염료가 결합되며,
    측정된 형광방출량의 증가 정도에 따라 엔도뉴클레아제가 이중가닥 핵산을 절단하는 활성을 결정하는 방법.
  13. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    DNA 메틸트랜스퍼라제, 단일가닥 말단에 형광염료를 포함하는 이중가닥 핵산 및 산화그래핀(graphene oxide)의 혼합물에 엔도뉴클레아제를 추가로 부가하는 실험군, 및 엔도뉴클레아제, 단일가닥 말단에 형광염료를 포함하는 이중가닥 핵산 및 산화그래핀(graphene oxide)의 혼합물을 이용하는 대조군을 만들고,
    상기 단일가닥 말단에 형광염료를 포함하는 이중가닥 핵산에서, 상기 형광염료를 포함하는 단일가닥이 형광염료를 포함하지 않은 상보적인 단일가닥보다 짧고, 상기 이중가닥 핵산의 이중가닥 부분은 DNA 메틸트랜스퍼라제의 인식 염기서열 및 엔도뉴클레아제의 인식 염기서열을 포함하며,
    실험군에서 측정된 형광방출량과 대조군에서 측정된 형광방출량의 차이에 따라 DNA 메틸트랜스퍼라제가 DNA에 메틸기를 치환시키는 활성을 결정하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 핵산에서 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 길고,
    상기 형광염료를 포함하는 단일가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계에 위치한, 상기 단일가닥의 말단에 형광염료가 결합되며,
    대조군에서 측정된 형광방출량이 실험군에서 측정된 형광방출량에 비하여 감소된 정도에 따라 DNA 메틸트랜스퍼라제가 DNA에 메틸기를 치환시키는 활성을 결정하는 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 핵산에서 이중가닥 부분이 단일가닥 부분보다 짧고,
    상기 형광염료를 포함하는 단일가닥의 양 말단 중에서, 핵산의 이중가닥 부분과 단일가닥 부분의 경계와 반대 방향에 위치한, 상기 단일가닥의 말단에 형광염료가 결합되며,
    대조군에서 측정된 형광방출량이 실험군에서 측정된 형광방출량에 비하여 증가된 정도에 따라 DNA 메틸트랜스퍼라제가 DNA에 메틸기를 치환시키는 활성을 결정하는 방법.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 효소 활성 검출 용액을 포함하는 효소 억제제 스크리닝 키트.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 효소 활성 검출 용액 및 효소 억제제 후보물질의 혼합물을 두 세트 이상 포함하고, 각 세트의 혼합물에는 각각 상이한 효소 억제제 후보물질 또는 각각 상이한 농도의 동일 효소 억제제 후보물질이 포함되어 있고, 상기 혼합물로부터 형광 방출량을 일정한 시간 간격으로 측정하는 단계를 포함하는 효소 억제제 스크리닝 방법.
KR1020100060339A 2010-06-25 2010-06-25 형광분석기반 효소 활성 검출 방법 KR101554173B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100060339A KR101554173B1 (ko) 2010-06-25 2010-06-25 형광분석기반 효소 활성 검출 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100060339A KR101554173B1 (ko) 2010-06-25 2010-06-25 형광분석기반 효소 활성 검출 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120000156A KR20120000156A (ko) 2012-01-02
KR101554173B1 true KR101554173B1 (ko) 2015-09-18

Family

ID=45608078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100060339A KR101554173B1 (ko) 2010-06-25 2010-06-25 형광분석기반 효소 활성 검출 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101554173B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170040080A (ko) 2015-10-02 2017-04-12 주식회사 레모넥스 수용성 고분자가 결합된 나노물질을 포함하는 소광제 및 이의 용도
KR101995895B1 (ko) 2018-10-18 2019-07-03 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 산화 그래핀 및 RNase H를 이용한 DNA의 등온 검출 방법

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102707060B (zh) * 2012-05-31 2015-05-20 杭州师范大学 一种检测mgmt活性的化学发光检测试剂盒及检测方法
KR101608584B1 (ko) 2014-06-24 2016-04-04 인천대학교 산학협력단 수산화기―풍부 그래핀 산화물을 전기화학적 환원하여 얻어진 그래핀 박막, 및 이를 이용한 요산 검출방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANAL. CHEM. Vol.82:5511-5517 (온라인출판일 2010. 06. 04.)
BIOSENSORS and BIOELECTRONICS. Vol.25:2361-2365 (온라인출판일 2010. 02. 26.)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170040080A (ko) 2015-10-02 2017-04-12 주식회사 레모넥스 수용성 고분자가 결합된 나노물질을 포함하는 소광제 및 이의 용도
KR20190014566A (ko) 2015-10-02 2019-02-12 주식회사 레모넥스 수용성 고분자가 결합된 나노물질을 포함하는 소광제 및 이의 용도
US10809196B2 (en) 2015-10-02 2020-10-20 Lemonex Inc. Quencher containing water soluble polymer-conjugated nanomaterial and use thereof
DE202016009124U1 (de) 2015-10-02 2022-07-22 Lemonex Inc. Quencher, der mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial enthält, und seine Verwendung
KR101995895B1 (ko) 2018-10-18 2019-07-03 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 산화 그래핀 및 RNase H를 이용한 DNA의 등온 검출 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120000156A (ko) 2012-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102628577B1 (ko) Crispr 이펙터 시스템 기반 진단법
EP3551753B1 (en) Crispr effector system based diagnostics
Liu et al. HMGB1: roles in base excision repair and related function
US20210269866A1 (en) Crispr effector system based amplification methods, systems, and diagnostics
Liu et al. DNA-templated copper nanoparticles: versatile platform for label-free bioassays
KR20200111180A (ko) Crispr 이펙터 시스템 기반 다중 진단
EP3837379B1 (en) Method of nucleic acid enrichment using site-specific nucleases followed by capture
Liu et al. DNA methyltransferase activity detection based on fluorescent silver nanocluster hairpin-shaped DNA probe with 5’-C-rich/G-rich-3’tails
KR20200062198A (ko) 다중-이펙터 crispr 기반 진단 시스템
Leung et al. Luminescent oligonucleotide-based detection of enzymes involved with DNA repair
JP6871181B2 (ja) 電場における単一分子の分析
Yeeles et al. Recombination hotspots and single-stranded DNA binding proteins couple DNA translocation to DNA unwinding by the AddAB helicase-nuclease
Shang et al. Label-free sensing of human 8-oxoguanine DNA glycosylase activity with a nanopore
KR101554173B1 (ko) 형광분석기반 효소 활성 검출 방법
CN107151694B (zh) 环介导的级联放大策略用于高灵敏检测dna甲基转移酶活性
Liu et al. Highly sensitive detection of T4 polynucleotide kinase activity by coupling split DNAzyme and ligation-triggered DNAzyme cascade amplification
Wang et al. Cytosine-5 methylation-directed construction of a Au nanoparticle-based nanosensor for simultaneous detection of multiple DNA methyltransferases at the single-molecule level
US20160047826A1 (en) Compositions and methods for detection of a target in a molecular assay using ph changes
Liu et al. A novel DNAzyme-based colorimetric assay for the detection of hOGG1 activity with lambda exonuclease cleavage
Lee et al. Nucleic acid-based fluorescent methods for the determination of DNA repair enzyme activities: a review
WO2023039491A2 (en) Coronavirus rapid diagnostics
KR101818177B1 (ko) Ｄｎａ 절단효소 또는 메틸전이효소 활성 분석용 그라핀 산화물 기반 키트
Zhang et al. Advances in enzyme-free nucleic acid amplification-based fluorescent biosensors for real-time imaging of DNA repair enzymes in living cells
Zahraee et al. Three-way junction skeleton biosensors based on aptamers, DNAzymes, and DNA hybridization probes
WO2013154138A1 (ja) 分子ビーコン型プローブを用いた標的核酸の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180823

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191226

Year of fee payment: 5

R401 Registration of restoration