DE202016009124U1 - Quencher, der mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial enthält, und seine Verwendung - Google Patents

Quencher, der mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial enthält, und seine Verwendung Download PDF

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Abstract

Zusammensetzung, umfassend einen Quencher, der ein mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial und eine mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde umfasst;
wobei das wasserlösliche Polymer aus der Gruppe ausgewählt sein kann, die aus Chitosan, einem Chitosansalz, Dextran, Hyaluronsäure, einem Hyaluronat, Pektin, einem Pektinsalz, einem Alginat, Alginsäure, Agar, einem Galactomannan, einem Galactomannansalz, Xanthan, einem Xanthansalz, β-Cyclodextrin, einem β-Cyclodextrinat, Polyethylenglycol (PEG), Polyethylenimin (PEI) und einer Kombination davon besteht; und
wobei das Nanomaterial ein aus Graphit-Nanofaser hergestelltes Graphenoxid-Nanokolloid (GON) ist; und
wobei das mit dem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial an die mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde gebunden ist.

Description

  • Fachgebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Quencher, der ein mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial enthält, und seine Verwendung.
  • Stand der Technik
  • Verfahren zum Nachweis einer spezifischen Nucleinsäure (DNA oder RNA) oder eines Proteins sind entscheidende Methoden in dem Gebiet der wissenschaftlichen Forschung. Da eine spezifische Nucleinsäure oder Protein nachgewiesen werden kann, konnten Forscher bestimmen, welcher genetische oder biologische Marker ein Marker ist, der den Gesundheitszustand eines Menschen anzeigt. Gemäß solcher Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure oder eines Proteins kann eine Modifikation eines pathogenen Gens, das in einer Probe vorhanden ist, oder die Expression eines spezifischen Gens, das in einer Probe vorhanden ist, gefunden werden.
  • Ein organisches oder anorganisches Polymer, wie Graphenoxid, das eine mit einem zweidimensionalen Gitter gefüllte planare Struktur aufweist, und Derivate davon können jedoch Elektronen übertragen. Eine solche Elektronenübertragung wird durch physikalische Eigenschaften wie die Kristall- und Gitterstruktur des Polymers verursacht. Insbesondere kann das Fluoreszenzsignal eines organischen Fluoreszenzfarbstoffs durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) abgelöscht werden.
  • Daher kann eine Veränderung des Fluoreszenzsignals eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Nucleinsäurepolymers mit Hilfe der physikalischen Eigenschaften eines Materials wie Graphenoxid beobachtet werden, und ein solches Biomaterial, wie eine Nucleinsäure oder ein Protein, kann nachgewiesen werden (Koreanisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 10-1496671). Außerdem wurde ein Verfahren zum Nachweis der Aktivität eines Enzyms auf Fluoreszenzanalysebasis mit Hilfe eines solchen Materials entwickelt (Koreanisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 10-1554173 ). In letzter Zeit wurden Techniken unter Verwendung eines solchen Materials genutzt, um ein Gen oder Protein eines in einer Probe vorhandenen Pathogens zu beobachten, und sind daher in der anfänglichen Erforschung einer Krankheit oder Erkrankung wichtig geworden.
  • Ein solches Nachweisverfahren mit Hilfe von Graphenoxid ist zwar einfach, kann aber durch eine Menge eines Zielmaterials, das in einer Probe enthalten ist, stark beeinflusst werden, und da die Größenverteilung von bei dem Nachweis verwendeten Nucleinsäurepolymeren nicht gleichmäßig ist, ist der Fehlerbereich groß. Außerdem sind in einer in-vitro-Umgebung für eine in-vitro-Diagnose die Polymere instabil, und somit ist die Reproduzierbarkeit reduziert.
  • Offenbarung
  • Technisches Problem
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Quencher, der mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial enthält, und eine Zusammensetzung, die den Quencher und eine mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde umfasst, bereitzustellen. Außerdem ist es ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bereitstellung von Informationen, die für die Diagnose einer Erkrankung notwendig sind, unter Verwendung der Zusammensetzung anzugeben.
  • Technische Lösung
  • Um die Ziele zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung einen Quencher bereit, der ein mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial enthält.
  • Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die den Quencher und eine mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde umfasst, bereit.
  • Außerdem gibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung von Informationen, die für die Diagnose einer Erkrankung notwendig sind, an, wobei das Verfahren umfasst: Herstellen eines Gemischs durch Mischen der Zusammensetzung mit einer isolierten Probe; Messen einer Fluoreszenzintensität des Gemischs; und Vergleichen der resultierenden Intensität mit einer Fluoreszenzintensität einer normalen Kontrollprobe.
  • Außerdem stellt die vorliegende Erfindung einen Kit bereit, der den Quencher und eine mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde umfasst.
  • Vorteilhafte Wirkungen
  • Ein Quencher der vorliegenden Erfindung, der ein mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial enthält, löscht wirksam die von einer mit einem fluoreszierenden Material konjugierten Sonde emittierte Fluoreszenz ab. Außerdem ist das mit einem wasserlöslichen Polymer konjugierte Nanomaterial stabil an die mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde gebunden. Wenn außerdem in Anwesenheit einer Zielmaterials die Sonde an das Zielmaterial gebunden ist, kann die Sonde leicht von dem mit dem wasserlöslichen Polymer konjugierten Nanomaterial freigesetzt werden, und somit kann das Zielmaterial wirksam nachgewiesen werden. Daher kann eine Zusammensetzung, die den Quencher und die mit dem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde umfasst, auch ein in einer niedrigen Konzentration vorhandenes Zielmaterial nachweisen. Aus diesem Grund kann die Zusammensetzung wirksam als Zusammensetzung oder Kit zum Bereitstellen von Informationen, die für den Nachweis eines Biomaterials oder die Diagnose einer Erkrankung notwendig sind, verwendet werden.
  • Figurenliste
    • 1 ist ein schematisches Diagramm, das ein Verfahren zur Herstellung eines mit einem wasserlöslichen Polymer konjugierten Nanomaterials und ein Verfahren zum Nachweis eines Biomaterials mit Hilfe des dadurch hergestellten Materials veranschaulicht.
    • 2 ist ein rasterkraftmikroskopisches (AFM) Bild eines Graphenoxid-Nanokolloids (GON), das in einem Beispiel hergestellt wird.
    • 3 umfasst ein rastertransmissionselektronenmikroskopisches (STEM; a) und AFM (b) Bild von zweidimensionalem Nanomaterial, und zwar Mangandioxid, das in einem Beispiel hergestellt wird.
    • 4 ist ein AFM-Bild von Nano-Graphenoxid (NGO), das in einem Beispiel hergestellt wird.
    • 5 umfasst ein AFM-Bild (a) und eine Graphik, die Raman-Spektren repräsentiert (b), von GON, das mit Dextran oberflächenmodifiziert ist (DReGON).
    • 6 ist ein AFM-Bild von NGO, das mit Polyethylenglycol oberflächenmodifiziert ist (PEG-NGO; a), oder GON, das mit PEG und Polyethylenimin (PEI) oberflächenmodifiziert ist (PEG-PEI-GON; b).
    • 7 ist eine Graphik, die ein Fluoreszenzsignal repräsentiert, das von einem Gemisch von DReGON und PNA-US5-2 (a) oder PNA-DENV (b) als Sonde emittiert wird, um zu bestätigen, ob eine Nachweiszusammensetzung entstanden ist oder nicht.
    • 8 ist eine Graphik, die ein Fluoreszenzsignal repräsentiert, das von einem Gemisch von PEG-NGO und PNA-Sa (a) oder PNA-Pa (b) als Sonde emittiert wird, um zu bestätigen, ob eine Nachweiszusammensetzung entstanden ist oder nicht.
    • 9 ist eine Graphik, die ein Fluoreszenzsignal repräsentiert, das von einem Gemisch von PEG-PEI-GON und PNA-TS als Sonde emittiert wird, um zu bestätigen, ob eine Nachweiszusammensetzung entstanden ist oder nicht.
    • 10 umfasst Diagramme zum Vergleichen der Fluoreszenzstabilität von GON (a) mit der von DReGON (b).
    • 11 ist eine Graphik zur Bestätigung der Zielmaterial-Nachweiseignung von DReGON und GON.
    • 12 ist eine Graphik zur Bestätigung der Nachweiseignung von PEG-NGO, wenn miR-21 (a) oder miR-223 (b) als Zielmaterial in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wird.
    • 13 ist eine Graphik zur Bestätigung der Nachweiseignung von PEG-PEI-GON, wenn miR-TS als Zielmaterial in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wird.
    • 14 umfasst Bilder zur Bestätigung, dass kein Fluoreszenzsignal nachgewiesen wird, wenn kein Sonde zu verschiedenen Krebszelllinien gegeben wird.
    • 15 umfasst Bilder zur Bestätigung der Krebszell-Nachweiseignung von DReGON, das mit PNA484 oder PNA31 gemischt ist, als Sonde in verschiedenen Krebszelllinien.
    • 16 umfasst Graphiken zur Bestätigung der Blutzell-Nachweiseignung von DReGON, das mit PNA21, PNA223, Let-7a oder einem Gemisch davon (verrührt) gemischt ist, als Sonde.
    • 17 ist eine Graphik von Fluoreszenzintensitäten, die man findet, nachdem verschiedene Konzentrationen einer fluoreszenzmarkierten Nucleinsäuresequenz, die an Pseudomonas aeruginosa (a) oder Staphylococcus aureus (b) bindet, mit PEG-NGO gemischt werden und mit Pseudomonas aeruginosa oder Staphylococcus aureus gemischt werden.
    • 18 ist eine Graphik von Fluoreszenzintensitäten, die man findet, nachdem eine Nucleinsäuresequenz, die spezifisch an humanes Cytomegalovirus (a) oder Denguevirus (b) bindet, mit DReGON gemischt wird und mit humanem Cytomegalovirus oder Denguevirus gemischt wird.
  • FORMEN DER ERFINDUNG
  • Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Quencher bereit, der ein mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial enthält.
  • Der hier verwendete Ausdruck „wasserlösliches Polymer“ bezieht sich auf ein Harz oder Polymer, das in Wasser gelöst oder in Form von feinen Teilchen in Wasser dispergiert werden kann. Das wasserlösliche Polymer kann ein natürliches Polymer, ein halbsynthetisches Polymer oder ein synthetisches Polymer sein. Das wasserlösliche Polymer, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann ein Molekulargewicht von 1 bis 20 kDa, 5 bis 15 kDa oder 8 bis 12 kDa aufweisen. In einer Ausführungsform kann das Molekulargewicht des wasserlöslichen Polymers 10 kDa betragen.
  • Das wasserlösliche Polymer kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Chitosan und einem Derivat davon, einem Chitosansalz, Dextran und einem Derivat davon, Hyaluronsäure und einem Derivat davon, einem Hyaluronat, Pektin und einem Derivat davon, einem Pektinsalz, einem Alginat und einem Derivat davon, Alginsäure, Agar, einem Galactomannan und einem Derivat davon, einem Galactomannansalz, Xanthan und einem Derivat davon, einem Xanthansalz, β-Cyclodextrin und einem Derivat davon, einem β-Cyclodextrinat, Polyethylenglycol (PEG), Polyethylenimin (PEI) und einer Kombination davon besteht. In einer Ausführungsform kann das wasserlösliche Polymer aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Dextran, Polyethylenglycol, Polyethylenimin und einer Kombination davon besteht.
  • Der hier verwendete Ausdruck „Nanomaterial“ bezieht sich auf ein nanoskaliges Material. Aufgrund seiner geringen Größe kann das Nanomaterial leicht durch eine Zellmembran gelangen. Das Nanomaterial kann in Blatt- oder Partikelform vorliegen. Das Blatt kann aus einer einzigen Schicht oder aus mehreren Schichten bestehen. Außerdem kann die Blattkonformation eine flache oder gekrümmte Fläche umfassen und kann in verschiedenen Formen vorliegen. In einer Ausführungsform kann das Nanomaterial ein zweidimensionales einschichtiges Nanomaterial des Blatttyps sein. Außerdem kann die Teilchenform verschiedene Formen umfassen, wie eine Kugel, ein Oval, ein Stäbchen und ein Vieleck.
  • Die Teilchengröße des Nanomaterials kann ungefähr 10 bis 500, 10 bis 200, 10 bis 150, 10 bis 100, 10 bis 50, 20 bis 200, 20 bis 150, 20 bis 100, 20 bis 50, 30 bis 200, 30 bis 150, 30 bis 100, 30 bis 50, 50 bis 200, 50 bis 150, 50 bis 100, 50 bis 80, 60 bis 200, 60 bis 100, 60 bis 80, 80 bis 200, 80 bis 150, 80 bis 100, 90 bis 200, 90 bis 150 oder 90 bis 100 nm betragen, aber die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Teilchengröße des Nanomaterials vorzugsweise 50 bis 80, 90 bis 200, 90 bis 150 oder 80 bis 100 nm. Dabei ist die Teilchengröße ein Mittelwert von experimentellen Werten, die mit Hilfe von dynamischer Lichtstreuung gemessen werden, oder von Größen, die in AFM- oder STEM-Bildern zu sehen sind, und bezieht sich auf einen Wert, der unter der Annahme erhalten wird, dass das Nanomaterial kugelförmig oder kreisförmig ist.
  • Das Nanomaterial kann als Kohlenstoff-Nanomaterial oder Mangandioxid hergestellt werden. Dabei kann das Kohlenstoff-Nanomaterial aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus NGO und einem Derivat davon, reduziertem Graphenoxid und einem Derivat davon, GON und einer Kombination davon besteht. In einer Ausführungsform kann es sich bei dem Nanomaterial um NGO, GON oder Mangandioxid handeln.
  • Der hier verwendete Ausdruck „Quencher“ bezieht sich auf ein Material, das Fluoreszenzenergie eines Fluoreszenz emittierenden Materials absorbiert, indem es Licht einer Wellenlänge absorbiert. Ein Quencheffekt tritt aufgrund der Wechselwirkung zwischen einem fluoreszierenden Material und einem Nanomaterial auf. Der Quencheffekt tritt gewöhnlich dann auf, wenn sich das fluoreszierende Material in einem kurzen Abstand, zum Beispiel ungefähr 10 nm oder weniger, von dem Nanomaterial befindet. Dabei dient das fluoreszierende Material als Energiedonor, und das Nanomaterial dient als Energieakzeptor.
  • Der Quencher kann dadurch hergestellt werden, dass man die Oberfläche eines Nanomaterials durch ein wasserlösliches Polymer modifiziert. Dabei können das wasserlösliche Polymer und das Nanomaterial durch eine chemische oder physikalische Bindung miteinander konjugiert sein. Die chemische Bindung kann eine Amidbindung, eines Esterbindung oder eine Etherbindung sein, aber die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt. Außerdem kann die chemische Bindung auch über ein Vernetzungsmittel erreicht werden. In einer Ausführungsform können das wasserlösliche Polymer und das Nanomaterial durch EDC-Kopplung miteinander konjugiert sein. Außerdem kann die physikalische Bindung eine elektrostatische Anziehung, eine Wasserstoffbrückenbindung oder eine van-der-Waals-Bindung sein, aber die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt. Außerdem kann ein solches Nanomaterial, das mit einem wasserlöslichen Polymer oberflächenmodifiziert ist, bezüglich Dispergierbarkeit, Stabilität und Biokompatibilität verbessert sein.
  • Außerdem stellt die vorliegende Erfindung in einem anderen Aspekt eine Zusammensetzung, die den Quencher und eine mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde umfasst, bereit.
  • Der hier verwendete Ausdruck „Sonde“ bezieht sich auf ein Material, das spezifisch an ein Zielmaterial binden kann. Die Sonde kann eine beliebige sein, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Antikörper, einer Nucleinsäure, einem Peptid, einem Protein und einer Kombination davon besteht. Außerdem kann jedes Material verwendet werden, das als Material mit hoher Affinität zu einem Zielmaterial bekannt ist. In einer Ausführungsform kann der Antikörper spezifisch an ein Epitop eines Zielproteins binden, um das Zielmaterial nachzuweisen. Wenn die Nucleinsäure außerdem eine zu der Sequenz einer Nucleinsäure des Zielmaterials komplementäre Sequenz aufweist, kann die Nucleinsäure an eine Zielbasensequenz binden, um das Zielmaterial nachzuweisen. Außerdem kann das Peptid spezifisch an einen Rezeptor oder Liganden binden, der auf einer Zelloberfläche exprimiert wird, um das Zielmaterial nachzuweisen.
  • Die Nucleinsäure kann irgendeine sein, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DNA, RNA, mRNA, miRNA, nichtcodierender RNA, Doppelhelix-RNA, Doppelhelix-DNA, einem DNA-basierten Enzym, einem Desoxyribozym, einem Aptamer, einer Peptidnucleinsäure (PNA), einer verbrückten Nucleinsäure (LNA) und einer Kombination davon besteht.
  • Dabei kann die Nucleinsäure zwar aus 10 bis 50, 10 bis 30, 12 bis 28, 15 bis 25 oder 18 bis 22 Basen bestehen, doch solange die Nucleinsäure komplementär an eine Zielnucleinsäuresequenz binden kann, gibt es keine Grenze für die Anzahl der Basen. In einer Ausführungsform kann die Nucleinsäure aus 15 bis 22 Basen bestehen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Nucleinsäure irgendeine sein, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 1 bis 20 besteht.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung bindet ein fluoreszierendes Material an die Sonde. Das fluoreszierende Material liegt durch Absorption der Fluoreszenzenergie durch ein mit einem wasserlöslichen Polymer konjugierten Nanomaterial in einem abgelöschten Zustand vor, und wenn die Sonde aufgrund der spezifischen Bindung an das Zielmaterial von dem Nanomaterial freigesetzt wird, wird Fluoreszenz emittiert. Das fluoreszierende Material kann an ein Ende oder an die Mitte der Sonde binden. Wenn die Sonde eine Nucleinsäure ist, kann sich das fluoreszierende Material auf der 5'- oder 3'-Position der Nucleinsäure oder in der Nucleinsäure befinden. Wenn die Sonde ein Peptid ist, kann das fluoreszierende Material an den N- oder C-Terminus des Peptids oder in dem Peptid binden. Das fluoreszierende Material kann direkt oder über ein Vernetzungsmittel an die Sonde binden.
  • Das fluoreszierende Material kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Fluorescein, Fluoresceinchlortriazinyl, Rhodamin-Grün, Rhodamin-Rot, Tetramethylrhodamin, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Oregon-Grün, einem Alexa-Fluor-Farbstoff, Carboxyfluorescein (FAM), 6-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein (JOE), Carboxy-X-rhodamin (ROX), 6-Carboxy-2',4,4',5',7,7'-hexachlorfluorescein (HEX), Texas-Rot (Sulforhodamin-101-Säurechlorid), 6-Carboxy-2',4,7',7-tetrachlorfluorescein (TET), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), einem Farbstoff auf Cyaninbasis, einem Thiodicarbocyanin-Farbstoff und einer Kombination davon besteht. Der Farbstoff auf Cyaninbasis kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 und einer Kombination davon besteht.
  • Der Quencher kann ein oder mehrere Targets nachweisen. Um ein oder mehrere Targets nachzuweisen, kann das Nanomaterial zwei oder mehr verschiedene Sonden umfassen. Dabei kann jede Sonde ein anderes fluoreszierendes Material umfassen. Dabei kann jede Sonde ein anderes Zielmaterial binden und dadurch auch ein anderes Zielmaterial nachweisen.
  • Außerdem kann die Zusammensetzung verwendet werden, um Informationen bereitzustellen, die für den Nachweis eines Biomaterials oder die Diagnose einer Erkrankung notwendig sind. Bei der Erkrankung kann es sich um Krebs, eine Infektionskrankheit, eine Entzündungskrankheit oder eine Erbkrankheit handeln, und in einer Ausführungsform handelt es sich bei der Erkrankung vorzugsweise um Krebs oder eine Entzündungskrankheit.
  • Der Krebs kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Brustkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Pankreaskrebs, Magenkrebs, Kolorektalkarzinom, Knochenkrebs, Hautkrebs, Hirntumoren, Sarkomen, Augenkrebs, Knochenmarkskrebs, Blutkrebs und einer Kombination davon besteht. Indessen kann die Infektionskrankheit durch eine Infektion mit irgendeinem verursacht sein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien, Pilzen, Viren, Parasiten und einer Kombination davon besteht. Dabei können die Bakterien Enterobakterien oder Enterokokken sein. Beispiele für die Bakterien sind Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Acinetobacter baumannii. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Bakterien vorzugsweise um Pseudomonas aeruginosa oder Staphylococcus aureus.
  • Beispiele für die Viren sind etwa ein doppelsträngiges DNA-Virus, ein einzelsträngiges DNA-Virus, ein doppelsträngiges RNA-Virus, ein einzelsträngiges Sense-RNA-Virus, ein einzelsträngiges Antisense-RNA-Virus, ein einzelsträngiges RNA-Retrovirus und ein doppelsträngiges DNA-Retrovirus. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Virus aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Cytomegalovirus, Dengue-Virus und einer Kombination davon besteht.
  • In noch einem anderen Aspekt gibt die vorliegende Erfindung ein ein Verfahren zur Bereitstellung von Informationen, die für die Diagnose einer Erkrankung notwendig sind, an, wobei das Verfahren umfasst: Mischen der Zusammensetzung, die den Quencher und die mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde umfasst, mit einer isolierten Probe; Messen einer Fluoreszenzintensität des Gemischs; und Vergleichen der resultierenden Intensität mit einer Fluoreszenzintensität einer normalen Kontrollprobe.
  • Der Quencher und die mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde, die in der Zusammensetzung enthalten sind, sind wie oben beschrieben. Außerdem kann die Probe eine Probe sein, die aus einem Diagnoseziel isoliert und ausgegeben wurde, und es kann sich auch um Zellen, ein Zellkulturmedium, Gewebe, Speichel, Urin, Stuhl, Sperma, Blut, Plasma oder Serum handeln. Außerdem bezieht sich „normale Kontrollprobe“ auf eine Probe, die von einer normalen Person ohne Krankheit isoliert und ausgegeben wurde.
  • Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um ein Biomaterial, wie eine Nucleinsäure oder ein Protein, nachzuweisen oder um eine Krankheit zu diagnostizieren, wie es oben beschrieben ist. Dabei kann die Fluoreszenz dadurch bestimmt werden, dass man Licht misst, das emittiert wird, während es freigesetzt wird, indem man ein von einem Nanomaterial abgelöschtes fluoreszierendes Material spezifisch mit einem Zielmaterial in Kontakt bringt oder es daran bindet. Um die Fluoreszenzintensität zu messen, können Durchflusscytometrie, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder ein Verfahren zum Analysieren eines Fluoreszenzsignals oder eines Bildes verwendet werden.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit bereit, der den Quencher und die mit dem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde umfasst. Der Quencher und die mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde, die in der Zusammensetzung enthalten sind, sind wie oben beschrieben. Der Kit kann verwendet werden, um ein Biomaterial, wie eine Nucleinsäure oder ein Protein, nachzuweisen oder um eine Krankheit zu diagnostizieren, wie es oben beschrieben ist.
  • Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Beispiele vollständig beschrieben. Die folgenden Beispiele sind jedoch lediglich angegeben, um die vorliegende Erfindung exemplarisch darzustellen, und die vorliegende Erfindung wird nicht durch die Beispiele eingeschränkt.
  • I. Herstellung von zweidimensionalem Nanomaterial
  • Beispiel 1. Herstellung von Graphenoxid-Nanokolloid (GON)
  • 4 g K2S2O8 und 4 g P4O10 wurden zu 50 ml H2SO4 gegeben und unter Rühren aufgelöst. Zu der resultierenden Lösung wurden 2 g Graphitnanofaser gegeben, und es wurde 16 Stunden lang auf 90°C erhitzt. Das erhitzte Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, 250 ml destilliertes Wasser wurden hinzugefügt, und anschließend wurde mit einem Papierfilter (Whatman-GE Healthcare, USA) filtriert. Das gereinigte Gemisch wurde zweimal oder öfter mit destilliertem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet.
  • 1,5 g der Graphitnanofaser des trockenen Pulvertyps wurden zu 250 ml H2SO4 gegeben, 10 g KMnO4 wurden langsam hinzugefügt und unter Rühren umgesetzt. Dabei überschritt die Reaktionstemperatur 10°C nicht. Die Reaktionsprodukte wurden für die weitere Reaktion in destilliertem Wasser von 35°C aufgewärmt, während 6 Stunden lang gerührt wurde. Nach der Reaktion wurden 1000 ml destilliertes Wasser hinzugefügt, und dabei wurde die Temperatur auf 55°C oder weniger gehalten. Zu dem Gemisch wurden 50 ml H2O2 gegeben, um eine Reaktion zu ermöglichen, und das resultierende Gemisch wurde 30 min lang mit 10000 U/min zentrifugiert, wodurch ein Sediment erhalten wurde. Das erhaltene Sediment wurde mit Hilfe einer Zentrifuge dreimal oder öfter mit 3,4 Gew.-% HCl und Aceton gewaschen.
  • Das in dem schließlich erhaltenen bräunlichen Überstand enthaltene Aceton wurde im Vakuum entfernt, und destilliertes Wasser wurde zu der restlichen Lösung gegeben, um die Endkonzentration auf 1 mg/ml einzustellen, und dann wurde im Vortexmischer bis zur vollständigen Suspension gemischt. Das aufgefangene Produkt wurde mit Hilfe einer 10000-Da-Dialysemembran gereinigt und neutralisiert, und das Endprodukt wurde lyophilisiert, wobei man GON des Pulvertyps erhielt. Das erhaltene GON wurde mittels AFM beobachtet, und das Ergebnis ist in 2 gezeigt. Wie in 2 gezeigt ist, wurde GON mit einer Größe von 100 nm oder weniger und einer Dicke von 2 nm oder weniger erhalten.
  • Beispiel 2. Herstellung von Mangandioxid (MnO2)
  • Destilliertes Wasser wurde zu einer Lösung von 32 ml Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1,6 ml H2SO4 gegeben, um das Endvolumen auf 300 ml einzustellen. Die resultierende Lösung wurde 15 Minuten lang auf 95°C erhitzt, und dann wurden 3,2 ml einer KMnO4-Lösung schnell hinzugefügt. Danach wurde das Erhitzen noch 60 Minuten lang fortgesetzt, und es wurde ein dunkelbraunes Mangandioxid-Blatt erhalten.
  • Dreifach destilliertes Wasser und ein Alkohol wurden in einem Volumenverhältnis von 1:1 zu dem erhaltenen Mangandioxid-Blatt gegeben, und es wurde mit 12000 U/min zentrifugiert, wodurch ein Sediment erhalten wurde. Außerdem wurde eine Zentrifugation zweimal unter denselben Bedingungen durchgeführt, damit das erhaltene Produkt in dreifach destilliertem Wasser resuspendiert werden konnte, wodurch das Endprodukt erhalten wurde. Das erhaltene MnO2 wurde durch STEM und AFM beobachtet, und das Ergebnis ist in 3 gezeigt. Wie in 3b gezeigt ist, wurde MnO2 mit einer Größe von 200 nm oder weniger und einer Dicke von 2 nm oder weniger erhalten.
  • Beispiel 3. Herstellung von Nano-Graphenoxid (NGO)
  • Zu 23 ml H2SO4 wurden 0,5 g Na2NO3 gegeben und unter Rühren aufgelöst. Zu der resultierenden Lösung wurden 0.5 g Graphitnanofaser gegeben, und dann wurden 3 g KMnO4 unter Rühren langsam hinzugefügt, um eine Reaktion zu ermöglichen. Dabei überschritt die Reaktionstemperatur 10°C nicht. Die Reaktionsprodukte wurden für die weitere Reaktion in destilliertem Wasser von 35°C aufgewärmt, während 1 Stunden lang gerührt wurde, und dann 30 Minuten lang bei 90°C weiter umgesetzt. Nach der Reaktion wurden 1 ml destilliertes Wasser hinzugefügt, und die Temperatur wurde auf 55°C oder weniger gehalten. Zu den Reaktionsprodukten wurden 3 ml H2O2 gegeben, um eine Reaktion zu ermöglichen, es wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und dann wurden 250 ml destilliertes Wasser hinzugefügt. Nachdem die resultierende Lösung mit Hilfe eines Filterpapiers filtriert worden war, wurde ein dadurch erhaltenes Filtrat zweimal oder öfter mit destilliertem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet.
  • Um Graphenoxid (GO) herzustellen, wurden 50 ml 9 M NaOH zu 10 mg/ml einer Graphenoxidlösung gegeben, und anschließend erfolgte 90 Minuten lang eine Ultraschallbehandlung mit der Sondenspitze. Das Graphenoxid wurde mit Hilfe einer 3800-Da-Dialysemembran gereinigt und neutralisiert, und das Endprodukt wurde lyophilisiert, wobei man NGO des Pulvertyps erhielt. Das erhaltene NGO wurde mittels AFM beobachtet, und das Ergebnis ist in 4 gezeigt. Wie in 4 gezeigt ist, wurde NGO mit einer Größe von 200 nm oder weniger und einer Dicke von 1.5 nm oder weniger erhalten.
  • II. Herstellung von mit Polymer oberflächenmodifiziertem zweidimensionalen Nanomaterial
  • Beispiel 4. Herstellung von mit Dextran oberflächenmodifiziertem GON (DReGON)
  • Die Oberfläche des in Beispiel 1 erhaltenen GON wurde mit Dextran modifiziert. Insbesondere In 50 ml destilliertem Wasser wurden 50 mg des GON suspendiert, und eine 0,1-Gew.-%-ige wässrige Dextranlösung wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang mit Ultraschall behandelt, und dann 3 Stunden lang unter Rühren bei 95°C mit 25 µl einer wässrigen Ammoniaklösung umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, durch 30 Minuten Zentrifugation mit 10000 U/min isoliert, und dann lyophilisiert, wodurch das Endprodukt DReGON erhalten wurde.
  • Unter Verwendung des erhaltenen DReGON wurde eine Raman-Analyse durchgeführt. Insbesondere wurde DReGON auf einen Silicium-Wafer gelegt, und dann wurde der Silicium-Wafer in ein Raman-Spektrometer (LabRAM HR UV/vis/NIR) montiert, und dann erfolgte eine Spektralanalyse durch Bestrahlung mit einem 514-nm-CW-Laser.
  • Das Ergebnis der Beobachtung des erhaltenen DReGON durch AFM ist in 5a gezeigt, und das Ergebnis der Raman-Spektralanalyse ist in 5b gezeigt. Wie in 5a gezeigt ist, wurde DReGON mit einer Größe von 100 nm oder weniger und einer Dicke von 7 nm oder weniger erhalten. Indessen wurden, wie in 5b gezeigt ist, ein D- und ein G-Peak bei 1370 cm-1 bzw. 1600 cm-1 beobachtet, und das ID/IG-Verhältnis betrug 0,85.
  • Beispiel 5. Herstellung von mit Polyethylenglycol (PEG) oberflächenmodifiziertem NGO
  • Die Oberfläche des in Beispiel 3 erhaltenen NGO wurde mit PEG modifiziert. Insbesondere wurden 5 mg NGO mit derselben Menge an PEG (10 kDa) gemischt, und dann wurde im Ultraschallbad behandelt. Nach Zugabe von 5 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) wurde die Behandlung des Gemischs im Ultraschallbad noch 5 Minuten fortgesetzt. Nach 6 Stunden Rühren wurde das Gemisch mit Hilfe einer 10000-Da-Dialysemembran gereinigt und neutralisiert, und das Endprodukt wurde lyophilisiert, wodurch NGO des Pulvertyps erhalten wurde, das mit PEG oberflächenmodifiziert war (PEG-NGO).
  • Das erhaltene PEG-NGO wurde durch AFM beobachtet, und das Ergebnis ist in 6a gezeigt. Wie in 6a gezeigt ist, wurde PEG-NGO mit einer Größe von 200 nm oder weniger und einer Dicke von 1 nm oder weniger erhalten.
  • Beispiel 6. Herstellung von mit Polyethylenglycol und Polyethylenimid (PEI) oberflächenmodifiziertem GON
  • Die Oberfläche des in Beispiel 1 erhaltenen GON wurde mit PEG und PEI modifiziert. Insbesondere wurden 20 mg PEG (10 kDa) zu 10 ml einer 2 mg/ml GON-Lösung gegeben, und dann wurde 5 Minuten lang im Ultraschallbad behandelt. Nach Zugabe von 20 mg EDC wurde die Behandlung des Gemischs im Ultraschallbad noch 5 Minuten fortgesetzt. Die Behandlung im Ultraschallbad wurde nach der Zugabe von 10 mg PEI und EDC zu dem Reaktionsprodukt jeweils 5 Minuten lang durchgeführt, und dann wurde 6 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, um gleichmäßige Reaktionen zu ermöglichen. Danach wurde das Gemisch mit Hilfe einer 12000-Da-Dialysemembran gereinigt und neutralisiert, und das Endprodukt wurde lyophilisiert, wodurch GON des Pulvertyps erhalten wurde, das mit PEG und PEI oberflächenmodifiziert war (PEG-PEI-GON).
  • Das erhaltene PEG-PEI-GON wurde durch AFM beobachtet, und das Ergebnis ist in 6b gezeigt. Wie in 6b gezeigt ist, wurde PEG-PEI-GON mit einer Größe von 100 nm oder weniger und einer Dicke von 10 nm oder weniger erhalten.
  • III. Bestätigung der Herstellung einer Zusammensetzung von mit Polymer oberflächenmodifiziertem zweidimensionalen Nanomaterial zum Nachweis eines Zielmaterials
  • Experimentelles Beispiel 1. Bestätigung der Herstellung einer Zusammensetzung von mit Polymer oberflächenmodifiziertem zweidimensionalen Nanomaterial zum Nachweis eines Zielmaterials
  • Experimentelles Beispiel 1-1. Bestätigung der Herstellung einer DReGON-Zusammensetzung zum Nachweis eines Zielmaterials (1)
  • Um zu bestätigen, dass das in Beispiel 4 hergestellte DReGON als Zusammensetzung zum Nachweis eines Zielmaterials verwendet werden kann, wurde ein Experiment wie folgt durchgeführt. Insbesondere wurde eine PeptidNucleinsäure-Sonde (PNA-Sonde) zum Nachweis eines Zielmaterials hergestellt, indem man Panagene (Südkorea) beauftragte, Cy5 am 5'-Ende zu markieren und als Linker zwei Einheiten mitzuverwenden, bei denen zwei Kohlenstoffatome zwischen Cy5 und der Sondensequenz an ein einziges Sauerstoffatom gebunden sind. Zu 20 µl nucleasefreiem Wasser wurde 1 µM der PNA-Sonde gegeben und vollständig aufgelöst, indem ungefähr 3 Minuten lang auf 80°C erhitzt wurde. 20 µl der gelösten PNA-Sonde wurden mit dem in Beispiel 4 hergestellten DReGON gemischt, und es wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Vier, acht, zwölf oder 24 Stunden nach der Reaktion wurde mit Hilfe eines Fluoreszenzlesegeräts bei Ex/Em = 647/670 nm ein Fluoreszenzsignal gemessen. Dabei wurde nur eine PNA-Sonde als Kontrolle verwendet.
  • Als Ergebnis wird, wenn das Fluoreszenzsignal der PNA-Sonde auf 100% gesetzt wird und wenn die PNA-Sonde mit einem zweidimensionalen Nanomaterial, das mit einem Polymer oberflächenmodifiziert ist, umgesetzt wird, das Fluoreszenzsignal auf weniger als 5% reduziert, und daher wurde bestätigt, dass das Material eine Nachweiszusammensetzung bildet.
  • Experimentelles Beispiel 1-2. Bestätigung der Herstellung einer DReGON-Zusammensetzung zum Nachweis eines Zielmaterials (2)
  • Um zu bestätigen, dass das in Beispiel 4 hergestellte DReGON als Zusammensetzung zum Nachweis eines Zielmaterials verwendet werden kann, wurde ein Experiment unter denselben Bedingungen und in derselben Weise wie im Experimentellen Beispiel 1-1 durchgeführt. Dabei wurden die in Tabelle 2 aufgeführten PNA-US5-2 oder PNA-DENV als PNA-Sonde verwendet. 10 pmol der PNA-Sonde wurden mit jeweils 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 oder 1,6 µg DReGON gemischt. Als Ergebnis ist ein Wert des gemessenen Fluoreszenzsignals in 7 gezeigt. Wie in 7 gezeigt ist, hängt die Reduktion des Fluoreszenzsignals von der Konzentration der hinzugefügten PNA-Sonde ab, und daher wurde bestätigt, dass das Material eine Nachweiszusammensetzung bildet.
  • Experimentelles Beispiel 1-3. Bestätigung der Herstellung einer PEG-NGO-Zusammensetzung zum Nachweis eines Zielmaterials
  • Um zu bestätigen, dass das in Beispiel 5 hergestellte PEG-NGO als Zusammensetzung zum Nachweis eines Zielmaterials verwendet werden kann, wurde ein Experiment unter denselben Bedingungen und in derselben Weise wie im Experimentellen Beispiel 1-1 durchgeführt. Dabei wurden 10 pmol einer PNA-Sonde mit jeweils 0, 0,1, 0,2, 0,5 oder 1,0 µg PEG-NGO gemischt. Als PNA-Sonde wurde eine verwendet, bei der ein Cy5-Fluoreszenzfarbstoff an PNA-Sa oder PNA-Pa gebunden ist und die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt ist. Als Ergebnis ist ein Wert des gemessenen Fluoreszenzsignals in 8 gezeigt. Wie in 8 gezeigt ist, hängt die Reduktion des Fluoreszenzsignals von der Konzentration der hinzugefügten PNA-Sonde ab, und daher wurde bestätigt, dass das Material eine Nachweiszusammensetzung bildet.
  • Experimentelles Beispiel 1-4. Bestätigung der Herstellung einer PEG-PEI-GON-Zusammensetzung zum Nachweis eines Zielmaterials
  • Um zu bestätigen, dass das in Beispiel 6 hergestellte PEG-PEI-GON als Zusammensetzung zum Nachweis eines Zielmaterials verwendet werden kann, wurde ein Experiment unter denselben Bedingungen und in derselben Weise wie im Experimentellen Beispiel 1-1 durchgeführt. Dabei wurden 10 pmol einer PNA-Sonde mit jeweils 0, 0,1, 0,2, 0,5 oder 1,0 µg PEG-PEI-NGO gemischt. Als PNA-Sonde wurde eine verwendet, bei der ein FITC-Fluoreszenzfarbstoff an PNA-TS gebunden ist und die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt ist. Als Ergebnis ist ein Wert des gemessenen Fluoreszenzsignals in 9 gezeigt. Wie in 9 gezeigt ist, hängt die Reduktion des Fluoreszenzsignals von der Konzentration der hinzugefügten PNA-Sonde ab, und daher wurde bestätigt, dass das Material eine Nachweiszusammensetzung bildet.
  • Experimentelles Beispiel 2. Bestätigung der Stabilität von DReGON-Teilchen
  • Um die Stabilität der in Beispiel 4 hergestellten DReGON-Teilchen zu bestätigen, wurde ein Experiment wie folgt durchgeführt. Insbesondere wurden 0,1 mg/ml einer DReGON-Lösung in einer serumhaltigen PBS-Lösung gut suspendiert und 0, 4, 8, 12 oder 24 Stunden lang auf Raumtemperatur gehalten, dann erfolgte eine Messung der Extinktion über die Zeit. Als Kontrolle wurde das in Beispiel 1 hergestellte GON verwendet. Als Ergebnis zeigte DReGON (b), wie in 10 gezeigt ist, in einer physiologisch aktiven Umgebung über einen langen Zeitraum hinweg stabilere Absorptionsspektren als GON (a), und diese stabile Dispergierbarkeit wurde 24 Stunden oder länger aufrechterhalten.
  • IV. Bestätigung der Nachweisbarkeit des Zielmaterials durch mit Polymer oberflächenmodifiziertes zweidimensionales Nanomaterial
  • Experimentelles Beispiel 3. Bestätigung der Nachweisbarkeit einer krebszellspezifischen Nucleinsäuresequenz
  • Experimentelles Beispiel 3-1. Bestätigung der Nachweisfähigkeit von DReGON
  • Zur Messung einer Nachweisgrenze des in Beispiel 4 hergestellten DReGON wurde ein Experiment wie folgt durchgeführt. Zuerst wurden PNA21 und DReGON als Sonden miteinander gemischt und unter denselben Bedingungen und in derselben Weise wie im Experimentellen Beispiel 1-1 umgesetzt. Dreißig Minuten nach der Reaktion wurde ein Zielmaterial, das eine krebszellspezifische Sequenz umfasste, d.h. miR-21, so zu dem Reaktionsprodukt gegeben, dass dieses eine Konzentration von 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 oder 1000 nM aufwies, und dann wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Fluoreszenzsignal wurden mit Hilfe eines Fluoreszenzlesegeräts bei Ex/Em = 647/670 nm gemessen. Die Sequenzen der PNA-Sonde und der Zielmaterialien, die in dem Experiment verwendet wurden, sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 aufgeführt. Tabelle 1
    Zielkrankheit Sonde Sequenz (5'→3') SEQ ID Nr.
    Krebs PNA21 TCAACATCAGTCTGATAAGCTA SEQ ID Nr. 1
    PNA31 AGCTATGCCAGCATCTTGCCT SEQ ID Nr. 2
    PNA223 ATTTGACAAACTGAC SEQ ID Nr. 3
    PNA484 GGAGGGGACTGAGCCTG SEQ ID Nr. 4
    Let-7a AACTATACAACCTACTACCTCA SEQ ID Nr. 5
    PNA-TS CTGCCCCAAAATGCCT SEQ ID Nr. 6
    Bakterielle Krank PNA-Pa GCGGCATGGCTGGATC SEQ ID Nr. 7
    PNA-Sa ACAGAGTTTTACGATC SEQ ID Nr. 8
    Viruserkrankung PNA-US5-2 AGACATCGTCACACCTATCATA SEQ ID Nr. 9
    PNA-DENV GCGTTTCAGCATATTGA SEQ ID Nr. 10
    Tabelle 2
    Zielkrankheit Zielmaterial Sequenz (5'→3') SEQ ID Nr.
    Krebs miR-21 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA SEQ ID Nr. 11
    miR-31 AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU SEQ ID Nr. 12
    miR-223 GUCAGUUUGUCAAAU SEQ ID Nr. 13
    miR-484 CAGGCUCAGUCCCCUCC SEQ ID Nr. 14
    Let-7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU SEQ ID Nr. 15
    miR-TS AGGCAUUUUGGGGCAG SEQ ID Nr. 16
    Bakterielle Krank miR-Pa GAUCCAGCCAUGCCGC SEQ ID Nr. 17
    miR-Sa GAUCGUAAAACUCUGU SEQ ID Nr. 18
    Viruserkrankung miR-US5-2 UAUGAUAGGUGUGACGAUGUCU SEQ ID Nr. 19
    miR-DENV UCAAUAUGCUGAAACGC SEQ ID Nr. 20
  • Ergebnisse, die dadurch abgeleitet sind, dass man Veränderungen in der Fluoreszenz vor und nach der Zugabe eines Zielmaterials in die folgende Gleichung 1 einsetzt, sind in 11 gezeigt. Dabei wurde als Kontrolle das in Beispiel 1 hergestellte GON verwendet. Detection Limit = 3.3 ( S D S )
    Figure DE202016009124U1_0001
    *SD: Standardabweichung, S: Steigung der Eichkurve
  • Wie in 11 gezeigt ist, wies GON bis zu 230 pM des Zielmaterials nach, aber DReGON wies bis zu 10 pM des Zielmaterials nach. Anhand des Ergebnisses wurde bestätigt, dass das mit einem Polymer oberflächenmodifizierte zweidimensionale Nanomaterial gemäß der vorliegenden Erfindung auch eine Zielnucleinsäure nachweisen kann, die in einer geringen Konzentration in einer Probe vorhanden ist.
  • Experimentelles Beispiel 3-2. Bestätigung der Nachweisfähigkeit von PEG-NGO
  • Die Fähigkeit von PEG-NGO, eine krebszellenspezifische Nucleinsäuresequenz nachzuweisen, wurde unter denselben Bedingungen und in derselben Weise wie im Experimentellen Beispiel 3-1 bestätigt. Dabei wurden 10 pmol des in Beispiel 5 hergestellten PEG-NGO anstelle von DReGON verwendet, und PNA21 und PNA233 als Sonden und miR-21 und miR-233 als Zielmaterialien wurden in einer Konzentration von 0, 0,002, 0,02, 0,2, 2, 20, 200 oder 2000 nM verwendet. Außerdem wurde, nachdem das Zielmaterial hinzugefügt wurde, eine Reaktion 4 Stunden lang durchgeführt, die Fluoreszenzveränderung wurde in Abständen von 20 Minuten gemessen, und das Ergebnis ist in 12 gezeigt. Wie in 12 gezeigt ist, wurde das Fluoreszenzsignal mit zunehmender Konzentration des Zielmaterials stärker, und die Fluoreszenz kehrte je nach der Konzentration und Art der Sonde auf unterschiedliche Niveaus zurück.
  • Experimentelles Beispiel 3-3. Bestätigung der Nachweisfähigkeit von PEG-PEI-GON
  • Die Fähigkeit von PEG-PEI-NGO, eine krebszellenspezifische Nucleinsäuresequenz nachzuweisen, wurde unter denselben Bedingungen und in derselben Weise wie im Experimentellen Beispiel 3-1 bestätigt. Dabei wurden 10 pmol des in Beispiel 6 hergestellten PEG-PEI-NGO anstelle von DReGON verwendet, und PNA-TS als Sonde und miR-TS als Zielmaterial wurden in Konzentrationen von 100, 200, 300 oder 500 nM verwendet. Außerdem wurde, nachdem das Zielmaterial hinzugefügt wurde, eine Reaktion 4 Stunden lang durchgeführt, die Fluoreszenzveränderung wurde in Abständen von 20 Minuten gemessen, und das Ergebnis ist in 13 gezeigt. Wie in 13 gezeigt ist, wurde das Fluoreszenzsignal mit zunehmender Konzentration des Zielmaterials stärker, und die Fluoreszenz kehrte je nach der Konzentration und Art der Sonde auf ein unterschiedliches Niveau zurück.
  • Experimentelles Beispiel 3-4. Bestätigung der Nachweisfähigkeit von DReGON in Krebszelllinien
  • Die Fähigkeit von DReGON, eine krebszellspezifische Nucleinsäuresequenz nachzuweisen, wurde mit Hilfe verschiedener Arten von Krebszelllinien bestätigt. Zuerst wurden MCF-7-, HeLa- und SW620-Zelllinien hergestellt, indem diese in einem DMEM- oder RPMI-Medium kultiviert wurden. PNA484 oder PNA31 als Sonde wurde jedoch unter denselben Bedingungen und in derselben Weise wie im Experimentellen Beispiel 1-1 mit DReGON gemischt, um eine Reaktion zu ermöglichen. Die präparierten Zellen wurden so in einer 12-Well-Platte ausgesät, dass sie eine Dichte von 1 x 105 Zellen pro Well aufwiesen, und nach 24 Stunden wurde ein Reaktionsprodukt von DReGON und PNA484 oder PNA31 in einer Konzentration von 80 pmol zu den Zellen gegeben.
  • Nach 14 Stunden sind Bilder von Fluoreszenzsignalen von Zellen, die mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops beobachtet wurden, in 15 gezeigt. Dabei sind Bilder, die ohne Zugabe einer Sonde zu den Zellen aufgenommen wurden, als Kontrolle in 14 gezeigt. Wie in 15 gezeigt ist, wurde der Nachweis des Zielmaterials durch DReGON durch ein Fluoreszenzsignal einer mit fluoreszierendem Material konjugierten Sonde identifiziert.
  • Experimentelles Beispiel 3-5. Bestätigung der Nachweisfähigkeit von DReGON in Blutzellen
  • Um die Nachweisfähigkeit von DReGON für eine spezifische Basensequenz, die in Blutzellen vorhanden ist, zu bestätigen, wurde ein Experiment wie folgt durchgeführt. Insbesondere wurden Blutzellen nach einem bekannten Verfahren aus 10 ml gesundem humanen Blut entnommen und in einem RPMI-Medium kultiviert. Die kultivierten Zellen wurden fixiert, und 200 nM einer PNA-Sonde, an die 3,0 µg DReGON und ein Cy5-Fluoreszenzfarbstoff gebunden waren, wurden hinzugefügt. Dabei wurde als PNA-Sonde PNA21, PNA223, Let-7a oder ein Gemisch davon (verrührt) verwendet. Als Kontrolle wurde eine unbehandelte Zellgruppe verwendet.
  • Die mittels Durchflusscytometrie nachgewiesene Intensität der in den Blutzellen wiederhergestellten Fluoreszenz nach 4 Stunden ist in 16 gezeigt. Wie in 16 gezeigt ist, wurde bestätigt, dass eine in den Blutzellen exprimierte Zielbasensequenz durch die PNA-Sonde nachgewiesen wird.
  • Experimentelles Beispiel 4. Bestätigung der Fähigkeit von PEG-NGO, eine bakterienspezifische Nucleinsäuresequenz nachzuweisen
  • Die Fähigkeit von PEG-NGO, eine für Pseudomonas aeruginosa oder Staphylococcus aureus spezifische Nucleinsäuresequenz nachzuweisen, wurde unter denselben Bedingungen und in derselben Weise wie im Experimentellen Beispiel 3-1 bestätigt. Dabei wurden 0,2 µg des in Beispiel 5 hergestellten PEG-NGO anstelle von DReGON und 10 pmol PNA-Pa oder PNA-Sa hinzugefügt, und dann wurden 0, 10, 20, 40, 70 oder 100 nM Pseudomonas-aeruginosa- oder Staphylococcus-aureus-AS-DNA als Zielmaterial hinzugefügt. Als Ergebnis ist die gemessene Fluoreszenzveränderung in 17 gezeigt. Wie in 17 gezeigt ist, wurde die Intensität der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Konzentration der hinzugefügten Pseudomonas-aeruginosa- oder Staphylococcus-aureus-AS-DNA erhöht.
  • Experimentelles Beispiel 5. Bestätigung der Fähigkeit von DReGON, eine virusspezifische Nucleinsäuresequenz nachzuweisen
  • Die Fähigkeit von DReGON, eine für humanes Cytomegalovirus (HCMV) oder Dengue-Virus (DENV) spezifische Nucleinsäuresequenz nachzuweisen, wurde unter denselben Bedingungen und in derselben Weise wie im Experimentellen Beispiel 3-1 bestätigt. Dabei wurden 0,5 µg DReGON und 20 pmol PNA-US5-2 oder PNA-DENV hinzugefügt, und 20 pmol miR-US5-2 oder miR-DENV wurden als Zielmaterial hinzugefügt. Als Ergebnis sind die über die Reaktionszeit gemessenen Fluoreszenzveränderungen in 18 gezeigt. Wie in 18 gezeigt ist, wurde die Intensität der Fluoreszenz für eine hinzugefügte HCMV- oder DENV-spezifische Nucleinsäuresequenz in Abhängigkeit von der Reaktionszeit erhöht.
  • Folglich kann anhand der Ergebnisse nachgewiesen werden, dass die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung im Unterschied zu einem Mikroarray oder RT-PCR leicht eine Zielsequenz nachweisen kann und verwendet werden kann, um die Konzentration der Zielsequenz indirekt zu bestätigen.
  • Sequenzprotokoll freier Text
    • SEQ ID Nr. 1: tcaacatcag tctgataagc ta
    • SEQ ID Nr. 2: agctatgcca gcatcttgcc t
    • SEQ ID Nr. 3: atttgacaaa ctgac
    • SEQ ID Nr. 4: ggaggggact gagcctg
    • SEQ ID Nr. 5: aactatacaa cctactacct ca
    • SEQ ID Nr. 6: ctgccccaaa atgcct
    • SEQ ID Nr. 7: gcggcatggc tggatc
    • SEQ ID Nr. 8: acagagtttt acgatc
    • SEQ ID Nr. 9: agacatcgtc acacctatca ta
    • SEQ ID Nr. 10: gcgtttcagc atattga
    • SEQ ID Nr. 11: uagcuuauca gacugauguu ga
    • SEQ ID Nr. 12: aggcaagaug cuggcauagc u
    • SEQ ID Nr. 13: gucaguuugu caaau
    • SEQ ID Nr. 14: caggcucagu ccccucc
    • SEQ ID Nr. 15: ugagguagua gguuguauag uu
    • SEQ ID Nr. 16: aggcauuuug gggcag
    • SEQ ID Nr. 17: gauccagcca ugccgc
    • SEQ ID Nr. 18: gaucguaaaa cucugu
    • SEQ ID Nr. 19: uaugauaggu gugacgaugu cu
    • SEQ ID Nr. 20: ucaauaugcu gaaacgc
  • Sequenzprotokoll
    • <110> Lemonex Inc.
    • <120> Quencher, der mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial enthält, und seine Verwendung
    • <130> 221022DE
    • <140> PCT/ KR2016/006355
    • <141> 2016-06-15
    • <150> 10-2015-0139174
    • <151> 2015-10-02
    • <160> 20
    • <170> KoPatentIn 3.0
    • <210> 1
    • <211> 22
    • <212> DNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> PNA21
    • <400> 1
      Figure DE202016009124U1_0002
    • <210> 2
    • <211> 21
    • <212> DNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> PNA31
    • <400> 2
      Figure DE202016009124U1_0003
    • <210> 3
    • <211> 15
    • <212> DNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> PNA223
    • <400> 3
      Figure DE202016009124U1_0004
    • <210> 4
    • <211> 17
    • <212> DNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> PNA484
    • <400> 4
      Figure DE202016009124U1_0005
    • <210> 5
    • <211> 22
    • <212> DNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> Let-7a
    • <400> 5
      Figure DE202016009124U1_0006
    • <210> 6
    • <211> 16
    • <212> DNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> PNA-TS
    • <400> 6
      Figure DE202016009124U1_0007
    • <210> 7
    • <211> 16
    • <212> DNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> PNA-Pa
    • <400> 7
      Figure DE202016009124U1_0008
    • <210> 8
    • <211> 16
    • <212> DNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> PNA-Sa
    • <400> 8
      Figure DE202016009124U1_0009
    • <210> 9
    • <211> 22
    • <212> DNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> PNA-US5-2
    • <400> 9
      Figure DE202016009124U1_0010
    • <210> 10
    • <211> 17
    • <212> DNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> PNA-DENV
    • <400> 10
      Figure DE202016009124U1_0011
    • <210> 11
    • <211> 22
    • <212> RNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> miR-21
    • <400> 11
      Figure DE202016009124U1_0012
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    • <211> 21
    • <212> RNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> miR-31
    • <400> 12
      Figure DE202016009124U1_0013
    • <210> 13
    • <211> 15
    • <212> RNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
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    • <400> 13
      Figure DE202016009124U1_0014
    • <210> 14
    • <211> 17
    • <212> RNA
    • <213> Künstliche Sequenz
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    • <223> miR-484
    • <400> 14
      Figure DE202016009124U1_0015
    • <210> 15
    • <211> 22
    • <212> RNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> Let-7a
    • <400> 15
      Figure DE202016009124U1_0016
    • <210> 16
    • <211> 16
    • <212> RNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> miR-TS
    • <400> 16
      Figure DE202016009124U1_0017
    • <210> 17
    • <211> 16
    • <212> RNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> miR-Pa
    • <400> 17
      Figure DE202016009124U1_0018
    • <210> 18
    • <211> 16
    • <212> RNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> miR-Sa
    • <400> 18
      Figure DE202016009124U1_0019
    • <210> 19
    • <211> 22
    • <212> RNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> miR-US5-2
    • <400> 19
      Figure DE202016009124U1_0020
    • <210> 20
    • <211> 17
    • <212> RNA
    • <213> Künstliche Sequenz
    • <220>
    • <223> miR-DENV
    • <400> 20
      Figure DE202016009124U1_0021
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • KR 101554173 [0004]
    • KR 2016/006355 [0067]

Claims (20)

  1. Zusammensetzung, umfassend einen Quencher, der ein mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial und eine mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde umfasst; wobei das wasserlösliche Polymer aus der Gruppe ausgewählt sein kann, die aus Chitosan, einem Chitosansalz, Dextran, Hyaluronsäure, einem Hyaluronat, Pektin, einem Pektinsalz, einem Alginat, Alginsäure, Agar, einem Galactomannan, einem Galactomannansalz, Xanthan, einem Xanthansalz, β-Cyclodextrin, einem β-Cyclodextrinat, Polyethylenglycol (PEG), Polyethylenimin (PEI) und einer Kombination davon besteht; und wobei das Nanomaterial ein aus Graphit-Nanofaser hergestelltes Graphenoxid-Nanokolloid (GON) ist; und wobei das mit dem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Nanomaterial an die mit einem fluoreszierenden Material konjugierte Sonde gebunden ist.
  2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Nanomaterial eine Teilchengröße von 0,01 bis 1 µm aufweist.
  3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Konjugation des mit dem wasserlöslichen Polymer konjugierten Nanomaterials durch eine chemische oder physikalische Bindung erreicht wird.
  4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei der chemischen Bindung um EDC-Kopplung handelt.
  5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei die physikalische Bindung eine Wasserstoffbrückenbindung ist.
  6. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Sonde aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Antikörper, einer Nucleinsäure, einem Peptid, einem Protein und einer Kombination davon besteht.
  7. Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei die Nucleinsäure aus 10 bis 50 Basen besteht.
  8. Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei die Nucleinsäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DNA, RNA, mRNA, miRNA, nichtcodierender RNA, Doppelhelix-RNA, Doppelhelix-DNA, einem DNA-basierten Enzym, einem Desoxyribozym, einem Aptamer, einer Peptidnucleinsäure (PNA), einer verbrückten Nucleinsäure (LNA) und einer Kombination davon besteht.
  9. Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei die Nucleinsäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 1 bis 10 besteht.
  10. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das fluoreszierende Material aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fluorescein, Fluoresceinchlortriazinyl, Rhodamin-Grün, Rhodamin-Rot, Tetramethylrhodamin, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Oregon-Grün, einem Alexa-Fluor-Farbstoff, Carboxyfluorescein (FAM), 6-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein (JOE), Carboxy-X-rhodamin (ROX), 6-Carboxy-2',4,4',5',7,7'-hexachlorfluorescein (HEX), Texas-Rot (Sulforhodamin-101-Säurechlorid), 6-Carboxy-2',4,7',7-tetrachlorfluorescein (TET), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA), einem Farbstoff auf Cyaninbasis, einem Thiodicarbocyanin-Farbstoff und einer Kombination davon besteht.
  11. Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, wobei der Farbstoff auf Cyaninbasis aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 und einer Kombination davon besteht.
  12. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung für den Nachweis eines Biomaterials oder die Diagnose einer Krankheit vorgesehen ist.
  13. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei der Erkrankung um Krebs, eine Infektionskrankheit, eine Entzündungskrankheit oder eine Erbkrankheit handelt.
  14. Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, wobei die Infektionskrankheit durch eine Infektion mit irgendeinem verursacht ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien, Pilzen, Viren, Parasiten und einer Kombination davon besteht.
  15. Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, wobei die Bakterien aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii und einer Kombination davon besteht.
  16. Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, wobei die Viren aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem doppelsträngigen DNA-Virus, einem einzelsträngigen DNA-Virus, einem doppelsträngigen RNA-Virus, einem einzelsträngigen Sense-RNA-Virus, einem einzelsträngigen Antisense-RNA-Virus, einem einzelsträngigen RNA-Retrovirus, einem doppelsträngigen DNA-Retrovirus und einer Kombination davon besteht.
  17. Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, wobei das Virus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus humanem Cytomegalievirus, Dengue-Virus und einer Kombination davon besteht.
  18. Verwendung von Informationen, die für die Diagnose einer Erkrankung notwendig sind, umfassend: 1) Mischen der Zusammensetzung gemäß Anspruch 10 mit einer isolierten Probe; 2) Messen einer Fluoreszenzintensität des Gemischs; und 3) Vergleichen der resultierenden Intensität mit einer Fluoreszenzintensität einer normalen Kontrollprobe.
  19. Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei es sich bei der Erkrankung um Krebs, eine Infektionskrankheit, eine Entzündungskrankheit oder eine Erbkrankheit handelt.
  20. Kit, umfassend die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1.
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