KR102119010B1 - 펩티드 핵산 및 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀을 포함하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펩티드 핵산 및 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀 입자를 포함하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물, 이를 이용한 표적 유전자의 발현 억제 방법 및 이를 이용한 펩티드 핵산의 생체내 전달 방법을 제공한다.
본 발명의 펩티드 핵산 및 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀 입자를 포함하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물은 표적 유전자 전달 분야에서 이를 이용한 표적 유전자의 발현 억제 방법 및 이를 이용한 펩티드 핵산의 생체내 전달 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

펩티드 핵산 및 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀을 포함하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물{Composition for downregulating expression of target gene comprising peptide nucleic acid and polyethylene glycol-engrafted graphene oxide}
본 발명은 표적 유전자 발현 억제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 펩티드 핵산 및 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀을 포함하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물에 관한 것이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 파킨슨 병 및 암과 같은 유전 질환의 치료를 위해 핵산 전달 시스템을 통해 세포에 전달되는 유전자 치료 수단이다. 유전자 치료를 위하여는 세포 내로 핵산을 간단하고 안전하며 향상된 효율로 형질주입하는 것이 필수적이다. 리포좀, 양전하를 띤 화학 물질 및 나노 물질을 포함하는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 전달하는 경우에는 여러 가지 문제가 발생한다.
지난 몇 년 동안, 그래핀과 그 산화 유도체인 산화 그래핀(graphene oxide, GO)은 금속 이온 검출, 세포 이미징, 약물 전달, 및 단백질 효소 고정화를 포함한 생명 공학, 생물 의학 및 전자 공학 분야의 실용적인 응용 분야에서의 사용에 있어서 거대한 잠재력을 보여 주었다. GO는 GO 표면 근처에서 형광 소광(fluorescence quenching)과 함께 단일가닥 핵산과 선별적으로 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이에 따라 유전자 전달의 유망한 전달체로 인정받고 있다. 그러나 GO는 세포 배양 배지에서 낮은 용해도를 보이며 세포에 상당한 세포독성을 나타낸다. GO는 세포에 도입되었을 때 세포사멸성 카스파제-3(apoptotic caspase-3)를 활성화시키고 괴사를 유도함으로써 세포 생존율을 감소시킨다. 또한, GO 전달은 몇몇 세포주에서 활성 산소종(reactive oxygen species)의 생성을 통한 자가소화작용을 유도한다. 따라서, 생체 적합성을 향상시키기 위해 GO 표면을 적절히 기능화시키지 않으면 GO는 인간 세포에 유해한 문제를 야기한다.
나노 물질의 표면 개질을 위한 생체 적합성 코팅으로 자주 사용되는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)은 이전에 GO 표면에 접합되어 불용성 분자의 용해도와 안정성을 향상시켰다. PEG-개질된 GO는 단백질 또는 약물 전달 시스템에서 용해도를 향상시킬 뿐만 아니라 세포독성을 감소시키는 데에도 사용되었다. PEG-개질된 GO는 또한 siRNA 및 플라스미드 DNA와 같은 치료 유전자의 운반 수단으로 사용되어 왔다. 음전하를 띤 유전자에 대한 PEG-개질된 GO의 로딩 용량(loading capacity)을 향상시키기 위해, 1-피렌메틸아민 염산염(1-pyrenemethylamine hydrochloride, Py-NH2) 또는 폴리에틸렌 이민(polyethylenimine, PEI) 등의 양전하를 띤 분자로 PEG-개질된 GO를 추가로 기능화시킨 연구도 보고된 바 있다(Yang, X. Y., et al., J. Mater. Chem. 2012, 22, 6649-6654; Feng, L., et al., Small 2013, 9, 1989-1997). 그러나, 이러한 양전하를 띤 분자는 GO 표면에 접합되었을 때 세포 내에서 독성 조건을 생성하여 유전자 전달 과정에서 세포 사멸을 유도한다는 문제점이 있다.
대한민국 특허공재 제10-2017-0040080호(2017.04.12.)
DONG HaiQing, et al., SCIENCE CHINA Chemistry, November(2010) Vol.53 No.11: 2265-2271. Zhuang Liu, et al., J Am Chem Soc. 2008 August 20; 130(33): 10876-10877.
본 발명자들은 세포 독성을 나타내지 않고 생체적합성을 갖는 유전자 전달체에 대하여 연구하던 중, 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)을 유전자 전달용 올리고뉴클레오티드로 사용하고, 유전자 전달을 위한 PNA의 생체 적합성 전달체로서 PEG화된 산화 그래핀(PEGylated graphene oxide, PEG-GO)을 사용하는 경우에 형광 PNA가 PEG화된 나노 크기의 GO(PEG-nGO) 구조체 상에 효율적으로 흡착되었고, 상보적인 RNA를 사용하여 PEG-nGO로부터 용이하게 해리되었지만, 비-상보적인 RNA에서는 그렇지 않음을 관찰하여, 세포 생존에 영향을 미치지 않고 해로운 자가소화작용을 유도하지 않으면서 PEG-nGO 구조체에 흡착된 형광-표지된 PNA가 세포 내로 효율적으로 전달될 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 펩티드 핵산 및 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀 입자를 포함하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물, 이를 이용한 표적 유전자의 발현 억제 방법 및 이를 이용한 펩티드 핵산의 생체내 전달 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따라, 펩티드 핵산 및 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀 입자를 포함하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 펩티드 핵산은 단일가닥일 수 있으며, 표적 유전자의 RNA에 대한 안티센스 펩티드 핵산일 수 있다. 또한, 상기 표적 유전자는 파킨슨 병 유전자, 표피 성장 인자 수용체 유전자 및 암 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 6-암(6-arm) 폴리에틸렌 글리콜일 수 있으며, 평균분자량 1 - 100 kDa일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀 입자는 평균 두께 0.01 - 100 nm일 수 있으며, 크기 0 nm 초과 200 nm 미만일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 표적 유전자 발현 억제용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 표적 유전자의 발현 억제 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 표적 유전자 발현 억제용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 펩티드 핵산의 생체내 전달 방법이 제공된다.
본 발명에 의해, 펩티드 핵산 및 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀 입자를 포함하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물에 있어서, PEG-nGO 구조체에 흡착된 형광-표지된 PNA가 세포 생존에 영향을 미치지 않고 해로운 자가소화작용을 유도하지 않으면서 세포 내로 효율적으로 전달될 수 있으며, PEG-nGO를 이용한 안티센스 PNA의 유전자 전달이 효과적으로 암 세포에서 표적 유전자의 넉다운(knockdown)을 유도하여, PEG-nGO 구조체가 세포독성을 나타내지 않고 유전자 조작을 위한 안티센스 PNA의 적절한 운반체임이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 펩티드 핵산 및 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀 입자를 포함하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물은 표적 유전자 전달 분야에서 이를 이용한 표적 유전자의 발현 억제 방법 및 이를 이용한 펩티드 핵산의 생체내 전달 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 PEG-nGO의 특성으로서, (a) PEG화된 나노 크기 산화 그래핀(PEG-nGO)의 구조(상부). 나노 크기의 산화 그래핀(nGO) 및 PEG-nGO의 AFM 이미지(하부). (b) nGO 및 PEG-nGO의 TEM 이미지(스케일 바 = 100 nm). (c) nGO 및 PEG-nGO의 제타 전위. (d) 상이한 수용액(물, PBS 및 세포 배양 배지) 중의 nGO, HOOC-nGO 및 PEG-nGO의 용해도. 이미지는 10,000 g에서 5분 동안 원심분리한 후 용액에서 nGO, HOOC-nGO 및 PEG-nGO(각각 100 μg·mL-1)의 침전을 나타낸다.
도 2는 PEG-nGO의 세포내 도입 및 시험관내 세포독성을 나타낸 것이다. (a) PEG-nGO + FAM 혼합물 또는 FAM-표지 PEG-nGO와 함께 24시간 동안 인큐베이션한 후 폐암 세포(A549)의 형광 현미경 이미지(상부 이미지). z 축을 따라 공초점 깊이를 변경하여 얻은 FAM-표지 PEG-nGO로 처리한 A549 세포의 형광 현미경 이미지(하부 이미지); 스케일 바 = 10 ㎛. (b) A549 세포에서 nGO 및 PEG-nGO의 세포독성으로서, 24시간 동안 nGO 또는 PEG-nGO(10 또는 100 μg·mL- 1)와 함께 인큐베이션한 후 WST-1 분석을 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. (c) nGO 및 PEG-nGO(10 또는 100 μg·mL- 1)로 24시간 동안 처리된 A549 세포에서의 자가소화작용 마커 단백질(LC3 I에서 II로의 전환)의 웨스턴 블롯 분석. (d) nGO 또는 PEG-nGO(100 μg·mL-1)와 24시간 동안 인큐베이션된 A549 세포의 TEM 이미지. LPS(1 μg·mL-1)로 처리한 세포를 자가소화포 형성에 대한 대조군으로 영상화하였다. 적색 화살표는 확대된 TEM 이미지에서 자가소화포를 표시한다(사각형으로 나타냄, 스케일 바 = 2 μm).
도 3은 PEG-nGO에 대한 다양한 유형의 올리고뉴클레오티드의 결합 (a) PEG-nGO와 올리고뉴클레오티드(ssDNA, ssRNA, siRNA 또는 ssPNA) 사이 상호작용의 비-변성 PAGE 분석(10 %). (b) 다양한 PEG-nGO 농도(0-100 μg·mL- 1)의 형광-표지된 ssPNA, ssDNA 또는 siRNA의 형광 소광 분석.
도 4는 PEG-nGO로부터 PNA의 흡착 및 해리. (a) 실시예에서 사용된 PNA 올리고뉴클레오티드의 서열 및 PNA의 구조(B: 염기). (b) PEG-nGO 상 PNA 흡착에 대응하는 FITC-표지된 PNA의 형광 소광을 나타내는 개략도(박스 내). FITC로 표지된 PNA(1 μM)를 nGO 또는 PEG-nGO의 농도를 변화시켜(0 - 100 μg·mL-1) 10분간 인큐베이션하였다. nGO 또는 PEG-nGO에 흡착된 PNA의 형광 세기는 GO 입자의 농도가 증가함에 따라 소광되었다. (c) 상보적 RNA의 첨가에 따른 PEG-nGO로부터의 PNA 해리에 상응하는 FITC-표지된 PNA의 형광 강도의 증가를 나타내는 개략도(박스 내). PEG-nGO(20 μg·mL- 1)에 FITC-표지된 PNA(1 μM)를 전-흡착시키고, PNA/PEG-nGO 복합체를 포함하는 용액에 단일가닥의 RNA(PNA 서열에 상보적 또는 비-상보적)를 첨가하였다. (d) FITC-표지된 PNA는 상보적 또는 비-상보적 RNA를 추가함으로써 PEG-nGO로부터 해리되었다. PNA 해리는 비-변성 PAGE(10 %)를 사용하여 검출하였다. 형광 PNA는 UV 투시법으로 검출하였다.
도 5는 PEG-nGO로부터의 PNA의 해리. (a) PNA 서열에 대한 상보적 RNA의 첨가에 의한 PEG-nGO와 nGO의 PNA 해리 용량의 비교. FITC-표지된 PNA(1 μM)를 nGO 또는 PEG-nGO(20 μg·mL- 1)에 전-흡착시키고 PNA/nGO 또는 PNA/PEG-nGO 복합체를 함유하는 용액에 상보적인 RNA를 농도를 증가시키면서 첨가하였다. FITC 형광을 플레이트 판독기에서 모니터링하였다. (b) PEG-nGO로부터의 pH 의존성 PNA 해리. PEG-nGO(20 μg·mL- 1)에 FITC-표지된 PNA(1 μM)를 전-흡착시키고, 생성된 용액의 분액을 다양한 pH 조건(pH 5.0 내지 7.5)의 배양 배지를 함유하는 웰에 첨가하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에서의 FITC 형광을 플레이트 판독기로 모니터링하였다.
도 6은 PEG-nGO를 사용한 PNA의 세포내 도입. (a) 전달 비히클 없이 또는 GO 물질(nGO 또는 PEG-nGO)과 함께 TAMRA-표지된 PNA와 함께 인큐베이션된 A549 세포의 형광 현미경 이미지. 25 ℃에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 TAMRA-표지된 PNA(1μM)를 nGO 또는 PEG-nGO 표면(각각 20 μg·mL- 1)에 전-흡착시켰다. 자유 PNA, PNA/nGO 또는 PNA/PEG-nGO 복합체를 A549 세포에 투여하고 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. A549 세포의 형광 현미경 이미지(상단 이미지)를 찍었고 이미지는 z 축을 따라 공초점 깊이를 변경하여 PNA/PEG-nGO 복합체로 처리한 A549 세포를 나타낸다(하단 이미지); 스케일 바 = 30 ㎛. (b) PNA 전달 후 A549 세포에서 FITC-표지된 PNA(FITC-PNA), FAM-표지된 PEG-nGO(FAM-PEG-nGO) 및 FITC-표지된 PNA/PEG-nGO 복합체(FITC-PNA/PEG-nGO)의 세포 내 분포를 보여주는 형광 현미경 이미지. 세포를 4.5시간 동안 FITC-PNA, FAM-PEG-nGO 또는 FITC-PNA/PEG-nGO 복합체와 함께 인큐베이션하고 엔도좀/리소좀과 핵을 각각 LysoTracker Red와 Topro-3로 염색 하였다(스케일 바 = 5 μm).
도 7은 다양한 시점에서의 PNA, PEG-nGO 또는 PNA/PEG-nGO 복합체의 세포내 도입. (a) FITC-PNA, (b) FAM-PEG-nGO 또는 (c) FITC-PNA/PEG-nGO 복합체와 함께 다양한 인큐베이션 시간(0.5 ~ 4.5시간) 동안 인큐베이션한 후 A549 세포에서 FITC-PNA 및 FAM-PEG-nGO의 세포 내 분포를 보여주는 형광 현미경 이미지를 얻었다. 엔도좀/리소좀과 핵은 각각 LysoTracker Red와 Topro-3로 염색하였다(스케일 바 = 5 μm).
도 8은 세포로 안티센스 PNA의 PEG-nGO-매개 전달을 통한 표적 유전자 넉다운. (a) 스크램블드(scrambled) PNA/PEG-nGO 또는 항-eGFP PNA/PEG-nGO 복합체로 처리한 후, eGFP-발현 A549 세포의 형광 현미경 이미지. (b) EGFR 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석. (c) 스크램블드 PNA/PEG-nGO 또는 항-EGFR PNA/PEG-nGO 복합체 처리 후의 A549 세포에서의 카스파제 3/7 세포 사멸 활성. (b)의 막대 그래프는 내부 대조군인 GAPDH에 대해 보정된 EGFR 발현 수준을 나타낸다. 데이터는 평균±표준편차(n = 3)로 나타내었다(* P <0.01 대조군 대비).
도 9는 세포 내로 안티센스 PNA의 PEG-nGO-매개 전달을 통한 표적 유전자 넉다운을 나타내는 개략도로서, a) PNA/PEG-nGO 복합체의 세포내 도입, b) PEG-nGO 표면으로부터 방출된 PNA의 엔도좀 탈출, c) 표적 mRNA에 안티센스 PNA를 결합시켜 표적 유전자의 넉다운을 일으키는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 측면에 따라, 펩티드 핵산 및 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀 입자를 포함하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물이 제공된다.
본 발명에서 사용되는 '펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)'은 포스포디에스테르 결합(phosphodiester bond) 대신 펩티드 결합(peptide bond)을 갖는 DNA 모사체(mimic)로서, DNA-DNA 또는 DNA-RNA 복합체보다 DNA 또는 RNA와 상당히 더 안정한 복합체를 형성한다. 본 발명에서는 펩티드 핵산을 유전자 전달용 올리고뉴클레오티드로 사용하며, 상보적인 mRNA와 안정한 복합체를 형성함으로써 전사를 억제하는 치료용 안티센스 올리고뉴클레오티드로 사용한다. PNA가 상보적인 mRNA와 안정한 복합체를 형성할 수 있지만, 세포로의 전달이 어려워 치료용 올리고뉴클레오티드로서의 유효성이 낮은 상태이나, 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하였다.
본 발명에서는 유전자 전달을 위한 PNA의 생체 적합성 전달체로서 PEG화된 산화 그래핀(PEGylated graphene oxide, PEG-GO)을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 펩티드 핵산은 단일가닥일 수 있으며, 표적 유전자의 RNA에 대한 안티센스 펩티드 핵산일 수 있으며, 예를 들어, mRNA에 대한 안티센스 펩티드 핵산일 수 있다. 또한, 상기 표적 유전자는 그 염기 서열을 확인할 수 있는 질병 유발 유전자라면 어떠한 유전자라도 가능하며, 예를 들어, 파킨슨 병 유전자, 표피 성장 인자 수용체 유전자 및 암 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 6-암(6-arm) 폴리에틸렌 글리콜일 수 있으며, 평균분자량 1 - 100 kDa, 바람직하게는 1 - 100 kDa, 더욱 바람직하게는 10 - 50 kDa, 가장 바람직하게는 15 kDa이다. 상기 폴리에틸렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 아민 형태로 산화 그래핀에 접합된 구조일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀 입자는 평균 두께 0.01 - 100 nm, 바람직하게는 0.1 - 50 nm, 더욱 바람직하게는 1 - 10 nm, 가장 바람직하게는 4.5 - 5.2 nm이다.
일 구현예에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀 입자는 크기 0 nm 초과 200 nm 미만일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 표적 유전자 발현 억제용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 표적 유전자의 발현 억제 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 표적 유전자 발현 억제용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 펩티드 핵산의 생체내 전달 방법이 제공된다.
본 발명에서, 형광 PNA는 PEG화된 나노 크기의 GO(PEG-nGO) 구조체 상에 효율적으로 흡착되는 것으로 관찰되었고, 상보적인 RNA를 사용하여 PEG-nGO로부터 용이하게 해리되었지만, 비-상보적인 RNA에서는 그렇지 않았다. PEG-nGO 구조체에 흡착된 형광-표지된 PNA는 세포 생존에 영향을 미치지 않고 해로운 자가소화작용을 유도하지 않고 세포 내로 효율적으로 전달되었다. 또한, PEG-nGO 구조체는 아니지만 PNA는 엔도좀을 벗어나는 것으로 관찰되었다. PEG-nGO를 이용한 안티센스 PNA의 유전자 전달은 효과적으로 암 세포에서 표적 유전자의 넉다운(knockdown)을 유도했다. 본 발명의 결과는 PEG-nGO 구조체가 세포독성을 나타내지 않고 유전자 조작을 위한 안티센스 PNA의 적절한 운반체임을 시사한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 실험
1.1. PEG 접합된 나노 크기의 산화 그래핀 (PEG-nGO), FAM-표지된 PEG-nGO(FAM-PEG-nGO) 및 올리고뉴클레오티드의 제조
산화 그래핀(GO)은 그래핀 라보라토리사(Graphene Laboratories, Inc., HCGO-W-175, 미국 뉴욕 주 Ronkonkoma 소재)에서 구입하였고, 6-암(6-arm) 폴리에틸렌 글리콜 아민(polyethylene glycol-amine, 평균분자량 15 kDa)은 선바이오사(SunBio, Seoul, Korea)에서 구입하였다. PEG-nGO는 선행문헌에 기재된 바에 따라 제조하였다(Kim, H. R., et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 2016, 8, 33521-33528). FAM으로 표지된 PEG-nGO를 합성하기 위해 PEG-nGO(1 mg·mL- 1)를 5-카르복시플루오레세인(5-carboxyfluorescein, 5-FAM, Anaspec, Fremont, CA, USA)(0.1 mg·mL- 1)과 혼합한 결과물을 5분간 수조에서 초음파 처리하였다. 상기 혼합물에 12시간 동안 교반하면서 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)(5mM)를 첨가하고, 50 mM 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol, Bio Basic Inc., Ontario, Canada)을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 얻어진 혼합물을 12시간 동안 증류수에서 투석하여 EDC, 2-머캅토에탄올 또는 유리 5-FAM을 제거하였다. 본 실시예에서 사용된 PNA 올리고뉴클레오티드(서열은 도 4a에 도시됨)는 파나진사(PANAGENE, 대전, 한국)에서 화학적 합성한 것이다. RNA 올리고뉴클레오티드를 HPLC 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(ST Pharm Co. Ltd. Seoul, Korea)을 통해 화학 합성 및 정제하였다.
1.2. nGO와 PEG-nGO 구조체의 특성
그래핀 재료(nGO 및 PEG-nGO)의 크기와 두께를 원자력 현미경(XE-100 AFM, Park Systems, Seoul, Korea)을 통해 측정하였다. nGO 또는 PEG-nGO의 표면 형태는 투과 전자 현미경(LIBRA 120; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 통해 평가하였다. 대응되는 제타 전위는 ELSZ 1000(Otsuka Electronics, Osaka, Japan)을 사용하여 기록하였다. 서로 다른 유형의 그래핀 물질의 용해도를 조사하기 위해, nGO, HOOC-nGO 및 PEG-nGO를 서로 다른 용액(물, PBS 및 세포 배양 배지)으로 준비하였다. 10,000 g에서 5분간 원심분리 한 후, nGO, HOOC-nGO 및 PEG-nGO 현탁액을 관찰하였다.
1.3. 세포 배양 및 PEG-nGO의 세포내 도입
미국 ATCC(American Type Culture Collection, ATCC CCL-185)로부터 구입한 A549 세포(non-small lung cancer cell line, 비소세포 폐암 세포주)를 10 % 소태아 혈청 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 유지시켰다. A549 세포를 37 ℃, 습한 5 % CO2 대기 하에서 배양하였다.
A549 세포를 커버 글래스(지름 18mm)가 있는 12-웰 플레이트에 접종하고 37 ℃에서 2시간 동안 Opti-MEM으로 인큐베이션하였다. 세포를 100 μg·mL-1 FAM-PEG-nGO로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 25 ℃에서 4 % 파라포름알데히드에서 1시간 동안 고정시켰다. 세포를 프로롱 골드 안티페드 시약(ProLong Gold antifade reagent, Invitrogen Life Technologies)를 사용하여 커버슬립(coverslip)에 장착하고 공초점 현미경(Olympus FV-1000 스펙트럼, 도쿄, 일본)을 사용하여 관찰했다.
1.4. 세포독성 및 세포 이미지
A549 세포를 24-웰 플레이트에 접종하고 nGO 또는 PEG-nGO(10, 100 μg·mL-1)로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 세포 생존율은 WST-1 시약(EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, 대일 연구소 서비스, 서울, 한국)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다. 세포 생존률을 평가하기 위해, VICTOR X3 다중 라벨 플레이트 판독기(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 자가소화 마커를 관찰하기 위해 nGO 또는 PEG-nGO(10, 100 μg·mL-1) 처리 후 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 항-LC3B(Cell Signaling Technology, 미국 메사추세츠 주 Beverly), 항-GAPDH(Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 서양고추냉이 퍼옥시다아제-결합 항-토끼(horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit, Santa Cruz biotechnology) 항체를 사용했다.
A549 세포를 100-mm 디쉬에 접종하고 24시간 동안 100 μg·mL-1 nGO, 100 μg·mL-1 PEG-nGO 또는 1 μg·mL-1 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS, Sigma-Aldrich에서 구입)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 2시간 동안 4 ℃에서 0.05M 카코딜산 나트륨 완충액(sodium cacodylate buffer, pH 7.2) 중에서 2 % 파라포름알데히드와 2 % 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 고정시켰다. 세포를 0.05M 카코딜산 나트륨 완충액(pH 7.2)으로 3회 세척하고 1 % 사산화 오스뮴(osmium tetroxide) 및 0.05M 카코딜레이트(cacodylate) 완충액으로 4 ℃에서 2시간 동안 후-고정시켰다. 후-고정 후, 세포를 증류수로 2회 세척하고 4 ℃에서 밤새 0.5 % 우라닐 아세테이트로 일괄하여 염색하였다. 이 후, 세포를 등급화된 에탄올 시리즈로 탈수시키고 100 % 프로필렌 옥사이드로 전이시켰다. 탈수된 세포는 산화 프로필렌에 Spurr 수지(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)로 침투시키고 Spurr 수지에서 70 ℃에서 하룻밤 동안 중합시켰다. 세포를 울트라마이크로톰 절편(ultramicrotome sectioning, MTX, RMC, Tucson, AZ, USA)한 후 2 % 우라닐 아세테이트와 레이놀즈 리드 시트레이트(Reynolds lead citrate)로 순차적으로 염색하였다. 준비된 세포를 투과 전자 현미경(LIBRA 120)으로 관찰하였다.
1.5. PEG-nGO에 대한 형광 단일가닥 핵산의 흡착
nGO 또는 PEG-nGO의 농도 증가에 따른 형광 소광 분석을 위해, 1 μM FITC-PNA를 상이한 농도의 nGO 또는 PEG-nGO(0, 1, 5, 10, 20, 30, 50 및 100 μg·mL- 1)와 25 ℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 FITC 형광 강도를 다중 라벨 플레이트 판독기(VICTOR X3)에서 485 nm의 여기 파장 및 535 nm의 방출 파장으로 측정하였다.
1.6. PEG-nGO로부터 형광 단일가닥 PNA의 해리
FITC-PNA(1 μM)를 100 μg·mL-1 nGO 또는 PEG-nGO에 전-흡착시켰다. 25 ℃에서 10분간 인큐베이션한 후, 상보적 또는 비-상보적인 RNA(10 내지 1000 nM)를 FITC-PNA/nGO 또는 PEG-nGO의 혼합물에 첨가하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. FITC 형광은 다중 라벨 플레이트 판독기(VICTOR X3) 상에서 485 nm의 여기 파장 및 535 nm의 방출 파장으로 측정하였다. 산성 조건 하에서 PEG-nGO로부터 방출된 PNA의 양을 측정하기 위해, 세포 배양 배지(DMEM, pH 7.5)를 시트르산으로 저 pH(pH 5.0 내지 pH 7.0)로 조정하였다. FITC-PNA(5 μM)를 25 ℃에서 10분간 PEG-nGO(500 μg·mL- 1)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 얻어진 FITC-PNA/PEG-nGO 혼합물(10 ㎕)을 상이한 pH(40 ㎕)를 갖는 DMEM에 첨가하였다. 인큐베이션 10분 후, 다중 라벨 플레이트 판독기(VICTOR X3, λex = 485 nm 및 λem = 535 nm)에서 형광을 측정하였다.
1.7. PNA/PEG-nGO의 세포내 도입 및 엔도좀 ( endosome ) 탈출
A549 세포는 커버 글래스(지름 18mm)가 있는 12-웰 플레이트에 접종하고 37 ℃에서 2시간 동안 Opti-MEM으로 인큐베이션하였다. PNA/nGO 또는 PNA/PEG-nGO 복합체를 제조하기 위해 200 μL의 Opti-MEM에 nGO 또는 PEG-nGO(100 μg·mL- 1)에 형광-표지된 PNA(TAMRA 또는 FITC, 5 μM)를 첨가하였다. 25 ℃에서 10분간 인큐베이션한 후, PNA/nGO 또는 PNA/PEG-nGO 혼합물을 A549 세포에 첨가하고 0.5 내지 4.5시간 동안 인큐베이션하였다. 엔도좀/리소좀(lysosomes)의 염색을 위해 세포를 75 nM LysoTracker Red DND-99(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 25 ℃에서 1시간 동안 4 % 파라포름알데히드로 고정시켰다. Topro-3(1 : 1000 희석)로 핵을 염색하고 세포를 프로롱 골드 안티페드 시약이 있는 커버슬립에 장착하고 공초점 현미경(Olympus FV-1000 스펙트럼)을 사용하여 관찰했다.
1.8. PNA/PEG-nGO를 이용한 유전자 넉다운 (knockdown)
eGFP를 발현하는 A549 세포를 준비하기 위해, 세포를 60-mm 디쉬에 접종하고 37 ℃에서 2시간 동안 Opti-MEM으로 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 5 μg의 eGFP 발현 플라스미드(peGFP-C2; Clontech, Mountain View, CA, USA)로 형질주입시켰다. 6시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 50 μg·mL-1 카나마이신을 함유하는 완전한 DMEM에서 유지시켰다. eGFP 발현 A549 세포를 커버 글래스(지름 18mm)가 있는 12-웰 플레이트에 접종하고, Opti-MEM에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 항-eGFP PNA(1 μM)를 20 μg·mL-1 PEG-nGO와 혼합하고 10분간 인큐베이션하였다. 항-eGFP PNA/PEG-nGO 복합체를 eGFP-발현 A549 세포에 첨가하고 3시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 세척하고 21시간 동안 완전 DMEM에서 인큐베이션하였다. 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정시키고 프로롱 골드 안티페드 시약이 있는 커버슬립에 올려 놓았다. 형광 현미경(AxioVert 200, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 A549 세포의 eGFP 형광을 관찰하였다.
EGFR 넉다운과 관련하여, A549 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 Opti-MEM으로 2시간 동안 인큐베이션하였다. 항-EGFR PNA(1 μM)를 20 μg·mL-1 PEG-nGO와 함께 25 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. A549 세포를 항-EGFR PNA/PEG-nGO 복합체로 처리하고 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이 후 세포를 세척하고 21시간 동안 완전 DMEM에서 인큐베이션하였다. 제조자의 지시에 따라 카스파제-글로 3/7 시약(Caspase-Glo 3/7 reagent, Promega, Paris, France)을 사용하여 카스파제 3/7 활성을 측정하였다. 카스파제 3/7 활성에 해당하는 발광을 VICTOR X3 다중 라벨 플레이트 판독기로 측정하였다.
2. 결과 및 토의
본 발명에서는 PEG화된 나노 크기의 산화 그래핀(PEG-nGO) 구조체를 준비하고 AFM(atomic force microscopy), TEM(transmission electron microscopy) 및 제타 전위 측정을 사용하여 nGO 및 PEG-nGO의 특성을 분석하였다. 준비된 nGO 및 PEG-nGO 입자의 크기는 AFM을 사용하여 200 nm 미만으로 측정되었다(도 1a). nGO 입자의 평균 두께는 1.39 nm이었고, 이것은 단일층의 그래핀에 해당하는 것인 반면에, PEG-nGO 입자는 nGO 표면에 PEG가 결합된 결과 4.5 - 5.2 nm의 더 두꺼운 두께를 나타냈다. TEM 이미지는 nGO 및 PEG-nGO 구조체의 크기가 약 200 nm 미만임을 보여주었다(도 1b). PEG-nGO는 nGO 표면에 접합된 PEG에 대응하는 것으로 추정되는 작은 흑색 반점을 갖는 반면, nGO는 깨끗하고 균일한 표면을 나타냈다. nGO 입자는 제타 전위 측정에 근거하여 음의 표면 전하(-38 mV)를 보였으나, PEG-nGO 입자의 제타 전위는 +35 mV만큼 높아져서 -1.63 mV에 도달하였다(도 1c). PEG-nGO 입자의 더 높은 제타 전위는 PEG의 GO 표면에 대한 접합으로 인한 것으로 보인다. PEG 분자는 그 암(arm)에 많은 아민을 포함하고 있어 PEG-nGO 표면의 음전하가 낮아진다.
수용액에서의 PEG-nGO의 용해도 향상을 확인하기 위해 nGO, HOOC-nGO 및 PEG-nGO를 증류수(Water), 인산염 완충 식염수(PBS) 및 세포 배양 배지(Media)에 용해시켰다(도 1d). 10,000 g에서 5분 동안 원심분리한 후 nGO와 HOOC-nGO는 각각의 수용액에서 응집체를 형성하였다. 반면에, PEG-nGO는 모든 수용액에서 높은 용해도를 보였으며 원심분리 후 응집되지 않았다. 종합하면, PEG를 nGO 표면에 접합시킴으로써(즉, PEG-nGO) nGO 또는 HOOC-nGO보다 식염수(PBS 및 세포 배양 배지)에서 PEG-nGO의 용해도가 높아졌다.
다음으로, 본 발명에서는 공초점 형광 현미경을 사용하여 암세포에 의한 PEG-nGO의 세포내 도입을 조사했다(도 2a). 세포에서 PEG-nGO의 존재를 모니터하기 위해 본 발명에서는 형광-표지 PEG-nGO(FAM-PEG-nGO)를 제조했다. PEG 층이 nGO 표면과 FAM을 분리하므로 FAM 형광은 nGO 표면의 형광 소광에 의해 영향을 받지 않았다. FAM-PEG-nGO 처리된 암 세포는 녹색 형광을 나타내었지만(도 2a), FAM과 PEG-nGO의 혼합물로 처리된 암세포에서는 신호가 검출되지 않았다. 이러한 결과로부터 PEG-nGO 구조체가 암 세포로 효과적으로 전달되었음을 알 수 있다.
세포 내에서 PEG-nGO의 세포독성을 평가하기 위해 세포 생존율 분석을 수행하였다(도 2b). 암세포를 10 μg·mL-1 및 100 μg·mL-1 nGO 또는 PEG-nGO로 24시간 처리하였다. nGO와 PEG-nGO(10 μg·mL-1) 저용량 처리군은 대조군과 거의 비슷한 수준의 세포 생존율을 보였다. 대조적으로, 높은 nGO 투여량으로 처리한 경우 세포 생존률이 현저히 감소한 반면(약 50 % 세포 생존율), PEG-nGO 처리군에서는 세포 생존율이 약간만 감소하여, 약 90 %의 세포 생존율이 유지되었다.
GO는 이전에 톨-유사 수용체 경로(toll-like receptor pathway), 즉 생체이물 탄소 물질(xenobiotic carbon material)의 축적에 의해 유도되는 세포 반응을 활성화시킴으로써 대식세포에서 세포질 자가소화작용을 유도하는 것으로 보고된 바 있다(Xu, Z., et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7, 1355-1363). PEG-nGO가 세포에서 자가소화작용을 유도하는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명에서는 nGO 또는 PEG-nGO로 처리된 세포에서의 자가소화 마커 단백질(즉, LC3B-1 내지 LC3B-II 전환) 수준을 측정하였다(도 2c). nGO 처리 세포는 LC3B 전환을 나타내었으며, 이는 자가소화 유도를 나타내는 반면, PEG-nGO 처리 세포에서는 LC3 전환이 관찰되지 않았다.
다음으로 TEM를 사용하여 nGO 또는 PEG-nGO로 처리한 후 암세포에서 자가소화 액포 형성을 조사하였다(도 2D). TEM 이미지에 나타난 바와 같이, LPS(양성 대조군)로 처리된 세포에서 큰 액포를 볼 수 있으며, 이는 자가소화 액포 형성을 유도하는 것으로 알려진 것이다. nGO 처리된 세포에서는 큰 자가소화 액포가 확인되었으나(적색 화살표, 도 2d), 이와는 대조적으로, PEG-nGO 처리 세포에서는 자가소화 액포가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 PEG-nGO가 심각한 세포독성을 일으키지 않으면서 세포 내로 전달될 수 있는 생체 적합성 탄소 재료임을 나타낸다.
PEG-nGO를 암세포로의 유전자 전달 물질로 활용하기 위해 다양한 종류의 올리고뉴클레오티드와 PEG-nGO 사이의 상호작용을 먼저 조사했다(도 3). PEG-nGO(100 μg·mL-1)를 단일가닥의 DNA, RNA 및 PNA(각각 ssDNA, ssRNA 및 ssPNA) 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)로서 이중가닥 RNA와 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 비-변성 PAGE 분석을 통해 흡착되지 않은 핵산을 검출하였다(도 3a). PEG-nGO의 농도가 증가함에 따라 PEG-nGO 표면에 PNA가 흡착됨으로 인해 ssPNA의 밴드 강도가 감소하는 반면, 다른 올리고뉴클레오티드(ssDNA, ssRNA 및 siRNA)의 밴드 강도는 흡착시 변화하지 않았다. 다음으로는 PEG-nGO의 농도를 증가시키면서 형광-표지된 ssPNA, ssDNA, 또는 siRNA와 인큐베이션시킨 후, 형광 소광 분석을 수행하였다(도 3b). PNA의 형광 강도는 용량 의존적으로 감소하여 PNA가 PEG-nGO에 쉽게 흡착된다는 것을 나타내었다.
PNA는 PEG-nGO 상에 쉽게 흡착될 수 있기 때문에 적절한 올리고뉴클레오티드로 선택되었다. 다음으로 PEG-nGO에 대한 PNA의 흡착 및 해리 특성을 조사하여 PEG-nGO를 세포 내로의 PNA 전달을 위한 전달체로 사용할 수 있는지 여부를 평가하였다. 이를 위하여 PNA 추적 및 이후의 세포 내 표적 유전자(표피 성장 인자 수용체, epidermal growth factor receptor, EGFR 유전자) 넉다운을 위한 형광 표지된 PNA 올리고뉴클레오티드를 설계하였다(도 4a). FITC-표지된 PNA(FITC-PNA)를 사용하여 PNA와 PEG-nGO 사이의 상호작용을 관찰하였다. PNA의 흡착 및 해리는 각각 형광의 감소 및 증가를 검출함으로써 측정될 수 있다. FITC-PNA(1 μM)를 nGO 또는 PEG-nGO(0 - 100 μg·mL- 1)의 농도를 변화시켜 25 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다(도 4b). PNA 형광은 nGO 또는 PEG-nGO의 농도가 증가함에 따라 소광되어 PNA가 nGO 및 PEG-nGO 표면 상에 쉽게 흡착되었음을 나타내었다.
다음으로, PEG-nGO에 흡착된 PNA가 표적 PNA 서열에 상보적인 RNA를 첨가함으로써 방출될 수 있는지 여부를 조사하였다(도 4c). PEG-nGO 표면 상에 PNA를 전-흡착시킨 후, 상보적 RNA(cRNA) 또는 비-상보적 RNA(non-cRNA)를 PNA/PEG-nGO 복합체에 첨가하였다. PNA 형광 세기의 90 % 이상이 상보적 RNA를 PNA/PEG-nGO 복합체에 첨가함으로써 회복되었지만, 비-상보적 RNA의 첨가는 형광을 증가시키지 않았다. 따라서, PEG-nGO 상에 흡착된 PNA는 상보적 RNA 서열의 존재 하에서는 용이하게 방출될 수 있는 것으로 확인되었다. 전-흡착된 PNA는 상보적 RNA를 첨가함으로써 농도 의존적인 방식으로 PEG-nGO로부터 쉽게 해리되었으며, 이는 겔에서 PNA 밴드의 형광 강도가 점차적으로 증가하는 것으로 관찰되었다(도 4d). 그러나, 비-상보적 RNA의 첨가는 PEG-nGO로부터 형광성 PNA의 방출을 일으키지 않았다. 대조적으로, PNA가 PEG-nGO 대신에 nGO 상에 전-흡착되면, 상보적 RNA를 이용한 PNA의 서열-특이적 해리는 관찰되지 않았으며(도 5a), 이는 PEG-nGO보다 nGO의 PNA에 대한 강한 친화성에 기인한 것일 수 있다. 요약하면, PNA가 PEG-nGO 표면 상에 흡착되고 PNA에 상보적인 RNA 첨가에 의해 쉽게 해리됨으로써, 세포 내에서 표적 RNA에 노출시 PNA의 효과적인 방출을 수행할 수 있는 PNA 전달체로서 PEG-nGO가 사용될 수 있음을 입증한다.
PEG-nGO를 이용한 PNA의 세포내 도입을 조사하기 위해, 형광-표지 PNA/PEG-nGO 복합체를 암 세포에 투여하였다(도 6a). TAMRA-표지된 PNA를 nGO 또는 PEG-nGO 표면에 10분간 전-흡착시켜 PNA/GO 복합체를 형성시켰다. 세포를 PNA/nGO 또는 PNA/PEG-nGO 복합체와 함께 3시간 동안 인큐베이션한 후, 형광 현미경을 사용하여 PNA로부터의 형광 신호를 모니터링하였다. 유리 PNA도 PNA/nGO 복합체도 세포 내에서 TAMRA 형광을 보이지 않았다. 대조적으로, PNA/PEG-nGO 복합체로 처리된 세포는 세포 내에서 현저하게 강한 형광을 나타내었고, 세포의 전체 세포질에서의 형광에 대한 수직 분포를 위해 좀더 절단 측정하였다(도 6a, 하부 패널).
다음으로, 세포내 도입 후 PNA 및 PEG-nGO의 세포 분포를 조사하기 위해, FITC-PNA, FAM-PEG-nGO 및 FITC-PNA/PEG-nGO 복합체로 암세포를 처리하고, 세포 내에서 이에 상응하는 형광 강도를 측정하였다(도 6b 및 도 7). 형질주입된 생체 이물질은 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 엔도좀과 리소좀과 같은 세포내 산성 소기관 내로 포획되는 경향이 있다. 따라서, 형광 염료(즉, LysoTracker Red)로 염색함으로써 세포 소기관을 추적하였다. FITC-PNA 처리 세포는 PNA의 형질주입 효율이 낮아 녹색 형광 신호가 약하게 축적되었다. PNA의 녹색 형광 반점은 적색 형광 반점과 완전히 일치하지 않아, 유리 PNA의 세포내 도입이 엔도사이토시스에 의해 매개되지 않는다는 것을 시사하였다. FAM 표지된 PEG-nGO로 처리한 세포는, 병합(merge) 이미지에서 황색 형광 영역으로 보이는, 적색 형광 반점과 공존하는 산재된 녹색 형광을 나타냈다.
이러한 결과는 PEG-nGO가 엔도사이토시스를 통해 세포에 도입되어 이후 리소좀으로 둘러싸인다는 것을 나타낸다. 대조적으로, FITC-PNA/PEG-nGO 복합체로 처리된 세포는 시간이 지남에 따라 리소좀에서 공존(co-localization)하지 않고 전체 세포질에 점차적으로 분산되는 녹색 형광을 나타내었다(도 7c). 이러한 결과는 형질주입된 PNA가 리소좀 축적없이 엔도좀 탈출을 통해 세포질로 방출된다는 것을 나타낸다. PEG-nGO에 흡착된 PNA는 낮은 pH 조건에서 PEG-nGO로부터 용이하게 방출되었고, 이는 엔도사이토시스 동안 산성 세포 소기관(즉, 엔도좀 및 리소좀) 내에서 세포 내 환경과 유사하다(도 5b). 종합하면, PNA/PEG-nGO 복합체의 세포내 도입은 엔도사이토시스에 의해 매개되고, 그 후 PNA는 엔도좀/리소좀의 낮은 pH 조건으로 인해 PEG-nGO 표면으로부터 방출된다. 이 후 PNA는 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 통해 세포질로 용이하게게 확산된다.
마지막으로, 본 발명에서는 암 세포에서 PNA의 PEG-nGO 매개 전달을 통한 유전자 넉다운 효율을 시험했다(도 8). 강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, eGFP)을 코딩하는 유전자를 표적으로 삼는 안티센스 PNA 올리고뉴클레오티드를 PNA/PEG-nGO와 복합체화시키고 eGFP-형질주입 폐암 세포에 투여하였다(도 8a). 항-eGFP PNA/PEG-nGO 복합체로 처리된 세포는 약한 녹색 형광 신호를 나타내었지만, PNA의 스크램블 서열을 포함하는 PNA/PEG-nGO 복합체로 처리된 세포는 강한 형광 강도를 유지했다. PEG-nGO를 사용한 PNA 전달 시스템이 암 유전자 치료에 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 폐암 세포에서 항-EGFR PNA/PEG-nGO 복합체를 사용하여 EGFR 유전자의 넉다운 효율을 조사했다. 세포 증식의 조절 인자로 알려진 EGFR의 넉다운은 카스파제 패밀리(family)를 활성화시켜 암세포의 세포 사멸을 유도한다. 5 μM 항-EGFR PNA/PEG-nGO 복합체로 처리된 폐암 세포는 대조군에 비해 5배 낮은 EGFR 발현을 보였다(도 8b). 또한, 항-EGFR PNA/PEG-nGO 복합체로 형질주입된 암세포는 대조군 또는 대조군 PNA로 처리 한 세포에 비하여 유의하게 높은 카스파제 3/7 활성을 나타내었다. 또한, 항-EGFR PNA/PEG-nGO로 처리된 세포는 효과적인 EGFR 넉다운의 결과로 세포 사멸에 이르렀다(도 8c). 이러한 결과는 PEG-nGO를 사용하여 암세포에 전달된 안티센스 PNA가 표적 암 유전자의 효과적인 넉다운을 유도한다는 것을 나타낸다. 따라서, PEG-nGO 물질은 세포에서 표적 유전자의 넉다운을 위한 유망한 PNA 전달 시스템으로서 작용한다.
3. 요약 및 결론
본 발명에서는 암세포에서 표적 유전자의 넉다운을 위해 PEG-nGO를 사용하는 효과적인 PNA 유전자 전달 시스템을 확인하였다. PEG화된 나노 크기의 GO는 PBS 및 세포 배양 배지와 같은 고염도 용액에서 응집되지 않고 GO 단독보다 낮은 세포독성과 높은 수용해도를 보였다. PEG-nGO는 핵산 흡착이라는 GO 특성을 그대로 나타내어, 표면에 단일가닥 PNA가 쉽게 흡착하였다. 더욱이, 흡착된 PNA는 상보적 RNA의 첨가시 또는 엔도좀 및 리소좀의 세포 환경과 유사한 저 pH 조건 하에서 PEG-nGO 표면으로부터 쉽게 해리되었다. PEG-nGO는 폐암 세포에 의해 흡수되었고, 유리 PNA 또는 PNA/nGO 복합체보다 더 효과적으로 PNA를 전달하였다. PEG-nGO의 세포내 도입은 엔도사이토시스를 통해 매개되는 반면, 유리 PNA는 엔도사이토시스를 통해 전달되는 것으로 관찰되지 않았다. 도 9에 도시된 바와 같이, PEG-nGO 표면 상에 흡착된 PNA는 엔도좀/리소좀의 산성 조건 하에서 방출되고, 엔도좀 탈출을 통해 결국 세포질로 확산되는 반면, PEG-nGO는 엔도좀/리소좀에 갇혀있는 것으로 보인다. 녹색 형광 단백질과 EGFR의 표적 유전자 넉다운은 PEG-nGO 매개 PNA 전달을 통한 표적 유전자 넉다운의 유효성을 확인하기 위해 수행하였다. 종합적으로, 상기 결과로부터 PEG-접합 산화 그래핀이 PNA 전달에 유용한 생체 적합성 전달체이고 암 유전자 치료를 위한 유망한 유전자 전달 도구로서의 역할을 한다는 것이 확인되었다.

Claims (10)

  1. 단일가닥의 펩티드 핵산 및 6-암(6-arm) 폴리에틸렌 글리콜 접합된 평균 두께 4.5 - 5.2 nm의 산화 그래핀 입자를 포함하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물로서, 상기 6-암(6-arm) 폴리에틸렌 글리콜이 평균분자량 15 kDa인 것을 특징으로 하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 단일가닥의 펩티드 핵산이 표적 유전자의 RNA에 대한 안티센스 펩티드 핵산인 것을 특징으로 하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 표적 유전자가 파킨슨 병 유전자, 표피 성장 인자 수용체 유전자 및 암 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 6-암(6-arm) 폴리에틸렌 글리콜 접합된 산화 그래핀 입자가 크기 4.5 nm 이상 200 nm 미만인 것을 특징으로 하는 표적 유전자 발현 억제용 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
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