JPH08507763A - ボルデテラからの細胞結合蛋白質の抽出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞結合蛋白質の懸濁液を加熱処理前にフロキュレート化剤と接触させることからなる細菌原の細胞結合蛋白質の抽出法。

Description

【発明の詳細な説明】 ボルデテラからの細胞結合蛋白質の抽出 本発明は抗原成分因子または無細胞ワクチンとしての有用性を有する細胞蛋白 質の新規単離方法に関する。特に、本発明は細菌の外層膜蛋白質、例えばボルデ テラ・ペルツッシス（Bordetella pertussis）の外層膜蛋白質であって、約６９ ,０００ダルトンの分子量を有し、通常、ボルデテラ・ペルツッシスの６９ｋＤ 蛋白質またはペルタクチン（pertactin）と称される蛋白質の新規抽出方法に関 する。 百日咳は、主に子供を冒す高感染性疾患である。呼吸併発症の原因となること に加えて、百日咳は、特に社会経済性の低い層にある子供および母性抗ペルツッ シス抗体を有しない新生児にて神経障害および高死亡発生率をもたらす。百日咳 の病原菌はグラム陰性球桿菌、すなわちボルデテラ・ペルツッシスである。該細 菌は呼吸管を冒し、その消滅後、数日後になってさえ、残存する毒性症状を誘発 すると考えられる。 該疾患は、一般に、ボルデテラ・ペルツッシス菌を醗酵槽中にて増殖させ、つ いで得られた細胞を加熱処理および／または化学薬剤の添加により不活性化する ことにより調製される「全細胞」ワクチンを用いる免疫処理によって制御される 。世界保険機構は、現在、百日咳の発生および蔓延を防止するのに乳児を免疫処 理することを推進しているが、多価ワクチン処方に由来して報告されている副作 用に対して懸念が生じている。その結果として生じる従来のビー・ペルツッシス ワクチンの使用の減少は、百日咳感染症の発病率の増加をもたらした。全細胞ワ クチンに由来して報告されている副作用を回避する百日咳ワクチンについて、そ の必要性が認識されている。したがって、少数の高純度抗原蛋白質成分からなる 効果的な無細胞ワクチンの開発に、かなりの研究努力が注がれている。 例えば、リンパ球増多因子（ＬＰＦ）を含め、さらにヒスタミン感作因子、島 活性化蛋白質または、より一般的には百日咳トキシン（ＰＴ）、線状血球凝集素 （ＦＨＡ）および線毛凝集原として知られている多くの抗原が無細胞ワクチン成 分として提案されている。 別の可能性のある抗原は、ビー・ペルツッシスのすべてのビルレント菌株に見 られる約６９,０００ダルトンの分子量を有する、細菌の外層膜蛋白質の一つ（ ペルタクチン）である。ビー・ペルツッシス６９ｋＤ蛋白質は、ヒト病原体のビ ー・パラペルツッシス（B.parapertussis）および動物病原体のビー・ブロンキ セプティカ（B.bronchiseptica）により産生される免疫学的に関連する類似蛋白 質であり、電気泳動移動性においてわずかな違いを有する。６９ｋＤ蛋白質は、 ビー・ペルツッシスの培養の間、醗酵ブロスに比較的少量にて分泌されるが、そ の大部分は細胞膜に付着し、６９ｋＤ蛋白質はその細胞膜から容易に抽出される ことが判明している。しかしながら、６９ｋＤ蛋白質の抽出および精製について 公開されている操作は、高純度の安定した抗原の大規模な商業的生産を可能とす るものではない。 ＥＰ−０ １６２ ６３９は、細胞を酸−グリシン抽出操作に付し、つづいて特 異的モノクローナル抗体を用いるアフィニティー・クロマトグラフィー分離操作 にて完結する複数の精製工程を記載する。得られた蛋白質は、安定性に欠け、ア デニレルシクラーゼ活性を有すると報告されており、下流（downstream）精製操 作は大規模生成に適しない。 ブレンナン（Brennan）ら（インフェクション・アンド・イムニティー（Infec tion and Immunity）５６，３１８９−３１９５，１９８８）は、加熱処理によ り蛋白質を細胞から分離して蛋白質抽出物を得、それをフェチュイン−セファロ ース（fetuin−Sepharose）およびモノクローナル抗体アフィニティーカラムを 用いるクロマトグラフィーにより精製する別の方法を記載する。 米国特許出願第７／３０８,８６４号は、加熱処理および遠心分離に付し、つ づいてＤＥＡＥ−セファロースイオン交換クロマトグラフィーおよび蛋白質特異 的染料リガンドゲルクロマトグラフィーに付すことからなる抽出および精製を記 載する。この方法は高価なモノクローナル抗体の使用を回避するが、にもかかわ らず、大規模生産に適していない。同定された１つの問題は、溶液中に放出され る６９ｋＤ蛋白質の量が、加熱処理後に分離される蛋白質全体の割合として少量 であるということである。ＥＰ−Ａ−０ ４３７ ６８７は、一連の複数の抽出工 程からなる反復抽出法を用いることにより、培養ブロスからの６９ｋＤ蛋白質の 放出効率が改良されると詳説する。 本発明は一回の抽出工程後に微生物細胞から放出される蛋白質の収量を向上さ せ、さらに細胞残骸を除去するのにその後の遠心分離操作の必要性を除外する方 法を提供することにより非効率的な蛋白質の回収の問題を解決するものである。 さらには、本発明の方法は、醗酵後に培養ブロス中に存在し、熱を加えることに より膜蛋白質を抽出した場合に溶液中に放出される高分子量エンドトキシン（リ ポ多糖体）の大部分を効果的に排除するという利点を有する。 醗酵後に微生物細胞の懸濁液を加熱処理することは、醗酵の間に微生物により 培養ブロス中にわずかに分泌される、蛋白質、例えば外層膜蛋白質の単離におけ る重要な工程である。ビー・ペルツッシスの６９ｋＤ蛋白質は、ブロス上清から の生産規模での直接単離を保証するのに十分な量で分泌されない外層膜蛋白質の 典型例である。この点において、該蛋白質は、無細胞百日咳ワクチンについての 他の抗原候補である、百日咳トキシン（ＰＴ）および線状血球凝集素（ＦＨＡ） と異なっている。 加熱処理は、細胞懸濁液を、緩衝液中、例えば、６０℃で約１時間加熱するこ とからなり、その間に外層膜蛋白質は細胞膜から溶液中に移行する。しかしなが ら、該溶液は易流動性液体でなく、辛うじて小規模（５〜１０ｍｌアリコート） で易流動性液体から（例えば、濾過または遠心分離により）分離できる、死菌細 胞とその内容物とからなる粘着性のゼリー状塊である。この重く水和されたゼリ ー物は、原液体容量の５０％以上を占めることが度々であり、除去されれば、６ ９ｋＤ蛋白質の収量がかなり減少する。該ゼリー物はすぐにフィルターをふさぎ 、液体の濾過を妨げるため、きめの粗い濾過はさらに満足のいくものではない。 本発明は加熱処理の間にゼリー状塊の形成を排除する効果的な方法を提供する ものである。加熱処理の前にフロキュレート化剤を細胞懸濁液に添加すると細胞 の激しいフロキュレーションが起こることが見いだされた。フロキュレート化し た細胞の塊は懸濁しているブロスから容易に分離でき、洗浄して加熱処理の前に 不要なブロス成分を除去してもよい。死菌細胞は加熱処理後に再度フロキュレー ト化し、大部分の可溶性蛋白質を含有する実質的に細胞不含の上清が残る。この 操作は、溶液中、下流精製について、所望の蛋白質の高回収率を付与する。 本発明は、さらにその上、高分子量エンドトキシンの大部分がフロキュレート 化した死菌細胞の塊と一緒に加熱処理後に得られる蛋白質含有の溶液より排除さ れるため、さほど厳重な下流精製に付す必要がない回収蛋白質を提供しうるとい う利点がある。したがって、予防および治療的用途に求められる基準の蛋白質純 度を得るのに要する下流精製工程の数を減少させる可能性がある。 したがって、本発明は、細胞結合蛋白質の懸濁液をフロキュレート化剤と接触 させることからなる細菌原の細胞結合した蛋白質を抽出する方法を提供する。 当該分野において周知の広範なフロキュレート化剤を本発明の方法に用い、加 熱処理後の細胞懸濁液の処理特性を改良してもよい。本発明にて用いるのに好ま しいフロキュレート化剤は二価カチオンからなる物質である。本発明にて用いる のに適当な二価カチオンは、バリウム、カルシウムおよびストロンチウムの塩、 例えば塩化バリウム、塩化カルシウムまたは塩化ストロンチウム、好ましくは塩 化バリウムのようなハライド塩から利用される。 フロキュレート化剤を、適当には、調整されたpＨ条件下、細胞の懸濁液と接 触させ、液体容量を適当な緩衝剤を添加することで調節する。混合した後、フロ キュレート化細胞が沈殿する。フロキュレート化した細胞を、適当には、沈降法 （または遠心分離）で採集し、加熱処理に付す前に、セイラインまたは緩衝液で 洗浄してもよい。 本発明の抽出方法を、さらなる下流処理と組み合わせて用いた場合、非常に高 純度の濃度のビー・ペルツッシス由来の６９ｋＤが得られる。例えば、検出可能 な濃度のＰＴまたは熱不安定性トキシンは含まれず、エンドトキシン濃度は蛋白 質１ｍｇ当たりナノグラムにまで減少する。加えて、該蛋白質は、従来の製法に 付随する、酵素活性、特にアデニルシクラーゼ活性を何ら有しない。 本発明の好ましい具体例において、６９ｋＤ蛋白質をビー・ペルツッシスの醗 酵ブロスまたは培養にて産生する。本発明にて用いるのに適当な菌株は以下に記 載されており、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国 、メリーランド州、ロックビル）から容易に入手される。好ましい菌株は液体培 地にて増殖能を有し、６９ｋＤ蛋白質を高収率にて産生するできる菌株である。 用いてもよい菌株は、例えば、限定されるものではなく、Ｉ期ビー・ペルツッ シス（B.pertussis phase Ｉ）、II期ビー・ペルツッシス（B.pertussis phase II）、Ｉ期ビー・ペルツッシスＣＳ（B.pertussis phase Ｉ ＣＳ）、ビー・ペ ルツッシス・トハマ（B.pertussis Tohama）、ビー・ペルツッシス株１８５−３ ０（B.pertussiss train １８５−３０）、ビー・ペルツッシス株１８３２３（B .pertussis strain １８３２３）、ビー・ペルツッシス株１３４（B.pertussis strain １３４）、ビー・ペルツッシス株５０９（B.pertussis strain ５０９） 、ビー・ペルツッシス株ウェルカム２８（B.pertussis strain Wellcome ２８） 、およびオフィス・オブ・バイオロジックス（Office of Biologics）のビー・ ペルツッシス株１６５（B.pertussis strain １６５）が挙げられる。本発明に て用いるのに好ましい菌株は、日本国、大阪府に住所を有する醗酵研究所（イン スティテュート・オブ・フェルメンターション）より、受託番号ＩＦＯ−１４０ ７３で入手可能なＩ期ビー・ペルツッシス・トハマである。 本発明にて用いる場合、選択されるビー・ペルツッシス株は、当業者に公知の 種々の方法にて増殖させることができる。種子培養の量および起源または保存方 法に依存して、異なる培養工程、液体または固体培地を用いる種々の培養方法が 知られている。しかし、いずれの公知方法も本発明にて用いるのに十分であり、 大規模生産について通常許容される大きさの接種物を提供する。 当業者であれば、ビー・ペルツッシス接種物の増殖用の適当な培地を選択でき る。適当な培地は、限定されるものではないが、ゲンゴウ（Gengou）培地（ＥＰ −Ａ−０ ０７７ ６４６）；エヌ・アンドーン（N.Andorn）ら（アプル・ミクロ バイオール・バイオテクノール（Appl.Microbiol.Biotechnol.），２８，３５６ −３６０，１９８８）およびその中の引用文献に記載の培地；スタイナー−ショ ルツ（Stainer-Scholte）培地（ジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバイオ ロジー（J.Gen.Microbiol.），６３，２１１−２２０，１９７１）；エイ・イマ イズミ（A.Imaizumi）ら（インフェクション・アンド・イムニティー（Infect.I mmun.），４１，３，１１３８−１１４３，１９８３およびジャーナル・オブ・ ミクロバイオロジカル・メソッズ（J.Microbiol.Methods），２，３３９−３４ ７，１９８４）に記載の変形したスタイナー−ショルツ培地；ベルウェイ（Verw ay）培地（米国特許第４,７８４,５８９号）；合成培地Ｂ２（ピー・フォン・ヘ マート（P.Van.Hemert）；プログ・インダスト・ミクロバイオール（Prog.Indus t.Microbiol.）；（Bull,M.J.ed.），１３巻，１５１頁，エルセバイアー・サイ （Elsevier Sci），アムステルダム（１９７７））またはその記載されている変 形を包含する。 本発明の出発物質であるビー・ペルツッシス培養物を増殖させる場合、接種物 を適当な液体培地に加え、当該分野において知られている通常の醗酵法および醗 酵槽のデザインを用いて醗酵操作を行う。当業者であれば、従来の醗酵槽のデザ イン、醗酵培地、方法および変数を、個々に組み合わせて選択することに依存し て異なる結果が得られることは明らかであろう。本発明で用いるのに好ましい組 み合わせは大規模生産に適するものである。かかる方法、デザインおよび培地の 組み合わせの例は、ＥＰ−Ａ−０ ０７７ ６４６、好ましくはＥＰ−Ａ−０ １ ２１ ２４９およびＥＰ−Ａ−０ ２３９ ５０４に例示されている。 醗酵完了後、ビー・ペルツッシス醗酵ブロスを適当に処理し、醗酵ブロス中に 直接分泌される抗原因子のＰＴおよびＦＨＡを、例えば、出典明示により本明細 書の一部とする、ＥＰ−Ａ−０ ４２７ ４６２に記載の方法により、ヒドロキシ 燐石灰に吸着させることで除去する。 蛋白質の放出を行うために加熱処理に付す前に、細胞結合した６９ｋＤ蛋白質 を含有する残りの細菌懸濁液を本発明に係るフロキュレート化剤で処理する。 残りのエンドトキシン濃度は上清のpＨを調整することにより最小としうるこ とが判明した。慣用実験により、選ばれたフロキュレート化剤に対するpＨの最 適値を選択できる。例えば、上清のpＨを、適当には、例えばバリウム、カルシ ウムまたはストロンチウムのハライド塩、好ましくは塩化バリウムの水溶液を添 加する前または後に、塩基を添加することにより４と１０の間、好ましくは８. ５と９.５の間に調整する。液体容量は緩衝液、適当にはトリス緩衝液を添加す ることで調整してもよい。適当には、混合を適宜５分間行い、得られたスラリー を約１時間にわたってフロキュレート化させる。ついで、増殖培地の未使用成分 （塩、アミノ酸、鉱物など）および醗酵の間にブロス中に放出される他の蛋白質 物質およびエンドトキシンを含有する上清を分離して捨て、フロキュレート化体 をさらに緩衝液またはセイラインで洗浄する。別法として、フロキュレート化細 胞を洗浄する前に遠心分離により分離してもよい。 醗酵ブロス中に存在する高濃度の塩、アミノ酸および鉱物は、後の精製工程を 妨げるため、必要ならば、フロキュレーション／洗浄工程を数回繰り返し、ハラ イド塩の濃度が許容される濃度、例えば、約０.０２％ｗ／ｖにまで減少したス ラリー状フロキュレート化細胞を得る。 ついで、スラリー状のフロキュレート化細胞を、約６０℃の温度で１５〜６０ 分間加熱処理に付すと、その間に６９ｋＤ蛋白質が液体懸濁液に遊離し、細菌が 死亡する。例えば約４℃で、適当な期間、好ましくは一夜、冷却した後、例えば 、デカンテーションまたは遠心分離により死菌細胞塊を除去し、上清を濾過し、 滅菌条件下、低温、約４℃で貯蔵する。 ついで、６９ｋＤ蛋白質を当該分野における適当な公知技法を用いて下流精製 に付す。好ましくは、該６９ｋＤ蛋白質を、イオン交換、疎水性相互作用および サイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを用いて精製する。適当なクロマト グラフィー支持体はＤＥＡＥ−セファロース、Ｑ−セファロース、ＳＰ−セファ ロース、ＣＭ−セファロースのようなアニオン交換支持体；ブチル−、フェニル −、オクチル−セファロース、ＴＳＫのような疎水性相互作用支持体；およびセ ファクリル、セファロース、セファデックス、スーパロース、スーパデックスな どのゲル濾過支持体を包含する。 高純度６９ｋＤ蛋白質を濾過、必要ならば、透析濾過に付すことにより滅菌処 理してもよい。 前記の方法にしたがって単離した精製６９ｋＤ外層膜の抗原強度は、例えば、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動 ）を用いる当該分野における周知技法、およびモノクローナル抗体を用いるウェ スタンブロット分析により測定してもよい。純度を定性的にＳＤＳ−ＰＡＧＥを 用いて測定してもよい。定量分析はＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法）またはＨ ＰＬＣを用いて実施できる。 本発明に従って得られた精製６９ｋＤ蛋白質は、ＥＬＩＳＡ試験により、該試 験の限界感度以下のＰＴおよびＦＨＡ含量を有することがわかった。ＰＴ活性（ ＣＨＯ細胞）は全く検出されなかった。ＬＳＬ−ＣＳ（リムラス・アモエボサイ ト溶解菌−色素産生基質）試験によれば、エンドトキシン濃度は０.１単位／ｍ ｃｇ蛋白質以下である。６９ｋＤ蛋白質は何ら検出可能なアデニルシクラーゼ活 性を有さず、アデニルシクラーゼについてのウェスタンブロット分析は陰性であ る。 得られた６９ｋＤ蛋白質は、ビー・ペルツッシスによる感染に対して保護抗体 応答を顕在化させるのに投与される無細胞ワクチンの抗原成分としての有用性を 有する。このようなワクチンは常法により製造してもよい。例えば、直接的使用 として、生理学的pＨに緩衝処理した水溶液中、抗原因子と適当な通常の担体と からなるワクチンを製造してもよい。また、抗原因子を従来のアジュバント、例 えば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム上に吸着させてもよい。加え て、６９ｋＤ蛋白質を包含する、１またはそれ以上のビー・ペルツッシス抗原を さらに別の免疫原と組み合わせテ１種以上の病原に対する保護誘発能を有する、 多機能性ワクチンを調製してもよい。 本発明は、特に、ビー・ペルツッシスの単一醗酵操作より、無細胞百日咳ワク チン用の、数種の蛋白質抗原候補を単離または精製する包括的な方法の一部とし ての有用性を有する。すなわち、ＰＴ、ＦＨＡおよび６９ｋＤ蛋白質は、各々、 単一百日咳ワクチンにおける配合用に、同一醗酵ブロスから純粋な形態にて単離 できる。ビー・ペルツッシス醗酵ブロスを、適当には、ＥＰ−Ａ−０ ４２７ ４ ６６に記載の方法に従って処理し、ＰＴおよびＦＨＡを単離し、残りの上清を本 明細書の記載に従って処理し、６９ｋＤ蛋白質を得る。百日咳トキシンを、出典 明示により本明細書の一部とするＷＯ９１／１２０２０に記載の方法に従ってト キソイド化してもよい。別々に精製した抗原成分を別々にアジュバント処理に付 し、その後、プールしてもよい。 細胞結合した蛋白質の抽出およびフロキュレート化剤、好ましくは二価カチオ ンを添加することによるエンドトキシンの溶液からの除去は、ボルデテラ・ペル ツッシスのような病原性ボルデテラ菌からの、ペルタクチンのような外層膜蛋白 質の単離に限定されない。本発明の方法は、予防または治療用外層膜蛋白質の産 生を包含するいずれの生物学的方法においても有用性を有する。本発明から利益 を得る他の生物学的方法の典型例は： ａ）ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）のような メニンジティディス種からの外層膜蛋白質の生成 ｂ）エシュリキア・コリ（Escherichia coli）からのポリ線毛および凝集原 の生成 ｃ）ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）のようなヘ モフィルス種からの外層膜蛋白質の生成 ｄ）ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）のようなボレリ ア種からの外層膜蛋白質の生成、および ｅ）Ａ群およびＢ群ストレプトコッカスの菌株のようなストレプトコッカス 種からの外層膜蛋白質の生成。 本発明の方法に従って得ることができる生物学的生成物は、ヒトに使用するた めの蛋白質に限定されない。利益を派生しうる他の典型的な方法は、以下の生成 に用いるための外層膜蛋白質の単離である： ｆ）ブタに感染し、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchise ptica）およびヘモフィルス・プリゥロニュウモニエ（Haemophilus pleuropneum oniae）により引き起こされる鼻炎用ワクチンの生成； ｇ）ブタに感染し、エシュリキア・コリにより引き起こされる大腸菌症用ワ クチンの生成；および ｈ）家畜動物、ウシおよびヒトに感染するレプトスピラ症に対するＥＬＩＳ Ａ試験用抗原の生成。 本発明の方法を、ボルデテラ・ペルツッシス由来の６９ｋＤ外層膜蛋白質の抽 出に関連する以下の実施例により説明するが、これに限定されるものではない。 添付図面において： 図１は精製した６９ｋＤ蛋白質に対する実施例１にて試験した４種のフロキュ レート化剤のフロキュレーション実験についての結果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示 す； 図２は精製した６９ｋＤ蛋白質に対する実施例１にて試験した４種のフロキュ レート化剤のフロキュレーション実験についての結果（ウェスタンブロット）を 示す； 図３は精製した６９ｋＤ蛋白質に対する実施例２にて試験した３種のフロキュ レート化剤のフロキュレーション実験および非フロキュレート化対照についての 結果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す； 図４は精製した６９ｋＤ蛋白質に対する実施例２にて試験した３種のフロキュ レート化剤のフロキュレーション実験および非フロキュレート化対照についての 結果（ウェスタンブロット）を示す； 図５は実施例３にて記載した塩化バリウムでのフロキュレーション実験につい ての結果（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す；および 図６は実施例３にて記載した塩化バリウムでのフロキュレーション実験につい ての結果（ウェスタンブロット）を示す。 実施例１ フロキュレーション実験 ビー・ペルツッシス・トハマ株を調整した醗酵槽条件下に培養し、上清からＰ ＴおよびＦＨＡをヒドロキシリン石灰ゲル上に吸着させることによって抽出する のに十分な量の細胞の懸濁液を得た。残りの細胞懸濁液を以下の工程に付した： １）懸濁液を４℃に冷却し、５０ｍｌの試料アリコートに分けた。 ２）以下に示すフロキュラントのうちの１つを各試料に添加し、次の最終濃度 を得た：デキストランＴ５００（１０ｇ／Ｌ）、塩化カルシウム（１０ｇ／Ｌ） 、メタノール（２０％）およびポリエチレングリコール５００００（１０ｇ／Ｌ ）。 ３）各試料を激しく混合し、同時にpＨを所定の値（デキストランＴ５００、p Ｈ５；塩化カルシウム、pＨ４および９；メタノール、pＨ６；ポリエチレングリ コール５００００、pＨ５）に調整した。ついで、該試料を４℃で混合すること なく放置してフロキュレート化した。 ４）上清をデカントし、１２５ｍＭの濃度の等容量のＴＲＩＳ緩衝液と置換し た。再懸濁の後、該試料を加熱し、水浴中、６０℃に１時間維持した。各試料を 定期的（５分毎）に振盪し、等温分布させた。 ５）攪拌することなく４℃に冷却した後、死菌細胞を再フロキュレート化した 。遠心分離に付した後、各試料からの上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、ウェスタン ブロット法およびＥＬＩＳＡ法により６９ｋＤ蛋白質の存在についてだけでなく 、ＬＡＬ−ＣＳ試験法を用いてエンドトキシン汚染の存在についても試験した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびウェスタンブロット法の結果を、各々、図１および 図２に示す。容量１５および４５μＬに対応する、２本の隣接するレーンを用い 、各試料（一のフロキュラントに対応する）を該ゲルおよび該ブロットに付した 。残りの３本のレーンには５５ｍｇ／Ｌの濃度の精製した６９ｋＤ蛋白質のプー ルから連続的に増加する容量（６.８、１３.６および２７.２μＬ）を装填した 。該ゲルおよびウェスタンブロットにおけるレーンについての凡例を以下の表に 示す： ＥＬＩＳＡおよびＬＡＬ−ＣＳ試験の結果を以下の表に示す： 図１および２は複数の試料における６９ｋＤ蛋白質の存在および位置を示す。 ６９ｋＤ蛋白質の存在は上記表２に示されるＥＬＩＳＡ試験の結果より確認され る。 pＨ４および９の両方のＣaＣl₂でフロキュレーションが生じるが、ゲルに関す るレーン５および６（図１）は、pＨ９のＣaＣl₂で処理した後に、上清中に存在 するエンドトキシンの濃度が著しく低下することを示す。このことを上記表２に 示されるＬＡＬ−ＣＳ試験の結果によって確認した。 実施例２ 二価カチオンの選択 実施例１に記載の方法論を用いるフロキュレーション実験を、以下のハライド 塩（１０ｇ／Ｌの濃度およびpＨ９）：塩化カルシウム、塩化バリウムおよび塩 化ストロンチウムを用いて実施した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法の結果を、各々、図３および４ に示す。最初の３本のレーンには５５ｍｇ／Ｌの濃度の精製した６９ｋＤ蛋白質 のプールから連続的に増加する容量（６.８、１３.６および２７.２μＬ）を装 填した。最後のレーンには細胞懸濁液の非フロキュレート化した対照試料を装填 した。該ゲルおよびウェスタンブロットにおけるレーンについての凡例を以下の 表に示す： ＥＬＩＳＡ試験の結果を以下に示す： 図３および４はすべての試料における６９ｋＤ蛋白質の存在および位置を示す 。対照試料（レーン７）にて観察される６９ｋＤ蛋白質バンドは、実質的に、二 価カチオンでフロキュレート化した試料（レーン４、５および６）で観察される バンドほど密でなく、それは非フロキュレート化試料からの上清中の６９ｋＤ蛋 白質が実質的に低濃度であることを示す。 表４のＥＬＩＳＡ試験にて得られる低い６９ｋＤ蛋白質濃度は、ストロンチウ ムがカルシウムまたはバリウムほど効果的なカチオンではないという印象を与え るが、ゲル（図３）またはブロット（図４）においてもこのような観察は反映さ れなかった。 しかしながら、カルシウムまたはバリウムのいずれかでフロキュレート化した 試料の上清において観察される６９ｋＤ濃度は、ＥＬＩＳＡ試験においては実質 的に等しく、ゲルおよびブロット法においても同様の強度の６９ｋＤ蛋白質バン ドが得られた。 フロキュレーション速度およびフロキュレート化物の形態に関して、視覚観察 した場合、フロキュレーション工程は、バリウムがカルシウムまたはストロンチ ウムよりもわずかに効果的であった。 実施例３ フロキュレーションおよび洗浄操作 フロキュレーションおよび洗浄を以下の操作を用いて実施した： １）ＰＴおよびＦＨＡを抽出した後の残りの細胞懸濁液を４℃に冷却し、４つ の試料アリコート（５０ｍｌ）に分けた。１の試料を対照として取っておいた。 ２）塩化バリウムを残りの３つの試料に加えて１０ｇ／Ｌの最終濃度を得、各 懸濁液をそのpＨを適当な塩基を用いて９に調整しながら激しく混合した。 ３）ついで該懸濁液を４℃で混合することなく放置してフロキュレート化した 。 ４）上清をデカントして各ペレットを分離し、３種の濃度のＴＲＩＳ緩衝液（ １２５、５０または２０ｍＭ）を各ペレット（ペレット当たり１の濃度）に加え 、５０ｍｌの最終容量とした。 ５）再び懸濁させた後、その３種の試料を４℃で混合することなく再び放置し てフロキュレート化した。 ６）前記の４）および５）に示される操作を必要ならば数回繰り返し、塩化バ リウムの濃度が約０.２ｇ／Ｌ以下になるまで希釈した。 ７）対照試料を１０,０００ｘｇで１時間遠心分離に付し、上清をデカントし て等容量のＴＲＩＳ緩衝液（１２５ｍＭ）と置換した。 ８）最後に所望の濃度のＴＲＩＳ緩衝液中に再び懸濁させた後、試料（対照を 包含する）をすべて加熱し、水浴中、６０℃に１時間維持した。各試料を周期的 （５分毎）に振盪して等温分布させた。 ９）すべての試料を攪拌することなく４℃に冷却した後、塩化バリウム含有の 試料中の死菌細胞を再び懸濁させ、対照試料中の死菌細胞を１０,０００ｘｇで １時間再び遠心分離に付した。 １０）各試料（対照を包含する）からの上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタン ブロットおよびＥＬＩＳＡにより６９ｋＤ蛋白質の存在について試験した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットの結果を、各々、図５および６に 示す。容量１５および４５μＬに相当する、２本の隣接するレーンを用い、各試 料をゲルおよびブロットに付した。ゲルおよびウェスタンブロットにおけるレー ンについての凡例を以下の表に示す： ＥＬＩＳＡ試験の結果を以下の表に示す： 図５および６は、すべての試料における６９ｋＤ蛋白質の存在および位置を示 す。６９ｋＤ蛋白質の存在を前記表６に示されるＥＬＩＳＡ試験の結果から確認 した。 前記した繰り返しフロキュレーションおよび洗浄工程に付した懸濁液の上清に 見られる６９ｋＤ蛋白質の濃縮物の存在および類似性は、この技法を適用するこ とにより得られる懸濁ブロスのイオン強度の主たる減少がビー・ペルツッシスか らの６９ｋＤ蛋白質の抽出および収量に悪影響を及ぼさなかったことを示した。 加えて、上清中、約０.２ｇ／Ｌと低濃度の塩化バリウムのフロキュラントと しての有効性が証明された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，Ｔ Ｊ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 コンバーバッチ，マーティン ベルギー国ベー―1330リクセンザルト、リ ュ・デュ・ランスティテュート89番 スミ スクライン・ビーチャム・バイオロジカル ス（ソシエテ・アノニム) (72)発明者 レランツ，ピエート ベルギー国ベー―1330リクセンザルト、リ ュ・デュ・ランスティテュート89番 スミ スクライン・ビーチャム・バイオロジカル ス（ソシエテ・アノニム) (72)発明者 ペトレ，ジャン ベルギー国ベー―1330リクセンザルト、リ ュ・デュ・ランスティテュート89番 スミ スクライン・ビーチャム・バイオロジカル ス（ソシエテ・アノニム)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．加熱処理によって宿主細胞から蛋白質を放出させることからなる細菌原の 細胞結合した外層膜蛋白質の強化された単離方法であって、該細胞結合した蛋白 質の懸濁液を加熱処理前にフロキュレート化剤と接触させることを特徴とする蛋 白質の強化された単離方法。 ２．細胞結合した蛋白質がボルデテラ、ヘモフィルス、エシュリキア、ストレ プトコッカスまたはボレリア種の外層膜蛋白質である請求項１記載の方法。 ３．外層膜蛋白質がボルデテラ・ペルツッシスの６９ｋＤ蛋白質である請求項 ２記載の方法。 ４．フロキュレート化剤が二価カチオンを含む物質である請求項１〜３記載の いずれか１つの方法。 ５．フロキュレート化剤がバリウム、カルシウムまたはストロンチウム塩であ る請求項４記載の方法。 ６．塩がハライドである請求項５記載の方法。 ７．塩が塩化物である請求項６記載の方法。 ８．塩が塩化バリウムである請求項７記載の方法。 ９．細胞結合した蛋白質をpＨが４〜１０の範囲にある上清に懸濁させる請求 項１〜８記載のいずれか１つの方法。 １０．細胞結合した細菌原の外層膜蛋白質からなる無細胞ワクチンであって、 該蛋白質が、宿主細胞の懸濁液をフロキュレート化剤と接触させ、つづいて加熱 処理に付すことにより該宿主細胞より放出されることを特徴とする無細胞ワクチ ン。