KR830002915B1 - 비병원성의 호기성 코리네박테리아로 부터 수용성 추출물을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

비병원성의 호기성 코리네박테리아로 부터 수용성 추출물을 제조하는 방법

제1a도는 세파덱스 G-200겔중 본 발명 추출물의 용출양상으로 나타내는 그래프이다.

제1b도는 Ultro Gel ACA 34 중 본 발명 추출물의 용출양상으로 나타내는 그래프이다.

제2도는 본 발명 추출물의 반응성 항체 생성억제효과를 나타내는 그래프이다.

제3도는 겔침전(Ouchterloney법)에 의한 교차 반응성 항원성을 나타낸다.

제4도는 본 발명 추출물의 항 보체 효과를 나나태는 그래프이다.

본 발명은 비병원성의 호기성 코리네박테리아로 부터 수용성 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

더욱 특히 본 발명은 비병원성의 호기성 박테리아로 부터 다음 특징을 지닌 수용성 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다;

a) 단백질 함량 : 3.9-5.5mg/ml(소의 혈청 알부민(BSA)에 대해)

b) 당성분 : 0.41-0.52mg/ml(글루코즈에 대해)

c) 핵산양 물질 : 260nm/280mn(비율)에서의 광학밀도 1.56-1.62

d) 등전점 : 3.75-3.80

최근 여러 보문중에 코리네박테리움파붐과 같은 혐기성 코리네박테리아의 배양액(세균 세포)과 이들 코리네박테리아세포로 부터의 추출물은 항종양효괌 치 감염 예방효과를 지니고 있다고 보고되어 왔으나 호기성 코리네박테리아세포의 배양액에 대해서는 보고가 없었다. 발명자들은 비병원성의 호기성 코리넥박테리아에 속하는 세균균주를 배양하여 얻은 배양액(세균 세포)은 항종양 효과 및 비장세포와 림파구에 대한 명역증강 효과를 지닐뿐만 아니라 혐기성 코리네박테리아의 배양액에서는 밝혀지지 않은 항알러지 효과도 지니고 있음을 이미 알고 있었다(일본구 특허공보(OPI) 제47,909/77호).

그러나, 전술된 배양액(세균 세포)은 실제 다음의 이유로 인해 약물로서는 사용이 부적합하다. 배양액(세균 세포)은 물에 불용이므로 현탁액으로 투여해야 한다. 이 현탁액을 피하투여하면 BCG 피하주사시와 같이 주사부위에 정결을 일으킨다. 이러한 피부 부작용은 계속 수회 투여시 불내성을 일으킨다. 이러한 실질적 어려움은 물물 배양액(세균세포)은 강한 독성을 나타낸다.

본 발명의 수용성 추출물은 항종향효과, 면역증강 효과 및 특히 강한 항알러지효과를 지님을 물론 일차배양액(세균세포)에 비해 매우 독성이 약하다. 또한 본 발명의 활성물질은 물에 용성이므로 또한 피하 또는 피내로 피부에 경결을 야기하지 않고 다회 주사할 수 있으므로 알러지 질환에 중요 요법인 탈감작 요법에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 수용성 추출물은 실제 약물로서 사용될 수 있다. 본 발명에 수용성 추출물의 구조적 조성이 명확하지는 않지만 추출물이 단백질, 당 및 핵산양 물질을 일정비율로 함유하는 당단백임을 틀림없다.

하기 기술된 단백질과 당에 대한 함량시험 결과에 의해 계산된 당성분 1부에 대한 단백질함량비는(페이지 9의 표)는 3.9/0.52 내지 5.5/0.41 즉 7.50 내지 13.42부이다. 따라서 비율을 변화시키지 않는한 추출물을 희석시킨 상태로 사용하는 것은 물론 본 발명의 범위내에 포함된다.

비병원성의 호기성 코리네박테리아에 속하며 본 발명에서 사용되느 세균 균주로서는 코리네박테리움 에퀴 Ko-85 균주, 코리네박테리움 파이오젠 토요 하이균주, 코리네박테리움 제로시스 53-K-1 균주 및 코리네박테리움 레날레 어트수노미야-우시균주 등이 있다. 이들 균주는 본 분야의 숙련자들에게 손쉽게 유용되고 있으며 또한 Medical Research Institute of Tokyo University에 표준 균주로서 보관되어 있다.

본 발명에서 사용되는 특히 바람직한 세균균주는 코리네박테리움 에퀴 Ko-85 균주이다. 이들 비병원성의 호기성 코리네박테리아의 배양액(세균 세포)은 하기의 참조실시예에 기술된 바와 같이 코리넵작테리아 세포 호기배양에 통상 사용되는 방법에 따라 코리네박테리아를 호기 배양하여 얻을 수 있다.

따라서 얻어진 일차 배양액을 처리함으로써 본 발명의 수용성 추출물이 제조된다. 즉 배병원성이 호기성 코리네박테리아에 속하는 세균 균주를 호기배양하여 얻어진 배양액(세균 세포)을 저온처리하여 배양액(세균 세포)을 분쇄 및 균질화시키고, 얻어진 균질물을 초음파 처리하여 유효성분을 분리시킨 후, 유효성분의 수용액 pH를 3.7 내지 3.75로 조절하여 침전물을 생성시키고, 침전물의 수용액을 거의 중성화하여, 이 수용액을 투석함으로써 수득된다. 얻어진 추출물은 통상의 방법에 따라 동결건조하여 분말상 고체 생성물로 변환시킨다. 상기 기술된 추출물의 제조방법은 통상의 방법에 따라 시행한다.

본 발명의 수용성 추출물은 항알러지효과, 항종양효과 및 면역증강효과를 지니며 특히 항알러지제로 유용하다. 그리고 하기에 밝혀진 실험결과에 의해 본 발명의 수용성 추출물이 탁월한 약물학적 작용을 지니며 독성을 미약하다는 것이 명백해졌다.

본 발명은 또한 상기에 기술된 수용성 추출물이 배합이 가능하고 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제 한가지 이상과 배합 함유된 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물을 경구, 직장 또는 비경구나 분무제로 투여될 수 있다. 인체용법시 용량은 원하는 효과를 나타내는 양이다. 용량은 성인 환자의 경우 1일 10ng 내지 500㎍이다.

본 발명을 제한의 의미를 갖지 않는 다음의 실시예에서 더욱 기술한다.

참조 실시예(일차 배양액(세균 세포) 제조) :

코리네박테리움 에퀴 Ko-85 균주를 육즙 10g, 글루코즈 10g, 염화나트륨 1g 및 재증류수 1000ml의 혼합물을 수산화나트륨수용액으로 pH 7.4로 조절하여 제조한 배지를 사용하여 37℃에서 5일간 배양한다.

50ml/분의 유동속도 및 10,000rpm에서 계속 원심분리시킨 후 생성된 침전물(세균 세포)을 염화나트륨 등 장액으로 3회 원심분리 세척하여 일차 배양액(세균 세포)을 얻는다.

제조된 배양액(세균 세포)의 수득량은 사용된 배치 10ℓ당 17.0g(습식중량)이다.

탁도 측정에 의해 참조 실시예에서의 배양액 수득량과 배양시간과의 관계가 다음 표에서와 같이 밝혀졌으며 여기서 배양후 약 120시간에 수득량이 최대가 되는 것으로 나타났다.

[제조실시예 1]

일차 배양액(세균 세포) 50g을 염화나트륨등장액으로 충분히 세척한 후 배양액을 -20℃에서 48시간 이상 저온 처리하여 세균세포를 비브로겐 세포분쇄기(VCH-1)로 분말화한다. 생성된 균질물을 물이나 희수산화나트륨 수용액 적량에 현탁시켜 빙수중에서 각기 10분간 6회 20KC초음파 처리한 후 현탁액을 진탕시켜 추출한다. 얻어진 추출물 150g을 105,000g에서 60분간 원심분리하여 세균 세포잔류물 및 불용성물질을 제거한다.

생성된 상등액을 25% 습식 중량 세균세포 농도로 조절하여 이의 pH를 1N 염산으로 8 내지 10℃에서 3.7 내지 3.75로 정확히 조절한 후 침전물을 48시간이상 배양시킨다. 침전물을 원심분리하여 포집하고 pH를 7.2에서 물에 용해시키고 용액을 밤새 투석시킨 후 시스템의 pH를 7.0으로 조절하여 12,000g에서 60분간 원심분리하여 상등액(추출물)을 분리시킨 후 동결 건조시킨다. 생성물의 수득량은 500mg(건조중량)이다.

생성물의 물리화학적 특징은 다음과 같다 :

A. 성질 :

추출물의 외형은 연황갈색 투염용액이다. 추출물으 pH을 3.75 내지 3.80으로 조절하면 침전물이 생서이된다.

B. 함량 :

3개의 시험표본물(추출물)을 상기에 기술된 방법으로 분리 제조하여 각기 No. 1, No. 2 및 No.3로 한다. 이들 시험 표본물의 함량은 다음 표와 같다.

^*1 : 단백함량(카퍼-폴린법)

추출물을 물로 희석하여 추출물의 용적이 10배가 되도록 하고 하기 용액C 3ml를 이 희석액 0.6ml에 가한 후 10분간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 페놀용액(시판품을 물로 희석하여 제조한) 0.3ml를 반응 혼합물에 가하고 혼합물을 실온에서 30분간 방치시킨 후 500nm에서 광학밀도(OD)를 측정한다. 0.2 내지 1.0mg/ml 농도범위에서 BSA에 의한 표준곡선을 만들어 이 표준곡선으로부터 추출물중의 함량을 측정한다.

용액 A : 0.1N 수산화나트륨용액에 탄산타트륨을 2% 농도로 가한다.

용액 B : 10% 나트륨 사이트레이트용액에 커퍼 설페이트를 0.5% 농도로 가한다.

용액 C : 용액 A 50ml와 용액 B 1ml(50 : 1)의 혼합물

^*2 : 당성분(황산 페놀법)

추출물을 물로 희석하여 추출물의 용적이 10배가 되도록하고 5% 페놀용개 1ml 및 황산 5ml를 희석액 1ml에 즉시 가한다. 혼합물을 20분간 방치시킨 후 490ml에서 광학밀도(O.D)츨 측정한다. 0.02 내지 0.2mg/ml의 농도범위에서 글루코즈수용액에 의한 표준곡선을 만들어 표준곡선으로 부터 추출물중의 함량을 측정한다.

^*3 : 핵산양 물질

추출물을 물로 희석하여 추춤룰의 용적이 20배가 되도록 하고 260nm와 280nm에서의 광학밀도(O.D)를 그 비율을 계산한다.

세파덱스 G-20겔중에서 본 발명 추출물을 용출할 경우 제1a도에서와 같이 단일 피크가 나타났다.

배드용적은 3.0×60cm²이고 용출완충제는 0.01M포스페이트완충제이고 용출속도는 20.8ml/시간이다.

종축은 280nm에서의 광학밀도를 나타내고 횡축은 용출용적(ml)을 나타낸다.

또한 본 발명 추출물의 Ultrogel ACA 34 중의 용출양상을 제1b도에 나타냈다.

칼럼 크기는 2.8×84cm², 용출완충제는 0.01M 포스페이트완충제 (0.85% 염화나트륨함유), 용출속도는 14.0ml/시간이다. 종축은 280nm에서의 광학밀도를 나타내고 횡축은 용출용적(ml)을 나타내며 화살표 1은 소의 r-글로블린(분자량 : 160,000)의 위치를 나타내고 화살표 2는 대두 트립신억제제(분자량 : 21,700)의 위치를 나타낸다.

[제조실시예 2]

일차 배양액(세균 세포) 152g을 -20℃에서 48시간 동안 저온 처리한 후 배양액(세균 세포)을 0.1mm직경의 유리알과 함게 정류수에 현탁시키고 현탁액을 비브로겐 세포분쇄기(VCH-1)로 4500rpm으로, 0℃에서 30분간씩 10회 처리하여 세균세포를 분쇄 및 균질화시킨다.

생성된 상등액을 1,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 빙수중에서 15분간 20KC에서 초음파 처리하여 3000rpm에서 20분간 원심분리시킨 후 16,000rpm(20,000g)에서 40분간 원심분리시켜 세균 세포 잔류물 및 불용성물질을 제거한다. 상등액을 25% 습식중량 세균세포 농도로 조절하여 그의 pH를 1N 염산으로 4℃에서 3.70으로 정확히 조절한 후 밤새 방치하여 완전히 침전시킨다. 침전물을 5,000rpm에서 30분간 원심분리하여 포집하여 1N 수산화나트륨으로 pH을 7.0으로 조절한 후 증류수에 용해시킨다. 이 용액을 4℃에서 증류수로 밤새 투석한 후 동일온도에서 2일간 염화나트륨 등장액으로 투석하고 pH를 7.0으로 조절하여 16,000rpm(20,000g)에서 40분간 원심분리한다. 상등액을 막여과기(밀리포아 HA)로 여과하여 추출물 약 500ml을 수득한 후 이들 동결건조시킨다.

본 발명의 추출물에 대한 약물학적 시험 및 독성 시험 결과를 하기에 나타냈다 :

A. 이듀노글로블린 E(I_gE) 항체에 대한 억제효과 : 염화나트륨 등장액에 수산화 알루미늄겔과 함께 DNP-OA2㎍을 현탁시켜 현탁액을 BALB/C 마우스에 복강내 투여한 후 본 발명 추출물 600㎍을 면역후 2일 및 7일에 투여한다. 면역 후 5,10,15,20,25 및 30일에 동물로 부터 혈청을 채취하여 이 혈청을 SD 쥐의 등부분에 피부 감작에 사용한다. 4시간 후 항원, 즉 0.5% 에반스 블루를 함유하는 DNO-BSA 용액을 꼬리 정맥에 주사하고 I_gE 역가를 반응 부위에서 추출된 염료의 양으로 측정한다.

그 결과를 도표 2에 나타낸다.

즉 도표 2는 본 발명 추출물에 의한 반응성 항체 생성 억제표과를 나타낸다.

DNA-OA 감작된 BALB/C 마우스를 3그룹으로 나누어 감작후 2및 7일에 그룹 1마우스(▲-▲)는 본 발명 추출물로 접종시키고 그룹 2 마우스(△-△)는 호기성 코리네박테리움 파붐의 사균 세포로 접종시키고 그룹 3마우스(○-○)는 생리 식염수로 접종한 후 이들의 I_gE 항체 생성에 대한 처리효과를 시험하였다.

종축은 I_gE 항체 역가를 나타내고 횡축은 DNP-OA 감작후의 날짜를 나타낸다.

도표 2에 밝혀진 결과로 본 발명 추출물이 알러지 반응을 즈4시 유도하는 I_gE 항체생성을 억제시킨다는 것이 밝혀졌다.

B. 국소치료에 의한 수동적 피부 아나필락시스(PCA) 억제 효과 :

SD 쥐의 피부를 본 발명 추출물로 미리 처리한 2시간후 쥐의 동일 피부 부위에 항-DNP(불완전 항원) I_gE 항체를 접종시키고 수동적 피부 아나필락시스(PCA)를 행해 본 발명 추출물의 억제 효과를 확인한다.

그 결과를 표 Ⅰ

[표 Ⅰ]

(특기사항) : 상기표중 괄호안의 숫잔는 PCA 반응에 대한 억제율을 나타낸다.

표에서 밝혀진 바와 같이 본 발명 추출물은 표적세포(비만세포, 호염기성 세포등)에의 I_gE 항체 결합을 차단하고 항원 침입시 히스타민의 유리를 억제시킨다.

C. 전신 치료에 의한 수동적 피부 아나필락시스(PCA) 억제효과 :

감작시킨 후 치료하는 것 보다 I_gE항체 감작전 본 발명 추출물로 처리하는 경우에 PCA 억제효과가 더욱 현저하였다.

그 결과를 다음 표에 나타내며 처리시 사용된 본 발명 추출물의 양은 1.0mg이고 PCA 치는 추출된 염료량으로 나타냈다.

[표 Ⅰ-B]

(특기사항) : 괄호안의 숫자는 대조군과 비교된 비율이다.

상기 기술된 실험결과로 본 발명 추출물이 비만세포난 호염기성 세포가 I_gE 항체와 결합하여 항원을 감작시킴으로써 일어난 수동적 피부 아나필락시스를 항원이 종류에 관계없이 억제신키고 또한 알러지반응을 광범위하게 억제시킨다는 것이 밝혀졌다.

D. 항합텐 IgG(IgM) 항체 생성 증가효과 :

본 발명 추출물을 7주된 BALB/C 마우스에 0.1mg 정맥내 주사한 ㅎ 이 마우스를 면역 후 7 및 14일에 DNP-OA 100㎍으로 정맥내 감작시킨다. 3일 후 비장세포내의 항체형성 세포의 수를 DNP-BSA로 감작된 양의 적혈구를 사용하는 컨닝햄의 직접법에 의해 측정한다. 그 결과를 표 Ⅱ에 나타낸다.

표 Ⅱ 항합텐 IgG(IgM) 항체 형성 세포수의 증가

표 Ⅱ에서 밝혀진 바와 같이 본 발명의 추출물은 항합텐 IgG(및 IgM)항체 생성을 증가시킨다.

그러므로 본 발명 추출물이 면역 활성효과를 지니고 있으며 알러지 항체 이외의 항체 생성이 증가될 수는 있으나 감소되지는 않는다는 것은 명백하다.

E. 항원 교차 반응 :

항원 교차반응을 겔침전반응(Ouchterloney법)에 의해 측정한다.

토끼 항코리네탁테리움 에퀴 항혈청과 토끼 항투베르쿨린 항 혈청을 사용하여 항원으로서 각기 10mg/ml로 조절된 본 발명의 추출물과 PPD 용액(TA₂)으로 Ouchetrloney범에 따라 겔 침전반응르 시행한다. 그 결과를 도표 3에 나타낸다

도표 3은 PPD 용액(B)과 본 발명 추출물(C)의 항 코리네박테리움 에퀴 토끼 항혈청(A)에 애한 융합된 침전선을 왼쪽에 표시하였고 또한 오른쪽에는 토끼 항투베르쿨린 항혈청(D)의 PPD용액(B) 및 본 발명 추출물(C)에 대한 교차 반응성 항원성을 나타낸다

도표 3에서 밝혀진 결과로 부터 본 발명의 추출물이 PPD와 항원성 교차반응을 지니고 있음이 명백해졌다. 따라서 본 발명의 추출물은 투베르쿨린 요법에 더욱 안정된 형태로서 사용될 수 있다.

F. 항보체효과 :

SD 쥐의 혈청을 여러 농도의 본 말명 추출물과 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 항-SRBC 항체로 감작된 양적혈구를 사용하여 보체의 잔류 용혈작용을 측정하였다. 그 결과를 도표 4에 밝힌다.

도표 4에서 밝혀진 바와 같이, 양저기혈구의 용혈반응 억제비율에 의해 본 발명 추출물이 현저한 항보체 효과를 지님이 확인된다. 그러므로 본 발명의 추출물은 비특이적 알러지 반응을 억제시키는 것으로 생가된다.

도표 4는 본 발명 추출물의 항보체 효과를 나타낸다. 횡측은 본 발명 추출물의 첨가량(㎍)을 나타내고 종측은 용혈반응 억제율(%)을 나타낸다.

G. 독성 :

본 발명 추출물과 그의 일차 배양액(세균세포)을 복강내 투여할 경우 급성독성은 다음과 같다.

일차 배양액(세균 세포)은 물에 불용이므로 수용성 현탁액으로써 투여한다.

본 발명 추출물 LD₅₀>20mg/마우스

일차배양액(세균세포) LD₅₀5mg/마우스

상기 기술된 실험 결과로 본 발명 추출물이 추출용의 일차 배양액(세균 세포)에 비해 매우 미약한 독성을 지니고 있음은 명백하다.

또한 말초 백혈구 수에 관한 효과 및 마우스의 체중증가 효과를 일반시험법에 의해 시험한 겨로가 본 발명 추출물로는 아무런 이상이 없었다(참조 : Minimum Requirement of Biological Products(1973) : Mininst. of Healt and Welfare Japan-3 General Testing Method-).

[처방 실시예]

본 발명 추출물(동결 건조품) 5mg/ml의 수용액을 제조하여 염화나트륨 등장수용액으로 100배 용적으로 희석하고 희석용액 각 1ml씩을 앰플에 충진시킨다.

본 발명의 주사제 용량은 통상의 탈감작 요법에 따라 매회 0.1 내지 0.8ml를 일주에 1 내지 2회 피하주사하는 것이다.

Claims (1)

1. 비병원성의 호기성 코리네박테리아에 속하는 균주를 호기 배양하여 얻은 배양액(세균세포)을 저온 처리하여 배양액을 분쇄 및 균질화시키고, 얻어진 ㄱ균질물을 초음파처리한 후, 얻어진 유효성분의 수용액의 pH를 3.7 내지 3.75로 조절하여 침전물을 생성시키고, 침전물을 거의 중성 수용액으로 하여 투석시키며 경우에 따라 투석된 생성물을 동경건조시킴을 특징으로 하여 비병원성의 호기성 코리네박테리아로부터 수용성 추출물을 제조하는 방법.

Images