JPS63101492A - アルカリプロテア−ゼ含有液体洗浄剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

夜亙分立 本発明は、優れた洗浄力を有し、かつ、酵素安定性の良
好な、新規アルカリプロテーゼを含有する液体洗浄剤組
成物に関する。 災米艮亙 従来、衣類の汚れに対する洗浄力をより向上させた洗浄
剤組成物を得るために、アミラーゼ、プロテアーゼ、セ
ルラーゼなどの酵素を配合することがよく知られている
（特公昭４７−４５８０２号公報、同４８３０６４６号
、特開昭４７−３７３３号公報、同５２−１２８９０４
号公報、同５３−５６２０４号公報、同５６−１２９２
９８号公報）。その中でも特にバチルス属（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）から生産されるアルカリプロテアーゼが一般に
使用されており、ノボ・インダストリー社の「アルカラ
ーゼＪ　（Ａｌｃａｌａｓｅ）、「エスペラーゼＪ（Ｅ
ｓｐｅｒａｓｅ）、　ｒサビナーゼ」（Ｓａｖｉｎａｓ
ｅ）、ギスト・ブロカーズ社の「マキサターゼＪ　（Ｍ
ａｘａｔａｓｓ）、ナガセ生化学工業−の「ビオプラー
ゼ」等の商品名で市販されている。 しかしながら、これら市販のアルカリプロテアーゼは、
一般に使用されているアニオン界面活性剤と併用すると
、保存時の酵素安定性に劣るという問題点を有している
。 見匪至且枚 本発明の目的は、アニオン界面活性剤と併用、されて優
れた洗浄力を発揮し、しかも保存時の酵素安定性の良好
なアルカリプロテアーゼ含有液体洗浄剤組成物を提供す
ることにある。 ２３し引毀戒。 本発明のアルカリプロテアーゼ含有液体洗浄剤組成物は
、以下の（Ａ）および（Ｂ）成分を含有することを特徴
とする。 （Ａ）一般式（１）で表わされるアニオン界面活性剤。 ＲＯ（ＣＨ２ＣＨ，○）ｎｓ　０３Ｍ　　　　　　　　
　−ＣＩ　＞（式中の各記号は次の通りである。 Ｒ：炭素数１１〜１５の直鎖もしくは分枝鎖のアルキル
基またはアルケニル 基 ｎ：２〜７の範囲の数 Ｍ：アルカリ金属またはアルカノール 置換もしくは無置換のアンモニラ ム基） （Ｂ）バチルス−ｘスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、
）Ｙ株（微工研条寄第１０２９号）から生産されるアル
カリプロテアーゼ。 以下、本発明についてさらに詳細に説明する。 （Ａ）成分として用いられるアニオン界面活性剤は、一
般式（１）で表わされるポリオキシエチレンアルキルエ
ーテル硫酸エステル塩である。 ＲＯ（ＣＨ，ＣＨ，Ｏ）、８０３Ｍ　　　　　　　　　
−（１）式中のＲは、炭素数１１〜１５の直鎖状もしく
は分枝状のアルキル基またはアルケニル基である。 Ｒの炭素数が１１未満では洗浄力が劣り、また１５を越
えると液性が劣化してくるので好ましくない。好ましい
炭素数は１２〜１３である。式中のＭは、例えばナトリ
ウムやカリウムなどのアルカリ金属、あるいはアンモニ
ウム基で、このアンモニウム基はまた１〜３個のアルカ
ノール、例えばエタノール、プロパツール等で置換され
てもよい。式中のｎはエチレンオキシド平均付加モル数
である。ｎが２未満では、酵素安定性および液の安定性
が低下し、また７を越えると泡立ち性が低下するので好
ましくない、望ましい平均付加モル数は３〜７である。 このようなポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エ
ステル塩は、例えばＣ□□〜０．の炭素鎖長を有する合
成または天然のアルキルアルコールあるいはアルケニル
アルコールに、アルカリ溶媒または酸溶媒の存在下に２
〜７培モルのエチレンオキシドを導入して付加反応させ
、得られた付加反応生成物をサルファンなどのスルホン
化剤で硫酸化したのち中和することにより容易に得るこ
とができる。 このポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル
塩の配合量は、特に限定されないが、洗浄剤組成物中に
１０〜５０重量％含有させることが好適であり、さらに
好ましくは１５〜４０重量％である。 本発明で（Ｂ）成分として用いられるアルカリプロテア
ーゼは新規な酵素であり、広く自然界よりアルカリプロ
テアーゼ産生菌を検索した結果見い出された、バチルス
属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する１菌種、バチルス・エ
スピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）Ｙ株から産生され
たものである。 バチルス・エスピー７株は、微工研条寄第１０２９号（
ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０２９）として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。また、バチルス・エス
ピー７株については、特願昭６０−１２３０２１号とし
て既に出願された出願明細書に記載されている。 以下にその菌学的詳細を説明する。 なお、菌学的性質および分類方法は、 Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ−１ｏｇｙ第８版（
１９７４）、　Ｒ，Ｅ、Ｇｏｒｄｅｎの検索表（１９７
２）に準じて行なった。ｐＨ１０の培地は、炭酸ナトリ
ウム１％を加えて調製した。温度およびｐＨに関する成
育最適範囲の測定は、温度勾配バイオフォトレコーダー
で行なった。 Ａ、形態的性質 肉汁寒天培地上で３５℃にて２日間培養したとき、以下
の形態的特徴が観察される。 １）細胞の形および大きさ： 桿菌、０．４−０．５μｍＸ１．７−１．９μｍ。 ２）多形性：なし。 ３）運動性：周鞭毛を有し運動性あり。 ４）胞子：胞子を形成し、形成途上で細胞は先端近くか
ら膨張する。成熟した 胞子はレモン型であり、大きさは、 ０．７−０．９μｍＸ１．０−１．２μｍ。 ５）ダラム染色性：陽性。 ６）抗酸性：陰性。 Ｂ、培養的性質 １）肉汁寒天平板培養： ＰＨ７，０にて生育して、円形、偏平状。 金縁のコロニーを形成する。該コロニーの表面は滑らか
で光沢有り、該周辺部は淡褐色、該中心部は半透明の淡
褐色。 ｐＨ１０，０にて生育して、円形、偏平状、金縁のコロ
ニーを形成する。該コロニーの表面は滑らかで光沢有り
、クリーム色。 ２）肉汁寒天斜面培養： ｐＨ７，０およびｐ）１１０．０にて波帯状に生育し、
光沢のあるクリーム色ないし淡褐色のコロニーを形成す
る。赤褐色の色素を僅かに生成する。 ３）肉汁液体培養： ｐＨ７，０にて生育するが、菌膜は形成しない。 ｐＨ１０，０にて生育が良好で、菌膜は形成しない。 ４）肉汁ゼラチン穿刺培養： ｐＨ７，０にて僅かに液化する。 Ｐ　Ｈ１０、０にて液化する。 ５）リドマス・ミルク ｐＨ７，０にて生育が非常に悪い。 ｐＨ１０，０にて生育する。 ミルクの凝固は見られない。培地がア ルカリ性のため、リドマスの変色は不 明・ Ｃ８生理的性質 １）硝酸塩の還元：陽性。 ２）脱窒反応：陰性。 ３）ＭＲテスト：陰性。 ４）ＶＲテスト：陰性。 ５）インドールの生成：陰性。 ６）硫化水素の生成：陰性。 ７）デンプンの加水分解：陽性。 ８）クエン酸の利用：　Ｋｏｓｅｒの培地では利用しな
い、　Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培 地では僅かに利用する。 ９）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用しない。 アンモニウム塩は利 用しない。 １０）色素の生成：水溶性の赤褐色の色素を菌体組成物
とに生産する。 １１）ウレアーゼ：陽性。 １２）オキシダーゼ：陽性。 １３）カタラーゼ：陽性。 １４）生育の温度範囲：３３ないし３５℃付近（２０な
いし４７℃）が良好。 １５）生育のｐＨ範囲：　１０．０付近（６０ないし１
２．０）が良好。 １６）酸素に対する態度：好気性下でも嫌気性下でも生
育する。 １７）Ｏ−Ｆテスト：陰性。 １ｇ）糖類から酸およびガスの生成： Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、 Ｄ−フラクトース、麦芽糖、ショ糖、 トレハロース、Ｄ−マンニット、デン プンから酸を生成するが、ガスは生成 しない。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシ ロース、Ｄ−ガラクトース、乳糖、イ ノジット、グリセリンからは酸もガス も生成しない。 Ｄ、その他の性質 １）塩化ナトリウムに対する耐性： １０％ＮａＣＱ下で生育する。 以上の性質を総括すると、まず１本菌株は、カラターゼ
陽性１通性好気性で耐熱胞子を有するダラム陽性の桿菌
であることにより、バチルス属の細菌である。 本菌株が、バチルス・アルカロフィルスに属すると思わ
れるため、理研、川越らのバチルス・アルカロフィルス
Ｎｌ１２２１（ＡＴＣＣ２１５２２）、魔５８（特公昭
４ｇ−２７９２号、５０−１６４３５号参照）、および
Ｎ１１Ｄ−６（特公昭５６−４２３６参照）と菌学的性
質を比較した０本菌株とバチルス・アルカロフィルスＮ
α２２１、　＆５８、ＮａＤ−６とは、アルカリ性の培
地（ｐＨ１０）で良く生育する点で一致するが、無機窒
素源の利用に関して、本菌株が、硝酸塩およびアンモニ
ウム塩を利用できないのに対して、上記公知の菌株らは
、利用できる。また、生育ｐ）ｌの範囲において、本菌
株がｐＨ６からＰＨ１２であるのに対して、＆２２１は
、ｐＨ７からｐＨ１１であり、嵐５８゜ＮＱＤ−６は、
ｐＨ７，５からｐＨ１１であり、上記公知の菌株は、ｐ
Ｈ７，０以下では生育できない点で異なる。 生育温度の範囲においても、本菌株が２０℃から４７℃
であり、最適温度範囲が３３℃から３５℃であるのに対
して、勲２２１は５５℃、Ｎａ５ｇは４５℃まで生育で
き、最適温度が３７℃から４０℃であり、ＮｃｉＤ−６
も最適温度が３５℃から４０℃と高く、本菌株と異なる
。また、本菌株と、糖類からの酸の生成をＮａＤ−６と
比較すると、本菌株がＬ−アラビノース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−ガラクトース、グリセリンから酸を生成しない
のに対して、ＮＱＤ−６は生成する。更に９本菌株は、
１０％食塩下でも成育し、上記公知の菌株とは区別され
る。 このように本菌株は公知のバチルス・アルカロフィルス
の菌株とは異なるが、上述の菌学的性質からバチルス・
アルカロフィルス類縁菌と判断することが妥当である。 バチルス−エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）Ｙ株
を培養して得られるアルカリプロテアーゼは、Ｙａ酵素
とＹｂ酵素との２種類であり、それぞれ特願昭６０−１
２３０２２号および特願昭６０−２８６９４４号に記載
されている。 バチルス・エスピー７株の培養は、例えば次のようにし
て行なうことができる。まず、可溶性デンプン２％、硫
酸マグネシウム０．０２％を含む液体培地と、乾燥酵母
１％、リン酸水素カリウムＯ０１％を含む液体培地とを
、それぞれ１２１℃にて２０分間別々に滅菌した後、各
２０ＩＱを５００履りの坂ロフラスコに分注し、更に滅
菌済みの炭酸ナトリウムを終濃度１％となるように該フ
ラスコに加え、５０ｍ　Ｑの培養液を調製する。該培養
液にバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ　、
　）　Ｙ株を接種し、該培養液を３０℃で１５時間培養
し、種培養液を調製する。該種培養液Ｌｏｏｍ　Ｑを同
じ組成の培地３．５　ｆｉの入った醗酵タンクに加え、
該タンクに３０℃で毎分３．５ａの空気を送りながら７
０時間通気撹拌培養して微生物液を得る。 Ｙａｐ索とＹｂ酵素との分離・製造法は第１図に示した
通りである。まず、微生物培養液を、１１００００ｒｐ
で５分間遠心分離し上清を得た０次に上清液を７０％飽
和の硫安塩析にかけた。更に得られた沈殿物を２０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ｐＨ７，
２）に溶解し、同緩衝液に対して透析し、Ｙ粗酵素（以
下、単にＹ酵素と称す）を得た。続いてＹ酵素溶液を、
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）　−５３セルロース
のアニオン交換クロマトグラフィーにかけ１０ｍＭホウ
酸緩衝液（ｐＨ０，３）で溶出させ、非吸着画分を得た
。 さらに続いて該非吸着画分を、再び７０％飽和の硫安塩
析にかけた。得られた沈殿物を再び２０ＩＩＩＭトリス
ー塩酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加。 ｐＨ７，２）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。 更にまた該溶液を、トヨバールＨＷ−５５のゲル濾過ク
ロマトグラフィーにかけ、２０ＩＩＩＭトリスー塩酸緩
衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ｐＨ７，２）で溶出させ
、活性のある両分を集めた。さらに該両分を７０％飽和
の硫安塩析にかけ、得られた沈殿物を２０ＩＩＩＭトリ
スー塩酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ｐＨ７，２）
に対して透析した。最後に変性蛋白質を除去するために
、透析後の活性画分をミリポアフィルタ−で濾過し、精
製Ｙａ酵素（以下、単にＹａ酵素と称す）を得た。 一方、得られたＹ酵素溶液をジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）　−５３セルロースのアニオン交換クロマトグ
ラフィーにかけ２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオ
ン２ｍＭ添加、ＰＨ７，２）で非吸着画分としてＹａ酵
素を溶出させた後、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む
同緩衝液を用い、直線濃度勾配で溶出し、Ｙｂ酵素の粗
両分を得た。該クロマトグラフィーの溶出曲線を第２図
に示す。 さらに続いて該ｙｂ粗画分を、再び７０％飽和の硫安塩
析にかけた。得られた沈殿物を５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。さ
らに該溶液をヘモグロビン−７ガロース、アフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーにかけ、　５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出させ、活性のある両分を集
めた。さらに該両分を７０％飽和の硫安塩析にかけ、得
られた沈殿物を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオ
ン２１１Ｍ添加、ｐＨ７，２）に溶解し、同緩衝液に対
して透析した。さらに該溶液をトヨパールＨＷ−５５の
ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、２０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（Ｃ，ａイオン２ｍＭ添加、ＰＨ７，２）で
溶出させ、活性のある両分を集めた。さらに該両分を７
０％飽和の硫安塩析にかけ、得られた沈殿物を２０＋ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ｐ）１
７．２）に溶解し、同緩衝液に対して透析し、精製Ｙｂ
酵素（以下、単にＹｂ酵素と称す）を得た。 精製済みのＹａ酵素およびｙｂｇ素を試料としたゲル濾
過クロマトグラフィーの溶出曲線を。 それぞれ第１２図および第１３図に示す。樹脂としてト
ヨバールＨＷ　−５５を用い、溶出液として２０ｍＭ）
−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，２，Ｃａイオン２ｍＭを含
む）を用い、展開を上昇法により実施した。 また、精製済みのＹａ酵素を試料とした高速液体クロマ
トグラフィーの溶出曲線を第１４図に示す１機種はウォ
ーターズＷ　Ｉ　Ｓ　Ｐ−７１０Ｂを用い、ｌ−１２５
カラムを２本直列させ、５０ｍＭリン酸緩衝液で溶出さ
せた。以上から明らかなように、Ｙａ酵素およびＹｂ＃
素は完全に精製された。 すなわち、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｐ、）Ｙ株を培養することによって得られるアルカリプ
ロテアーゼであるＹ酵素は、はＹａ酵素とｙｂ酵素との
混合物であり、その比率はＹａ酵素／Ｙｂ酵素＝９０／
１０〜５０１５０である。 次に前述した方法に従って得られたＹａ酵素、Ｙｂ酵素
およびＹ酵素について説明する。 〔１〕基質特異性 Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の作用は、蛋白質の加水分解で
ある５その酵素の基質特異性を第１表に示す。また、バ
チルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　Ｙ株
より同時に生産されるＹａ酵素およびｙｂ酵素との混合
物の基質特異性も同様に評価し、比較した。 Ａ酵素［バチルス・リケニフォルミス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｌｉｃｈａｎｉｆｏｒ＋ａｉｓ）
より単離されたアルカリプロテアーゼ（商品名アルカラ
ーゼ。 ノボ社）の活性を１００としたときの相対分解率を次の
条件で測定した。 条件：温度　　　３５℃ ＰＨ１０，５（５０■Ｍホウ酸緩衝液）反応時間　６０
分 基質温度　１％ただしヘモグロビ ンは０．４％ 酵素使用量１００Ａ　Ｐ　Ｕ／ｍＱ　　ただし卵白は５
００ＡＰＵ／ｍＱ 蛋白質分解率すなわち活性の測定は、アンソン−萩原の
変法に従った０反応後濾過した反応溶液の吸光度を２７
５ｎｍにて測定した。１分間にチロシン１μｇを遊離さ
せる酵素活性を１アル力リプロテアーゼ単位（Ａ　Ｐ　
Ｕ）とした。 この表から、Ｙａ酵素はケラチンに対して特異性が強く
、Ｙｂ酵素は卵白に対する特異性が強く、不溶性蛋白質
であるケラチンに対しては弱いことが分かる。また、Ｙ
ａ酵素とｙｂ酵素の混合物であるＹ＃索は、公知のＡ酵
素より広範な基質に対して強く作用する特徴を有する。 〔２〕至適ＰＨおよび安定ＰＨ領領 域ａ酵素およびｙｂ酵素の至適ＰＨおよび安定ＰＨ領領
域グラフ図を第３図および４図に示す。用いた緩衝液は
以下のとおりである。 （以下余白） ｌ圀櫨−−−一区明〔＝ ３．５−５．５　　　　　　　酢酸 ４．５−７．０　　　　　　　クエン酸６．０−８．０
　　　　　　　リン酸 ７．５−９．０　　　　　　　トリス−Ｈ（１８，０−
９，０ホウ酸−ＨＣβ ９．０−１０．５　　　　　　　グリシン−ＮａＯＨ９
，５−１１，０ホウ酸−Ｎ　ａ　ＯＨｌｌ、０−１２．
０　　　　　　　リン酸−ＮａＯＨ１２，０−１３，０
ＫＧ　Ｑ　−Ｎ　ａ　ＯＨ至適ｐＨを調べるに当っては
、カゼイン０．６％を含む２０ｍＭの各緩衝液に各酵素
を約４００ＡＰＵ／ｍＱとなるように加え、３５℃で１
０分間反応させ活性を測定した。至適ｐＨでの活性を１
００とするときの各ｐＨでの相対活性を求めた。 安定ＰＲ領領域調べるに当っては、　２０ｍＭの各緩衝
液に各酵素を約４００ＡＰＵ／ｍΩとなるように加え、
２５℃で２４時間インキニーベートした後、活性を測定
した。インキューベート前の活性を１００として各ＰＨ
での相対活性を求めた。第３図から分かるように、Ｙａ
酵素の至適ｐＨは１０．０ないし１２．５であり、安定
ｐＨ領域は６．５ないし１３．０である。第４図から分
かるように、ｙｂ酵素の至適ＰＨは９．０ないし１０．
０であり、安定ｐ）ｌ領域は６゜５ないし１２．０であ
る。 〔３〕至適温度及び耐熱性 Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の至適温度と耐熱性を第５図お
よび６図に示す。至適温度を調べるに当っては、基質と
して０．６％のカゼインを含むｐＨ１０，５の緩衝液に
各酵素を加え、１０分間各温度で反応させた。３５℃で
の活性を１００として各温度での相対活性を求めた。耐
熱性は次のようにして調べた。　５０ｍＭホウ酸−Ｎａ
ＯＨ１ｉｌ衝液（３５℃でｐＨ１０，５）に約４００Ａ
Ｐ　Ｕ　／　ｍ　Ｑの酵素を加え、各温度で１０分間熱
処理し、水冷した後、活性を測定した。第５図から分か
るように、Ｙａ酵素の至適温度は７０℃であり、５５℃
の温度まで活性が維持される。 第６図から分かるように、Ｙｂ酵素の至適温度は６５な
いし７０℃の範囲であり、５０℃の温度まで１００％活
性が維持される。 〔４〕紫外線吸収スペクトル Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の紫外吸収スペクトルを第７図
および第８図に示す。試料を５０ｍＭのトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）に溶かし、紫外線吸収スペクトルを
測定したところ、Ｙａ酵素は２７６ｎｍの波長で極大吸
収を示し、その波長での吸光係数Ｅ）ルは７．４と計算
された。一方、Ｙｂ酵素は２７８ｎｍの波長で極大吸収
を示し、その波長での吸光係数Ｅ）瓜は９．５と計算さ
れた。 〔５〕金属イオンの影響 金属イオンのＹａ酵素およびＹｂ酵素の活性に与える影
響を調べた。その結果を第２表および第３表に示す。２
０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，５）にＹａ
酵素またはＹｂ酵素を約４００ＡＰＵ／ｍｌを加え、更
に各種金属塩を１ｗｒＭの濃度で添加し、各所定の条件
で処理後残存活性を測定した。数値は０分の活性を１０
０としてその相対活性で表す。 （以下余白） 第２表（Ｙａ酵素） この第２表から、Ｙａ酵素は硫酸銅、硝酸銀、塩化第２
水銀、塩化カドミウムの添加により活性は阻害されるが
、塩化カルシウムの添加では活性の熱に対する安定性が
増すことが分かる。 また、第３表から、ｙｂ酵素は硫酸銅、硝酸銀、塩化第
２水銀の添加により、活性が阻害されることが分かる。 バチルス属に属する菌の生産するアルカリプロテアーゼ
は、一般にＣａ”＋によって熱安定性を増すことから、
Ｃａ２＋の効果をみるため、５ｍＭのＣａ”＋を含む５
０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（３５℃でｐＨ１０，５
）に約４００ＡＰＵ／ｍ１の酵素を加え、各温度で１０
分間熱処理し。 氷冷した後活性を測定して残存活性を求めた。 比較のため、Ｃａ２ゝを加えない条件でも同時に評価し
た。その結果を第４表に示す。数値は０分の活性を１０
０としてその相対活性で表す。 （以下余白） 第４表 Ｃａイオンの添加により、熱に対する安定性がＹａ酵素
では約５℃、Ｙｂ酵素では約１０℃向上することが分か
った。 〔６〕阻害剤の影響 Ｙａ酵素およびｙｂ酵素に対する各種の阻害剤の影響を
調べた。条件および方法は以下の通りである。５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２）でＹａ酵素を８００
ＡＰＵ／ｍｌになるよう調製した。各阻害剤を添加して
、３５℃で３０分間インキュベート後、残存活性を測定
した。値は、阻害剤無添加のものを１００とした相対活
性で示した。その結果を第５表に示す。 この表から分かるように、Ｙａ酵素およびＹｂ酵素は、
カゼインを基質とした場合、ＥＤＴＡ（エチレンジアミ
ン四酢酸）およびＰＣＭ　Ｂ　（ｐ−クロロマーキュリ
−安息香酸）、アンチパイン（Ａｎｔｉｐａｉｎ）、キ
モスタチン（Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）では活性が阻害
されないが、ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロリン酸）
およびＰＭｓＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオリ
ド）では活性が阻害されることより、活性中心にセリン
を有するプロテアーゼである。 〔７〕分子量 Ｙａ酵素およびｙｂ酵素の分子量をゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより調べた。充填剤には、トヨバールＨト５
５を用い、２０ＩＩＭトリスー塩酸緩衝液（Ｃａイオン
２ｍＭ添加、ｐＨ７，２）を溶出液とした。標準蛋白に
以下の蛋白（カッコ内は分子量）を用いて検量線を作成
した。蛋白アルブミン（４３，０００）、サーモライシ
ン（３７，５００）　、ズブチリシン（２７，６００）
、キモトリプシノーゲン（２５，７００）、ミオグロビ
ン（１７，２００）、チトクロームＣ（１１，７００）
を用いた。 検量線を第９図に示す。この方法により、Ｙａ酵素の分
子量は２１，０００、Ｙｂ酵素の分子量は４０，０００
と決定した。 〔８〕等電点 Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の等電点を等重点電気泳動法に
より調べた。カラム用担体には。 ファルマライト３−１０を用いた。Ｙａ酵素およびＹｂ
酵素の等電点電気泳動模様を第１Ｏ図および１１図に示
す。この方法によりＹａ酵素の等電点は１Ｏ１１、ｙｂ
酵素の等電点は５．１と決定した。

〔９〕アミノ酸組成 Ｙａ酵素およびＹｂ＃素のアミノ酸組成〔アミノ酸分析
器几Ｃ−２００Ａ（日本電子）使用〕を調べた。なお、
トリプトファンはアルカリ分解法、システィンは過蟻酸
酸化法により測定した。その組成を公知のプロテアーゼ
のものと比較して第６表に示す。 （以下余白） その結果、他の酵素と比べてＹａ酵素はトリプトファン
、セリン、バリンなどｙｂ酵素はトリプトファン、ヒス
チジン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、アラ
ニンなどのアミノ酸組成において顕著な相違が見られる
。 〔１０〕元素分析値 Ｙａ酵素およびｙｂ酵素の元素分析値を第７表に示す。 最後にまとめとして、Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の各種性
状をＡ酵素、バチルス属の好アルカリ性細菌の生産する
公知のアルカリプロテアーゼのもと比較して後記の第８
表に示す。 他の類似した公知のアルカリプロテアーゼ（Ｅ−１，Ｅ
−２，ＡＰＩ−２１，Ｎα２２１については第８表の注
を参照）と比較すると、至適ＰＨはＡ酵素、Ｅ−１，Ｅ
−２およびＡＰＩ−２１が１０〜１１、＆２２１が１１
〜１２であり、Ｙａ酵素は１０〜１２．５と領域が高ｐ
Ｈ側に広く、Ｙｂ酵素の至適ｐＨは９〜１０であり、Ｙ
ａ酵素と他の公知のアルカリプロテアーゼに比べて低い
。 次に、至適温度がＹａ酵素およびＹｂ酵素が７０℃付近
にあるのに対して、Ａ酵素、Ｎａ２２１は６０℃、ＡＰ
Ｉ−２１は４５〜５０℃と低く、ＩＥ−１、Ｅ−２にお
いては、７５℃とＹａ酵素およびＹｂ酵素より高く、こ
の点においても異なる。 また、Ｙａ酵素およびＹｂ酵素は５■ＭＣａ”＋イオン
存在下で、Ａ酵素、Ｎｎ２２１．　ＡＰＩ−２１の酵素
と同様に耐熱性が約５〜１０℃向上−するが、バチルス
ＮαＤ−６株（第８表の注を参照）の生産するＥ−１、
Ｅ−２はＣａ”＋イオンによる熱安定性の増大が認めら
れない点で異なる。 更に、ｙｂ酵素の分子量が４万と公知のアルカリプロテ
アーゼに比べて大きく、等電点も５．１と低いことから
も、明らかに別種のものと言える。 以上のことから本酵素は従来知られているアルカリプロ
テアーゼのいずれとも異なる。 よって本酵素を新規酵素と判断することが妥当であり、
アルカリプロテアーゼＹａおよびＹｂと命名した。 （以下余白） 本発明のアルカリプロアーゼ（Ｙ酵素）の配合量は特に
限定されないが、好ましくは、洗浄剤組成物１ｋｇ当り
５０〜１００ＯＯＡ　Ｐ　Ｕ、さらに好ましくは１００
０〜５０００Ａ　Ｐ　Ｕである。 本発明の洗浄剤組成物には、さらに洗浄力を向上させ、
また液の粘度を低下させるなどの目的でノニオン性界面
活性剤を添加することができる。このノニオン性界面活
性剤としては、例えば一般式（ＩＩ）で表わされるもの
が好適である。 Ｒ’　０（ＣＨ２ＣＨ，０）ｎＨ−（ｎ）（式中のＲ′
は炭素数１１〜１５の直鎖状または分枝状のアルキル基
またはアルケニル基、ｍは７〜２５の範囲のエチレンオ
キシド平均付加モル数である。） このノニオン性界面活性剤の配合量は、洗浄剤組成物に
対して５〜３０重量％の広い範囲で適用することができ
るが、特に５〜２０重量％の範囲が好適である。 本発明の液体洗浄剤組成物の中には、さらに必要に応じ
て任意成分を配合することができる。 任意成分としては、一般に洗浄剤組成物に用いられる増
泡剤、アルカリビルダー、キレートビルダー、酵素、蛍
光増白剤、ハイドロトロープ、防カビ剤、無機塩、色素
、香料などがあげられる。 増泡剤としては、アルキルアミンオキシド、脂肪酸アル
カノールアミドなどが挙げられる。 アルカリビルダーとしては、ケイ酸塩、炭酸塩等の無機
塩、トリエタノールアミン、ジェタノールアミン等のア
ルカノールアミン等が挙げられ、これらのアルカリビル
ダーはそれぞれ単独で用いてもよいし、２種以上組合せ
てもよく。 その配合量は１〜３０ｗｔ％が適当であり、好ましくは
５〜２０ｗｔ％である。 キレートビルダーとしては、オルソリン酸塩、ピロリン
酸塩、トリポリリン酸塩、メタリン酸塩、ヘキサメタリ
ン酸塩等のリン酸塩；ニトリロ三酢酸、エチレンジアミ
ン四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、
ジエチレントリアミン五酢酸等のアミノカルボン酸また
はこれらの塩；クエン酸、ジグリコール酸、リンゴ酸、
シュウ酸、酒石酸、コハク酸などの多価カルボン酸また
はこれらの塩；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ア
クリル酸共重合体、ポリマレイン酸、ポリフマル酸、無
水マレイン酸共重合体などの高分子電解質またはこれら
の塩；ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール
、カルボキシメチルセルロースなどの非電解離高分子；
一般式 （ＩＶ）で表わされる結晶性または無定形アルミノケイ
酸塩が挙げられる。 ｘ　（Ｍ、○又はＭ’　０）−ＡＩ２２０３−、ｙ（Ｓ
ｉ０２）−Ｗ（Ｈ２Ｏ）・・・（ＩＶ） （式中のＭはアルカル金属、Ｍ′はカルシウムラムと交
換可能なアルカリ土類金属、Ｘ、ｙ、ｗは各成分のそれ
ぞれのモル数を表わし、一般的には、Ｘは０．７〜１．
５　ｙは１〜３、Ｗは任意の数である。） これらキレートビルダーは、単独であるいは２種以上組
合せて用いられ、洗浄剤組成物中に好ましくは１〜３０
ｖｔ％、さらに好ましくは５〜２０ｗｔ％配合させる。 蛍光増白剤としては、４゜４′−ビス（２−スルホスチ
リル）−ビフェニル塩、４，４′−ビス（４−クロロ−
３−スルホスチリル）−ビフェニル塩、２−（スチルフ
ェニル）ナフトチアゾール誘導体、４，４′−ビス（ト
リアゾール−２−イル）スチルベン誘導体、ビス（トリ
アジニルアミノ）スチルベンジスルホン酸などが、ハイ
ドロトロープとしては低級アルコール、多価アルコール
、低級アリールスルホン酸またはその塩などが挙げられ
、これらの各成分はいずれもそれぞれ単独で用いてもよ
いし、２種以上組合せてもよい。 見豆勿処米 本発明によれば、バチルス・エスピー７株から生産され
る新規なアルカリプロテアーゼを、特定のアニオン性界
面活性剤と併用して用いることにより、十分な洗浄力向
上効果が発揮され、しかも長期にわたる保存においても
酵素の活性低下が少なく、従来知られていた酵素含有洗
浄剤組成物に比べて顕著に改良された酵素安定性と洗浄
力を併有する極めて実用性の高い洗浄剤組成物が実現で
きる。 次に、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。 各実施例における評価は、以下の試験方法に従って行な
った。 ・洗浄力 ＵＳ、　Ｔｅｓｔｉｎｇ社のＴｅｒｇ−０−Ｔｏｍｅｔ
ｅｒを洗浄装置として使用し、これにタンパク質配合湿
式人工汚垢布１０枚とセバム布、清浄メリヤス布を入れ
浴比３０倍に合わせ、１２０ｒ　、　ｐ　、　ｍで２５
℃１０分間洗浄する。洗浄液は、洗浄剤濃度０．１％の
もの９００ｍ　＋２を用い、すすぎは９００ｍ　Ｑの水
で３分間行なう。使用水は３°ＤＨのものを用いた。洗
浄力は次式で算出する。 （１９８１）ｒ新しい人工汚垢に関する研究（第１報）
」に準する。 ・酵」１乱法ｆｌＪ１に 供試洗浄剤組成物１００ｍ　Ｑを広口ビンに入れ、３５
℃で２週間保存したのち酵素活性を測定し、保存前の酵
素活性に対する度合を１００分率で表わした。なお、酵
素活性の測定は、朝食書店発行「酵素研究法２」（赤用
四部ｇり第２３８ページ以下に記載のＣａ５ｅｉｎ−２
７５ｎ＋μ吸収Ａ法に準じて行なった。 実施例 以下の第９表に示した液体洗浄剤組成物を調製して、そ
の性能を評価した。 （以下余白）

【図面の簡単な説明】

第１図はＹａ酵素およびｙｂ酵素の精製段階を示すフロ
ーシートである。 第２図はＹ酵素のＤＥＡＥ−５３セルロースのアニオン
交換クロマトグラフィーにかけた際の溶出曲線を示すグ
ラフである。 第３図はＹａ酵素の至適ｐＨおよび安定ｐＨ領域を、第
４図はｙｂ酵素の至適ｐＨおよび安定ｐＨ領域を示すグ
ラフである。 第５図はＹａ酵素の至適温度および耐熱性を、第６図は
ｙｂ酵素の至適温度および耐熱性を示すグラフである。 第７図はＹａ酵素の紫外線吸収スペクトル曲線を、第８
図はｙｂ酵素の紫外線吸収スペクトル曲線を示すグラフ
である。 第９図はＹａ酵素およびｙｂ酵素の分子量決定の際の検
量線を示すグラフである。 第１０図はＹａ酵素の、第１１図はｙｂ酵素のそれぞれ
等電点電気泳動模様を示すグラフである。 第１２図はＹａ酵素の、第１３図はＹｂ酵素のそれぞれ
ゲル濾過クロマトグラフィー溶出曲線を示すグラフであ
る。 第１４図はＹａ酵素の高速液体クロマトグラフ第１図 〔微生物培養液〕 ↓ ↓ Ｃ上清〕 ↓ 〔Ｙ粗酵素〕 ↓ 〔精製ｙｂ酵素〕 第４Ａ図 第４Ｂ図 Ｈ 第５Ａ図　　　　　第６Ａ図 〜　温度（℃）ｕ＠度（’Ｃ） 洛出ｆｉ（ｍｌ） 第１０図 第１Ｉ図 分１１１番号 第１２図 分画番号

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（Ａ）一般式（ I ）で表わされるアニオン界面活
   性剤、 ＲＯ（ＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｏ）ｎＳＯ＿３Ｍ・・・（ I
   ）（式中の各記号は次の通りである。 Ｒ：炭素数１１〜１５の直鎖もしくは分枝鎖のアルキル
   基またはアルケニル基 ｎ：２〜７の範囲の数 Ｍ：アルカリ金属またはアルカノール置 換もしくは無置換のアンモニウム基） （Ｂ）バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．
   ）Ｙ株（微工研条寄第１０２９号）から生産されるアル
   カリプロテアーゼ を含有することを特徴とするアルカリプロテアーゼ含有
   液体洗浄剤組成物。