KR100245615B1 - 써모박테로이데스의 열안정성 프로테아제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 열안정성 프로테아제의 분야에 속한다. 더욱 바람직하게는 본 발명은 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스의 열안정성 프로테아제, 이들 효소의 제조방법, 및 이들 효소를 포함하는 세제조성물에 관한 것이다. 이 효소는 75 내지 95℃ 범위의 최적온도 및 6.5 내지 10.0 범위의 최적 pH를 갖는다.

Description

[발명의 명칭]
씨모박테로이데스의 열안정성 프로테아제
[기술분야]
본 발명은 열안정성 프로테아제의 분야에 속한다. 더욱 상세하게는 본 발명은 새로운 열안정성 프로테아제, 이들 요소의 제조방법 및 이들 효소를 포함하는 세제조성물에 관한 것이다.
[배경기술]
써모박테로이데스 프로테올리티쿠스(Thermobacteroides proteolyticus) 균주가 펩톤, 젤라틴 및 카제인을 발효시킨다는 것이 International Journal of Systematic Bacteriology, 1985년 10월, 제35권, 제4호, 제425-428쪽에 공지되어 있다. 써모박테로이데스(Thermobacteroides)의 프로테아제는 분리되거나 또는 특성화되지 않았으며, 그러한 프로테아제에 대한 어떤 용도도 제안되지 않았다.
[발명의 간단한 개시]
현저한 열안정성 뿐만 아니라 열활성을 나타내는 새로운 효소가 본 발명의 범위내에서 제공된다. 따라서, 제1양태에 따라서, 본 발명은 pH 6.5 내지 10.0범위의 최적 및 pH 및 75내지 95℃ 범위의 최적온도를 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제를 제공한다. 다른 양태에 있어서, 본 발명은 pH 6.5 내지 10.0범위의 최적 pH, 75 내지 95℃ 범위의 최적 온도, 및 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스 DSM No. 5265로부터 유래되는 프로테아제의 것과 동일하거나 또는 부분적으로 동일한 면역화학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제를 제공한다.
제3태양에 있어서, 본 발명은 본 발명의 열안정성 프로테아제의 제조방법으로서, 탄소 및 질소원 및 무기염을 함유하는 적절한 영양배지에서 써모박테로이데스의 프로테아제 생산 균주를 배양하는 단계 및 원하는 효소를 회수하는 단계로 이루어지는 제조방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서는, 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스 균주를 배양한다. 더욱 바람직한 구체예에서는, 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스 DSM No. 5265, 또는 이것의 돌연변이체 또는 변이체를 배양한다.
[도면의 간단한 설명]
본 발명을 첨부한 도면을 참조하여 더 예시한다. 도면은 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스로부터 얻어지는 프로테아제의 단백질분해활성과 온도 및 pH의 관계를 각각 보여준다.
[발명의 상세한 개시]
써모박테로이데스에 대한 생장실험으로 이 생물체가 극도의 열안정성 및 열활성 단백질가 수분해효소를 분비함이 밝혀졌다. 이들 효소는 극단적인 조건하에서 단백질분해활성을 갖는다. 써모박테로이데스 프로테아제의 성질은 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스로부터 얻어지는 프로테아제를 통해 입증된다. 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스 균주는 DSM No. 5265로부터 얻을 수 있다.
도면으로부터 명백한 바와 같이, 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스로부터 얻을 수 있는 프로테아제는 넓은 온도 및 pH범위, 즉 아래 50℃에서 위 95℃까지의 온도 및 아래 5.5에서 위 10까지의 pH범위에서 활성이다. 최적온도는 75 내지 95℃, 더욱 바람직하게는 85℃ 부근인 80 내지 90℃이다. 95℃에서도 약 40%의 단백질분해활성이 여전히 검출된다. 또한, 도면으로부터 명백한 바와 같이, 프로테아제활성과 pH간의 관계는 편평한 활성 곡선을 보이고, 이것은 프로테아제가 pH에 대해 매우 내성적이어서, 일반적으로 넓은 pH 범위에 걸쳐 놓은 단백질분해활성을 갖고 있음을 의미한다. 이렇게 하여, 본 발명의 프로테아제는 pH 6.5 내지 pH 10, 더욱 구체적으로 pH 8 내지 pH 10, 훨씬 더 구체적으로는 pH 9.5부근인 pH 9 내지 pH 10범위에서 최적 pH를 갖는다. 써모박테로이데스 종으로부터 얻을 수 있는 프로테아제의 몇가지 특성을 표 1에 나타낸다.
[표 1]
면역화학적 성질
면역화학적 성질은 교차반응 동일성 시험에 의해 면역학적으로 결정할 수 있다. 동일성 시험은 잘 알려진 Ouchterlony 이중면역확산법 또는 N.H. Axelsen; Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques; Blackwell Scientific Publications(1983), 제5 및 14장에 따른 탠덤교차 면역전기영동에 의해 수행할 수 있다. ＆quot;항원 동일성＆quot; 및 ＆quot;부분적 항원 동일성＆quot;이라는 용어는 동일한 책의 제5,10 및 20장에 기술되어 있다.
프로테아제의 제조
본 발명에 따른 프로테아제는 써모박테로이데스 속의 균주, 예컨대 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 프로테아제는 써모박테로이데스의 프로테아제 생산 균주를 탄소 및 질소원 및 무기염을 함유하는 적절한 영양배지에서 배양하여 원하는 효소를 수거함으로써 제조될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 프로테아제는 재조합 DNA기술에 의해 제조될 수 있다.
세제조성물
본 발명에 따른 프로테아제의 독특한 성질 때문에 이들 효소는 산업상의 이용, 예컨대 세제산업에서의 용도에 대단히 중요하다.
본 발명의 세제조성물은 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 음이온성, 비이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 쯔비터이온성 형태, 또는 이것들의 혼합물일 수 있다. 음이온성 계면활성제의 전형적인 예에는 선형 알킬 벤젠 술포네이트(LAS); 알킬 술페이트(AS); 알파 올레핀 술포네이트(AOS); 알코올 에톡시 술페이트(AES) 및 천연지방산의 알칼리금속염이 있다. 비이온성 계면활성제의 예에는 알킬 폴리에틸렌 글리콜 에테르; 노닐페놀 폴리에틸렌 글리콜 에테르; 수크로스 및 글루코스의 지방산 에스테르; 및 폴리에톡실화 알킬글루코시드의 에스테르가 있다.
또한 본 발명의 세제조성물은 본 기술분야에서 알려진 다른 세제성분, 예컨대 증강제, 표백제, 표백활성제, 부식방지제, 금속이온봉쇄제, 오물재침전 방지제, 향료, 효소 및 표백제용 안정화제, 조제보조물, 광택제, 거품촉진제, 착화제, 충전제, 직물유연제 등도 함유할 수도 있다. 본 발명의 세제조성물은 실질적으로 J. Falbe [Falbe, J.; Surfactants in Consumer Products. Theory, Technology and Application; Springer Verlag 1987, 특히 ＆quot;Frame formulations for liquid/powder heavy-duty detergents＆quot;라는 제목이 붙은 부분 참조]에 의해 기술된 바와 같이 조제될 수 있다.
현재 본 발명의 세제조성물은 세척액 리터당 단백질분해 효소 0.0005 내지 0.5CPU에 대응하는 양의 효소세제를 함유할 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 세제조성물은 어떤 편리한 형태, 예컨대 분말, 액체 등으로 조제될 수 있다.
본 발명의 세제조성물은 하나 이상의 다른 효소, 예컨대 세제조성물에 통상적으로 포함되는 리파제; 아밀라제; 셀룰라제; 및/또는 퍼옥시다제를 포함하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 프로테아제는 세제 프로테아제를 함유하는 독립된 첨가제를 첨가하거나 또는 다른 세제 효소를 포함하는 복합 첨가제를 첨가함으로써 세제조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 첨가제는 과립, 액체, 슬러리 등으로 조제될 수 있다. 바람직한 세제첨가제 제제는 비분진성 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 슬러리 또는 보호된 효소이다. 분진이 없는 과립은 GB 1,362,365 또는 US 4,106,991호에 따라 제조될 수 있고, 선택적으로 본 기술 분야에서 알려진 방법으로 피복될 수 있다. 세제효소는 과립화하기 전 또는 후에 혼합될 수 있다. 예를 들면 액체효소제제는 확립된 방법에 따라 다가알콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 당 또는 당 알코올; 락트산 또는 붕산을 첨가함으로써 안정화될 수 있다. 다른 효소 안정화제는 본 기술분야에 잘 공지되어 있다. 보호된 효소는 EP 238,216에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다.
하기 실시예에 의해 본 발명을 더 예시한다.
[실시예 1]
써모박테로이데스 프로테올리티쿠스의 배양
써모박테로이데스 프로테올리티쿠스 DSM No. 5265를 하기 성분(리터당)을 함유하는 영양 배지에서 배양하였다.
KH2PO40.4g
NH4Cl 1.0g
MgCl2·6H2O 1.0g
CaCl2·2H2O 0.4g
효모추출액 2.0g
트립티카제 BBL 2.0g
미량원소용액(DSM-배지 141참조) 10ml
레사주린 1.0mg
NaHCO32.0g
Na2S·9H20 0.5g
증류수 1000ml까지 pH 7.0-7.5
세포를 N2/CO2(80/20) 분위기하에 65℃에서 배양하였다. 황화나트륨이 없는 배지를 20분간 끓인 후, 얼음위에서 냉각시키고 N2/CO2(80/20) 분위기하에서 분배하였다. 이어서 배지를 N2/CO2(80/20) 분위기하에 100ml 유리병에 채웠다. 배지를 20분간 120℃에서 가압멸균하였다. 접종전에 100ml/l의 멸균된 중성 황화나트륨(3% 용액)을 첨가하여 배지를 환원시켰다. 배지를 10%의 생장된 예비배양물로 접종하여 최종적으로 65℃에서 36 내지 48시간 동안 배양하였다.
단백질분해활성 분석
분석 혼합물은 50mM Tris/글리신 완충액(pH 9.0)에 용해된 0.25% 카제인(Hammarsten)을 함유하였다. 85℃에서 효소샘플 250μl를 분석혼합물 2250μl에 첨가하여 반응을 개시하였다. 샘플(각 500μl)을 30, 60, 90 및 120분 후에 취하였다. 샘플을 얼음으로 냉각시키고 트리클로로아세트산(10% 용액) 500ml를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 혼합물을 실온에서 약 30분간 방치시키고 이어서 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상청액의 흡광도를 280nm에서 블랭크에 대해 측정하였다. 효소 IU를 특정 조건하에서 1분당 티로신 1μmol을 방출시키는 효소의 양으로 정의하였다.
프로테아제의 특성화
50 내지 95℃의 온도에서 20mM MES(2-[N-모르폴리노]에탄술폰산), 20mM HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산) 및 20mM 글리신으로 구성되고 pH값이 5.5 내지 10인 완충액 혼합물에 0.25%의 농도로 카제인(Hammarsten)을 용해시켰다.
도면으로부터 명백한 바와 같이, 프로테아제활성 수준은 pH 9.5부근에서 최대치에 달하였다. pH값 5.5에서는 약 40%, pH값 10에서는 약 90%의 단백질분해활성이 검출될 수 있었다. 카제인 기질에 대한 단백질분해의 최적 활성은 85℃에서 나타났다. 95℃에서는 약 40%의 효소활성이 측정되었고, 50℃에서는 약 10%의 효소활성이 측정되었다.

Claims (13)

  1. 하기의 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
    (a) pH 8 내지 10범위의 최적 pH;
    (b) 80 내지 90℃ 범위의 최적온도; 및
    (c) 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스 DSM No. 5265 균주로부터 유래되는 프로테아제의 것과 동일한 면역화학적 성질.
  2. 제1항에 있어서, 써모박테로이데스 속의 균주로부터 유래되는 것을 더 특징으로 하는 프로테아제.
  3. 재2항에 있어서, 티. 프로테올리티쿠스 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
  4. 제3항에 있어서, 티. 프로테올리티쿠스 DSM No. 5265 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
  5. 제1항 내지 제4항중의 어느 한 항의 프로테아제 제조방법에 있어서, 탄소 및 질소원 및 무기염을 함유하는 적절한 영양배지에서 써모박테로이데스의 프로테아제 생산 균주, 바람직하게는 티. 프로테올리티쿠스의 프로테아제 생산 균주를 배양하는 단계 및 원하는 효소를 회수하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 티. 프로테올리티쿠스 DSM No. 5265 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 비분진성 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 슬러리, 또는 보호된 효소 형태의 단백질분해 세제첨가제에 있어서, 하기 성질을 갖는 프로테아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질분해 세제첨가제 :
    (a) pH 8 내지 10범위의 최적 pH;
    (b) 80 내지 90℃ 범위의 최적온도; 및
    (c) 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스 DSM No. 5265 균주로부터 유래되는 프로테아제의 것과 동일한 면역화학적 성질.
  8. 제7항에 있어서, 써모박테로이데스 균주, 바람직하게는 티. 프로테올리티쿠스 균주로부터 유래되는 것을 더 특징으로 하는 단백질분해 세제첨가제.
  9. 제8항에 있어서, 티. 프로테올리티쿠스 DSM No. 5265균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 단백질분해 세제첨가제.
  10. 하기의 성질을 갖는 프로테아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제함유 세제조성물.
    (a) pH 8 내지 10범위의 최적 pH;
    (b) 80 내지 90℃ 범위의 최적온도; 및
    (c) 써모박테로이데스 프로테올리티쿠스 DSM No. 5265로부터 유래되는 프로테아제의 것과 동일한 면역화학적 성질.
  11. 제10항에 있어서, 써모박테로이데스 균주, 바람직하게는 티. 프로테올리티쿠스 균주로부터 유래되는 것을 더 특징으로 하는 프로테아제함유 세제조성물.
  12. 제11항에 있어서, 티. 프로테올리티쿠스 DSM No. 5265 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 프로테아제함유 세제조성물.
  13. 제10항 내지 제12항중의 어느 한항에 있어서, 하나 이상의 다른 효소, 특히 아릴라제, 리파제, 셀룰라제 또는 퍼옥시다제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제함유 세제조성물.
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