JPH05507616A - サーモバクテロイデス由来の熱安定性プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サーモバクテロイデス由来の熱安定性プロテアーゼ技術分野 本発明は、熱安定性プロテアーゼの分野に属する。更に詳しくは本発明は新規熱 安定性プロテアーゼ、これらの酵素の製造方法および該酵素を含んでなる洗剤組 成物に関する。

背景技術 サーモバクテロイデス　プローオリティカス（Ｔｈｅｒ＠ｏｂａｃｔｅｒｏｉｄ ｅｓｒｏｔｅＯ１ｔｉｃｕｓ）の菌株がプベトン、ゼラチンおよびカゼインを発 酵することは、Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｅｐｔｅｍａｔｉ ｃ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌｏｇｙ、　Ｏｃｔ。

１９８５、　ｐ４２５〜４２８．　ｖｏｌ、３５．　Ｎｏ、　４より公知である 。サーモバクテロイデス由来のプロテアーゼは、これまで単離又は特性化されて おらず、ましてこれのようなプロテアーゼに対する使用はこれまで示唆されてい なかった。

発明の簡単な開示 本発明の範囲内において、法外に熱安定性および熱活性を示す新規酵素が提供さ れる。従って、その第一の面において、本発明はｐＨ６，５〜１０．０に最適ｐ ｏおよび７５〜９５°Ｃに最適温度を有するプロテアーゼを提供する。他の面に おいて、本発明はｐＨ６，５〜１０．０に最適ｐＨおゼのそれらと同一であるか 又は部分的に同一であるプロテアーゼを提供する。

第三の面において、本発明は本発明の熱安定性プロテアーゼの調製方法を提供す るものであり、この方法は炭素、および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄 養培地中で支ユニｉ乙Ｆｅｌ±！：←乞２２（Ｔｈｅｒ■ｏｂａｃｔｅｒｏｉｄ ｅｓ　のプロテアーゼ生産株を培養し、次いで所望の酵素を回収することを含ん でなる。この方法の好ましい態様においてサーモバクテロイデス　プロテア−イ カス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｏｉｄ＠５ｒｏｔｅｏｌｔｉｃｕｓ）の菌株を 培養する。更に好ましい態様において、サーモバクテロイデス　プロテオリティ カスＤＳＭ　Ｎｏ、５２６５又はその突然変異体又は変異体を培養する。

図面の簡単な説明 本発明を更に添付の図面を参照しつつ説明する。ここにおいて、図面はサーモバ クテロイデス　プロテオリティカス（Ｔｈｅｒｗｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｐｒ ｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）由来のプロテアーゼのタンパク質分解活性と温度およ びｐＨとのそれぞれの関係を示す。

本発明の詳細な説明 サーモバクテロイデス（τｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｏｉｄａｓ）による増殖実験 は、これらの生物が極めて熱安定性で熱的活性タンパク加水分解酵素を分泌する ことを今や示している。これらの酵素は、極単な条件のもとて蛋白分解活性を有 する。サーモバクテロイデス　プロテアーゼの性質は、サーモバクテロイデス　 プロテオリティカスから得られるプロテアーゼにより実証される。サーモバクテ ロイデス　プロテオリティカスの菌株は、ＤＳＭからＮｏ、３６３９として入手 可能である。

図面から明らかなように、サーモバクテロイデス　プロテオリティカス由来のプ ロテアーゼは、広範囲の温度および９Ｈ域、すなわち、５０℃未満〜９５℃超の 温度、ｐｎｓ、ｓ未満から１０超までのｐＨ値で活性である。！適温度は７５〜 ９５℃、より詳しくは８０〜９０°Ｃ２約８５°Ｃである。

約４０％のタンパク質分解活性が９５゛Ｃで未だ検出される。しかし、図面から 明らかなように、プロテアーゼ活性をｐＨ間の関係は平坦な活性曲線であり、こ のことはプロテアーゼは極めて９Ｈに寛容であることを意味しており、巾広いｐ Ｈ域にわたって一般に高いタンパク質分解活性を有する。このようにして本発明 のプロテアーゼは、ｐｉ（６，５〜１０に、より詳しくはｐ［Ｉ８〜１０に、更 により詳しくはｐＨ９〜ｌＯに、約ｐＨ９，５に最適ｐＨを有する。

第１表にサーモバクテロイデスｓｐ、由来のプロテアーゼの性質を示す。

Ｓｕｃ　＝スクシニル ｐＮＡ　＝ニトロアニリド Ｐｉｐ　＝ピペラジン 免疫化学的性質 免疫化学的性質は、交差同定試験によって免疫学的に測定できる。

同定試験は、周知のオウテル口二一（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）二重免疫拡散手 順により又はＮ、Ｈ，アケルセンに従ったタンデム交差免疫電気泳動により行う ことができる；　１ｌａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　＋−ｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａ ｔＩｏｎ−：ｎ−Ｇｅ１Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；ブラックウェルサイエンティフ ィック　バブリケーション（１９８３）　５章および１４章０語句「抗原の同一 性」および１部分的に抗原の同一性」は同書、５章１９章および２０章に記載さ れている。

プローアーゼの量 本発明によるプロテアーゼは、サーモバクテロイデス（丁ｈｅｒｓｏｂａｃｔｅ ｒｏｉｄｅｓ）属、例えばサーモバクテロイデス　プロテオリティカスの群から 得ることができる。

本発明のプロテアーゼは炭素、および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養 培地中でスタフィロサーマス（Ｓｔａｐｂｙｌｏ　ｔｈｅｒｓｕｓ）プロテアー ゼ生産株を培養し、次いで所望の酵素を回収することをによって得ることができ る。

本発明に係るプロテアーゼは、組換体ＤＮＡ−手法により生産することもできる 。

洗五凪底１ 本発明に係るプロテアーゼの独得な性質のため、これらの酵素は例えば洗剤産業 における使用用として工業的適用に対し極めて興味がある。

本発明の洗剤組成物は、１種以上の界面活性剤を含むことができ、この活性剤は 、アニオン、カチオン、非イオン、両性又は双性イオン型又はそれらの混合物で あってよい、アニオン界面活性剤の典型的例は、直鎖アルキルベンゼンスルホネ ート　（ＬＡＳ）　ｉアルキルスルフェート（ＡＳ）　；αオレフインスルホネ ート（ＡＯ５）　ｉアルコールエトキシスルホネート（ＡＥＳ）および天然脂肪 酸のアルカ＋）金属塩である。非イオン界面活性剤の例は、アルキルポリエチレ ングリコールエーテル；ノニルポリエチレングリコールエーテル；スクロースお よびグルコースの脂肪酸エステル；ポリエトキシル化アルキルグリコシドのエス テルである。

本発明の洗剤組成物は又他の公知の洗剤成分、例えばビルダー、漂白剤、漂白活 性化剤、凝固防止側、金属イオン封鎖剤、抗土壌−再沈着剤、香料、酵素用安定 化剤および漂白剤、製剤化助荊、けい光増白剤、起泡増進剤、キレート剤、充て ん剤、布帛柔軟剤等をも含有できる０本発明の洗剤組成物は、Ｊ、ファルベエに 記載される如くに実質的に同じ方法で製剤化できる（Ｐａｌｂｅ、　Ｊ、；　５ ｕｒｆａｃｔａｎｔｓｉ＋＋　Ｃｏｎｓｕｍｅｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｔｈｅ ｏｒｙ、　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　；Ｓｐｒ ｔｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　１９８７＋　特に　’Ｆｒａｍｅ　ｆｏｒｍｕｌａ ｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　１ｉｑｕｉｄ　／ｐｏｗｄｅｒ　ｈｅａｖｙ−ｄｕｔｙ　 ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ’の章を参照〕。

現在以下のように企図される。すなわち、本発明の洗剤組成物は、洗液１１当た り蛋白質分解酵素０．０００５〜Ｑ、５ＣＰＵに相当する量の酵素調製品を含有 できる。

本発明の洗剤組成物は、好都合の形態で、例えば粉末、液体等に製剤化できる。

本発明の洗剤組成物は、１種以上の他の酵素、例えばリパーゼ；アミラーゼ；セ ルラーゼ；および／又はペルオキシダーゼを含み、これらは洗剤組成物中に好都 合に含まれる。

本発明のプロテアーゼは、洗剤プロテアーゼを含有する別個の添加剤を添加する ことにより、又は異なる酵素を含んでなる一緒にした添加剤を添加することによ り洗剤組成物中に含ましめることができる。

本発明の添加剤は、例えば粒質物、液体、スラリー等として製剤化できる。好ま しい洗剤用添加剤配合物は、無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー 、又は保護された酵素である。無粉塵性粒質物は、例えば英国特許１，３６２， ３６５および米国特許４．１０６．９９１に従って調製でき、更に所望により公 知方法でコートできる。洗剤用酵素は造粒前又は造粒後に混合できる。液体酵素 調製品は、例えばポリオール例えばプロピレングリコール；糖又は糖アルコール ；乳酸又はホウ酸等を確立された方法に従って添加することにより安定化できる 。他の酵素安定化剤は周知である。保護された酵素は、ヨーロッパ特許２３８， ２１６に開示された方法に従って調製できる。

次に実施例により更に本発明を説明する。

例１ サーモバク−ロイデス　ブロテオリーイカスの立サーモバクテロイデス　プロテ オリティカス、　ＤＳＭ　Ｎｏ、５２６５を以下の成分（１１当たり）を含有す る栄養培地中で培養した：Ｋ１１ｚＰＯ４０，４ｇ Ｎｌｌ、ＣＩ　１．０　ｇ ＭｇＣｌ、・６［１，０１，Ｏｇ ＣａＣｌｚ　Ｈ２Ｌｏ　０．４ｇ 酵母エキス　２．０ｇ トリプティカーゼＢＢＬ　２．Ｏｇ 微量元素溶液（ＤＳＭ−培地１４１参照）　１０ｍレザズリン　１．０■ ＮａＨＣＯｓ　２．Ｏｇ Ｎａ＊Ｓ　−９）１ｔＯＯ，５ｇ 純水１０００ｍを加える　ｐＦＩ７．０〜７．５細胞をＮｘ／Ｃｏｔ（８０／２ ０）雰囲気中、６５℃で培養した。

硫化ナトリウムおよびイオウを含まない培地を２０分間ボイルし、氷上で冷却し Ｎｔ／Ｃｏ□（８０／２０）雰囲気で分散した０次いで培地をＮ、／ｃｏｗ（８ ０／２０）雰囲気下、１００ｄのバイアルに充てんした。培地を１２０’Ｃに２ ０分間オートクレーブ処理した。

接種前に培地を、殺菌性中性硫化ナトリウム（３％溶液）　ｌｏ＋ｄ／１を添加 して還元した。培地に１０％の増殖した予備培養物を接種し次いで６５°Ｃで３ ６〜４８時間最終的にインキュベートした。

ンパク　１　のための 分析用混合物は、５０ＭＭ　）リス／グリシン緩衝液（ｐＨ９，０）に溶解した カゼイン（バーマルステン）　０．２５％を含有していた。２５０μｌの酵素サ ンプルを２２５０μｍの分析用混合物に８５°Ｃで添加することにより反応を開 始せしめた。サンプル５００μｌ毎）を、３０．６０．９０および１２０分後に 採取した。氷上で冷却して反応を停止させ次いで三塩化酢酸（１０％溶液）５０ （ｌｄを添加した。混合物を室温で約３０分開放！し、その後１２，０００ｒ、 ｐ４．で１０分遠心分離した。上澄みの吸光度を、ブランクに対し２８０ｎｓで 測定した。ＩＵの酵素を、言及した条件下毎分１ｕｍｏｌのチロシンを遊離する 酵素の量をに定義する。

ブニ±ユニ亙■豊立 カゼイン（バーマルステン）を、緩衝液混合物中０．２５％の濃度で、ｐＨ５， ５〜１０でかつ５０〜９０°Ｃの温度で溶解したが、該混合物は、２０ｍＭのＭ ＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ〕エタタンスルホン酸）２ｈＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ− ２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２エタンスルホン酸）および２０１１ Ｍのグリシンから構成されていた。

図に示すように、プロテアーゼのレベルは約ｐＨ９，５で最大に達した。　ｐＨ ５，５で約４０％、ｐｌｌｌｏで約９０％のタンパク質分解活性が検出された。

基質カゼインに対する最適タンパク質分解活性は８５℃で生した。約４０％の酵 素活性は９５℃で測定され、更に約ｌＯ％の酵素活性は５０℃で測定された。

活性（％） 要約書 本発明は、熱安定性プロテアーゼの分野に間する。更に詳しくは本発明はサーモ バクテロイデス　プロテオリティカス由来の熱安定性プロテアーゼ、これらの酵 素の調製方法、およびこれらの酵素を含んでなる洗剤組成物に関する。酵素は７ ５〜９５”に最適温度を存し、ｐＨ６，５〜１０に最適ｐＨを有する。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年１２月ＩＩ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次の特性： （ａ）ｐＨ６．５〜１０．０に最適ｐＨ；（ｂ）７５〜９５℃に最適温度； を有することを特徴とする、プロテアーゼ。 ２．次の特性： （ａ）ｐＨ６．５〜１０に最適ｐＨ； （ｂ）７５〜９５℃に最適温度； （ｃ）サーモバクテロイデス　プロテオリティカス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｏｉｄｅｓＰｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＤＳＭ　Ｎｏ．５２６５由来のプロテ アーゼの免疫化学的性質と同一であるか又は部分的に同一である免疫化学的性質 を有することを特徴とするプロテアーゼ。 ３．次の特性 （ａ）ｐＨ６．５〜１０．０に最適ｐＨ；（ｂ）７５〜１００℃に最適温度； （ｃ）サーモバクテロイデスの菌株から由来するものである、を有することを特 徴とする、プロテアーゼ。 ４Ｔ．プロテオリティカス（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）種の菌株由来請求の 範囲第３項記載のプロテアーゼ。 ５．菌株ＤＳＭ　Ｎｏ．５２６５由来の請求の範囲第４項記載のプロテアーゼ。 ６．炭素、および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養培地中でサーモバク テロイデス（ｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）のプロテアーゼ生産株を 培養し、次いで所望の酵素を回収することを含んでなる、請求の範囲第１〜５項 のいずれかに記載のプロテアーゼの調製方法。 ７．サーモバクテロイデス　プロテオリティカス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｉ ｏｉｄｅｓｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の菌株を培養する、請求の範囲第６項 記載の方法。 ８．サーモバクテロイデス　プロテオリティカス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｉ ｏｉｄｅｓｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ），ＤＳＭ　Ｎｏ．５２６５又はその突 然変異体又はその変異体である、請求の範囲第７項記載の方法。 ９．無粉塵性粉質物、液体、特に安定化液体、スラリー又は保護された酵素の形 態にある蛋白質分解洗剤用添加剤であって、請求の範囲第１〜５項のいずれかに 記載のプロテアーゼを含んでなる、前記添加剤。 １０．プロテアーゼ−含有洗剤組成物であって、請求の範囲第１〜５項のいずれ かに記載のプロテアーゼを含んでなる、前記組成物。 １１．１種以上の酵素、特にアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又はペルオキシ ダーゼを更に含んでなる、請求の範囲第１０項記載の洗剤組成物。