JP3126727B2 - サーモバクテロイデス由来の熱安定性プロテアーゼ - Google Patents

サーモバクテロイデス由来の熱安定性プロテアーゼ

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、熱安定性プロテアーゼの分野に属する。更
に詳しくは本発明の新規熱安定性プロテアーゼ、これら
の酵素の製造方法および該酵素を含んでなる洗剤組成物
に関する。
背景技術 サーモバクテロイデス プロテオリティカス（Thermo
bacteroides proteolyticus）の菌株がプペトン、ゼラ
チンおよびカゼインを発酵することは、Internal Journ
al of Septematic Bacterialogy,Oct.1985,p425〜428,V
ol.35,No.4より公知である。サーモバクテロイデス由来
のプロテアーゼは、これまで単離又は特性化されておら
ず、ましてこれのようなプロテアーゼに対する使用はこ
れまで示唆されていなかった。
発明の簡単な開示 本発明の範囲内において、法外に熱安定および熱活性
を示す新規酵素が提供される。従って、その第一の面に
おいて、本発明はpH6.5〜10.0に最適pHおよび75〜95℃
に最適温度を有するプロテアーゼを提供する。他の面に
おいて、本発明はpH6.5〜10.0に最適pHおよび90〜100℃
に最適温度を有し、かつ免疫化学的性質がサーモバクテ
ロイデス プロテオリティカスDSM No.5265由来のプロ
テアーゼのそれらと同一であるか又は部分的に同一であ
るプロテアーゼを提供する。
第三の面において、本発明は本発明の熱安定性プロテ
アーゼの調製方法を提供するものであり、この方法は炭
素、および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養培
地中でサーモバクテロイデス（Thermobacteroides）の
プロテアーゼ生産株を培養し、次いで所望の酵素を回収
することを含んでなる。この方法の好ましい態様におい
てサーモバクテロイデス プロテオリティカス（Thermo
bacteroides proteolyticus）の菌株を培養する。更に
好ましい態様において、サーモバクテロイデス プロテ
オリティカスDSM No.5265又はその突然変異体又は変異
体を培養する。
図面の簡単な説明 本発明を更に添付の図面を参照しつつ説明する。ここ
において、図面はサーモバクテロイデス プロテオリテ
ィカス（Thermobacteroides proteolyticus）由来のプ
ロテアーゼのタンパク質分解活性と温度およびpHとのそ
れぞれの関係を示す。
本発明の詳細な説明 サーモバクテロイデス（Thermobacteroides）による
増殖実験は、これらの生物が極めて熱安定性で熱的活性
タンパク加水分解酵素を分泌することを今や示してい
る。これらの酵素は、極単な条件のもとで蛋白分解活性
を有する。サーモバクテロイデス プロテアーゼの性質
は、サーモバクテロイデス プロテオリティカスから得
られるプロテアーゼにより実証される。サーモバクテロ
イデス プロテオリティカスの菌株は、DSMからNo.3639
として入手可能である。
図面から明らかなように、サーモバクテロイデス プ
ロテオリティカス由来のプロテアーゼは、広範囲の温度
およびpH域、すなわち、50℃未満〜95℃超の温度、pH5.
5未満から10超までのpH値で活性である。最適温度は75
〜95℃、より詳しくは80〜90℃、約85℃である。約40％
のタンパク質分解活性が95℃で未だ検出される。しか
し、図面から明らかなように、プロテアーゼ活性をpH間
の関係は平坦な活性曲線であり、このことはプロテアー
ゼは極めてpHに寛容であることを意味しており、巾広い
pH域にわたって一般に高いタンパク質分解活性を有す
る。このようにして本発明のプロテアーゼは、pH6.5〜1
0に、より詳しくはpH8〜10に、更により詳しくはpH9〜1
0に、約pH9.5に最適pHを有する。
第１表にサーモバクテロイデスsp.由来をプロテアー
ゼの性質を示す。
免疫化学的性質 免疫化学的性質は、交差同定試験によって免疫学的に
測定できる。同定試験は、周知のオウテルロニー（Ouch
terlony）二重免疫拡散手順により又はN.H.アケルセン
に従ったタンデム交差免疫電気泳動により行うことがで
きる;Handbook of immunoprecipitation−in−Gel Tech
niques;ブラックウエルサイエンティフィック パブリ
ケーション（1983）５章および14章。語句「抗原の同一
性」および「部分的に抗原の同一性」は同書、５章19章
および20章に記載されている。
プロテアーゼの調製 本発明によるプロテアーゼは、サーモバクテロイデス
（Thermobacteroides）属、例えばサーモバクテロイデ
ス プロテオリティカスの群から得ることができる。
本発明のプロテアーゼは炭素、および窒素源並びに無
機塩を含有する適当な栄養培地中でスタフィロサーマス
（Staphylo thermus）プロテアーゼ生産株を培養し、次
いで所望の酵素を回収することをによって得ることがで
きる。
本発明に係るプロテアーゼは、組換体DNA−手法によ
り生産することもできる。
洗剤組成物 本発明に係るプロテアーゼの独得な性質のため、これ
らの酵素は例えば洗剤産業における使用用として工業的
適用に対し極めて興味がある。
本発明の洗剤組成物は、１種以上の界面活性剤を含む
ことができ、この活性剤は、アニオン、カチオン、非イ
オン、両性又は双性イオン型又はそれらの混合物であっ
てよい。アニオン界面活性剤の典型的例は、直鎖アルキ
ルベンゼンスルホネート（LAS）；アルキルスルフェー
ト（AS）；αオレフィンスルホネート（AOS）；アルコ
ールエトキシスルホネート（AES）および天然脂肪酸の
アルカリ金属塩である。非イオン界面活性剤の例は、ア
ルキルポリエチレングリコールエーテル；ノニルポリエ
チレングリコールエーテル；スクロースおよびグルコー
スの脂肪酸エステル；ポリエトキシル化アルキルグリコ
シドのエステルである。
本発明の洗剤組成物は又他の公知の洗剤成分、例えば
ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、凝固防止剤、金属イ
オン封鎖剤、抗土壌−再沈着剤、香料、酵素用安定化剤
および漂白剤、製剤化助剤、けい光増白剤、起泡増進
剤、キレート剤、充てん剤、布帛柔軟剤等をも含有でき
る。本発明の洗剤組成物は、J.ファルベェに記載される
如くに実質的に同じ方法で製剤化できる〔Falbe,J.;Sur
factants in Consumer Products.Theory,Technology an
d Application;Springer Verlag 1987,特に“Frame for
mulations for liquid/powder heavy−duty detergent
s"の章を参照〕。
現在以下のように企図される。すなわち、本発明の洗
剤組成物は、洗液１当たり蛋白質分解酵素0.0005〜0.
5CPUに相当する量の酵素調製品を含有できる。
本発明の洗剤組成物は、好都合の形態で、例えば粉
末、液状等に製剤化できる。
本発明の洗剤組成物は、１種以上の他の酵素、例えば
リパーゼ；アミラーゼ；セルラーゼ；および／又はペル
オキシダーゼを含み、これらは洗剤組成物中に好都合に
含まれる。
本発明のプロテアーゼは、洗剤プロテアーゼを含有す
る別個の添加剤を添加することにより、又は異なる酵素
を含んでなる一緒にした添加剤を添加することにより洗
剤組成物中に含ましめることができる。
本発明の添加剤は、例えば粒質物、液体、スラリー等
として製剤化できる。好ましい洗剤用添加剤配合物は、
無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー、又
は保護された酵素である。無粉塵性粒質物は、例えば英
国特許1,362,365および米国特許4,106,991に従って調製
でき、更に所望により公知方法でコートできる。洗剤用
酵素は造粒前又は造粒後に混合できる。液体酵素調製品
は、例えばポリオール例えばプロピレングリコール；糖
又は糖アルコール；乳酸又はホウ酸等を確立された方法
に従って添加することにより安定化できる。他の酵素安
定化剤は周知である。保護された酵素は、ヨーロッパ特
許238,216に開示された方法に従って調製できる。
次に実施例により更に本発明を説明する。
例１ サーモバクテロイデス プロテオリティカスの培養 サーモバクテロイデス プロテオリティカス,DSM No.
5265を以下の成分（１当たり）を含有する栄養培地中
で培養した： KH2PO4 0.4g NH4Cl 1.0g MgCl2・6H2O 1.0g CaCl2・2H2O 0.4g 酵母エキス 2.0g トリプティカーゼBBL 2.0g 微量元素溶液（DSM−培地141参照） 10ml レザズリン 1.0mg NaHCO3 2.0g Na2S・9H2O 0.5g 純水1000mlを加える pH7.0〜7.5 細胞をN2/CO2（80/20）雰囲気中、65℃で培養した。
硫化ナトリウムおよびイオウを含まない培地を20分間
ボイルし、氷上で冷却しN2/CO2（80/20）雰囲気で分散
した。次いで培地をN2/CO2（80/20）雰囲気下、100mlの
バイアルに充てんした。培地を120℃に20分間オートク
レーブ処理した。
接種前に培地を、殺菌性中性硫化ナトリウム（３％溶
液）10ml/を添加して還元した。培地に10％の増殖し
た予備培養物を接種し次いで65℃で36〜48時間最終的に
インキュベートした。
タンパク質分解活性のための分析 分析用混合物は、50mMトリス／グリシン緩衝液（pH9.
0）に溶解したカゼイン（ハーマルステン）0.25％を含
有していた。250μｌの酵素サンプルを2250μｌの分析
用混合物に85℃で添加することにより反応を開始せしめ
た。サンプル500μｌ毎）を、30,60,90および120分後に
採取した。氷上で冷却して反応を停止させ次いで三塩化
酢酸（10％溶液）500mlを添加した。混合物を室温で約3
0分間放置し、その後12,000r.p.m.で10分遠心分離し
た。上澄みの吸光度を、ブランクに対し280nmで測定し
た。1Uの酵素を、言及した条件下毎分１μmolのチロシ
ンを遊離する酵素の量をに定義する。
プロテアーゼの特性 カゼイン（ハーマルステン）を、緩衝液混合物中0.25
％の濃度で、pH5.5〜10でかつ50〜90℃の温度で溶解し
たが、該混合物は、20mMのMES（２−〔Ｎ−モルホリ
ノ〕エタタンスルホン酸）20mMのHEPES（Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２エタンスルホン酸）
および20mMのグリシンから構成されていた。
図に示すように、プロテアーゼのレベルは約pH9.5で
最大に達した。pH5.5で約40％、pH10で約90％のタンパ
ク質分解活性が検出された。基質カゼインに対する最適
タンパク質分解活性は85℃で生じた。約40％の酵素活性
は95℃で測定され、更に約10％の酵素活性は50℃で測定
された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−64786（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，247（１) （1987），ｐ．121−133 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の特性： （ａ）pH8〜10.0に最適pHを有する； （ｂ）75〜95℃に最適温度を有する； （ｃ）サーモバクテロイデス（Thermobacteroides）属
    微生物由来である； （ｄ）下記の基質特異性： を有する； ことを特徴とするセリンプロテアーゼ。
  2. 【請求項２】次の特性： （ａ）pH6.5〜10に最適pHを有する； （ｂ）75〜95℃に最適温度を有する； （ｃ）サーモバクテロイデス・プロテオリティカス（Th
    ermobacteroides proteolyticus）DSM No.5265由来のプ
    ロテアーゼの免疫化学的性質と同一の免疫化学的性質を
    有する； （ｄ）下記の基質特異性： を有する； ことを特徴とするセリンプロテアーゼ。
  3. 【請求項３】サーモバクテロイデス・プロテオリティカ
    ス（Thermobacteroides proteolyticus）由来の、請求
    項１又は２に記載のセリンプロテアーゼ。
  4. 【請求項４】前記サーモバクテロイデス・プロテオリテ
    ィカスがサーモバクテロイデス・プロテオリティカスDS
    M No.5265である、請求項３に記載のセリンプロテアー
    ゼ。
  5. 【請求項５】炭素、および窒素源並びに無機塩を含有す
    る適当な栄養培地中でサーモバクテロイデス（Thermoba
    cterioides）のプロテアーゼ生産株を培養し、次いで所
    望の酵素を回収することを含んでなる、請求項１〜４の
    いずれか１項に記載のプロテアーゼの調製方法。
  6. 【請求項６】サーモバクテロイデス・プロテオリティカ
    ス（Thermobacterioides proteolyticus）の菌株を培養
    する、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】サーモバクテロイデス・プロテオリティカ
    ス（Thermobacterioides proteolyticus）,DSM No.5265
    又はその突然変異体又はその変異体を培養する、請求項
    ６に記載の方法。
  8. 【請求項８】請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロ
    テアーゼを含んでなる、無粉塵性粉質物、液体、スラリ
    ー又は保護された酵素の形態にある蛋白質分解洗剤用添
    加剤。
  9. 【請求項９】前記液体が安定化液体である、請求項８に
    記載の洗剤用添加剤。
  10. 【請求項１０】請求項１〜４のいずれか１項に記載のプ
    ロテアーゼを含んでなる、プロテアーゼ−含有洗剤組成
    物。
  11. 【請求項１１】１又は複数の他の酵素をさらに含んで成
    る請求項10に記載の洗剤組成物。
  12. 【請求項１２】１又は複数の他の酵素がアミラーゼ、リ
    パーゼ、セルラーゼ又はペルオキシダーゼである、請求
    項11に記載の洗剤組成物。
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