JP3126728B2 - スタフィロサーマス由来の熱安定性プロテアーゼ - Google Patents
スタフィロサーマス由来の熱安定性プロテアーゼInfo
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、熱安定性プロテアーゼの分野に属する。更
に詳しくは本発明は新規熱安定性プロテアーゼ、これら
の酵素の製造方法および該酵素を含んでなる洗剤組成物
に関する。
に詳しくは本発明は新規熱安定性プロテアーゼ、これら
の酵素の製造方法および該酵素を含んでなる洗剤組成物
に関する。
背景技術 超高熱性古細菌が、硫黄鉱山および海底の熱水系から
単離されている(ケリー,R.M.およびデミング,J.N.;Bio
tech.Progress.4,47−62(1988)参照)。
単離されている(ケリー,R.M.およびデミング,J.N.;Bio
tech.Progress.4,47−62(1988)参照)。
ピロコッコス(Pyrococcws)およびサーモコッカス
(Thermoccws)の群は、熱安定性プロテアーゼおよびア
ミラーゼを含有するものと想像されていたStelter,K.
O.:J.Chem.Technol.Biotechnol.,42(4),(315−317
(1988))。しかし、スタフィロサーマス(Staphyloth
ermus)の群から得られるプロテアーゼは、決して予知
されておらず、単離されておらず又は他の方法で研究さ
れていなかった。
(Thermoccws)の群は、熱安定性プロテアーゼおよびア
ミラーゼを含有するものと想像されていたStelter,K.
O.:J.Chem.Technol.Biotechnol.,42(4),(315−317
(1988))。しかし、スタフィロサーマス(Staphyloth
ermus)の群から得られるプロテアーゼは、決して予知
されておらず、単離されておらず又は他の方法で研究さ
れていなかった。
発明の簡単な開示 本発明の範囲内において、法外に熱安定および熱活性
を示す新規酵素が提供される。従って、その第一の面に
おいて、本発明はpH6.5〜10に最適pHおよび90〜100℃に
最適温度を有するプロテアーゼを提供する。他の面にお
いて、本発明はpH6.5〜10に最適pHおよび90〜100℃に最
適温度を有し、かつ免疫化学的性質がスタフィロサーマ
ス マリナス(Staphylothermus marinus),DSM No.363
9由来のプロテアーゼのそれらと同一であるか又は部分
的に同一であるプロテアーゼを提供する。
を示す新規酵素が提供される。従って、その第一の面に
おいて、本発明はpH6.5〜10に最適pHおよび90〜100℃に
最適温度を有するプロテアーゼを提供する。他の面にお
いて、本発明はpH6.5〜10に最適pHおよび90〜100℃に最
適温度を有し、かつ免疫化学的性質がスタフィロサーマ
ス マリナス(Staphylothermus marinus),DSM No.363
9由来のプロテアーゼのそれらと同一であるか又は部分
的に同一であるプロテアーゼを提供する。
第三の面において、本発明は本発明の熱安定性プロテ
アーゼの調製方法を提供するものであり、この方法は炭
素、および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養培
地中でスタフィロサーマス(Staphylothermus)のプロ
テアーゼ生産株を培養し、次いで所望の酵素を回収する
ことを含んでなる。この方法の好ましい態様においてス
タフィロサーマス マリナス(Staphylothermus marinu
s)株、好ましくはスタフィロサーマス マリナス(Sta
phylothermus marinus),DSM No.3639又はそれらの突然
変異体又は変異体を培養する。
アーゼの調製方法を提供するものであり、この方法は炭
素、および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養培
地中でスタフィロサーマス(Staphylothermus)のプロ
テアーゼ生産株を培養し、次いで所望の酵素を回収する
ことを含んでなる。この方法の好ましい態様においてス
タフィロサーマス マリナス(Staphylothermus marinu
s)株、好ましくはスタフィロサーマス マリナス(Sta
phylothermus marinus),DSM No.3639又はそれらの突然
変異体又は変異体を培養する。
図面の簡単な説明 本発明を更に添付の図面を参照しつつ説明する。ここ
において、図面はスタフィロサーマス マリナス(Stap
hylothermus marinus)由来のプロテアーゼのタンパク
質分解活性と温度およびpHとのそれぞれの関係を示す。
において、図面はスタフィロサーマス マリナス(Stap
hylothermus marinus)由来のプロテアーゼのタンパク
質分解活性と温度およびpHとのそれぞれの関係を示す。
本発明の詳細な説明 スタフィロサーマス(Staphylothermus)による増殖
実験は、これらの生物が極めて熱安定性で熱的活性タン
パク加水分解酵素を分泌することを今や示している。こ
れらの酵素は、極単な条件のもとで蛋白分解活性を有す
る。スタフィロサーマス プロテアーゼの性質は、スタ
フィロサーマス マリナス(Staphylothermus marinu
s)から得られるプロテアーゼにより実証される。スタ
フィロサーマス マリナスの菌株は、DSMからNo.3639と
して入手可能である。
実験は、これらの生物が極めて熱安定性で熱的活性タン
パク加水分解酵素を分泌することを今や示している。こ
れらの酵素は、極単な条件のもとで蛋白分解活性を有す
る。スタフィロサーマス プロテアーゼの性質は、スタ
フィロサーマス マリナス(Staphylothermus marinu
s)から得られるプロテアーゼにより実証される。スタ
フィロサーマス マリナスの菌株は、DSMからNo.3639と
して入手可能である。
図面から明らかなように、スタフィロサーマス マリ
ナス由来のプロテアーゼは、広範囲の温度およびpH域、
すなわち、65℃未満〜100℃超の温度、pH6未満から10超
までのpH値で活性である。最適温度は90〜100℃、約95
℃である。約80%のタンパク質分解活性が100℃で未だ
検出される。しかし、図面から明らかなように、プロテ
アーゼ活性をpH間の関係は平坦な活性曲線であり、この
ことはプロテアーゼは極めてpHに寛容であることを意味
しており、巾広いpH域にわたって一般に高いタンパク質
分解活性を有する。このようにして、本発明のプロテア
ーゼは、pH6.5〜10に、より好ましくはpH8〜10に、更に
特異的にpH8.5〜9.5に最適pHを有し、約70%のタンパク
質分解活性が検出される。
ナス由来のプロテアーゼは、広範囲の温度およびpH域、
すなわち、65℃未満〜100℃超の温度、pH6未満から10超
までのpH値で活性である。最適温度は90〜100℃、約95
℃である。約80%のタンパク質分解活性が100℃で未だ
検出される。しかし、図面から明らかなように、プロテ
アーゼ活性をpH間の関係は平坦な活性曲線であり、この
ことはプロテアーゼは極めてpHに寛容であることを意味
しており、巾広いpH域にわたって一般に高いタンパク質
分解活性を有する。このようにして、本発明のプロテア
ーゼは、pH6.5〜10に、より好ましくはpH8〜10に、更に
特異的にpH8.5〜9.5に最適pHを有し、約70%のタンパク
質分解活性が検出される。
第1表において、スタフィロサーマスsp.から入手可
能なプロテアーゼの性質のいくつかを示す。
能なプロテアーゼの性質のいくつかを示す。
免疫化学的性質 免疫化学的性質は、交差同定試験によって免疫学的に
測定できる。同定試験は、周知のオウテルロニー(Ouch
terlony)二重免疫拡散手順により又はN.H.アケルセン
に従ったタンデム交差免疫電気泳動により行うことがで
きる;Handbook of immunoprecipitation−in−Gel Tech
niques;ブラックウェル サイエンティフィック パブ
リケーション(1983)5章および14章。語句「抗原の同
一性」および「部分的に抗原の同一性」は同書、5章、
19章および20章に記載されている。
測定できる。同定試験は、周知のオウテルロニー(Ouch
terlony)二重免疫拡散手順により又はN.H.アケルセン
に従ったタンデム交差免疫電気泳動により行うことがで
きる;Handbook of immunoprecipitation−in−Gel Tech
niques;ブラックウェル サイエンティフィック パブ
リケーション(1983)5章および14章。語句「抗原の同
一性」および「部分的に抗原の同一性」は同書、5章、
19章および20章に記載されている。
プロテアーゼの調製 本発明によるプロテアーゼは、スタフィロサーマス
(Staphylothermus)属、例えばスタフィロサーマス
マリナスの群から得ることができる。
(Staphylothermus)属、例えばスタフィロサーマス
マリナスの群から得ることができる。
本発明のプロテアーゼは、炭素、および窒素源並びに
無機塩を含有する適当な栄養培地中でスタフィロサーマ
ス(Staphylothermus)プロテアーゼ生産株を培養し、
次いで所望の酵素を回収することによって得ることがで
きる。
無機塩を含有する適当な栄養培地中でスタフィロサーマ
ス(Staphylothermus)プロテアーゼ生産株を培養し、
次いで所望の酵素を回収することによって得ることがで
きる。
本発明に係るプロテアーゼは、組換体DNA−手法によ
り生産することもできる。
り生産することもできる。
洗剤組成物 本発明に係るプロテアーゼの独得な性質のため、これ
らの酵素は例えば洗剤産業における使用用として工業的
適用に対し極めて興味がある。
らの酵素は例えば洗剤産業における使用用として工業的
適用に対し極めて興味がある。
本発明の洗剤組成物は、1種以上の界面活性剤を含む
ことができ、この活性剤は、アニオン、カチオン、非イ
オン、両性又は双性イオン型又はそれらの混合物であっ
てよい。アニオン界面活性剤の典型的例は、直鎖アルキ
ルベンゼンスルホネート(LAS);アルキルスルフェー
ト(AS);αオレフィンスルホネート(AOS);アルコ
ールエトキシスルホネート(AES)および天然脂肪酸の
アルカリ金属塩である。非イオン界面活性剤の例は、ア
ルキルポリエチレングリコールエーテル;ノニルポリエ
チレングリコールエーテル;スクロースおよびグルコー
スの脂肪酸エステル;ポリエトキシル化アルキルグリコ
シドのエステルである。
ことができ、この活性剤は、アニオン、カチオン、非イ
オン、両性又は双性イオン型又はそれらの混合物であっ
てよい。アニオン界面活性剤の典型的例は、直鎖アルキ
ルベンゼンスルホネート(LAS);アルキルスルフェー
ト(AS);αオレフィンスルホネート(AOS);アルコ
ールエトキシスルホネート(AES)および天然脂肪酸の
アルカリ金属塩である。非イオン界面活性剤の例は、ア
ルキルポリエチレングリコールエーテル;ノニルポリエ
チレングリコールエーテル;スクロースおよびグルコー
スの脂肪酸エステル;ポリエトキシル化アルキルグリコ
シドのエステルである。
本発明の洗剤組成物は又他の公知の洗剤成分、例えば
ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、凝固防止剤、金属イ
オン封鎖剤、抗土壌−再沈着剤、香料、酵素用安定化剤
および漂白剤、製剤化助剤、けい光増白剤、起泡増進
剤、キレート剤、充てん剤、布帛柔軟剤等をも含有でき
る。本発明の洗剤組成物は、J.ファルベェに記載される
如くに実質的に同じ方法で製剤化できる〔Falbe,J.;Sur
factants in Consumer Products.Theory,Technology an
d Application;Springer Verlag 1987,特に“Frame for
mulations for liquid/powder heavy−duty detergent
s"の章を参照〕。
ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、凝固防止剤、金属イ
オン封鎖剤、抗土壌−再沈着剤、香料、酵素用安定化剤
および漂白剤、製剤化助剤、けい光増白剤、起泡増進
剤、キレート剤、充てん剤、布帛柔軟剤等をも含有でき
る。本発明の洗剤組成物は、J.ファルベェに記載される
如くに実質的に同じ方法で製剤化できる〔Falbe,J.;Sur
factants in Consumer Products.Theory,Technology an
d Application;Springer Verlag 1987,特に“Frame for
mulations for liquid/powder heavy−duty detergent
s"の章を参照〕。
現在以下のように企図される。すなわち、本発明の洗
剤組成物は、洗液1当たり蛋白質分解酵素0.0005〜0.
5CPUに相当する量の酵素調製品を含有できる。
剤組成物は、洗液1当たり蛋白質分解酵素0.0005〜0.
5CPUに相当する量の酵素調製品を含有できる。
本発明の洗剤組成物は、好都合の形態で、例えば粉
末、液状等に製剤化できる。
末、液状等に製剤化できる。
本発明の洗剤組成物は、1種以上の他の酵素、例えば
リパーゼ;アミラーゼ;セルラーゼ;および/又はペル
オキシダーゼを含み、これらは洗剤組成物中に好都合に
含まれる。
リパーゼ;アミラーゼ;セルラーゼ;および/又はペル
オキシダーゼを含み、これらは洗剤組成物中に好都合に
含まれる。
本発明のプロテアーゼは、洗剤プロテアーゼを含有す
る別個の添加剤を添加することにより、又は異なる酵素
を含んでなる一緒にした添加剤を添加することにより洗
剤組成物中に含ましめることができる。
る別個の添加剤を添加することにより、又は異なる酵素
を含んでなる一緒にした添加剤を添加することにより洗
剤組成物中に含ましめることができる。
本発明の添加剤は、例えば、粒質物、液体、スラリー
等として製剤化できる。好ましい洗剤用添加剤配合物
は、無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリ
ー、又は保護された酵素である。無粉塵性粒質物は、例
えば英国特許1,362,365および米国特許4,106,991に従っ
て調製でき、更に所望により公知方法でコートできる。
洗剤用酵素は造粒前又は造粒後に混合できる。液体酵素
調製品は、例えばポリオール例えばプロピレングリコー
ル;糖又は糖アルコール;乳酸又はホウ酸等を確立され
た方法に従って添加することにより安定化できる。他の
酵素安定化剤は周知である。保護された酵素は、ヨーロ
ッパ特許238,216に開示された方法に従って調製でき
る。
等として製剤化できる。好ましい洗剤用添加剤配合物
は、無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリ
ー、又は保護された酵素である。無粉塵性粒質物は、例
えば英国特許1,362,365および米国特許4,106,991に従っ
て調製でき、更に所望により公知方法でコートできる。
洗剤用酵素は造粒前又は造粒後に混合できる。液体酵素
調製品は、例えばポリオール例えばプロピレングリコー
ル;糖又は糖アルコール;乳酸又はホウ酸等を確立され
た方法に従って添加することにより安定化できる。他の
酵素安定化剤は周知である。保護された酵素は、ヨーロ
ッパ特許238,216に開示された方法に従って調製でき
る。
次に実施例により更に本発明を説明する。
例 1 スタフィロサーマス マリナスの培養 スタフィロサーマス マリナス,DSM No.3639を以下の
組成(当たり)を含有する栄養培地中で培養した: 海 塩 30g KH2PO4 1.5g NiCl2・6H2O 2mg 微量元素溶液 (DSM培地141参照) 10ml 酵母エキス 1g ペプトン 5g レザズリン 1mg 粉末イオウ 10g Na2S・9H2O 0.5g pH6.3−6.5,88℃ 硫化ナトリウムおよびイオウを含まない培地を20分間
ボイルし、氷上で冷却し窒素雰囲気下で分散した。次い
で培地を窒素雰囲気下、イオウを含有する100mlのバイ
アルに充てんした。殺菌用に培地を100℃に1時間毎日
3日間連続で加熱した。
組成(当たり)を含有する栄養培地中で培養した: 海 塩 30g KH2PO4 1.5g NiCl2・6H2O 2mg 微量元素溶液 (DSM培地141参照) 10ml 酵母エキス 1g ペプトン 5g レザズリン 1mg 粉末イオウ 10g Na2S・9H2O 0.5g pH6.3−6.5,88℃ 硫化ナトリウムおよびイオウを含まない培地を20分間
ボイルし、氷上で冷却し窒素雰囲気下で分散した。次い
で培地を窒素雰囲気下、イオウを含有する100mlのバイ
アルに充てんした。殺菌用に培地を100℃に1時間毎日
3日間連続で加熱した。
接種前に培地を、殺菌性中性硫化ナトリウム(5%溶
液)10ml/を添加して還元した。培地に10%の増殖し
た予備培養物を接種し次いで88℃で48〜58時間最終的に
インキュベートした。
液)10ml/を添加して還元した。培地に10%の増殖し
た予備培養物を接種し次いで88℃で48〜58時間最終的に
インキュベートした。
タンパク質分解活性のための分析 分析用混合物は、50mMトリス/グリシン緩衝液(pH9.
0)に溶解したカゼイン(ハーマルステン)0.25%を含
有していた。250μの酵素サンプルを2250μの分析
用混合物に90℃で添加することにより反応を開始せしめ
た。サンプル(500μ毎)を、30,60,90および120分後
に採取した。氷上で冷却して反応を停止させ次いで三塩
化酢酸(10%溶液)を添加した。混合物を室温で約30分
間放置し、その後12,000r.p.m.で30分間遠心分離した。
上澄みの吸光度を、ブランクに対し280nmで測定した。1
Uの酵素を言及した条件下毎分1μmolのチロシンを遊離
する酵素の量をして定義する。
0)に溶解したカゼイン(ハーマルステン)0.25%を含
有していた。250μの酵素サンプルを2250μの分析
用混合物に90℃で添加することにより反応を開始せしめ
た。サンプル(500μ毎)を、30,60,90および120分後
に採取した。氷上で冷却して反応を停止させ次いで三塩
化酢酸(10%溶液)を添加した。混合物を室温で約30分
間放置し、その後12,000r.p.m.で30分間遠心分離した。
上澄みの吸光度を、ブランクに対し280nmで測定した。1
Uの酵素を言及した条件下毎分1μmolのチロシンを遊離
する酵素の量をして定義する。
プロテアーゼの特性 カゼイン(ハーマルステン)を、緩衝液混合物中0.25
%の濃度で、pH6〜10でかつ65〜100℃の温度で溶解した
が、該混合物は、20mMのMES(2−〔N−モルホリノ〕
エタタンスルホン酸)、20mMのHEPES(N−2−ヒドロ
キシエチルピペラジン−N′−2エタンスルホン酸)お
よび20mMのグリシンから構成されていた。
%の濃度で、pH6〜10でかつ65〜100℃の温度で溶解した
が、該混合物は、20mMのMES(2−〔N−モルホリノ〕
エタタンスルホン酸)、20mMのHEPES(N−2−ヒドロ
キシエチルピペラジン−N′−2エタンスルホン酸)お
よび20mMのグリシンから構成されていた。
図に示すように、プロテアーゼ活性のレベルは最大pH
8〜10、約pH9付近に達した。pH6およびpH10で、それぞ
れ70%のタンパク質分解活性が検出できた。基質カゼイ
ンに対する最適タンパク質分解活性は95℃で生じた。約
80%の酵素活性は100℃で測定され、更に約20%の酵素
活性は65℃で測定された。
8〜10、約pH9付近に達した。pH6およびpH10で、それぞ
れ70%のタンパク質分解活性が検出できた。基質カゼイ
ンに対する最適タンパク質分解活性は95℃で生じた。約
80%の酵素活性は100℃で測定され、更に約20%の酵素
活性は65℃で測定された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−64786(JP,A) Biochem.J.,247(1) (1987),p.121−133 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) BIOSIS(DIALOG) EPAT(QUESTEL) WPI(DIALOG)
Claims (12)
- 【請求項1】次の特性: (a)pH8〜10に最適pHを有する; (b)90〜100℃に最適温度を有する; (c)スタフィロサーマス(Staphylothermus)属微生
物由来である; (d)下記の基質特異性: を有する; ことを特徴とするプロテアーゼ。 - 【請求項2】次の特性: (a)pH8〜10に最適pHを有する; (b)90〜100℃に最適温度を有する; (c)スタフィロサーマス・マリナス(Staphylothermu
s marinus),DSM No.3639由来のプロテアーゼの免疫化
学的性質と同一の免疫化学的性質を有する; (d)下記の基質特異性: を有する; 特徴とするプロテアーゼ。 - 【請求項3】スタフィロサーマス・マリナス(Staphylo
thermus marinus)由来の、請求項1又は2に記載のプ
ロテアーゼ。 - 【請求項4】前記スタフィロサーマス・マリナスがスタ
フィロサーマス・マリナスDSM 3639である、請求項3に
記載のプロテアーゼ。 - 【請求項5】炭素、および窒素源並びに無機塩を含有す
る適当な栄養培地中でスタフィロサーマス(Staphyloth
ermus)のプロテアーゼ生産株を培養し、次いで所望の
酵素を回収することを含んでなる、請求項1〜4のいず
れか1項に記載のプロテアーゼの調製方法。 - 【請求項6】スタフィロサーマス・マリナス(Staphylo
thermus marinus)の菌株を培養する、請求項5に記載
の方法。 - 【請求項7】スタフィロサーマス・マリナス(Staphylo
thermus marinus)DSM No.3639又はその突然変異体又は
その変異体を培養する、請求項6に記載の方法。 - 【請求項8】請求項1〜4のいずれか1項に記載のプロ
テアーゼを含んでなる、無粉塵性粒質物、液体、スラリ
ー又は保護された酵素の形態にある蛋白質分解洗剤用添
加剤。 - 【請求項9】前記液体が安定化液体である、請求項8に
記載の洗剤用添加剤。 - 【請求項10】請求項1〜4のいずれか1項に記載のプ
ロテアーゼを含んでなる、プロテアーゼ−含有洗剤組成
物。 - 【請求項11】1または複数の他の酵素を含んで成る、
請求項10に記載の洗剤組成物。 - 【請求項12】1または複数の他の酵素が、アミラー
ゼ、リパーゼ、セルラーゼ又はペルオキシダーゼであ
る、請求項11に記載の洗剤組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK1460/90 | 1990-06-15 | ||
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