DE69101638T2

DE69101638T2 - Thermostabile protease aus staphylothermus.

Info

Publication number: DE69101638T2
Application number: DE69101638T
Authority: DE
Inventors: Garabed Antranikian; Michael Klingeberg
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1991-06-14
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2011-06-15
Also published as: EP0535069B1; FI103516B1; KR100245616B1; US5346821A; ES2051596T3; WO1991019791A1; ATE103975T1; FI925676A0; DK0535069T3; EP0535069A1; DE69101638D1; JPH05507620A; FI103516B; DK146090D0; FI925676A; KR930701593A; JP3126728B2

Description

TECHNISCHES GEBIET

Diese Erfindung liegt im Gebiet hitzestabiler Proteasen. Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung neuartige hitzestabile Proteasen, ein Verfahren zur Herstellung dieser Enzyme und Waschmittelzusammensetzungen, die diese Enzyme umfassen.

HINTERGRUNDTECHNIK

Hyperthermophile Archaebakterien sind aus solfatarischen und unterseeischen hydrothermalen Systemen isoliert worden (Kelly, R.M. & Deming, J.W.; Biotech. Progress, 4, 47-62 (1988)). Es ist angenommen worden, daß Angehörige von Pyrococcus und Thermococcus hitzestabile Proteasen und Amylasen enthalten (Stetter, K.O.; J. Chem. Technol. Biotechnol., 42(4), 315-317 (1988)), aber Proteasen, die aus Angehörigen von Staphylothermus erhältlich sind sind noch nie vorhergesagt, isoliert oder in anderer Weise untersucht worden.

KURZE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung werden neuartige Enzyme, die außergewöhnliche Hitzestabilität sowie Hitzeaktivität zeigen, bereitgestellt. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine Protease zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein pH-Optimum im Bereich von pH 6,5 bis ein Temperatur-Optimum im Bereich von 90 bis 100ºC und immunchemische Eigenschaften besitzt, die identisch oder teilweise identisch zu denjenigen der aus Staphylothermus marinus, DSM Nr. 3639, gewonnenen Protease sind.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der hitzestabilen Proteasen der Erfindung zur Verfügung, wobei das Verfahren Kultivierung eines Protease-produzierenden Stammes von Staphylothermus in einem geeigneten Nährstoffmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, gefolgt von Gewinnung des gewünschten Enzyms umfaßt. In bevorzugten Ausführungsformen dieses Verfahrens wird ein Stamm von Staphylothermus marinus, vorzugsweise Staphylothermus marinus, DSM Nr. 3639, oder eine Mutante oder eine Variante desselben, kultiviert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Die vorliegende Erfindung wird weiter veranschaulicht durch Bezugnahme auf die beiliegende Zeichnung, in der die Figur die Beziehung zwischen der proteolytischen Aktivität der aus Staphylothermus marinus erhaltenen Protease und Temperatur bzw. pH zeigt.

DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Zuchtexperimente mit Staphylothermus haben nunmehr gezeigt, daß diese Organismen extrem hitzestabile und hitzeaktive Prottein-hydrolysierende Enzyme sekretieren. Diese Enzyme besitzen proteolytische Aktivität unter extremen Bedingungen. Die Eigenschaften der Staphylothermus-Proteasen werden belegt durch die aus Staphylothermus marinus erhaltene Protease. Ein Stamm von Staphylothermus marinus ist erhältlich von der DSM. Nr. 3639.
Wie aus der Figur deutlich wird, ist die aus Saphylothermus marinus erhältliche Protease in einem breiten Temperatur- und pH-Bereich aktiv, nämlich bei Temperaturen von unter 65ºC bis über 100ºC und bei PH-Werten von unter pH 6 bis über 10. Das Temperatur-Optimum liegt zwischen 90 und 100ºC, um 95ºC. Ungefähr 80% der proteolytischen Aktivität werden noch bei 100ºC nachgewiesen. Darüber hinaus wird aus der Figur deutlich, daß das Verhältnis zwischen Proteaseaktivität und pH zu einer flachen Aktivitätskurve führt, was bedeutet, daß die Protease sehr pH-tolerant ist, wobei sie eine im allgemeinen hohe proteolytische Aktivität über einen breiten pH-Bereich besitzt. In dieser Hinsicht besitzen die Proteasen gemäß der Erfindung ein pH-Optimum im Bereich von pH 6,5 bis 10, spezifischer zwischen pH 8 und pH 10, noch spezifischer zwischen pH 8,5 und pH 9 5, um pH 9. Bei pH 6 bzw. 10 werden etwa 70% der proteolytischen Aktivität nachgewiesen.
In Tabelle 1 sind einige der Eigenschaften der aus Staphylothermus sp. erhältlichen Proteasen dargestellt. Tabelle 1 Staphylothermus marinus pH-Optimum Temperatur-Optimum Typ Substratspezivität Serin Suc = Succinyl pNA = p-Nitroanilid Pip = Piperazin

Immunchemische Eigenschaften

Die immunchemischen Eigenschaften können immunologisch durch Kreuzreaktionsidentitätstests bestimmt werden. Die Identitätstests können mit dem gut bekannten Ouchterlony-Doppelimmundiffusionsverfahren oder mit Tandem-Kreuzimmunelektrophorese gemäß N. H. Axelsen; Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques; Blackwell Scientific Publications (1983), Kapitel 5 und 14, durchgeführt werden. Die Begriffe "antigenische Identität" und "teilweise antigenische Identität" sind in demselben Buch, Kapitel 5, 19 und 20, beschrieben.

Herstellung der Proteasen

Die Proteasen gemäß der vorliegenden Erfindung sind erhältlich aus Angehörigen der Gattung Staphylothermus, z.B. Staphylothermus marinus.
Die Proteasen der Erfindung können hergestellt werden durch Kultivierung eines Protease-produzierenden Stammes von Angehörigen von Staphylothermus in einem geeigneten Nährstoffmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, und Ernten des gewünschten Enzyms.
Die Protease gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden.

Waschmittelzusammensetzungen

Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften der Proteasen gemäß der vorliegenden Erfindung sind diese Enzyme von großem Interesse für industrielle Anwendungszwecke, z.B. für die Verwendung in der Waschmittelindustrie.
Die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung kann ein oder mehrere Tenside umfassen, die von einem anionischen, nichtionischen, kationischen, amphoterischen oder zwitterionischen Typ sein können, oder eine Mischung von diesen Typische Beispiele von anionischen Tensiden sind lineare Affikylbenzolsulfonate (LAS); Alkylsulfate (AS); Alpha-Olefinsulfonate (AOS); Alkoholethoxysulfate (AES) und Alkalimetallsalze natürlicher Fettsäuren. Beispiele für nicht-ionische Tenside sind Alkylpolyethylenglykolether; Nonylphenolpolyethylenglykolether; Fettsäureester von Saccharose und Glucose; und Ester von polyethoxylieriem Alkylglucosid.
Die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung kann auch andere Waschmittelbestandteile enthalten, die in der Technik bekannt sind, wie etwa Builder, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Antikorrosionsmittel, Maskierungsmittel, Mittel zur Verhinderung erneuter Ablagerung von Schmutz, Duftstoffe, Stabilisatoren für die Enzyme und Bleichmittel, Formulierungshilfsstoffe, optische Aufheller, Schaumverstärker, Chelatbildner, Füllstoffe, Gewebeerweicher, etc.. Die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung kann formuliert werden, wie im wesentlichen beschrieben in J. Falbe [Falbe. J.; Surfactants in Consumer Products. Theory, Technology and Application; Springer Verlag 1987, siehe insbesondere den Abschnitt mii dem Titel "Frame formulations for liquid/powder heavy-duty detergents"].
Es wird gegenwärtig in Betracht gezogen, daß die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung die Enzymzubereitung in einer Menge enthalten kann, die 0,0005-0,5 CPU des proteolytischen Enzyms pro Liter Waschlauge entspricht.
Die Waschmittelzusammensetzungen der Erfindung können in jeder geeigneten Form formuliert werden, wie etwa Pulver, Flüssigkeiten, etc..
Die Waschmittelzusammensetzung der Erfindung kann vorteilhafterweise ein oder mehrere andere Enzyme einschließen, z.B. Lipasen; Amylasen; Cellulasen; und/oder Peroxidasen, die herkömmlicherweise in Waschmittelzusammensetzungen einbezogen werden.
Die Protease der Erfindung kann in eine Waschmittelzusammensetzung eingebracht werden, indem separate Zusatzstoffe, die die Waschmittel-Protease enthalten, zugegeben werden oder indem ein kombinierter Zusatzstoff zugegeben wird, der verschiedene Waschmittel-Enzyme umfaßt.
Der Zusatzstoff der Erfindung kann z.B. als Granulate, Flüssigkeiten, Aufschlämmungen, etc. formuliert sein. Bevorzugte Waschmittelzusatzstoff-Formulierungen sind nicht-staubende Granulate, Flüssigkeiten, insbesondere stabilisierte Flüssigkeiten, Aufschlämmungen oder geschützte Enzyme. Staubfreie Granulate können gemäß z.B. GB 1,362,365 oder U.S 4,106,991 hergestellt und fakultativ mit in der Technik bekannten Verfahren beschichtet werden. Die Waschmittel-Enzyme können vor oder nach Granulierung vermischt werden. Flüssige Enzymzubereitungen können z.B. durch Zugabe eines Polyols, wie etwa z.B. Propylenglykol; eines Zuckers oder Zuckeralkohols; von Milchsäure oder Borsäure, gemäß eingeführten Verfahren stablisiert werden. Andere Enzymstabilisatoren sind in der Technik gut bekannt. Geschützte Enzyme können gemäß dem in EP 238,216 offenbarten Verfahren hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter.

BEISPIEL 1 KULTIVIERUNG VON STAPHYLOTHERMUS MARINUS

Staphylothermus marinus, DSM Nr. 3639, wurde in einem Nährstoffmedium kultiviert, das die folgenden Bestandteile (pro Liter) enthielt:
Seesalz 30 g
KH&sub2;PO&sub4; 1,5g
NiCl&sub2; 6H&sub2;O 2 mg
Spurenelementlösung (siehe DSM-Medium 141) 10 ml
Hefeextrakt 1g
Pepton 5 g
Resazurin 1 mg
Schwefel, pulverisiert 10 g
Na&sub2;S 9H&sub2;O 0,5 g
pH 6,3-6,5, 88ºC
Das Medium ohne Natriumsulfid und Schwefel wurde 20 Minuten gekocht, auf Eis abgekühlt und unter N&sub2;-Atmosphäre abgezogen. Das Medium wurde dann unter N&sub2;-Atmosphäre in 100 ml-Ampullen, die Schwefel enthielten, abgefüllt. Zur Sterilisierung des Mediums wurde auf 100ºC für 1 Stunde an jedem von 3 aufeinanderfolgenden Tagen erhitzt.
Vor Beimpfung wurde das Medium durch Zugabe von 10 ml/l sterilem, neutralen Natriumsulfid (5%ige Lösung) reduziert. Das Medium wurde mit 10% einer gezüchteten Vorkultur beimpft und schließlich bei 88ºC für 48-58 Stunden inkubiert.

Test auf proteolytische Aktivität

Die Testmischung enthielt 0,25% Casein (Hammarsten), das in 50 mM Tris/Glycin-Puffer, pH 9,0, gelöst war. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 250 ul Enzymprobe zu 2250 ul Testmischung bei 90ºC eingeleitet. Proben (jeweils 500 ul) wurden nach 30, 60, 90 und 120 min genommen. Die Reaktion wurde durch Abkühlen auf Eis und nach der Zugabe von Trichloressigsäure (10%ige Lösung) gestoppt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für etwa 30 Minuten stehengelassen und anschließend für 10 Minuten bei 12.000 UPM zentrifugiert. Die Extinktion des Überstands wurde bei 280 nm gegen eine Blindprobe bestimmt. 1 U Enzym ist definiert als diejenige Enzymmenge, die 1 uMol Tyrosin pro Minute unter den spezifizierten Bedingungen freisetzt.

Charakterisierung der Protease

Casein (Hammerstein) wurde bei einer Konzentration von 0,25% in einer Puffermischung gelöst, die zusammengesetzt war aus 20 mM MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure), 20 mM HEPES (N-2- Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) und 20 mM Glycin, bei pH-Werten von 6 bis 10 und bei Temperaturen von 65 bis 100ºC.
Wie in der Figur dargestellt, erreichte das Niveau der Protease-Aktivität ein Maximum zwischen pH 8 und 10, um pH 9. Bei einem pH-Wert von 6 bzw. 10 konnten ungefähr 70% der proteolytischen Aktivität nachgewiesen werden. Optimale proteolytische Aktivität für das Substrat casein trat bei 95ºC auf. Ungefähr 80% der Enzymaktivität wurden bei 100ºC gemessen und ungefähr 20% der Enzymaktivität wurden bei 65ºC gemessen.

Claims

1. Protease, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgenden Eigenschaften besitzt:

(a) pH-Optimum im Bereich von pH 6,5 bis 10;

(b) Temperatur-Optimum im Bereich von 90 bis 100ºC;

(c) immunchemische Eigenschaften, die identisch oder teilweise identisch zu denjenigen der aus Staphylothermus marinus, DSM Nr.3639, gewonnenen Protease sind.

2. Protease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Stamm gewonnen ist, der zur Gattung Staphylothermus gehört.

3. Protease nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Stamm der Spezies S. marinus gewonnen ist.

4. Protease nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus dem Stamm S. marinus, DSM 3639, gewonnen ist.

5. Verfahren zur Herstellung einer Protease nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das Verfahren Kultivierung eines Protease-produzierenden Stammes von Staphylothermus in einem geeigneten Nährstoffmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, gefolgt von Gewinnung des gewünschten Enzyms umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem ein Stamm von S. marinus kultiviert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem S. marinus, DSM Nr. 3639, oder eine Mutante oder eine Variante desselben, kultiviert wird.

8. Proteolytischer Waschmittelzusatzstoff, in der Form eines nicht-staubenden Granulats, einer Flüssigkeit, insbesondere einer stabilisierten Flüssigkeit, einer Aufschlämmung oder eines geschützten Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß er die Protease nach einem der Ansprüche 1-4 umfaßt.

9. Protease enthaltende Waschmittelzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Protease nach einem der Ansprüche 1-4 umfaßt.

10. Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 9, die außerdem ein oder mehrere andere Enzyme umfaßt, insbesondere Amylasen, Lipasen, Cellulasen oder Peroxidasen.