KR100249995B1

KR100249995B1 - 터모코쿠스 유래 열안정성 프로테아제

Info

Publication number: KR100249995B1
Application number: KR1019920702952A
Authority: KR
Inventors: 가라베트안트라니키안; 크링게베르그 미하엘
Original assignee: 한센 핀 베네드, 안네 제헤르; 노보 노르디스크 에이/에스
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1991-06-14
Publication date: 2000-03-15
Also published as: FI925677A; DK145890D0; FI103669B1; DK0535110T3; JP3126729B2; DE69105974D1; EP0535110B1; DE69105974T2; FI925677A0; JPH05507621A; WO1991019792A1; EP0535110A1; ES2065695T3; ATE115624T1; FI103669B

Abstract

본 발명은 열안정성 프로테아제의 분야에 속하는 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 Thermococcus celer, Thermococcus stetteri 또는 Thermococcus litoralis로부터 유래되는 열안정성 프로테아제, 이들 효소의 제조방법 그리고 이들 효소를 포함하는 세제조성물에 관한 것이다. 이 효소는 75℃ 내지 100℃ 범위의 최적 온도와 6.0 내지 10범위의 최적 pH를 갖는다.

Description

터모코쿠스(Thermococcus) 유래 열안정성 프로테아제

[도면의 간단한 설명]

본 발명을 첨부한 도면에 의해 더 설명한다. 제1도 내지 제4도는 Thermococcus celer; Thermococcus sp. AN1; Thermococcus stetteri; Thermococcus litoralis로부터 얻어진 프로테아제의 효소활성과 온도 및 pH와의 관계를 각각 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 열안정성 프로테아제의 분야에 속하는 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 신규의 열안정성 프로테아제, 이 효소의 제조방법, 및 이 효소를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

[배경기술]

초호열성 시원세균이 황질분기공 및 해저 열수계로부터 분리되었다(예컨대, Kelly, R.M. ＆ Deming, J.W.; Biotech. Progress, 4,47-62 (1988) 참조). Thermococcus에 속하는 것은 열안정성 프로테아제 및 아밀라제를 포함한다고 추정되어 왔다(Stetter, K.O.; J. Chem. Technol. Biotechnol., 42(4),315-317 (l988)). 그러나 Thermococcus 유래 프로테아제는 지금까지 분리되거나 조사되지 않았다.

[발명의 개요]

본 발명의 범위내에서 열활성 뿐만 아니라 현저한 열안정성을 나타내는 신규의 효소가 제공되었다. 따라서, 본 발명의 첫번째 양태는, 6.0 내지 10.0 범위의 최적 pH와 75℃ 내지 100℃범위의 최적 온도를 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 양태는 6.0 내지 10.0 범위의 최적 pH, 75℃ 내지 100℃ 범위의 최적 온도, 및 Thermococcus celer, DSM No.2476; Thermococcus sp. AN1, DSM No.2770; Thermococcus stetteri DSM No.5262; 또는 Thermococcus litoralis, DSM No. 5474로부터 유래되는 프로테아제의 면역화학적 성질과 동일한 또는 부분적으로 동일한 면역화학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는, 이들 프로테아제를 제조하는 방법으로서, 탄소 및 질소원 그리고 무기염을 포함하는 적당한 영양배지에서 프로테아제를 생산하는 Thermococcus 균주를 배양하고, 이어서 원하는 효소를 채취하는 것으로 구성된 방법을 제공하는 것이다.

이 방법의 바람직한 실시태양에서는, Thermococcus celer 균주; Thermococcus sp. AN1 균주; Thermococcus stetteri 균주; 또는 Thermococcus litoralis 균주를 배양한다.

이 방법의 보다 바람직한 실시태양에서는, Thermococcus celer, DSM No. 2476; Thermococcus sp. ANl, DSM No. 2770; Thermococcus stetteri, DSM No. 5262; 또는 Thermococcus litoralis DSM No. 5474; 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체를 배양한다.

Thermococcus의 생장실험은 이들 생물체가 매우 열안정적이고 열활성적인 단백질 가수분해 효소를 분비한다는 것을 보여주었다. 이들 효소는 극단의 조건하에서 단백질분해활성을 갖는다. Thermococcus의 이런 성질은 Thermococcus celer, Thermococcus sp. AN1, Thermococcus stetteri, 및 Thermococcus litoralis에 의해 입증되었다. Thermococcus celer 균주는 DSM No. 2576으로부터 얻을 수 있고, Thermococcus sp. AN1 균주는 DSM No. 2770으로부터 얻을 수 있고, Thermococcus stetteri 균주는 DSM No.5262로부터 얻을 수 있고, Thermococcus litoralis 균주는 DSM No.5474로부터 얻을 수 있다.

도면에 나타난 바와 같이, Thermococcus로부터 얻을 수 있는 프로테아제는 6.0 내지 10.0 범위의 최적 pH, 및 75℃ 내지 100℃ 범위의 최적 온도로 특정지을 수 있다.

또한, 제1도에 나타난 바와 같이, Thermococcus celer로부터 얻을 수 있는 프로테아제는 넓은 온도범위, 즉 아래로는 75℃부터 위로는 110℃까지의 온도, 및 아래로는 5.5부터 위로는 10.5까지의 pH 범위에서 활성이 있다. 최적 온도는 90℃ 내지 100℃이며, 보다 상세하게는 약 95℃이다. 75℃에서는 60%의 효소활성이 검출되었고, 110℃에서는 40%의 효소활성이 검출되었다. 이 효소는 6.5 내지 8.5의 범위, 보다 상세하게는 7.0 내지 8.0의 범위(약 7.5)에서 최적 pH를 갖는다. 각각 pH 5.5와 pH 10.0에서도 여전히 상당한 효소활성이 검출된다.

제2도에 따르면, Thermococcus sp. AN1으로부터 얻을 수 있는 프로테아제는 50℃ 내지 110℃의 온도범위, 그리고 아래로는 5.5부터 10까지의 pH 범위에서 활성이 있다. 이 프로테아제는 80℃ 내지 100℃의 범위, 보다 상세하게는 약 90℃의 온도에서 최적 온도를 가지며 6.0 내지 8.0의 pH 범위, 보다 상세하게는 약 7.0의 pH에서 최적 pH를 갖는다.

제3도에 의하면, Thermococcus stetteri로부터 얻을 수 있는 프로테아제는 45℃ 내지 100℃ 온도범위, 및 5.5 내지 10의 pH 범위에서 활성이 있다는 것을 알 수 있다. 이 프로테아제는 75℃ 내지 85℃의 온도범위, 보다 상세하게는 약 80℃의 온도에서 최적 온도을 갖는다. 그리고 pH 8 내지 10의 범위, 보다 상세하게는 약 9.0의 pH에서 최적 pH를 갖는다.

제4도에 의하면, ThermococcLls litoralis로부터 얻을 수 있는 프로테아제는 60℃ 내지 100℃의 온도범위와 6.5 내지 11의 pH 범위에서 활성이 있다는 것을 알 수 있다. 이 프로테아제는 90℃ 내지 100℃의 온도범위, 보다 상세하게는 약 95℃에서 최적 온도를 갖고, 8 내지 10의 pH 범위, 보다 상세하게는 약 9.0의 pH에서 최적 pH를 갖는다. Thermococcus sp.로부터 유래된 프로테아제의 몇몇 성질을 표 1에 나타내었다.

[표 1]

Suc = 숙신일

pNA = p-니트로아닐리드

Pip = 피페라진

면역화학적 성질은 교차반응 동일성 테스트에 의해 면역학적으로 결정할 수 있다. 동일성 테스트는 N. H Axelsen; 겔에서의 면역침강기술 안내서; Blackwell Scientific PLlblications (1983), 제5장 및 제14장에 따른 직렬 교차 면역전기이동(tandem crossed immunoelectrophoresis) 또는 잘 알려진 오크테르로니 2중 면역확산방법(0uchterlony double immunodiffusion procedure)에 의해 수행될 수 있다. "항원동일성" 및 "부분항원 동일성" 이라는 용어는 같은 책 제5장, 제19장 및 제20장에 기술되어 있다.

[프로테아제의 제조]

본 발명에 따른 프로테아제는 탄소 및 질소원과 무기염을 함유하는 적당한 영양배지에서 프로테아제를 생산하는 Thermococcus 균주를 배양하고, 이어서 원하는 효소를 채취하는 당해 기술분야에 알려진 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 프로테아제는 또한 재조합 DNA 기술에 의해서도 제조될 수 있다.

[세제조성물]

본 발명에 따른 프로테아제의 독특한 성질로 인해, 이들 효소는 예컨대 세제 산업에의 이용과 같은 산업적인 이용에 대해 큰 이점이 있다.

본 발명의 세제조성물은 음이온, 비이온, 양이온, 양쪽성 또는 쯔비터이온형, 또는 이들의 혼합물일 수 있는 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 음이온형적인 예는 선형 알킬벤젠술포네이트(LAS); 알킬술페이트(AS); 알파(AOS); 알코올에톡시술페이트(AES) 및 천연 지방산의 알칼리금속염이다. 비이온 계면활성제의 예는 알킬폴리에릴렌글리콜에테르; 노닐페놀폴리에틸렌글리콜에테르; 수크로스 및 글루코스의 지방산 에스테르; 및 폴리에톡실화 알킬글루코시드의 에스테르이다.

본 발명의 세제조성물은 또한 증강제, 표백제, 표백활성제, 내식제, 금속이온봉쇄제, 오물재침전억제제, 향료, 효소 및 표백제의 안정화제, 제제보조제, 광학적 광택제, 거품 부스터, 킬레이트제, 충전제, 직물 연화제 등과 같은 당해 기술분야에 알려져 있는 다른 세제성분을 함유할 수도 있다. 본 발명의 세제조성물은 J. Falbe [Falbe, H.; Surfactants in Consumer Products. Theory, Technology and Application; Springer Verlag 1987, 특히 "Frame formulations for l iguid/powder heavy-duty detergent"라는 제목의 절 참조]에 기술되어 있는 것에 따라 실질적으로 제조할 수 있다.

현재, 본 발명의 세제조성물은 세척액 1리터당 단백질분해 효소 0.0005-0.5CPU에 대응하는 양으로 효소제제를 함유할 수 있는 것으로 생각된다.

본 발명의 세제조성물은 분말, 액체 등과 같은 임의의 편리한 형태로 조제될 수 있다.

본 발명의 세제조성물은 세제조성물에 통상적으로 포함되는 예컨대 리파제;아밀라제; 셀룰라제 및/또는 퍼옥시다제와 같은 하나 이상의 다른 효소를 유리하게 포함할 수 있다.

본 발명의 프로테아제는 세제 프로테아제를 함유하는 별도의 첨가제를 첨가시키는 것에 의해 또는 다른 세제효소를 포함하는 조합된 첨가제를 첨가시키는 것에 의해 세제조성물에 포함시킬 수 있다.

본 발명의 첨가제는 예컨대 과립, 액체, 슬러리 등과 같은 것으로 조제할 수 있다. 바람직한 세제첨가제 제제는 비분진성 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 슬러리 또는 보호 효소이다. 분진 없는 과립은 예컨대 영국특허 제1,362,365호 또는 미국특허 제4,106,991호에 따라 생산할 수 있고, 선택적으로 당해 기술분야에 알려진 방법에 따라 코팅시킬 수도 있다. 세제효소는 과립화전 또는 후에 혼합시킬 수 있다. 액체효소 제제는, 예컨대 확립되어 있는 방법에 따라, 예컨대 프로필렌글리콜과 같은 폴리올; 당 또는 당알코올; 락트산 또는 붕산을 첨가시켜서 안정화시킬 수 있다. 다른 효소 안정화제도 당해기술 분야에 잘 알려져 있다. 보호 효소는 유럽특허 제238,216호에 개시된 방법에 따라 조제될 수 있다.

다음의 실시예로 본 발명을 더 설명한다.

[실시예 1]

Thermococcus celer의 배양

Thermococcus celer DSM No. 2476을 아래의 성분을 함유하는 영양배지에서 배양하였다 (1 리터당).

NaCl 40.00g

(NH₄)₂SO₄1.30g

KH₂PO₄0.28g

MgSO₄·7H₂O 0.25g

CaCl₂·2H₂O 0.07g

FeCl₃·6H₂O 2.000mg

MnCl₂·4H₂O 1.800mg

Na₂B₄O₇·1OH₂O 4.500mg

ZnSO₄·7H₂O 0.220mg

CuCl₂·2H₂O 0.050mg

Na₂MoO₄·2H₂O 0.030mg

VOSO₄·5H₂O 0.038mg

C_OSO₄0.010mg

효모추출물 1.00g

팹톤 1.00g

레사주린 1.000mg

황(분말) 5.00g

Na₂S·9H₂O 0.50g

pH는 5.8로 조정

황화나트륨 및 황이 없는 배지를 20분 동안 끓이고, 얼음상에서 냉각하여 질소분위기하에서 조제하였다. 다음에 이 배지를 질소 분위기하에서 황이 들어 있는 100㎖ 바이알에 채웠다. 살균을 위해 이 배지를 연속3 일간 매일 1시간 동안 100℃로 가열하였다.

접종하기 전에 이 배지를 10㎖/ℓ의 무균 중성 황화나트륨(5% 용액)을 첨가함으로서 환원시켰다. 이 배지에 10%의 성장된 예비배양물(preculture)을 접종하고 최종적으로 88℃에서 24-36시간 동안 배양하였다.

(단백질분해활성의 측정)

효소반응은 0.25%의 카세인(Hammarsten, Serva, Heidelberg, 독일)을 함유하는 pH 7의 50mM 인산염 완충용액에서 실시하였다. 이 반응은 250㎕의 세포 현탁액을 2250μ1의 측정 혼합물에 첨가시키는 것에 의해 개시하였다. 90℃에서 30,60,90 및 120분 동안 배양후에 샘플(각 500μ1)을 취하였다. 얼음상에서 샘플을 냉각시키고 500㎕의 트리클로아세트산(10% 용액)을 첨가시켜 반응을 중지시켰다. 혼합물을상온에서 30분동안방치한 후에 12000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액의 흡광도를 바탕값(blank)에 대하여 280nm에서 측정하였다. 효소 1U는 1분당 티로신 1㎛을 유리시키는 효소의 양으로 정의한다.

[프로테아제의 특성화]

효소활성에 대한 pH 및 온도의 영향을 연구하기 위해 20mM의 MES(2-[N-모르폴리노]에탄술폰산), 20mM의 HEPES(N-2-히드록시에틸구성된 완충용액 혼합물을 사용하였다. pH값은 5.5부터 11.0까지 0.5씩 증가하게 변화를 주었고, 온도는 75℃부터 110℃까지 변화를 주었다. 카세인(0.25%)을 기질로 사용하였다.

제1도에 나타난 바와 같이 T. celer로부터 유래된 프로테아제는 넓은 온도 및 pH 범위에서 활성이 되었다. 75℃ 및 110℃에서도 각각 60% 및 40%의 효소활성이 여전히 검출되었다. 최적 온도는 90 내지 100℃이다 이 효소는 약 pH 7.5의 최적 pH를 갖고, pH 5 및 pH 10에서도 또한 상당한 활성이 검출되었다.

[실시예 2]

Thermococcus sp. AN1의 배양

Thermococcus sp. AN1, DSM No. 2770을 아래의 성분을 함유하는 영양배지에서 배양하였다(1리터당).

트립티카제(BBL) 10.0g

KH₂PO₄1.5g

NaCl 2.5g

황(분말) 8.0g

Na₂S·9H₂O 0.5g

레사주린 1.0mg

pH는 7.3으로 조정

황화나트륨 및 황이 없는 배지를 20분 동안 끓이고, 얼음상에서 냉각시켜 N₂분위기하에서 조제하였다. 다음에 이 배지를 질소 분위기하에서 황이 들어 있는 100ml 바이알에 채웠다. 살균을 위해 이 배지를 연속 3일간 pH일 1시간 동안 100℃로 가열하였다. 10%의 성장된 예비배양물로 접종하기 전에 이 배지를 10ml/l의 무균 중성 황화나트륨(5% 용액)을 첨가하여 환원시켰다. 박테리아를 75℃에서 24-36시간 동안 배양하였다.

[단백질분해활성의 측정]

효소반응은 0.25%의 카세인(Hammarsten, Serva, Heidelberg, 독일)을 함유하는 pH 7의 50mM 인산염 완충용액에서 수행하였다. 이 반응은 250㎕의 세포 현탄액을 2250㎕의 측정 혼합물에 첨가시켜서 개시하였다. 80℃에서 30,60,90 및 120분 동안 배양한 후에 샘플(각 500㎕)을 취하였다. 얼음상에서 샘플을 냉각시기고 500㎕의 트리클로로아세트산(10% 용액)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 혼합물을 상온에서 30분 동안 방치한 후효소 1U는 1분당 1㎛의 티로신을 유리시키는 효소의 양으로 정의한다.

[프로테아제의 특성화]

pH값이 5.5 내지 9이고 온도가 50 내지 110℃인 20mM의 MES(2-[N-모르폴리노]에탄술폰), 20mM의 HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산) 및 20mM 글리신으로 구성된 완충용액 혼합물에 카세인(Hammarsten)을 0.25%의 농도로 용해시켰다.

제2도에 나타낸 것과 같이, 프로테아제 활성수준은 약 pH 7에서 최대를 이루었다. pH값 5.5 및 9.0에서는 대략 35%의 활성이 검출될 수 있었다. 카세인 기질에 대한 최적 단백질분해활성은 90℃에서 발생하였다. 100℃에서는 대략 50%의 효소활성이 측정되었다.

[실시예 3]

Thermococcus stetteri의 배양

Thermococcus stetteri, DSM No. 5262를 아래의 성분을 함유하는 영양배지에서 배양하였다(1리터당).

NaCl 25.00g

NH₄Cl 0.33g

CaCl₂·2H₂O 0.33g

MgCl₂·6H₂O 0.33g

KCl 0.33g

KH₂PO₄0.33g

미량원소용액

(DSM-배지 320 참조) 1.0㎖

비타민용액

(DSM-배지 320 참조) 10.0㎖

트립티가제 BBL 5.00g

분말황 10.00g

레사주린 1.00mg

Na₂S·9H₂O 0.50g

pH 5.7

황화나트륨 및 황이 없는 배지를 20분 동안 끓이고, 얼음상에서 냉각하여 N₂분위기하에서 조제하였다.

이 배지를 N₂분위기하에서 황이 들어 있는 100㎖ 바이알에 채웠다. 살균을 위하여 이 배지를 연속 3일간 pH일 1시간 동안 100℃로 가열하였다. 10%의 성장된 예비배양물로 접종하기 전에 이 배지를 10㎖/ℓ의 무균 중성 황화나트륨(5% 용액)을 첨가하여 환원시켰다. 박테리아를 80℃에서 24-36시간 동안 배양하였다.

[단백질분해활성의 측정]

측정 혼합물은 pH 9.0인 50mM의 트리스/글리신 완충용액에 용해되어 있는 0.25% 카세인(Hammarsten)을 포함하였다. 이 반응은 80℃에서 250㎕의 효소 샘플을 2350㎕의 측정혼합물에 첨가시켜서 개시하였다 30,60,90,120분 배양 후에 샘플(각 500㎕)을 취하였다. 얼음상에서 샘플을 냉각시키고 500ml의 트리클로아세트산(10%)을 침가하여 반응을 중지시켰다. 이 혼합물을 실온에서 약 30분 동안 방치한 후 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액의 흡광도를 바탕값에 대하여 280nm에서 측정하였다. 효소 1U는 상술한 조건하에서 1분당 1㎛의 티로신을 유리시기는 효소의 양으로 정의한다.

[프로테아제의 특성화]

pH값이 5.5 내지 10이고 온도가 45 내지 100℃인 20mM의 MES(2-[N-모르폴리노]에탄술폰산), 20mM의 HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산) 및 20mM 글리신으로 구성된 완충용액 혼합물에 카세인(Hammarsten)을 0.25%의 농도로 용해시 켰다.

제3도에 나타낸 바와 같이, 프로테아제 활성의 수준은 약 pH 9.0에서 최대에 달하였다. 5.5의 pH값에서는 약 30%의 효소활성을 검출할 수 있었고 pH 10에서는 약 70%의 활성을 검출할 수 있었다. 카세인 기질에 대한 최적 단백질분해활성은 80℃에서 발생하였으며 45℃에서는 약 30%의 효소활성이 측정되었다.

[실시예 4]

Thermococcus litoralis의 배양

Thermococcus litoralis, DSN No. 5474를 아래의 성분을 함유하는 영양배지에서 배양하였다 (1리터당).

NaCl 19.45g

MgCl₂·6H₂O 12.60g

Na₂SO₄3.42g

CaCl₂·2H₂O 2.38g

KCl 0.55g

Na₂CO₃0.61g

KBr 0.08g

SrCl₂57.2mg

Na₂HPO₄10.0mg

Na 메타실리케이트 4.0mg

NaF 2.4mg

KNO₃1.6mg

레사주린 100.0mg

효모추출물 1.0mg

박토팹톤 5.0mg

황(분말) 10.0g

Na₂S·9H₂O 0.5g

1000ml 까지의 증류수로 pH를 6.5로 함

황화나트륨 및 황이 없는 배지를 20분 동안 끓이고, 얼음상에서 냉각하여 N₂분위기하에서 조제하였다. 이 배지를 질소 분위기하에서 황이 담겨 있는 100㎖ 바이알에 채웠다. 멸균을 위하여 이 배지를 연속 3일간 pH일 1시간 동안 100℃로 가열하였다. 접종하기 전에 배지를 무균 중성 황화나트륨(5% 용액) 10㎖/ℓ를 첨가하여 환원시켰다. 이 배지를 10%의 성장된 예비배양물로 30%의 효소활성이 측정되었다.

[단백질분해활성의 측정]

측정 혼합물은 pH 9.0인 50mM의 트리스/글리신 완충용액에 용해되어 있는 0.25% 카세인(Hamnlarsten)을 포함하였다. 이 반응은 90℃에서 250㎕의 효소 샘플을 2350㎕의 측정혼합물에 첨가하여 개시하였다. 30,60,90,120분 배양 후에 샘플(각 500μ1)을 취하였다. 냉각 및 500ml의 트리클로로아세트산(10%)의 첨가에 의해 반응을 중지시켰다. 이 혼합물을 상온에서 약 30분 동안 방치한 후 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액의 흡광도는 바탕값에 대하여 280nm에서 측정하였다. 효소 1U는 상술한 조건하에서 1분당 1㎛의 티로신을 유리시키는 효소의 양으로 정의한다.

[프로테아제의 특성화]

pH가 6.5 내지 11이고 온도가 60 내지 100℃인 20mM의 MES(2-[N-모르폴리노]에탄술폰산), 20mM의 HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산) 및 20mM의 글리신으로 구성된 완충용액 혼합물에 카세인(Hammarsten)을 0.25%의 농도로 용해시켰다.

제4도에 나타낸 바와 같이, 프로테아제 활성수준은 대략 pH 9에서 최대값에 달하였다. pH 5.5 및 pH 11에서는 약 10%의 활성을 검출할 수 있었다. 카세인 기질에 대한 최적 단백질분해활성은 95℃에서 발생하였다. 100℃에서는 약 90%의 효소활성이 측정되었고, 6.0℃에서는 약 30%의 효소활성이 측정되었다.

Claims

(a) pH 6.5 내지 pH 8.5 범위의 최적 pH;

(b) 90℃ 내지 100℃ 범위의 최적 온도;

(c) Thermococcus celer, DSM No.2476으로부터 유래되는 프로테아제의 면역화학적 성질과 동일한 면역화학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
제1항에 있어서, Thermococcus celer, DSM No.2476 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
(a) pH 6.0 내지 pH 8.0 범위의 최적 pH;

(b) 80℃ 내지 100℃ 범위의 최적 온도;

(c) Thermococcus sp. AN1, DSM No.2770으로부터 유래되는 프로테아제의 면역화학적성질과 동일한 면역화학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
제3항에 있어서, Thermococcus sp. ANl, DSM No.2770 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
(a) pH 8.0내지 pH 10 범위의 최적 pH;

(b) 75℃ 내지 85℃ 범위의 최적 온도;

(c) Thermococcus stetteri , DSM No.5262로부터 유래되는 프로테아제의 면역화학적 성질과 동일한 면역화학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
제5항에 있어서, Thermococcus stetteri, DSM No. 5626 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
(a) pH 8.0 내지 pH 10 범위의 최적 pH;

(b) 90℃ 내지 100℃ 범위의 최적 온도;

(c) Thermococcus litoralis, DSM No.5474로부터 유래되는 프로테아제의 면역화학적성질과 동일한 면역화학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제.
제7항에 있어서, Thermococcus litoralis, DSM No.5474 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 프로데아제.
제1항 또는 제2항에 따른 프로테아제의 제조방법에 있어서, 탄소 및 질소원 그리고 무기염을 함유하는 적당한 영양배지에서 프로테아제를 생산하는 Thermococcus celer 균주를 배양하고, 이어서 원하는 효소를 채취하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, Thermococcus celer, DSM No.2476을 배양하는 것을 특징으 로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 따른 프로테아제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비분진성 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 슬러리, 또는 보호효소 헝태의 단백질분해 세제첨가제.
제1항 또는 체 2항에 따른 프로테아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 함유 세제조성물.
제12항에 있어서, 하나 이상의 다른 효소, 특히 아밀라제, 리파제, 셀룰라제, 또는 퍼옥시다제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세제조성물.
제3항 또는 제4항에 따른 프로테아제의 제조방법에 있어서, 탄소 및 질소원 그리고 무기염을 함유하는 적당한 영양배지에서 프로테아제를 생산하는 Thermococcus sp. ANl 균주를 배양하고, 이어서 원하는 효소를 채취하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, Thermococcus sp. ANl, DSM No. 2770을 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
(신설) 제3항 또는 제4항에 따른 프로테아제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비분진성 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 슬러리, 또는 보호효소 형태의 단백질분해 세제첨가제
(신설) 제3항 또는 제4항에 따른 프로데아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 함유 세제조성물.
제17항에 있어서, 하나 이상의 다른 효소, 특히 아밀라제, 리파제, 셀룰라제, 또는 퍼옥시다제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세제조성물.
(신설) 제5항 또는 제6항에 따른 프로테아제의 제조방법에 있어서, 탄소 및 질소원 그리고 무기염을 함유하는 적당한 영양배지에서 프로테아제를 생산하는 Thermococcus stetteri 균주를 배양하고, 이어서 원하는 효소를 채취하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
(신설) 제19항에 있어서, Thermococcus stetteri, DSM No.5262를 배양하는 것을 특징 으로 하는 방법.
(신설) 제5항 또는 제6항에 따른 프로테아제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비분진성 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 슬러리, 또는 보호효소 형태의 단백질분해 세제첨가제.
(신설) 제5항 또는 제6항에 따른 프로테아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테 아제 함유 세제조성물.
(신설) 제22항에 있어서, 하나 이상의 다른 효소, 특히 아밀라제, 리파제, 셀룰라제, 또는 퍼옥시다제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세제조성물.
(신설) 제7항 또는 제8항에 따른 프로테아제의 제조방법에 있어서, 탄소 및 질소원 그리고 무기염을 함유하는 적당한 영양배지에서 프로테아제를 생산하는 Thermococcus litoralis 균주를 배양하고, 이어서 원하는 효소를 채쥐하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
(신설) 제24항에 있어서, Thermoococcus litoralis, DSM No.5474를 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
(신설) 제7항 또는 제8항에 따른 프로테아제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비분진성 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 슬러리, 또는 보호효소 형태의 단백질분해 세제첨가제.
(신설) 제7항 또는 제8항에 따른 프로테아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테 아제 함유 세제조성물.
(신설) 제27항에 있어서, 하나 이상의 다른 효소, 특히 아밀라제, 리파제, 셀룰라제, 또는 퍼옥시다제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세제조성물.