FI103669B

FI103669B - Thermococcuksesta peräisin oleva lämmönkestävä proteaasi ja menetelmä sen valmistamiseksi

Info

Publication number: FI103669B
Application number: FI925677A
Authority: FI
Inventors: Garabed Antranikian; Michael Klingeberg
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1992-12-14
Publication date: 1999-08-13
Also published as: DE69105974T2; ATE115624T1; DK145890D0; JPH05507621A; FI925677A0; KR100249995B1; EP0535110A1; JP3126729B2; EP0535110B1; DE69105974D1; DK0535110T3; ES2065695T3; WO1991019792A1; FI103669B1; FI925677A

Description

103669

Thermococcuksesta peräisin oleva lämmönkestävä proteaasi ja menetelmä sen valmistamiseksi

Tekninen ala 5 Tämä keksintö kuuluu lämmönkestävien proteaasi en alaan. Tarkemmin sanottuna tämä keksintö liittyy uusiin lämmönkestäviin proteaaseihin, menetelmään näiden entsyymien valmistamiseksi ja näitä entsyymejä käsittäviin detergenttikoostumuk-siin.

Keksinnön tausta 10 Hypertermofiilisiä archaebacteria-ryhmän organismeja on eristetty rikkipitoisista ja merenalaisista hydrotermisistä järjestelmistä (ks. esimerkiksi Kelly, R.M. ja Denting, J.W., Biotech. Progress 4 (1988) 47-62). Thermococcus-ryhmän jäsenten otaksutaan sisältävän lämmönkestäviä proteaaseja ja amylaaseja (Stetter, K.O., J. Chem. Technol. Biotechnol. 42(4) (1988) 315-317). Thermococcuksesta peräisin 15 olevia proteaaseja ei kuitenkaan ole aiemmin eristetty tai tutkittu.

Keksinnön lyhyt kuvaus Tällä keksinnöllä saadaan käyttöön sen suojapiiriin kuuluvia uusia entsyymejä, joiden lämmönkestävyys sekä aktiivisuus korkeissa lämpötiloissa on erinomaista luokkaa. Tämän keksinnön ensimmäisen kohteen mukaisesti siitä saadaan käyttöön pro-20 teaasi, jolle on ominaista, että sen pH-optimi on alueella 6,0-10,0 ja lämpötilaoptimi alueella 75-100 °C. Tämän keksinnön toisena kohteena saadaan käyttöön proteaasi, jolle on ominaista, että sen pH-optimi on alueella 6,5-10,0 ja lämpötilaoptimi alueella 75-100 °C ja sen immunokemialliset ominaisuudet ovat identtisiä tai osittain identtisiä sellaisten proteaasien vastaaviin ominaisuuksin verrattuna, jotka ovat pe-25 räisin DSM-talletusIaitokseen talletetuista organismeista Thermococcus celer, haku-„ . numero 2476, Thermococcus sp. ANI, hakunumero 2770, Thermococcus stetteri, hakunumero 5262 tai Thermococcus litoralis, hakunumero 5474.

Vielä yhtenä kohteenaan tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menetelmä näiden proteaasien valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää sen, että viljellään proteaasia 30 tuottavaa Thermococcus-kantaa sopivassa hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja sisältävässä ravintoliuoksessa, minkä jälkeen haluttu entsyymi otetaan talteen.

103669 2 Tämän menetelmän edullisissa sovellutusmuodoissa viljellään Thermococcus celer, Thermococcus sp. ANI, Thermococcus stetteri tai Thermococcus litoralis -kantaa.

Vielä yhdessä tämän menetelmän edullisessa sovellutusmuodossa viljellään Thermococcus celer -kantaa DSM-nro 2476, Thermococcus sp. ANI -kantaa DSM-nro 5 2770, Thermococcus stetteri -kantaa DSM-nro 5262 tai Thermococcus litoralis -kantaa DSM-nro 5474 tai näiden mutantteja tai variantteja.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on kuvattu oheisissa patenttivaatimuksissa.

Piirrosten lyhyt kuvaus Tätä keksintöä on kuvattu vielä seuraavilla piirroksilla, joissa kuvat 1-4 esittävät 10 Thermococcus celeristä, Thermococcus sp. ANl:stä, Thermococcus stetteristä ja Thermococcus Iitoraliksesta peräisin olevien proteaasien entsymaattista aktiivisuutta lämpötilan ja pH:n funktiona.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tässä keksinnössä Thermococcuksella suoritetut kasvatuskokeet ovat osoittaneet 15 sen, että nämä organismit erittävät erittäin lämmönkestäviä ja korkeassa lämpötilassa aktiivisia proteiineja hydrolysoivia entsyymejä. Nämä entsyymit ovat pro-teolyyttisesti aktiivisia ääriolosuhteissa. Thermococcuksen ominaisuuksia voidaan demonstroida käyttäen Thermococcus celeriä, Thermococcus sp. AN 1 itä, Thermococcus stetteriä ja Thermococcus litoralista. Thermococcus celer -kanta on saatavilla 1 20 DSM-talletuslaitoksesta hakunumerolla 2576, Thermococcus sp. ANI -kanta on . saatavilla DSM-talletuslaitoksesta hakunumerolla 2770, Thermococcus stetteri - I kanta on saatavilla DSM-talletuslaitoksesta hakunumerolla 5262 ja Thermococcus litoralis -kanta on saatavilla DSM-talletuslaitoksesta hakunumerolla 5474.

Kuten kuvista käy ilmi, Thermococcuksesta saatavissa oleville proteaaseille on 25 luonteenomaista, että niiden pH-optimi on alueella 6,0-10,0 ja niiden lämpötilaop-timi on alueella 75-100 °C.

Kuvasta 1 ilmenee lisäksi se, että Thermococcus celeristä saatavissa oleva proteaasi on aktiivinen laajalla lämpötila-alueella, nimittäin alueella alle 75 °C:sta yli 110°C:een olevissa lämpötiloissa, ja alle 5,5:stä 10,5:een olevalla pH-alueella. p 30 Lämpötilaoptimi on välillä 90-100 °C, ja se on tarkemmin sanottuna noin 95 °C:n kohdalla. 60 % entsyymiaktiivisuudesta havaitaan 75 °C:ssa ja 40 % havaitaan 110 °C:ssa. Entsyymin pH-optimi on alueella 6,5-8,5 ja se on tarkemmin sanottuna 3 103669 alueella 7,0-8,0 (noin 7,5). Huomattavaa entsyymiaktiivisuutta on havaittavissa vielä pH-arvoissa 5,5 ja 10,0.

Kuvasta 2 ilmenee, että Thermococcus sp. ANl:stä saatavissa oleva proteaasi on _ aktiivinen 50°C:sta 110°C:een olevalla lämpötila-alueella ja alle 5,5:stä 10:een 5 olevalla pH-alueella. Proteaasin lämpötilaoptimi on välillä 80-100 °C, ja se on tarkemmin sanottuna noin 90 °C:n kohdalla, ja pH-optimi on alueella 6,0-8,0, ja se on tarkemmin sanottuna noin 7,0.

Kuvasta 3 ilmenee, että Thermococcus stetteristä saatavissa oleva proteaasi on aktiivinen alle 45 °C:sta 100 °C:een olevalla lämpötila-alueella ja alle 5,5:stä yli 10 10:een olevalla pH-alueella. Proteaasin lämpötilaoptimi on välillä 75-85 °C, ja se on tarkemmin sanottuna noin 80 °C:n kohdalla, ja pH-optimi on pH-alueella 8-10, ja se on tarkemmin sanottuna noin pH:n 9,0 kohdalla.

Kuvasta 4 ilmenee, että Thermococcus litoraliksesta saatavissa oleva proteaasi on aktiivinen alle 60 °C:sta yli 100 °C:een olevalla lämpötila-alueella ja alle 6,5:stä yli 15 1 l :een olevalla pH-alueella. Proteaasin lämpötilaoptimi on välillä 90-100 °C, ja se on tarkemmin sanottuna noin 95 °C, ja pH-optimi on pH-alueella 8-10, ja se on tarkemmin sanottuna noin pH 9,0 kohdalla.

Taulukossa 1 on esitetty joitakin Thermococcus sp:stä saatavissa olevien proteaasien ominaisuuksia.

20 Taulukko 1 =============== T. celer T. ANI T. stett. T, litor.

pH-optimi__7^5__7^0__9^0__9j0_

lämpötilaoptimi__95 °C 90 °C 80 °C 95 °C

tyyppi__seriini seriini seriini seriini substraattispesifisyys:_____ Z-DL-Arg-pNA__-__+__+__+_

Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA__+__+__+__+_ Z-DL-Lys-pNA____-__+__+_ Z-Gly-Pro-pNA__-__+__-__+_ D-Phe-Pip-Arg-pNA__+__+_ + + D-Val-L-Leu-Lys-pNA__+__-__+__-_ 4 103669

Sue = sukkinyyli pNA = p-nitroanilidi Pip = piperatsiini

Immunokemialliset ominaisuudet voidaan määrittää immunologisesti ristireaktioihin 5 perustuvilla identiteettitutkimuksilla. Identiteettitutkimukset voidaan suorittaa tunnetulla Ouchterlony-kaksoisimmuunidiffuusiomenetelmällä tai tandem-risti-immu-noelektroforeesilla teoksen N. H. Axelsen, Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications (1983), luvuissa 5 ja 14 esitettyjen kuvausten mukaisesti. Termit "antigeenien identtisyys" ja "antigeenien osittainen 10 identtisyys" on kuvattu saman teoksen luvuissa 5, 19 ja 20.

Proteaasien valmistus Tämän keksinnön mukaisia proteaaseja voidaan valmistaa tällä alalla tunnetuilla menetelmillä viljelemällä proteaasia tuottavaa Thermococcus-kantaa sopivassa hiili-ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja sisältävässä ravintoliuoksessa ja ottamalla 15 talteen haluttu entsyymi.

Tämän keksinnön mukainen proteaasi voidaan myös valmistaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

Deter genttikoostum ukset Tämän keksinnön mukaisten proteaasien ainutlaatuisten ominaisuuksien johdosta 20 näistä entsyymeistä on suurta hyötyä teollisille sovellutuksille, esimerkiksi käytölle detergenttiteollisuudessa.

Tämän keksinnön mukainen detergenttikoostumus voi käsittää yhden tai useamman pinta-aktiivisen aineen, joka voi olla tyypiltään anioninen, ioniton, kationinen, am-foteerinen tai zwitterioninen tai se voi olla näiden seos. Tyypillisiä esimerkkejä 25 anionisista pinta-aktiivisista aineista ovat lineaariset alkyylibentseenisulfonaatit (LAS), alkyylisulfaatit (AS), alfa-olefiinisulfonaatit (AOS), alkoholietoksisulfaatit (AES) ja luonnollisten rasvahappojen alkalimetallisuolat. Esimerkkejä ionittomista pinta-aktiivisista aineista ovat alkyylipolyetyleeniglykolieetterit; nonyylifenyylipo- ! lyetyleeniglykolieetterit; sakkaroosin ja glukoosin rasvahappoesterit; ja polyetoksy- j 30 loidun alkyyliglukosidin esterit.

Tämän keksinnön mukainen detergenttikoostumus voi myös sisältää muita tällä alalla tunnettuja detergenttien ainesosia, kuten tehoaineita, valkaisuaineita, valkai- 5 103669 suaineiden aktivaattoreita, korroosionestoaineita, metalleja sitovia aineita, lian uudelleen tarttumista ehkäiseviä aineita, entsyymien ja valkaisuaineiden stabilointiaineita, formulaation apuaineita, optisia kirkasteita, vaahdon muodostusta lisääviä aineita, kelatoivia aineita, täyteaineita, kankaan pehmentimiä ja niin edelleen. Tämän 5 keksinnön mukainen detergenttikoostumus voidaan formuloida olennaisesti J. Fal-ben kuvaamalla tavalla (Falbe, J., Surfactants in Consumer Products. Theory, Technology and Application, Springer Verlag 1987 katso erityisesti kohtaa, jonka otsikko on "Frame formulations for liquid/powder heavy-duty detergents").

Tämän keksinnön ajatellaan tällä hetkellä mahdollisesti sisältävän sellaisen määrän 10 entsyymipreparaattia, joka vastaa 0,0005-0,5 CPU:ta proteolyyttistä entsyymiä pe-sunestelitraa kohti.

Tämän keksinnön mukaiset detergenttikoostumukset voidaan formuloida mihin tahansa sopivaan muotoon, kuten jauheiksi, nesteiksi ja niin edelleen.

Tämän keksinnön mukainen detergenttikoostumus voi sisältää edullisesti yhtä tai 15 useampaa detergenttikoostumuksiin tavallisesti lisättyä muunlaista entsyymiä, esimerkiksi lipaaseja, amylaaseja, sellulaaseja ja/tai peroksidaaseja.

Tämän keksinnön mukaista proteaasia voidaan käyttää detergenttikoostumuksessa lisäämällä tähän detergenttiproteaasin sisältäviä erillisiä lisäaineita tai lisäämällä tähän lisäaineseos, joka käsittää eri detergenttientsyymejä.

20 Tämän keksinnön mukainen lisäaine voidaan formuloida esimerkiksi granulaateiksi, nesteiksi, lietteiksi ja niin edelleen. Edulliset detergenttilisäaineformulaatiot ovat pölyämättömiä granulaatteja, nesteitä ja erityisesti stabiloituja nesteitä, lietteitä tai suojattuja entsyymejä. Pölyämättömät granulaatit voidaan valmistaa esimerkiksi patenttijulkaisujen GB-1 362 365 tai US-4 106 991 mukaisesti ja ne voidaan vaihto-25 ehtoisesti päällystää tällä alalla tunnetuilla menetelmillä. Detergenttientsyymit voidaan sekoittaa ennen granulointia tai sen jälkeen. Nestemäiset entsyymipreparaatit voidaan esimerkiksi stabiloida vakiomenetelmillä lisäämällä polyolia, kuten esimerkiksi propyleeniglykolia; sokeria tai sokerialkoholia; tai maitohappoa tai boorihap-poa. Tällä alalla tunnetaan muita entsyymien stabilointiaineita. Suojattuja entsyyme-30 jä voidaan valmistaa menetelmällä, joka on kuvattu patenttijulkaisussa EP-238 216.

Esillä olevaa keksintöä on kuvattu tarkemmin seuraavissa esimerkeissä.

6 103669 j Esimerkki 1 Thermococcus celerin viljely

Thermococcus celeriä, DSM-nro 2476, viljeltiin ravintoliuoksessa, joka sisälsi seu-raavat komponentit (litraa kohti):

NaCl 40,00 g 5 (NH4)2S04 1,30 g KH2PO4 0,28 g

MgS04 · 7 H20 0,25 g

CaCl2 · 2 H2O 0,07 g

FeCl3 · 6 H20 2,000 mg 10 MnCl2 · 4 H20 1,800 mg

Na2B407 · 10 H20 4,500 mg

ZnS04 · 7 H20 0,220 mg

CuCl2 2 H20 0,050 mg

Na2Mo04 · 2 H20 0,030 mg 15 VOS04 · 5 H20 0,038 mg

CoS04 0,010 mg

Hiivauute 1,00 g ^ Peptoni 1,00 g I Resatsuriini 1,000 mg 20 Rikki (jauhemainen) 5,00 g

Na2S · 9 H20 0,50 g pH säädetään arvoon 5,8 . Kasvatusliuosta, johon natriumsulfidi ja rikki oli jätetty lisäämättä, keitettiin 20 mi nuuttia, jäähdytettiin jäissä ja annosteltiin N2-atmosfäärin alla. Kasvatusliuos lisät-25 tiin N2-atmosfaärin alla rikkiä sisältäviin 100 ml:n pulloihin. Kasvatusliuoksen steriloimiseksi sitä kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa kolmena peräkkäisenä päivänä.

Ennen ymppäystä kasvatusliuos pelkistettiin lisäämällä siihen steriiliä neutraalia natriumsulfidia (5-prosenttinen liuos) pitoisuuteen 10 ml/1. Kasvatusliuokseen ympättiin 10 % kasvatettua esikasvatusta ja inkuboitiin lopuksi 88 °C:ssa 24-36 tuntia..

30 Proteolyyttisen aktiivisuuden määritys

Entsyymireaktio Suoritettiin 0,25 % kaseiinia (Hammarsten, Serva, Heidelberg, Saksan liittotasavalta) sisältävässä 50 mM fosfaattipuskurissa, jonka pH oli 7,0. Reaktio aloitettiin lisäämällä 250 μΐ solususpensiota 2250 pl:aan määritysseosta. Näytteitä (500 μΐ) otettiin 90 °C:ssa suoritetun 30, 60, 90 ja 120 minuutin pituisen inkuboin- 7 103669 nin jälkeen. Reaktio pysäytettiin jäähdyttämällä näytteet jäissä ja lisäämällä 500 μΐ trikloorietikkahappoa (10-prosenttinen liuos). Seoksen annettiin seistä huoneenlämmössä 30 minuuttia ja se sentrifugoitiin tämän jälkeen 10 minuuttia nopeudella 12 000 kierrosta minuutissa. Supematantin absorbanssi määritettiin 280nm:n koh-5 dalta nollaliuosta vastaa. 1 U entsyymiä on määritelty sellaiseksi entsyymimääräksi, joka vapauttaa 1 pmol tyrosiinia minuutissa.

Proteaasin luonnehtiminen

Entsyymiaktiivisuuteen kohdistuvien pH:n ja lämpötilan vaikutusten tutkimiseen käytettiin puskuriseosta, jonka koostumus oli 20 mM MES (2-[N-morfoliini]etaani-10 sulfonihappo), 20 mm HEPES (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaanisulfoni-happo) ja 20 mM glysiini. Liuosten pH-arvot tulivat alueelle 5,5:stä 1 l,0:aan 0,5 yksikön lisäyksin ja lämpötilat olivat alueella 75-110 °C. Substraattina käytettiin kaseiinia (0,25 %).

Kuten kuvasta 1 käy ilmi, oli T. celeristä peräisin oleva proteaasi oli aktiivinen laa-15 jalla pH- ja lämpötila-alueella. Entsyymiaktiivisuudesta oli 75 °C:n ja 110°C:n lämpötiloissa havaittavissa vielä 60 % ja 40 % lämpötilaoptimin ollessa 90-100 °C. Entsyymin pH-optimi oli noin 7,5 ja huomattavaa aktiivisuutta havaittiin myös pH-arvoissa 5 ja 10.

Esimerkki 2 Thermococcus sp. ANl:n viljely 20 Thermococcus sp. ANl:tä, DSM-nro 2770, viljeltiin seuraavat komponentit sisältävässä ravintoliuoksessa (määrät on esitetty litraa kohti): •

Tryptikaasi (BBL) 10,0 g KH2P04 1,5 g

NaCl 2,5 g 25 Rikki (jauhemainen) 8,0 g

Na2S · 9 H20 0,5 g * : Resatsuriini 1,0 mg pH säädetään arvoon 7,3 f

Kasvatusliuosta, johon natriumsulfidi ja rikki oli jätetty lisäämättä, keitettiin 20 mi-30 nuuttia, jäähdytettiin jäissä ja annosteltiin N2-atmosfäärin alla. Kasvatusliuos lisättiin N2-atmosfäärin alla rikkiä sisältäviin 100 ml:n pulloihin. Kasvatusliuoksen steriloimiseksi sitä kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa kolmena peräkkäisenä päivänä.

g 103669

Kasvatusliuos pelkistettiin lisäämällä siihen 10 ml steriiliä neutraalia natriumsulfidia (5-prosenttinen liuos) litraa kohti, minkä jälkeen siihen ympättiin 10 % kasvatettua esikasvatusviljelmää. Bakteereja kasvatettiin 75 °C:ssa 24-36 tuntia.

Proteolyyttisen aktiivisuuden määritys 5 Entsyymireaktio suoritettiin 0,25 % kaseiinia (Hammarsten, Serva, Heidelberg, Saksan liittotasavalta) sisältävässä 50 mM fosfaattipuskurissa, jonka pH oli 7,0. Reaktio aloitettiin lisäämällä 250 μΐ solususpensiota 2250 μΐ^βη määritysseosta. Näytteitä (500 μΐ) otettiin 80 °C:ssa suoritetun 30, 60, 90 ja 120 minuutin pituisen inkuboin-nin jälkeen. Reaktio pysäytettiin jäähdyttämällä näytteet jäissä ja lisäämällä 500 μΐ 10 trikloorietikkahappoa (10-prosenttinen liuos). Seoksen annettiin seistä huoneenlämmössä 30 minuuttia ja se sentrifugoitiin tämän jälkeen 10 minuuttia nopeudella 12 000 kierrosta minuutissa. 1 U entsyymiä on määritelty sellaiseksi entsyymimää-räksi, joka vapauttaa 1 pmol tyrosiinia minuutissa.

Proteaasin luonnehtiminen 15 Kaseiini (Hammarsten) liuotettiin 0,25 % konsentraatioon puskuriseokseen, jonka koostumus oli 20 mM MES (2-[N-morfoliini]etaanisulfonihappo), 20 mm HEPES (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo) ja 20 mM glysiini ja jonka pH-arvot oli säädetty alueelle 5,5:stä 9:ään ja lämpötilat olivat alueella 50-110 °C.

Kuten kuvasta 2 käy ilmi, saavutti proteaasiaktiivisuus korkeimman tasonsa noin 20 pH-arvon 7 kohdalla. pH-arvoissa 5,5 ja 9,0 voitiin havaita noin 35 % aktiivisuudesta. Optimaalinen proteolyyttinen aktiivisuus kaseiinisubstraattia kohtaan esiintyi 90 °C:ssa. Noin 50 % entsyymiaktiivisuudesta oli määritettävissä 100 °C:ssa.

Esimerkki 3 Thermococcus stetterin viljely

Thermococcus stetteriä, DSM-nro 5262, viljeltiin ravintoliuoksessa, joka sisälsi seu-= 25 raavat komponentit (määrät on esitetty litraa kohti)

"T

: NaCl 25,00 g NH4CI 0,33 g

CaCl2-2H20 0,33 g

MgCl2 · 6 H20 0,33 g Ϊ, 30 KC1 0,33 g KH2P04 0,33 g 9 103669

Hivenaineliuos (ks. DSM-medium 320) 1,0 ml

Vitamiiniliuos (ks. DSM-medium 320) 10,0 ml 5 Tryptikaasi BBL 5,00 g

Jauhemainen rikki 10,00 g

Resatsuriini 1,00 mg

Na2S · 9 H20 0,50 g pH 5,7 10 Kasvatusliuosta, johon natriumsulfidi ja rikki oli jätetty lisäämättä, keitettiin 20 minuuttia, jäähdytettiin jäissä ja annosteltiin N2-atmosfaärin alla. Kasvatusliuos lisättiin N2-atmosfäärin alla rikkiä sisältäviin 100 ml.n pulloihin. Kasvatusliuoksen steriloimiseksi sitä kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa kolmena peräkkäisenä päivänä.

Ennen 10 %:lla kasvatettua esikasvatusviljelmää suoritettavaa ymppäystä kasvatus-15 liuos pelkistettiin lisäämällä siihen 10 ml steriiliä neutraalia natriumsulfidia (5-pro-senttinen liuos) litraa kohti. Bakteereja kasvatettiin 80 °C:ssa 24-36 tuntia.

Proteolyyttisen aktiivisuuden määritys Määritysseos sisälsi 0,25 % kaseiinia (Hammarsten), joka oli liuotettu 50 mM Tris/glysiini-puskuriin, jonka pH oli 9,0. Reaktio aloitettiin lisäämällä 250 μΐ ent-20 syyminäytettä 2350 pl:aan määritysseosta, jonka lämpötila oli 80 °C. Näytteet (500 μΐ) otettiin 30, 60, 90 ja 120 minuutin kuluttua. Reaktio pysäytettiin jäähdyttämällä näytteet jäissä ja lisäämällä 500 ml trikloorietikkahappoa (10-prosenttinen liuos). Seoksen annettiin seistä huoneenlämmössä noin 30 minuuttia ja se sentrifu-goitiin tämän jälkeen 10 minuuttia nopeudella 12 000 kierrosta minuutissa. Super-25 natantin absorbanssi määritettiin 280 nm:n kohdalta nollaliuosta vastaan. 1 U entsyymiä on määritelty sellaiseksi entsyymimääräksi, joka vapauttaa 1 pmol tyrosiinia minuutissa kuvatuissa olosuhteissa.

: Proteaasin luonnehtiminen • Kaseiinia (Hammarsten) liuotettiin konsentraatioon 0,25 % puskuriseokseen, jonka 30 koostumus oli 20 mM MES (2-[N-morfoliini]etaanisulfonihappo), 20 mm HEPES (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo) ja 20 mM glysiini ja jonka pH oli säädetty alueella 5,5-10 oleviin arvoihin, ja sitä käytettiin lämpötila-alueella 45-100 °C.

103669 ίο

Kuten kuvasta 3 käy ilmi, proteaasiaktiivisuus saavutti maksimitasonsa suunnilleen pH-arvon 9,0 kohdalla. Aktiivisuudesta voitiin havaitaan pH-arvon 5,5 kohdalla noin 30 % ja pH-arvon 10,0 kohdalla noin 70 %. Proteolyyttinen aktiivisuus kaseii-nisubstraattia kohtaan oli optimaalista 80 °C:ssa. Noin 30 % entsyymiaktiivisuudes-5 ta oli mitattavissa 45 °C:ssa.

Esimerkki 4 Thermococcus litoraliksen kasvatus

Thermococcus litoralista, DSM-nro 5474, viljeltiin ravintoliuoksessa, joka sisälsi seuraavat komponentit (määrät on esitetty litraa kohti):

NaCl 19,45 g 10 MgCl2-6H20 12,60 g

Na2S04 3,42 g

CaCl2 2 H20 2,38 g KC1 0,55 g

Na2C03 0,61 g 15 KBr 0,08 g

SrCl2 57,2 mg

Na2HP04 10,0 mg

Na-metasilikaatti 4,0 mg ! NaF 2,4 mg j 20 KN03 1,6 mg

Resatsuriini 100,0 mg

Hiivauute 1,0 g

Bacto-peptoni 5,0 g

Jauhemainen rikki 10,0 g 25 Na2S · 9 H20 0,5 g täytetään 1000 ml:ksi tislatulla H20:lla pH 6,5

Kasvatusliuosta, johon natriumsulfidi ja rikki oli jätetty lisäämättä, keitettiin 20 mi-: nuuttia, jäähdytettiin jäissä ja annosteltiin N2-atmosfäärin alla. Kasvatusliuos lisät- 30 tiin N2-atmosfäärin alla rikkiä sisältäviin 100 ml:n pulloihin. Kasvatusliuoksen steriloimiseksi sitä kuumennettiin 1 tunti 100 °C:ssa kolmena peräkkäisenä päivänä.

Ennen ymppäystä kasvatusliuos pelkistettiin lisäämällä siihen steriiliä neutraalia natriumsulfidia (5-prosenttinen liuos) pitoisuuteen 10ml/l. Kasvatusliuokseen ym- 11 103669 pättiin 10 %:lla kasvatettua esikasvatusviljelmää ja inkuboitiin lopuksi 85 °C:ssa 24-36 tuntia.

Proteolyyttisen aktiivisuuden määritys Määritysseos sisälsi 0,25 % kaseiinia (Hammarsten), joka oli liuotettu 50 mM 5 Tris/glysiini-puskuriin, jonka pH oli 9,0. Reaktio aloitettiin lisäämällä 250 μΐ ent-syyminäytettä 2350 pilaan määritysseosta, jonka lämpötila oli 90 °C. Näytteet (500 μΐ) otettiin 30, 60, 90 ja 120 minuutin kuluttua. Reaktio pysäytettiin jäähdyttämällä ja lisäämällä 500 ml trikloorietikkahappoa (10-prosenttinen liuos). Seoksen annettiin seistä huoneenlämmössä noin 30 minuuttia ja se sentrifugoitiin tämän jäl-10 keen 10 minuuttia nopeudella 12 000 kierrosta minuutissa. Supematantin absorbans-si määritettiin 280 nm:n kohdalta nollaliuosta vastaan. 1 U entsyymiä on määritelty sellaiseksi entsyymimääräksi, joka vapauttaa 1 μπιοί tyrosiinia minuutissa kuvatuissa olosuhteissa.

Proteaasin luonnehtiminen 15 Kaseiinia (Hammarsten) liuotettiin konsentraatioon 0,25 % puskuriseokseen, jonka koostumus oli 20 mM MES (2-[N-morfoliini]etaanisulfonihappo), 20 mm HEPES (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo) ja 20 mM glysiini ja jonka pH oli säädetty alueella 6,5-11 oleviin arvoihin, ja sitä käytettiin lämpötila-alueella 60-100 °C.

20 Kuten kuvasta 4 käy ilmi, proteaasiaktiivisuus saavutti maksimitasonsa suunnilleen pH-arvossa 9,0. Aktiivisuudesta voitiin pH-arvojen 5,5 ja 11 kohdalla havaita noin 10 %. Proteolyyttinen aktiivisuus kaseiinisubstraattia kohtaan oli optimaalista 95 °C:ssa. 100 °C:ssa suoritetuissa määrityksissä havaittiin noin 90 % entsyymiaktiivisuudesta ja 60 °C:ssa suoritetuissa määrityksissä noin 30 % entsyymiaktiivisuu-25 desta.

*

Claims

103669

1. Proteaasi, tunnettu siitä, että sillä on seuraavat ominaisuudet: (a) alueella 6,0-10,0 oleva pH-optimi, (b) alueella 75-100 °C oleva lämpötilaoptimi ja 5 (c) immunokemialliset ominaisuudet, jotka ovat identtiset sellaisen proteaasin vastaavien ominaisuuksien kanssa, joka on peräisin DSM-talletuslaitokseen haku-numerolla 2476 talletetusta Thermococcus celeristä tai DSM-hakunumerolla 2770 talletetusta Thennococcus sp. ANlistä tai DSM-hakunumerolla 5262 talletetusta Thermococcus stetteristä tai DSM-hakunumerolla 5474 talletetusta Thermococcus 10 litoraliksesta.

2. Proteaasi, tunnettu siitä, että sillä on seuraavat ominaisuudet: (a) alueella 6,0-10,0 oleva pH-optimi, (b) alueella 75-100 °C oleva lämpötilaoptimi ja että (c) se on peräisin Thermococcus celer, Thermococcus sp. ANI, Thermococcus 15 stetteri tai Thermococcus litoralis -lajin kannasta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että se on peräisin Thermococcus celer -kannasta, jonka DSM-hakunumero on 2476, Thermococcus sp. ANI -kannasta, jonka DSM-hakunumero on 2770, Thermococcus stetteri -kannasta, jonka DSM-hakunumero on 5262 tai Thermococcus litoralis -kannasta, jonka DSM- 2. hakunumero on 5474. i

4. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen proteaasin val- . mistamiseksi, joka menetelmä käsittää sen, että viljellään proteaasia tuottavaa Thermococcus celer -kantaa, Thermococcus sp. AN 1 -kantaa, Thermococcus stetteri -kantaa tai Thermococcus litoralis -kantaa sopivassa hiili- ja typpilähteitä ja epäor-25 gaanisia suoloja sisältävässä ravintoliuoksessa, minkä jälkeen haluttu entsyymi otetaan talteen.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä viljellään : Thermococcus celer -kantaa, jonka DSM-hakunumero on 2476, Thermococcus sp. ANI -kantaa, jonka DSM-hakunumero on 2770, Thermococcus stetteri -kantaa, jon- t 30 ka DSM-hakunumero on 5262 tai Thermococcus litoralis -kantaa, jonka DSM-hakunumero on 5474, tai jotakin näiden mutanttia tai varianttia.

6. Proteolyyttinen detergenttilisäaine, joka on pölyämättömän granulaatin, nesteen ja erityisesti stabiloidun nesteen, lietteen tai suojatun entsyymin muodossa, ΙΪ 103669 tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen proteaasin.

7. Proteaasin sisältävä detergenttikoostumus, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen proteaasin.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen detergenttikoostumus, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää yhden tai useamman muun entsyymin, erityisesti amylaaseja, lipaa-seja, sellulaaseja tai peroksidaaseja.