FI95482B - Uusi emäksinen pullulanaasi Y, jolla on -amylaasiaktiivisuutta, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen valmistamiseksi - Google Patents

Description

. 95482

Uusi emäksinen pullulanaasi Y, jolla on a-amylaasiaktii-visuutta, sitä tuottava mikro-organismi ja menetelmä sen valmistamiseksi 5 Tämä keksintö koskee uutta emäksistä pullulanaasi Y:tä, jolla on a-amylaasiaktiivisuutta, mikro-organismia joka tuottaa edellämainittua emäksistä pullulanaasi Y:tä, ja menetelmää edellämainitun emäksisen pullulanaasi Y:n tuottamiseksi.

10 Pullulanaasi on entsyymi, joka katkaisee pul- lulaanista pelkästään a-1,6-glykosidisidoksen ja tuottaa lopulta maltotrioosia. Pullulanaasin löysivät ensin Aero-bacter aerogenes -lajiin kuuluvasta kannasta Bender ja Wallenfels 1961 [Biochem. Z., 334, 79, (1961)]. Äskettäin 15 on raportoitu useista mikro-organismeista, jotka pystyvät tuottamaan pullulanaasia. Näitä mikro-organismeja ovat esimerkiksi Bacillus sp. [J. Jpn. Soc. Starch Sei. 30, 200, (1983)]; Bacillus acidopullulyticus [Agric. Biol.

Chem., 52, 2293, (1984)]; Bacillus stearothermophilus 20 [Eur. J. Appi. Microbiol. Biotechnol., 17, 24, (1983)];

Streptococcus mitis [Biochem. J., 108, 33, (1968)]; Lactobacillus [Denpun Kagaku, 28, 72, (1981)]; Clostridium sp. [Appi, Environ. Microb., 53, 7, (1987)]; Clostridium ther-mohydrosulfuricum [Appi. Environ. Microb., 49, 5, (1985), 25 J. Bacteriol., 164, 3, (1985), Biochem. J., 246, (1987)], Thermus aguaticus [Enzyme Microb. Technol., 8, (1986)]; ja Thermus sp. [J. Jpn. Soc. Starch Sei., 34, 1, (1987)].

Tiedetään, että pullulanaasi ei vaikuta pelkästään pullulaaniin, vaan sillä on myös hydrolyyttisiä aktiivi-30 suuksia tärkkelyksen, glykogeenin, amylopektiinin ja näi-: den osittaisesta hajoamisesta syntyvien haaraisten oligos akkaridien a-1,6 -glykosidisidokseen. Tämän ominaisuutensa vuoksi pullulanaasia kutsutaan "haaroja katkovaksi entsyymiksi" .

2 95482

Edelleen on havaittu, että pullulanaasi käytettynä yhdessä sekä endotyyppisen amylaasin että eksotyyppisen amylaasin kanssa pystyi tuottamaan glukoosia tai malto-oligosakkarideja kuten maltoosia, maltotrioosia, maltotet-5 raoosia, maltopentaoosia tai maltoheksaoosia tärkkelyksestä korkealla saannolla. Tämä ominaisuus on viime aikoina herättänyt huomattavasti huomiota.

Lisäksi on haluttu kehittää pullulanaasi, jolla on α-amylaasiaktiivisuutta, joka pystyy reagoimaan a-l,4-gly-10 kosidisidoksen kanssa, tarkoituksena yksinkertaistaa tavanomaisia sokerintuottomenetelmiä joissa käytetään kahta tai useampaa entsyymiä. Tässä suhteessa on raportoitu vain kahdesta entsyymistä. Toinen on yhdistetty pullulanaasi-amylaasientsyymi, jota tuottaa Bacillus subtilis TU [Agri-15 c. Biol, Chem., 51, 9, (1987); japanilainen patenttijulkaisu n:o 18717/1989)], ja toinen on Bacillus circulansin tuottama amylaasi, jolla on pullulanaasiaktiivisuutta (japanilainen nähtäväksi pantu patentti n:o 60376/1989).

Sillä välin on selvitetty, että pullulanaasin, jol-20 la on edellämainitut ominaisuudet, ja a-amylaasin käyttö yhdessä lisäaineina astianpesu- tai pyykinpesujauheissa parantaa huomattavasti puhdistustehoa lähinnä tärkkelys-tahrojen suhteen (japanilainen patenttihakemus n:o 285424/1988). Pullulanaasin lisähyödyntäminen näillä 25 aloilla on odotettavissa.

« · '

Kuitenkin, lähes kaikki luonnossa ilmenevät pul-lulanaasit luokitellaan neutraaleiksi tai happamiksi pul-lulanaaseiksi, joilla on suurin ja vakaa entsymaattinen aktiivisuus neutraaleissa tai happamissa olosuhteissa. On 30 olemassa joitakin harvoja emäksisiä tai emäksisiä olosuh-: teitä sietäviä pullulanaaseja, jotka ovat kestävämpiä ja joiden aktiivisuus on suurin emäksisellä pH-alueella, jossa pyykinpesu tai astianpesu suoritetaan. Mitä tulee emäksiseen pullulanaasiin, jolla olisi a-amylaasiaktiivisuut-35 ta, sellaista ei ole havaittu koskaan aikaisemmin. Tässä 3 95482 mainittu emäksinen pullulanaasi osoittaa tämän sillä, että sen optimi-pH on emäksisellä alueella. Emäksisiä olosuhteita sietävä pullulanaasi osoittaa tämän sillä, että sen optimi-pH on neutraalilla tai happamalla alueella, mutta 5 sillä on emäksisellä alueella riittävä määrä samoja toimintoja kuin optimi-pH:ssa, samalla kun se säilyttää hyvän stabiilisuuden. Sana "neutraali" tässä tarkoittaa pH-alu-etta 6-8 ja sana "emäksinen" tarkoittaa pH-aluetta joka on vähintään 8.

10 Tähän mennessä ei ole tunnettu menetelmiä joilla tuotettaisiin emäksistä pullulanaasia tai emäksisiä olosuhteita sietävää pullulanaasia, lukuunottamatta Horikoshin et ai. raporttia, joka tuo julki menetelmän emäksisen pullulanaasin tuottamiseksi viljelemällä 15 Bacillus-sukuun kuuluvaa alkalofiilistä mikro-organismia [Biochem. Blophys. Acta, 397, 188, (1975), ja japanilainen patenttijulkaisu n:o 27786/1978)].

Horikoshin et ai. pullulanaasi on entsyymi, jonka optimi-pH on emäksisellä alueella ja jolla on laajempi 20 substraattispesifisyys kuin tavanomaisilla tunnetuilla pullulanaaseilla. Kuitenkin, koska sen optimi-pH on heikosti emäksisellä alueella 8-9 ja sillä ei ole a-amylaasi-aktiivisuutta, se ei sovellu pesuaineseoksiin. Lisäksi Horikoshin et ai. pullulanaasilla on haittana entsyymin 25 epästabiilisuus ja entsyymin alhainen tuottavuus. Tämän- kaltainen menetelmä on näin ollen sopimaton teolliseen käymistuotantoon. Näistä syistä johtuen on haluttu kehittää pullulanaaseja, joiden optimi-pH on korkeammalla emäksisellä alueella ja joilla on myös a-amylaasiaktiivisuut-30 ta.

: Astian- tai pyykinpesu suoritetaan tavallisesti laajalla pH-alueella, neutraalista hyvin emäksiseen. Näin ollen on kannattavaa löytää ja hankkia luonnon mikro-organismeja, joiden optimi-pH on hyvin emäksisellä alueella ja 35 jotka kykenevät tuottamaan emäksistä pullulanaasia, jolla 4 95482 on α-amylaasiaktiivisuutta ja joka toimii astian- tai pyykinpesujauheisiin soveltuvana entsyyminä.

Tämän tilanteen vuoksi keksijät ovat suorittaneet laajoja tutkimuksia hankkiakseen luonnollisia mikro-orga-5 nismeja, jotka kykenevät tuottamaan emäksistä pullulanaa-sia, jolla on a-amylaasi-aktiivisuutta, ja tuloksena havainneet, että alkalofiilinen mikro-organismi Bacillus sp. KSM-AP1378 (FERM P-10886), jonka keksijät löysivät Tochi-gi-shin maaperästä Tochigi-kenistä, Japanista, kykeni 10 tuottamaan uutta emäksistä pullulanaasi Y:tä, jolla on a-amylaasiaktiivisuutta ja joka oli tehokas pesujauhekompo-nentti automaattisiin astianpesukoneisiin tai pyykinpesu-jauheisiin. Tämä löydös on johtanut tämän keksinnön toteuttamiseen .

15 Vastaavasti, tämän keksinnön tarkoitus on saattaa käyttöön uusi emäksinen pullulanaasi, jolla on a-amylaasi-aktiivisuutta ja jolla on seuraavat entsymologiset ominaisuudet : (1) Toiminta 20 Vaikuttaa pullulaaniin ja liukoiseen tärkkelykseen tuottaen enimmäkseen maltotrioosia pullulaanista ja enimmäkseen maltotetraoosia ja maltopentaoosia liukoisesta tärkkelyksestä. Vaikuttaa myös glykogeeniin tuottaen maltotetraoosia ja maltopentaoosia.

25 (2) Substraattispesif isyys

Vaikuttaa pullulaaniin, liukoiseen tärkkelykseen ja glykogeeniin.

(3) Käyttö-pH ja optimaalinen pH-alue

Vaikuttaa pullulaaniin pH-alueella 5-12 optimaa- 30 lisen pH-alueen ollen 8,5 - 10. Vaikuttaa liukoiseen tärkkelykseen alueella 4-12 optimaalisen pH-alueen ollen 7 - 9,5.

5 95482 (4) pH-kestävyys

On stabiili pH-alueella 6-10,5 pullulaania kohtaan ja pH-alueella 4-12 liukoista tärkkelystä kohtaan (käsittelyolosuhteet: 45 °C, 10 minuuttia).

5 (5) Käyttölämpötila ja optimilämpötila

Vaikuttaa pullulaaniin ja liukoiseen tärkkelykseen laajalla lämpötila-alueella välillä 10-65 °C optimilämpö-tilan ollen 50 °C.

(6) Lämmönkestävyys 10 On stabiili 45 °C:seen asti käsiteltynä 10 mM gly- siini-NaCl-NaOH -puskurissa (pH 9,5) 30 minuutin ajan.

(7) Molekyylipaino

Noin 200 000 ± 5 000 mitattuna elektroforeesin avulla natriumdodekyylisulfaattia (SDS) käyttäen.

15 (8) Metalli-ionien vaikutukset

Pullulanaasiaktiivisuuteen vaikuttavat haitallisesti Hg2t-, Mn2*- ja Pb2+-ionit ja a-amylaasiaktiivisuuteen vaikuttavat haitallisesti Hg2*-, Mn2*-, Pb2*, Zn2+- ja Cd2*-ionit.

20 Tämän keksinnön toinen tavoite on saattaa käyttöön mikro-organismi, joka tuottaa emäksistä pullulanaasia, jolla on a-amylaasiaktiivisuutta yllä mainituilla ominaisuuksilla.

Tämän keksinnön lisätavoite on saattaa käyttöön 25 menetelmä emäksisen pullulanaasin tuottamiseen yllä maini- « tuilla ominaisuuksilla.

Keksinnön muut tavoitteet, piirteet ja edut käyvät paremmin ilmi alempana seuraavasta kuvauksesta.

Kuvio 1 on paperikromatografia, jossa näkyy malto-30 oligosakkaridien tuotanto, kun suoritetaan entsymaattinen ; reaktio, jossa käytetään tämän keksinnön mukaista emäksis- tä pullulanaasi Y:tä, jolla on α-amylaasiaktiivisuutta, ja substraattina on pullulaani, amylopektiini, amyloosi ja glykogeeni.

t 6 95482

Kuviot 2(a) ja 2(b) ovat piirroksia, joissa näytetään tämän keksinnön mukaisen emäksisen pullulanaasi Y:n, jolla on α-amylaasiaktiivisuutta, reaktio-pH:n ja suhteellisen aktiivisuuden suhde.

5 Kuviot 3(a) ja 3(b) ovat piirroksia, joissa näyte tään tämän keksinnön mukaisen emäksisen pullulanaasi Y:n, jolla on α-amylaasiaktiivisuutta, reaktio-pH:n ja jäännös-aktiivisuuden suhde.

Kuviot 4(a) ja 4(b) ovat piirroksia, joissa näyte-10 tään tämän keksinnön mukaisen emäksisen pullulanaasi Y:n, jolla on α-amylaasiaktiivisuutta, reaktiolämpötilan (pH:ssa 9,5) ja suhteellisen aktiivisuuden suhde.

Kuviot 5(a) ja 5(b) ovat piirroksia, joissa näytetään tämän keksinnön mukaisen emäksisen pullulanaasi Y:n, 15 jolla on α-amylaasiaktiivisuutta, reaktiolämpötilan (pH:ssa 9,5) ja jäännösaktiivisuuden suhde.

Kuvio 6 on piirros, joka näyttää tämän keksinnön mukaisen emäksisen pullulanaasi Y:n, jolla on a-amylaasi-aktiivisuutta, elektroforeesin tulokset Davisin menetelmän 20 mukaan.

Kuvio 7 on piirros, joka näyttää tämän keksinnön mukaisen emäksisen pullulanaasi Y:n, jolla on a-amylaasi-aktiivisuutta, SDS-elektroforeesin tulokset.

Tämän keksinnön mukaisen emäksistä pullulanaasia 25 tuottavan mikro-organismin mykologiset ominaisuudet käsi- tellään nyt. Seuraavia 21 elatusainetyyppiä (elatusaineet 1-21) käytetään kantojen luokitteluun. Kaikki sisältävät 0,5 paino-% steriloitua natriumkarbonaattia (Na2C03).

30 Käytettyjen elatusaineiden koostumus (painoprosent- • teinä)

Elatusaine 1: ravintoliemi, 0,8; agarjauhe (valmistaja

Wako Pure Chemical Co.), 1,5 Elatusaine 2: ravintoliemi, 0,8 7 95482

Elatusaine 3: ravintoliemi, 0,8; gelatiini, 20,0; agar- jauhe (valmistaja Wako Pure Chemical), 1,5 Elatusaine 4: Bacto-lakmusmaito, 10,5

Elatusaine 5: ravintoliemi, 0,8: KN03, 0,1 5 Elatusaine 6: Bacto-peptoni, 0,7; NaCl, 0,5; glukoosi, 0,5

Elatusaine 7: SIM-agarelatusaine (valmistaja Eiken

Kagaku), ilmoitettu määrä

Elatusaine 8: TSI-agar (valmistaja Eiken Kagaku), ilmoi- 10 tettu määrä

Elatusaine 9: hiivauute, 0,5; Bacto-peptoni, 1,5; K2HP04, 0,1; MgS04.7H20, 0,02; liukoinen tärkkelys, 2,0; agarjauhe (valmistaja Wako Pure Chemical), 1,5 15 Elatusaine 10: Koserin elatusaine (valmistaja Eiken

Kagaku), ilmoitettu määrä

Elatusaine 11: Christensenin elatusaine (valmistaja Eiken

Kagaku), ilmoitettu määrä

Elatusaine 12: Elatusaine, joka sisältää seuraavat seokset 20 (1) ja (2), johon on lisätty typenlähteitä jotka koostuvat natriumnitraatista, nat-riumnitriitistä, ammoniumkloridista, ja ammoniumfosfaatista vastaavina määrinä 0,25 %, 0,2025%, 0,158% ja 0,195% paino-... 25 prosentteina elatusaineessa.

(1) Hiivauute, 0,05; Na2S04, 0,1; KH2P04, 0,1; glukoosi, 1,0 (2) Hiivauute, 0,05; Na2S04, 0,1; KH2P04, 0,1; glukoosi, 1,0; CaCl2.2H20, 0,05; 30 MnS04.4-6H20, 0,01; FeS04.7H20, 0,001;

MgS04.7H20, 0,02 < » «

Elatusaine 13: King A -elatusaine "Eiken" (valmistaja

Eiken Kagaku), ilmoitettu määrä Elatusaine 14: King B -elatusaine "Eiken" (valmistaja 35 Eiken Kagaku), ilmoitettu määrä β 95482

Elatusaine 15: Karbamidielatusaine "Eiken" (valmistaja

Eiken Kagaku), ilmoitettu määrä Elatusaine 16: Sytokromioksidaasi-testisuodatinpaperi (valmistaja Nissui Pharmaceutical Co., 5 Ltd. )

Elatusaine 17: 3 % vetyperoksidivesiliuos

Elatusaine 18: Bacto-peptoni, 0,5; hiivauute, 0,5; K2HP04, 0,1; glukoosi, 1,0; MgS04.7H20, 0,02 Elatusaine 19: Bacto-peptoni, 2,7; NaCl, 5,5; K2HP04, 0,3; 10 glukoosi, 0,5; bromitymolisininen, 0,06; agarjauhe (valmistaja Wako Pure Chemical), 1,5

Elatusaine 20: (NH4)2HP04, 0,1; KC1, 0,02; MgS04.7H20 , 0,02; hiivauute, 0,05; sokeri, 1,0 15 Elatusaine 21: kaseiini, 0,5; hiivauute, 0,5; glukoosi, 1,0; K2HP04, 0,1; MgS04.7H20 , 0,02; agar jauhe (valmistaja Wako Pure Chemical), 1,5 Mykologiset ominaisuudet (1) Mikroskooppiset havainnot 20 Solut ovat sauvoja, kooltaan 0,8 - 2,4 pm x 1,8 - 4,0 pm, joiden päiden lähelle muodostuu elliptinen sisä-itiö (1,0 - 1,2 pm x 1,2 - 1,4 pm). Niillä on flagelloja ja ne ovat liikkuvia. Gram-värjäytymistä on mahdoton määritellä. Haponkestävyys: negatiivinen.

25 (2) Kasvu eri elatusaineissa • · (a) Ravintoagarmalja (elatusaine 1)

Solut kasvavat hyvin. Pesäke on ympyränmuotoinen, sen pinta tasainen ja sen ulkoreuna tasainen. Pesäkkeen väri on keltainen, puoliksi läpinäkyvä ja kiiltävä.

30 (b) Ravintoagarvinopintaviljelmä (elatusaine 1) • Solut kykenevät kasvamaan. Pesäkkeellä on huntumai- • · : ' sesti leviävä muoto, pesäkkeen väri on kiiltävä, keltainen ja puoliksi läpinäkyvä.

(c) Ravintoliemi (elatusaine 2) 35 Solut kykenevät kasvamaan.

9 95482 (d) Pistoviljelmä ravintoliemi-gelatiinissa (ela-tusaine 3)

Solut kasvavat hyvin. Gelatiinin sulatusta havaitaan.

5 (e) Lakmusmaitoelatusaine (elatusaine 4)

Maidon koaguloitumista ja peptonisoitumista ei havaita. Lakmuksen värin muutosta ei voida määrittää koska elatusaine on emäksinen elatusaine.

(3) Fysiologisia piirteitä 10 (a) Nitraatin pelkistys ja denitrifikaatio (elatus- aine 5)

Nitraatin pelkistys: positiivinen

Denitrifikaatio: negatiivinen (b) MR-testi (elatusaine 6) 15 Ei voida määrittää koska elatusaine on emäksinen elatusaine.

(c) V-P -testi (elatusaine 6)

Negatiivinen (d) Indolintuotanto (elatusaine 7) 20 Negatiivinen (e) Vetysulfidin tuotanto (elatusaine 8)

Negatiivinen (f) Tärkkelyksen hydrolyysi (elatusaine 9)

Positiivinen ... 25 (g) Sitruunahapon hyödyntäminen (elatusaine 10, • · elatusaine 11)

Negatiivinen Koserin elatusaineessa (elatusaine 10) ja mahdoton määritellä Christensenin elatusaineessa (elatusaine 11) 30 (h) Epäorgaanisten typenlähteiden hyödyntäminen ^ (elatusaine 12)

Nitraattia, ammoniumsuoloja ja nitriittiä käytetään kaikkia hyödyksi.

(i) Värinmuutos (elatusaine 13, elatusaine 14) 35 Negatiivinen 10 95482 (j) Ureaasi (elatusaine 15)

Negatiivinen (k) Oksidaasi (elatusaine 16)

Negatiivinen 5 (1) Katalaasi (elatusaine 17)

Positiivinen (m) Kasvualue (elatusaine 18)

Kasvulämpötila: 20 - 40 eC,

Optimaalinen kasvulämpötila: 30 - 35 °C

10 Kasvun pH-alue: 7 - 10,5

Optimi-pH: 10 (n) Käytös hapen läsnäollessa Aerobinen (o) O-F -testi (elatusaine 19) 15 Värinmuutosta ei voida määrittää koska elatusaine on emäksinen elatusaine. Solut voivat kasvaa vain aerobisissa olosuhteissa.

(p) Sokerin hyödyntäminen (elatusaine 20) L-arabinoosia, D-ksyloosia, D-glukoosia, D-mannoo- 20 siä, D-fruktoosia, D-galaktoosia, maltoosia, sakkaroosia, laktoosia, trehaloosia, D-sorbitolia, D-mannitolia, inosi-tolia, glyserolia, tärkkelystä, raffinoosia, salisiinia, D-riboosia ja dekstriiniä hyödynnetään.

(q) Kasvu natriumsuolaa sisältävässä elatusaineessa 25 (elatusaineen 1 muunnos) • ·

Solut voivat kasvaa 7 % natriumkloridin läsnäollessa, mutteivät voi kasvaa 10 % natriumkloridin läsnäollessa.

(r) Kaseiinin hydrolyysi (elatusaine 21) 30 Positiivinen

Yllä mainittujen mykologisten ominaisuuksien perusteella tämän keksinnön mukainen kanta tutkittiin käyttäen apuna kirjoja Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Voi 8 ja "The Genus Bacillus" Ruth, E. Gordon, Ag-35 riculture Handbook No. 427, Agricultural Research Service, <i aiti mu him 11 95482 U.S. Department of Agriculture Washington D.C., (1973), ja määritettiin itiöiväksi sauvamaiseksi mikro-organismiksi, joka kuuluu sukuun Bacillus. Kanta ei kasva neutraalilla alueella, mutta voi kasvaa enimmäkseen hyvin emäksisellä 5 alueella. Tämän seikan perusteella tämän keksinnön mukainen kanta luokitellaan alkalofiiliseksi mikro-organismiksi jonka esittelivät Horikoshi ja Akiba [Alkalophillc Microorganism, Japan Scientific Society Press (Tokyo), 1982]. Tämän keksinnön mukainen kanta eroaa Bacillus-sukuun kuu-10 luvasta mikro-organismiryhmästä, joka kasvaa neutraalilla pH-alueella.

Tämän keksinnön mukaisella kannalla, yllä mainittujen ominaisuuksien lisäksi, on mykologisesti erilaisia piirteitä kuin millään tavanomaisella tunnetulla "alkalo-15 fiilisellä Baclllus-lajilla". Vastaavasti tämän keksinnön mukainen kanta määritettiin uudeksi kannaksi ja sille annettiin nimeksi Bacillus sp. KSM-AP1378, joka talletettiin talletuslaitokseen Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology nimellä FERM P-10886.

20 Tämän keksinnön mukaista emäksistä pullulanaasia, jolla on α-amylaasiaktiivisuutta, voidaan tuottaa siirros-tamalla tämän keksinnön mikro-organismeja ja viljelemällä mikro-organismeja tavanomaisin viljelymenetelmin. On suotavaa lisätä elatusaineeseen sopiva määrä hiilen- ja 25 typenlähteitä, joita mikro-organismi voi hyödyntää.

• ·

Hiilen-ja typenlähteille ei ole erityisiä rajoituksia. Typenlähteiksi luetellaan orgaanisia typenlähteitä kuten maissigluteenijauhot, hieno soijapapujauho, maissin lio-tusneste, kasaminohappo, hiivauute, Pharma-elatusaine, 30 lihauute, tryptoni, "soytone", "hypro", Aji-jauhe, kar kea soijapapujauho, puuvillansiemenjauho, "cultivator", ’ "ajipron", "zest" ja vastaavat; ja epäorgaanisia typenläh teitä kuten ammoniumsulfaatti, ammoniumnitraatti, ammo-niumfosfaatti, ammoniumkarbonaatti, natriumnitraatti, am-35 moniumasetaatti ja vastaavat. Hiilenlähteistä annetaan 12 95482 esimerkkeinä liukoinen tärkkelys, liukenematon tärkkelys, amylopektiini, glykogeeni, pullulaani ja niiden osittaisen hajoamisen tuottamat haaraiset oligomeerit, ja hyödynnettävissä olevat hiilenlähteet kuten glukoosi, maltoosi, 5 arabinoosi, ksyloosi, riboosi, mannoosi, fruktoosi, galak-toosi, sakkaroosi, laktoosi, trehaloosi, mannitoli, sorbitoli, glyseroli ja hyödynnettävissä olevat orgaaniset hapot kuten sitruunahappo, etikkahappo ja vastaavat. Näiden hiilen- ja typenlähteiden lisäksi elatusaineeseen voi-10 daan lisätä epäorgaanisia ioneja kuten fosfaattia, magnesiumia, kalsiumia, mangaania, sinkkiä, kobolttia, natriumia, kaliumia ja vastaavia; tarvittaessa muitakin orgaanisia tai epäorgaanisia aineita mikro-organismien ravinnoksi .

15 Suotava viljelylämpötila-alue on 20-40 °C, mielui ten 30-35 °C. Suotava pH-alue on 8-10,5, suotuisin pH on 10. Näissä olosuhteissa viljely valmistuu tavallisesti 2-3 päivässä.

Tämän keksinnön emäksinen pullulanaasi, jolla on a-20 amylaasiaktiivisuutta, voidaan eristää elatusliemestä yleisiin entsyymeihin sovellettavilla tavanomaisilla keruu- ja puhdistusmenetelmillä. Tarkasti ilmaisten, solut erotellaan viljelyliemestä tavanomaisilla kiinteä-neste -erotusmenetelmillä, kuten sentrifugaatiolla, suodatuksella 25 tai vastaavalla, jolloin saadaan raaka entsyymiliuos.

Vaikka on mahdollista käyttää näin saatua raakaa entsyymi-liuosta sellaisenaan, se voi soveltua puhdistetuksi entsyymiksi tarpeen mukaan sen jälkeen kun se on eroteltu erottelumenetelmin raakaentsyymiksi, esim. suolaamalla 30 irti liuoksesta, seostamalla, ultrasuodatuksella ja vastaavalla, ja puhdistamalla ja kiteyttämällä raakaentsyymi tavanomaisin menetelmin.

Nyt esitellään suotava menetelmä tämän keksinnön emäksisen pullulanaasi Y:n tuottamiseksi. Bacillus-sukuun 35 kuuluvia alkalofiilisen mikro-organismin kantoja, esimer- il · eSfc Hl H 144« > 13 95482 kiksi KSM-AP1378 -kantoja, viljellään ravistellen aerobisesti 30 °C lämpötilassa kolme (3) päivää elatusaineessa, jossa on 1 paino-% pullulaania; 1 paino-% polypeptonia; 0,5 paino-% hiivauutetta; 0,1 paino-% KH2P04; 0,25 paino-% 5 Na2HP04.12H20; 0,02 paino-% MgS04.7H20; ja 0,5 paino-% natriumkarbonaattia. Solut poistetaan viljelyliuoksesta ja supernatantti otetaan talteen. Supernatantti puhdistetaan sen jälkeen DEAE-selluloosa-adsorptiolla, a-syklodekstrii-niaffiniteettikromatografialla, DEAE-Toyopeal (valmistaja 10 Tosoh) -kromatografialla, ja Sephacryl (valmistaja Pharmacia) -kromatografiällä. Näin saatu puhdistettu entsyymi näkyy yhtenä juovana kun se ajetaan elektroforeesissa käyttäen polyakryyliamidigeeliä (geelin konsentraatio: 15 % paino/tilavuus) ja elektroforeesissa natriumdodekyy-15 lisulfaattia (SDS) käyttäen. Tällä menetelmällä aktiivisen pullulanaasin saanto on noin 2 %.

Nyt käydään läpi uuden entsyymin, tämän keksinnön mukaisen emäksisen pullulanaasi Y:n entsymologiset ominaisuudet. Ensymaattiset aktiivisuudet mitattiin käyttäen 20 seuraavia puskuriliuoksia (kukin 50 mM) alla selitetyn menetelmän mukaisesti.

Puskuriliuokset: pH 4 - 6: asetaattipuskuri pH 6 - 8: fosfaattipuskuri (pullulanaasiaktiivi- 25 suuden määrittämiseen) pH 6 - 8: Tris-malaattipuskuri (a-amylaasiaktii- visuuden määrittämiseen) pH 8 - 11: glysiini-NaCl-NaOH -puskuri pH 11 - 12: KCl-NaOH -puskuri 30 Entsymaattisen aktiivisuuden mittaaminen . (1) Pullulanaasiaktiivisuus • 1 0,1 ml entsyymiliuosta lisättiin 0,9 ml:aan kutakin substraattiliuosta, jotka oli valmistettu kustakin pullulaania sisältävästä puskuriliuoksesta (reaktiosysteemin 14 95482 lopullinen konsentraatio: 0,25 % paino/tilavuus) ja seos saatettiin reagoimaan 40 °C 30 minuutin ajan. Reaktion jälkeen pelkistävät sokerit määritettiin kvantitatiivisesti 3,5-dinitro-salisyylihappo (DNS) -menetelmällä. Tarkas-5 ti ilmaisten, 1,0 ml DNS-reagenssia lisättiin 1,0 ml:aan reaktioliuosta ja seosta kuumennettiin 100 "C 5 minuutin ajan värin kehittämiseksi. Jäähdyttämisen jälkeen seos laimennettiin lisäämällä 4,0 ml deionisoitua vettä. Tämä liuos analysoitiin kvantitatiivisesti kolorimetrillä aal-10 lonpituudella 535 nm. Yksi yksikkö (1 U) entsyymiaktiivisuutta määritettiin siksi entsyymimääräksi, joka vapautti 1 pmol pelkistävää sokeria (glukoosina) minuutissa stan-dardikoeolosuhteissa.

(2) a-amylaasiaktiivisuus 15 0,1 ml entsyymiliuosta lisättiin kuhunkin 0,9 ml:aan substraattiliuosta, jotka oli valmistettu kustakin liukoista tärkkelystä sisältävästä puskuriliuoksesta (reaktiosysteemin lopullinen konsentraatio: 0,25 % pai- no/tilavuus) ja liuos saatettiin reagoimaan 50 eC 15 mi-20 nuutin ajan. Reaktion jälkeen pelkistävät sokerit määritettiin kvantitatiivisesti DNS-menetelmällä. Tarkasti ilmaisten, 1,0 ml DNS-reagenssia lisättiin 1,0 ml:aan reaktioliuosta ja seos kuumennettiin 100 °C 5 minuutin ajan värin kehittämiseksi. Jäähdyttämisen jälkeen liuos laimen-25 nettiin lisäämällä 4,0 ml deionisoitua vettä. Tämä liuos • · 4 analysoitiin kvantitatiivisesti kolorimetrillä aallonpituudella 535 nm. Yksi yksikkö (1 U) entsyymiaktiivisuutta määritettiin siksi entsyymimääräksi, joka vapautti 1 pmol pelkistävää sokeria (glukoosina) minuutissa standardikoe-30 olosuhteissa.

. Entsymologiset ominaisuudet (1) Toiminta

Vaikuttaa pullulaaniin ja liukoiseen tärkkelykseen tuottaen enimmäkseen maltotrioosia pullulaanista ja enim-35 mäkseen maltotetraoosia ja maltopentaoosia liukoisesta il ' iu t liiti l i : s* : 15 95482 tärkkelyksestä. Vaikuttaa myös glykogeeniin tuottaen mal-totetraoosia ja maltopentaoosia. (Katso kuva 1) (2) Substraattispesifisyys

Vaikuttaa pullulaaniin, liukoiseen tärkkelykseen ja 5 glykogeeniin. (Katso taulukko 1)

Taulukko 1

Substraatti Konsentraatio Suhteellinen 10 aktiivisuus (%)

Pullulaani 0,25 % w/v 100

Glykogeeni (osteri) 0,5 % w/v 25

Glykogeeni 15 (kanin maksa) 0,5 % w/v 24

Amylopektiini 0,5 % w/v 55

Amyloosi 0,5 % w/v 28

Maltoosi 1 x 10'2 M 0

Maltotrioosi 1 x 10*2 M 0 20 Panoosi 1 x 10"2 M 0

Isomaltoosi 1 x 10'2 M 4

Isomaltotrioosi 1 x 10'2 M 11

Gentiobioosi 1 x 10'2 M 0 25 (3) Käyttö-pH ja optimaalinen pH-alue a ·

Vaikuttaa pullulaaniin pH-alueella 5-12 optimaalisen pH-alueen ollen 8,5 - 10.

Pullulanaasin aktiviteetit eri pH-arvoilla mitat-30 tiin käyttämällä kutakin reaktiosysteemiä, jotka koostuivat 0,25 % (paino/tilavuus) pullulaanista ja puskuriliuoksesta, joka oli 10 mM asetaatti (pH 4 - 5), fosfaatti (pH 6-8), glysiini-NaCl-NaOH (pH 9-10,5) ja KC1-NaOH (pH 11-12). Kukin reaktio saatettiin tapahtumaan 35 40 °C 30 minuutin ajan. Tulokset esitetään kuviossa 2(a).

16 95482

Aktiivinen pH-alue liukoiselle tärkkelykselle on 4-12, optimaalisen pH-alueen ollen 7 - 9,5.

α-amylaasiaktiviteetit eri pH-arvoilla mitattiin käyttämällä kutakin reaktiosysteemiä, jotka koostuivat 5 0,25 % (paino/tilavuus) liukoisesta tärkkelyksestä ja pus kuriliuoksesta, joka oli 10 mM asetaatti (pH 4-5), Tris-malaatti (pH 6-8), glysiini-NaCl-NaOH (pH 9-10,5) ja KC1-NaOH (pH 11-12). Kukin reaktio saatettiin tapahtumaan 50 °C 15 minuutin ajan. Tulokset esitetään kuviossa 2(b). 10 (4) pH-kestävyys

On stabiili pH-alueella 6-10,5 pullulaania kohtaan. Pullulanaasin aktiviteetit eri pH-arvoilla mitattiin käyttämällä kutakin reaktiosysteemiä, jotka koostuivat 0,25 % (paino/tilavuus) pullulaanista ja pusku-15 riliuoksesta, joka oli 10 mM asetaatti (pH 4 - 5), fosfaatti (pH 6-8), glysiini-NaCl-NaOH (pH 9-10,5) ja KC1-NaOH (pH 11-12). Kukin reaktio saatettiin tapahtumaan 40 °C 10 minuutin ajan. Tulokset esitetään kuviossa 3(a). On stabiili pH-alueella 4-12 liukoista 20 tärkkelystä kohtaan.

α-amylaasiaktiviteetit eri pH-arvoilla mitattiin käyttämällä kutakin reaktiosysteemiä, jotka koostuivat 0,25 % (paino/tilavuus) liukoisesta tärkkelyksestä ja puskuriliuoksesta, joka oli 10 mM asetaatti (pH 4 - 5), Tris-25 malaatti (pH 6-8), glysiini-NaCl-NaOH (pH 9-10,5) ja KC1- »· «

NaOH (pH 11-12). Kukin reaktio saatettiin tapahtumaan 50 °C 15 minuutin ajan. Tulokset esitetään kuviossa 3(b).

(5) Käyttölämpötila ja optimilämpötila

Vaikuttaa pullulaaniin ja liukoiseen tärkkelykseen 30 laajalla lämpötila-alueella 10 - 65 °C optimilämpötilan • ollen noin 50 °C. Tulokset esitetään kuvissa 4(a) ja 4(b).

(6) Lämmönkestävyys Lämpötila, jossa entsyymi menettää aktiivisuutensa, tutkittiin lämpökäsittelemällä entsyymiä eri lämpötiloissa 35 30 minuutin ajan pH:n ollessa 9,5. Tulosten mukaan entsyy- 17 95482 mi oli stabiili aina 45 eC asti. Tulokset esitetään kuvissa 5(a) ja 5(b).

(7) Molekyylipaino

Noin 200 000 ± 5 000 mitattuna SDS-polyakryyliami-5 digeelielektroforeesilla (geelin konsentraatio: 7,5 % paino/tilavuus).

(8) Metalli-ionien vaikutukset

Pullulanaasin aktiivisuuteen vaikuttavat haitallisesti Hg2+-, Mn2+- ja Pb2+-ionit ja a-amylaasiaktiivisuuteen 10 vaikuttavat haitallisesti Hg2*-, Mn2*-, Pb2*, Cd2+- ja Zn2+-ionit. Tulokset näkyvät taulukossa 2.

Taulukko 2 15 Yhdiste Konsentraatio Jäännösaktiivisuus (%)

Pullulanaasi- a-amylaasi- ak- tiivisuus aktiivisuus 20 Ei lisätty - 100 100

Metallisuola

HgCl2 1 mM 36 53

MnCl2 1 mM 51 28

PbCl2 1 mM 53 53 25 CdCl2 1 mM 80 38

ZnCl2 1 mM 93 57 .. Kelatoiva agenssi EDTA 10 mM 77 17 (88) * EGTA 10 mM 65 18 (91) * 30 - * : Sulkeissa oleva arvo on jäännösaktiivisuus kun Ca2+-ioneja lisättiin uudelleen.

* · ♦ 4

Kuten taulukossa 2 näytetään, metalli-ionit, jotka 35 vaikuttavat haitallisesti tämän keksinnön emäksisen pullulanaasin pullulanaasi- tai a-amylaasiaktiivisuuteen, eroavat toisistaan.

ie 95482 (9) Pesuaineiden vaikutus 0,05 % pinta-aktiivisten pesuaineiden liuoksia, kuten lineaarista alkyylibentseenisulfonaattia (LAS), natriumpolyoksietyleenialkyylisulfaattia (ES), nat-5 rium-a-olefiinisulfonaattia (AOS), natrium-a-sulfonoitua rasvahappoesteriä (α-SFE), natriumalkyylisulfonaattia (SAS), natriumdodekyylisulfaattia (SDS), saippuoita ja softanolia testattiin 40 °C lämpötilassa 15 minuutin ajan, jotta saatiin vahvistetuksi, etteivät nämä vaikuttaneet 10 haitallisesti entsyymiaktiivisuuteen.

(10) Kelatoivien agenssien vaikutukset

Kelatoivat agenssit kuten EDTA (10 mM) ja EGTA (10 mM) eivät vaikuta haitallisesti pullulanaasiaktiivisuu-teen, mutta vaikuttavat voimakkaasti a-amylaasiaktiivisuu-15 teen. a-amylaasiaktiivisuus, johon kelatoiva agenssi on vaikuttanut haitallisesti, voidaan palauttaa lisäämällä Ca2*-ioneja kuten taulukossa 2 näytetään.

(11) Vastustuskyky proteaasille

Aktiivisuudet mitattiin emäksisen proteaasin, esi-20 merkiksi Maxatasen (IBIS), Sabinasen (Novo), tai vastaavan ollessa läsnä määränä 0,2 AU/1, jotta saatiin vahvistetuksi että tämän keksinnön mukainen entsyymi osoitti vahvaa vastustuskykyä kaikille proteaaseille.

Kuten yllä mainittujen entsymologisten ominaisuuk-25 sien perusteella on selvää, on tämän keksinnön mukainen emäksinen pullulanaasi Y entsyymi, jolla on fysiologisesti ja kemiallisesti erilaiset ominaisuudet kuin tavanomaisilla pullulanaaseilla, joilla on a-amylaasiaktiivisuutta.

Jotta tämän keksinnön mukaisen entsyymin uutuus 30 selviäisi, taulukossa 3 näytetään vertailevia tietoja tämän keksinnön mukaisen emäksisen pullulanaasi Y:n ja ta-vanomaisten pullulanaasien, joilla on a-amylaasiaktiivisuutta, fysiologisista ja kemiallisista ominaisuuksista.

19 95482

00 I

. r*. o an p w η ο υ ο -p a v m o ° x o co < o o> -v

4-> 31 rHCTiinOOH-H

C Η 2 in m o 0) w in

H H CO II O I 0) O

so co h x I I w a) EÄ ϋη ino o Q Μ ή ao o) cot - - o m o w ο ''ϊ n co

Eh x ffltn cotvin^n^HOO 0 0 (0 p p h o>

co +J

x o

30 I -P

H > OH

CD 30 P 5 (0 4-> O' +J vO ε ίο £ co co n x o C H 30 (?> W C - Φ'-' ·* (0 -P C H 3 (0 00 Ο Η Η *

Η μ S H H o 0) w in O

3 C 3 νθ H 3 I U O O I 0) O

h <d -p r> ho ° o v) a)

H l-PCnOPODOO 00 D M - H

3 iii id mo to h i - * o oh w o ^ n co co a ι-j a a^o m o a ^ cv m mcN^-ai o ο o 11 o x ΐ

3 ¢0 -PH

3 3 0 CD

3 -p p o

m (OHO

μ σι Ό n S (0 2 loo m o OO E w -H 3 σ> co co 3 ·* P CD H 3 H tv [v OCO ' ·· 0) PH''-·. H H OH CS n £.

C co tv H H I IOUOH O O0

0) .* Η Η P ° « 0) -P

I P Η Εν Ο Λ Otv O 0) ' 'H

λ ID 30 ID 3D « - Ο οιη Oi nn H (0

ann CUCOEh cv vo in yo — OO WE

0 0 ·· * -P Ό

(0 HO

P <0 ·. I Q) (0 W E -

• H I Q) H -PH H

C0I3HH WC ·· W

(0 H H H Q) 0)(0 no

(0 10 H 0) O C010 OO

C (0 3 Ό I 3 HH (0

(0 <0 a 3 Ö 3 0 3 - P

HH 3 W JiH HC

•H 30)>i<Dc0W(0H 3 H COO) E hhehhhh^o h 30 3 oa

CO HHtOHH^HHC H P a OO

H 3 d) I 0) -P H -P H H W X -P

C aO 0 Ό O -H O +J H) -P 0) -P 3 H

(0 3 3 a-p a* a o) w o) h ro

Ο Ϊ3Κ3ΕΧΕ®·Η 0) .* 0) Ö> E

: ρ awaw30(0;(0HH ρ >< ρ 0 I H I H H H H W >i -P H -P ·· ·· 1 H>H>HWH(0>i 00)0 H in

O ΕΗΕΗΕίΟΕίΟΛ: 3*3 OO

p H H H H H 3 H H 0) ^ Jt ·Ρ * +j +j Ρ Ρ P C P >i H 30 P 30 h a*a*awaEo ao ao ao 2 oiooiooHOiDS a -p a * 20 95482

Kuten taulukon 3 fysikaaliskemiallisista ja entsy-mologisista ominaisuuksista käy ilmi, on tämän keksinnön mukainen emäksinen pullulanaasi Y selvästi erilainen kuin Bacillus subtilis TU:n tuottama pullulanaasi-amylaasikomp-5 leksi ja Bacillus circulans F-2:n tuottama amylaasi, jolla on pullulanaasiaktiivisuutta.

Tämän keksinnön mukaisella emäksisellä pullulanaasi Y:llä on α-amylaasiaktiivisuutta, ja sen optimaalinen pH sijaitsee korkeammalla emäksisellä alueella kuin tavan-10 omaisilla emäksisillä pullulanaaseilla, ja se osoittaa erinomaista kestävyyttä laajalla pH-alueella. Lisäksi, tämän keksinnön mukaisella emäksisellä pullulanaasilla on vahva sietokyky lähes kaikille pesuainekomponenteille kuten pinta-aktiivisille pesuaineille, kelatoiville agens-15 seille, pesuaineiden proteaaseille ja vastaaville.

Niinpä tämän keksinnön mukaista entsyymiä voidaan käyttää eduksi pesuaineen ainesosana. Tämän keksinnön mukainen entsyymi on täten erinomaisen hyödyllinen teollisilla aloilla.

20 Muut keksinnön piirteet käyvät ilmi seuraavasta tyypil listen suoritusmuotojen kuvauksesta, jotka annetaan esimerkkeinä keksinnöstä eikä niitä ole siitä syystä tarkoitettu rajoittaviksi.

ESIMERKKEJÄ 25 Esimerkki 1 * ·

Lusikallinen maata (noin 0,5 g) Tochigi-shista, Tochigi-kenista, Japanista, suspensoitiin steriloituun suolaliuokseen ja seosta lämpökäsiteltiin 80 °C lämpötilassa 15 minuuttia. Lämpökäsitellyn seoksen supernatantti 30 laimennettiin sopivasti, siirrettiin eristävälle agarela-tusaineelle (Elatusaine A) ja viljeltiin 30 eC lämpötilassa pesäkkeiden kasvattamiseksi. Pesäkkeet, jotka muodostivat läpinäkyviä vyöhykkeitä reunoihinsa pullulaa-nin hajoamisen vuoksi, kerättiin, jotta saatiin kantoja, 35 jotka tuottavat pullulanaasia jolla on a-amylaasiaktiivi-suutta. Nämä kannat siirrostettiin nestemäiseen elatusai-neeseen B ja viljeltiin ravistellen 30 °C lämpötilassa 3 21 95482 päivää. Viljelyn jälkeen viljelty liemi sentrifugoitiin supernatantin erottamiseksi. Supernatantin pullulanaasi-ja a-amylaasiaktiivisuudet mitattiin pH:ssa 10, jotta voitiin valita kannat, jotka tuottavat emäksistä pullulanaa-5 siä jolla on a-amylaasiaktiivisuutta. Täten saatiin hankittua Bacillus sp. KSM-AP1378 (FERM P-10886), joka on mikro-organismi, joka pystyy tuottamaan emäksistä pullula-naasia, jolla on a-amylaasiaktiivisuutta.

% (paino/tilavuus) 10 Elatusaine A Pullulaani 0,5

Liukoinen tärkkelys 0,5 Värjätty pullulaani 0,2

Polypeptidi 0,2

Hiivauute 0,1 15 KH2P04 0,03 (NH4)2S04 0,1

MgS04 · 7H20 0,02

CaCl2 · 2H20 0,02

FeS04 · 7H20 0,001 20 MnCl2 · 4H20 0,0001

Agar 1,5

Na,C0, 0,5 pH: 10,0 25 % (paino/tilavuus) ' · ·

Elatusaine B Pullulaani 0,5

Liukoinen tärkkelys 0,5

Tryptoni 0,2

Hiivauute 0,1 30 KH2P04 0,03 (NH4)2S04 0,1 1 MgS04 · 7H20 0,02

CaCl2 · 2H20 0,02

FeS04 · 7H20 0,001 35 MnCl2 · 4H20 0,0001

Na2C03 0^5 pH: 10,0 22 95482

Esimerkki 2

Bacillus sp. KSM-AP1378 -kannat, jotka tuottavat emäksistä pullulanaasi Y:tä, jolla on a-amylaasiaktiivi-suutta, siirrostettiin nestemäiseen elatusaineeseen B, 5 jolla oli sama koostumus kuin esimerkissä 1, ja viljeltiin ravistellen 30 °C lämpötilassa 3 päivää. Viljelyn jälkeen solut poistettiin sentrifugoimalla, jotta saatiin pullula-naasientsyymin raakapreparaatti. Raaka entsyymi prosessoitiin tavanomaisella menetelmällä, jotta saatiin valmistet-10 tua etanolikuivattua jauhetta. Tuloksena saatiin emäksistä pullulanaasi Y:tä, jolla on a-amylaasiaktiivisuutta, mikä vahvistettiin kuten taulukossa 4 on näytetty. Entsymaatti-nen aktiivisuus mitattiin pH:ssa 9.

15 Taulukko 4

Kanta Entsyymimäärä Entsymaattinen aktiivisuus (U/g) per - elatusainelitra Pullulanaasi a-amylaasi 20 (g) KSM-AP1378 0,2 2,096 2,476

Esimerkki 3 25 Bacillus sp. KSM-AP1378, joka kykenee tuottamaan emäksistä pullulanaasia, jolla on a-amylaasiaktiivisuutta, ; siirrostettiin elatusaineeseen, jolla oli sama koostumus kuin nestemäisellä elatusaineella B esimerkissä 1, paitsi että pullulaanin ja liukoisen tärkkelyksen sijasta lisät-30 tiin 1 % maltoosia ja viljeltiin 30 °C 2 - 3 päivää ravistellen. Supernatantin pullulanaasiaktiivisuudeksi sentri-fugoinnin jälkeen mitattiin 211 U/litra viljelylientä.

Esimerkki 4

Esimerkissä 2 valmistettuun raakaentsyymin super-35 natanttiin lisättiin DEAE-selluloosajauhetta ja supernatantin pullulanaasi adsorboitiin täysin DEAE-selluloosaan.

Kun hartsi oli pesty 10 mM Tris-HCl -puskurilla (pH 8), ;l au 4- tilt; I l · 23 95482 entsyymi eluoitiin 10 mM Tris-HCl -puskurilla (pH 8) jossa oli 0,6 M natriumkloridia. Eluaatti dialysoitiin 10 mM Tris-HCl -puskuria vastaan. Sitten entsyymi adsorboitiin 10 mM Tris-HCl -puskurilla tasapainotettuun o-syklodeks-5 triiniaffiniteettipylvääseen ja elutoitiin β-syklodeks- triiniä sisältävällä 10 mM Tris-HCl -puskurilla (pH 8) aktiivisten fraktioiden keräämiseksi. Dialysoinnin jälkeen aktiiviset fraktiot adsorboitiin DEAE-Toyopeal 650S:ään joka oli tasapainotettu 10 mM Tris-HCl-puskurilla 10 (pH 8). Aktiivisten fraktioiden keräämiseksi adsorboitu entsyymi eluoitiin 10 mM Tris-HCl -puskurigradientilla, joka sisälsi natriumkloridia konsentraatioissa 0,1 - IM. Dialysoinnin jälkeen aktiiviset fraktiot kaadettiin Sepha-cryl S-200 -pylvääseen, joka oli tasapainotettu 10 mM 15 Tris-HCl -puskurilla (pH 8), joka sisälsi 0,1 M natriumkloridia, ja aktiivisten fraktioiden keräämiseksi eluoitiin samalla puskurilla, joka sisälsi 0,1 M natriumkloridia. Aktiiviset fraktiot konsentroitiin ultrasuodatusmemb-raanille ja dialysoitiin yli yön 10 mM Tris-HCl -puskuria 20 vastaan (pH 8) jotta saataisiin emäksinen pullulanaasi Y, jolla on a-amylaasiaktiivisuutta. Saatu emäksinen pullulanaasi Y, jolla on α-amylaasiaktiivisuutta, pantiin elektroforeesiin, jossa käytettiin polyakryyliamidigeeliä (geelin konsentraatio: 15 % paino/tilavuus) Davisin mene-. 25 telmän mukaisesti [Ann. N. Y. Acad. Sei., 121, 404, (1964)], ja värjättiin Coomassie Brilliant Bluella jotta saatiin vahvistettua, että se antoi yhden juovan (katso kuvio 6).

Esimerkki 5 30 Esimerkissä 4 saatu emäksinen pullulanaasi Y, jolla on α-amylaasiaktiivisuutta, pantiin natriumdodekyylisul-‘ v* faatti (SDS) -elektroforeesiin tavanomaisen menetelmän mukaisesti, jotta saatiin vahvistettua, että entsyymin molekyylipaino oli 200 000 ± 5 000. (Katso kuvio 7).

24 95482

Ilmeisesti tätä keksintöä voidaan muunnella ja varioida monin tavoin yllä olevien oppien valossa. On sen vuoksi ymmärrettävä, että liitteenä olevien patenttivaatimusten suoja-alan piirissä keksintöä voidaan käyttää toi-5 sin kuin tässä erityisesti kuvaillaan.

» ^ 51 ' - »rt Hill lit f M !

Claims (8)

1. 25 95482
2. 1. Emäksinen pullulanaasi Y, jolla on a-amylaasi-aktiivisuutta, tunnettu siitä, että sillä on seu-5 raavat entsymologiset ominaisuudet: (1) Toiminta Vaikuttaa pullulaaniin ja liukoiseen tärkkelykseen tuottaen enimmäkseen maltotrioosia pullulaanista ja enimmäkseen maltotetraoosia ja maltopentaoosia liukoisesta 10 tärkkelyksestä, ja vaikuttaa myös glykogeeniin tuottaen maltotetraoosia ja maltopentaoosia; (2) Substraattispesifisyys Vaikuttaa pullulaaniin, liukoiseen tärkkelykseen ja glykogeeniin; 15 (3) Käyttö-pH ja optimaalinen pH-alue Vaikuttaa pullulaaniin pH-alueella 5-12 optimaalisen pH-alueen ollen 8,5 - 10, ja vaikuttaa liukoiseen tärkkelykseen pH-alueella 4-12 optimaalisen pH-alueen ollen 7 - 9,5; 20 (4) pH-kestävyys On stabiili pH-alueella 6-10,5 pullulaania kohtaan ja pH-alueella 4-12 liukoista tärkkelystä kohtaan (käsittelyolosuhteet: 45 eC; 10 minuuttia); (5) Käyttölämpötila ja optimilämpötila
3. 25 Vaikuttaa pullulaaniin ja liukoiseen tärkkelykseen laajalla lämpötila-alueella 10 - 65 ®C optimilämpötilan ollen noin 50 °C; (6) Lämmönkestävyys On stabiili 45 °C:seen saakka kun käsitellään 10 mM 30 glysiini-NaCl-NaOH -puskurissa (pH 9,5) 30 minuutin ajan; (7) Molekyylipaino ' Noin 200 000 ± 5 000 mitattuna elektroforeesilla käyttäen natriumdodekyylisulfaattia (SDS); (8) Metalli-ionien vaikutukset
4. 35 Pullulanaasin aktiivisuuteen vaikuttavat haitalli- 95482 sesti Hg2*-, Μη2*- ja Pb2*-ionit ja α-amylaasiaktiivisuuteen vaikuttavat haitallisesti Hg2*-, Mn2*-, Pb2*, Zn2*- ja Cd2*-ionit; ja (9) Se on saatavissa viljelemällä Bacillus sp. KSM-5 AP1378, joka on talletettu talletuslaitokseen Fermentation Researsch Institute Agency of Industrial Science and Technology numerolla FERM BP-3048.
5. 2. Emäksistä pullulanaasia, jolla on a-amylaasiak-tiivisuutta, tuottava mikro-organismi, tunnettu 10 siitä, että sille on annettu nimi Bacillus sp. KSM-AP1378 ja se on talletettu numerolla FERM BP-3048 talletuslaitokseen Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.
6. 3. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen emäks- 15 isen pullulanaasin Y tuottamiseksi, tunnettu sii tä, että viljellään Bacillus-sukuun kuuluva mikro-organismi, joka kykenee tuottamaan mainittua emäksistä pullulanaasia, jolla on α-amylaasiaktiivisuutta, ja kerätään emäksinen pullulanaasi, jolla on a-amylaasiaktiivisuutta, 20 viljellystä elatusaineesta.
7. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään emäksistä pullulanaasia, jolla on α-amylaasiaktiivisuutta, tuottava mikro-organismi, jolle on annettu nimi Bacillus sp. KSM-
8. 25 AP1378 ja joka on talletettu talletuslaitokseen Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology nimellä nimellä FERM BP-3048, ja kerätään emäksinen pullulanaasi Y, jolla on a-amylaasiaktiivisuutta, viljellystä elatusaineesta. ) · 27 95482