JPS63101493A - アルカリプロテア−ゼ含有洗浄剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

挟権宛乱 本発明は、優れた洗浄力を有し、かつ、安定性の良好な
、新規アルカリプロテーゼを含有する洗浄剤組成物に関
する。 災米技亙 従来、衣類の汚れに対する洗浄力をより向上させた洗浄
剤組成物を得るために、アミラーゼ、プロテアーゼ、セ
ルラーゼやプロティンなどの酵素を配合することがよく
知られている（特公昭４７−４５８０２号公報、同４８
−３０６４６号、特開昭４７−３７３３号公報、同５２
−１２８９０４号公報、同５３−５６２０４号公報、同
５６−１２９２９８号公報）。その中でも特にバチルス
属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から生産されるアルカリプロテ
アーゼが一般に使用されており、ノボ・インダストリー
社の「アルカラーゼ」（Ａｌｃａｌａｓｅ）、「エスペ
ラーゼＪ　（Ｅｓｐｅｒａｓｅ）、「サビナーゼＪ　（
Ｓａｖｉｎａｓｅ）、ギスト・プロカーズ社の「マキサ
ターゼＪ　（Ｍａｘａｔａｓｅ）、ナガセ生化学工業−
の「ビオプラーゼ」等の商品名で市販されている。 しかしながら、これら市販のアルカリプロテアーゼは、
洗浄力向上剤であるキレートビルダーと併用すると、そ
の洗浄力向上効果が不十分であったり、保存時の安定性
に劣るという問題点を有している。 見豆立ｌ汐 本発明の目的は、キレートビルダーと併用されて優れた
洗浄力を発揮し、しかも保存時の安定性の良好なアルカ
リプロテアーゼ含有洗浄剤組成物を提供するものである
。 見匪立復媛 本発明のアルカリプロテアーゼ含有洗浄剤組成物は、以
下の（Ａ）、　（Ｂ）および（Ｃ）成分を含有すること
を特徴とする。 （Ａ）バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、
）Ｙ株（微工研条寄第１０２９号）から生産されるアル
カリプロテアーゼ。 （Ｂ）カルシウムイオンに対するキレート生成定数が６
以上のキレートビルダー。 （Ｃ）カルシウムイオン。 以下、本発明についてさらに詳細に説明する。 本発明で用いられるアルカリプロテアーゼは新規な酵素
であり、広く自然界よりアルカリプロテアーゼ産生菌を
検索した結果具い出された、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）に属する１菌種、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｐ、）Ｙ株から産生されたものである。 バチルス・エスピー７株は、微工研条寄第１０２９号（
ＦＥＲＮ　０Ｐ−１０２９）として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。また、バチルス・エス
ピー７株については、特願昭６０−１２３０２１号とし
て既に出願された出願明細書に記載されている。 以下にその菌学的詳細を説明する。 なお、菌学的性質および分類方法は、 Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ−１ｏｇｙ第８版（
１９７４）、Ｒ，Ｅ、Ｇｏｒｄｅｎの検索表（１９７２
）に準じて行なった。ｐＨ１０の培地は、炭酸ナトリウ
ム１％を加えて調製した。温度およびｐＨに関する成育
最適範囲の測定は、温度勾配バイオフォトレコーダーで
行なった。 Ａ、形態的性質 肉汁寒天培地上で３５℃にて２日間培養したとき、以下
の形態的特徴がｗｉ察される。 １）細胞の形および大きさ： 桿菌、０．４−０．５ｕｍＸ１．７−１−９μｍ５２）
多形性：なし。 ３）運動性二周鞭毛を有し運動性あり。 ４）胞子：胞子を形成し、形成途上で細胞は先端近くか
ら膨張する。成熟した 胞子はレモン型であり、大きさは、 ０．７−０．９μ珈Ｘ１．０−１．２μ１１゜５）ダラ
ム染色性：陽性。 ６）抗酸性：陰性。 Ｂ、培養的性質 １）肉汁寒天平板培養： ｐＨ７，０にて生育して、円形、偏平状、金縁のコロニ
ーを形成する。該コロニーの表面は滑らかで光沢有り、
該周辺部は淡褐色、該中心部は半透明の淡褐色。 ｐ）ｌ　１０．０にて生育して１円形、偏平状、金縁の
コロニーを形成する。該コロニーの表面は滑らかで光沢
有り、クリーム色。 ２）肉汁寒天斜面培養： ＰＨ７，０およびｐＨ１０，０にて波帯状に生育し、光
沢のあるクリーム色ないし淡褐色のコロニーを形成する
。赤褐色の色素を僅かに生成する。 ３）肉汁液体培養： ｐＨ７，０にて生育するが、菌膜は形成しない。 ρ旧０．０にて生育が良好で、菌膜は形成しない。 ４）肉汁ゼラチン穿刺培養： ｐＨ７，０にて僅かに液化する。 ｐＨ１０，０にて液化する。 ５）リドマス・ミルク ｐＨ７，０にて生育が非常に悪い。 ＰＨ１０，０にて生育する。 ミルクの凝固は見られない。培地がア ルカリ性のため、リドマスの変色は不 明。 Ｃ６生理的性質 １）硝酸塩の還元：陽性。 ２）脱窒反応：陰性。 ３）ＭＲテスト：陰性。 ４）ＶＲテスト：陰性。 ５）インドールの生成：陰性。 ６）硫化水素の生成：陰性。 ７）デンプンの加水分解：陽性。 ８）クエン酸の利用：にｏｓｅｒの培地では利用しない
。Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培 地では僅かに利用する。 ９）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用しない。 アンモニウム塩は利 用しない。 １０）色素の生成：水溶性の赤褐色の色素を菌体組成物
とに生産する。 １１）ウレアーゼ：陽性。 １２）オキシダーゼ：陽性。 １３）カタラーゼ：陽性。 １４）生育の温度範囲：３３ないし３５℃付近（２０な
いし４７℃）が良好。 １５）生育のｐＨ範囲：　１０．０付近（６０ないし１
２．０）が良好。 １６）酸素に対する態度：好気性下でも嫌気性下でも生
育する。 １７）Ｏ−Ｆテスト：陰性。 １８）糖類から酸およびガスの生成： Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、 Ｄ−フラクトース、麦芽糖、ショ糖、 トレハロース、Ｄ−マンニット、デン プンから酸を生成するが、ガスは生成 しない。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシ ロース、Ｄ−ガラクトース、乳糖、イ ノジット、グリセリンからは酸もガス も生成しない。 Ｄ、その他の性質 １）塩化ナトリウムに対する耐性： １０％ＮａＣＱ下で生育する。 以上の性質を総括すると、まず１本菌株は、カラターゼ
陽性、通性好気性で耐熱胞子を有するダラム陽性の桿菌
であることにより、バチルス属の細菌である。 本菌株が、バチルス・アルカロフイルスに属すると思わ
れるため、理研、川越らのバチルス・アルカロフィルス
＆　２２１　（Ａ丁ＣＣ２１５２２）、Ｎａ５８（特公
昭４８−２７９２号、　５０−１６４３５号参照）、お
よびＮａｏ−６（特公昭５６−４２３６参照）と菌学的
性質を比較した。本菌株とバチルス・アルカロフィルス
−２２１、＆５８、＆Ｄ−６とは、アルカリ性の培地（
ｐＨ１０）で良く生育する点で一致するが、無機窒素源
の利用に関して、本菌株が、硝酸塩およびアンモニウム
塩を利用できないのに対して、上記公知の菌株らは、利
用できる。また、生育ＰＨの範囲において、本菌株がＰ
Ｈ６からｐＨ１２であるのに対して、Ｎα２２１は、ｐ
Ｈ７からＰＨＩＩであり、Ｎａ５８、Ｎ（１０−６は、
ｐＨ７，５からｐＨ１１であり、上記公知の菌株は、ｐ
Ｈ７，０以下では生育できない点で異なる。 生育温度の範囲においても、本菌株が２０℃から４７℃
であり、最適温度範囲が３３℃から３５℃であるのに対
して、　Ｎａ２２１は５５℃、魔５８は４５℃まで生育
でき、最適温度が３７℃から４０℃であり、＆Ｄ−６も
最適温度が３５℃から４０℃と高く、本菌株と異なる。 また、本菌株と、糖類からの酸の生成を＆Ｄ−６と比較
すると１本菌株がＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−ガラクトース。 グリセリンから酸を生成しないのに対して、ＮαＤ−６
は生成する。更に、本菌株は、１０％食塩下でも成育し
、上記公知の菌株とは区別される。 このように本菌株は公知のバチルス・アルカロフィルス
の菌株とは異なるが、上述の菌学的性質からバチルス・
アルカロフィルス類録菌と判断することが妥当である。 バチルス−ｘスビー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）Ｙ株
を培養して得られるアルカリプロテアーゼは、Ｙａ酵素
とｙｂ酵素との２種類であり、それぞれ特願昭６０−１
２３０２２号および特願昭６０−２８６９４４号に記載
されている。 バチルス・エスピー７株の培養は、例えば次のようにし
て行なうことができる。まず、可溶性デンプン２％、硫
酸マグネシウム０．０２％を含む液体培地と、乾燥酵母
１％、リン酸水素カリウム０，１％を含む液体培地とを
、それぞれ１２１℃にて２０分間別々に滅菌した後、各
２０ｍ　Ｑを５００ｍΩの坂ロフラスコに分注し、更に
滅菌済みの炭酸ナトリウムを終濃度１ｚとなるように該
フラスコに加え、５０ｍΩの培養液を調製する。該培養
液にバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）
　Ｙ株を接種し、該培養液を３０℃で１５時間培養し、
種培養液を調製する。該種培養液１００ＩＩＱを同じ組
成の培地３．５１２の入った醗酵タンクに加え、該タン
クに３０℃で毎分３．５Ｑの空気を送りながら７０時間
通気撹拌培養して微生物液を得る。 Ｙａ酵素とｙｂ酵素との分離・製造法は第１図に示した
通りである。まず、微生物培養液を、１１００００ｒｐ
で５分間遠心分離し上清を得た。次に上清液を７０％飽
和の硫安塩析にかけた。更に得られた沈殿物を２０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ｐＨ７，
２）に溶解し、同緩衝液に対して透析し、Ｙ粗酵素（以
下、単にＹ酵素と称す）を得た。続いてＹ酵素溶液を、
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）　−５３セルロース
のアニオン交換クロマトグラフィーにかけ１０ｍＭホウ
酸緩衝液（ｐ）１９．３）で溶出させ、非吸着画分を得
た。 さらに続いて該非吸着画分を、再び７０％飽和の硫安塩
析にかけた。得られた沈殿物を再び２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ｐＨ７，２）に溶解
し、同緩衝液に対して透析した。 更にまた該溶液を、トヨパールＨＷ−５５のゲル濾過ク
ロマトグラフィーにかけ、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（Ｃａイオン２［０Ｍ添加、ｐＨ７，２）で溶出させ、
活性のある両分を集めた。さらに該両分を７０％飽和の
硫安塩析にかけ、得られた沈殿物を２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ＰＨ７，２）に対し
て透析した。最後に変性蛋白質を除去するために、透析
後の活性画分をミリポアフィルタ−で濾過し、精製Ｙａ
酵素（以下、単にＹａ酵素と称す）を得た。 一方、得られたＹ酵素溶液をジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）　−５３セルロースのアニオン交換クロマトグ
ラフィーにかけ２０ｍＲ４トリス−塩酸緩衝液（Ｃａイ
オン２ｍＭ添加、ｐＨ７，２）で非吸着画分としてＹａ
酵素を溶出させた後、Ｏ〜０．５Ｍ塩化ナトリウムを含
む同緩衝液を用い、直線濃度勾配で溶出し、ｙｂ酵素の
粗両分を得た。該クロマトグラフィーの溶出曲線を第２
図に示す。 さらに続いて該ｙｂ粗両分を、再び７０％飽和の硫安塩
析にかけた。得られた沈殿物を５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。さ
らに該溶液をヘモグロビン−アガロース、アフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーにかけ、５０ｍＭリン酸緩
衝液（Ｐ　Ｈ７、０）で溶出させ、活性のある両分を集
めた。さらに該両分を７０％飽和の硫安塩析にかけ、得
られた沈殿物を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオ
ン２ｍＭ添加、ｐＨ７，２）に溶解し、同緩衝液に対し
て透析した。さらに該溶液をトヨパールＨＷ−５５のゲ
ル濾過クロマトグラフィーにかけ、２０ｍ　Ｍトリス−
塩酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ρ４１７．２）で
溶出させ、活性のある両分を集めた。さらに該両分を７
０％飽和の硫安塩析にかけ、得られた沈殿物を２０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオン２１Ｍ添加、ＰＨ７，
２）に溶解し、同緩衝液に対して透析し、精製Ｙｂ酵素
（以下、単にｙｂ酵素と称す）を得た。 精製済みのＹａ酵素およびｙｂ酵素を試料としたゲル濾
過クロマトグラフィーの溶出曲線を、それぞれ第１２図
および第１３図に示す。樹脂としてトヨパールＨＷ−５
５を用い、溶出液として２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２，Ｃａイオン２ｍＭを含む）を用い、展開を上
昇法により実施した。 また、精製済みのＹａ酵素を試料とした高速液体クロマ
トグラフィーの溶出曲線を第１４図に示す。機種はウォ
ーターズＷ　Ｉ　Ｓ　Ｐ−７１０Ｂを用い、ｌ−１２５
カラムを２本直列させ、５０ｍＭリン酸緩衝液で溶出さ
せた。以上から明らかなように、Ｙａ酵素およびＹｂ酵
素は完全に精製された６ すなわち、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｐ、）Ｙ株を培養することによって得られるアルカリプ
ロテアーゼであるＹ酵素は、はＹａ酵素とＹｂ酵素との
混合物であり、その比率はＹａ酵素／Ｙｂ酵素＝９０／
１０〜５０１５０である。 次に前述した方法に従って得られたＹａ酵素、Ｙｂ酵素
およびＹ酵素について説明する。 （１）基質特異性 Ｙａ酵素およびｙｂ酵素の作用は、蛋白質の加水分解で
ある。その酵素の基質特異性を第１表に示す、また、バ
チルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）Ｙ株よ
り同時に生産されるＹａ酵素およびｙｂ酵素との混合物
の基質特異性も同様に評価し、比較した。 Ａ酵素［バチルス・リケニフォルミス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｌｉｃｈａｎｉｆｏｒｍｉｓ）が
より単離されたアルカリプロテアーゼ（商品名アルカラ
ーゼ、ノボ社）の活性を１００としたときの相対分解率
を次の条件で測定した。 条件：温度　　　３５℃ ｐＦ＋　　　　　１０．５（５０ｍＭホウ酸緩衝液）反
応時間　６０分 基質温度　１％ただしヘモグロビ ンは０．４％ 酵素使用量１００ＡＰＵ／ｍＱ　ただし卵白は５００Ａ
ＰＵ／ｎＱ 蛋白質分解率すなわち活性の測定は、アンソン−萩原の
変法に従った。反応後濾過した反応溶液の吸光度を２７
５ｎｍにて測定した。１分間にチロシン１μｇを遊雛さ
せる酵素活性を１アル力リプロテアーゼ単位（Ａ　Ｐ　
Ｕ）とした。 この表から、Ｙａ酵素はケラチンに対して特異性が強＜
、Ｙｂ酵素は卵白に対する特異性が強く、不溶性蛋白質
であるケラチンに対しては弱いことが分かる。また、Ｙ
ａ酵素とｙｂ酵素の混合物であるＹ酵素は、公知のＡ酵
素より広範な基質に対して強く作用する特徴を有する。 〔２〕至適ｐＨおよび安定ｐ）ｌ領域 Ｙａ酵素およびｙｂ酵素の至適ＰＨおよび安定ｐＨ領域
のグラフ図を第３図および４図に示す。用いた緩衝液は
以下のとおりである。 （以下余白） ｍ−」弗」炙−！良−−− ３．５−５．５　　　　　　　酢酸 ４．５−７．０　　　　　　　クエン酸゛６．０−８．
０　　　　　　　リン酸 ７．５−９．０　　　　　　　トリス−ＨＣＱ８．０−
９．０　　　　　　ホウ酸−Ｈ（１９，０−１０，５グ
リシン−ＮａＯＨ ９，５−１１，０ホウ酸−ＮａＯＨ １１，０−１２，０リン酸−ＮａＯＨ １２，０−１３，０ＫＣＱ−ＮａＯＨ 至適ｐＨを調べるに当っては、カゼイン０．６％を含む
２０ｍＭの各緩衝液に各酵素を約４００ＡＰＵ／ｍ！と
なるように加え、３５℃で１０分間反応させ活性を測定
した。至適ｐＨでの活性を１００とするときの各ｐＨで
の相対活性を求めた。安定ＰＨ領領域調べるに当っては
、２０ｔａＭの各緩衝液に各酵素を約４００ＡＰＵ／ｍ
Ｑとなるように加え、２５℃で２４時間インキニーベー
トした後、活性を測定した。インキューベート前の活性
を１００として各ｐＨでの相対活性を求めた。第３図か
ら分かるように、Ｙａ酵素の至適ｐＨは１Ｏ００ないし
１２．５であり、安定ｐＨ領域は６．５ないし１３．０
である。第４図から分かるように、Ｙｂ酵素の至適ｐＨ
は９．０ないし１０．０であり、安定ｐＨ領域は６．５
ないし１２．０である。 【３〕至至適塵及び耐熱性 Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の至適温度と耐熱性を第５図お
よび６図に示す。至適温度を調べるに当っては、基質と
して０．６％のカゼインを含むｐＨ１０，５の緩衝液に
各酵素を加え、１０分間各温度で反応させた。３５℃で
の活性を１００として各温度での相対活性を求めた。耐
熱性は次のようにして調べた。５０ａ＋Ｍホウ酸−Ｎａ
ＯＨ１衝液（３５℃でｐＨ１０，５）に約４００ＡＰ　
Ｕ　／　ｍ　Ｑの酵素を加え、各温度で１０分間熱処理
し、水冷した後、活性を測定した。第５図から分かるよ
うに、Ｙａ酵素の至適温度は７０℃であり、５５℃の温
度まで活性が維持される。 第６図から分かるように、Ｙｂ酵素の至適温度は６５な
いし７０℃の範囲であり、５０℃の温度まで１００％活
性が維持される。 〔４〕紫外線吸収スペクトル Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の紫外吸収スペクトルを第７図
および第８図に示す。試料を５０ｍＭのトリス−塩酸緩
衝液（ＰＨ８，０）に溶かし、紫外線吸収スペクトルを
測定したところ、Ｙａ酵素は２７６ｎｍの波長で極大吸
収を示し、その波長での吸光係数Ｅ）ルは７．４と計算
された。一方、Ｙｂ酵素は２７８ｎｍの波長で極大吸収
を示し、その波長での吸光係数Ｅ）ルは９．５と計算さ
れた。 〔５〕金属イオンの影響 金属イオンのＹａ酵素およびＹｂ酵素の活性に与える影
響を調べた。その結果を第２表および第３表に示す。２
０ｍＭホウ酸−Ｎａ○Ｈ緩衝液（ｐＨ１０，５）にＹａ
酵素またはＹｂ酵素を約４００ＡＰＵ／＋ｏｌを加え、
更に各種金属塩を１ｍＭの濃度で添加し、各所定の条件
で処理後残存活性を測定した。数値は０分の活性を１０
０としてその相対活性で表す。 第２表（Ｙａ酵素） この第２表から、Ｙａ酵素は硫酸銅、硝酸銀、塩化第２
水銀、塩化カドミウムの添加により活性は阻害されるが
、塩化カルシウムの添加では活性の熱に対する安定性が
増すことが分かる。 また、第３表から、Ｙｂ酵素は硫酸鋼、硝酸銀、塩化第
２水銀の添加により、活性が阻害されることが分かる。 バチルス属に属する菌の生産するアルカリプロテアーゼ
は、一般にＣａ”＋によって熱安定性を増すことから、
Ｃａ”＋の効果をみるため、５ｍＭのＣａ”＋を含む５
０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨＬａ衝液（３５℃でｐＨ１０，
５）に約４００ＡＰＵ／ｍｌの酵素を加え、各温度で１
０分間熱処理し、氷冷した後活性を測定して残存活性を
求めた。 比較のため、Ｃａ″＋を加えない条件でも同時に評価し
た。その結果を第４表に示す。数値は０分の活性を１０
０としてその相対活性で表す。 （以下余白） 第４表 Ｃａイオンの添加により、熱に対する安定性がＹａ酵素
では約５℃、ｙｂ酵素では約１０℃向上することが分か
った。 〔６〕阻害剤の影響 Ｙａ酵素およびＹｂ酵素に対する各種の阻害剤の影響を
調べた０条件および方法は以下の通りである。５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（Ｐ１１７．２）でＹａ酵素または
Ｙｂ酵素を８００ＡＰＵ／＠１になるよう調製した。各
阻害剤を添加して、３５℃で３０分間インキュベート後
、残存活性を測定した。値は、阻害剤無添加のものを１
００とした相対活性で示した。その結果を第５表に示す
。 （以下余白） この表から分かるように、Ｙａ酵素およびＹｂ酵素は、
カゼインを基質とした場合、ＥＤＴＡ（エチレンジアミ
ン四酢酸）およびＰＣＭ　Ｂ　（ｐ−クロロマーキュリ
−安息香酸）、アンチパイン（Ａｎｔｉｐａｉｎ）、キ
モスタチン（Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）では活性が阻害
されないが、ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロリン酸）
およびＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオリ
ド）では活性が阻害されることより。 活性中心にセリンを有するプロテアーゼである。 〔７〕分子量 Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の分子量をゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより調べた。充填剤には、トヨパールＨＶ−
５５を用い、２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（Ｃａイオ
ン２ｍＭ添加、ｐＨ７，２）を溶出液とした。標準蛋白
に以下の蛋白（カッコ内は分子量）を用いて検量線を作
成した。蛋白アルブミン（４３，０００）、サーモライ
シン（３７，５００）、ズブチリシン（２７，６００）
、キモトリプシノーゲン（２５，７００）、ミオグロビ
ン（１７，２００）、チトクロームＣ（１１，７００）
を用いた。 検量線を第９図に示す。この方法により、Ｙａ酵素の分
子量は２１，０００、ｙｂ酵素の分子量は４０，０００
と決定した。 ［８］等電点 Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の等電点を等電点電気泳動法に
より調べた。カラム用担体には、ファルマライト３−１
０を用いた。Ｙａ酵素およびＹｂ酵素の等電点電気泳動
模様を第１０図および１１図に示す。この方法によりＹ
ａ酵索の等電点は１０．１、ｙｂ酵素の等電点は５．１
と決定した。

〔９〕アミノ酸組成 Ｙａ酵素およびＹｂ酵素のアミノ酸組成〔アミノ酸分析
器几Ｃ−２０ＯＡ（日本電子）使用〕を調べた。なお、
トリプトファンはアルカリ分解法、システィンは過蟻酸
酸化法により測定した。その組成を公知のプロテアーゼ
のものと比較して第６表に示す。 （以下余白） その結果、他の酵素と比べてＹａ酵素はトリプトファン
、セリン、バリンなどｙｂ酵素はトリプトファン、ヒス
チジン、アルギニン。 アスパラギン酸、グリシン、アラニンなどのアミノ酸組
成において顕著な相違が見られる。 〔１０〕元素分析値 Ｙａ酵素およびｙｂ酵素の元素分析値を第７表に示す。 第７表 最後にまとめとして、ＹＡ酵素およびｙｂ酵素の各種性
状をＡ酵素、バチルス属の好アルカリ性細菌の生産する
公知のアルカリプロテアーゼのもと比較して後記の第８
表に示す。 他の類似した公知のアルカリプロテアーゼ（Ｅ−１，Ｅ
−２，ＡＰＩ−２１，魔２２１については第８表の注を
参照）と比較すると、至適ｐＨはＡ酵素、Ｅ−１，Ｅ−
２およびＡＰＩ−２１が１０〜１１、Ｎα２２１が１１
〜１２であり、Ｙａ酵素は１０〜１２．５と領域が高ｐ
Ｈ側に広く、ｙｂ酵素の至適ｐＨは９〜ＩＯであり、Ｙ
ａ酵素と他の公知のアルカリプロテアーゼに比べて低い
。 次に、至適温度がＹａ酵素およびＹｂ酵素が７０℃付近
にあるのに対して、Ａ酵素、Ｎα２２１は６０℃、ＡＰ
Ｉ−２１は４５〜５０℃と低く、Ｅ−１、Ｅ−２におい
ては、７５℃とＹａ酵素およびＹｂ酵素より高く、この
点においても異なる。 また、Ｙａ酵素およびＹｂ酵素は５ｍＭＣａ”＋イオン
存在下で、Ａ酵素、Ｎ１１２２１、ＡＰＩ−２１の酵素
と同様に耐熱性が約５〜１０℃向上するが、バチルスＮ
ａ　Ｄ　−６株（第８表の注を参照）の生産するＥ−１
、Ｅ−２はＣａ”＋イオンによる熱安定性の増大が認め
られない点で異なる。 更に、ｙｂ酵素の分子量が４万と公知のアルカリプロテ
アーゼに比べて大きく１等電点も５．１と低いことから
も、明らかに別種のものと言える。 以上のことから本酵素は従来知られているアルカリプロ
テアーゼのいずれとも異なる。 よって本酵素を新規酵素と判断することが妥当であり、
アルカリプロテアーゼＹａおよびｙｂと命名した。 （以下余白） 本発明のアルカリプロアーゼ（Ｙ酵素）の配合量は特に
限定されないが、好ましくは、洗浄剤組成物１ｋｇ当り
５０〜１００ＯＯＡ　Ｐ　Ｕ、さらに好ましくは１００
０〜５０００Ａ　Ｐ　Ｕである。 本発明の（Ｂ）成分のキレートビルダーは、カルシウム
イオンに対するキレート定数が６以上であることが必要
である。ここでいうキレート生成定数は、金属イオンと
キレート剤とが反応して生成するキレート化合物の平衝
定数の対数値で示される。カルシウムイオンに対するキ
レート生成定数が６未満であると、液の安定性が劣化し
てしまう。 カルシウムイオンに対するキレート生成定数が６以上の
キレートビルダーとしては、エチレンジアミン四酢酸塩
（１０，８５）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三
酢酸塩（８，５１）　、ニトリロ三酢酸塩（６，５６）
、ジエチレントリアミン五酢酸塩（１０，７４）などが
挙げられ、これらは単独で用いてもよいし、２種以上組
合せて使用してもよい。ここで、カッコ内はキレート生
成定数を示す、これらキレートビルダーの塩としては、
ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；モノエ
タノールアミン塩、ジェタノールアミン塩、トリエタノ
ールアミン塩等のアルカノールアミン塩などが好ましい
。 （Ｂ）成分のキレートビルダーの洗浄剤組成物に対する
配合量は特に限定されないが、好ましくは１〜３０ｗｔ
％、さらに好ましくは５〜２０νｔ％である。 本発明の組成物には、さらに（Ｃ）成分としてカルシウ
ムイオンを（Ｂ）成分に対するモル比が０．９以上とな
るように配合させることが必要である。この値が０．９
未満では、酵素安定性が劣化してしまう。 本発明の洗浄剤組成物の中には、さらに必要に応じて任
意成分を配合することができる。任意成分としては、一
般に洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤、アルカリビ
ルダー、再汚染防止剤、漂白剤、酵素、蛍光増白剤、ハ
イド・ロトロープ、無機塩、香料などがあげられる。 界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、ノニオン
性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤
または双性イオン界面活性剤などが用いられる。アニオ
ン性界面活性剤としては、通常のスルホネート系、サル
フェート系、ホスフェート系のアニオン性界面活性剤お
よび石鹸が使用される。スルホネート系アニオン性界面
活性剤としては、Ｃｓ＋ｚｚの直鎖または分枝鎖のアル
キルベンゼンスルホン酸塩、Ｃ６〜２□の長鎖アルキル
スルホン酸塩、Ｃ３〜２□の長鎖オレフィンスルホン酸
塩などが挙げられる。また、サルフェート系アニオン性
界面活性剤としては、Ｃ１１−２□の直鎖または分枝鎖
のアルキルないしア′ルケニル硫酸エステル塩、Ｃ８，
２のポリオキシエチレン（ＥＯｉｌｉ＝　１〜７モル）
直鎖または分枝鎖のアルキルないしアルケニルエーテル
硫酸エステル塩、Ｃ，−１，のポリオキシエチレン（Ｅ
Ｏｐ＝　１〜７モル）直鎖または分枝鎖のアルキルフェ
ニルエーテル硫酸エステル塩などが挙げられる。ここで
ＥＯｉ５は、エチレンオキシドの平均付加モル数を示す
。また、ホスフェート系アニオン性界面活性剤としては
、Ｃ６〜２□のモノアルキル（またはアルケニル）、ジ
アルキル（またはアルケニル）あるいはセスキリン酸塩
、Ｃ１−１のポリオキシエチレン（ＥＯβ＝１〜７モル
）モノアルキル（またはアルケニル）、ジアルキル（ま
たはアルケニル）あるいはセスキリン酸塩などが挙げら
れる。石鹸としては、Ｃ，−１の飽和または不飽和脂肪
酸塩が挙げられる。これらのアニオン性界面活性剤の対
イオンとしての陽イオンは、例えばナトリウム、カリウ
ム、マグネシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土
類金属イオン、モノエタノールアミン、ジェタノールア
ミン、トリエタノールアミンなどのアルカノールアミン
、アンモニウムなどである。 ノニオン性界面活性剤としては、Ｃ６〜２．のポリオキ
シエチレン（ＥＯｉ５＝　１〜２５モル）直鎖または分
枝鎖のアルキルまたはアルケニルエーテル、Ｃ，〜１８
のポリオキシエチレン（ＥＯｉ５＝　１〜２５モル）ア
ルキルまたはアルケニルフェニルエーテル、ポリオキシ
エチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーなど
のオキシアルキレン付加化合物、０８〜２４の飽和また
は不飽和脂肪酸アルカノールアミドまたはそのアルキレ
ンオキサイド付加物、Ｃ□２〜１４の第三級アミンオキ
シドなどが挙げられる。 両性界面活性剤としては、ジメチルジアルキル（ＣＳ〜
１．）アルキルカルボキシベタイン、ジアルキル（Ｃ，
〜０．）アミノアルキレンカルボン酸塩、２−アルキル
−１−カルボキシ−１−ヒドロキシエチルイミダゾリウ
ムベタインなどが挙げられる。 カチオン性界面活性剤としては、下記の一般式（１）、
（Ｉｆ）、（ＩＩＩ）で表されるものが挙げられる。 （式中のＲ工、Ｒ２，Ｒ，、Ｒ４の少なくとも１つは０
１□〜２４のアルキルまたはアルケニル基であり、その
他はＣ１〜４のアルキル基またはビトロキシアルキル基
あるいはベンジル基を表わし、又はハロゲンを表わす。 ） たはアルケニル基、Ｒ７はＣ□１のアルキル基またはビ
トロキシアルキル基あるいはベンジル基、Ｒ８はＨまた
はＣＨ，、ｎは１〜５の整数、又はハロゲンを表わす。 ） （式中のＲ９とＲ１゜はＣｔａ〜２４のアルキル基また
はアルケニル基、悲およびｍは１〜２０の整数、Ｘはハ
ロゲンを表わす、） これらの界面活性剤はそれぞれ単独で用いてもよいし、
２種以上組合せてもよく、その配合量は１０〜５０ｗｔ
％が適当であり、好ましくは１５〜４０ｗｔ％である。 アルカリビルダーとしては、ケイ酸塩、炭酸塩などの無
機塩、トリエタノールアミン、ジェタノールアミンなど
のアルカノールアミンなどが挙げられ、これらのアルカ
リビルダーはそれぞれ単独で用いてもよいし、２種以上
組合せてもよく、その配合量は１〜５０ｗｔ％が適当で
あり、好ましくは５〜３０ｖｔ％である。 再汚染防止剤としては、カルボキシメチルセルロース、
ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ
ビニルピロリドンなどが。 蛍光増白剤としては、４，４′−ビス（２−スルホスチ
リル）−ビフェニル塩、４，４′−ビス（４−クロロ−
３−スルホスチリル）−ビフェニル塩、２−（スチルフ
ェニル）ナフトチアゾール誘導体、４，４′−ビス（ト
リアゾール−２−イル）スチルベン誘導体、ビス（トリ
アジニルアミノ）スチルベンジスルホン酸などが、ハイ
ドロトロープとしては低級アルコール、多価アルコール
。 低級アリールスルホン酸またはその塩などが挙げられ、
これらの各成分はいずれもそれぞれ単独で用いてもよい
し、２種以上組合せてもよい。 見豆立羞果 本発明の洗浄剤組成物によれば、バチルス・エスピー７
株から生産される新規なアルカリプロテアーゼを用い、
さらにカルシウムイオンに対するキレート生成定数が６
以上のキレートビルダーとカルシウムイオンとを特定の
割合で存在させることにより、十分な洗浄力向上効果が
発揮され、しかも優れた液安定性および保存時における
酵素安定性が得られる。 次に、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。 各実施例における評価は、以下の試験方法に従って行な
った。 ・夜止左 ＵＳ、　Ｔｅｓｔｉｎｇ社のＴｅｒｇ−０−Ｔｏａｓｔ
ｅｒを洗浄装置として使用し、これにタンパク質配合湿
式人工汚垢布１０枚とセバム布、清浄メリヤス布を入れ
浴比３０倍に合わせ、１２０ｒ、ｐ、腸で２５℃１０分
間洗浄する。洗浄液は、所定の洗浄濃度のもの９００ｍ
　Ｑを用い、すすぎは９００ｒａ　Ｑの水で３分間行な
う。 使用水は３°ＤＨのものを用いた。洗浄力は次式で算出
する。 なお、本洗浄力試験法は、油化学３０，４３２（１９８
１）ｒ新しい人工汚垢に関する研究（第１報）」に準す
る。 ・籠ｌ五作反髪主 供試洗浄剤組成物１００諷Ωを広口ビンに入れ、所定温
度に所定時間保存したのち酵素活性を測定し、保存前の
酵素活性に対する度合を１００分率で表わした。なお、
酵素活性の測定は、朝食書店発行「酵素研究法２」（赤
堀四籟編）第２３８ページ以下に記載のＣａ５ｅｉｎ−
２７５＋ｓμ吸収Ａ法に準じて行なった。 辰支定血 供試洗浄剤組成物１００ｇを広口ビンに入れ、４５℃で
１ケ月保存したのち、外観の状態を目視で観察した。 ０：均一透明 ×：沈殿物あり 実施例 後記第９表に示す組成の液体洗浄剤組成物を調製し、そ
の性能を評価した。 （以下余白）

【図面の簡単な説明】

第１図はＹａ酵素およびＹｂ酵素の精製段階を示すフロ
ーシートである。 第２図はＹ酵素のＤＥＡＥ−５３セルロースのアニオン
交換クロマトグラフィーにかけた際の溶出曲線を示すグ
ラフである。 第３図はＹａ酵素の至適ｐＨおよび安定ｐＨ領域を、第
４図はＹｂ酵素の至適ｐＨおよび安定ＰＨ領領域示すグ
ラフである。 第５図はＹａ酵素の至適温度および耐熱性を、第６図は
Ｙｂ酵素の至適温度および耐熱性を示すグラフである。 第７図はＹａ酵素の紫外線吸収スペクトル曲線を、第８
図はｙｂ酵素の紫外線吸収スペクトル曲線を示すグラフ
である。 第９図はＹａ酵素およびＹｂ酵素の分子量決定の際の検
量線を示すグラフである。 第１０図はＹａ酵素の、第１１図はＹｂｕ素のそれぞｉ
等電点電気泳動模様を示すグラフである。 第１２図はＹａ酵素の、第１３図はｙｂ酵素のそれぞれ
ゲル濾過クロマトグラフィー溶出曲線を示すグラフであ
る。 第１４図はＹａ酵素の高速液体クロマトグラフ第１図 〔微生物培ｇＩ液〕 ↓ ｊ■工１ ↓ 〔上清〕 ′１ ↓ 〔Ｙ租酵素〕 土 ↓ 〔精製ｙｂ酵素　〕 第４Ａ図 第４Ｂ図 Ｈ 第５Ａ図　　　　　第６Ａ図 第１０図 第１１図 分画番号 第１２図 分画番号 第１４図 お出時間（分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（Ａ）バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
   ｐ．）Ｙ株（微工研条寄第１０２９号）から生産される
   アルカリプロテアーゼ （Ｂ）カルシウムイオンに対するキレート生成定数が６
   以上のキレートビルダーおよび （Ｃ）カルシウムイオン を含有し、上記（Ｂ）成分／（Ｃ）成分のモル比が０．
   ９以上であるすることを特徴とするアルカリプロテアー
   ゼ含有洗浄剤組成物。