MXPA06010403A - Enzimas lipoliticas fungicas - Google Patents

Abstract

Una enzima lipolítica fúngica de tipo silvestre que tiene una proporción de actividad sobre los lípidos polares mayor en comparación con los triglicéridos, en donde preferiblemente la enzima tiene una proporción de actividad de fosfolípido:triglicérido de por lo menos 4;preferentemente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención tiene una proporción de actividad hidrolizante de glicolípido:triglicérido de por lo menos 1.5;en una modalidad, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:4 o la SEQ ID NO:6, o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90%de identidad con estas;la presente invención también abarca unácido nucleico que codifica una enzima lipolítica fúngica, dichoácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de:(a) unácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7, (b) unácido nucleico que estáemparentado con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7 por la degeneración del código genético;y (c) unácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 90%de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7.

Description

ENZIMAS LIPOLITICAS FUNGICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a enzimas (¡políticas fúngicas novedosas y a uno o más polinucleótidos que codifican una o más enzimas lipolíticas fúngicas novedosas. La ¡nvención también se refiere a métodos para producir enzimas lipolíticas fúngicas y los usos de las mismas. Además, la presente invención se refiere a la preparación de un producto alimenticio mejorado, en particular a la preparación de productos de panadería mejorados. Específicamente, la invención provee enzimas lipolíticas fúngicas novedosas; estas enzimas son capaces de conferir características mejoradas a productos alimenticios que ¡ncluyen productos de panadería.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Desde hace muchos años se conoce el uso benéfico de las enzimas lipolíticas (EC.3.1.1.x) en aplicaciones industriales de alimentos o forrajes. Por ejemplo, en EP 0 585 988, se reclama que la adición de lipasa al amasijo mejora el efecto contra la rancidez. Se sugiere que la lipasa obtenida de Rhizopus arrhizus, cuando se agrega al amasijo, puede mejorar la calidad del pan resultante cuando se usa en combinación con manteca vegetal/grasa. WO 94/04035 enseña que se puede obtener una suavidad mejorada del pan agregando al amasijo una lipasa, sin agregar al amasijo más grasa/aceite. Castello, P., ESEGP 89-10, diciembre de 1999, Helsinki, muestra que ias lipasas exógenas pueden modificar el volumen del pan. El substrato para las lipasas en la harina de trigo es 1.5-3% de lípidos endógenos de trigo, que son una mezcla compleja de lípidos polares y no polares. Los lípidos polares se pueden dividir en glicolípidos y fosfolípídos. Estos lípidos se forman de glicerol esterificado con dos ácidos grasos y un grupo polar. El grupo polar contribuye a la actividad de superficie de estos lípidos. El corte enzimático de uno de los ácidos grasos en estos lípidos produce lípidos con una actividad de superficie mucho mayor. Es bien conocido que los emulsionantes, tales como DATEM, con alta actividad de superficie, son muy funcionales cuando se agregan al amasijo. Las enzimas lipolíticas hidrolizan uno o más de los ácidos grasos de los lípidos presentes en el alimento, lo que puede resultar en la formación de poderosas moléculas emulsionantes dentro del producto alimenticio que proveen una funcionalidad comercialmente valiosa. Las moléculas que contribuyen a las características emulsionantes más significativas son los productos de la hidrólisis parcial, tales como las moléculas de lisofosfolípidos, lisoglicolípidos y monoglicérido. Son particularmente ventajosos los productos polares de hidrólisis de lípido, tales como lisofosfolípidos y lisoglicolípidos. En la elaboración dei pan, tales emulsionantes derivados in situ pueden dar una funcionalidad equivalente como emulsionantes añadidos, tales como DATEM.

Sin embargo, también se ha encontrado que la actividad de las enzimas lipolíticas produce la acumulación de ácidos grasos libres que puede llevar a una funcionalidad perjudicial en el producto alimenticio. Esta actividad inherente de las enzimas lipolíticas limita su funcionalidad. El efecto negativo sobre el volumen del pan frecuentemente se explica por sobredosificación. La sobredosificación puede reducir la elasticidad del gluten, lo que resulta en un amasijo que es demasiado rígido y por lo tanto resulta en volúmenes reducidos. Además, o alternativamente, tales lipasas pueden degradar la manteca vegetal, el aceite o la grasa de leche agregada al amasijo, dando como resultado la pérdida del sabor del amasijo y el producto horneado. La sobredosificación y la pérdida de sabor se han atribuido a la acumulación de ácidos grasos libres en el amasijo, particularmente ácidos grasos de cadena corta. La presencia de cantidades altas de ácidos grasos libres (FFA) en materias primas o productos de alimento, generalmente es reconocida como un defecto de calidad, y usualmente los procesadores de alimentos y los clientes incluirán en las especificaciones de los alimentos una cantidad máxima de FFA. Los efectos resultantes de las cantidades excesivas de FFA pueden ser defectos organolépticos o funcionales. En EP 1 193 314 los inventores descubrieron que el uso de enzimas lipolíticas activas sobre los glicolípidos era particularmente benéfico en aplicaciones de preparación de pan, ya que se encontró que los productos de la hidrólisis parcial de los lisoglicolípidos tenían una funcionalidad emulsionante muy alta, aparentemente dando como resultado una proporción más alta de funcionalidad emulsionante positiva en comparación con la acumulación perjudicial de los ácidos grasos libres. Sin embargo, también se encontró que las enzimas tienen actividad no selectiva significativa sobre los triglicéridos, lo que dio como resultado un ácido graso libre innecesariamente alto. Este problema de actividad alta de triglicérido fue manejado en WO 02/094123, en donde los inventores descubrieron que seleccionando enzimas lipolíticas que eran activas sobre los lípidos polares (glicolípidos y fosfolípidos) en un amasijo, pero sustancialmente inactivas sobre triglicéridos o 1-mono-glicéridos, se podía obtener una mejor funcionalidad. Una fuente comercialmente preferida de enzimas lipasas es la de los hongos filamentosos como Aspergillus spp. y Fusarium spp. Se ha encontrado que las lipasas aisladas de hongos filamentosos tienen características industrialmente aplicables, y también se ha encontrado que se expresan rutinariamente en sistemas de producción heterólogos tales como Aspergillus oryzae, Fusarium y levadura. Una lipasa de Fusarium oxysporum fue identificada en EP 0 130 064, y Hoshino y otros, Biosci. Biotech. Biochem 56: 660-664 (1992), han sugerido el uso de lipasas de F. oxysporum en aplicaciones alimentarias. EP 0 869 167 describe la clonación y expresión de una lipasa de Fusarium oxysporum y su uso en la panadería. Se describe que la enzima tiene actividad de fosfolipasa. Actualmente esta enzima es vendida por Novozymes A/S (Dinamarca) como Lipopan F™. WO 02/00852 describe cinco enzimas lipasas y sus polinucleótidos codificadores, aislados de F. venenatum, F. sulphureum, A. berkeleyanum, F. culmorum y F. solani. Se describe que las cinco enzimas tienen actividad hidrolizante de triacilglicerol, y actividad de fosfolipasa y galactolipasa. Tres de las enzimas tienen actividad equivalente a la enzima de F. oxysporum enseñada en EP 0 869 167: F. venenatum, F. sulphureum, F. culmorum. Por lo tanto, es evidente que algunas lipasas de Fusarium, que incluyen la Lipopan F™, tienen una actividad secundaria sobre los lípidos polares, que incluyen fosfolípidos y glicolípidos. Aunque en EP 0 869 167 la lipasa de Fusarium oxysporum se describe como una fosfolipasa, tiene una actividad alta de lipasa. La enzima también tiene actividad de glicolipasa. Sin embargo, a pesar de su actividad significativa sobre los lípidos polares, la funcionalidad alcanzada con su uso es limitada debido a su actividad alta de lipasa (esto es, triglicérido). Nagao y otros (J. Biochem 116 (1994) 536-540) describen una lipasa de F. heterosporum; esta enzima funciona predominantemente como una lipasa (E.G. 3.1.1.3) para hidrolizar triglicéridos. Es muy diferente de las enzimas de acuerdo con la presente invención. Se han producido variantes de enzimas lipolíticas con sustituciones específicas de aminoácido y fusiones, algunas de las cuales tienen una mayor actividad sobre los lípidos polares en comparación con las enzimas originales de tipo silvestre. WO 01/39602 describe una de estas variantes, referida como SP979, que es una fusión de la lipasa de Thermomyces lanuginosus y la lipasa de Fusarium oxysporum descrita en EP 0 869 167. Se ha encontrado que esta variante tiene una proporción significativamente alta de actividad sobre fosfolípidos y glicolípidos en comparación con los triglicéridos. Sin embargo, antes de la presente ¡nvención no se habían enseñado enzimas lipolíticas fúngicas naturales, particularmente de Fusarium spp., que tuvieran una proporción alta de actividad sobre lípidos polares en comparación con los triglicéridos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a una enzima lipolítica fúngica que tiene una proporción mayor de actividad sobre los lípidos polares (fosfolípidos o glicolípidos), en comparación con los triglicéridos, en particular una proporción mayor de actividad sobre glicolípidos los en comparación con los triglicéridos. En un aspecto amplio adicional, la presente invención se refiere a una enzima lipolítica fúngica de tipo silvestre que tiene una proporción mayor de actividad sobre los lípidos polares (fosfolípidos o glicolípidos), en comparación con los triglicéridos, en particular una proporción mayor de actividad sobre los glicolípidos en comparación con los triglicéridos.

En aspecto amplio adicional, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica fúngica novedosa como la que se reclama en la presente. En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a un método de preparación de un producto alimenticio, preferiblemente un producto alimenticio basado en huevo; el método comprendiendo agregar una enzima lipolítica fúngica de la presente invención a uno más ingredientes de un producto alimenticio. La presente invención se refiere a un método de preparación de un amasijo, el método comprendiendo agregar una enzima lipolítica fúngica de la presente invención a uno o más ingredientes de amasijo y mezclar para formar el amasijo. Otro aspecto amplio de la presente invención se refiere a un método de preparación de un producto horneado de un amasijo, el método comprendiendo agregar una enzima lipolítica fúngica de la presente invención al amasijo. También se provee un método de preparación de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención, el método comprendiendo transformar una célula hospedera con un ácido nucleico recombinado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima lipolítica fúngica, la célula hospedera siendo capaz de expresar la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la enzima lipolítica fúngica; cultivar la célula hospedera transformada bajo las condiciones adecuadas para expresar el ácido nucleico; y cosechar la enzima lipolítica fúngica. En un aspecto amplio adicional, la invención provee una enzima lipolítica que retiene su actividad a temperatura baja, es decir, es una enzima lipolítica de baja temperatura. Los aspectos de la presente invención se presentan en las reivindicaciones y los comentarios que siguen. Otros aspectos de las secuencias de nucleótidos que se pueden usar en la presente invención incluyen: una construcción que comprende las secuencias de la presente invención; un vector que comprende las secuencias para usar en la presente invención; un plásmido que comprende las secuencias para usar en la presente ¡nvención; una célula transformada que comprende las secuencias para usar en la presente invención; un tejido transformado que comprende las secuencias para usar en la presente invención; un órgano transformado que comprende las secuencias para usar en la presente ¡nvención; un hospedero transformado que comprende las secuencias para usar en la presente invención; un organismo transformado que comprende las secuencias para usar en la presente invención. La presente ¡nvención también abarca métodos de expresión de la secuencia de nucleótidos para usar en la presente ¡nvención, tales como expresión en una célula hospedera; incluyendo métodos para transferir la misma. La presente ¡nvención también abarca métodos de aislamiento de la secuencia de nucleótidos, tales como aislamiento de una célula hospedera.

Otros aspectos de la secuencia de aminoácidos para usar en la presente ¡nvención incluyen: una construcción que codifica las secuencias de aminoácidos para usar en la presente invención; un vector que codifica las secuencias de aminoácidos para usar en la presente invención; un plásmido que codifica las secuencias de aminoácidos para usar en la presente invención; una célula transformada que expresa las secuencias de aminoácidos para usar en la presente invención; un tejido transformado que expresa las secuencias de aminoácidos para usar en la presente invención; un órgano transformado que expresa las secuencias de aminoácidos para usar en la presente invención; un hospedero transformado que expresa las secuencias de aminoácidos para usar en la presente ¡nvención; un organismo transformado que expresa las secuencias de aminoácidos para usar en la presente invención. La presente ¡nvención también abarca métodos de purificación de la secuencia de aminoácidos para usar en la presente invención, tales como expresión en una célula hospedera; incluyendo métodos para transferir la misma, y después purificar dicha secuencia. Para facilitar la referencia, estos y otros aspectos de la presente invención se exponen ahora bajo subtítulos apropiados. Sin embargo, las enseñanzas de cada sección no están limitadas necesariamente a cada sección particular.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente ¡nvención provee una enzima lipolítica fúngica de tipo silvestre que tiene una proporción mayor de actividad sobre lípidos polares en comparación con triglicéridos. En un aspecto, la presente invención provee una enzima lipolítica fúngica que comprende una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, o SEQ ID No. 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad con una de estas secuencias. En un aspecto adicional, la presente invención provee un ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica fúngica que comprende una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 o SEQ ID No. 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad con una de estas secuencias. La SEQ ID No. 1 se muestra en la figura 37, la SEQ ID No. 2 se muestra en la figura 38, la SEQ ID No. 4 se muestra en la figura 40, y la SEQ ID No. 6 se muestra en la figura 42. En un aspecto adicional, la presente invención provee un ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica fúngica, dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7; b) un ácido nucleico que está emparentado con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7 por la degeneración del código genético; y c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 90% de identidad con la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7. La SEQ ID No. 3 se muestra en la figura 39; la SEQ ID No. 5 se muestra en la figura 41; y la SEQ ID No. 7 se muestra en la figura 43. En otro aspecto, la presente invención provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un producto alimenticio, tal como por ejemplo un amasijo, un producto horneado, un huevo, un producto con huevo, un producto de pasta, un producto de queso, un producto de tortilla, un alimento para animales, un aceite vegetal o un aceite comestible. Ventajosamente, la adición de una enzima de la presente invención al producto alimenticio puede mejorar la emulsificación, con una menor acumulación de ácidos grasos libres. En un aspecto adicional, la presente invención provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un amasijo o un producto horneado, que comprende agregar dicha enzima lipolítica a un amasijo, y (opcionalmente) hornear el amasijo para hacer un producto horneado para uno o más de lo siguiente: reducir la pegajosidad del amasijo; mejorar maquinabilidad del amasijo; reducir la formación de burbujas durante el horneado del producto; mejorar el volumen o suavidad del pan; prolongar la duración en almacén del producto horneado o amasijo; mejorar el efecto contra la rancidez del producto horneado o amasijo; mejorar la estructura de migajón del producto horneado; reducir la heterogeneidad de poro del producto horneado; mejorar la homogeneidad de poro del producto horneado; reducir el tamaño medio de poro del producto horneado; aumentar el índice de gluten del amasijo; mejorar el sabor u olor del producto horneado; mejorar el color de la corteza del producto horneado. Ventajosamente, la enzima de acuerdo con la presente invención puede tener una actividad más alta que las enzimas lipolíticas convencionales a pH bajo, y por lo tanto son más adecuadas para usar en un medio de amasijo agrio que las enzimas lipolíticas convencionales. En otro aspecto de la presente invención se provee un método de preparación de un amasijo o un producto horneado, que comprende agregar una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención a un amasijo, y (opcionalmente) hornear el amasijo para hacer un producto horneado. En un aspecto adicional de la presente invención, se provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención en la fabricación de productos con huevo para mejorar la textura, reducir el tamaño medio de partícula, reducir la distribución media de partícula, mejorar la estabilidad frente ai calor, mejorar el rendimiento o la estabilidad en microondas. En otro aspecto de la presente invención, se provee un método de tratamiento de huevo o producto con huevo, dicho método comprende agregar una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención a un huevo o un producto con huevo. En otro aspecto de la invención, se provee un método de fabricación de una pasta, o un amasijo para pasta, o un producto de pasta, dicho método comprende agregar una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención a la pasta, amasijo para pasta o producto de pasta. En un aspecto de la presente invención, se provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención en la fabricación de una pasta o un producto de pasta, para obtener uno o más de lo siguiente: mejorar el color/amarillez, estabilizar las características del color, reducir el brillo, reducir el contenido de grasa, mejorar la textura y mordedura (masticabilidad), reducir la actividad de agua, reducir el rompimiento, aumentar la firmeza del núcleo y mejorar la retención de forma durante el procesamiento. En otro aspecto de la invención, se provee un método de fabricación de una tortilla o un amasijo de tortilla, dicho método comprende agregar una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención a la tortilla o amasijo de tortilla. Un aspecto adicional de la presente invención provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención en la fabricación de una tortilla o un amasijo de tortilla, para mejorar la enrollabilidad de una tortilla, aumentar la flexibilidad de una tortilla, mejorar las propiedades contra la rancidez de la tortilla o amasijo de tortilla, mejorar la suavidad o reducir la pérdida de sabor de la tortilla o amasijo de tortilla. La funcionalidad de la enzima lipolítica en la tortilla o pasta se puede mejorar combinándola con emulsionantes como DATEM. En otro aspecto de la invención, se provee un método de tratamiento de leche, leche de quesería, queso, o un producto de queso, dicho método comprende agregar una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención al queso o producto de queso. La presente invención también provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente ¡nvención en la fabricación de un queso o un producto de queso para obtener uno o más de: mejorar el sabor, la textura o la estabilidad, reducir el efecto de separación de aceite en el queso, o aumentar el rendimiento de la producción del queso. En otro aspecto de la invención, se provee un método de tratamiento de alimento para animales, dicho método comprende agregar una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención al alimento para animales. La presente invención también provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención en la fabricación de alimentos para animales para mejorar uno o más de: la utilización o eficiencia de conversión del forraje, la ganancia de peso corporal, la incorporación de nitrógeno digerible, el metabolismo de la materia seca, y el sabor aceptable. En un aspecto adicional de la presente invención, se provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención en un procedimiento de preparación de un lisofosfolípido, por ejemplo lisolecitina, por tratamiento de un fosfolípido (por ejemplo lecitina) con la enzima, para producir el producto de hidrólisis parcial, esto es, el lisofosfolípido. En otro aspecto de la presente invención se provee un procedimiento de preparación de un lisofosfolípido, por ejemplo lisolecitina, dicho procedimiento comprende tratar un fosfolípido (por ejemplo lecitina) con la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención. En un aspecto adicional de la presente invención, se provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención en un procedimiento de preparación de un lisoglicolípido (por ejemplo digalactosil monoglicérido (DGMG) o monogalactosil monoglicérido (MGMG)), por tratamiento de un glicolípido (por ejemplo digalactosil diglicérido (DGDG) o monogalactosil diglicérido (MGDG)) con la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención, para producir el producto de la hidrólisis parcial, esto es, el lisoglicolípido. En un aspecto más se provee un procedimiento de preparación de un lisoglicolípido (por ejemplo digalactosil monoglicérido (DGMG) o monogalactosil monoglicérido (MGMG)), que comprende tratar un glicolípido (por ejemplo digalactosil diglicérido (DGDG) o monogalactosil diglicérido (MGDG)) con una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención. La presente invención también provee un procedimiento de desgomado enzimático de aceites vegetales o comestibles, que comprende tratar el aceite vegetal o comestible con la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención, a fin de hidrolizar la mayor parte de los lípidos polares (por ejemplo fosfolípido glicolípido). Para evitar dudas, una persona con conocimientos medios en la materia conoce la metodología adecuada para efectuar el tratamiento enzimático de los aceites comestibles (por ejemplo, véase EP 0 869 167). Los métodos conocidos se pueden usar adecuadamente para realizar la presente invención, con la condición de que la enzima conocida sea reemplazada con la enzima de acuerdo con la presente invención. En un aspecto adicional, la presente invención provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un aceite vegetal o aceite comestible, para reducir la cantidad de fosfolípido en el aceite vegetal o aceite comestible, manteniendo al mismo tiempo el contenido de triglicérido del aceite, o previniendo o reduciendo la acumulación de ácidos grasos libres. En un aspecto más, la presente invención provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención en un procedimiento que comprende el tratamiento de un fosfolípido para hidrolizar los grupos acilo grasos. En otro aspecto, la presente invención provee el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención en un procedimiento para reducir el contenido de fosfolípido en un aceite comestible, que comprende tratar el aceite con la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención, para hidrolizar la mayor parte del fosfolípido y separar del aceite la fase acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizado. En un aspecto adicional, la invención provee una enzima lipolítica que retiene su actividad a temperatura baja, esto es, una enzima lipolítica de baja temperatura. Aspectos adicionales de la invención ¡ncluyen el uso de una enzima lipolítica de baja temperatura en los métodos y usos que aquí se describen, esto es, de la enzima lipolítica fúngica de la presente invención. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención tiene una proporción mayor de actividad sobre lípidos polares (por ejemplo glicolípidos o fosfolípidos) que sobre triglicéridos. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención tiene una proporción mayor de actividad sobre fosfolípidos que sobre triglicéridos. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención tiene una proporción mayor de actividad sobre glicolípidos que sobre triglicéridos. Convenientemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención puede tener una proporción mayor de actividad sobre glicolípidos y fosfolípidos que sobre triglicéridos. De preferencia, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención tiene una proporción mayor de actividad sobre digalactosil diglicérido (DGDG) que sobre triglicéridos. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención hidroliza DGDG o MGDG a DGMG o MGMG, respectivamente. El término "proporción de actividad mayor sobre lípidos polares", como se refiere aquí, significa que la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención tiene una proporción de actividad hidrolizante de lípido polar : triglicérido que es mayor en comparación con una enzima comercial Lipopan F™ (Novozymes A/S, Dinamarca). El término "lípidos polares", como se usa aquí, significa fosfolípidos o glicolípidos. Preferiblemente, el término "lípidos polaresS como se usa aquí, significa tanto fosfolípidos como glicolípidos. Los términos "proporción de actividad mayor sobre glicolípidos" y "proporción de actividad mayor sobre fosfolípidos", como se refieren aquí, significan que la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención tiene una proporción de actividad hidrolizante de glicolípido : triglicérido, o una proporción de actividad hidrolizante de fosfolípido : triglicérido, respectivamente, que es más alta que la proporción correspondiente obtenida con la enzima comercial Lipopan F™ (Novozymes A/S, Dinamarca). Preferiblemente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede tener una proporción de actividad hidrolizante de lípido polar : triglicérido de por lo menos 4. Convenientemente, la proporción de actividad hidrolizante de lípido polar : triglicérido puede ser mayor de 5. Convenientemente, la proporción de actividad hidrolizante de lípido polar : triglicérido puede ser mayor de 8, preferiblemente mayor de 9, de preferencia mayor de 10, muy preferiblemente mayor de 15. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención puede tener una proporción de actividad hidrolizante de fosfolípido : triglicérido de por lo menos 4. Convenientemente, la proporción de actividad hidrolizante de lípido polar : triglicérido puede ser mayor de 5. Convenientemente, la proporción de actividad hidrolizante de lípido polar : triglicérido puede ser mayor de 8, preferiblemente mayor de 9, de preferencia mayor de 10, muy preferiblemente mayor de 15. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención puede tener una proporción de actividad hidrolizante de glicolípido : triglicérido de por lo menos 1.5, preferiblemente por lo menos 1.8, preferiblemente por lo menos 2, preferiblemente por lo menos 3, de preferencia por lo menos 4. Convenientemente, la proporción de actividad hidrolizante de glicolípido : triglicérido puede ser mayor de 4. Convenientemente, la proporción de actividad hidrolizante de glicolípido : triglicérido puede ser mayor de 5. En un aspecto adicional, la presente invención provee una enzima lipolítica fúngica que tiene una proporción de actividad hidrolizante de lípido polar : triglicérido de por lo menos 4. Convenientemente, la proporción de actividad hidrolizante de lípido polar : triglicérido puede ser mayor de 5.

Convenientemente, la proporción de actividad hidrolizante de lípido polar: triglicérido puede ser mayor de 8, preferiblemente mayor de 9, de preferencia mayor de 10, muy preferiblemente mayor de 15. En otro aspecto, la presente invención provee una enzima lipolítica fúngica que tiene una proporción de actividad hidrolizante de fosfolípido: triglicérido de por lo menos 4. Convenientemente, la proporción de actividad hidrolizante de lípido polar: triglicérido puede ser mayor de 5. Convenientemente, la proporción de actividad hidrolizante de lípido polar : triglicérido puede ser mayor de 8, preferiblemente mayor de 9, de preferencia mayor de 10, muy preferiblemente mayor de 15. En un aspecto más, la presente invención provee una enzima lipolítica fúngica que tiene una proporción de actividad hidrolizante de glicolípido: triglicérido de por lo menos 1.5, preferiblemente por lo menos 1.8, preferiblemente por lo menos 2, preferiblemente por lo menos 3, preferiblemente por lo menos 4, preferiblemente mayor de 5, preferiblemente mayor de 10, preferiblemente mayor de 15. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente ¡nvención tiene por lo menos 1.5 veces más actividad contra lípidos polares (por ejemplo, actividad de fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4) o actividad de fosfolipasa Al (E.C. 3.1.1.32) o actividad de glicolipasa (E.C. 3.1.1.26)) que contra triglicérido (E.C. 3.1.1.3), de preferencia por lo menos 2 veces más, de preferencia por lo menos 3 veces más, de preferencia por lo menos 4 veces más.

Preferiblemente la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención tiene por lo menos 1.5 veces más actividad de glicolipasa (E.C. 3.1.1.26) que actividad de triglicérido lipasa (E.C. 3.1.1.3), de preferencia por lo menos 2 veces más, de preferencia por lo menos 3 veces más, de preferencia por lo menos 4 veces más. Preferiblemente, a la dosis que provee el volumen óptimo de pan usando la prueba de minihorneado que se detalla en el ejemplo 3, la proporción de hidrólisis de DGDG a triglicérido (TG) es de por lo menos 1.7%, preferiblemente por lo menos 1.8%, preferiblemente por lo menos 2%, preferiblemente por lo menos 3%, preferiblemente por lo menos 4%, preferiblemente por lo menos 5%, preferiblemente por lo menos 10%, preferiblemente por lo menos 20%, preferiblemente por lo menos 40%, preferiblemente por lo menos 50%. El término "actividad de glicolipasa", como se usa aquí, abarca la "actividad de galactolipasa". La actividad de glicolipasa, la actividad de fosfolipasa y la actividad de triacilglicérido lipasa de una enzima se pueden determinar usando las pruebas que se describen más abajo.

Determinación de la actividad de galactolipasa (prueba de actividad de glicolipasa): Substrato: Se disolvió 0.6% de digalactosildiglicérido (Sigma D 4651 ), 0.4% de Triton-X 100 (Sigma X-100) y 5 mM de CaCI2 en amortiguador HEPES 0.05M pH 7.

Procedimiento de la prueba: Se añadieron 400 µL de substrato a un tubo de Eppendorf de 1.5 mL y este se puso en un Eppendorf Thermomixer a 37°C durante 5 minutos. Al tiempo t= 0 min, se agregaron 50 µL de la solución de enzima. También se analizó un blanco con agua en lugar de enzima. La muestra se mezcló a 10*100 rpm en el Eppendorf Thermomixer a 37°C durante 10 minutos. Al tiempo t=10 min, el tubo de Eppendorf se puso en otro termomezclador a 99°C durante 10 minutos para detener la reacción. Se analizó el ácido graso libre en las muestras usando el equipo NEFA C de WAKO GmbH. Se calculó la actividad enzimática GLU a pH 7 como micromoles de ácido graso producidos por minuto bajo las condiciones de la prueba.

Determinación de la actividad de fosfolipasa (prueba de actividad de fosfolipasa): La actividad de fosfolipasa se midió usando dos métodos diferentes que dan resultados comparables. Cualquiera de estos métodos se puede usar para determinar la actividad de fosfolipasa de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente se usa la prueba PLU para determinar la actividad de fosfolipasa de cualquier enzima.

"Prueba PLU" para determinar la actividad de fosfolipasa Substrato: Se disolvió 0.6% de L-a fosfatidilcolina 95% Planta (Avanti #441601 ), 0.4% de Triton-X 100 (Sigma X-100) y 5 mM de CaCI2 en amortiguador HEPES 0.05M pH 7.

Procedimiento de la prueba: Se agregaron 400 µL de substrato a un tubo de Eppendorf de 1.5 mL y se puso en un Eppendorf Thermomixer a 37°C durante 5 minutos. Al tiempo t= 0 min, se agregaron 50 µL de la solución de enzima. También se analizó un blanco con agua en lugar de enzima. La muestra se mezcló a 10*100 rpm en el Eppendorf Thermomixer a 37°C durante 10 minutos. Al tiempo t=10 min, el tubo de Eppendorf se puso en otro termomezclador a 99°C durante 10 minutos para detener la reacción. Se analizó el ácido graso libre en las muestras usando el equipo NEFA C de WAKO GmbH. Se calculó la actividad enzimática PLU-7 a pH 7 como micromoles de ácido graso producidos por minuto bajo las condiciones de la prueba.

"Prueba TIPU" para determinar la actividad de fosfolipasa 1 TIPU (Unidad de Titulación de Fosfolipasa) se define como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de ácido graso libre por minuto a las condiciones de la prueba. Las fosfolipasas A1 y A2 catalizan ia conversión de lecitina en lisolecitina con la liberación del ácido graso libre de las posiciones 1 y 2, respectivamente. La actividad de fosfolipasa se puede determinar mediante la titulación continua de los ácidos grasos liberados de la lecitina durante la acción enzimática, puesto que el consumo de álcali es igual a la cantidad de ácido graso liberado.

Substrato: Se dispersó 4% de lecitina, 4% de Triton-X 100, y 6 mM de CaCI2: 12 g de lecitina en polvo (Lípidos polares Avanti #44160) y 12 g de Triton-X 100 (Merck 108643) en aproximadamente 200 ml de agua desmineralizada durante la agitación magnética. Se le agregaron 3.0 ml de CaCI2 0.6 M (Merck 1.02382). El volumen se ajustó a 300 mL con agua desmineralizada y la emulsión se homogeneizó usando un Ultra Thurax. El substrato se preparó nuevamente todos los días.

Procedimiento de prueba: Se preparó una solución de enzima para dar una pendiente en una curva de titulación de entre 0.06 y 0.18 ml/min agregando 300 µL de la enzima. Se incluyó una muestra de control de actividad conocida Las muestras se disolvieron en agua desmineralizada y se agitaron 15 min a 300 rpm. Se estabilizaron térmicamente 25.00 ml de substrato a 37.0°C durante 10-15 minutos antes de ajustar el pH a 7.0 con NaOH 0.05 M. Se agregaron 300 µL de solución de enzima al substrato y se hizo una titulación continua con NaOH 0.05 M usando un titulador pH-stato (Phm 290, Mettler Toledo). Se hicieron dos determinaciones de actividad en cada escala. Después de 8 minutos se detuvo la titulación y la pendiente de la curva de calibración se calculó de entre 5 y 7 minutos. El límite de detección es de 3 TIPU/ml de solución de enzima.

Cálculos: La actividad de fosfolipasa (TIPU/g enzima) se calculó de la siguiente manera: en donde: a es la pendiente de la curva de titulación entre 5 y 7 minutos de tiempo de reacción (ml/min) N es la normalidad del NaOH usado (mol/1) V-i es el volumen en el que se disolvió la enzima (ml) m es la cantidad de enzima agregada al V-¡ (g) V2 es el volumen de la solución de enzima agregado al substrato (ml) Determinación de la actividad de triacilglicérido lipasa: prueba basada en triglicérido (tributirina) como substrato (LIPU): La actividad de lipasa basada en tributirina se mide de acuerdo con "Food Chemical Codex", cuarta edición, National Academy Press, 1996, p. 803, con las modificaciones de que la muestra se disuelve en agua desionizada en lugar de amortiguador de glicina, y el punto de ajuste del pH-stato es de 5.5 en lugar de 7. 1 LIPU se define como la cantidad de enzima que puede liberar 1 mol de ácido butírico por minuto bajo las condiciones de la prueba. Basándose en las pruebas de la actividad sobre galactolípido (GLU), fosfolípido (PLU) y triglicérido (LIPU), es posible calcular las proporciones PLU/LIPU y GLU/LIPU. El análisis de Lipopan F™ y una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención, derivada de Fusarium heterosporum (muestra 209; véase el ejemplo 3), dio los siguientes resultados. Las proporciones de actividad relativa para Lipopan F™ y la muestra 209 son: Lipopan F Muestra 209 Fosfolípido/triglicérido PLU/LIPU 3 9 Galactolípido/triglicérido GLU/LIPU 1 4 Convenientemente, los términos "sinergia" o "efecto sinérgico", como se usan aquí, significan que la combinación produce un mejor efecto que cuando se usa cada componente separadamente (esto es, cada enzima).

La sinergia se puede determinar haciendo un producto, por ejemplo un amasijo o un producto horneado, con la adición de cada componente (esto es, cada enzima), separadamente y en combinación, y comparando los efectos. El término "enzima lipolítica fúngica", como se usa aquí, significa que la fuente natural de la enzima es un hongo. Sin embargo, para evitar las dudas, este término puede incluir una enzima fúngica aislada de un hongo, una enzima que se expresa en un hongo hospedero (ya sea el hongo nativo o no nativo), o una que se expresa en un hospedero que no es hongo (por ejemplo en una bacteria o levadura). Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención es una enzima de tipo silvestre.

Los términos "natural" y "tipo silvestre", como se usan aquí, significan una enzima que ocurre naturalmente. Es decir, una enzima expresada del código genético endógeno y aislada de su organismo hospedero endógeno, o una enzima producida heterólogamente que no ha sido mutada (esto es, no contiene supresiones, adiciones, ni sustituciones de aminoácidos), en comparación con la secuencia de la proteína madura producida endógenamente (después de los eventos de corte concurrentes con la traducción y posteriores a la misma). Las proteínas naturales y de tipo silvestre de la presente invención pueden ser codificadas por polinucleótidos de codón optimizado para expresión heteróloga, y también pueden comprender un péptido de señal no endógeno seleccionado para la expresión en ese hospedero. El término "péptido de señal no endógeno", como se usa aquí, significa un péptido de señal no presente naturalmente en la cadena de polipéptido naciente de la enzima lipolítica antes del corte concurrente con la traducción. En la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención, una parte o todo el péptido de señal no endógeno, por ejemplo un propéptido, puede permanecer unido al polipéptido maduro -este es abarcado por el término de "tipo silvestre" como se usa aquí. Como se mencionó arriba, los términos "natural" y "tipo silvestre", como se usan aquí, significan una enzima natural. Sin embargo, esto no excluye el uso de un polipéptido sintético o sintetizado químicamente comprendido de la misma secuencia de polipéptido que la enzima lipolítica madura natural. El término "variante", como se usa aquí, significa una proteína expresada de un código genético no endógeno, que produce una o más alteraciones de aminoácidos (esto es, supresiones, adiciones o sustituciones de aminoácidos), en comparación con la secuencia natural o de tipo silvestre en la secuencia de proteína madura.

Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención es una enzima lipolítica que retiene su actividad a temperatura baja, esto es, es una enzima lipolítica de baja temperatura. El término "una enzima lipolítica de baja temperatura" significa una enzima que tiene una actividad significativa a 5-15°C, preferiblemente una enzima que tiene una actividad significativa a 10°C. En una modalidad, la enzima lipolítica de baja temperatura de acuerdo con la presente invención no es una enzima lipolítica que comprenda la secuencia de aminoácidos del motivo GDSX que se describe en WO 2004/064987, en donde X es uno o más de los siguientes residuos de aminoácido: L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o S. Una enzima lipolítica de baja temperatura de acuerdo con la presente invención puede ser una enzima que tiene una actividad relativa de por lo menos 5%, preferiblemente por lo menos 7%, de preferencia por lo menos 10%, sobre un substrato de lecitina 10°C, a un pH dentro del 20% del pH óptimo de la enzima lipolítica, determinada mediante el análisis de ácidos grasos libres por el método NEFA C (véase el ejemplo 5, realizado a pH 7). El ejemplo 6 provee un método para determinar el pH óptimo para una enzima lipolítica. Una enzima lipolítica de baja temperatura de acuerdo con la presente invención puede ser una enzima que tiene una actividad relativa de por lo menos 10%, preferiblemente por lo menos 15%, preferiblemente por lo menos 20%, preferiblemente por lo menos 25%, y muy de preferencia por lo menos 30% sobre un substrato de lecitina 20°C, a un pH dentro del 20% del pH óptimo de la enzima lipolítica, determinada mediante el análisis de ácidos grasos libres por el método NEFA C (véase el ejemplo 5, realizado a pH 7). El ejemplo 6 provee un método para determinar el pH óptimo para una enzima lipolítica. Una enzima lipolítica de baja temperatura de acuerdo con la presente invención, también puede mostrar una actividad significativa sobre la lecitina de yema de huevo a 5°C, caracterizada porque es capaz de liberar por lo menos 1%, preferiblemente por lo menos 1.5%, de preferencia por lo menos 2% de ácido graso libre después de un tiempo de reacción de 480 minutos a una dosis de enzima equivalente a 20 U/g de yema de huevo, usando la prueba que se describe en el ejemplo 9 y se ilustra en las figuras 24 y 25. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención puede ser obtenible (y preferiblemente se obtiene) de un hongo filamentoso. De preferencia, la enzima lipolítica fúngica es obtenible (y preferiblemente se obtiene) de Fusarium spp. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención puede ser obtenible (y preferiblemente se obtiene) de Fusarium heterosporum o Fusarium semitectum. Convenientemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención puede ser obtenible (y preferiblemente se obtiene) de Fusarium heterosporum (CBS 782.83) o Fusarium semitectum (IBT 9507). Así, en un aspecto, preferiblemente la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención es una enzima lipolítica de hongo filamentoso, preferiblemente una enzima lipolítica de tipo silvestre de hongo filamentoso. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90%, preferiblemente por lo menos 95%, preferiblemente por lo menos 98%, de preferencia por lo menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 o SEQ ID No.6. Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención, comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 90%, preferiblemente por lo menos 95%, preferiblemente por lo menos 98%, de preferencia por lo menos 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 7. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención no es una proteína de fusión que comprenda una secuencia de aminoácidos de una proteína de Thermomyces, ni parte de la misma, fusionada con una secuencia de aminoácidos de una proteína de Fusarium o parte de la misma. En particular, preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención no es una proteína de fusión que comprenda una secuencia de aminoácidos de una proteína de Thermomyces lanuginosa, ni parte de la misma, fusionada con una secuencia de aminoácidos de una proteína de Fusarium oxysporum o parte de la misma.

Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención no se obtiene de Thermomyces lanuginosa, y no es una variante de una enzima obtenida de Thermomyces lanuginosa. Preferiblemente, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención se aisla de un caldo de fermentación de Fusarium heterosporum CBS 782.83 o Fusarium semitectum (IBT 9507). Convenientemente, la enzima se puede purificar mediante cromatografía de líquidos. La secuencia de aminoácidos de la enzima lipoiítica fúngica pura se puede determinar mediante degradación de Edman y análisis de MALDI-TOF. Se probó una enzima lipolítica parcialmente purificada de Fusarium heterosporum CBS 782.83 en pruebas de horneado a escala miniatura y en pruebas de horneado a escala piloto, con resultados muy buenos. Los efectos sobre el horneado de la enzima lipolítica de F. heterosporum CBS 782.83 fueron superiores a los de Lipopan F™, y esto se correlacionó con una proporción de actividad mayor sobre los lípidos polares, en particular sobre los glicolípidos como digalactosi! diglicérido (DGDG), en comparación con los triglicéridos. Adicionalmente, se probó la actividad de una enzima lipolítica de Fusarium semitectum IBT sobre los lípidos de la harina en una suspensión de amasijo, con resultados muy buenos.

Se mostró que la enzima lipolítica de F. semitectum IBT 9507 tiene una actividad significativa sobre los galactolípidos en un amasijo, y relativamente menos actividad sobre los triglicéridos, en comparación con Lipopan F™. Convenientemente, el término "producto alimenticio", como se usa aquí, significa una sustancia que es adecuada para el consumo humano o animal. Convenientemente, el término "producto alimenticio", como se usa aquí, puede significar un producto alimenticio en una forma lista para su consumo. Sin embargo, alternativamente o adicionalmente, el término producto alimenticio, como se usa aquí, puede significar uno o más materiales de alimento que se usan en la preparación de un producto alimenticio. A manera de ejemplo solamente, el término producto alimenticio abarca productos horneados producidos de amasijos, así como también el amasijo usado en la preparación de dichos productos horneados. En un aspecto preferido, la presente invención provee un producto alimenticio como se define arriba, en donde el producto alimenticio se selecciona de uno o más de los siguientes: huevos, productos con huevo que incluyen sin limitación mayonesa, aderezos para ensalada, salsas, helados, polvo de huevo, yema de huevo modificada y productos hechos de la misma; productos horneados que incluyen panes, bizcochos, productos de amasijo dulces, amasijos laminados, batidos líquidos, panecillos, donas, bísquets y galletas; confitería que incluye chocolate, dulces, caramelos, halawa, gomas, incluyendo gomas azucaradas y sin azúcar, chicle de bomba, chicle de bomba suave, goma de mascar y pudines; productos congelados que incluyen sorbetes, preferiblemente productos lácteos congelados que incluyen helado y leche helada; productos lácteos que incluyen queso, mantequilla, leche, crema para café, crema batida, crema de flan, bebidas lácteas y yogurt; mus, cremas vegetales batidas; aceites y grasas comestibles, productos batidos aireados y no aireados, emulsiones aceite en agua, emulsiones agua en aceite, margarina, manteca vegetal y productos para extender que incluyen productos untables bajos en grasa y muy bajos en grasa; aderezos, mayonesa, dips, salsas de crema, sopas de crema, bebidas, emulsiones de especias y salsas. En un aspecto, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención puede ser un producto de amasijo o un producto horneado, tal como un pan, un producto frito, un bocadillo, bizcochos, pays, galletas, pastas, pastas instantáneas, tortillas, productos para bocadillo como galletitas, galletas de harina de trigo entero, biscochos, chips de papa y pastas. En otro aspecto, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención puede ser un alimento para animales. En un aspecto preferible, el producto alimenticio se selecciona de uno o más de los siguientes: huevos, productos con huevo que incluyen mayonesa, aderezos para ensalada, salsas, helado, polvo de huevo, yema de huevo modificada y productos hechos de la misma.

En algunas aplicaciones mencionadas en la presente, particularmente en las aplicaciones alimentarias, tales como las aplicaciones de panadería, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención se puede usar con uno o más emulsionantes convencionales que incluyen, por ejemplo, monoglicéridos, esteres de ácido diacetiltartárico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos, estearoil lactilato de sodio (SSL) y lecitinas. La enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención es especialmente preferida en recetas de pan con grasa añadida; se considera que esto se debe a la baja actividad de la enzima lipolítica de la invención sobre los triglicéridos, lo que produce menor acumulación de ácidos grasos libres y, con respecto a los triglicéridos de cadena corta, menor pérdida de olor o anulación de dicha pérdida. En el presente contexto, el término "grasa añadida" se usa para indicar que ningún lípido ni grasa se agrega al amasijo de harina. Además, o alternativamente, la enzima de acuerdo con la presente invención se puede usar con una o más de otras enzimas de grado alimenticio. De esta manera, dentro del alcance de la presente invención está que además de la enzima de la presente invención se puede agregar por lo menos una enzima adicional al producto horneado o al amasijo. Tales enzimas adicionales incluyen enzimas de degradación de almidón tales como endo- o exoamilasas, pululanasas, enzimas desramificadoras, hemicelulasas que incluyen xilanasas, celulasas, oxidorreductasas, por ejemplo glucosa oxidasa, piranosa oxidasa, sulfihidrilo oxidasa o una carbohidrato oxidasa, por ejemplo una que oxide maltosa, por ejemplo hexosa oxidasa (HOX), lipasas, fosfolipasas, hexosa oxidasa, proteasas, y aciltransferasas (como las que se describen por ejemplo en WO 04/064987). Particularmente, se prefiere usar la enzima lipolítica de la invención en combinación con alfa amilasas para elaborar productos de alimento. En particular, la amilasa puede ser una amilasa no maltogénica, tal como un polipéptido que tiene actividad de exoamilasa no maltogénica, en particular actividad de glucano 1 ,4-alfa-maltotetrahidrolasa (EC 3.2. 1.60) (como se describe en WO 05/003339). Una amilasa no maltogénica adecuada está disponible comercialmente como Powersoft™ (disponible de Danisco A/S, Dinamarca). También se pueden usar amilasas maltogénicas tales como Novamyl™ (Novozymes A/S, Dinamarca). En una modalidad, la combinación de alfa-amilasas y la enzima lipolítica de la invención se puede usar en un amasijo, o en la producción de un producto horneado, tal como pan, bizcochos, donas, o roscas de pan. La combinación de alfa-amilasas y la enzima lipolítica de la invención también se consideran preferidas para usar en métodos de producción de tortillas, tales como las tortillas de trigo o de maíz. En otra modalidad preferida, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención se puede usar en combinación con una xilanasa para elaborar productos de alimento. GRINDAMYL™ y POWERBake 7000 son ejemplos de enzimas xilanasa disponible comercialmente de Danisco A/S. Otros ejemplos de enzimas xilanasas se pueden encontrar en WO 03/020923 Preferiblemente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención se puede usar en combinación con una xílanasa y una alfa-amilasa.

Convenientemente, la alfa-amilasa puede ser una alfa-amilasa maltogénica o no maltogénica (tales como GRINDAMYL™ o POWERSoft, disponibles comercialmente de Danisco A/S), o una combinación de las mismas. Preferiblemente, la enzima lipolítica de la invención también se puede usar en combinación con una enzima oxidante, tal como una enzima oxidante de maltosa (MOX), por ejemplo hexosa oxidasa (HOX). Se describen métodos adecuados en WO 03/099016. Las enzimas oxidantes de maltosa disponibles comercialmente, GRINDAMYL™ y SUREBake, están disponibles de Danisco A/S. Opcionalmente, se puede usar una alfa-amilasa, tal como una exoamilasa no maltogénica o una amilasa maltogénica, o una enzima oxidante de maltosa (MOX) en combinación con la enzima de acuerdo con la presente invención, en los métodos de preparación de un amasijo, un producto horneado, tortilla, bizcocho, pasta instantánea/bocadillo frito, o un producto lácteo como el queso. La enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención normalmente se incluye en el producto alimenticio u otra composición mediante los métodos conocidos. Tales métodos incluyen agregar la enzima lipolítica directamente al producto alimenticio o composición, agregar la enzima lipolítica en combinación con un estabilizador o vehículo, y agregar una mezcla que comprende la enzima lipolítica y un estabilizador o vehículo. Los estabilizadores adecuados para usar con la presente invención incluyen, sin limitación, sales inorgánicas (tales como NaCI, sulfato de amonio), sorbitol, emulsionantes y detergentes (tales como Tween 20, Tween 80, Panodan AB100 sin triglicéridos, éster de poliglicerol, monooleato de sorbitán), aceite (tales como aceite de nabo, aceite de semilla de girasol y aceite de soya), pectina, trehalosa y glicerol. Los vehículos adecuados para usar con la presente invención incluyen, sin limitación, almidón, trigo molido, harina de trigo, NaCI y citrato. El índice de gluten se puede medir por medio de un Glutomatic 2200 de Perten ¡nstruments (Suecia). Para medir el índice de gluten: inmediatamente después de esponjar se pueden pesar 15 g de amasijo y ponerlo en el Glutomatic, y se lava con 500 ml de solución de NaCI al 2% durante 10 min. El amasijo lavado se transfiere entonces a una centrífuga Gluten Index Centrifuge 2015 y las dos fracciones de gluten se pesan; se calcula el índice de gluten de acuerdo con la siguiente ecuación: índice de gluten = (peso del gluten remanente en el tamiz x 100) / peso total del gluten Preferiblemente, el índice de gluten del amasijo aumenta por lo menos 5% con respecto a un amasijo sin el polipéptido; el índice de gluten se puede determinar por medio del aparato Glutomatic 2200 anteriormente mencionado. Aspectos preferibles adicionales se presentan en las reivindicaciones anexas y en la descripción y ejemplos siguientes.

Ventajas Se ha encontrado sorprendente e inesperadamente que las enzimas lipolíticas fúngicas de acuerdo con la presente invención tienen una proporción de actividad sobre lípidos polares (fosfolípidos o glicolípidos) : triglicéridos, mucho mayor en comparación con las enzimas lipolíticas de hongos identificadas anteriormente (particularmente LipopanF™). Esto es particularmente sorprendente porque antes de la presente invención ninguna de las enzimas lipolíticas de hongos de tipo silvestre conocidas mostraron esta actividad. Aunque se habían investigado variantes de enzimas lipolíticas (esto es, enzimas que se habían expuesto a mutagénesis no natural o se habían alterado de alguna otra manera), no se había contemplado que una enzima natural de tipo silvestre de hongo pudiera tener estas características altamente beneficiosas. Se ha encontrado que las enzimas identificadas tienen una funcionalidad superior cuando se usan en aplicaciones de panadería. El uso de la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la invención mejora significativamente las propiedades del amasijo o los productos horneados, en comparación con otras enzimas lipolíticas de hongos, particularmente Lipopan F™. Ventajosamente, la enzima lipolítica que retiene actividad a temperatura baja, esto es, una enzima lipolítica de baja temperatura, puede ser adecuada para usar en aplicaciones de baja temperatura, eliminando así la necesidad de calentar el substrato. Esto puede ser una ventaja particular en aplicaciones tales como el tratamiento enzimático de la yema de huevo, desgomado enzimático de los aceites comestibles, y en el tratamiento de la leche o productos lácteos, por ejemplo en el tratamiento de leche de quesería antes de la fabricación del queso. Una ventaja adicional del uso de una enzima lipolítica de baja temperatura se puede encontrar en los productos alimenticios o alimentos para animales, en donde una retención significativa de actividad a temperaturas de operación bajas permite realizar el tratamiento enzimático con menor riesgo de contaminación microbiana, particularmente la bacteriana. Además, cuando la estabilidad de la enzima es mayor a temperaturas bajas, esto permite una dosificación eficiente de la enzima y una vida útil prolongada de la enzima en aplicaciones industriales.

Efectos técnicos Para productos horneados tales como pan, bísquets al vapor y pan blanco americano, por ejemplo, la adición de una enzima lipolítica de la presente invención puede producir uno o más de los siguientes efectos: mejorar el volumen y suavidad del pan, prolongar la duración en almacén del producto, un efecto contra la rancidez, mejorar la estructura de migajón, reducir la heterogeneidad de poro, reducir el tamaño medio de poro, aumentar el índice de gluten, mejorar el sabor u olor, y mejorar el color de la corteza. Ventajosamente, la enzima de acuerdo con la presente invención se puede usar para reemplazar los emulsionantes en los productos alimenticios tales como amasijo o productos horneados. La enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede tener sinergia con los emulsionantes como DATEM, SSL, CSL, monoglicérido, polisorbatos y Tween. Así, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención se puede usar en combinación con uno o más emulsionantes. Ventajosamente, el uso de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en combinación uno o más emulsionantes puede reducir la cantidad general de emulsionante usado, en comparación con la cantidad requerida cuando no se usa la enzima de acuerdo con la presente invención. La enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención también puede tener sinergia con los hidrocoloides, guar, xantano y pectina, y con enzimas oxidantes de maltosa, tales como hexosa oxidasa. Para donas, roscas de pan, pastelillos y panecillos, por ejemplo, el uso de una enzima lipolítica de la presente invención en combinación con una o más alfa-amilasas, alfa-amilasa maltogénica y alfa-amilasa no maltogénica, puede producir un efecto sinérgico. En bizcochos, pasteles esponjosos, tortas de almendra de palma, por ejemplo, el uso de una enzima lipolítica de la presente invención en combinación con uno o más hidrocoloides tales como guar, o uno o más emulsionantes tales como DATEM, puede producir un efecto sinérgico. En bísquets, por ejemplo, el uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente ¡nvención confiere mejores propiedades de enrollabilidad y manejo, particularmente cuando están fríos (enrollabilidad en frío). Ventajosamente, en la mayonesa y otros productos con huevo, por ejemplo, el uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede mejorar la textura, reducir el tamaño medio de partícula o reducir la distribución media de partícula, mejorar la estabilidad en el calor, mejorar el rendimiento o estabilidad en microondas. En bizcochos, el uso de la presente invención mejora ventajosamente la suavidad, el volumen, las propiedades de conservación y la duración en almacén. En sopas de pasta o productos de sopa de pasta, por ejemplo sopas de pasta instantáneas, la enzima lipolítica de la presente ¡nvención puede conferir una o más de las siguientes características: mejor color/amarillez, color más estable, menor brillantez, menor contenido de grasa, mejor textura y mordedura (masticabilídad), menor actividad de agua, menor rompimiento, mayor firmeza del núcleo, y mejor retención de forma durante el procesamiento. Preferiblemente, la enzima lipolítica de la presente invención se puede usar para reducir el contenido de grasa de una sopa de pasta o un producto de sopa de pasta, por ejemplo una sopa de pasta instantánea. En la tortilla, por ejemplo, el uso de la enzima de acuerdo con la presente invención puede producir una de las siguientes características: mejor enrollabilidad de la tortilla, por ejemplo aumentando la flexibilidad, mejores propiedades contra la rancidez, más suavidad, o menor pérdida de sabor. Ventajosamente, una mejor enrollabilidad o flexibilidad puede reducir la probabilidad de que la tortilla se parta cuando se enrolla. En el queso o productos de queso, por ejemplo, el uso de la enzima de acuerdo con la presente invención puede producir una de las siguientes características: mejor sabor, textura o estabilidad, menor efecto de separación de aceite del queso, o mayor rendimiento del queso. El término "efecto de separación de aceite", como se usa aquí, se refiere al aceite libre liberado cuando se funde el queso. La enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención se puede usar para producir queso de bajo contenido de grasa. Ventajosamente, la enzima de la presente invención puede estabilizar la grasa de la leche o puede mejorar el sabor. Una ventaja de la presente invención es que la enzima funciona (y en realidad tiene una alta funcionalidad) a temperatura baja. Esto puede tener varias ventajas dependiendo del uso que se le dé a la enzima. Por ejemplo, en ía fabricación de queso, esta funcionalidad puede reducir el riesgo de contaminación microbiana y crecimiento bacteriano durante el tratamiento enzimático. La razón de esto puede ser que el queso puede permanecer frío durante el tratamiento enzimático. Así, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede ser particularmente adecuada para madurar el queso a temperatura baja para mejorar el sabor. En alimentos para animales, por ejemplo, la enzima de acuerdo con la presente invención puede producir ventajosamente una de las siguientes características: mayor eficiencia de utilización/conversión del alimento en el animal, mayor ganancia de peso del animal, mejor digestibilidad del alimento, mejor incorporación de nitrógeno en el animal, por ejemplo del alimento, mejor metabolismo de la materia seca del alimento, y mejor aceptación del sabor del alimento. En el desgomado de un aceite comestible, tal como un aceite vegetal, la enzima lipolítica de la presente invención tiene una actividad alta a temperatura baja. Esto puede reducir ventajosamente el requerimiento de calentar el aceite antes o durante el tratamiento enzimático. Esto tiene el efecto ventajoso de reducir la cantidad de energía necesaria para realizar el tratamiento. La enzima de acuerdo con la presente invención puede mejorar selectivamente la reducción de fosfolípidos en comparación con triglicéridos. En un aceite comestible (tal como un aceite vegetal), la enzima de acuerdo con la presente ¡nvención puede tener una actividad hidrolítica reducida sobre triglicéridos en comparación con fosfolípidos. Esto puede originar que menos triglicérido sea hidrolizado (en comparación con una enzima fosfolipasa convencional), y menores pérdidas del aceite o menor acumulación de ácido graso libre en el aceite (en comparación con una enzima lipolítica/fosfolipasa convencional).

Usos La enzima de acuerdo con la presente invención tiene muchas aplicaciones. En particular, las enzimas lipolíticas fúngicas de acuerdo con la presente invención pueden ser útiles en la preparación de un producto alimenticio. Por ejemplo, las enzimas lipolíticas fúngicas de acuerdo con la presente invención pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de huevo o productos con huevo. Las fosfolipasas, particularmente la fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4), se han usado durante muchos años para el tratamiento de huevo o productos con huevo (véase US 4,034,124 y Dutihl y Groger, 1981 , J. Sci. Food Agrie. 32, 451-458, por ejemplo). La actividad de fosfolipasa durante el tratamiento del huevo o los productos con huevo origina la acumulación de lisolecitina polar, que puede actuar como un emulsionante. El tratamiento de huevo o productos con huevo con una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención, puede mejorar la estabilidad, la estabilidad térmica bajo tratamiento con calor, tal como pasteurización, y produce un espesamiento sustancial. Los productos con huevo pueden incluir, sin limitación, bizcochos, mayonesa, aderezos para ensalada, salsas, helados y similares. Las enzimas lipolíticas fúngicas de acuerdo con la presente invención son particularmente útiles en la preparación de productos horneados, tales como los preparados de un amasijo, que incluyen panes, bizcochos, productos de amasijo dulces, amasijos laminados, batidos líquidos, panecillos, donas, bísquets, y galletas. Las enzimas lipolíticas fúngicas de acuerdo con la presente invención también se pueden usar como aditivos mejoradores del pan; por ejemplo, composiciones de amasijo, aditivos de amasijo, acondicionadores de amasijo, premezclas y preparaciones similares, añadidas comúnmente a la harina o al amasijo durante los procesos de elaboración de pan u otros productos horneados, para mejorar las propiedades del pan o los productos horneados. Así, la presente invención también se refiere a una composición mejoradora de pan o a una composición mejoradora de amasijo, que comprende una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención; y también a un amasijo o producto horneado que comprende dicha composición mejoradora de pan o mejoradora de amasijo. La composición mejoradora de pan o la composición mejoradora de amasijo puede comprender, además de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención, otras sustancias usadas convencionalmente en la panadería para mejorar las propiedades del amasijo o los productos horneados. La composición mejoradora de pan o la composición mejoradora de amasijo puede comprender uno o más agentes de panadería convencionales, tales como uno o más de los siguientes constituyentes: polvo de leche, gluten, emulsionante, grasa granulada, oxidante, aminoácido, azúcar, sal, harina o almidón. Ejemplos de emulsionantes adecuados son: monoglicéridos, esteres de ácido diacetiltartárico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos, esteres de azúcar, estearoil lactilato de sodio (SSL) y lecitinas. La composición mejoradora de pan o amasijo también puede comprender otra enzima, tal como una o más de otras enzimas de grado alimenticio que incluyen enzimas de degradación de almidón tales como endo-o exoamilasas, pululanasas, enzimas desramificadoras, hemicelulasas que ¡ncluyen xilanasas, celulasas, oxidorreductasas, por ejemplo glucosa oxidasa, piranosa oxidasa, sulfihidrilo oxidasa o una carbohidrato oxidasa, por ejemplo una que oxida maltosa, por ejemplo hexosa oxidasa (HOX), lipasas, fosfolipasas, hexosa oxidasa, proteasas, y aciltransferasas (como las que se describen por ejemplo en WO 04/064987). El término "propiedades mejoradas", como se usa aquí, significa cualquier propiedad que puede ser mejorada por la acción de las enzimas lipolíticas fúngicas de la presente invención. En particular, el uso de una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención resulta en una o más de las siguientes características: mayor volumen del producto horneado; mejor estructura de migajón del producto horneado; propiedades contra la rancidez en el producto horneado; mayor fuerza, mayor estabilidad, menor pegajosidad, o mejor maquinabilidad del amasijo. Las propiedades evaluadas se evalúan por comparación con un amasijo o un producto horneado preparado sin la adición de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención. El término "producto horneado", como se usa aquí, incluye un producto preparado de un amasijo. Ejemplos de productos horneados (de tipo blanco, claro u oscuro) que pueden ser producidos ventajosamente por la presente invención, incluyen uno o más de los siguientes: pan (que incluye pan blanco, de harina integral y de centeno), normalmente en forma de hogazas o rollos o tostado, pan francés de tipo baguet, pan de pitta, tortillas, tacos, bizcochos, panqués, bísquets, pan crujiente, pasta, sopas de pasta y similares. El amasijo de acuerdo con la presente invención puede ser un amasijo fermentado o un amasijo que se va a someter a fermentación. El amasijo se puede fermentar de varias maneras, por ejemplo agregando bicarbonato de sodio o similares, o agregando un cultivo de levadura adecuada, tal como un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de pan). La presente ¡nvención también se refiere al uso de las enzimas lipolíticas fúngicas de acuerdo con la presente invención para producir un amasijo de pasta, preferiblemente preparada de harina de trigo duro o una harina de calidad comparable. Las enzimas lipolíticas fúngicas de acuerdo con la presente invención son adecuadas para usar en el desgomado enzimático de aceites vegetales o comestibles. En el procesamiento de aceite vegetal o comestible, dicho aceite se trata con una enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención a fin de hidrolizar la mayor parte de los lípidos polares (por ejemplo fosfolípidos o glicolípidos). Preferiblemente son hidrolizados los grupos acilo grasos de los lípidos polares. El proceso de desgomado normalmente reduce el contenido de lípidos polares en un aceite comestible, particularmente de fosfolípidos, debido a la hidrólisis de la mayor parte (esto es, más del 50%) del lípido polar, por ejemplo glicolípido o fosfolípido. Normalmente, la fase acuosa que contiene el lípido polar hidrolizado (por ejemplo fosfolípido o glicolípido) se separa del aceite. Convenientemente, el aceite comestible o vegetal inicialmente puede tener un contenido de fósforo de 50-250 ppm (pretratamiento con la enzima de acuerdo con la presente invención). Además, la presente invención está dirigida al uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención para el tratamiento de productos de queso. La enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención también es particularmente adecuada para usarla en la preparación de un alimento para animales. Como es del conocimiento del experto en la materia, el término "desgomado", como se usa aquí, significa la refinación de aceite por conversión de los fosfátidos (tales como lecitina, fosfolípidos y aceite absorbido) en fosfátidos hidratables. El aceite que se ha desgomado es más fluido y por lo tanto tiene mejores propiedades de manejo que el aceite que no ha sido desgomado. El cuadro siguiente es únicamente una guía general y provee una descripción general de la dosis que se puede requerir en diferentes aplicaciones de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención. El cuadro también da una guía de la dosis de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente ¡nvención cuando se usa en combinación, por ejemplo, con un emulsionante. Desde luego, como será evidente para el experto en la materia, se puede optimizar fácilmente la dosis, la temperatura de reacción y el tiempo de reacción para cualquier aplicación dada, usando experimentación rutinaria.

Forma aislada En un aspecto, preferiblemente la secuencia está en una forma aislada. El término "aislada" significa que la secuencia está por lo menos sustancialmente libre de por lo menos otro componente con el cual la secuencia está asociada naturalmente en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza.

Forma pura En un aspecto, preferiblemente la secuencia está en una forma pura. El término "pura" significa que la secuencia está en un estado relativamente puro -por ejemplo, por lo menos aproximadamente 90% puro, o por lo menos aproximadamente 95% puro, o por lo menos aproximadamente 98% puro.

Secuencia de nucleótidos El alcance de la presente invención abarca secuencias de nucleótidos que codifican enzimas que tienen las propiedades específicas definidas en la presente. El término "secuencia de nucleótidos", como se usa aquí, se refiere a una secuencia de oligonucleótido o una secuencia de polinucleótido, y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de la misma (por ejemplo porciones de la misma). La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico o sintético o recombinante, que puede ser de doble cadena o de una sola cadena que representa la cadena de sentido o de antisentido. El término "secuencia de nucleótidos" con respecto a la presente invención incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Preferiblemente significa ADN, de preferencia secuencia de ADNc codificadora. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótidos abarcada per se por la presente invención no incluye la secuencia de nucleótidos nativa de acuerdo con la presente invención cuando está en su entorno natural y cuando está unida a sus secuencias asociadas naturalmente, que también están en su entorno natural. Para facilidad de referencia, esta modalidad preferida se denominará la "secuencia de nucleótidos no nativa". A este respecto, el término "secuencia de nucleótidos nativa" significa una secuencia de nucleótidos completa que está en su entorno natural, y cuando está unida operativamente a un promotor completo con el cual se asocia naturalmente, dicho promotor también en su entorno natural. Sin embargo, la secuencia de aminoácidos abarcada por la presente invención se puede aislar o purificar después de su expresión de una secuencia de nucleótidos en su organismo nativo. Preferiblemente, sin embargo, la secuencia de aminoácidos abarcada por la presente invención puede ser expresada por una secuencia de nucleótidos en su organismo nativo, pero la secuencia de nucleótidos no está bajo el control del promotor con el que está asociado naturalmente dentro de ese organismo.

Preparación de la secuencia de nucleótidos Normalmente, la secuencia de nucleótidos abarcada por la presente invención se prepara usando técnicas de recombinación de ADN (esto es, ADN recombinado). Sin embargo, en una modalidad alternativa de la invención, la secuencia de nucleótidos se puede sintetizar, toda o en parte, usando métodos químicos muy conocidos (véase Caruthers MH y otros (1980), Nuc Acids Res Symp Ser 215-23; y Horn T y otros (1980), Nuc Acids Res Symp Ser, 225-232). Una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que tiene las propiedades específicas que aquí se definen, se puede identificar o aislar o purificar de cualquier célula u organismo que produzca dicha enzima. Son muy conocidos varios métodos para la identificación o aislamiento o purificación de las secuencias de nucleótidos. A manera de ejemplo, una vez que se ha identificado o aislado o purificado una secuencia adecuada, se pueden usar las técnicas de amplificación de PCR para preparar más de una secuencia. A manera de ejemplo, se puede construir un ADN genómico o una colección de ADNc usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la enzima. Si se conoce la secuencia de aminoácidos de la enzima, o una parte de la secuencia de aminoácidos, se pueden sintetizar sondas de oligonucleótido marcado y se usan para identificar clonas codificadoras de enzima de la colección genómica preparada del organismo. Alternativamente, se podría usar una sonda de oligonucleótido marcado que contiene secuencias homologas a otro gen de enzima conocido para identificar clonas codificadoras de enzima. En este último caso se usan condiciones de hibridación y lavado de severidad más baja. Alternativamente, se podrían identificar clonas codificadoras de enzima insertando fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformando bacterias negativas de enzima con la colección de ADN genómico resultante, y después sembrando las bacterias transformadas sobre placas de agar que contienen un substrato para la enzima (por ejemplo, maltosa para una enzima que produce glucosidasa (maltasa)), permitiendo así identificar las clonas que expresan la enzima. En una alternativa adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima se puede preparar sintéticamente por medio de los métodos estándares establecidos, por ejemplo el método de fosforamidita descrito por Beucage S. L. y otros (1981 ), Tetrahedron Letters 22, p. 1859-1869, o el método descrito por Matthes y otros (1984), EMBO J. 3, p. 801-805. En el método de fosforamidita se sintetizan oligonucleótidos, por ejemplo en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se aparean, se ligan y se clonan en los vectores apropiados. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen mixto, genómico y sintético, de origen mixto sintético y de ADNc, o de origen mixto genómico y de ADNc, preparada ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado), de acuerdo con las técnicas estándares. Cada fragmento ligado corresponde a varias partes de toda la secuencia de nucleótidos. La secuencia de ADN también se puede preparar por reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando iniciadores específicos, por ejemplo como se describe en US 4,683,202, o en Saiki R K y otros (Science (1988) 239, p. 487-491 ). Debido a la degeneración del código genético se pueden producir fácilmente secuencias de nucleótidos en las que se ha cambiado el uso de codón de triplete, para algunos o todos los aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos original, produciendo con ello una secuencia de nucleótidos con baja homología con respecto a la secuencia de nucleótidos original, pero que codifica la misma secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos original, o una variante de la misma. Por ejemplo, para la mayoría de los aminoácidos, la degeneración del código genético está en la tercera posición en el codón de triplete (posición de bamboleo) (como referencia véase Stryer, Lubert, "Biochemistry", tercera edición, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7); por lo tanto, una secuencia de nucleótidos en la que todos los codones de triplete se han "bamboleado" en la tercera posición, sería aproximadamente 66% idéntica a la secuencia de nucleótidos original. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos enmendada codificaría la misma secuencia primaria de aminoácidos que la secuencia de nucleótidos original, o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos que tenga un uso de codón de triplete alternativo en al menos un codón de triplete codificador de aminoácido, pero que codifique la misma secuencia de polipéptido codificada por la secuencia de nucleótidos original, o una variante de dicha secuencia de polipéptido. Además, organismos específicos normalmente tienen un sesgo en cuanto a los codones de triplete usados para codificar aminoácidos. Se tienen disponibles tablas de uso de codón preferido y se pueden emplear para preparar genes de codón óptimo. Las técnicas de optimización de codón se usan rutinariamente para optimizar la expresión de transgenes en un hospedero heterólogo Secuencias de aminoácidos El alcance de la presente invención también abarca secuencias de aminoácidos de enzimas que tienen las propiedades específicas aquí definidas. Como se usa aquí, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "polipéptido" o del término "proteína". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "péptído". En algunos casos, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "enzima". La secuencia de aminoácidos se puede preparar/aislar de una fuente adecuada, o se puede hacer sintéticamente, o se puede preparar usando técnicas de recombinación de ADN. La enzima abarcada por la presente invención se puede usar en conjunto con otras enzimas. Así, la presente invención también cubre una combinación de enzimas en donde la combinación comprende la enzima de la presente ¡nvención y otra enzima, que puede ser otra enzima de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, cuando se hace referencia a la secuencia de aminoácidos abarcada per se por el alcance de la presente invención, no es una enzima nativa. A este respecto, el término "enzima nativa" significa una enzima completa que está en su entorno nativo y que ha sido expresada por su secuencia de nucleótidos nativa.

Identidad / Homología La presente invención también abarca el uso de homólogos de cualquier secuencia de aminoácidos de una enzima o de cualquier secuencia de nucleótidos que codifique dicha enzima. Aquí, el término "homólogo" significa una entidad que tiene una cierta homología con las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos. Aquí, el término "homología" puede ser considerado igual que "identidad". Estos términos se usarán aquí intercambiablemente. En el presente contexto, se considera que una secuencia de aminoácidos homologa ¡ncluye una secuencia de aminoácidos que puede ser por lo menos 92% idéntica, de preferencia por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia. Normalmente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc., que la presente secuencia de aminoácidos. Aunque la homología también se puede considerar en cuanto a la similitud (esto es, residuos de aminoácido que tienen propiedades químicas / funciones similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en cuanto a identidad de secuencia. Preferiblemente, una secuencia de aminoácidos homologa de acuerdo con la presente invención es una que tiene por lo menos 90% de identidad, de preferencia por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad, sobre una región de por lo menos 30, preferiblemente 40, aminoácidos contiguos. En el presente contexto, se considera que una secuencia de nucleótidos homologa incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser por lo menos 92% idéntica, de preferencia por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de la presente invención (la presente secuencia). Normalmente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican los sitios activos, etc., que la presente secuencia. Aunque la homología también se puede considerar en en cuanto a la similitud (esto es, residuos de aminoácido que tienen propiedades químicas / funciones similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en en cuanto a la identidad de secuencia. Preferiblemente, una secuencia de nucleótidos homologa de acuerdo con la presente invención es una que tiene por lo menos 90% de identidad, de preferencia por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad, sobre una región de por lo menos 30, preferiblemente 40, de preferencia 60 nucleótidos contiguos. Para las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos, las comparaciones de homología se pueden hacer a simple vista o más usualmente con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas de computadora disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias. El % de homología se puede calcular sobre secuencias contiguas, esto es, una secuencia se alinea con la otra secuencia y se compara directamente cada aminoácido de una secuencia con el aminoácido correspondiente de la otra secuencia, un residuo a ia vez. Esto se denomina alineación "sin espacios". Normalmente, tales alineaciones sin espacios solo se realizan sobre un número relativamente pequeño de residuos. Aunque este es un método muy simple y consistente, no toma en consideración que por ejemplo, en un par de secuencias por lo demás idénticas, una inserción o supresión ocasionará que los siguientes residuos de aminoácido queden fuera de alineación, resultando así potencialmente en una reducción grande del % de homología cuando se realiza una alineación global. Consecuentemente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencia están diseñados para producir alineaciones óptimas que toman en consideración posibles inserciones y supresiones sin penalizar indebidamente la puntuación general de homología. Esto se logra insertando "espacios" en la alineación de secuencia para intentar maximizar la homología local.

Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de espacio" a cada espacio que ocurre en la alineación, de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencias con tan pocos espacios como sea posible -que reflejan mayor parentesco entre las dos secuencias comparadas- obtendrá una puntuación más alta que con muchos espacios. Normalmente se usan "costos de espacios afines" para cargar un costo relativamente alto por la existencia de un espacio y una penalización más pequeña para cada residuo subsiguiente en el espacio. Este es el sistema de puntuación de espacios usado más comúnmente. Desde luego, las penalizaciones de espacio altas producirán alineaciones óptimas con menos espacios. La mayoría de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones de espacios. Sin embargo, se prefieren usar los valores por omisión cuando se utiliza dicho software para comparaciones de secuencia. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsín Bestfit, la penalización de espacio por omisión para secuencias de aminoácidos es de -12 para un espacio y -4 para cada extensión. Por lo tanto, el cálculo de % de homología máximo requiere primeramente la producción de una alineación óptima, tomando en consideración las penalizaciones de espacio. Un programa de computadora adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux y otros, 1984, Nuc. Acids Research, 12, p. 387). Ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencias incluyen, sin limitación, el paquete BLAST (véase Ausubel y otros, 1999, "Short Protocols in Molecular Biology", 4a. edición, capítulo 18), FASTA (Altschul y otros, 1990, J. Mol. Biol., 403-410), y la serie GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsqueda fuera de línea y en línea (véase Ausubel y otros, 1999, "Short Protocols in Molecular Biology", p. 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas de las aplicaciones se prefiere usar el programa GCG Bestfit. También está disponible una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences, para comparar secuencias de proteína y nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett, 1999, 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett, 1999, 177(1): 187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov). Aunque el % de homología final se puede medir en en cuanto a la identidad, el proceso de alineación mismo normalmente no se basa en una comparación de pares de todo o nada. Mas bien, se usa generalmente una matriz de puntuación de similitud graduada, que asigna puntuaciones a cada comparación de par en par basándose en la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de dicha matriz usada comúnmente es la matriz BLOSUM62 -la matriz de omisión para la serie de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsín generalmente usan los valores por omisión públicos o una tabla de comparación de símbolo habitual, si se suministra (véase el manual del usuario para m.ayores detalles). Para algunas aplicaciones se prefieren utilizar los valores por omisión públicos para el paquete GCG o, en caso de otro software, la matriz de omisión como la BLOSUM62.

Alternativamente, el porcentaje de homología se puede calcular usando la característica de alineación múltiple en ADNSIS™ (Hitachi Software), basado en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244). Una vez que el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software normalmente hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico. Las secuencias también pueden tener supresiones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácido que producen un cambio silencioso y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Se pueden hacer sustituciones deliberadas de aminoácidos basándose en la similitud de las propiedades del aminoácido (tales como polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, o la naturaleza antipática de los residuos), y por lo tanto son útiles para agrupar los aminoácidos en grupos funcionales. Los aminoácidos se pueden agrupar en base solo a las propiedades de su cadena lateral. Sin embargo, es más útil incluir también datos de mutación. Los grupos de aminoácidos así derivados probablemente se han de conservar por razones estructurales. Estos grupos se pueden describir en forma de un diagrama de Venn (Livingstone CD. y Barton GJ. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl Biosci. 9: 745-756; Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation", J. Theor. Biol. 119; 205-218). Las sustituciones conservativas se pueden hacer, por ejemplo, de acuerdo con el siguiente cuadro, que describe un diagrama de Venn aceptado generalmente que agrupa los aminoácidos.

La presente invención también abarca la sustitución homologa que puede ocurrir (aquí se usan sustitución y reemplazo para indicar el intercambio de un residuo de aminoácido existente con un residuo alternativo), esto es, la sustitución de igual por igual, tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También puede ocurrir sustitución no homologa, esto es, de una clase de residuo a otra, o alternativamente que incluye la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (en adelante referida como Z), ácido diaminobutírico ornitina (en adelante referida como B), norleucina omitina (en adelante referida como O), pirilalanina, tienilalánina, naftilalanina y fenilglicina. También se pueden hacer reemplazos con aminoácidos no naturales. Las secuencias de aminoácidos variantes pueden ¡ncluir grupos espaciadores adecuados que se pueden insertar entre cualesquiera dos residuos de aminoácido de la secuencia, que incluyen grupos alquilo tales como metilo, etilo o propilo, además de los espaciadores de aminoácido tales como los residuos de glicina o ß-alanina. Una forma adicional de variación incluye la presencia de uno o más residuos de aminoácido en forma peptoide, que será entendida por los expertos en la materia. Para evitar cualquier duda, la "forma peptoide" se usa para referirse a residuos de aminoácido variantes en donde el grupo sustituyente del carbono a está sobre el átomo de nitrógeno del residuo en lugar del carbono a. Los procedimientos para preparar péptidos en la forma peptoide son conocidos; véase por ejemplo Simón RJ y otros, PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 , y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134. Las secuencias de nucleótidos para usar en la presente invención pueden incluir nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen varios tipos diferentes de modificación de oligonucleótidos. Estos ¡ncluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, o la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' o 5' de la molécula. Para los fines de la presente invención, se entiende que las secuencias de nucleótidos aquí descritas se pueden modificar con cualquier método disponible. Estas modificaciones se pueden hacer para incrementar la actividad in vivo o la vida útil de las secuencias de nucleótidos. La presente invención también abarca el uso de secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias aquí presentadas, o cualquier derivado o fragmento de las mismas. Si la secuencia es complementaria a un fragmento de las mismas, entonces esa secuencia se puede usar como una sonda para identificar secuencias codificadoras similares en otros organismos, etc. Los polinucleótidos que no son 100% homólogos a las secuencias de la presente invención pero que están dentro del alcance de la ¡nvención, se pueden obtener de varias maneras. Otras variantes de las secuencias aquí descritas se pueden obtener por ejemplo sondeando colecciones de ADN hechas de una gama de individuos, por ejemplo individuos de poblaciones diferentes. Además, se pueden obtener otros homólogos, y en general tales homólogos y sus fragmentos serán capaces de hibridarse selectivamente con las secuencias mostradas en el presente listado de secuencias. Tales secuencias se pueden obtener sondeando colecciones de ADNc hechas de colecciones de ADN genómico de otras especies de animales, y sondeando tales colecciones con sondas que comprenden una parte o toda una secuencia mostrada en el listado de secuencias anexo, bajo condiciones de severidad media a alta. Se aplican consideraciones similares para obtener homólogos de especies y variantes alélicas de las secuencias de polipéptido o nucleótido de la invención. También se pueden obtener variantes y homólogos de especie/cepa usando PCR degenerada que utiliza iniciadores diseñados para dirigir secuencias dentro de las variantes y homólogos, que codifican secuencias de aminoácidos conservadas dentro de las secuencias de la presente invención. Las secuencias conservadas se pueden predecir, por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos de varias variantes/homólogos. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar usando el software de computadora conocido. Por ejemplo, se utiliza ampliamente el programa GCG Wisconsin PileUp. Los iniciadores usados en PCR degenerada contendrán una o más posiciones degeneradas y se usarán en condiciones menos severas que para clonar secuencias con iniciadores de una secuencia con secuencias conocidas. Alternativamente, dichos polinucleótidos se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida al sitio de secuencias caracterizadas. Esto puede ser útil cuando por ejemplo se requieren cambios de codón de secuencia silenciosos, para optimizar las preferencias de codón para una célula hospedera particular en la que se expresan las secuencias de polinucleótido. Otros cambios de secuencia pueden ser convenientes para introducir sitios de reconocimiento de enzima de restricción, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Los polinucleótidos (secuencias de nucleótidos) de la invención se pueden usar para producir un iniciador, por ejemplo un iniciador de PCR, un iniciador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda marcada, por ejemplo con una marca de revelado, por medios convencionales utilizando marcas radioactivas o no radioactivas, o los polinucleótidos se pueden clonar en vectores. Dichos iniciadores, sondas y otros fragmentos serán de por lo menos 15, de preferencia por lo menos 20, de preferencia por lo menos 25, 30 o 40 nucleótidos de longitud, y también están abarcados por el término polinucleótidos de la ¡nvención como se usa aquí. Los polinucleótidos, tales como los polinucleótidos de ADN, y las sondas de acuerdo con la invención, se pueden producir recombinantemente, sintéticamente, o por cualquier medio disponible para el experto en la materia. También se pueden clonar mediante las técnicas estándares. En general, los iniciadores serán producidos por medios sintéticos, que incluyen una fabricación paso a paso de la secuencia deseada de ácido nucleico, un nucleótido a la vez. Las técnicas para realizar esto usando técnicas automáticas están fácilmente disponibles. Generalmente serán producidos polinucleótidos más grandes usando medios recombinantes, por ejemplo usando técnicas de clonación de PCR (reacción en cadena de polimerasa). Los iniciadores se pueden diseñar para contener sitios adecuados de reconocimiento de enzima de restricción, de modo que el ADN amplificado puede ser clonado en un vector de clonación adecuado.

Secuencias biológicamente activas Preferiblemente, las secuencias variantes, etc., son por lo menos tan biológicamente activas como las secuencias aquí presentadas. Como se usa aquí, el término "biológicamente activo" se refiere a una secuencia que tiene una función estructural similar (pero no necesariamente al mismo grado), o una función reguladora similar (pero no necesariamente al mismo grado), o una función bioquímica similar (pero no necesariamente al mismo grado), que la secuencia natural.

Hibridación La presente invención también abarca secuencias que son complementarias a las secuencias de ácido nucleico de la presente invención, o secuencias que son capaces de hibridar con las secuencias de la presente ¡nvención o con secuencias que son complementarias a las mismas. El término "hibridación", como se usa aquí, incluye "el proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria mediante apareamiento de bases", así como también el proceso de amplificación efectuado en las técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR). La presente invención también abarca el uso de secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias que son complementarias a las secuencias aquí presentadas, o cualquier derivado o fragmento de las mismas. El término "variante" también abarca secuencias que son complementarias a las secuencias que son capaces de hibridar con las secuencias de nucleótidos aquí presentadas. Preferiblemente, el término "variante" abarca secuencias que son complementarias a las secuencias que son capaces de hibridar, bajo condiciones severas (por ejemplo, 50°C y SSC 0.2x {SSC 1x = NaCI 0.15 M, Na3-citrato 0.015 M, pH 7.0}) con las secuencias de nucleótidos aquí presentadas. Muy preferiblemente, el término "variante" abarca secuencias que son complementarias a las secuencias que son capaces de hibridar, bajo condiciones muy severas (por ejemplo, 65°C y SSC 0.1x {SSC 1x = NaCI 0.15 M, Na3-citrato 0.015 M, pH 7.0}) con las secuencias de nucleótidos aquí presentadas. La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos de la presente invención (que incluyen secuencias complementarias a las que aquí se presentan). La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos de la presente invención (que incluyen secuencias complementarias a las que aquí se presentan). También se incluyen dentro del alcance de la presente invención las secuencias de polinucleótido que son capaces de hibridar bajo condiciones de severidad intermedia a máxima con las secuencias de nucleótidos aquí presentadas. En un aspecto preferido, la presente invención cubre secuencias de nucleótidos que pueden hibridar bajo condiciones severas (por ejemplo 50 °C y SSC 0.2x) con la secuencia de nucleótidos de la presente invención, o el complemento de la misma.

En un aspecto muy preferido, la presente invención cubre secuencias de nucleótidos que pueden hibridar bajo condiciones de alta severidad (por ejemplo 65 °C y SSC 0.1x) con la secuencia de nucleótidos de la presente invención, o el complemento de la misma.

Recombinación En un aspecto, la secuencia para usar en la presente invención es una secuencia recombinada -esto es, una secuencia que se ha preparado usando técnicas de recombinación de ADN. Estas técnicas de recombinación de ADN son del dominio del experto en la materia. Dichas técnicas se explican en la literatura, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Secuencias sintéticas En un aspecto, la secuencia para usar en la presente invención es una secuencia sintética -esto es, una secuencia que ha sido preparada in vitro por síntesis química o enzimática. Incluye, sin limitación, secuencias hechas con uso de codón óptimo para organismos hospederos -tales como las levaduras metilotróficas Pichia y Hansenula.

Expresión de enzimas La secuencia de nucleótidos para usar en la presente invención se puede incorporar en un vector duplicable recombinado. El vector se puede usar para duplicar y expresar la secuencia de nucleótidos, en forma de enzima, en una célula hospedera compatible. La expresión se puede controlar usando secuencias de control, por ejemplo, secuencias reguladoras. La enzima producida por una célula hospedera recombinante mediante la expresión de la secuencia de nucleótidos, puede ser secretada o puede estar contenida intracelularmente, dependiendo de la secuencia o el vector utilizado. Las secuencias codificadoras se pueden diseñar con secuencias de señal que dirijan la secreción de las secuencias codificadoras de sustancia a través de una membrana celular procariótica o eucariótica.

Vector de expresión El término "vector de expresión" significa una construcción capaz de expresarse in vivo o in vitro. Preferiblemente, el vector de expresión se incorpora en el genoma de un organismo hospedero adecuado. El término "incorpora" cubre preferiblemente la incorporación estable en el genoma. La secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar presente en un vector, en el que la secuencia de nucleótidos está enlazada operativamente con secuencias reguladoras capaces de expresar la secuencia de nucleótidos en un organismo hospedero adecuado. Los vectores para usar en la presente invención pueden ser transformados en una célula hospedera adecuada como se describe más abajo, para proveer la expresión de un polipéptido de la presente invención. La elección del vector, por ejemplo vector de plásmido, cósmido, o fago, muchas veces dependerá de la célula hospedera en la que se quiere introducir. Los vectores para usar en la presente invención pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, tales como un gen que confiere resistencia a un antibiótico, por ejemplo resistencia a la ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Alternativamente, la selección se puede realizar por medio de cotransformación (corno se describe en WO 91/17243). Los vectores se pueden usar in vitro, por ejemplo para producir ARN, o se pueden usar para transfectar, transformar, transducir o infectar una célula hospedera. De esta manera, en una modalidad adicional, la invención provee un método para hacer las secuencias de nucleótidos de la presente invención, introduciendo una secuencia de nucleótidos de la presente invención en un vector duplicable, introduciendo el vector en una célula hospedera compatible, y desarrollando la célula hospedera bajo condiciones que producen la duplicación del vector. El vector también puede comprender una secuencia de nucleótidos que permite que el vector se duplique en la célula hospedera en cuestión. Ejemplos de dichas secuencias son los orígenes de duplicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y plJ702.

Secuencias reguladoras En algunas aplicaciones, la secuencia de nucleótidos para usar en la presente invención se enlaza operativamente con una secuencia reguladora capaz de sustentar la expresión de la secuencia de nucleótidos, por ejemplo en la célula hospedera elegida. A manera de ejemplo, la presente invención cubre un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la presente invención, enlazada operativamente con dicha secuencia reguladora, es decir, el vector es un vector de expresión. El término "enlazado operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera que se pretende. Una secuencia reguladora "enlazada operativamente" con una secuencia codificadora está ligada de tal manera que se logra la expresión de la secuencia codificadora bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. El término "secuencias reguladoras" incluye promotores e incrementadores y otras señales de regulación de la expresión. El término "promotor" se usa en el sentido normal de la técnica, por ejemplo un sitio de unión de ARN polimerasa. También, la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de la presente invención se puede incrementar mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo regiones promotoras, de guía de secreción y terminadoras. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención está enlazada operativamente por lo menos con un promotor. Son muy conocidos los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos en un hospedero bacteriano, fúngico o de levadura.

Construcciones El término "construcción" -que es sinónimo de términos tales como "conjugado", "cásete" e "híbrido"- ¡ncluye una secuencia de nucleótidos para usar de acuerdo con la presente invención, unida directamente o indirectamente a un promotor. Un ejemplo de una unión indirecta es la provisión de un grupo espaciador adecuado, tal como una secuencia de intrón, tal como el intrón Sh1 o el intrón ADH, intermedio entre el promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Lo mismo es cierto para el término "fusionado" con respecto a la presente invención, que incluye unión directa o indirecta. En algunos casos, los términos no cubren la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína, asociada comúnmente con el promotor del gen de tipo silvestre, ni cuando están ambos en su entorno natural. La construcción puede incluso contener o expresar un marcador que permita la selección de la construcción genética. Para algunas aplicaciones, preferiblemente la construcción de la presente invención comprende por lo menos la secuencia de nucleótidos de la presente invención enlazada operativamente con un promotor.

Células hospederas El término "célula hospedera" -con respecto a la presente invención- incluye cualquier célula que comprende la secuencia de nucleótidos o un vector de expresión como se describen arriba, y que se usa en la producción recombinante de una enzima que tiene las propiedades específicas aquí definidas. De esta manera, una modalidad adicional de la presente invención provee células hospederas transformadas o transfectadas con una secuencia de nucleótidos que expresa la enzima de la presente invención. Se elegirán las células que sean compatibles con dicho vector y, por ejemplo, pueden ser procarióticas (por ejemplo células bacterianas), fúngicas, de levadura o de planta. Preferiblemente, las células hospederas no son células humanas. Ejemplos de organismos hospederos bacterianos adecuados son las especies de bacterias gram positivas o gram negativas. Dependiendo de la naturaleza de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de la presente invención, o de la conveniencia de más procesamiento de la proteína expresada, se pueden preferir hospederos eucarióticos tales como levaduras u otros hongos. En general, se prefieren las células de levadura sobre las células de hongo porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son secretadas muy poco por la célula de levadura, o en algunos casos no son procesadas apropiadamente (por ejemplo, la hiperglicosilación en la levadura). En estos casos, se debe seleccionar un organismo hospedero fúngico diferente. El uso de células hospederas adecuadas -tales como las células hospederas de levadura, hongo y planta- puede proveer modificaciones posteriores a la traducción (por ejemplo miristoilación, glicosilación, truncado, lapidación y fosforilación de tirosina, serina o treonina), según sea necesario para conferir una actividad biológica óptima en los productos de expresión recombinante de la presente invención. La célula hospedera puede ser de una cepa deficiente de proteasa o sin proteasa. El genotipo de la célula hospedera se puede modificar para mejorar la expresión. Los ejemplos de modificaciones de la célula hospedera incluyen deficiencia de proteasa, complementación de ARNt's raros, y modificación del potencial reductor en el citoplasma para aumentar la formación de enlaces disulfuro. Por ejemplo, la célula hospedera E. coli puede sobreexpresar ARNt's raros para mejorar la expresión de proteínas heterólogas como lo describe Kane (Curr. Opin. Biotechnol (1995), 6, 494-500 "Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E. col!'). La célula hospedera puede ser deficiente en varias enzimas reductoras, favoreciendo así la formación de enlaces disulfuro estables, como lo describe Bessette (Proc. Nati. Acad Sci. USA (1999), 96, 13703-13708, "Efficient folding of proteins with múltiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm").

Organismo El término "organismo", con respecto a la presente invención, incluye cualquier organismo que pueda comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de acuerdo con la presente invención, o los productos obtenidos de la misma, o en donde un promotor pueda permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente ¡nvención cuando está presente en el organismo. Los organismos adecuados pueden ¡ncluir un procariote, hongos, levaduras o una planta. El término "organismo transgénico", con respecto a la presente invención, ¡ncluye cualquier organismo que comprenda la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de acuerdo con la presente invención, o productos obtenidos de la misma, o en donde un promotor pueda permitir la expresión dentro del organismo de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos se incorpora en el genoma del organismo. El término "organismo transgénico" no cubre secuencias codificadoras de nucleótidos nativas en su entorno natural cuando están bajo el control de su promotor natural, que también está en su entorno natural. Por lo tanto, el organismo transgénico de la presente ¡nvención incluye un organismo que comprende cualquiera de: la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de acuerdo con la presente invención, construcciones de acuerdo con la presente invención, vectores de acuerdo con la presente invención, plásmidos de acuerdo con la presente ¡nvención, células de acuerdo con la presente ¡nvención, tejidos de acuerdo con la presente ¡nvención, o sus productos, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, el organismo transgénico también puede comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de la presente invención bajo el control de un promotor heterólogo.

Transformación de las células/organismos hospederos Como se indicó anteriormente, el organismo hospedero puede ser procariótico o eucariótico. Ejemplos de hospederos procarióticos adecuados ¡ncluyen E. coli y Bacillus subtilis. Las enseñanzas sobre la transformación de hospederos procarióticos están bien documentadas en la técnica; véase por ejemplo Sambrook y otros ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Si se usa un hospedero procariótico, entonces puede ser necesario modificar adecuadamente la secuencia de nucleótidos antes de la transformación -por ejemplo por remoción de intrones. Las células de hongos filamentosos se pueden transformar usando varios métodos conocidos -tales como un procedimiento que ¡ncluye la formación de protoplasto y transformación de los protoplastos, seguido por regeneración de la pared celular de la manera conocida. El uso de Aspergillus como microorganismo hospedero se describe en EP 0 238 023. Otro organismo hospedero puede ser una planta. Se puede encontrar una revisión de las técnicas generales usadas para transformar plantas en los artículos de Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. [1991] 42: 205-225) y de Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech, marzo/abril, 1994, 17-27). Se pueden encontrar más enseñanzas sobre la transformación de plantas en EP-A-0449375. En las siguientes secciones se presentan enseñanzas generales sobre la transformación de hongos, levaduras y plantas.

Hongos transformados Un organismo hospedero puede ser un hongo -por ejemplo un hongo filamentoso. Ejemplos de dichos hospederos adecuados incluyen cualquier miembro que pertenezca a los géneros Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma, y similares.

Las enseñanzas sobre la transformación de hongos filamentosos se revisan en US-A-5741665, que indica técnicas estándares muy conocidas para la transformación de hongos filamentosos y el cultivo de los hongos. Una revisión extensa de las técnicas, aplicada a N crassa, se encuentra por ejemplo en Davis y de Serres, Methods Enzymol. (1971 ) 17A: 79-143. En US-A-5674707 se dan más enseñanzas sobre la transformación de hongos filamentosos. En un aspecto, el organismo hospedero puede ser del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger. También se puede preparar un Aspergillus transgénico de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, siguiendo las enseñanzas de Turner G., 1994 ("Vectors for genetic manipulation", en: Martinelli S. D., Kinghorn J. R. (editores), "Aspergillus: 50 years on, Progress in industrial rnicrobiology, vol 29. Elsevier, Amsterdam 1994, p. 641-666). La expresión genética en hongos filamentosos ha sido revisada por Punt y otros (2002), Trends Biotechnol, mayo de 2002, 20(5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17 (4): 273-306.

Levadura transformada En otra modalidad, ei organismo transgénico puede ser una levadura. Una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en levaduras se provee, por ejemplo, en Methods Mol Biol (1995), 49: 341-54, y Curr Opin Biotechnol (1997), octubre; 8 (5): 554-60. A este respecto, se pueden usar levaduras -como las especies Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (véase FEMS Microbiol Rev (2000 24 (1 ): 45-66)- como un vehículo para la expresión de genes heterólogos. Una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae y la secreción de los productos de gen, es la de E. Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose y J Stuart Harrison, eds, 2a. edición, Academic Press Ltd.). Para la transformación de levaduras se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, se puede preparar una Saccharomyces transgénica de acuerdo con la presente invención siguiendo las enseñanzas de Hinnen y otros (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, Londres, 275, 104); e Ito, H y otros (1983, J Bacteriology 153, 163-168). Las células de levadura transformadas se pueden seleccionar usando varios marcadores selectivos -tales como marcadores auxotróficos y marcadores de resistencia a antibiótico dominantes.

Plantas /células de planta transformadas Un organismo hospedero adecuado para la presente invención puede ser una planta. Una revisión de las técnicas generales se puede encontrar en los artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech, marzo/abril, 1994 17-27).

Cultivo y producción Las células hospederas transformadas con la secuencia de nucleótidos de la presente invención se pueden cultivar bajo condiciones propicias para la producción de la enzima codificada, y que facilitan la recuperación de la enzima de las células o el medio de cultivo. El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para desarrollar la célula hospedera en cuestión y obtener la expresión de la enzima. La proteína producida por una célula recombinante puede ser presentada sobre la superficie de la célula. La enzima puede ser secretada de las células hospederas y se puede recuperar convenientemente del medio de cultivo usando los procedimientos conocidos.

Secreción Muchas veces es conveniente que la enzima sea secretada del hospedero de expresión hacia el medio de cultivo, de donde la enzima se puede recuperar más fácilmente. De acuerdo con la presente ¡nvención, la secuencia guía de secreción se puede seleccionar en función del hospedero de expresión deseado. También se pueden usar secuencias de señal híbridas en el contexto de la presente invención. Los ejemplos típicos de secuencias guía heterólogas de secreción son las que se originan del gen fúngico de amiloglucosidasa (AG) (glaA -tanto la versión de 18 como de 24 aminoácidos, por ejemplo de Aspergillus), del gen del factor a (levaduras, por ejemplo Saccharomyces, Kluyveromyces y Hansenula), o del gen de a-amilasa (Bacillus). A manera de ejemplo, en Methods Enzymol (1990), 182:132-43, se describe la secreción de proteínas heterólogas en E. coli.

Detección Se conoce una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de la secuencia de aminoácidos. Los ejemplos ¡ncluyen la prueba de inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RÍA) y clasificación de célula activada fluorescente (FACS). Los expertos en la materia conocen una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación que se pueden usar en varias pruebas de ácido nucleico y aminoácido. Varias compañías, tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, Nueva Jersey), Promega (Madison, Wisconsin) y US Biochemical Corp (Cleveland, Ohio), suministran equipos y protocolos comerciales para estos procedimientos. Moléculas reporteras o marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como substratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Patentes que enseñan el uso de tales marcas incluyen US-A-3,817,837; US-A-3,850,752; US-A-3,939,350; US-A-3,996,345; US-A-4,277,437; US-A-4,275,149 y US-A-4,366,241. También se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en US-A-4,816,567.

Proteínas de fusión La secuencia de aminoácidos para usar de acuerdo con la presente ¡nvención se puede producir como una proteína de fusión, por ejemplo para ayudar a la extracción y purificación de la misma. Ejemplos de socios de proteína de fusión ¡ncluyen glutatión-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de activación de unión o transcripción de ADN) y ß-galactosidasa. También puede ser conveniente ¡ncluir un sitio de corte proteolítico entre el socio de proteína de fusión y la secuencia de proteína de interés, para permitir la remoción de las secuencias de la proteína de fusión. Preferiblemente, la proteína de fusión no obstaculizará la actividad de la secuencia de proteína. Los sistemas de expresión de fusión de genes en E. coli han sido revisados en Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6 (5): 501-6. En otra modalidad de la invención, la secuencia de aminoácidos se puede ligar con una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para examinar colecciones de péptidos para seleccionar agentes capaces de afectar la actividad de la sustancia, puede ser de utilidad codificar una sustancia quimérica que exprese un epítope heterólogo que sea reconocido por un anticuerpo disponible comercialmente.

Aplicación en grande escala En una modalidad preferida de la presente invención, ia secuencia de aminoácidos se usa para aplicaciones a grande escala. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos se produce en una cantidad de 1 gramo por litro a aproximadamente 2 gramos por litro del volumen total del cultivo celular después del cultivo del organismo hospedero. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos se produce en una cantidad de 100 mg por litro a aproximadamente 900 mg por litro del volumen total de cultivo celular después del cultivo del organismo hospedero. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos se produce en una cantidad de 250 mg por litro a aproximadamente 500 mg por litro del volumen total del cultivo celular después del cultivo del organismo hospedero.

Alimento La composición de la presente invención se puede usar como un alimento, o en la preparación del mismo. Aquí, el término "alimento" se usa en un sentido amplio y cubre alimento para humanos y también alimento para animales (es decir, un forraje). En un aspecto preferido, el alimento es para consumo humano. El alimento puede estar en forma de una solución o un sólido, dependiendo del uso y modo de aplicación o modo de administración.

Ingrediente de alimento La composición de la presente invención se puede usar como un ingrediente de alimento. Como se usa aquí, el término "ingrediente de alimento" incluye una formulación que es un alimento funcional o un producto alimenticio, o que puede agregarse a alimentos funcionales o productos alimenticios, e ¡ncluye formulaciones que se pueden usar a concentraciones bajas en una amplia variedad de productos que requieren por ejemplo acidificación o emulsificación. El ingrediente de alimento puede estar en forma de una solución o un sólido, dependiendo del uso, o modo de aplicación o modo de administración.

Productos de alimento La composición de la presente invención se puede usar en la preparación de productos de alimento, por ejemplo uno o más de: productos de confitería, productos lácteos, productos de aves, productos de peces y productos de panadería. La presente ¡nvención también provee un método de preparación de un alimento o un ingrediente de alimento, el método comprendiendo mezclar una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención con otro ingrediente de alimento.

EJEMPLOS A continuación se describirá la presente invención únicamente a manera de ejemplo, en donde se hace referencia a las siguientes figuras: La figura 1 muestra perfiles de actividad de lipasa (indicada por áreas sombreadas, marcadas como grupo B) y proteína (línea de trazos), obtenidos después de una cromatografía lEC. La figura 2 muestra la enzima lipolítica fúngica pura (carriles 3-5) aplicada en un gel (NU-PAGE, 4-12%, amortiguador Mes, preparado como lo describe el fabricante, Novex, E.U.A.), que después se tiñó con un colorante de Commassie. La figura 3 muestra el cromatograma #61. La figura 4 muestra una SDS-PAGE de fracciones de la columna Butyl Sepharose (P: Grupos #172-174, 100 U/mL, dilución 1 :10; Std = Serie de proteínas estándares). La figura 5 muestra experimentos de minihorneado con 1 ) Crom. #61 fracc. 9; 2) Grupos #172-#174; 3) Crom. #61 fracc. 14; 4) Control; 5) Lipasa #3044. La figura 6 muestra un análisis de GLC de los lípidos de amasijo digalactosildiglicérido (DGDG) y digalactosilmonoglicérido (DGMG) de BS8948-2. La figura 7 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de todos los péptidos CBS con la lipasa de la cepa japonesa de F. heterosporum (Nagao y otros, 1994). Los aminoácidos idénticos y similares (bien conservados) están marcados debajo de la alineación con * y ', respectivamente. La figura 8 muestra una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos traducida del gen sintético de la enzima lipolítica de F. heterosporum (CBS 782.83), fusionado con la secuencia de señal alfa sintética. La secuencia de aminoácidos se presenta arriba de la secuencia de nucleótidos. Los nucleótidos que contienen los sitios de enzima de restricción Eco Rl y Bam Hl están subrayados, y los codones de iniciación y detención de traducción están doblemente subrayados. Las puntas de flecha marcan la posición de la fusión entre la secuencia de señal alfa y el gen de la enzima lipolítica. Las flechas indican los iniciadores usados para el ensamble del gen. La figura 9 muestra una representación esquemática del vector de expresión pB14 de Hansenula, que contiene el gen sintético de enzima lipolítica de F. heterosporum (CBS 782.83) (LIPASA) fusionado con una secuencia de señal alfa (ss alfa) sintética. URA3, el gen de orotidin-5'-fosfato-descarboxilasa para la complernentación de uracilo para selección en Hansenula. HARS, la secuencia de duplicación autónoma para duplicación en Hansenula. FMD-P, el promotor de FMD para expresión en Hansenula. La figura 10 muestra la actividad de fosfolipasa de clonas seleccionadas de Hansenula polymorpha que contienen el gen sintético de la enzima lipolítica de F. heterosporum. Se usó como substrato lecitina y el ácido graso libre se determinó usando el equipo NEFA (Roche). La figura 11 muestra un minipan horneado con una mayor dosis (PLU) de fosfolipasa de la muestra 205 y Lipopan F™. La figura 12 muestra un análisis de GLC de lípidos del amasijo. DGDG = digaloctosildiglicérido. DGMG = digalactosilmonoglicérido. Suma = DGDG+DGMG (ejemplo 3). La figura 13 muestra un cromatograma de HPTLC de: A) Referencias: 1. Lípido de harina fraccionada, 2. DGDG hidrolizado, 3. DGDG. B) Lípidos extraídos del amasijo: 4. Control, 5. 2000 PLU-7 /kg muestra 205 y 6.40 ppm de Lipopan F™. La figura 14 muestra un análisis de GLC del isómero digalactosilmonoglicérido en el amasijo tratado con una enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum. La figura 15 muestra la actividad de la enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum, determinada con 10 minutos de acción enzimática sobre substrato de lecitina, pH 7.0, a varias temperaturas, y determinación subsiguiente de los ácidos grasos libres según el método NEFA C. La figura 16 muestra la actividad de la enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum, determinada después de 30 minutos de incubación en amortiguador de fosfato 50 mM a 3 TIPU/ml y varias temperaturas (amortiguador de fosfato 50 mM, pH 7.0), con 10 minutos de acción enzimática sobre substrato de lecitina (sin CaCI2) a 37°C y pH 7.0, y determinación subsiguiente de los ácidos grasos libres según el método NEFA C. La figura 17 muestra la actividad de la enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum, determinada después de 10 minutos de acción enzimática sobre substrato de lecitina (sin CaCI2) a 37°C y varios pH (amortiguador de fosfato 50 mM), y determinación subsiguiente de los ácidos grasos libres según el método NEFA C. La figura 18 muestra la actividad de la enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum, determinada después de 30 minutos de incubación en amortiguador de fosfato 50 mM a 3 TIPU/ml y varios pH (amortiguador de fosfato 50 mM), con 10 minutos de acción enzimática sobre substrato de lecitina (sin CaCI2) a 37°C y pH 7.0, y determinación subsiguiente de los ácidos grasos libres según el método NEFA C. Las figuras 19a y 19b muestran la determinación del peso molecular, según SDS-PAGE, de una enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum. La figura 20 representa la temperatura óptima para una enzima lipolítica de acuerdo con la presente ¡nvención. La reacción enzimática se efectuó a varias temperaturas. Las figuras 21A-21C representan la cantidad de lecitina en la yema de huevo modificada con enzima en función del tiempo de reacción a: A, 30°C, B, 40°C, y C, 50°C. La cantidad de lecitina se analizó por LC/MS-MS y se expresa como porcentaje de la yema de huevo. Las figuras 22A-22C representan la cantidad de lisolecitina en la yema de huevo modificada con enzima en función del tiempo de reacción a: A, 30°C, B, 40°C y C, 50°C. La cantidad de lisolecitina se analizó por LC/MS-MS y se expresa como porcentaje de la yema de huevo. Las figuras 23A-23C representan la cantidad de ácido graso libre en la yema de huevo modificada con enzima en función del tiempo de reacción, a: A, 30°C, B, 40°C, y C, 50°C. La cantidad de ácido graso libre se analizó por el método NEFA C y se expresa como porcentaje de la yema de huevo. Las figuras 24A-24C representan la conversión enzimática de la yema de huevo con una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención (ejemplo 4). Las cantidades de lisolecitina (A), ácido graso libre (B), y lecitina (C) en función del tiempo de reacción. Las barras de error indican la desviación estándar de las determinaciones dobles (n=2). La cantidad de lecitina y lisolecitina se determinó por LC/MS-MS, y la cantidad de ácido graso libre se determinó por el método NEFA C. Los resultados se expresan como porcentaje de la yema de huevo. Las figuras 25A-25C representan la conversión enzimática de la yema de huevo con fosfolipasa Lecitase® Ultra de Novozymes A/S (ejemplo 4). Las cantidades de lisolecitina (A), ácido graso libre (B), y lecitina (C) en función del tiempo de reacción. Las barras de error indican la desviación estándar de las determinaciones dobles (n=2). La cantidad de lecitina y lisolecitina se determinó por LC/MS-MS, y la cantidad de ácido graso libre se determinó por el método NEFA C. Los resultados se expresan como porcentaje de la yema de huevo. La figura 26 muestra un análisis de TLC (el disolvente era cloroformo: metano agua (65:24:4)) de un extracto de lípido de yema de huevo modificada (ejemplo 4). 1 : Estándar de PC y LPC. 2: Enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención, 10°C, 240 min. 3: Enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención, 20°C, 240 min. 4: Enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención, 53°C, 240 min. 5: Enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención, 20°C, 1440 min. 6: Lecitase® Ultra, 10°C, 4h. 7: Lecitase® Ultra, 20°C, 240 min. 8: Lecitase® Ultra, 53°C, 4h. 9: Lecitase® Ultra, 20°C, 1440 min. 10: Muestra de control. Los compuestos listados a la izquierda de la placa de TLC son: colesterol (C), triacilglicérido (TG), diacilglicérido (DG), ácido graso libre (FFA), monoacilglicérido (MG), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina (PC), lisofosfatidiletanolamina (LPE), y lisofosfatidilcolina (LPC). La figura 27 representa la relación entre el cambio en contenido de lisolecitina y ácido graso libre durante la acción enzimática sobre la yema de huevo de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente ¡nvención y fosfolipasa Lecitase® Ultra, respectivamente (ejemplo 4). Los resultados se basan en un peso molar de lisolecitina de 523 y un peso molar de ácidos grasos libres de 283. El ácido graso libre se determinó por el método NEFA C. La lisolecitina y la lecitina se determinaron por LC/MS-MS.

La figura 28 muestra un análisis de HPTLC (el disolvente era p- éter:MTBE:ácido acético (50:50:1 )) de un extracto de lípido de yema de huevo modificada (ejemplo 4). Los compuestos listados a la izquierda de la placa de TLC son: triacilglicérido (TG), ácido graso libre (FFA), 1 ,3-diacilglicérido (1 ,3 DG); 1 ,2 diacilglicérido (1 ,2 DG), colesterol (C), monoacilglicérido (MG), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina (PC), iisofosfatidiletanolamina (LPE) y lisofosfatidilcolina (LPC). La figura 29 muestra un análisis de TLC (disolvente IV) de una mayonesa hecha con una yema de huevo de Sanofa A/S modificada con enzima (ejemplo 5). La figura 30 muestra la mayonesa preparada de la yema de huevo de Sanofa A/S modificada con enzima, tratada con calor en un horno de microondas (ejemplo 5). La muestra 1 era un control con agua añadida en lugar de la solución de enzima; la muestra 2 contenía 30 U/g de enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención; y la muestra 3 contenía 30 U/g de Lecitase® Ultra. La figura 31 muestra el volumen específico de pan de rollos de corteza firme horneados con diferentes concentraciones de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención, sola o en combinación con emulsionante DATEM Panodan® M2020 y probada contra una combinación de Lipopan F™ y DATEM, y también Lipopan F™ pura o DATEM puro. La figura 32 muestra el volumen específico de pan de rollos de corteza firme horneados con diferentes concentraciones de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente ¡nvención, sola o en combinación con emulsionante DATEM Panodan® A2020 o SSL P 55 y probada contra una combinación de Lipopan F™/SSL P 55 o Lipopan™/DATEM, y también Lipopan F pura, DATEM puro y SSL P 55 puro. La figura 33 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 5) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO. 4) del ADNc de lipasa de F. semitectum (IBT 9507). La secuencia de aminoácidos deducida se presenta arriba de la secuencia de nucleótidos. Las flechas indican los iniciadores usados para la amplificación del ADNc. La figura 34 muestra una representación esquemática del vector de expresión de Hansenula pDB14-alp-sem que contiene el gen de lipasa de F. semitectum (Lipasa) fusionado con la secuencia de señal a (ss alfa). AP(R), URA3, gen de orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa para la complementación de uracilo para selección. HARS, secuencia de duplicación autónoma para duplicación en Hansenula. FMD-P, promotor de FMD para expresión en Hansenula. La figura 35 muestra la actividad de fosfolipasa de una enzima lipolítica de Fusarium semitectum IBT9507 en función de la temperatura. La figura 36 muestra la actividad de fosfolipasa de una enzima lipolítica de Fusarium semitectum IBT9507 en función del pH. La figura 37 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 1 ) de una enzima lipolítica fúngica derivada de Fusarium heterosporum. La figura 38 muestra una secuencia de aminoácidos de una enzima lipolítica fúngica derivada de Fusarium heterosporum, que comprende una secuencia de señal N-terminal (subrayada) (SEQ ID No. 2). La figura 39 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 3) que codifica una enzima lipolítica fúngíca derivada de Fusarium heterosporum de acuerdo con la presente invención. La figura 40 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 4) de una enzima lipolítica derivada de Fusarium semitectum. La figura 41 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO.5) que codifica una enzima lipolítica derivada de Fusarium semitectum. La figura 42 muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID No. 6) de una enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum (EAEA es un propéptido originalmente de la secuencia de señal del factor a). La figura 43 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID No. 7) de una enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum, que incluye una secuencia de señal del factor a. La figura 44 muestra un divisor de flujo EJEMPLO 1 Expresión, purificación, secuenciación y pruebas de horneado de una enzima lipolítica de Fusarium heterosporum Fermentación La cepa Fusarium heterosporum CBS 782.83 se obtuvo de Centraalbureau voor Schimmelcultures (Países Bajos).

Medio de Crecimiento Agar de glucosa-extracto de levadura: Extracto de levadura 4 g/L KH2P04 1 g/L MgS04, 7H20 0.5 g/L Glucosa 15 g/L Agar 20 g/L La glucosa se añadió después de esterilizar en autoclave 1.4 Medio de fermentación: Harina de soya 50 g/L Glucosa monohidratada 50 g/L KH2P04 2 g/L Na2HP04 3 g/L Aceite de soya 1 g/L El medio se preparó en matraces agitados de 500 mL con bafles, y se añadieron 100 mL por matraz agitado. El aceite de soya se añadió separadamente a cada matraz. La glucosa se añadió después de esterilizar en autoclave.

Medio de producción Peptona 10 g/L Tween TM-80 12 g/L MgS04, 7H20 2 g/L CaCI2, 2H20 0.1 g/L El medio se preparó en matraces agitados de 500 mL con bafles, y se agregaron 100 mL por matraz agitado. El Tween TM-80 se agregó separadamente a cada matraz. El pH se ajustó a 6.0 antes de esterilizar en autoclave.

Condiciones del Cultivo Se inoculó Fusarium heterosporum CBS 782.83 en placas de agar de glucosa-extracto de levadura, que se incubaron a 24°C hasta el desarrollo de las esporas. Un matraz agitado que contenía medio de prefermentación se inoculó con 4 cm2 de agar en una placa que contenía un cultivo bien esporulado. El matraz agitado se incubó a 30°C y 200 RMP. Después de tres días de desarrollo, 30 matraces agitados de medio de producción se inocularon con 5 mL de caldo de fermentación del matraz agitado de prefermentación. Los matraces agitados de medio de producción se incubaron a 30°C y 200 RPM. Se cosecharon diez matraces agitados de medio de producción después de 2, 3 y 4 días de crecimiento. La biomasa se removió por centrifugación, seguida por filtración en estéril del sobrenadante a través de filtros de 0.2 µm (VacuCap 90 Filter Unit w/0.2 µm, Supor Membrane) de Gelman Laboratoy. Después de la filtración, el filtrado se congeló a -80°C y se guardó hasta su análisis.

Procedimientos analíticos La actividad de fosfolipasa se determinó de acuerdo con la "prueba de PLU" previamente descrita.

Aplicación Análisis de TLC La placa de TLC se activó en un soporte de calentamiento (110 °C) durante 1/2 h. Se vaciaron 100 ml de disolvente de desarrollo en una cámara cromatográfica con tapa. Las paredes de la cámara se cubrieron con papel filtro (Whatman 2) para saturar la cámara con el vapor del disolvente. La placa de TLC se puso en un marco y la muestra se aplicó sobre la placa de TLC, 2 cm desde la parte inferior. Después, la placa de TLC se puso en la cámara de TLC con el disolvente de desarrollo. Cuando el disolvente de desarrollo alcanzó 14 cm desde la parte inferior de la placa, esta se retiró y se secó en una campana de vapores, y después se colocó en el soporte de calentamiento a 110 °C durante 10 minutos. Después, la placa de TLC se sumergió en el reactivo revelador y se secó en el soporte de calentamiento a 110 °C durante 15 minutos.

Disolvente de desarrollo: No. IV: cloroformo : metanol : H20 (65:25:4) No. I: P-éter : éter metil-ter-butílico MTBE : ácido acético (60:40:1 ).

Reactivo revelador (amortiguador de vanadato): 32 g de Na2C03 en 300 ml de H20 (1 M) Se' agregan 18.2 g de pentóxido de vanadato (V205) y se disuelven con calentamiento suave, y la solución se cuece en un horno "BACO-LINE" durante 6 minutos. La solución se enfría a temperatura ambiente. Se le agregan cuidadosamente 460 ml de H2S0 2.5 M (460 ml de H20 + 61 ml de H2S04). Se le agrega agua hasta 1000 ml.

Cromatografía de gases Cromatógrafo de gases capilar Perkin Elmer 8420 equipado con una columna de sílice fusionada WCOT de 12.5 m x 0.25 mm d.i. x 0.1 µm, 5% fenil-metil-silicón (CP Sil 8 CB de Crompack). Portador: helio. Inyección: 1.5 µl con división Detector FID. 385 °C. Programa del horno: 1 2 3 4 Temperatura del horno [°C] 80 200 240 360 Tiempo isotérmico [min] 2 0 0 10 Velocidad de la temperatura [°C/min] 20 10 12 Preparación de la muestra: 50 mg de lípido de trigo se disolvieron en 12 mi de heptano:piridina, 2:1 , que contenía un estándar interno de heptadecano, 0.2 mg/ml. Se transfirieron 500 µl de la muestra a un frasco corrugado; se le agregaron 100 µl de MSTFA (N-Metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida), y la reacción se incubó 15 minutos a 90 °C. Cálculos: Los factores de respuesta para mono-, di-, triglicéridos, ácidos grasos libres y galactolípidos, se determinaron de mezclas de referencia de estos componentes. Basándose en estos factores de respuesta se calcularon los lípidos en el amasijo.

Prueba de minihomeado Los siguientes ingredientes se agregaron a un recipiente mezclador Brabrender de 50 g y se amasaron durante 5 minutos a 30°C: harina 50 g, levadura seca 50 g, azúcar 0.8 g, sal 0.8 g, ácido ascórbico 70 ppm y agua (hasta una consistencia de amasijo de 400 unidades Brabender). El tiempo de reposo fue de 10 minutos a 34°C. El amasijo se dividió en porciones de 15 g por amasijo. Después se moldearon sobre un dispositivo especial en donde el amasijo se enrolló entre una placa de madera y un marco de Plexiglás. Los amasijos se esponjaron en latas durante 45 minutos a 34°C y se hornearon en un horno doméstico Voss durante 8 minutos a 225°C. Después de hornear, los panes estos se enfriaron a temperatura ambiente, y después de 20 minutos se pesaron y se determinó el volumen según el método de desplazamiento de semilla de nabo. Los panes también se cortaron y se evaluó su migajón y su corteza.

Pruebas piloto de horneado (Rollos de corteza firme): Se amasó harina Danish Reform, 1500 g; levadura comprimida, 90 g; azúcar, 24 g; salm 24 g; agua, 400 unidades Brabender + 2%, en un mezclador Hobart con gancho, durante 2 minutos a velocidad baja y 9 minutos a velocidad alta. La temperatura del amasijo era de 26°C. El amasijo se dividió en porciones de 1 ,350 gramos. El amasijo se dejó en reposo durante 10 minutos a 30°C y se moldeó en un moldeador Fortune. Después, el amasijo se esponjó durante 45 minutos a 34°C. El amasijo se horneó en un horno Bago durante 18 minutos a 220°C, y a vapor durante 12 segundos. Después de enfriar, los rollos se pesaron y se midió su volumen según el método de desplazamiento de semilla de nabo.

Volumen específico de pan: Volumen del pan, ml Volumen específico = Peso del pan, g Resultados y discusión Fermentación Las muestras de fermentación se analizaron para determinar la actividad de fosfolipasa y los resultados se muestran en el cuadro 1.

CUADRO 1 Resultados de la fermentación aMedio D = medio de producción Se vio que la actividad de fosfolipasa fue casi idéntica los días 2, 3 y 4, y por lo tanto todas las muestras se reunieron e identificaron como JBS- 2254-97-3.

Purificación y secuenciación Purificación de fosfolipasas del extracto crudo usando cromatografía de intercambio de aniones: La columna (Q-Sepharose FF, 1.5 X 2.8 cm, 5 mL gel) se preparó como lo describe el fabricante (Amersham Bio.), y después se equilibró en amortiguador de tris/HCI 20 mM, NaCI 0.1 M, pH 7.5 (amortiguador A). A la muestra (15 mL) se le agregó NaCI 0.1 M y se aplicó a la columna a una velocidad de flujo de 3.5 mL/min. La enzima lipolítica se eluyó con un gradiente lineal de NaCI 0-0.6 M en amortiguador A (véase la figura 1 ). Se recogieron fracciones de 3.5 mL durante toda la operación. Se sometieron a prueba de placa de punto 10 µL de cada fracción. La actividad de lipasa se determinó por medio de una prueba de placa de punto de tributirina y lecitina (10 µL de cada fracción se transfirieron al orificio y la placa se incubó a 40°C; con el tiempo se forman halos en los geles de agarosa; también se agregó un blanco sin enzima a uno de los orificios para comparación). Después, las fracciones que contenían actividad lipolítica se sometieron a SDS-PAGE (véase la figura 2) y análisis N-terminales.

Identificación enzimática mediante MALDI-TOF y secuenciación de aminoácidos La proteína se redujo con ditiotreitol y los residuos de cisteína se protegieron por carboximetilación usando yodoacetamida. La proteína se cortó con tripsina y el patrón de fragmentación de los péptidos trípticos se examinó por análisis de MALDI-TOF. Los péptidos se separaron por cromatografía en una columna de HPLC de fase inversa de de, y el grado de purificación se monitoreó por análisis de MALDI-TOF. La secuencia de aminoácidos se determinó por degradación de Edman como se describió en detalle previamente en TR6452. Se determinó la secuencia de aminoácidos completa de la enzima lipolítica de Fusarium heterosporum. La digestión con tripsina dio péptidos muy específicos en donde se pudo determinar conclusivamente el MW (MALDI-TOF). La secuencia de aminoácidos de todos los péptidos también se determinó por degradación de Edman. La secuencia de aminoácidos determinada por degradación de Edman cubre 99.64% de la cadena de polipéptidos de la enzima lipolítica de F. heterosporum. En el cuadro 2 se muestra un resumen de los estudios de MALDI-TOF y degradación de Edman.

CUADRO 2 Identificación enzimática y MW de los péptidos trípticos de la enzima lipolítica de Fusaríum heterosporum, y determinación de la secuencia de aminoácidos completa por degradación de Edman + = Confirmada por secuenciación de Edman; * = Triptófano oxidado Cobertura de secuencia = 99.64% La secuencia de aminoácidos completa de la enzima lipolítica de Fusarium heterosporum se muestra como SEQ ID No. 1 (véase la figura 37).

Pruebas de aplicación Una mezcla de 2 litros de las tres muestras de F. heterosporum (cuadro 1 ), marcada como Grupo #172-174, se concentró por ultrafiltración (filtro de 10 kDa) en una unidad de filtración Amicon Ultra. Doscientos cincuenta mililitros del producto retenido contenían aproximadamente 100 PLU-7/ml. El producto retenido se ajustó con acetato de amonio 1 M y se aplicó sobre una columna de Butyl Sepharose de 27 ml (d.i. 2.5 cm), y se eluyó con amortiguador A NH -acetato 1 M en 20 mM de TEA, pH 7.4, y amortiguador B, 20 mM de TEA, pH 7.4. En la figura 3 se muestra el cromatograma (#61 ) de la purificación. Las fracciones del cromatograma #61 se analizaron por SDS-PAGE como se muestra en la figura 4. Se recolectaron fracciones de 10 mL de esta cromatografía y se analizó la actividad de fosfolipasa como se muestra en el cuadro 3. Estos resultados indican una actividad de fosfolipasa muy alta en las fracciones eluidas en el pico principal del cromatograma. Alguna cantidad de actividad no se liga a la columna pero se eluye en el frente. Aunque el gel de SDS no corre muy adecuadamente, se observa que las fracciones contienen varias proteínas; sin embargo, las fracciones 14 y 15 contienen una banda principal, que se espera que sea la enzima lipolítica fúngica.

CUADRO 3 La fracción 9 y la fracción 14 del cromatograma #61 se usaron para una prueba de minihorneado, y también el grupo #172-174 no purificado se probó en una prueba de minihorneado. En el cuadro 4 se muestran los resultados de este experimento de horneado. Esto muestra claramente que la enzima lipolítica pura de F heterosporum CBS 782.83 da muy buenos resultados de horneado en cuanto a un mejor volumen del pan. También la muestra no purificada contribuye mucho a mejorar el volumen del pan. La estructura de migajón de los panes también mejoró mucho con la enzima lipolítica de F. heterosporum, como lo indica la figura 5, y se evalúa mejor que con una lipasa de Pseudomonas cepacia #3044.

CUADRO 4 El amasijo de este experimento de minihorneado se extrajo con butanol saturado con agua, y los lípidos se analizaron por TLC. El análisis de TLC confirmó que la lipasa #3044 es más activa sobre triglicérido que la enzima lipolítica de las muestras de F. heterosporum. La cantidad de ácidos grasos libres (FFA) también fue más alta con la lipas #3044. La TLC en el disolvente IV indica un componente (DGMG), que es claramente más alto en las muestras de lípidos de amasijo tratado con F. heterosporum en comparación con la lipasa hidrolízante de triglicérido #3044. Las fracciones puras de F. heterosporum también se probaron en un experimento de horneado piloto con los resultados que se muestran en el cuadro 5.

CUADRO 5 Uso de las fracciones purificadas por cromatografía de Fusarium heterosporum en una prueba de horneado piloto, y efectos sobre el volumen de pan El amasijo de esta prueba de horneado se extrajo con butanol saturado con agua y los lípidos de amasijo se analizaron por GLC con los resultados que se muestran en el cuadro 6.

CUADRO 6 Análisis de GLC de los lípidos del amasijo GL = glicerol. FFA = ácido graso ibre. MGMG = monogalactosilmonoglicérido. DAG= diacilglicérido. DGMG = digalactosilmonoglicérido. MGDG = monogalactosildiglicérido. DGDG digalactosildiglicérido. TRI = triglicérido.

En el cuadro 7 se muestra la proporción de hidrólisis de DGDG en comparación con la hidrólisis de triglicérido. El análisis de GLC de galactolípidos también se ilustra gráficamente en la figura 6. Los resultados de GLC confirman que la cantidad de DGMG producido en el amasijo por F. heterosporum es más alta que la cantidad producida por 40 ppm de Lipopan F (#3016). Los resultados también indican un grado mayor de hidrólisis de MGDG que DGDG. Los resultados también indican que la cantidad de triglicérido hidrolízado es baja en comparación con una enzima hidrolizante de triglicérido normal, como la #3044 de P. cepacia. Los resultados de horneado a escala piloto y el análisis de lípido confirmaron que la enzima lipolítica de F. heterosporum CBS 782.83 tiene una clara actividad hidrolítica sobre digalactosildiglicérido (DGDG) y la formación de digalactosilmonoglicérido (DGMG) en un amasijo.

CUADRO 7 Proporción de la hidrólisis de DGDG en comparación con la hidrólisis de triglicérido en fracciones purificadas por cromatografía de Fusarium heterosporum 4. Conclusiones En este estudio se produjo una enzima lipolítica fúngica de F. heterosporum CBS 782.83 por fermentación en matraces agitados. La enzima se purificó y la secuencia de aminoácidos se determinó. La enzima tenía aproximadamente 83% de homología con una lipasa comercial de F. oxysporum (LipopanF™). La enzima dio muy buenos resultados en una prueba de horneado, en cuanto a volumen mejorado de pan y estructura mejorada de migajón. El análisis de lípidos del amasijo confirmó que la enzima era activa sobre los galactolípidos durante la producción de galactomonoglicéridos. Sin optimizar la dosis, los resultados de horneado indican que la enzima lipolítica fúngica de F heterosporum CBS 782.83 es por lo menos equivalente a la enzima comercial Lipopan F, y la actividad comparativa de DGDG a triglicéridos indica que esta enzima tiene una actividad enzimática superior en un medio de amasijo en comparación con LipopanF TM EJEMPLO 2 Construcción y expresión de un ge ven sintético que codifica una enzima lipolítica de Fusarium heterosporum (CBS 782.83) en Hansenula polymorpha La secuencia de aminoácidos de una enzima lipolítica fúngica aislada de Fusarium heterosporum (CBS 782.83) se determinó y se usó para diseñar y clonar un gen sintético de enzima lipolítica para su expresión en Hansenula polymorpha. Para favorecer una alta expresión, los codones del gen sintético se optimizaron para concordar con las preferencias de codón de Hansenula polymorpha. Una secuencia de señal del factor alfa de codón optimizado se sintetizó y también se clonó al frente del gen sintético de la enzima lipolítica. La construcción ensamblada se transfirió al vector de expresión pB14 y se transformó en Hansenula polymorpha. El pB14 es un plásmido sin genes que confiere resistencia de antibiótico y por lo tanto se puede usar en medios de producción. Varias cepas de Fusarium productoras de enzima lipolítica se examinaron para determinar sus actividades y seleccionar las de alta proporción de actividad sobre galactolípidos o fosfolípidos en comparación con triglicéridos. Se seleccionaron varias de las cepas que producen las enzimas lipolíticas de interés. Entre éstas está la de Fusarium heterosporum (CBS 782.83). Por lo tanto, la enzima lipolítica de esta cepa se aisló y se determinó su secuencia de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos se tradujo inversamente a una secuencia de ácido nucleico que se usó para diseñar y construir un gen sintético para su expresión en Hansenula polymorpha.

Parte experimental La cepa de Hansenula usada en este estudio era la cepa RB11 auxotrófica de uracilo (odd) de Hansenula polymorpha, obtenida de Rhein Biotech GmbH (Dusseldorf, Alemania).

Identificación enzimática por MALDI-TOF y secuenciación de aminoácidos Una proteína que tiene actividad de enzima lipolítica se aisló de Fusarium heterosporum (CBS 782.83). La proteína se redujo con ditiotreitol y los residuos de cisteína se protegieron por carboximetilación usando yodoacetamida. La proteína se cortó con tripsina y el patrón de fragmentación de los péptidos trípticos se examinó por MALDI-TOF. Los péptidos se separaron por cromatografía en una columna de HPLC de fase inversa de C18, y el grado de purificación se monitoreó por medio de un análisis de MALDI-TOF. La secuencia de aminoácidos se determinó por degradación de Edman como se describió previamente en los detalles en TR6452.

Diseño y construcción de un gen sintético de enzima lipolítica La secuencia de aminoácidos de los fragmentos de péptido se ordenaron por alineación con una cepa japonesa de F. heterosporum (Nagao y otros, 1994). La secuencia de aminoácidos completa así obtenida se tradujo inversamente a una secuencia de ácido nucleico para revelar todos los codones posibles. Para cada codón se eligió el codón más favorable para la expresión en Hansenula polymorpha de acuerdo con el cuadro de preferencia de codón de los genes expresados en Hansenula polymorpha. Se sintetizaron oligonucleótidos sintéticos, cada uno de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, que comprenden el gen completo, y el gen se ensambló por medio de PCR. Para la amplificación final del gen se usó un iniciador de dirección 5' (alps.cbss) diseñado con los nucleótidos más 5' del extremo 3' de la secuencia de señal del factor alfa, para permitir fusión en marco, y un iniciador de dirección 3' (cbss.t) diseñado con un sitio de enzima de restricción Sam Hl para fines de clonación (cuadro 8). Similarmente se sintetizó una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de señal del factor de apareamiento de levadura alfa, con codones favorables por oligonucleótidos, y se amplificó por medio de PCR. Para la amplificación final de la secuencia de señal alfa se usó un iniciador de dirección 5' (alpsynt) diseñado con un sitio de enzima de restricción Eco Rl para fines de clonación, y un iniciador de dirección 3' (cbss.alps) diseñado con las secuencias más 5' del extremo 5' del gen sintético de la enzima lipolítica, para permitir fusión en marco (cuadro 8).

Para fusionar la secuencia de señal sintética del factor alfa con el gen sintético de enzima lipolítica, los dos fragmentos se mezclaron y reamplificaron con los iniciadores externos alpsynt y cbss.t (cuadro 8). El producto de PCR se clonó en el vector pCR 2.1 -TOPO (Invitrogen), y la secuencia de nucleótidos de los insertos se determinó usando un equipo de secuenciación cíclica BigDye Terminator v3.0 (Applied Biosystems), y un analizador ABl Prism 3100 Genetic Anallyzer (Applied Biosystems).

CUADRO 8 Secuencias de iniciador usadas para la amplificación y ensamble del gen sintético de la enzima lipolítica de F. heterosporum (CBS 782.83) y la secuencia sintética de señal alfa Los sitios de enzimas de restricción introducidos para fines de clonación en cada iniciador están subrayados. Los nucleótidos incluidos que permiten la fusión del gen sintético de enzima lipolítica y la señal alfa sintética están doblemente subrayados.

Expresión de la enzima lipolítica en Hansenula polymorpha Para expresar el gen sintético de enzima lipolítica de F. heterosporum (CBS 782.93) en Hansenula, el gen combinado de secuencia de señal alfa /enzima lipolítica se insertó detrás del promotor de FMD en el vector de expresión de Hansenula pB14, un plásmido sin genes que confiere resistencia de antibiótico. Después de la conformación de la estructura esperada del plásmido ensamblado en E. coli, el plásmido se transformó en células competentes de Hansenula polymorpha por electroporación. Los transformantes se seleccionaron sobre placas de YND y se seleccionaron colonias para integración múltiple del gen por medio de 3 y 8 pasos de diluciones de 1 :200 en cultivos líquidos de YND. Finalmente, los cultivos seleccionados se estabilizaron transfiriendo dos veces en medio YPD. Para seleccionar más los cultivos de alta expresión, cada cultivo que mostró un alto grado de expresión se sembró en placa para colonias individuales, de las cuales se determinó el grado de expresión. Para determinar el grado de expresión del gen de la enzima lipolítica, las clonas seleccionadas se desarrollaron en YPD con 1.8% de glicerol y 0.2% de glucosa durante 2 días a 24°C.

Actividad enzimática Unas muestras del medio de cultivo se analizaron para determinar la actividad enzimática lipolítica, con lecitina o DGDG como substratos, y usando el equipo NEFA Kit (Roche) escalado descendentemente a volúmenes adecuados para placas de microtítulo, para determinar los ácidos grasos libres liberados.

Resultados Identificación enzimática por MALDI-TOF y secuenciación de aminoácidos Se determinó la secuencia de aminoácidos completa de la enzima lipolítica de Fusarium heterosporum (véase la SEQ ID No. 1 - figura 37). La digestión con tripsina dio péptidos muy específicos en donde se pudo determinar conclusivamente el MW (MALDI-TOF). También se determinaron ias secuencias de aminoácidos de todos los péptidos por degradación de Edman. Las secuencias de aminoácidos determinadas por degradación de Edman cubren 99.64% de la cadena de polipéptido de la enzima lipolítica de F. heterosporum (CBS 782.83). Las secuencias de aminoácidos de todos los péptidos se alinearon con la lipasa de la cepa japonesa de F heterosporum (Nagao y otros, 1994, J. Biochem. 116:536-540), revelando así el orden de los péptidos que identifica la secuencia de aminoácidos de la proteína madura. La alineación se muestra en la figura 7. En el cuadro 9 se da un resumen de los estudios de MALDI-TOF y la degradación de Edman usando el orden de los péptidos de acuerdo con su alineación con la secuencia de Nagao.

CUADRO 9 Identificación enzimática y determinación del MW de la secuencia de aminoácidos completa por degradación de Edman de los péptidos trípticos de la enzima lipolítica de Fusaríum heterosporum (CBS 782.83) Las secuencias de péptido confirmadas por degradación de Edman están marcadas con +. El triptófano oxidado está marcado con *. Cobertura de secuencia = 99.64%.

Identidad con otras lipasas de Fusarium Las alineaciones de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la enzima lipolítica de F. heterosporum (CBS 782.83) con secuencias de otras lipasas de Fusarium muestran las relaciones entre algunas de las lipasas de Fusarium (cuadro 10).

CUADRO 10 Identidad de aminoácidos y nucleótidos de la enzima lipolítica de F. heterosporum (CBS 782.83) en comparación con otras lipasas de Fusaríum La mezcla y amplificación por PCR de los oligonucleótidos sintéticos para el gen de la enzima lipolítica y la secuencia de señal alfa, dieron como resultado fragmentos de ADN que se clonaron y secuenciaron. Los fragmentos que contenían las secuencias correctas se usaron para ensamblar el gen completo mediante reamplificación usando los iniciadores mostrados en el cuadro 8. La secuencia de nucleótidos ensamblada se muestra en la figura 8 con su secuencia de aminoácidos traducida y los iniciadores usados se indican con flechas. El fragmento de ADN que contenía la construcción del gen ensamblado se transfirió al vector de expresión de Hansenula pB14 usando los sitios de enzima de restricción introducidos. El plásmido resultante pB14- alps.cbss se muestra esquemáticamente en la figura 9.

Expresión de la actividad de la enzima lipolítica fúngica en clonas seleccionadas Las clonas que pasaron a través del proceso de selección se analizaron para determinar la expresión de la enzima lipasa. Muestras de 10 µl del sobrenadante de cultivos de 2 días se incubaron con DGDG o lecitina durante 10 minutos, y 10 microlitros de estas reacciones se analizaron con el equipo NEFA. En la figura 10 se muestran los resultados después del aislamiento de colonias individuales de 3 de las clonas. Se determinó la secuencia de aminoácidos de una enzima lipolítica de una cepa de Fusarium heterosporum (CBS 782.83), y se construyó un gen sintético que codifica esta enzima lipolítica y se optimizó para su expresión en Hansenula polymorpha. El gen que codifica la enzima madura se fusionó con una secuencia de señal sintética derivada del factor alfa de apareamiento de levadura. Se había visto previamente que la combinación de la secuencia de señal alfa con el promotor de FMD del vector pB14 de Hansenula, era adecuado para la expresión de lipasas de Fusarium.

EJEMPLO 3 Expresión de una enzima lipolítica de Fusaríum heterosporum CBS 782.83 en Hansenula polymorpha y caracterización del producto en pruebas de horneado La cepa Hansenula polymorpha B14:8-3,8 (DCDK0172), que contiene un gen codificador de enzima lipolítica del hongo filamentoso Fusarium heterosporum CBS782.83, se fermentó en el modo de alimentación por lotes. Después de 160 horas de fermentación, la actividad de fosfolipasa alcanzó 1200 U/mL. Con los fermentos se hicieron tres productos y después se probaron. Los productos se denominaron de la siguiente manera: muestra 205, 206 y 209. Una muestra de 205 de enzima lipolítica de F. heterosporum expresada en H. polymorpha se probó en experimentos de horneado a miniescala. El amasijo del experimento de horneado se analizó por GLC y HPTLC. Los resultados del horneado a miniescala confirmaron un mejoramiento muy grande de la muestra de enzima lipolítica 205 sobre el volumen de pan y la estructura de migajón. El análisis de la enzima lipolítica confirmó una fuerte actividad hidrolítica de la muestra de enzima lipolítica 205 sobre digalactosildiglicérido (DGDG), concomitantemente con la acumulación de digalactosilmonoglicérido (DGMG). La enzima sólo tuvo actividad menor sobre los triglicéridos en el amasijo. Las muestras 206 y 209 se probaron en pruebas de horneado de escala piloto y confirmaron la buena acción en el horneado de las enzimas lipolíticas, tanto con respecto a un mayor volumen de pan como a una mejor estructura de migajón. Las pruebas de horneado indican que la muestra 206 mejora las propiedades de mordedura en comparación con la muestra 209 en un procedimiento directo de amasijo; sin embargo, los productos no se han comparado directamente uno con otro y esto se tiene que confirmar con más pruebas de horneado. 2. Parte experimental Fermentación Microorganismo: En este estudio se usó la cepa de H. polymorpha transformada con el plásmido que contiene la enzima lipolítica de F. heterosporum CBS 782.83 que se describe en el ejemplo 2. El promotor usado en la construcción fue el promotor de formiato deshidrogenasa de H. polymorpha.

Medio de crecimiento y condiciones de cultivo: Medio de YNB-glicerol El medio usado para la preparación del inoculo para las fermentaciones en biorreactor y para desarrollo en los matraces agitados contenía: 1.7 g/L de base de nitrógeno de levadura (DIFCO, Detroit, E.U.A., 0335-15-9), 5 g/L de (NH4)2S04, 10 g/L de glicerol, y 0.1 M de ácido 2-[N- morfolin]etanosulfónico (MES) como amortiguador. El pH se ajustó a 6.1 (el pKa del MES) con NaOH 4M (antes de esterilizar en autoclave). La base de nitrógeno de levadura y el (NH4)2S0 se esterilizaron en un filtro hacia el medio después de esterilizar en autoclave. Este medio se usó para desarrollo en matraces agitados (250 mL de medio en un matraz agitado con un volumen total de 500 mL).

Aqar YNB El medio definido usado para sembrar en placa los cultivos de abastecimiento (mantenidos a -80°C en de glicerol al 25% (p/v)) contenía: 1.7 g/L de base de nitrógeno de levadura (DIFCO, Detroit, E.U.A. 0335-15-9), 5 g/L de (NH4)2S04, 10 g/L de glicerol y 20 g/L de agar (DIFCO, Detroit, E.U.A. 0140-01 ). La Base de nitrógeno de levadura y el (NH4)2S04 se esterilizaron por filtración hacia el medio después de esterilización en autoclave.

Medio YPD El medio enriquecido se usó para verificar la contaminación en los termentadores. El medio contenía: 10 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de peptona y 20 g/L de glicerol.

Fermentaciones Se efectuaron tres fermentaciones en este estudio: HET0401 , HET0402 y HET0410, todos con la cepa descrita anteriormente. Las variaciones entre las tres fermentaciones son en la composición del medio del lote y el medio de alimentación. Los otros parámetros fueron idénticos para las tres fermentaciones. El medio de lote (3L) usado para la fermentación en un fermentador de 6 L, contenía: 13.3 g/L de NH4H2P04, 3.0 g/L de MgS04H20, 3.3 g/L de KCl, 0.3 g/L de NaCI, 15 g/L de glicerol y 3 mL/L de ADD APT® Foamstop Sin 260 (ADD APT Chemicals AG, Helmond, Países Bajos), 1.0 g /L de CaCI22H20, 67 mg/L de (NH4)2Fe(S04)2 6H20, 5 mg/L de CuS045H20, 20 mg/L de ZnS047H20, 21 mg/L de MnS04H20, y 67 mg/L de EDTA), 0.65 mg/L de NiS046H20, 0.65 mg/L de CoCI2, 0.65 mg/L de H3B04, 0.65 mg/L de Kl, 0.65 mg/L de Na2Mo042H20), 2 mg/L de D-biotina y 0.67 g/L de clorhidrato de tiaminacloruro. Además del medio de lote descrito arriba, la fermentación HET0402 contenía 10 g/L de peptona en el medio de lote. Además del medio de lote anteriormente descrito, la fermentación HET0410 contenía 10 g/L de Bacto triptona en el medio de lote.

Medio de alimentación HET0401 y HET0402: El medio de alimentación contenía 635 g/kg de glicerol y 130 g/kg de ácido fórmico.

Medio de alimentación HET0410: El medio de alimentación contenía 570 g/kg de glicerol, 120 g/kg de ácido fórmico y 95 g/kg de Bacto triptona. El pH se controló agregando 25% (p/v) de NH3-agua. La fermentación se efectuó en el modo de alimentación por lotes en un fermentador de 6 L de laboratorio. Se usaron las siguientes condiciones de fermentación: pH 5, aeración 1 vvm, temperatura 26°C, y agitación de 400 a 700 rpm. El fermentador se inoculó con 2*250 mL de medio de cultivo YNB-glicerol desarrollado a 25°C y 180 rpm, y con una DO-600 de aproximadamente 10. El flujo de la alimentación en la fermentación se controló mediante el desprendimiento de C02 acumulado y basándose en las siguientes ecuaciones: Alimentación - flujo [g/h]= 0, AcC02 < 0.45 Alimentación - flujo [g/h]=1.33 -V- AccC02, 0.45 < AccC02 < 3.25 Alimentación - flujo [g/h]=4.33 -V, 3.25 < AccC02 V: Volumen del caldo de fermentación [L] AccC02: Desprendimiento del C02 acumulado [moles] Cosecha: Las fermentaciones se cosecharon por centrifugación durante 10 minutos a 16,000 x g, seguido por filtración estéril del sobrenadante a través de filtros de 0.2 µm (VacuCap 90 Filter Unit w 0.8/0.2 µm Supor Membrane) de Gelman Laboratory. El producto se mantuvo a 4°C hasta usar en las pruebas de horneado.

Procedimientos analíticos: Determinación de la actividad de lipasa Una muestra de fermentación (10 mL) se centrifugó a 9,000 x g durante 10 minutos, y el sobrenadante se usó para el análisis de la actividad de fosfolipasa de acuerdo con la "prueba de PLU" enseñada previamente en la presente.

Crecimiento de la biomasa La concentración de biomasa en un fluido de cultivo se determinó por centrifugación de 10 ml de fluido de cultivo a 9,000 x g durante 10 minutos en un contenedor previamente pesado. Después de centrifugar, el sobrenadante se removió y la biomasa se secó 24 horas a 100°C y después se pesó. La concentración de biomasa se calculó como g de peso seco de células por L de fluido de cultivo.

Caracterización de la enzima y minihorneado Enzimas y harina: Muestra 205: Muestra 7 (161 horas de fermentación) de HET0401 Fosfolipasa Lipopan F, #2938 Harina: Reform 2003055 Minihorneado: Los siguientes ingredientes se agregaron a un recipiente mezclador Brabrender de 50 g y se amasaron durante 5 minutos a 30°C: harina 50 g, levadura seca 10 g, azúcar 0.8 g, sal 0.8 g, ácido ascórbico 70 ppm, y agua (a una consistencia de amasijo de 400 unidades de Brabender). El tiempo de reposo fue de 10 min a 34°C. El amasijo se dividió en porciones de 15 g por amasijo. Después se moldeó en un dispositivo especial en donde el amasijo se enrolló entre una placa de madera y un marco de Plexiglás. Los amasijos se esponjaron en latas durante 45 minutos a 34°C, y se hornearon en un horno doméstico Voss durante 8 minutos a 225°C. Después de hornear, los panes se enfriaron a temperatura ambiente y después de 20 minutos se pesaron; el volumen se determinó según el método de desplazamiento de semilla de nabo. Los panes también se cortaron y se evaluó su migajón y su corteza.

Extracción de lípido: 10 g de amasijo completamente esponjado se congelaron inmediatamente y se secaron congelados. El amasijo secado por congelación se molió en un molino de café y se pasó a través de un tamiz de 800 mieras. Se pesaron 1.5 g de amasijo secado por congelación en un tubo de centrífuga de 15 mL con tapa de rosca. Se le agregaron 7.5 mi de butanol saturado con agua (WSB). El tubo de centrífuga se colocó en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Los tubos se colocaron en un Rotamix y se giraron a 45 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después se colocaron nuevamente en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos y se encendió el Rotamix durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los tubos se centrifugaron a 3,500 g durante 5 minutos. Se transfirieron 5 ml del sobrenadante a un frasco. El WSB se evaporó hasta sequedad bajo una corriente de nitrógeno.

Cromatografía de gases: Se hizo una cromatografía de gases como se describe bajo los procedimientos analíticos del ejemplo 1 anterior.

HPTLC: Aplicador: LINOMAT 5, CAMAG. Placa de HPTLC: 10 x 10 cm, Merck No. 1.05633 Antes de usarse, la placa se secó en un horno a 180°C durante 20-30 minutos. Aplicación: 1.0 µL de una solución al 1 % en CHCI3:MeOH 85:15 se aplica a la placa de HPTLC usando el aplicador LINOMAT 5.

Amortiguador de desarrollo: No. IV: Cloroformo: Metanol: H20 (65:25:4) No. I: P-éter: éter metil-fer-butílico (MTBE): ácido acético (60:40:1) Tiempo de aplicación/elusión: 11 minutos para el amortiguador de desarrollo I, y 18 minutos para el amortiguador de desarrollo IV. La placa se seca en un horno a 180°C durante 10 minutos; se enfría y se revela con acetato de cobre al 6% en H3P0 al 16%. Se seca 10 minutos más a 180°C y se evalúa directamente.

Pruebas de horneado: Productos probados #3016 - Lipopan F que contiene 8700 LIPU/g Receta: Rollos de corteza firme hechos con harina Reform:2003159 %Pan Cantidad, g Harina Reform 2003159 100 2000 Agua 58.5 1170 Levadura comprimida 6 120 Sal 1.6 32 Azúcar 1.6 32 Acido ascórbico 10 ppm 0.02 Alfa-amilasa estándar GRINDAMYL™ A 1000 90 ppm 0.180 Procedimiento de horneado: Sistema mezclador Diosna • Secar la mezcla durante 1 minuto lentamente • Mezclar 2 minutos lentamente + 4 minutos rápido • Temperatura del amasijo: 26°C • División en porciones de: 1.350 g • Reposo: 10 min a 30°C en una cabina de calentamiento • Moldeado: Fortuna 3/17/7 • Esponjamiento: 45 min. a 34°C, 85% de H.R. • Horneado: horno Bago:13 min. a 220°C, 13 segundos al vapor + 5 minutos con compuerta abierta • Cubierta MIWE stone: Programa #1 • Después de hornear, los rollos se enfrían durante 25 minutos antes de pesar y medir el volumen.

Resultados y discusión Fisiología de la fermentación y producción de fosfolipasa La adición de triptona al lote y medio de alimentación de HET0410 dio como resultado una producción más rápida de biomasa y una cantidad final más alta de biomasa en comparación con HET0401-0402. HET0401 y HET0402 son casi idénticos con respecto al desarrollo de la actividad de fosfolipasa, mientras que la productividad de fosfolipasa es significativamente mayor en HET0410.

Cosecha Los fermentos se cosecharon después de 168 horas (HET0401- 0402) y 161 horas (HET0410) de fermentación. El producto se mantuvo a 4°C hasta usarse en las pruebas de horneado. Parte del producto de HET0401 se denominó la muestra 205, y contenía aproximadamente 700 PLU-7/mL. Parte del producto de HET0401 y HET0402 se concentró y se denominó la muestra 206. Este producto contenía aproximadamente 390 PLU-7/mL. La actividad de enzima de la muestra 206 más baja en comparación con el producto final de HET0401 y HET0402, puede ser causada por el almacenamiento y la filtración en estéril. El producto de HET0410 se denominó la muestra 209 y contenía aproximadamente 950 PLU-7/mL.

Caracterización de la enzima y minihorneado La muestra de enzima lipolítica 205 de la fermentación HET0401 se probó en un experimento de minihorneado a dosis diferentes y en comparación con un control y Lipopan F™. El volumen específico de pan de esta prueba de horneado se muestra en el cuadro 11. Una representación del pan se muestra en la figura 11.

CUADR0 11 Enzima lipolítica de Fusaríum heterosporum (muestra 205) en experimentos de mini horneado; efecto sobre el volumen de pan Muestra Dosis, PLU-7 /kg de Volumen de pan, harina mL/g 205 0 3.56 205 200 U/kg 3.98 205 500 U/kg 4.87 205 1000 U/kg 5.05 205 1500 U/kg 5.13 205 2000 U/kg 4.82 205 5000 U/kg 5.05 205 10000 U/kg 4.51 Lipopan F 40 ppm 4.57 Los resultados de horneado confirmaron un efecto muy fuerte de la muestra 205 sobre el mejoramiento del volumen de pan, y el efecto del volumen fue mejor que con Lipopan F™ en una dosis estándar de 40 ppm.

En la figura 11 también se ve que la muestra 205 contribuye a un fuerte mejoramiento en la estructura y color del migajón. Un amasijo completamente esponjado de este experimento de horneado se secó en congelación y se extrajo con butanol saturado con agua, y los lípidos aislados se analizaron por GLC y HPTLC. El análisis de GLC de los lípidos de amasijo (cuadro 12) confirma el efecto hidrolítico de la muestra de enzima lipolítica 205 sobre digalactosildiglicérido (DGDG), concomitantemente con una acumulación de digalactosilmonoglicérido (DGMG). La actividad de la enzima sobre DGMG es muy baja porque la cantidad molar total de DGDG (mmol % = mmol/100 g de amasijo secado en congelación) y DGMG (mmol %) permanece constante a una dosis de enzima mayor (figura 12). Los resultados de GLC también indican una actividad muy baja de la muestra 205 sobre triglicérido.

CUADRO 12 Análisis de GLC de los lípidos del amasijo mmol % = mmol/100 g de amasijo secado en congelación FFA = ácido graso libre. MGMG = monogalactosilmonoglicérido. DGMG digalactosilmonoglicérido. MGDG = monogalactosildiglicérido. DGDG = digalactosildiglicérido. TRI = triglicérido Comparando los resultados del horneado y el análisis de los lípidos es interesante observar que el mejor efecto de horneado no se obtiene con una hidrólisis completa de DGDG a DGMG, sino que los resultados indican que una hidrólisis parcial de DGDG a DGMG puede dar el mejor rendimiento de horneado. La dosis alta de enzima produce más DGMG pero también se produce más ácido graso libre que se espera que dé un efecto de horneado negativo, que podría ser otra explicación del porqué es preferible una hidrólisis sólo parcial de DGDG. El cuadro 13 muestra la proporción de hidrólisis de DGDG y triglicéridos, calculada del cuadro 12. Los resultados ilustran que se obtiene el mejor rendimiento de horneado a una dosis en donde la proporción de actividad de DGDG a triglicéridos es la más grande.

CUADRO 13 Proporción de hidrólisis de DGDG a triglicérido del análisis de GLC de los lípidos del amasijo Algunas de las muestras de lípido también se analizaron por HPTLC como se muestra en la figura 13. Las muestras 4, 5 y 6 son lípidos de amasijo del experimento de horneado. El análisis de HPTLC confirma la hidrólisis de DGDG y la formación de DGMG con la muestra de enzima lipolítica 205. La proporción de actividad relativa de lípido polar : triglicérido del Lipopan F y la muestra 209 usando las pruebas enseñadas anteriormente, es: Fosfolípido/triglicérido (PLU/LIPU) Lipopan F = 3 Muestra 209 = 9 Galactolípido/triglicérido (GLU/LIPU) Lipopan F = 1 Muestra 209 = 4 La enzima lipolítica de Fusarium heterosporum CBS 782.83 dio efectos muy fuertes en experimentos de horneado a miniescala con un fuerte aumento del volumen de pan y mejoramiento de la estructura de migajón. El análisis de lípidos confirma una fuerte actividad hidrolítica sobre DGDG en el amasijo, concomitantemente con la acumulación de DGMG. La enzima lipolítica de Fusarium heterosporum CBS 782.83 mostró baja actividad sobre los triglicéridos en un amasijo.

EJEMPLO 4 Caracterización de la actividad sobre substratos de lípido y especificidad de posición de una enzima lipolítica Fusaríum heterosporum CBS 782.83 expresada en Hansenula polymorpha Una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención de Fusarium heterosporum se expresó en Hansenula polymorpha como se describe en el ejemplo 3.

Procedimientos analíticos La actividad de fosfolipasa se determinó usando la prueba de PLU anteriormente descrita. La actividad de galactolipasa se determinó usando la prueba de galactolipasa anteriormente descrita. La actividad sobre triglicérido (tributirina) se determinó usando la prueba de LIPU anteriormente descrita.

Actividad sobre aceite de girasol (LUSol. pH-stato, pH 6): Reactivos: Se disuelven 8.4 g de goma arábiga en 100 ml de agua desionizada y se le agregan 100 ml de CaCI2 30 mM. Lentamente se le agregan 36 g de aceite de girasol durante el mezclado con un mezclador Turrax (20000 rpm).

Prueba: Se equilibran 20 ml de emulsión de aceite de girasol en un matraz a 30°C durante 5 min. El pH se ajusta a 6.3-6.5 usando un pH-stato.

Se agregan 2 mi de solución de enzima y se agrega continuamente NaOH 0.05 N que mantiene el pH a 6.5 durante 10 minutos. Se calcula la pendiente de la curva para la adición de NaOH 0.05 N en función del tiempo. 1 LUSol se define como la cantidad de enzima que puede liberar 1 µmol de ácido graso por minuto bajo las condiciones de prueba. Se determinó la actividad de la enzima lipolítica sobre diferentes substratos de acuerdo con los procedimientos anteriormente mencionados. Los resultados se muestran en el cuadro 14.

CUADRO 14 Actividad de una enzima lipolítica de Fusaríum heterosporum de acuerdo con la presente invención sobre diferentes substratos de lípido La enzima lipolítica de Fusarium heterosporum expresada en Hansenula polymorpha hidroliza principalmente ácidos grasos en la posición sn-1 de galactolípido y fosfolípidos en el amasijo. La especificidad de la enzima se investigó agregando diferentes concentraciones de la enzima a un amasijo de pan. El amasijo completamente esponjado se congeló y se secó en congelación, y los lípidos del amasijo se extrajeron con butanol saturado con agua.

Los lípidos del amasijo se analizaron por GLC y HPLC. Mediante el análisis de GLC fue posible analizar digalactosildiglicérido (DGDG) y digalactosilmonoglicérido (DGMG). Además, fue posible analizar los isómeros de posición de digalactosilmonoglicérido (1 :diagalactosil-1 -monoglicérido y 2:digalactosil-2-monoglicérido, véanse las estructuras más abajo). Estos componentes se separaron y se cuantificaron por GLC. 1 : R1 = H y R2 = acilo graso 2: R1 = acilo graso y R2 = H OM En una prueba de horneado para la producción de rollos de corteza firme se agregaron diferentes dosis de la enzima lipolítica y se analizaron los galactolípidos en el amasijo completamente esponjado. La cantidad de digalactosilmonoglicéridos isoméricos se muestra en el cuadro 15 y se ilustra gráficamente en la figura 14.

CUADRO 15 Cantidad de digalactosilmonoglicéridos isoméricos en una prueba de horneado usando la enzima lipolítica de Fusaríum heterosporum Dosis de enzima, Digalactosil 2-monoglicérido, Digalactosil 1 -monoglicérido, % basado en el peso seco del % basado en el peso seco del TIPU/kg harina amasijo amasijo 0 0.0102 0.0399 200 0.0092 0.0167 400 0.0071 0.0100 400 0.0067 0.0057 800 0.0103 0.0063 1000 0.0071 0.0060 1200 0.0081 0.0053 1500 0.0064 0.0057 2000 0.0084 0.0047 Conclusión De los resultados del cuadro 15 y la figura 14 se concluye que el digalactosil diglicérido es hidrolizado principalmente en la posición 1 durante la producción de digalactosil 2-monoglicérido. También se observa un pequeño aumento de la cantidad de digalactosil 1 -monoglicérido. Es bien conocido que ocurre la emigración de acilo de la posición 2 a la posición 1 del ácido graso de acilo en los lípidos. Esta emigración de acilo depende de la temperatura y ocurre un equilibro entre digalactosil-2-monoglicérido y digalactosil 1-monoglicérido en función del tiempo. Este fenómeno explica el hecho de que también se observa un pequeño aumento de digalactosil 1 -monoglicérido.

EJEMPLO 5 Determinación de la temperatura óptima y estabilidad de la enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum La actividad enzimática de la enzima lipolítica secada por aspersión derivada de F. heterosporum y expresada en Hansenula polymorpha, se determinó a varias temperaturas de acuerdo con PLU-7 con las modificaciones que se describen más abajo. El substrato era una emulsión de 0.6% de fosfatidilcolina, 0.4% de Tritón X-100, 6 mM de CaCI2 y 50 mM de HEPES, pH 7.0. El fermento de enzima lipolítica secado por aspersión se diluyó con agua desmineralizada a 3 TIPU/ml. Se estabilizaron térmicamente 400 µl de substrato durante 5 minutos a 10, 20, 30, 40, 50, 45, 50 y 60°C, y se agregaron 50 µl de muestra. Después de exactamente 10 minutos, la acción enzimática se detuvo por incubación a 99°C por otros 10 minutos. Finalmente se determinó la cantidad de ácidos grasos libres según el método de NEFA C (Wako Chemicals GMBH, Neuss, Alemania). El reactivo de color A y B se hizo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se pipetearon 10 µl de lípido extraído redispersado y 100 µl del reactivo A, a una placa de microtítulo que se incubó a 37°C durante 10 minutos. Se agregaron 200 µl del reactivo B a la placa de microtítulo y esta se incubó a 37°C durante 10 minutos. Se midió la densidad óptica a 540 nm. Se determinó la cantidad de ácido graso libre usando la absorbancia leída y una curva patrón basada en ácido oleico. Los resultados se muestran en la figura 15.

La estabilidad enzimática del fermento de la enzima lipolítica secada por aspersión se determinó a varias temperaturas. El fermento de la enzima lipolítica secada por aspersión se diluyó con amortiguador de fosfato 50 mM, pH 7.0 a 3 TIPU/ml. Después de 30 minutos de incubación a 20, 30, 37, 40 y 45°C, la muestra se guardó sobre hielo. Subsiguientemente se determinó la actividad de fosfolipasa de acuerdo con PLU-7 con las modificaciones que se describen abajo. El substrato era una emulsión de 0.6% de fosfatidilcolina, 0.4% de Tritón X-100, y 50 mM de amortiguador de fosfato. Se dejó fuera el CaCI2 para impedir la precipitación del fosfato de calcio y no afectar la actividad de la enzima. Se estabilizaron térmicamente 400 µl de substrato durante 5 minutos a 37°C y se le agregaron 50 µl de muestra. Después de exactamente 10 minutos, la actividad enzimática se detuvo por incubación a 99°C durante otros 10 minutos. Finalmente se determinó la cantidad de ácidos grasos libres según el método de NEFA C (Wako Chemicals GMBH, Neuss, Alemania). Los reactivos de color A y B se hicieron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se pipetearon 10 µl de lípido extraído redispersado y 100 µl del reactivo A, a una placa de microtítulo que se incubó a 37°C durante 10 minutos. Se agregaron 200 µl del reactivo B a la placa de microtítulo y esta se incubó a 37°C durante 10 minutos. Se midió la densidad óptica a 540 nm. La cantidad de ácido graso libre se determinó usando la absorbancia leída y una curva patrón basada en ácido oleico. Los resultados se muestran en la figura 16.

EJEMPLO 6 Determinación del pH óptimo y la estabilidad de una enzima lipolítica derivada de Fusaríum heterosporum La actividad de una enzima lipolítica secada por aspersión, derivada de F. heterosporum y expresada en Hansenula polymorpha, se determinó a varios valores de pH. El substrato era una emulsión de 0.6% de fosfatidilcolina, 0.4% de Tritón X-100, y amortiguador de fosfato 50 mM, pH 4.0, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 y 10.0. Se dejó fuera el CaCI2 para impedir la precipitación de fosfato de calcio y no afecta la actividad de la enzima. El fermento de la enzima lipolítica secada por aspersión se diluyó con agua desmineralizada a 3 TIPU/ml. Se estabilizaron térmicamente 400 µl de substrato durante 5 minutos a 37°C y se le agregaron 50 µl de la muestra. Después de exactamente 10 minutos, la actividad enzimática se detuvo por incubación a 99°C durante otros 10 minutos. Finalmente se determinó la cantidad de ácidos grasos libres mediante el método de NEFA C (Wako Chemicals GMbH, Neuss, Alemania). Los reactivos de color A y B se hicieron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se pipetearon 10 µl de lípido extraído redispersado y 100 µl del reactivo A, a una placa de microtítulo, y esta se incubó a 37°C durante 10 minutos. Se agregaron a la placa de microtítulo 200 µl del reactivo B y la placa se incubó a 37°C durante 10 minutos. Se midió la densidad óptica a 540 nm. Se determinó la cantidad de ácido graso libre usando la absorbancia leída y una curva patrón basada en ácido oleico. Los resultados se muestran en la figura 17. La estabilidad del fermento de la enzima lipolítica secado por aspersión se determinó a varios valores de pH. El fermento de enzima lipolítica secado por aspersión se diluyó con amortiguador de fosfato 50 mM a pH 4.0, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 y 10.0, a 3 TIPU/ml. Después de 30 minutos de incubación a 37 °C, la muestra se guardó sobre hielo. Subsiguientemente, la actividad de fosfolipasa se determinó de acuerdo con PLU-7 con las modificaciones que se describen abajo. El substrato era una emulsión de 0.6% de fosfatidilcolina, 0.4% de Tritón X-100, y amortiguador de fosfato 50 mM, pH 7. Se dejó fuera el CaCI2 para impedir la precipitación de fosfato de calcio y no afecta la actividad de la enzima. Se estabilizaron térmicamente 400 µl de substrato durante 5 minutos a 37°C y se le agregaron 50 µl de la muestra. Después de exactamente 10 minutos, la actividad enzimática se detuvo por incubación a 99°C durante otros 10 minutos. Finalmente se determinó la cantidad de ácidos grasos libres mediante el método de NEFA C (Wako Chemicals GMbH, Neuss, Alemania). Los reactivos de color A y B se hicieron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se pipetearon 10 µl de lípido extraído redispersado y 100 µl del reactivo A, a una placa de microtítulo, y esta se incubó a 37°C durante 10 minutos. Se agregaron a la placa de microtítulo 200 µl del reactivo B y la placa se incubó a 37°C durante 10 minutos. Se midió la densidad óptica a 540 nm. Se determinó la cantidad de ácido graso libre usando la absorbancia leída y una curva patrón basada en ácido oleico. Los resultados se muestran en la figura 18.

EJEMPLO 7 Determinación del peso molecular de la enzima lipolítica pura derivada de Fusarium heterosporum La enzima lipolítica pura de acuerdo con la presente invención, derivada de Fusarium heterosporum, se corrió en un gel SDS-PAGE, figuras 19A y 19B. El peso molecular se calculó como se muestra en el cuadro 16 en función del marcador estándar Novex.

CUADRO 16 Determinación del peso molecular de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención Muestra Rf Mw Log M Cálculos (kDa) 0.91 3.0 0.48 Log Mw (kDa)= -5.30 RfJ + 7.50 R 5.00'Rf + 2.7986 0.82 6.0 0.78 r2 = 0.9989 0.71 14 1.15 Estándar 0.66 17 1.23 Novex 0.55 28 1.45 0.47 38 1.58 0.38 49 1.69 0.31 62 1.79 0.23 98 1.99 0.13 188 2.27 Enzima lipolítica de 0.52 Log Mw = -5.300.52J + 7.500.52z - acuerdo con la 5.000.52 + 2.80-presente invención => Mw = 29.9 kDa El peso calculado de la enzima lipolítica fue de 29.9 kDa.

EJEMPLO 8 Determinación del punto isoeléctrico (pl) de la enzima lipolítica derivada de Fusaríum heterosporum El punto isoeléctrico (pl) de una enzima lipolítica derivada de F. heterosporum se determinó teóricamente en función de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:6. El cálculo se hizo usando el software Vector NTI suite 9 de Informax (Invitrogen, California, E.U.A.) y resultó un pl de 6.40.

EJEMPLO 9 Caracterización de la conversión enzimática de lecitina en lisolecitina en yema de huevo a diferentes temperaturas con una enzima lipolítica de Fusaríum heterosporum CBS 782.83 Las enzimas lipolíticas pueden convertir la lecitina (fosfatidilcolina) en lisolecitina (lisofosfatidilcolina) con liberación de un ácido graso libre. La conversión enzimática de la lecitina en lisolecitina en la yema de huevo crea mejores propiedades emulsionantes porque la lisolecitina es un mejor emulsionante que la lecitina. Es importante que las yemas de huevo tengan buenas propiedades emulsionantes para preparar mayonesa estable al calor y otros alimentos, y para aplicaciones alimentarias como por ejemplo, sin limitación, pastelería y maduración de quesos.

Preparación de la enzima Una enzima lipolítica de Fusarium heterosporum, CBS 782.83, expresada en Hansenula polymorpha de la fermentación HET0420, se secó por aspersión en almidón de trigo. La preparación enzimática resultante tenía una actividad de fosfolipasa de 1265 U/g, determinada en una prueba TIPU, anteriormente descrita. Se preparó una solución de abastecimiento de enzima al 10% (p/v) o 20% (p/v), disolviendo el polvo de enzima secado por aspersión en agua desmineralizada. Después de 15 minutos de agitación, la solución se centrifugó durante cinco minutos a 1370 x g. El sobrenadante se usó como la solución de abastecimiento de enzima.

Acción enzimática Se prepararon dos experimentos diferentes para determinar la combinación óptima de dosis de enzima, temperatura de reacción y tiempo de conversión enzimática de lecitina en lisolecitina en la yema de huevo. En primer lugar, la acción enzimática se realizó con una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención a las siguientes temperaturas: 30 °C, 40 °C y 50 °C, cada una con las siguientes dosis: 5 U/g de yema de huevo, 10 U/g de yema de huevo, 20 U/g de yema de huevo, y 30 U/g de yema de huevo. En el segundo experimento, la acción enzimática se realizó con una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención y con Lecitase® Ultra de Novozymes A/S (Dinamarca), respectivamente, a las siguientes temperaturas: 5 °C, 100 °C, 15 °C, 20 °C y 53 °C, con una dosis de enzima de 30 U/g de yema de huevo. También se probó la dosis de enzima de 60 U/g de yema de huevo a 53 °C. En ambos experimentos se transfirieron 10.0 g de yema de huevo pasteurizada de Dan/Eg (Christiansfeld, Dinamarca) a un tubo de Wheaton y se pusieron en un plancha de calentamiento estabilizada a la temperatura adecuada. Las muestras se mezclaron continuamente en un agitador magnético. Al tiempo t=0 la solución de abastecimiento de enzima se agregó a la yema de huevo de acuerdo con el cuadro 17. Cada experimento se hizo por duplicado. Se tomaron muestras de 1.0 g de las soluciones de yema de huevo/enzima de acuerdo con el cuadro 18. Después de los tiempos de incubación de acuerdo con el cuadro 18, se detuvo la reacción enzimática en las muestras agregando 7.5 ml de disolvente orgánico (CHCI3:MeOH, 2:1 ).

CUADRO 17 Adición de la solución de abastecimiento de enzima a la yema de huevo Muestra Cantidad de Actividad de Actividad Volumen Volumen yema de la enzima enzimática agregado de la agregado de huevo de la sol. de sol. de abast. de H20 desm. abast. enzima Control 10.0 g 0 U - O ml 2.35 ml 10.0 g 50 U 127 U/ml 0.40 ml 1.95 ml Enzima 10.0 g 100 U 127 U/ml 0.80 ml 1.55 ml lipolítica 10.0 g 200 U 127 U/ml 1.60 ml 0.75 ml 10.0 g 300 U 127 U/ml 2.35 ml O ml 10.0 g 600 U 253 U/ml 2.35 ml O ml Lecitase® 10.0 g 300 U 3620 U/ml 83 µl 2.25 ml Ultra 10.0 g 300 U 3620 U/ml 165 µl 2.20 ml La solución de abastecimiento de enzima se agregó a la yema de huevo a modo de obtener diferentes dosificaciones de enzima, incluyendo un control. Para compensar cualquier diferencia de volumen tras la adición de diferentes volúmenes de solución de abastecimiento de enzima, se agregó agua desmineralizada hasta un total de 2.35 ml.

CUADRO 18 Tiempos de reacción a la extracción de muestra en los diferentes experimentos Temperatura de reacción Dosis de enzima Tiempo de reacción 5 °C, 10 °C, 15 °C, 20 °C 30 U/g 60 120 240 360 480 1440 - 30 °C 5, 10, 20 y 30 U/g 30 60 120 240 360 - 40 °C 5, 10, 20 y 30 U/g 30 60 120 240 360 - 50 °C 5, 10, 20 y 30 U/g 30 60 120 240 360 - 53 °C 30 U/g 15 30 60 90 120 240 53 °C 60 U/g 15 30 60 90 120 240 330 Extracción de lípido La adición de 7.5 ml de disolvente orgánico a la muestra (CHCI3:MeOH, 2:1 ) no solo detuvo la reacción enzimática sino que además extrajo los lípidos. Además, se agregaron a la muestra 0.2 mi de H20 desmineralizada antes de dispersarla, usando un mezclador de Whirley, durante 1 minuto. Después, la muestra se centrifugó durante diez minutos a 1 10 x g. Aproximadamente 3 ml de la fase orgánica se transfirieron a otro tubo y este lípido extraído se usó para varios análisis. Las muestras se guardaron a -18 °C.

Determinación de ácidos grasos libres: Se evaporaron 100 µl de solución de lípido extraído bajo nitrógeno a 50 °C. Se le agregó 1.0 ml de H20 desmineralizada y el lípido se dispersó usando un mezclador de Whlrley. La cantidad de ácido graso libre se determinó usando el equipo NEFA C de WAKO Chemicals GMbH (Neuss, Alemania). Los reactivos de color A y B se hicieron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se pipetearon 10 µl de lípido extraído redispersado y 100 µl de la solución A, a una placa de microtítulo. La placa se incubó a 37°C durante 15 minutos. Se agregaron a la placa de microtítulo 200 µl de la solución B y la placa se incubó a 37°C durante 10 minutos. Se midió la densidad óptica a 540 nm. Se determinó la cantidad de ácido graso libre usando la absorbancia leída y una curva patrón basada en ácido oleico.

Determinación de lecitina y lisolecitina por medio de LC/MS-MS: Materiales: Acetona, metanol y cloroformo de Lab Sean, Dublin, Irlanda; etanol al 96% de De Danske Spritfabrikker; y ácido fórmico de AppliChem, Darmstadt, Alemania.

Instrumentación: El sistema de HPLC consistió de una bomba cuaternaria (G1311A), una bomba capilar (G1376A), un automuestreador (G1377A), y un compartimiento de columna (G1316A), todos de Agilent Technologies (Waldbronn, Alemania). Se usó un divisor de flujo Acurate™ (ACM-CU-CR) de LC Packings (Amsterdam, Países Bajos) para dividir el efluente de la columna hacia el espectrómetro de masa y para introducir disolvente polar de compensación. El espectrómetro de masa fue un LCQ Deca Ion Trap de Thermo Finnigan (San José, California, E.U.A.). La columna era una Hypersil Si, d.i. 100 x 4.6 mm, 5µm, de Thermo Hypersil-Keystone.

Condiciones de la cromatografía y la MS Fases móviles A: -no utilizada B: Cloroformo C: Metanol /ácido fórmico (1000/0.190) D: Cloroformo/metanol/agua/ácido fórmico (300/550/150/0.190) Disolvente de compensación: Etanol al 96% Flujo fml/minj Tiempo [min] B [%] C [%] D [%] 0.6 0 40 60 0 0.6 2 0 0 100 0.6 8 0 0 100 0.6 9 40 60 0 0.6 16 40 60 0 El volumen de la inyección fue de 5 µl, y la temperatura de la columna fue de 45 °C Divisor de flujo (véase la figura 44) Flujo de LC: 0.60 ml/min Flujo de compensación: 100 µl/min Tubería ELSD/FC: d.i. 100 cm x 0.100 mm (SS) Tubería MS: 100 cm x 150 µm (FS-150-MS) La división aproximada es de 20:1.

Condiciones de MS Ajustes de los parámetros de MS: Parámetro Valor Temp. Capilar [°C] 325 Flujo de gas de camisa 70 Flujo de gas auxiliar 4 Fuente ESI Polaridad Positiva Voltaje de fuente [kV] 6.0 Micro barridos SIM 5 Tiempo de ion. Max. SIM [ms] 200 Ajuste del detector de MS: Parámetro Valor Duración [min] 15 Método de ajuste LPC 544 SIM OO.LCQTune Evento de barrido 1- Escalas SIM Intervalo de masa LPC (16:0) - H" 494.0 - 498.0 LPC (18:2) - H+ 517.0 - 527.0; 541.0 - 549.0 PC (34:2) - H+ 778.0 - 786.0 PC (36:4) - H+ 801.0 - 813.0 Preparación del estándar y la muestra La lisofosfatidilcolina (LPC) (huevo, pollo) (89865) y la fosfatidilcolina (PC) (planta) (441601 ) eran de Avanti Polar Lipid, Inc, Alabaster, Alabama, E.U.A. Se preparó una solución de abastecimiento de PC y LPC (10 mg/20 ml CHCI3/MeOH). Se prepararon diluciones de las mismas para cubrir concentraciones de 50 µg/ml a 2.5 µg/ml. Se reconstituyeron 7.5 µl de extracto de lípido de 1 g de yema de huevo en 1.5 ml de CHCI3:MeOH (1:1 ).

Análisis de TLC: El análisis de TLC se efectuó como se describe en el ejemplo 1.

Para visualizar los diferentes glicéridos se aplicaron 2 µl de extracto de lípido en bandas de 3 mm a una placa de HPTLC de sílice 60 (Merck) por medio de un muestreador automático de TLC 4 (CAMAG). La placa de sílice se puso en una cámara de desarrollo horizontal (CAMAG) con amortiguador de desarrollo I (P-éter : éter metil-ter-butílico : ácido acético (50:50:1 )). Se usaron 20 ml de amortiguador de desarrollo para la fase de gas y 5 ml para la continua, y la placa se eluyó hasta aproximadamente 5 cm de la posición de aplicación. La placa se secó en un soporte de calentamiento (160 °C) durante 5 minutos. Finalmente, la placa de TLC se sumergió en el reactivo revelador (Cu(CH3COO)2 al 6% en H3P04 acuoso al 16%) y se carbonizó en un soporte de calentamiento (160 °C) durante 10 minutos.

Resultados Para determinar la combinación óptima de dosis de enzima, temperatura de reacción y tiempo de la conversión enzimática de lecitina a lisolecitina en la yema de huevo, se probaron cuatro dosis diferentes de enzima a tres temperaturas diferentes y cinco tiempos de reacción diferentes. Las cuatro dosis de enzima usadas, 5 U/g, 10 U/g, 20 U/g y 30 U/g, así como los tiempos de reacción usados, 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos, 240 minutos, y 360 minutos, se basan en pruebas iniciales no cubiertas en la presente. Las tres temperaturas, 30°C, 40°C y 50°C, se eligieron basándose en la curva de temperatura óptima para la enzima lipolítica; véase la figura 20. La cantidad de lecitina y lisolecitina en la yema de huevo modificada con enzima se analizó por HPLC, y se representa en las figuras 21A-21C y las figuras 22A-22C en función del tiempo de reacción. En las figuras 23A-23C se representa la cantidad de ácido graso libre en la yema de huevo modificada con enzima en función del tiempo de reacción. El experimento muestra que la conversión de lecitina a lisolecitina con una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención, fue óptima usando 20 U de la enzima lipolítica /g de yema de huevo a 30 °C durante 120 minutos. La dosis de 20 U/g de yema de huevo se eligió debido a una reducción observada de la concentración de LPC a 30 U/g de yema de huevo, de 120 minutos de reacción a 240 minutos de reacción. Basándose en este resultado, se examinó si la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención y Lecitase® Ultra tienen un efecto sobre los lípidos de la yema de huevo a temperaturas menores de 30 °C, y para comparar sus actividades a 53 °C, que es la temperatura usada actualmente en la industria para Lecitase® Ultra. La conversión enzimática de lecitina en lisolecitina en la yema de huevo se probó a cinco temperaturas diferentes (5°C, 10°C, 15°C, 20°C y 53°C) y seis tiempos de reacción diferentes. Se probó una dosis de enzima de 30 U/g de yema de huevo porque esta sería la dosis de interés comercial más alta debido al costo de la enzima, y porque se esperaba que las velocidades de reacción fueran bajas a las temperaturas probadas. Todas las unidades de enzima mencionadas se determinaron por TIPU. También, la dosis recomendada de Lecitase® Ultra es de 30 U/g de yema de huevo. Además, se probó una dosis de 60 U/g de yema de huevo a 53 °C. Los tiempos de reacción usados fueron de 60 minutos, 120 minutos, 240 minutos y 360 minutos, y 480 minutos y 1440 minutos. Sin embargo, a 53 °C los tiempos de reacción fueron de 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 90 minutos, y 120 minutos y 240 minutos. También se tomó una muestra a 330 minutos de reacción a 53 °C usando 60 U/g. En las figuras 24A-24C y 25A-25C se representa la cantidad de lisolecitina, ácido graso libre y iecitina en la yema de huevo modificada con enzima, en función del tiempo de reacción, usando la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención y fosfolipasas Lecitase® Ultra, respectivamente. El contenido de lecitina y lisolecitina de las muestras se determinó por LC-MS y el contenido de ácido graso libre se determinó mediante el método NEFA C. La cantidad de FFA en las muestras de control (resultados no mostrados) y la suma de lisolecitina y lecitina permanecieron constantes durante los experimentos mostrados en las figuras 24A-24C y 25A- 25C. Las figuras 24A-24C muestran los resultados de la acción enzimática de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en la yema de huevo. A 53 °C, la actividad de la enzima lipolítica terminó después de 30 minutos de reacción, alcanzando una concentración de LPC de 1.7% (p/p) con 30 U/g de yema de huevo (figura 24B). Las concentraciones de FFA fueron de 1.0% (p/p) y 1.3% (p/p) con 30 U/g de yema de huevo y 60 U/g de yema de huevo, respectivamente. Usando Lecitase® Ultra, las cantidades de LPC y FFA aumentaron durante el período de 15-240 minutos (figura 19), produciendo 2.7% de LPC (p/p) después de 240 minutos de reacción con 30 U/g de yema de huevo. Las concentraciones de FFA fueron 1.4% (p/p) y 2.1 % (p/p) después de 240 minutos de reacción, usando 30 y 60 U/g de yema de huevo, respectivamente. La actividad de Lecitase® Ultra terminó después de 330 minutos de reacción usando 60 U/g de yema de huevo. La enzima lipolítica de la presente invención tuvo una velocidad de reacción inicial más alta que la Lecitase® Ultra. A 20 °C y 53 °C, las velocidades de reacción iniciales fueron similares con la enzima lipolítica de la presente invención (figuras 24A-24C). A temperaturas de 5-20 °C, la cantidad de LPC y FFA aumentó durante el experimento. Aunque a temperaturas menores de 20 °C la velocidad inicial disminuyó notablemente, a 20 °C se alcanzó una concentración de LPC de 3.3% (p/p) y una concentración de FFA de 1.6% (p/p) después de 60 minutos de reacción, con 30 U/g de yema de huevo. Esta concentración fue similar a 240 minutos de reacción a 53 °C con Lecitase® Ultra. No fue posible resuspender el extracto de lípido libre de disolvente para el análisis de FFA después de 1440 minutos de reacción a 20 °C. Después de 1440 minutos a 5 °C y 10 °C, las muestras con la enzima lipolítica tuvieron una viscosidad alta que hizo imposible la agitación. Esto se debió muy probablemente a la cristalización del FFA. La disminución de las concentraciones de LPC que se observó en TN 6642 a 30 U/g de yema de huevo a 30 °C, de 120 a 240 minutos de reacción, no se observó en ninguno de estos experimentos. La acción enzimática de la fosfolipasa Lecitase® Ultra en la yema de huevo da velocidades iniciales significativamente decrecientes a temperaturas de 20 °C y menores, en comparación con la velocidad inicial de Lecitase® Ultra a 54 °C (figuras 25A-25C). A 20 °C se alcanzó una concentración de LPC de 3.0% (p/p) y una concentración de FFA de 1.5% (p/p) después de 1440 minutos de reacción con 30 U/g de yema de huevo. Esta concentración fue similar a 240 minutos de reacción a 53 °C. La figura 26 muestra el análisis de TLC de lípido extraído de la yema de huevo modificada con enzima. Este análisis confirmó los resultados de LC-MS y mostró que la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención y la fosfolipasa Lecitase® Ultra aumentan la cantidad de lisolecitina. La reacción enzimática, que es catalizada por las enzimas lipolíticas, produce cantidades equivalentes de lisolecitina y ácidos grasos libres. Una posible y no deseada reacción secundaria es la hidrólisis de triacilglicéridos. La relación entre el cambio de cantidad de lisolecitina y ácidos grasos libres durante la reacción enzimática se muestra en la figura 27. Con la Lecitase® Ultra hay una buena correlación entre la formación equivalente de lisolecitina y ácidos grasos libres (figura 27). Sin embargo, en la mayoría de las muestras tratadas con Lecitase® Ultra hubo muy poca reacción. La acción de la enzima lipolítica de la presente invención en la yema de huevo resulta en la producción de más de un ácido graso libre por lisolecitina, formado a concentraciones de lisolecitina superiores a 40 mM y concentraciones de ácido graso libre superiores a 60 mM. La conversión máxima con Lecitase® Ultra es de 30 mM de lisolecitina y 25 mM de ácido graso libre. Las muestras con una proporción de ácido graso libre a lisolecitina menor de 0.8 o mayor de 1.2 (n/n), y con contenido de LPC mayor de 1.0% (p/p), se muestran en el cuadro 19.

CUADRO 19 Muestras con proporciones de ácido graso libre (FFA) a lisolecitina (LPC) menores de 0.8 o mayores de 1.2 (n/n), y contenido de LPC mayor de 1% (p/p).

Enzima Temp. Tiempo de ?FFA/ %LPC %FFA % PC (°C) reacción ?LPC (P/P) (P/P) (P/P) (min) (n/n) Enzima lipolítica 5 1440 1.99 3.0 2.9 2.0 Enzima lipolítica 10 480 1.97 2.3 2.3 2.5 Enzima lipolítica 15 480 1.48 4.1 3.5 0.6 Enzima lipolítica 15 360 1.64 3.6 3.4 1.0 Enzima lipolítica 15 1440 1.98 4.2 4.7 0.1 Enzima lipolítica 20 60 0.67 3.3 1.6 2.0 Enzima lipolítica 20 360 1.30 4.7 3.6 0.3 Enzima lipolítica 20 480 1.43 5.0 4.1 0.3 Lecitase® Ultra 20 1440 0.72 3.0 1.5 2.0 Enzima lipolítica 53 15 0.69 1.5 0.9 3.7 Enzima lipolítica 53 60 0.70 1.7 1.0 2.6 Enzima lipolítica 53 90 - 0.71 1.8 1.0 2.7 Enzima lipolítica 53 240 0.72 1.7 1.0 2.8 Enzima lipolítica 53 30 0.72 1.8 1.0 3.0 Lecitase® Ultra 53 120 0.61 2.4 1.1 2.3 Leciíase® Ultra 53 60 0.62 1.6 0.9 2.9 Las muestras se trataron con enzima lipolítica o Lecitase® Ultra. El FFA se determinó mediante el método NEFA C. La LPC y la PC se determinaron por LC-MS. Generalmente se observan muestras con una proporción de ácido graso libre a lisolecitina mayor de 1.2 (n/n) y un contenido de LPC mayor de 1.0% (p/p) (figura 27), a tiempos de reacción prolongados, o en muestras que contienen menos de 1.0% de PC (p/p). Con la enzima lipolítica a 15 °C se observaron proporciones elevadas de ácido graso libre a lisolecitina en todas las muestras. Esto indica que las enzimas cambian de especificidad de substrato a tiempos de reacción prolongados o cuando el contenido de PC es bajo. Esto se podría deber a la hidrólisis de fosfatidiletanolamina, digalactosil diacilglicérido o triacilaglicéridos que se encuentran en la yema de huevo. Generalmente se observan muestras con una proporción de ácido graso libre a lisolecitina menor de 0.8 (n/n) y un contenido de LPC mayor de 1.0% (p/p), a una temperatura de reacción de 53 °C (cuadro 18). Esto se podría explicar por interesterificaciones. La figura 28 muestra que la enzima lipolítica de la presente invención no tiene actividad hidrolítica sobre triacilglicéridos ni 1 ,3-diacilglicéridos, a tiempos de reacción prolongados ni a concentraciones bajas de PC. La acumulación de 1 ,2-diacilglicéridos muestra que la actividad de la lipasa es 1 ,3-específica. La formación de monogiicéridos muestra que la Lecitase® Ultra tuvo un efecto hidrolítico sobre tri- o diacilglicéridos a 20 °C. No es posible determinar si la enzima lipolítica de la presente ¡nvención o la fosfolipasa Lecitase® Ultra tiene un grado más alto de hidrólisis de triacilglicéridos, porque el grado de formación de LPC difiere significativamente. La disminución de la dosis de enzima y el tiempo de reacción de la enzima lipolítica podría reducir la hidrólisis. El cuadro 18A muestra el tiempo de reacción, la temperatura y la dosis aplicada a los sujetos de los carriles 1-30 de la figura 28.

CUADRO 19A Para el experto en la materia será evidente que usando experimentación de rutina se puede optimizar fácilmente la dosis de enzima, la temperatura de reacción y el tiempo de reacción para cualquier aplicación alimentaria dada.

Conclusión Se probó la acción enzimática de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención y fosfolipasas Lecitase® Ultra sobre yema de huevo de DanAEg A/S, para determinar la conversión de lecitina en lisolecitina. Esto se hizo usando una dosis de enzima de 30 U/g de yema de huevo a cinco temperaturas (5-20 °C y 53 °C), y seis tiempos de reacción diferentes (60-1440 minutos), sin embargo se efectuó a 53 °C y 15-240 min para examinar la actividad de la enzima. Actualmente la temperatura usada en la industria para modificar la yema de huevo con Lecitase® Ultra es de 53 °C. La enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención tuvo una velocidad de reacción inicial más alta que la Lecitase® Ultra a todas las temperaturas probadas. A 53 °C la reacción con la enzima lipolítica terminó después de solo 30 minutos de reacción. A una dosis de 30 U/g de yema de huevo a 53 °C, la concentración de LPC fue de 1.7% y 2.7% (p/p) con la enzima lipolítica y la Lecitase® Ultra, respectivamente. Se alcanzó una concentración de 3.3% (p/p) de LPC después de solo 60 minutos de reacción a 20 °C con la enzima lipolítica. A temperaturas bajas (5-20 °C), la conversión de lecitina en lisolecitina fue significativamente mejor con la enzima lipolítica que con ia Lecitase® Ultra. La velocidad de reacción de la enzima lipolítica fue notablemente más baja a 10 °C y menos, en comparación con 15 °C y más. La enzima lipolítica fue activa a 5 °C y la formación de más de 2% (p/p) de lisolecitina fue detectable después de 24 horas de reacción. También, las muestras con la enzima lipolítica fueron más viscosas a una temperatura de 10 °C y menor, en comparación con temperaturas más altas. Se encontró que, a tiempos de reacción prolongados o cuando el contenido de PC es bajo, la enzima lípolítica cambia de especificidad de substrato e hidroliza fosfatidiletanolamina, digalactosil diacilglicérido o triacilglicéridos, además de los fosfolípidos. Esto se puede evitar usando una dosis más baja de enzima y menores tiempos de reacción y justifica la necesidad de optimizar completamente las condiciones de tratamiento para cada producto en cuestión. A 53 °C las interesterificaciones pueden explicar que se produce menos de un equivalente de ácido graso libre por lisolecitina con la enzima lipolítica y la Lecitase® Ultra. En conclusión, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención es un candidato potencial para la acción enzimática de la yema de huevo a temperaturas bajas. La actividad observada a temperaturas bajas también es de interés en otras aplicaciones.

EJEMPL0 10 Producción de mayonesa usando una enzima lipolítica de Fusaríum heterosporum CBS 782.83 Producción de la mayonesa: Se disolvieron 6.25 g de la enzima lipolítica preparada como se describe en el ejemplo 4 en 50 mL de H20 desmineralizada, que corresponde a una actividad de fosfolipasa de 150 U/mL. Después de 15 minutos de agitación, la solución se centrifugó cinco minutos a 1370 x g. El sobrenadante se usó para la acción enzimática sobre 150 g de yema de huevo de Sanofa A/S de acuerdo con el cuadro 20. Otros 150 g de yema de huevo de Sanofa A/S se trataron con Lecitase® Ultra (Novozymes A/S, Dinamarca) de acuerdo con el cuadro. La acción enzimática se efectuó a 30 °C durante 180 minutos con agitación lenta. El lípido se extrajo como se describe en el ejemplo 4.

CUADRO 20 Acción enzimática de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención y Lecitase® Ultra sobre la yema de huevo de Sanofa A/S La solución de enzima lipolítica usada tenía una actividad de 150 U/mL y la Lecitase® Ultra tenía una actividad de fosfolipasa de 34500 U/mL. La mayonesa con yema de huevo de Sanofa A/S modificada con enzima fue producida usando un mezclador Koruma (Disho V60/10). Durante el procesamiento, la mayonesa se calentó a 95 °C durante cinco minutos.

CUADRO 21 Ingredientes usados para producir la mayonesa Análisis de TLC: El análisis de TLC se efectuó como se describe arriba.

Determinación del tamaño de partícula en la mayonesa: Se disolvieron 2.0 g de muestra de la mayonesa en 22.5 g de SDS al 0.2% y esto se agitó un mínimo de 30 minutos a 300 rpm. La distribución del tamaño de partícula se midió entonces en un Malvern Masterizer.

Resultados Para producir la mayonesa con yema de huevo modificada con enzima, se usó yema de huevo de Sanofa A/S. Esta yema de huevo contenía 8% de sal (a diferencia de 0% en la yema de huevo de DanAEg). Pruebas iniciales (no mostradas) mostraron que la concentración de sal más alta en la yema de huevo de Sanofa A/S afecta la actividad lipolítica, y por lo tanto se usó una dosis de enzima de 30 U/g en lugar de 20 U/g. El análisis de TLC del lípido extraído de la yema de huevo de Sanofa A/S modificada con enzima (figura 29), mostró que la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención redujo la cantidad de lecitina concurrentemente con un aumento de la cantidad de lisolecitina (figura 29). En cambio, cuando se usa Lecitase® Ultra la conversión de lecitina en lisolecitina fue despreciable. La alta conversión de lecitina en lisolecitina mostrada por la TLC se correlaciona bien con la determinación de ácido graso libre hecha en el lípido extraído de la yema de huevo modificada con enzima de Sanofa A/S (cuadro 22). La cantidad de ácido graso libre liberado usando la enzima lipolítica fue 3.5 veces más alta que la cantidad de ácido graso libre liberado usando la Lecitase® Ultra.

CUADRO 22 Cantidad de ácido graso libre en la yema de huevo modificada con enzima de Sanofa A/S La cantidad de ácido graso libre se analizó con el método NEFA C y se expresa como porcentaje de yema de huevo. Se analizó la distribución del tamaño de las gotitas de aceite en la mayonesa para evaluar las propiedades emulsionantes de la yema de huevo Sanofa A/S modificada diferentemente con enzima. Como puede verse, la mayonesa producida con yema de huevo tratada con la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención, tuvo el tamaño de partícula medio más pequeño, y también una distribución de tamaño de partícula más estrecha en comparación con la mayonesa producida con yema de huevo tratada con Lecitase® Ultra o yema de huevo no tratada. Un tamaño de partícula medio pequeño y también una distribución de tamaño de partícula estrecha, indican buenas propiedades emulsionantes; por lo tanto, la yema de huevo modificada con la enzima lipolítica tuvo las mejores propiedades emulsionantes.

CUADRO 23 Distribución del tamaño de partícula en la mayonesa hecha con la yema de huevo Sanofa A/S modificada con enzima Para evaluar la estabilidad frente al calor de las emulsiones hechas con la yema de huevo Sanofa A/S modificada con enzima, las mayonesas se calentaron en un horno de microondas durante 4 segundos. Como puede verse en la figura 30, la mayonesa que contiene la yema de huevo modificada con enzima produjo emulsiones estables al calor, mientras que el control que contenía la yema de huevo no tratada se separó por el calor en el horno de microondas, y por lo tanto la emulsión no fue estable al calor.

Conclusión Se correlacionan bien los resultados del análisis de TLC y la determinación del ácido graso libre de la yema de huevo Sanofa A/S modificada con enzima, y la prueba de distribución de tamaño de partícula y estabilidad frente al calor de las mayonesas producidas con la yema de huevo Sanofa A/S modificada con enzima. La yema de huevo modificada con una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención tuvo la velocidad de conversión más alta de lecitina a lisolecitina, y la cantidad más alta de ácido graso libre. Como se esperaba, este cambio en la proporción de lecitína:lisolec¡tina resultó en una mayonesa estable al calor y que tenía la distribución óptima del tamaño de partícula. El uso de la Lecitase® Ultra para modificar la yema de huevo de Sanofa A/S no resulta en un cambio muy grande en la proporción de lecitina:lisolecitina, ni tampoco en una cantidad alta de ácidos grasos libres. Esta conversión menos pronunciada de lecitina en lisolecitina se reflejó en la distribución del tamaño de partícula de la mayonesa, que fue similar a la yema de huevo no modificada. Sin embargo, el cambio en la proporción de lec¡tina:l¡solecit¡na que ocurrió usando Lecitase® Ultra fue suficiente para hacer la mayonesa estable al calor. La yema de huevo de Sanofa A/S modificada con 30 U de enzima lipolítica /g a 30 °C durante 120 minutos, mostró una velocidad de conversión alta de lecitina a lisolecitina, y la mayonesa producida con esta yema de huevo fue estable al calor y tenía una distribución óptima de tamaño de partícula. En cambio, la yema de huevo de Sanofa A/S tratada con 30 U de Lecitase® Ultra /g a 30 °C durante 120 minutos, mostró solo un cambio menor en la proporción de lecitina:lisolecitina, y la mayonesa producida tenía una distribución de tamaño de partícula similar a la mayonesa con yema de huevo sin tratar, pero de hecho fue estable al calor. Por lo tanto, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención fue superior a la Lecitase® Ultra en la producción de mayonesa.

EJEMPLO 11 Prueba de aplicación de una enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum en combinación con un emulsionante para preparar rollos con corteza firme En esta prueba se usaron fermentos de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención derivados de Fusarium heterosporum, solos o en combinación con Panodan® A2020 DATEM y GRINDSTED® SSL P55, ambos emulsionantes de Danisco A/S, para hornear rollos con corteza firme. El efecto sobre el volumen específico de pan se comparó con el efecto de Lipopan F™ de Novozymes, sola o en combinación con emulsionante sobre el volumen específico de pan. Aplicación Los rollos con corteza firme se hornearon usando la receta y procedimiento que siguen.

Receta de horneado Cantidad % de harina de hornear Harina -Danish Reform 2004002 200 g 100 Agua 1140 g 57 Levadura comprimida 120 g 6 Sal 32g 1.6 Azúcar 32g 1.6 Acido ascórbico 0 ppm 0 alfa-Amilasa estándar /GRINDAMYL™ A 1000 de Danisco A/S 75 ppm 0.150 Procedimiento de horneado Sistema mezclador Diosna. 1. Mezclar lentamente en seco durante 1 min. 2. Mezclar lentamente 2 min + rápidamente 4 min . 3. Temperatura de amasijo: 26 °C. 4. División del amasijo en porciones de: 1.350 g. 5. Reposo: 10 min a 30 °C en cabina de calentamiento. 6. Moldeado: Moldeador Fortuna 3/17/7 7. Prueba: 45 min a 34 °C, 85% H.R. 8. Horneado en un horno Bago: 13 min a 220 °C, 13 s de vapor + 5 min de compuerta abierta. 9. Cubierta MIWE stone: Programa #1 10. Después de hornear los rollos, se enfrían 25 min antes de pesarlos. El volumen de los rollos se midió mediante el método de desplazamiento de semilla de nabo.

Volumen específico de pan: Volumen específico = Volumen del pan, cm3 /peso del pan, g La adición de la enzima lipolítica secada por aspersión se basa en la harina. La enzima se agrega a la harina después de mezclar primero con el agua, ácido ascórbico y levadura comprimida. Todos los otros ingredientes secos se mezclan en el paso 1.

Resultados La enzima lipolítica secada por aspersión derivada de Fusarium heterosporum se usa en combinación con Panodan® M2020 DATEM de Danisco A/S, y se prueba contra una combinación de Lipopan F™ / DATEM y también Lipopan F™ pura o DATEM pura. Los resultados se muestran en el cuadro 24 y la figura 31.

CUADRO 24 Muestra Cantidad Volumen específico, q/cm3 Control 5.89 10 ppm 5.98 Lipopap F TM 30 ppm 7.54 40 ppm 8.18 96 ppm 6.07 191 ppm 6.2 Enzima lipolítica 287 ppm 7.06 383 ppm 8.13 478 ppm 8.01 PAN M2020 0.3% 7.89 0.15% 6.5% PAN M2020 + 0.15% Enzima lipolítica 96 ppm 7.68 PAN M2020 + 0.15% Enzima lipolítica 191 ppm 8.29 PAN M2020 + 0.15% Lipopan F TM 10 ppm 7.69 Se usó la enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum secada por aspersión en combinación con Panodan® A2020 DATEM y GRINDSTED® SSL P55, y se probó contra una combinación de Lipopan F™ / SSL o Lipopan F™ / DATEM, y también Lipopan F™ pura, DATEM pura y SSL pura. Los resultados se muestran en el cuadro 25 y la figura 32.

CUADRO 25 Muestra Cantidad Voluí men específico. q/cm3 Control 5.98 Panodan® A2020, 0.3% 0.3% 7.98 SSL P 55, 0.3% 0.3% 7.78 Lipopan F™ 15 ppm 6.42 40 ppm 7.77 Lipopan F™ + 15 ppm Panodan® A2020, 0.15% 0.15% 8.44 Lipopan FTM + 15 ppm SSL P55 0.15% 0.15% 8.62 Enzima lipolítica 43 ppm 5.93 86 ppm 6.43 Enzima lipolítica + 30 ppm Panodan® A2020 0.15% 0.15% 7.86 Enzima lipolítica + 43 ppm Panodan® A2020 0.15% 0.15% 7.86 Enzima lipolítica + 43 ppm GRINDSTED® SSL P55 0.15% Conclusión La conclusión del cuadro 24 y la figura 31 es que una dosis óptima de la enzima lipolítica secada por aspersión de acuerdo con la presente invención es de 383 ppm de enzima lipolítica y que el producto se puede usar en una dosis baja en combinación con una dosis baja del emulsionante DATEM. En un experimento paralelo se mostró que a dosis de 574 ppm a 1912 ppm de enzima lipolítica, el volumen específico de pan disminuyó (datos no mostrados). La acción de 383 ppm de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención es similar a la de 40 ppm de Lipopan FTM. Cuando se usa en combinación con emulsionante la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención también actúa al mismo grado que Lipopan FTM. De acuerdo con la determinación de la actividad de fosfolipasa usando la prueba TIPU anteriormente descrita, 10 ppm de LipopanTM es aproximadamente 120 TIPU por kg de harina y 96 ppm de la enzima lipolítica de la presente invención corresponden a 117 TIPU por kg de harina. Además, basándose en los resultados de las pruebas del cuadro 25 y la figura 32, se concluye que se puede usar una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en combinación con SSL y también con DATEM, y con ello reforzar el efecto de una cantidad baja de emulsionante. La funcionalidad de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención se puede comparar con la funcionalidad de Lipopan F™ cuando se dosifican igualmente. Nuevamente, se determina que el grado óptimo de actividad de fosfolipasa en combinación con un emulsionante es de aproximadamente 100- 150 TIPU por kg de harina. Conclusivamente, una dosis óptima de la enzima lipolítica pura de acuerdo con la presente invención es de alrededor de 500 TIPU por kg de harina, y en combinación con emulsionante, ia cantidad de enzima lipolítica debe ser 1/5 a VA de la cantidad ópfima de la enzima lipolítica, es decir, aproximadamente 120 TIPU por kg de harina.

EJEMPLO 12. Prueba de aplicación de una enzima lipolítica derivada de Fusarium heterosporum para preparar tortillas de harina Se probó el efecto de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención derivada de Fusarium heterosporum sobre el enrollamiento de una tortilla de harina hecha con ácido fumárico (procedimiento de E.U.), como se explica en el siguiente ejemplo. La tortilla de harina se horneó usando los ingredientes del cuadro 26: CUADRO 26 Receta para preparar tortilla de harina Procedimiento para preparar el amasijo de tortilla de harina: 1. Temperatura deseada del amasijo: 32 °C 2. El amasijo se realiza a temperatura ambiente en un mezclador Kemper. 3. Poner todos los ingredientes secos en un recipiente mezclador (que incluye opcionalmente enzimas lipolíticas o emulsionantes). 4. Secar la mezcla durante 1 min. 5. Agregar agua. 6. Mezclar: 11 min a velocidad 1. 7. División en porciones de: 1350 g x 3. 8. Conformación: en bolas de amasijo en un divisor/redondeador Glimek 9. Reposo durante 10 min a 32 °C. 10. Horneado: en un horno de tortillas CFO 40, con los siguientes ajustes: Alta: 230 °C; media: 228 °C; y baja: 160 °C. 11. Enfriamiento: 12 min a 20 °C, 80% H.R. Una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención se agregó al amasijo a concentraciones crecientes (pruebas Nos. 3-7). Para comparación se incluyó un control (prueba No.1 ) y una prueba con el emulsionante Panodan® 205 de Danisco A/S (prueba No.2); véase el cuadro 27. La enzima lipolítica, el Panodan® 205 y L-cisteína, se agregaron en el primer proceso de mezclado (pasos 3 y 4 anteriores). La L-cisteína se puede agregar para aumentar la extensibilidad del amasijo preparado y mejorar así el proceso de compresión del amasijo antes de hornear.

CUADRO 27 Ajustes de la prueba Las tortillas se evaluaron por medio de una prueba de enrollabilidad en frío, a temperatura ambiente, en donde la tortilla se enrolla alrededor de diferentes palos de madera de diferentes diámetros, empezando con el palo de madera de diámetro más grande. La enrollabilidad se indica por el número de palos de madera alrededor de los cuales se puede enrollar la tortilla sin romperse. A mayor número será mejor la enrollabilidad.

De los resultados se concluye que una dosis de 200 ppm o mayor de una proteína lipolítica de acuerdo con la presente invención, parece dar una mejor enrollabilidad en comparación con el sistema de control. Usando la prueba TIPU anteriormente descrita se determinó que el grado de actividad necesario para mejorar la enrollabilidad (en una dosis de 200 ppm), corresponde a aproximadamente 650 unidades TIPU por kg de harina. De los resultados también se puede concluir que la fuerza para hacer la prueba de penetración aumenta con una concentración más alta de enzima lipolítica, lo que significa que se mejora la resistencia de la tortilla. La prueba de penetración se realiza usando el analizador de textura TAXT2 producido por Stable Micro System, en donde se mide la fuerza necesaria para penetrar/romper la tortilla.

Este equipo se ajusta con los siguientes parámetros: La fuerza se mide en la compresión Velocidad previa de la prueba 10 mm/s Velocidad de la prueba 2 mm/s Velocidad posterior de la prueba 10 mm/s Distancia prueba de ruptura 1 mm Distancia 25 mm Fuerza 1 9 Tiempo 5 s Celda de carga 5 kg Temperatura 20-22 °C (temperatura ambiente) EJEMPLO 13 Clonación molecular, análisis de secuencia y expresión heteróloga de un gen sintético que codifica una enzima lipolítica de Fusaríum semitectum (IBT9507) en Hansenula polymorpha Un fragmento de un gen de enzima lipolítica de F. semitectum se clonó de ADN genómico, usando PCR con iniciadores diseñados de bloques de aminoácidos conservados dentro de secuencias de proteína alineadas de enzimas lipolíticas de diferentes cepas de Fusarium. Los iniciadores de PCR degenerados se diseñaron usando los programas de computadora CODEHOP (Rose y otros, 2003, Nucleic Acid Res., 18:3763-3766)).

Para clonar los extremos del gen se usaron los métodos de 5'- y 3'- RACE (Frohman y otros, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85:8998-9002).

Se aisló ARN total de un cultivo de la cepa de F semitectum inducido con 1 % de aceite de girasol, y los iniciadores usados se diseñaron de ia secuencia del fragmento de gen obtenido con los iniciadores de CODEHOP. Los tres fragmentos obtenidos de los procedimientos anteriores se ensamblaron en silicio para revelar la secuencia de ADNc de longitud completa. El análisis de la secuencia del ADNc de 1236 nucleótidos de largo mostró un marco de lectura abierto que comprende 352 aminoácidos (figura 33). Para expresar el gen de enzima lipolítica de F. semitectum en Hansenula, el gen se produjo con una secuencia de señal del factor de apareamiento a de levadura y se insertó detrás del promotor de FMD en el vector de expresión de Hansenula pB14. El plásmido resultante, pB14-alp.sem (mostrado esquemáticamente en la figura 34) se transformó en células competentes de Hansenula polymorpha por electroporación. Los transformantes se seleccionaron en placas de YND y se seleccionaron colonias para integración múltiple del gen por medio de 10 pasos de diluciones de 1 :200 en cultivos líquidos de YND. Finalmente, los cultivos seleccionados se transfirieron dos veces en medio YPD. Para determinar el grado de expresión del gen de la enzima lipolítica, las clonas seleccionadas se desarrollaron en YPD con 1.8% de glicerol y 0.2% de glucosa durante 2 días a 37 °C.

EJEMPLO 14 Determinación del pH y temperatura óptimos para la actividad de una enzima lipolítica de Fusaríum semitectum Una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención de Fusarium semitectum IBT 9507 y expresada en Hansenula polymorpha como se describe en el ejemplo 8, se usó en pruebas funcionales en una suspensión de amasijo para determinar la actividad de fosfolipasa y galactolipasa; y se estudió la actividad de esta enzima con respecto a las variaciones de pH y temperatura.

Procedimientos analíticos Cromatografía de gases: Se pesan 0.8 gramos de harina de trigo en un tubo de centrífuga de 12 ml con tapa. Se le agregan 1.5 ml de agua que contenía la enzima. La muestra se mezcla en un aparato Whirley y se coloca en una cabina de calentamiento a 30 °C durante 6 minutos. Se le agregan 6 ml de n:butanol:etanol 9:1 y la muestra se vuelve a mezclar hasta distribuir finamente la harina en el disolvente. Los tubos se ponen entonces en un baño de agua a 95 °C durante 10 minutos. Después se mezcla nuevamente y se ponen en un dispositivo de rotación a 45 rpm durante 45 minutos. Después se centrifuga la muestra a 2000 g durante 10 minutos y se transfieren 2 ml del sobrenadante a un vasito de 10 ml. El disolvente se evapora a 70 °C bajo una corriente de nitrógeno. Los lípidos aislados se analizan por GLC. La cromatografía de gases y la prueba de actividad de galactolipasa se realizaron como se describe en el ejemplo 1.

Temperatura óptima: Actividad de fosfolipasa: Para determinar la actividad en función de la temperatura, la prueba de fosfolipasa se realizó como en el ejemplo 1, pero la temperatura se ajustó a 30 °C, 37 °C, 45 °C, 52 °C o 60 °C. pH óptimo: Actividad de fosfolipasa: Para determinar la actividad en función del pH, la prueba de fosfolipasa se realizó como en el ejemplo 1 , pero el 0.6% de L-a fosfatidilcolina 95% Planta (Avanti #441601 ) y 0.4% de Triton-X 100 (Sigma X-100), se disolvieron en amortiguador de fosfato 0.05 M de pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, o pH 9.

Resultados Una enzima lipolítica de Fusarium semitectum IBT9507 de acuerdo con la presente invención se analizó para determinar su actividad de fosfolipasa PLU-7 y su actividad de galactolipasa GLU con los resultados mostrados en el cuadro 28.

CUADRO 28 Actividad enzimática de Fusaríum semitectum Prueba Actividad Fosfolipasa 0.8 PLU-7/ml Galactolipasa 1.3 GLU/ml La cepa Fusarium semitectum IBT9507 se probó en experimentos de suspensión de amasijo agregando 1 PLU-7 a 0.8 gramos de harina de acuerdo con el procedimiento mencionado. También se preparó una muestra de control con agua en lugar de la enzima y una muestra con Lipopan F™. Los lípidos extraídos del amasijo se analizaron por GLC con los resultados mostrados en el cuadro 29.

CUADRO 29 GLC de lípido de amasijo Enzima Dosis % FFA % % % % % TRI MGMG DGMG MGDG DGDG Control 0 0.148 0.007 0.025 0.047 0.160 0.516 F. semitectum 1 PLU-7/g 0.268 0.001 0.120 0.033 0.045 0.446 harina Lipopan F™ 1 PLU-7/g 0.229 0.027 0.090 0.016 0.069 0.415 harina El % se basa en el peso de la harina; FFA = ácidos grasos libres; MGMG = monogalactosilmonoglicérido; DGMG = digalactosilmonoglicérido; MGDG = monogalactosildiglicérido; DGDG = digalactosildiglicérido; TR! = triglicérido. Los resultados del cuadro 29 indican que la lipasa de F semitectum tiene una actividad significativa sobre los galactolípidos y menos actividad relativa sobre los triglicéridos en comparación con Lipopan F™. También se analizó la actividad de Fusarium semitectum IBT9507 en función de la temperatura (cuadro 30) y el pH (cuadro 31 ).

CUADRO 30 Actividad de la fosfolipasa en función de la temperatura para F. semitectum Temperatura, °C Actividad relativa, PLU 30 79 37 92 45 100 52 20 60 2 CUADRO 31 Actividad de la fosfolipasa en función del pH para F. semitectum PH Actividad relativa, PLU 5 67 6 83 7 100 8 80 9 17 Las actividades indicadas en los cuadros 30 y 31 también se ilustran gráficamente en las figuras 35 y 36.

Conclusión La enzima lipolítica de Fusarium semitectum de acuerdo con la presente invención ha mostrado una actividad muy fuerte sobre los galactolípidos en el amasijo, y su actividad sobre los triglicéridos es menor que la actividad sobre los triglicéridos del Lipopan F™. La temperatura óptima para la actividad de esta enzima es de aproximadamente 45 °C y el pH óptimo es de 7.

EJEMPLO 15 Uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en forraje para animales Para determinar la eficacia de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención a varias dosis usadas en forraje normal para el período de producción completo de pollos para asar.

Resumen: Los resultados preliminares sugieren que la adición de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en las dietas de pollos para asar es una estrategia nutricional efectiva para mejorar el rendimiento de las aves, para mejorar la retención de nutrientes, y para reducir la excreción de nitrógeno. Específicamente, las investigaciones preliminares sugieren que la adición de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención a la dieta del animal mejora la ganancia de peso corporal, la eficiencia de conversión de forraje, y el metabolismo de la materia seca y del nitrógeno del animal.

Formulación de la dieta y horario de alimentación Ingredientes Iniciador (%) Terminador (%) Maíz 55.55 59.22 Centeno 5.00 9.00 SBM (48% CP) 33.47 24.79 Aceite de soya 1.85 3.06 Sal 0.41 0.33 DL Metionina 0.21 0.14 Lisina HCl 0.05 0.10 Piedra caliza 1.118 1.15 Fosfato de dicalcio 1.48 1.41 Vit/Min 0.50 0.50 TiO2 0.30 0.30 TOTAL 100.00 100.00 Provisión de nutrientes (calculada) CP (%) 21.50 18.06 ME (kcal/kg) 3000.0 3125.0 ME (MJ/kg) 12.55 13.08 Calcio (%) 0.90 0.85 P (%) 0.68 0.63 P prom. (%) 0.40 0.38 Grasa (%) 4.48 5.73 Fibra (%) 2.59 2.48 Met (%) 0.55 0.43 Cys (%) 0.36 0.32 Met+Cys (%) 0.91 0.75 Lys (%) 1.20 1.00 Try (%) 0.25 0.20 Na (%) 0.18 0.15 El forraje se prepara como una masa, ya sea con o sin la enzima lipolítica de acuerdo con la presente ¡nvención. Se ofrece a los animales la dieta y agua a voluntad. Las dietas de prueba se abastecen continuamente durante toda la prueba. Las muestras de forraje se complementan opcionalmente con una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención a 330 g/t. La enzima se puede agregar como enzima seca mientras se mezcla el forraje. Observaciones que se toman: Peso vivo (basado en la jaula): día 0, 21 y 42 Ganancia de peso: 0-21 d, 22-42 d, 0-42 d Ingestión de forraje: 0-21 d, 22-42 d, 0-42 d FCR (proporción de conversión de alimento) 0-21 d, 22-42 d, 0-42 d Recolección del contenido ileal día 21 y 42 Se determinan los pesos totales de forraje y aves, así como el peso de mortalidad total y el número de aves por jaula por periodo analizado. El consumo de forraje por jaula se determina sin corregir por la mortalidad. Se determinan datos de eficiencia de conversión de forraje como consumo total por peso vivo y peso total base (incluyendo peso de mortalidad) Antes de iniciar el estudio los animales se examinan en busca de signos de enfermedad o lesión. Cualquier animal que parezca estar en una condición deficiente es eliminado del estudio. Los animales del estudio se asignan a sus grupos de tratamiento usando una técnica de aleatorización. Los animales y sus corrales se identifican de forma única antes de empezar la administración del forraje de prueba. Los datos de los grupos tratados se comparan con los de su grupo de control relevante usando las pruebas estadísticas apropiadas y aceptando un grado de probabilidad menor de 0.05 como indicativo de significancia. Los pesos corporales, la ingestión de alimento y las proporciones de conversión de alimento, se analizan mediante varianza y pruebas de diferencia menos significativa.

Animales Número de tratamiento: 2 Número de réplicas: 13 a 21 días y 9 a 42 días Animales por réplica: 8 a 21 días y 2 a 42 días Especie de animal: Pollo para asar Raza del animal: Ross Sexo: Masculino Edad de los animales de prueba: 0-42 d Pesos de los animales de prueba:~-40 g Dieta/alojamiento Información de la dieta: véase arriba Forma de la dieta: masa Iniciador de coccidiostático: ninguno Terminador de coccidiostático: ninguno Iniciador de promotor de crecimiento: ninguno Terminador de promotor de crecimiento: ninguno Principales mediciones hechas: Variables: ganancia de peso, conversión de alimento, digestibilidad de nutrientes Cuando: 0-21 d, 22-42 d Enzimas/aditivos Enzimas usadas (1 ): Enzima lipolítica de Fusarium semitectum o Fusarium heterosporum 330 g/t.

EJEMPL0 16 Evaluación del efecto de una enzima lipolítica de Fusarium heterosporum CBS 782.83 sobre la calidad de sopas de pasta instantáneas de harina china Introducción El mercado de las sopas de pasta instantáneas ("Instant Noodles", "IN") ha tenido un crecimiento extraordinario en los últimos 5-8 años en el sureste de Asia y en alguna medida en Europa y E.U. Este crecimiento es evidente en regiones que son tradicionalmente mercados basados en arroz o pasta ("Food Navigator'S 2000). La reciente popularidad de la IN se puede atribuir principalmente a su costo muy rentable, conveniencia y procedimientos de producción limpios. La harina con un contenido de proteína promedio (9-11%), un valor de ceniza bajo (-0.50%), brillantez L* (85) y amarillez b* (>8.0) bajas, y viscosidad de pasta de almidón alta (<750 BU), produce una sopa de pasta instantánea (IN) de color cremoso/amarillo y tiene las características deseadas de sensación en la boca. Existen diferentes tipos de sopas de pasta consumidas, cada una con características de calidad de harina específicas que tienen un impacto sobre la calidad final del producto. El cubrir las demandas del usuario final es un reto para la ¡ndustria de la harina debido al gran número de productos finales y a una amplia gama de expectativas del cliente. Los ingredientes diseñados específicamente y los aditivos a las dosis correctas funcionan importantemente para mejorar el sabor, textura, apariencia, vida útil en almacenamiento y valor nutritivo del producto terminado final. Aunque la importancia del color y la textura de la IN cocida no se puede subestimar, los clientes se están volviendo cada vez más perspicaces y concientes de su salud y buscan alternativas bajas en grasa sin perjuicio de la calidad. Una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención se probó en harina china para evaluar su efecto sobre el contenido de grasa de las IN y estudiar los cambios de textura y color durante el procesamiento.

Materiales y métodos Para este proyecto se usó el procedimiento estándar de Agrifood Technology para la producción de IN y un método de evaluación extendido. Se usó harina china como la harina de control y se corrió al inicio de cada día. Se midió el contenido de proteína, humedad, ceniza, color, gluten húmedo y actividad diastática de la harina china, usando los métodos aprobados por la AACC (Asociación de Química Clínica de E.U.A.). Las pruebas de reología del amasijo incluyeron: farinograma, extensograma (45 min de tracción), alveograma y amilograma. La producción de IN se puede resumir de la siguiente manera: Cada lote de IN se hizo de 350 g de harina que se mezclaron gradualmente a velocidad baja con 33 partes de solución acuosa de sal que contenía 1 % de cloruro de sodio y 0.2% de sales alcalinas (carbonato de potasio : carbonato de sodio, en una proporción de 6:4). Para muestras dosificadas, la harina se mezcló completamente con la cantidad medida de ingrediente antes de agregar la solución acuosa de sal. El amasijo friable se mezcló 4 minutos a velocidad media y se laminó 8 veces. El laminado comenzó con una prensa de acero, seguida por dos rodillos estriados de plástico y finalmente con cinco rodillos lisos de acero inoxidable, con una proporción de reducción del 30% entre cada rodillo. El grosor final de la lámina de amasijo era de 1.35 mm. La lámina de amasijo se laminó una vez más antes de cortar. La diferencia de velocidad entre los rodillos cortadores y la banda transportadora produjo bucles compactos. Las tiras rizadas de pasta compacta se trataron con vapor dos minutos, se frieron en aceite de palma por ambos lados a 180 °C durante 1 minuto. Los bloques de pasta se enfriaron y envasaron en bolsas con sello de broche para análisis posterior. Se recolectaron muestras en varias etapas de producción para su análisis. El color y el tamaño de partícula de la miga se midieron usando el Minolta Chromameter y los calibradores de Vernier, respectivamente. El color de la lámina de amasijo y del producto final se registró con el Minolta Chromameter y se tomó una fotografía digital de ambos (no mostrado). Se midió la actividad de agua en las tiras de pasta tratadas con vapor. La actividad de agua se puede medir determinando el peso de las tiras de pasta tratadas con vapor, inmediatamente después de dicho tratamiento y después de la remoción completa de su contenido de agua por secado en un horno a 90 °C -el contenido de agua se puede determinar entonces dividiendo la diferencia de peso antes y después del secado entre el peso después del secado. Se determinó el tiempo de cocción óptimo, rendimiento de cocción, pérdida de cocción (método gravimétrico), color y textura (firmeza) de las tiras de pasta cocidas, usando los procedimientos estándares de Agrifood Technology conocidos por el experto en la materia. También se realizó un análisis del perfil de textura (TPA) sobre la textura de las tiras de pasta cocidas para medir la cohesividad, elasticidad y masticabilidad. La cohesividad de define como la capacidad del producto para resistir una segunda deformación con respecto a la primera deformación. Se mide como el área de trabajo durante la segunda compresión dividida entre el área de trabajo durante la primera compresión, y por io tanto no tiene unidades de medida. La cohesividad, en este caso, se refiere "al-dente" del producto, que no es un atributo deseable para la IN. La elasticidad se define como la propiedad de un producto de regresar físicamente a su forma original después de haber sido deformado durante la primera compresión. La elasticidad se mide de varias maneras pero más normalmente se mide por la distancia de la altura detectada del producto en la segunda compresión. La masticabilidad se aplica solo a los productos sólidos y se calcula como la gomosidad multiplicada por la elasticidad. La masticabilidad es mutuamente exclusiva con la gomosidad. Un bloque de tiras de pasta que representa cada dosificación se molió en un molino de café, y una muestra derivada homogénea se usó para el análisis de grasa por el método de hidrólisis acida (se pueden usar métodos alternativos estándares para determinar el contenido de grasa).

Resultados y discusión El contenido de proteína y el color (con respecto al brillo, L*) de ia harina estuvieron dentro de la escala aceptable para la producción de sopa de pasta instantánea. La absorción de agua fue ligeramente superior al final de la producción de la IN; sin embargo, como el amasijo de la pasta es muy friable, no tiene un impacto sobre la maquinabilidad. La harina tuvo una buena extensibilidad simple (extensograma) y biaxial (alveograma), lo que tendría un impacto positivo sobre las cualidades de alimentación de la pasta. La viscosidad pico del amilograma fue de 870 BU, lo que es deseable para la IN. La pérdida a la cocción de la IN que contenía la segunda dosis más alta de la enzima lipolítica fue más alta que el control y que la IN que contenía la cantidad mínima de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención. El contenido de grasa de la IN con la cantidad más alta de la enzima lipolítica fue significativamente mas bajo que el control y la IN experimental con la cantidad más baja de enzima lipolítica. La elasticidad y masticabilidad de algunas IN experimentales fueron mejores que el control. Basándose en estos datos, la enzima lipolítica debería ser investigada más a diferentes dosis.

Conclusiones Algunos de los puntos sobresalientes que se pueden señalar de este estudio son: La adición de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención a una IN no tiene un impacto notable sobre el tamaño de miga, la pegajosidad de amasijo, la maquinabilidad o características de procesamiento.

De manera importante, las dosis crecientes de enzima lipolítica resultaron en una reducción del contenido de grasa de la IN. La enzima lipolítica mejoró la firmeza de las tiras de pasta a dosis crecientes en comparación con el control, mientras que la cohesividad no fue afectada. La enzima lipolítica tuvo un efecto positivo sobre la amarillez de las tiras de pasta cocidas. Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior se incorporan aquí como referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos descritos y el sistema de la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia, sin apartarse del alcance y espíritu de la presente invención. Aunque la presente invención se ha descrito con respecto a modalidades específicas preferidas, se debe entender que la invención reclamada no se debe limitar indebidamente a dichas modalidades específicas. En realidad, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, que son obvios para los expertos en bioquímica y biotecnología o los campos relacionados, se consideran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una enzima lipolítica fúngica de tipo silvestre que tiene una proporción de actividad sobre los lípidos polares mayor en comparación con los triglicéridos. 2.- La enzima lipolítica fúngica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque tiene una proporción de acfividad hidrolizante de fosfolípido :triglicérido de por lo menos 4. 3.- La enzima lipolítica fúngica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque tiene una proporción de actividad hidrolizante de glicolípido:triglicérido de por lo menos 1.5. 4.- Una enzima lipolítica fúngica que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2, o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad con estas. 5.- La enzima lipolítica fúngica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque es obtenible de un hongo filamentoso. 6.- La enzima lipolítica fúngica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque es obtenible de Fusarium spp. 7.- La enzima lipolítica fúngica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque es obtenible de Fusarium heterosporum. 8.- La enzima lipolítica fúngica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque es obtenible de Fusarium heterosporum CBS 782.83. 9.- Una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima lipolítica fúngica como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 4-8. 10.- Un ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica fúngica, seleccionado del grupo que consiste de: (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:3; (b) un ácido nucleico que está emparentado con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 por la degeneración del código genético; y (c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 90% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:3. 11.- Un método de fabricación de un producto alimenticio que comprende añadir la enzima lipolítica fúngica que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-8, a uno o más ingredientes del producto alimenticio. 12.- Un método de fabricación de un producto horneado que comprende añadir una enzima lipolítica fúngica como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-8, a un amasijo, y hornear el amasijo para hacer el producto horneado. 13.- El método que se reclama en la reivindicación 11 , en donde

Claims (1)

el producto alimenticio es uno o más de: un huevo o un producto con huevo; un producto horneado; confitería; un producto congelado; un producto lácteo que incluye queso; un mus; crema vegetal batida; aceite y grasa comestibles; un producto batido aireado y no aireado; emulsiones de aceite en agua y emulsiones de agua en aceite; margarina; manteca vegetal; productos para extender que incluyen productos untables bajos en grasa y muy bajos en grasa; aderezos; mayonesa; dips; salsa de crema; sopa de crema; bebidas; emulsiones de especias y salsas. 14.- Un método de preparación de un lisofosfolípido que comprende tratar un fosfolípido con ia enzima lipolítica fúngica que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para producir el lisofosfolípido. 15.- Un procedimiento para desgomado enzimático de aceites vegetales o comestibles, que comprende tratar el aceite vegetal o comestible con una enzima lipolítica fúngica como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-8, a fin de hidrolizar la mayor parte de los lípidos polares presentes. 16.- Un producto alimenticio obtenido mediante el método que se reclama en la reivindicación 11. 17.- Un producto horneado obtenido mediante el método que se reclama en la reivindicación 12. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Una enzima lipolítica fúngica de tipo silvestre que tiene una proporción de actividad sobre los lípidos polares mayor en comparación con los triglicéridos, en donde preferiblemente la enzima tiene una proporción de actividad de fosfolípido:triglicérido de por lo menos 4; preferiblemente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención tiene una proporción de actividad hidrolizante de glicolípido:triglicérido de por lo menos

1.5; en una modalidad, la enzima lipolítica fúngica de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:4 o la SEQ ID NO:6, o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad con estas; la presente invención también abarca un ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica fúngica, dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de: (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7; (b) un ácido nucleico que está emparentado con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7 por la degeneración del código genético; y (c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 90% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7. 5B P06/1181 F h : min : s FIG. 1 FIG. 2