KR101751966B1

KR101751966B1 - 트리코데르마 속 균주의 혼합배양에 의한 고활성 셀룰라아제를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101751966B1
Application number: KR1020150089225A
Authority: KR
Inventors: 김봉기; 김용덕; 박동철
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2015-06-23
Filing date: 2015-06-23
Publication date: 2017-06-30
Also published as: KR20170000459A

Abstract

본 발명은 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주의 혼합 배양을 이용하여 셀룰라아제를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 본 발명의 방법에 의해 생산된 셀룰라아제는 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주를 이용하여 생산한 셀룰라아제와 비교하여 총 셀룰로오스 활성 및 β-글루코시다아제 활성이 현저하게 높고, 시판 셀룰라아제와 비교하여도 동일 또는 우수한 당화능을 가져 종래의 셀룰라아제를 대체할 수 있는 이점이 있다.

Description

트리코데르마 속 균주의 혼합배양에 의한 고활성 셀룰라아제를 생산하는 방법{Method for Producing Cellulase with Improved Activity by Mixed Culture of the Genus Trichoderma}

본 발명은 트리코데르마 속 균주의 혼합 배양을 이용한 고활성 셀룰라아제 생산방법에 관한 것이다.

셀룰로오스는 전 세계적으로 가장 풍부한 재생가능 자원이며, 미생물이 생산하는 셀룰라아제에 의해서 생분해 될 수 있다. 하지만 대부분의 셀룰로오스 자원들이 농업 및 산림 폐산물로 방치되고 있어 환경오염의 문제가 되고 있다. 이를 해결하기 위한 효율적 당화 공정 기술의 개발은 바이오기반 제품 및 에너지의 생산과 더불어 이산화탄소 배출 절감효과를 통한 환경문제 해결에도 큰 도움이 될 수 있다. 셀룰로오스의 당 전환은 물리·화학적 처리 방법과 효소를 이용한 전환 방법이 있다. 강산 및 강염기를 이용한 고온·고압 분해방법의 경우 생산 장비 및 수반되는 폐기물 처리비용이 고가이며, 비환경적이라는 문제점을 안고 있다. 따라서 화학적 전처리 및 고농도로 농축된 셀룰라아제를 이용한 단당으로의 전환방법을 병행하는 것이 최근의 추세이다. 또한 고활성의 셀룰라아제는 포함되어 있는 난소화성 탄수화물인 셀룰로오스를 효과적으로 분해하여 가축의 곡물 사료 이용성을 높일 수 있어 사료산업에서도 연구가 활발히 진행 중이다.

현재 이용되고 있는 셀룰라아제의 생산균주는 효소 농도에 있어 산업적으로 부족한 면이 있으며, 낮은 효소농도는 바이오에탄올 생산 수율에 영향을 끼칠 수도 있다. 따라서 유전적 변이를 통한 고활성 및 고농도의 셀룰라아제 생산 균주의 개발이 요구되고 있으며, 본 발명에서는 트리코데르마 레세이 균주의 혼합 배양을 이용하여 바이오 에탄올 및 사료 첨가제로서의 셀룰라아제를 제공함을 기술개발 목적으로 하고 있다.

대한민국 공개특허 제2015-0026032호에는 고활성 셀룰라아제를 생산하는 트리코데르마 레세이 변이주에 대하여 개시하고 있으나, 트리코데르마 하지아눔에 대하여는 개시하고 있지 아니하며, 상기 트리코데르마 레세이 변이주에 트리코데르마 하지아눔을 혼합하여 배양함으로써 셀룰라아제 활성을 증진시키는 방법에 대하여는 개시된 바가 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 바이오 에탄올 생산을 위한 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 포도당으로 전환시키는 단계에 있어, 이에 사용되는 고활성 셀룰라아제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) KCCM11770 균주의 변이주인 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P)와 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum) 균주를 혼합 배양하는 경우 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성이 모두 증가한다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주를 이용하여 셀룰라아제를 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 생산된 셀룰라아제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주를 포함하는 셀룰라아제 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주를 포함하는 셀룰로오스 분해용 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum) 균주를 배지에 접종하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 균주를 배양하여 셀룰라아제를 생산하는 단계를 포함하는 셀룰라아제 생산방법을 제공한다.

본 발명자들은 바이오 에탄올 생산을 위한 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스를 포도당으로 전환시키는 단계에 있어, 이에 사용되는 고활성 셀룰라아제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 트리코데르마 레세이 KCCM11770 균주의 변이주인 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P)와 트리코데르마 하지아눔 균주를 혼합 배양하는 경우 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성이 모두 증가한다는 사실을 확인하였다.

따라서 본 발명은 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주를 이용하여 셀룰라아제를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주는 트리코데르마 레세이 KCCM11770에 NTG(MNNG: N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 제조된 균주이다.

본 발명에서 사용한 균주를 제조하는 물질인 NTG는 일반 박테리아에 대하여 DNA 변이를 일으키는 물질로 알려져 있다(Pleven, C. et al, Glioblastomas and chemical mutagenesis in biology laboratories. Report of 3 deaths in the same institute(Fr.). Arch. Mal . Prof ., 44: 411-418(1983); Martin, M.S. et al, Susceptibility of inbredrats to gastric and duodenal carcinomas induced by N-methyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine. J. natl Cancer Inst ., 53:837-840(1974);IARC Monographs, Suppl. 6:394-398(1987)).

상기 NTG의 화학 구조는 하기 화학식 1에 나타내었다.

화학식 1

본 발명의 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주는 ITS(internal space region) 영역의 염기서열을 분석한 결과 종래의 트리코데르마 레세이 균주인 하이포크레아 제코리나(hypocrea jecorina) GTXKohli-1 균주와 100%의 높은 상동성을 보여 트리코데르마 레세이 균주로 동정하였으며, 본 발명의 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주를 기탁기관인 한국생명공학연구원에 2013년 08월 27일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 18256P를 부여받았다.

본 명세서의 용어 “셀룰라아제(cellulase)”는 셀룰로오스를 가수분해하고, 1차 생성물로써 글루코오스(glucose), 셀로비오스(cellobiose) 및 셀로올리고사카라이드(cellooligosaccharide)를 생성하는 효소를 의미한다. 본 명세서의 용어 “셀룰로오스(cellulose)"는 D-글루코오스가 (1→4)-β-형의 글리코시드 결합으로 곧은 사슬 모양으로 결합한 고분자 화합물을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 셀룰라아제는 엔도-β-1,4-글루카나아제(endo-β-1,4-glucanase, endo-glucanase 또는 carboxymethylcellulase, EG, EC 3.2.1.4), 엑소-β-1,4-글루칸 셀로비오히드롤라아제(exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase 또는 exocellobiohydrolase, CBH, EC 3.2.1.91), 필터 페이퍼라아제(Fpase: Filter paperase) 및 β-글루코시다아제(β-glucosidase 또는 셀로비아제(cellobiase), BG, EC 3.2.1.21)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 포함한다.

본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 균주를 배지에 접종

본 발명에 따르면, 우선 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주를 배지에 접종한다.

본 발명의 배지는 곰팡이 배양에 사용되는 당업계의 어떠한 배지도 포함하며, 예컨대 YM 배지 및 만델 배지(modified Mandel’s medium)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 트리코데르마 하지아눔 균주는 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763 균주이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 접종은 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주를 동일한 배지에 접종한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 배지는 탄소원을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 배지의 탄소원은 보릿짚, 억새, 밀기울 및 팜 부산물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 탄소원이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 배지의 탄소원은 억새이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 배지는 질소원 또는 무기염류를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 배지의 질소원은 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 배지의 무기염류로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철, 아연, 코발트 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염류의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 본 발명의 배지에 추가적으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 배지는 pH 4-6, pH 4.5-6.0, pH 4.5-5.5, pH 5.0-5.5이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주와 트리코데르마 하지아눔 균주의 접종 비는 3:7-9:1이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 접종 비는 3:7-7:3, 4:6-7:3, 4:6-6:4 또는 5:5이다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주와 트리코데르마 하지아눔 균주의 접종 비를 3:7-7:3로 하는 경우 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성 모두가 현저하게 증가한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 트리코데르마 하지아눔 균주의 접종은 상기 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주를 접종하여 60-96시간 배양한 후에 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 트리코데르마 하지아눔 균주의 접종은 상기 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주를 접종하여 60-84시간, 66-84시간, 66-78시간, 69-78시간, 69-75시간 또는 72시간 배양한 후에 실시한다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주를 48-96시간 배양한 후에 트리코데르마 하지아눔 균주를 접종하는 경우 대조군에 비하여 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성 모두가 현저하게 증가함을 알 수 있다.

단계 (b): 균주를 배양하여 셀룰라아제 생산

단계 (a) 실시 이후, 단계 (a)의 균주를 배양하여 셀룰라아제를 생산한다.

본 발명은 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주의 전배양 또는 종배양 하는데 있어 공지된 배양방법을 통해 배양할 수 있다. 상기 배양의 결과물인 효소액은 셀룰라아제를 포함하고 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 배양은 20-35℃, 25-35℃, 25-33℃ 또는 27-33℃에서 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 배양은 교반속도 100-300 rpm, 150-300 rpm, 150-250 rpm 또는 150-200 rpm에서 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 배양은 120-168시간, 132-156시간, 138-150시간 또는 141-147시간이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b)의 배양 결과물의 총 셀룰라아제 활성은 1.0-3.0, 1.5-3.0, 1.7-3.0, 1.7-2.8, 1.7-2.5, 2.0-3.0, 2-2.8, 2-2.5, 2.3-3.0 또는 2.3-2.5 FPU/ml이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b)의 배양 결과물은 β-글루코시다아제를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b)의 배양 결과물의 β-글루코시다아제 활성은 2.0-10.0, 5.0-10.0, 6.0-10.0, 7.0-10.0, 8.0-10.0, 2.0-9.0, 5.0-9.0, 6.0-9.0, 7.0-9.0, 8.0-9.0, 2.0-8.5, 5.0-8.5, 6.0-8.5, 7.0-8.5 또는 8.0-8.5 U/ml이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 제조된 셀룰라아제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주를 포함하는 셀룰라아제 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 셀룰라아제 생산용 조성물은 본 발명의 배지성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 셀룰라아제 생산용 조성물은 바이오매스(기질)를 글루코오스로 분해한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주를 포함하는 셀룰로오스 분해용 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명의 사료 첨가제를 제조하기 위하여, 본 발명의 혼합 균주 또는 이의 배양액을 직접 제제화하거나 밀분, 녹말, 텍스트린 등의 희석제 및 곡류, 왕겨 및 탈지 쌀겨와 같은 겨, 오일 및 지방분이 풍부한 종자 케이크와 같은 사료용 원료와 함께 제제화될 수 있다. 수득된 본 발명의 변이주에 포함된 셀룰라아제는 그를 함유한 사료 첨가제 형태로 또는 사료 형태로 적당량 동물에 투여되어 체중 증가 및 촉진 성장을 시킨다.

또한, 본 발명의 사료 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 첨가되는 효소 제제는 건조 또는 액체 상태가 모두 가능하며, 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라나제(xylanase), 말토오스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase) 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가용 부형제로는 제올라이트, 옥분 또는 미강 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 사료 첨가제를 포함하는 가축 성장용 사료를 제공한다.

본 발명의 사료는 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 사료원료를 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 적절히 사용할 수 있다. 가공 과정은 사료원료가 충진된 상태에서 가압 하에 일정한 배출구로 압축되는 공정으로 단백질의 경우에는 변성이 되어 이용성이 증가되는 압출 성형(extrusion)을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 압출 성형은 열처리 과정을 통해 단백질을 변성시키고, 항효소 인자를 파괴시키며, 단백질 분해효소의 활성을 분자적 구조변화에 의한 새로운 부위로의 효소적 노출에 의해 증가시키는 등의 장점을 갖는다. 또한, 대두 단백질과 같은 경우에는 압출 성형을 통해서 단백질의 소화율을 향상시키고 대두에 존재하는 단백질 분해효소의 저해제 중 하나인 트립신 저해제(trypsin inhibitor)와 같은 항 영양인자들을 불활성화시키며, 단백질 분해효소에 의한 소화율 향상을 증가시켜 대두 단백의 영양적 가치를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 사료가 사용될 수 있는 동물의 대표적인 예는 다음과 같다: 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축; 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은 새 등과 같은 가금류.

또한, 투여량은 투여될 동물의 종류, 나이 및 기타 사료 성분의 종류에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주를 포함하는 세제 조성물을 제공한다.

본 발명의 세제 조성물은 1부 및 2부 수성 세제 조성물, 비수성 액체 세제 조성물, 성형 고체(cast solid), 과립 형태, 입자 형태, 압축 정제, 겔 및/또는 페이스트 및 슬러리 형태일 수 있다. 상기와 같은 세제 조성물을 사용하여 음식물의 찌든 때, 음식물 잔류막 및 기타 소량의 식품 조성물을 신속하게 제거할 수 있다. 본 발명의 세제 조성물은 전분 다당류를 촉매 가수분해하여 말라붙은 얼룩 제거에 효과적일 수 있다.

본 발명의 세제 조성물은 단단한 표면을 세정하는 세제 조성물, 직물을 세정하는 세제 조성물, 설거지용 세제조성물, 구강 세정용 세제 조성물, 의치 세정용 세제 및 콘택트 렌즈 세정 용액을 비롯한 세제 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주를 이용하여 셀룰라아제를 생산하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 셀룰라아제를 제공한다.

(c) 본 발명은 본 발명의 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔 균주를 포함하는 셀룰라아제 생산용 조성물, 사료 조성물 및 세제 조성물을 제공한다.

(d) 본 발명의 방법에 의해 생산된 셀룰라아제는 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주를 이용하여 생산한 셀룰라아제와 비교하여 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성이 현저히 높고, 시판 셀룰라아제와 비교하여도 동일 또는 우수한 활성을 가져 종래의 셀룰라아제를 대체할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763 균주의 접종에 따른 총 셀룰라아제 및 β-글루코시다아제 최적 활성을 나타낸다.
도 2는 트리코데르마 레세이 DSCE24 및 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763 균주의 혼합 배양 농축액의 당화능을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 혼합 배양 균주 선정 및 혼합배양 균주의 셀룰라아제 활성 평가

균주 및 이의 단독 배양

트리코데르마 레세이 DSCE24, 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763, 페니실리움 베루쿨로슘(penicillium verruculosum) COKE4E, 아스퍼질러스 가와치(Aspergillus kawachii) KCCM 11460, 트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) KCCM 60389 균주를 배양하여 효소액을 생산하였다.

상기 트리코데르마 레세이 DSCE24 변이주는 트리코데르마 레세이 KCCM11770(모주)에 NTG(MNNG: N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 변이시킨 셀룰라아제 고활성(모주에 비하여 총 셀룰라아제 활성이 약 48% 증가하고, β-글루코시다아제의 활성은 약 54% 증가) 변이주이다. 상기 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주의 제조방법은 본 발명자들의 대한민국 출원특허 제2013-0104329호에 상세하게 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상기 트리코데르마 레세이 DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주는 기탁기관 한국생명공학연구원에 2013년 08월 28일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 18256P를 부여받았다. 페니실륨 베루쿨로슘 COKE4E(기탁번호 KCTC 11897BP)은 한국생명공학연구원 미생물자원센터 KCTC(Korean Collection for Type Culture)로부터 분양받았고, 트리코데르마 하지아눔(기탁번호 KCCM 11763), 아스퍼질러스 가와치(기탁번호 KCCM 11460) 및 트리코데르마 롱기브라키아툼(기탁번호 KCCM 60389)은 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)로부터 분양받았다.

상기 균주의 플라스크 배양은 PDA(Potato dextrose agar) 플레이트에 획선 도말하여 배양 후, 멸균 증류수(SDW: Sterile Distilled Water)를 이용하여 상기 셀룰라아제 고활성 균주의 포자를 현탁 또는 플레이트를 1 x 1 cm로 커팅 후 배양에 이용하였다. 포자 현탁액을 YM(Yeast mold) 배지에 1차 배양 후, 글루코오스가 포함된 변형된 만델 배지(modified Mandel’s medium)에 2차 배양 한 다음, 글루코오스를 팜 부산물 및 밀기울로 대체하고 NaOH를 이용하여 pH를 5.2로 조정한 변형된 만델 배지(표 1)에 본 배양(30℃, 170rpm, 6일)을 하였다. 이후 상기 배양액을 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 후 상등액을 비교 효소액으로 사용하였다.

균주의 혼합 배양

균주의 혼합 배양 시 단독 배양 시와 동일한 방법으로 배양하며, 트리코데르마 레세이 DSCE24를 전체 배양액의 5 (v/v)%로 접종 후 페니실리움 베로클로슘 COKE4E, 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763, 아스퍼질러스 가와치 KCCM 11460 혹은 트리코데르마 롱기브라키아튬 KCCM 60389을 각각 5 (v/v)%씩 추가 접종 하였다.

총 셀룰라아제의 활성 분석

총 셀룰라아제의 활성은 NREL(National Renewable Energy Laboratory)에서 제시한 필터 페이퍼 분석(filter paper assay) 방법(Technical Report NREL/TP-510-42628; www.nrel.gov)을 이용하여 측정하였다.

시험관(Φ18 × h180 mm)에 0.05 M 구연산 완충액(citrate buffer) 1 ml을 넣고 기질로서 Whatman NO.1 필터페이퍼(Whatman社, 미국)를 50 mg(1 x 6 cm) 넣은 후, 상기 단독 배양 균주 및 혼합 배양 균주의 효소액을 0.5 ml를 첨가하였다. 50℃에서 60분 동안 반응 후, 3 ml 3,5-디니트로살리실산(DNS: 3,5-Dinitrosalicylic acid, SIGMA社, 미국)을 첨가한 후, 100℃에서 5분 동안 끓여서 반응 정지 및 발색을 하였다. 차가운 물에 식힌 후, 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 미리 작성한 글루코오스 표준곡선(glucose standard curve)에 대입하여 생성된 환원당의 양을 계산하였다. 사용된 효소 활성단위는 FPU(filter paper unit)이며, 이는 위 반응 조건에서 1분 당 1 μmol의 글루코오스를 생성하는데 사용된 효소의 양으로 정의하였다.

β-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성 측정

β-글루코시다아제는 파라-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드(pNPG: para-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside, SIGMA社, 미국)를 이용하여 측정하였다. 반응액은 2.7 ml 구연산 완충액(citrate buffer)에 기질로서 10 mM pNPG를 0.2 ml 첨가한 후, 0.1 ml 효소액을 첨가하여 준비하였다. 이를 50℃에서 30분 동안 반응시킨 후 1M 소디움카보네이트(sodium carbonate) 1 ml을 첨가하여 반응을 정지시키고, 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 미리 작성하여 둔 표준 곡선에 대입하여 생성되는 파라-니트로-페놀(pNP: para-nitro-phenol)의 양을 측정하여 상대적인 글루코오스 생산량을 확인하였다. 활성은 U(unit)로 표시하며, 1 U는 상기 조건에서 pNPG를 분해하여 1분 당 1 μmol의 pNP를 생성하는데 사용된 효소의 양으로 정의하였다.

단독 및 혼합 배양 시의 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성

트리코데르마 레세이 DSCE24, 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763, 페니실리움 베루쿨로슘 COKE4E, 아스퍼질러스 가와치 KCCM 11460, 트리코데르마 롱기브라키아툼 KCCM 60389 균주의 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성을 하기 표 2에 기재하였다.

트리코데르마 레세이 DSCE24는 총 셀룰라아제 활성은 높으나, β-글루코시다아제 활성이 낮으며, 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763은 β-글루코시다아제 활성이 매우 높으나, 총 셀룰라아제 활성이 낮음을 알 수 있었다. 페니실리움 베루쿨로슘 COKE4E, 아스퍼질러스 가와치 KCCM 11460, 트리코데르마 롱기브라키아툼 KCCM 60389은 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성이 모두 낮았다.

트리코데르마 레세이 DSCE24에 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763, 페니실리움 베루쿨로슘 COKE4E, 아스퍼질러스 가와치 KCCM 11460, 트리코데르마 롱기브라키아툼 KCCM 60389 균주를 혼합 배양 한 경우의 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성을 하기 표 3에 기재하였다.

균주를 혼합 배양하는 경우 각 균주의 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성은 단독 배양 시에 비해 전반적으로 감소하는 경향을 보였다. 이 중, 트리코데르마 레세이 DSCE24에 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763을 혼합하여 배양하는 경우의 총 셀룰라아제 활성의 감소폭이 가장 낮았으며, β-글루코시다아제 활성은 트리코데르마 레세이 DSCE24 단독 배양 시에 비하여 약 3배 이상 증가함을 확인하였다. 따라서 혼합 배양 균주는 트리코데르마 레세이 DSCE24 및 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763으로 선별하였다.

실시예 2: 혼합 균주 접종 비에 따른 활성 변화

트리코데르마 레세이 DSCE24, 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763, 트리코데르마 롱키브라키아툼 KCCM 60389의 플라스크 배양은 PDA 플레이트에 획선 도말하여 배양 후, SDW를 이용하여 상기 셀룰라아제 고활성 균주의 포자를 현탁하였으며, 페니실리움 베로컬로슘 COKE4E 및 아스퍼질러스 가와치 KCCM 11460의 경우 배양된 PDA 플레이트를 커팅하여 2 슬라이스(1 x 1 cm)를 YM 배지에 1차 배양 후, 글루코오스가 포함된 변형된 만델 배지(modified Mandel’s medium)에 2차 배양 한 다음, 글루코오스를 팜 부산물 또는 억새 및 밀기울로 대체하고 NaOH를 이용하여 pH를 5.2로 조정한 변형된 만델 배지(표 1)에 본 배양(30℃, 170rpm, 6일)을 하였다. 이후 상기 배양액을 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 후 상등액을 비교 효소액으로 사용하였다.

접종 비에 따른 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성은 하기 표 4에 기재하였다.

트리코데르마 레세이 DSCE24의 상대적인 접종량을 늘릴수록 총 셀룰라아제 활성은 증가하나 트리코데르마 레세이 DSCE24의 상대적인 접종비율이 50%를 초과하면 총 셀룰라아제 활성은 증가하지 않으며, β-글루코시다아제 활성의 감소만을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 접종량을 10%로 하는 경우 5:5의 비율로 접종하는 것이 효소활성에 가장 유리함을 알 수 있었다.

실시예 3: 혼합 배양 시 균주 접종 시점에 따른 활성 변화

트리코데르마 레세이 DSCE24, 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763, 트리코데르마 롱키브라키아툼 KCCM 60389의 플라스크 배양은 PDA 플레이트에 획선 도말하여 배양 후, SDW를 이용하여 상기 셀룰라아제 고활성 균주의 포자를 현탁하였으며, 페니실리움 베로컬로슘 COKE4E 및 아스퍼질러스 가와치 KCCM 11460의 경우 배양된 PDA 플레이트를 커팅하여 2 슬라이스(1 x 1 cm)를 YM 배지에 1차 배양 후, 글루코오스가 포함된 변형된 만델 배지(modified Mandel’s medium)에 2차 배양 한 다음, 글루코오스를 팜 부산물 또는 억새 및 밀기울로 대체하고 NaOH를 이용하여 pH를 5.2로 조정한 변형된 만델 배지(표 1)에 본 배양(30℃, 170rpm, 6일)을 하였다. 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763는 트리코데르마 레세이 DSCE24 배양 후 36 시간부터 96시간 사이에 12 시간 간격으로 추가 접종 하였다. 이후 상기 배양액을 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 후 상등액을 비교 효소액으로 사용하였다.

접종 시점에 따른 총 셀룰라아제 활성 및 β-글루코시다아제 활성은 하기 표 5에 기재하였다(도 1).

트리코데르마 레세이 DSCE24 배양 72 hr에 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763 혼합배양 시 총 셀룰라아제 활성은 대조군 대비 약 43% 증가된 2.43 FPU/ml이고, β-글루코시다아제 활성은 대조군 대비 38% 증가 된 8.3 U/ml을 나타내어 혼합 배양의 최적의 접종 시점이 72 hr인 것을 확인하였다. 이는 트리코데르마 레세이 DSCE24가 바이오매스 성분 중 셀룰로오스를 분해하여 셀로올리고당, 셀로바이오스(cellobiose) 및 글루코오스를 생산하고 이중 셀로바이오스를 트리코데르마 하지아눔 ATCC 32086이 탄소원으로 이용하여 β-글루코시다아제를 생성하여, 생성된 β-글루코시다아제에 의해 시너지 효과가 발생하여 총 셀룰라아제 활성이 상승한 것으로 판단된다.

실시예 4: 당화능 평가

트리코데르마 레세이 DSCE24 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763 혼합 배양 농축액(본 배양 후의 배양액을 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 10 kDa 원심필터가 장착된 스터드 셀(Stirred cell)을 이용하여 농축하였다), Cellic CtecⅡ(Novozymes社, 덴마크) 및 효소 혼합물 농축액(트리코데르마 레세이 DSCE24 및 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763 본 배양 후의 배양액을 각각 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 회수한 상등액(효소)을 혼합하여 10 KDa 원심필터가 장착된 스터드 셀을 이용하여 농축) 각각의 당화능을 측정하였다.

당화능 측정은 상기 각각의 효소(20 FPU/g 기질)를 하기 표 6의 조성을 갖는 반응액에 첨가하여 180 rpm으로 교반하며 72 시간 동안 반응시켰으며, 전환되는 글루코오스의 양은 샘플을 채취하여 원심분리(12000 rpm x 5분) 후 상등액을 당분석기(YSI 2900, YSI life science社, 미국)를 이용하여 측정하였다.

상기 방법에 의한 당화율 측정 결과, Cellic CtecⅡ과 유사한 수준의 당화율을 나타냄을 확인하였다(도 2). 따라서 본 발명의 균주 혼합 배양액을 이용하는 경우 기존의 효소 혼합이 불요하여 제조 공정이 단순해지고, 발효 비용의 절감 효과를 기대할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC18256P

20130827

Claims

다음 단계를 포함하는 셀룰라아제의 생산방법:
(a) 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum) 균주를 배지에 접종하는 단계로서, 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주의 접종량은 트리코데르마 하지아눔 균주의 접종량을 초과하지 않으며; 및
(b) 단계 (a)의 균주를 배양하여 셀룰라아제를 생산하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 트리코데르마 하지아눔 균주는 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주와 트리코데르마 하지아눔 균주의 접종 비는 3:7-5:5인 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 셀룰라아제의 생산방법:
(a) 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) DSCE24(기탁번호 KCTC 18256P) 균주 및 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum) 균주를 배지에 접종하는 단계로서, 상기 트리코데르마 하지아눔 균주의 접종은 상기 트리코데르마 레세이 DSCE24 균주를 접종하여 60-96시간 배양한 후에 실시하며; 및
(b) 단계 (a)의 균주를 배양하여 셀룰라아제를 생산하는 단계.
제 4 항에 있어서, 상기 트리코데르마 하지아눔 균주는 트리코데르마 하지아눔 KCCM 11763 균주인 것을 특징으로 하는 방법.