JP5305353B2 - alpBをコードする遺伝子の機能が欠損している麹菌及びその利用 - Google Patents
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(2)ゲノムDNA中に2種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ(alpA、alpB)をコードする遺伝子を保有するアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)のalpBをコードする遺伝子のみを欠損させることで、麹汁培地上で胞子を形成せず、親株に比べて総プロテアーゼ活性を向上させたアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
(1)相同組換え法によるalpA遺伝子破壊株およびalpB遺伝子破壊株の作成
alpA、alpBそれぞれの遺伝子破壊株の単離には、まず親株として、硫酸(硫黄源)を資化することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・オリゼーΔligD株を用いた。なお、ΔligD株は、公知文献(Fungal Genet Biol.45(2008)、878−889)に従い、アスペルギルス・オリゼーRIB40株(ATCC42149)を元に作成された株である。また、マーカー遺伝子としては、硫酸(硫黄源)を資化する機能をもつアスペルギルス・ニドランスsC遺伝子(Mol Gen Genet.1995 May 20;247(4):423−429.)を用いた。
alpA遺伝子コード領域の上流領域約1.5kbp(alpA ORF上流領域)から下流領域約1.5kbp(alpA ORF下流領域)までをプライマーAとBを用いてPCR法により増幅した。PCR反応にはKOD−Plus−(東洋紡ライフサイエンス)を用い、条件は附属のプロトコルに従った。以下で行うPCR反応についても、同様の条件を用いた。該増幅産物をベクターpENTR D/TOPO(インビトロジェン)に導入し、完成したベクターをプライマーCとDを用いて再度PCR法により増幅し、増幅断片「い」を得た。
トレースエレメント組成:硫酸鉄七水和物0.1%、硫酸亜鉛七水和物0.88%、硫酸銅五水和物0.04%、硫酸マンガン四水和物0.015%、四ホウ酸ナトリウム十水和物0.01%、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物0.005%。
alpB遺伝子コード領域の上流領域約1.5kbp(alpB ORF上流領域)から下流領域約1.5kbp(alpB ORF下流領域)までをプライマー1と2を用いてPCR法により増幅した。該増幅断片をベクターpENTR D/TOPO(インビトロジェン)に導入し、完成したベクターを制限酵素NdeIサイト、SphIサイトを付加したプライマー3と4を用いて再度PCR法により増幅した。増幅断片を制限酵素NdeI、SphIで処理し、alpBのORF部分を欠損した直鎖状の配列(甲)を得た。
上記(1)で作成したアスペルギルス・オリゼーalpA欠損株およびalpB欠損株について、胞子形成能、生育および総プロテアーゼ活性を確認した。
(2−1)胞子形成能
直径8cmのプラスチックシャーレに麹汁培地を作成し、親株と該麹菌を播種した。30℃で7日間培養した後、0.03%ツイーンを含む滅菌蒸留水20mlを加え、胞子を激しく縣濁し、ミラクロス(コスモバイオ社)でろ過することで、胞子縣濁液を得た。得られた胞子縣濁液の胞子数を血球計算盤で測定し、プレート一枚当たりに形成された胞子数を測定した。その結果、alpA遺伝子破壊株とは対照的に、alpB遺伝子破壊株はほとんど胞子を形成しないことが明らかとなった(表3)。なお表3中、ΔligDは親株、ΔalpAはalpA遺伝子破壊株、ΔalpBはalpB遺伝子破壊株をそれぞれ示す。
直径8cmのプラスチックシャーレに麹汁培地を作成し、親株と該麹菌をプレートの中央に播種した。30℃で24時間おきにコロニーの直径を測定した。その結果、親株であるΔligD株、alpA破壊株、alpB破壊株間で生育に差がないことが明らかとなった(図2)。
脱脂大豆5gに8mlの滅菌蒸留水を散水し、5gの割砕小麦を加えてよく攪拌し、40分オートクレーブ処理を行った原料を醤油原料培地とした。該醤油原料培地1g当たり、胞子数が106個となるように該麹菌の胞子を散布し、よく攪拌して、28℃で48時間程度培養した。結果、培養した麹では、胞子の形成はほとんど観察されなかった。
上記の麹に140mlの冷水を添加しよく攪拌した後4時間放置し、これをろ紙でろ過し、酵素溶液を調整した。調整した酵素溶液を用いて総プロテアーゼ活性を測定した。測定には「しょう油試験法」(財団法人日本醤油研究所)に記載の方法を用い、以下の手順で行った。
以上の結果より、alpBをコードする遺伝子の機能を欠損させることによって、胞子形成能が著しく低く、しかも総プロテアーゼ活性が親株に比べて高くなっている所期の麹菌を得ることができることが明かとなった。なお、上記の特性は、多少の程度の差はあるものの、取得したalpB破壊株すべてにおいて観察されたことから、alpB破壊に由来することが確認された。
実施例1で選択したalpB破壊株を使用して醤油を製造し、醸造特性を調べた。すなわち、脱脂大豆5kgに150%散水し、2kg/cm2で13分間加圧蒸煮後、40℃に冷却したものに炒熬割砕した小麦4.8kgを混合して粉合せ原料を得、これにalpB破壊株を接種混合して小型通風製麹装置内で送風温度28℃で24時間、次いで26℃で20時間製麹して醤油麹を得た。
Claims (2)
- ゲノムDNA中に2種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ(alpA、alpB)をコードする遺伝子を保有するアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)のalpBをコードする遺伝子のみを欠損させることで、麹汁培地上で胞子を形成せず、親株に比べて総プロテアーゼ活性を向上させたアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)を用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
- ゲノムDNA中に2種のサブチリシンリレーテッドプロテアーゼ(alpA、alpB)をコードする遺伝子を保有するアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)のalpBをコードする遺伝子のみを欠損させることで、麹汁培地上で胞子を形成せず、親株に比べて総プロテアーゼ活性を向上させたアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
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