ES2256895T3 - Celulas huesped y metodos de produccion de proteinas. - Google Patents
Celulas huesped y metodos de produccion de proteinas.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A NUEVAS CELULAS ANFITRIONAS Y A UNOS PROCEDIMIENTOS DE PRODUCCION DE PROTEINAS. MAS ESPECIFICAMENTE ESTA INVENCION SE REFIERE A UNA CELULA ANFITRIONA UTIL PARA LA EXPRESION DE PROTEINAS HETEROLOGAS, EN LAS CUALES LA CELULA MADRE EN CUESTION HA SIDO GENETICAMENTE MODIFICADA PARA EXPRESAR NIVELES PRACTICAMENTE REDUCIDOS DE UNA METALOPROTEASA O DE UNA PROTEASA ALCALINA. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR UNA PROTEINA HETEROLOGA, CONSISTIENDO ESTE PROCEDIMIENTO EN CULTIVAR LA CELULA ANFITRIONA EN UN MEDIO DE CRECIMIENTO ADECUADO Y LUEGO, EN RECUPERAR LA PROTEINA DESEADA.
Description
Células huésped y métodos de producción de
proteínas.
La presente invención se refiere a células
huésped fúngicas nuevas y a métodos para producir proteínas. Más
específicamente, la invención se refiere a una célula de
Aspergillus oryzae útil para la expresión de proteínas
heterólogas donde la célula huésped ha sido genéticamente modificada
para expresar niveles significativamente reducidos de una
metaloproteinasa y una proteasa alcalina. Además, la invención se
refiere a un método para producir proteínas de interés en altos
rendimientos usando los hongos de la invención, donde el método
comprende cultivar la célula en un medio de crecimiento adecuado,
seguido de la recuperación de la proteína deseada. La invención
también comprende métodos para producir tales hongos y constructos
de ADN para su uso en estos métodos.
El uso de células huésped recombinantes en la
expresión de proteínas heterólogas ha simplificado mucho en los
últimos años la producción de grandes cantidades de proteínas
comercialmente valiosas que de lo contrario son obtenibles sólo
mediante la purificación de sus fuentes nativas. Habitualmente, hay
una selección variada de sistemas de expresión de los cuales se
puede hacer una selección para la producción de cualquier proteína
dada, incluyendo huéspedes eubacteriales y eucarióticos. La
selección de un sistema de expresión apropiado a menudo depende no
sólo de la capacidad de la célula huésped para producir
rendimientos adecuados de la proteína en un estado activo, sino que
también, en gran medida, puede ser determinada por el uso final al
que está destinada la proteína.
Un problema frecuentemente encontrado es el alto
nivel de enzimas proteolíticas producidas por una célula huésped
dada o presente en el medio de cultivo. Se ha sugerido que se
podrían proporcionar organismos huésped privados de la capacidad de
producir compuestos proteolíticos específicos. Por ejemplo, la
solicitud de patente internacional WO 90/00192 (Genencor) describe
huéspedes fúngicos filamentosos incapaces de segregar proteinasa
aspártica enzimáticamente activa, y EP 574 347 (Ciba Geigy AG)
describe huéspedes de Aspergillus defectuosos en una serina
proteasa del tipo subtilisina.
Se han aislado metaloproteasas de varias fuentes
eucarióticas. Las metaloproteasas neutras, es decir metaloproteasas
con actividad óptima a un pH neutro, aisladas de cepas de
Aspergillus también han sido descritas. Las propiedades
fisicoquímicas de dos metaloproteasas neutras de Aspergillus
sojae, NpI y NpII, han sido descritas en una serie de estudios
(Sekine, H. 1972. Agric. Biol. Chem. 36:198-206,
207-216; Sekine, H. 1972. Agric. Biol. Chem.
36:2143-2150). Se reveló que las características
enzimáticas y fisicoquímicas de NpI, pero no de NpII, se asemejan a
las de la termolisina de Bacillus thermoproteolyticus. Se ha
descrito recientemente la secuencia de ADNc de una metaloproteasa
neutra, NpII, de Aspergillus oryzae (Tatsumi H, et al.
1991. Mol. Gen. Genet. 228:97-103). No obstante, la
secuencia de ADNc de una metaloproteasa neutra del grupo NpI de
Aspergillus oryzae nunca ha sido descrita.
La proteasa alcalina es una serina proteasa con
un pH alcalino óptimo (Nakagawa, Y. 1970. Methods Enzymol.
19:581-591). Es un homólogo de la subtilisina y es
la endopeptidasa alcalina extracelular predominante de
Aspergillus oryzae. El gen ha sido aislado y caracterizado
(Murakami, et al. 1991. Agric. Biol. Chem.
55:2807-2811). Otras dos especies de
Aspergillus, A. flavus y A. sojae, producen
enzimas idénticas o muy relacionadas.
Un papel potencial de las metaloproteasas y
proteasas alcalinas para reducir la estabilidad de productos
proteínicos obtenidos a partir de Aspergillus no ha sido
descrito.
Según la presente invención se ha hallado
recientemente que la actividad proteolítica de la metaloproteasa I
neutra y de la proteasa alcalina, sea de forma individual o en
combinación, puede reducir significativamente la estabilidad de un
producto proteínico de interés producido por una célula dando como
resultado un rendimiento reducido de dicha proteína.
En consecuencia, la presente invención
proporciona una célula de Aspergillus orzyae en la que se ha
introducido una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un
polipéptido heterólogo, donde la célula ha sido modificada mediante
la tecnología del ADN recombinante en un modo en el que
a) una metaloproteasa endógena,
- i)
- codificada por la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO 2, o una secuencia de ADN que tiene al menos una identidad del 70% con la SEC ID NO: 2, y
b) una actividad proteasa alcalina endógena,
codificada por la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO 3, o
una secuencia de ADN que tiene al menos una identidad del 70% con
la SEC ID NO: 3,
son funcionalmente inactivas o expresadas a
niveles reducidos en comparación con una célula parental.
Según otro aspecto, la invención proporciona un
método para producir un producto proteínico heterólogo en una
célula de Aspergillus oryzae de la invención, donde el
método comprende la introducción en la célula de una secuencia de
ácidos nucleicos que codifique la proteína, el cultivo de la célula
en un medio de crecimiento adecuado, y la recuperación del producto
proteínico heterólogo.
Mediante el método de la invención, la actividad
proteolítica resultante de una metaloproteasa I neutra y de una
proteasa alcalina son significativamente reducidas, de ese modo
mejorando la estabilidad y el rendimiento de la proteína obtenida
por el método. Además, la proteína obtenida por el método de la
invención puede ser una proteína precursora tal como un zimógeno,
una proteína híbrida, una proteína obtenida como una secuencia pro
o secuencia pre-pro, o cualquier otro tipo de forma
inmadura.
La presente invención se ilustra con mayor
detalle haciendo referencia a los dibujos anexos, en los que:
La Fig. 1 es un diagrama de la construcción del
plásmido pJaL335 que contiene el gen pyrG;
La Fig. 2 es un diagrama de la construcción del
plásmido pSO5 que contiene las secuencias 5' y 3' del gen
pyrG;
La Fig. 3 es un diagrama de la construcción del
plásmido pJaL212 donde la secuencia de codificación de pyrG
ha sido insertada entre las secuencias 5' y 3' del gen
alp;
La Fig. 4 es un diagrama de la construcción del
plásmido pJaL399 donde la secuencia de codificación de NpI es
interrumpida;
La Fig. 5 muestra la secuencia de aminoácidos
N-terminal de la lipasa B de Candida
antarctica y las secuencias de dos cebadores oligonucleótidos
derivados de esta secuencia;
La Fig. 6 es un diagrama de la construcción del
plásmido pMT1305 que contiene la lipasa B de C.
antarctica;
La Fig. 7 es un diagrama de la construcción del
plásmido pMT1329 que contiene la secuencia parcial del extremo 5'
del gen de la lipasa B de C. antarctica;
La Fig. 8 es un diagrama de la construcción del
plásmido pMT1332 que contiene el gen de la lipasa B de C.
antarctica; y
La Fig. 9 es un diagrama de la construcción del
plásmido de expresión pMT1335 que contiene el gen de la lipasa B de
C. antarctica.
La presente invención proporciona una célula
huésped útil para la expresión de proteínas heterólogas, donde la
célula ha sido genéticamente modificada para expresar niveles
significativamente reducidos de actividad metaloproteasa y proteasa
alcalina en comparación con una célula parental. Dicha célula
huésped está derivada de la célula parental que puede ser una
célula de tipo salvaje.
Preferiblemente, la célula huésped de la
invención es un hongo filamentoso capaz de producir una proteína
deseada. En una forma de realización preferida, el hongo
filamentoso es una cepa de Aspergillus oryzae.
En el contexto de esta invención, una
metaloproteasa es una enzima proteolítica que contiene un centro
metálico de zinc catalítico que participa en la hidrólisis del
esqueleto peptídico del sustrato. El centro de zinc activo
diferencia estas proteasas de las calpaínas, cuyas actividades son
dependientes de la presencia de calcio. Se confirma una proteasa
como una metaloproteasa por la pérdida reversible de actividad
proteolítica tras la eliminación del centro de zinc con 1 mM
1,10-fenantrolina, y su restauración después de la
valoración con Zn^{2+} (0.1-100 mM).
En una forma de realización preferida, la
metaloproteasa contemplada en el contexto de esta invención es una
metaloproteasa neutra, que es una metaloproteasa que posee actividad
proteolitica óptima en la región de pH neutro, es decir en la gama
de pH de aproximadamente 6-8, preferiblemente en la
gama de pH de aproximadamente 6.5-7.5, más
específicamente, alrededor de un pH 7. Más particularmente, la
metaloproteasa contemplada en el contexto de esta invención es una
metaloproteasa neutra de Aspergillus del grupo NpI o NpII
(Tatsumi, et al., 1991, supra).
En una forma de realización preferida, la
metaloproteasa es una Metaloproteasa I neutra (NpI) de
Aspergillus oryzae que comprende una secuencia de
aminoácidos derivada de la secuencia de nucleótidos presentada como
la SEC. ID. N°. 2, o una secuencia homóloga a ésta.
En el contexto de esta invención una proteasa
alcalina es una serina proteasa con una actividad que alcanza el
valor máximo en la gama de pH de neutro a alcalino. Los análisis de
la secuencia de aminoácidos de las proteasas alcalinas indican que
existe homología con el subgrupo de las subtilasas de serina
proteasas del tipo subtilisina. Como está resumido por Siezen, et
al. (1991. Protein Eng. 4:719-737) más de 50
subtilasas han sido identificadas a partir de una amplia variedad
de organismos, los cuales varían desde varias especies de
bacterias, incluyendo especies gram positivas y gram negativas,
hasta los hongos y levaduras y hasta eucariotas más grandes,
incluyendo gusanos, insectos, plantas y mamíferos. La secuencia de
aminoácidos ha sido determinada en más de 40 de éstas subtilasas, y
revela que la región madura de la enzima varia de 268 a 1775
aminoácidos de largo y una región pre-pro de 27 a
280 aminoácidos en la proximidad del N-terminal. En
los hongos y la levadura, la variación es aparentemente más
pequeña, con unas gamas correspondientes de 279 a 281 y de 105 a
121 en los hongos, y de 297 a 677 y de 126 a 280 en la levadura. Un
fragmento de ADNc de la zona de codificación entera de la proteasa
alcalina de Aspergillus oryzae fue clonado y expresado en
Saccharomyces cerevisiae (Tatsumi, H, et al. 1989.
Mol. Gen. Genet. 219:33-38). La estructura primaria
mostró que compartía del 29% al 44% de homología con otras
subtilisinas secuenciadas, y que tres residuos en el centro activo,
Asp32, His 64 y Ser221 en la subtilisina BPN', fueron
conservados.
En una forma de realización preferida, la
proteasa alcalina es una proteasa alcalina de Aspergillus
oryzae (alp), preferiblemente codificada por una
secuencia de ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos
presentada como la SEC. ID. N°. 3, o una secuencia homóloga a
ésta.
Según se utiliza en este caso, la homología
secuencial del ADN está determinada como el grado de identidad
entre las dos secuencias indicando una derivación de la primera
secuencia de la segunda. La homología puede ser determinada de
manera adecuada mediante programas informáticos señalados en la
técnica, tales como GAP, proporcionado en el paquete del programa
GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, versión 8, agosto
1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison WI, USA;
Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., 1970. J. Mol. Biol.
48:443-453). Usando los siguientes ajustes de GAP
para la comparación de la secuencia de ADN, un penalidad de
creación de 5.0 y una penalidad de extensión de 0.3, la zona de
codificación de la secuencia de ADN análoga muestra algo de
identidad preferiblemente de al menos el 70%, más preferiblemente
de al menos el 80%, más preferiblemente de al menos el 90%, más
preferiblemente de al menos el 95%, y más preferiblemente de al
menos el 97% con la región de codificación de una secuencia de ADN
indicada.
La homología de la secuencia de aminoácidos como
se utiliza en este caso es determinada de forma similar como el
grado de identidad entre dos secuencias indicando una derivación de
la primera secuencia de la segunda. La homología puede ser
determinada de manera adecuada mediante los programas informáticos
señalados en la técnica, tales como GAP al que se ha hecho
referencia arriba (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., 1970,
supra). Usando GAP con los ajustes siguientes para comparar
la secuencia de aminoácidos, una penalidad de creación de 3.0 y una
penalidad de extensión de 0.1, el polipéptido codificado por una
secuencia de ADN análoga muestra algo de identidad preferiblemente
al menos del 70%, más preferiblemente al menos del 80%, más
preferiblemente al menos del 90%, más preferiblemente al menos del
95%, especialmente al menos del 97% con una secuencia de ADN que
comprende la región que codifica la proteína estructural.
La presente invención está también dirigida a
variantes de metaloproteasas y proteasas alcalinas que tienen una
secuencia de aminoácidos que difiere de no más de tres aminoácidos,
preferiblemente de no más de dos aminoácidos, y más preferiblemente
de no más de un aminoácido del polipéptido maduro de la secuencia
de aminoácidos derivada de la SEC. ID. N°. 1, SEC. ID. N°. 2 y SEC.
ID. N°. 3.
La hibridación según se utiliza en este caso se
destina a indicar que una secuencia de ADN análoga se enlaza a una
sonda de oligonucleótidos correspondiente a un polipéptido
codificado por una secuencia de ADN indicada que comprende la
región que codifica la proteína estructural bajo ciertas
condiciones específicas que están descritas con más detalle más
abajo.
Unas condiciones adecuadas para determinar la
hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia homóloga
de ADN o ARN implica prehumedecer el filtro que contiene los
fragmentos de ADN o ARN que deben de ser hibridados en 5x SSC
(tampón citrato salino estándar; ver, Sambrook et al., 1989.
Molecular Cloninq, Cold Spring Harbor NY, USA) durante 10
min, y prehibridar el filtro en una solución de 5x SSC, 5 x
solución de Denhardt, 0.5% de SDS y 100 \mug/ml de ADN de esperma
de salmón desnaturalizado y sometido a ultrasonidos (Sambrook et
al. 1989, supra), y a continuación hibridar en la misma
solución que contiene una sonda cebada aleatoriamente (Feinberg, A.
P., and Vogelstein, B. 1983. Anal. Biochem.
132:6-13), marcada con
^{32}P-DCTP (actividad específica > 1 x
10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 45°C. El filtro es
luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2x SSC, 0.5% de SDS a
una temperatura de al menos 55°C (baja estringencia), más
preferiblemente al menos 60°C (estringencia media), más
preferiblemente al menos 65°C (estringencia media/alta), más
preferiblemente al menos 70°C (alta estringencia), incluso más
preferiblemente al menos 75°C (estringencia muy alta). Las
moléculas a las que la sonda de oligonucleótidos se hibrida bajo
estas condiciones están detectadas por exposición a una película de
rayos x.
La célula de Aspergillus oryzae de la
invención, para expresar niveles significativamente reducidos de
actividad metaloproteasa y proteasa alcalina, es genéticamente
modificada, lo cual puede ser conseguido usando la tecnología del
ADN recombinante estándar conocida por un experto en la técnica.
Las secuencias de genes respectivamente responsables de producir
actividad metaloproteasa y proteasa alcalina pueden ser inactivadas
o parcialmente o totalmente eliminadas. Así, una célula de
Aspergillus oryzae de la invención expresa niveles reducidos
o no detectables de metaloproteasa y proteasa alcalina o expresa
metaloproteasa y proteasa alcalina funcionalmente inactivas.
En una forma de realización particular, dicha
inactivación se obtiene mediante la modificación de las respectivas
regiones estructurales o reguladoras codificadas dentro de los
genes de la metaloproteasa y de la proteasa alcalina de interés.
Técnicas conocidas y útiles incluyen, pero no se limitan a,
mutagénesis específica o aleatoria, mutagénesis generada por PCR,
supresión de ADN sitio específica, inserción y/o sustitución,
interrupción génica o sustitución de genes, técnicas sin sentido, o
una combinación de éstas.
La mutagénesis puede ser realizada usando un
agente mutagenizante físico o químico adecuado. Ejemplos de un
agente mutagenizante físico o químico adecuado para este objetivo
incluyen, pero no se limitan a, irradiación ultravioleta (UV),
hidroxilamina,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil
metano sulfonato (EMS), bisulfito sódico, ácido fórmico, y análogos
de nucleótidos. Cuando se usan estos agentes, la mutagénesis es
normalmente realizada incubando la célula que debe ser mutagenizada
ante el agente mutagenizante de elección bajo las condiciones
adecuadas, y seleccionando células que muestran una producción
significativamente reducida de NpI y alp.
La modificación puede también ser realizada por
la introducción, sustitución o eliminación de uno o más nucleótidos
en la secuencia estructural o un elemento regulador requerido para
la transcripción o traducción de la secuencia estructural. Por
ejemplo, se pueden insertar o eliminar nucleótidos de tal manera
que se produzca la introducción de un codón de detención, la
eliminación del codón de iniciación o un cambio del marco de lectura
abierto de la secuencia estructural. La modificación o inactivación
de la secuencia estructural o un elemento regulador derivado puede
realizarse por mutagénesis sitio dirigida o mutagénesis generada
por PCR conforme a los métodos conocidos en la técnica. Aunque, en
principio, la modificación puede ser realizada in vivo, es
decir directamente en la célula que expresa los genes de la
metaloproteasa y de la proteasa alcalina, actualmente se prefiere
que la modificación sea realizada in vitro según se
ejemplifica más abajo.
Un modo conveniente de inactivar o reducir la
producción de metaloproteasa y de proteasa alcalina en una célula
huésped de elección se basa en las técnicas de interrupción génica.
En este método una secuencia de ADN correspondiente al gen endógeno
o fragmento de gen de interés es mutagenizada in vitro.
Dicha secuencia de ADN codifica de este modo un gen defectuoso que
es luego transformado en la célula huésped. Mediante recombinación
del homólogo, el gen defectuoso reemplaza al gen endógeno o al
fragmento de gen. Puede ser deseable que el gen defectuoso o
fragmento de gen también codifique un marcador que puede ser usado
para seleccionar transformantes donde los genes respectivos que
codifican la metaloproteasa y/o proteasa alcalina han sido
modificados o destruidos.
Los métodos para eliminar o interrumpir un gen
objetivo están específicamente descritos por Miller, et al
(1985. Mol. Cell. Biol. 5:1714-1721); WO 90/00192;
May, G. (1992. Applied Molecular Genetics of Filamentous
Funqi. J.R. Kinghorn and G. Turner, eds., Blackie Academic and
Professional, pp. 1-25); y Turner, G. (1994.
Vectors for Genetic Manipulation. S.D. Martinelli and J.R.
Kinghorn, eds., Elsevier, pp.641-665).
De forma alternativa, la modificación o
inactivación de la secuencia de ADN puede ser realizada por
técnicas antisentido establecidas usando una secuencia de
nucleótidos complementaria a una secuencia de codificación para
metaloproteasa, p. ej. las secuencias de nucleótidos presentadas
como SEC. ID. N°. 1 y SEC. ID. N°. 2, o una secuencia de
codificación de proteasa alcalina, p. ej. la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N°. 4. La tecnología
antisentido y su aplicación están descritas con detalle en la
patente estadounidense N°. 5.190.931 (Universidad de Nueva
York).
En consecuencia, debido a la modificación
genética, la célula de Aspergillus oryzae de la invención
expresa niveles significativamente reducidos de actividad
metaloproteasa y proteasa alcalina. En una forma de realización
preferida, el nivel de estas actividades proteoliticas expresado por
la célula de Aspergillus oryzae es reducido individualmente
más de aproximadamente el 50%, preferiblemente más de
aproximadamente el 85%, más preferiblemente más de aproximadamente
el 90%, y más preferiblemente más de aproximadamente el 95%. En
otra forma de realización preferida, las actividades proteolíticas
en la célula de Aspergillus oryzae de la invención pueden ser
reducidas en cualquier combinación. En una forma de realización más
preferida, el producto expresado por la célula de Aspergillus
oryzae está esencialmente libre de actividad proteolítica
debido a la metaloproteasa y a la proteasa
alcalina.
alcalina.
Mediante el método de la invención, las
actividades proteolíticas de la metaloproteasa y de la proteasa
alcalina son significativamente reducidas, mejorando así la
estabilidad y aumentando el rendimiento de los productos
proteínicos susceptibles sintetizados por la célula de
Aspergillus oryzae de la invención. Más específicamente,
mediante el método de la invención, la célula de Aspergillus
oryzae es genéticamente modificada dentro de las regiones
estructurales y/o reguladoras codificadas dentro de los genes de la
metaloproteasa y de la proteasa alcalina.
En consecuencia, otro aspecto de la invención
proporciona un método para producir proteínas en una célula de
Aspergillus oryzae de la invención, incluyendo polipéptidos
heterólogos, donde dicho método comprende introducir en dicha
célula una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el producto
proteínico de interés, cultivando la célula en un medio de
crecimiento adecuado, seguido de la recuperación del producto
proteínico.
Así, la célula de Aspergillus oryzae de la
invención contendrá las regiones genéticas estructurales y
reguladoras necesarias para la expresión del producto deseado. La
naturaleza de tales regiones estructurales y reguladoras depende en
gran medida del producto y de la célula de Aspergillus oryzae
en cuestión. El diseño genético de la célula de Aspergillus
oryzae de la invención puede ser realizado por el experto en la
técnica usando la tecnología del ADN recombinante estándar para la
transformación o transfección de una célula huésped (véase, p. ej.,
Sambrook et al., inter alia).
Preferiblemente, la célula de Aspergillus
oryzae es modificada mediante los métodos conocidos en la
técnica para la introducción de un vehículo de clonación apropiado,
es decir un plásmido o un vector, que comprende un fragmento de ADN
que codifica el producto proteínico deseado. El vehículo de
clonación puede ser introducido en la célula huésped bien como un
plásmido que se replica de manera autónoma o integrado en el
cromosoma. Preferiblemente, el vehículo de clonación comprende una
o más regiones estructurales operativamente enlazadas a una o más
regiones reguladoras apropiadas.
Las regiones estructurales son regiones de las
secuencias de nucleótidos que codifican el producto proteínico
deseado. Las regiones reguladoras incluyen regiones del promotor
que comprenden secuencias de transcripción y de control de la
traducción, regiones del terminador que comprenden señales de
detención, y regiones de poliadenilación. El promotor, es decir una
secuencia de nucleótidos que muestra una actividad transcripcional
en la célula huésped de elección, puede ser un derivado de un gen
que codifica una proteína extracelular o una intracelular,
preferiblemente una enzima, tal como una amilasa, una glucoamilasa,
una proteasa, una lipasa, una celulasa, una xilanasa, una
oxidorreductasa, una pectinasa, una cutinasa, o una enzima
glicolítica. Ejemplos de promotores adecuados para la transcripción
en una célula huésped fúngica son los promotores derivados del gen
que codifica la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae,
\alpha-amilasa neutra de Aspergillus
Niger, \alpha-amilasa ácida estable de
Aspergillus Niger, glucoamilasa (GluA) de Aspergillus
Niger o de Aspergillus awamsii, acetamidasa de
Aspergillus nidulans, proteasa alcalina de Aspergillus
oryzae, triosa fosfatasa isomerasa de Aspergillus
oryzae, proteinasa aspártica de Rhizopus meihei, y
lipasa de Rhizopus meihei. Los promotores preferidos son la
TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y GluA de
Aspergillus awamsii.
El vehículo de clonación puede también incluir un
marcador seleccionable, tal como un producto genético que
complemente una carencia en la célula huésped de Aspergillus
oryzae, o uno que confiera resistencia a los antibióticos.
Ejemplos de antibióticos útiles como marcadores para la selección
de Aspergillus incluyen higromicina, fleomicina y Basta.
Otros ejemplos de marcadores para la selección de
Aspergillus incluyen amdS, que codifica una enzima
implicada en la utilización de acetamida; pyrG, que codifica
una enzima implicada en la biosíntesis de uridina; argB, que
codifica una enzima implicada en la biosíntesis de arginina;
niaD, que codifica una enzima implicada en la vía de
asimilación de nitrato; y sC, que codifica una enzima
implicada en la vía de asimilación de sulfato. Para el uso en una
célula huésped de Aspergillus se prefieren los marcadores
amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o de Aspergillus
oryzae. Además, la selección puede ser realizada por
cotransformación, donde la transformación se realiza con una mezcla
de dos vectores y la selección es realizada sólo para un
vector.
Los procedimientos usados para ligar el
constructo de ADN de la invención, el promotor, terminador y otros
elementos, respectivamente, y para insertarlos en vehículos de
clonación adecuados conteniendo la información necesaria para la
replicación, son conocidos por los expertos en la técnica (véase p.
ej., Sambrook et al., 1989; inter alia).
El caldo de cultivo o medio usado puede ser
cualquier medio convencional adecuado para el cultivo de la célula
huésped de la invención, y puede ser formulado según los principios
de la técnica precedente. El medio preferiblemente contiene fuentes
de nitrógeno y carbono al igual que otras sales inorgánicas. Los
medios adecuados, p. ej. medios mínimos o complejos, están
disponibles por proveedores comerciales, o pueden ser preparados
según recetas publicadas, como en The Catalogue of Strains,
published by The American Type Culture Collection. Rockville MD,
USA. 1970.
El pH apropiado para la fermentación a menudo
dependerá de factores tales como la naturaleza de la célula huésped
que va a ser usada, la composición del medio de crecimiento, la
estabilidad del polipéptido de interés, y similares. En
consecuencia, aunque la célula de Aspergillus oryzae de la
invención puede ser cultivada usando cualquier proceso de
fermentación realizado a cualquier pH, es ventajoso que el pH del
proceso de fermentación sea tal que las actividades de la proteasa
acídica y/o netura de la célula de Aspergillus oryzae sean
esencialmente eliminadas o al menos significativamente reducidas.
Por lo tanto, la eliminación de la actividad de proteasa aspártica
como se describe en WO 90/00192 puede también ser realizada
aumentando la fermentación del pH, y no presenta ningún efecto
ventajoso adicional en el rendimiento de una proteína deseada de
células huésped cultivadas en la gama de pH alcalino.
Si el pH del proceso de fermentación está dentro
de la gama de 5 a 11, como por ejemplo de 6 a 10.5, 7 a 10, u 8 a
9.5, la actividad de las proteasas acídicas, tales como las serina
proteasas y aspárticas, y de las proteasas neutras en las gamas de
pH superiores a 7, será reducida o bloqueada. Ejemplos de enzimas
producidas bajo condiciones de fermentación alcalina incluyen
endoglucanasas, fitasas y protein-disulfuro
isomerasas.
No obstante, la gama de pH alcalino soportará la
actividad proteasa alcalina en una célula huésped inmodificada,
que, a su vez, puede de forma potencial suponer la degradación del
producto polipeptídico de interés. Consecuentemente, en tales casos
la inactivación del gen que codifica la proteasa alcalina es
especialmente ventajosa.
La inactivación del gen de proteasa alcalina de
la invención es también especialmente ventajosa para ciertas
células huésped, puesto que los niveles de actividades proteasa
acídica, neutra y alcalina varían de unas especies a otras. Por
ejemplo, el nivel de actividad proteasa alcalina en Aspergillus
oryzae es superior al de la de Aspergillus Niger.
Después del cultivo, la proteína deseada es
recuperada por los métodos convencionales de aislamiento y
purificación de proteínas de un caldo de cultivo. Los
procedimientos de purificación bien establecidos incluyen separar
las células del medio por centrifugado o filtración, precipitar los
componentes proteínicos del medio mediante una sal tal como sulfato
de amonio, y métodos cromatográficos tales como cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel,
cromatografía de afinidad, y similares.
El producto final deseado, es decir la proteína
heteróloga expresada por la célula huésped de la invención, puede
ser cualquier proteína o péptido eubacterial o eucariótico.
Tal y como se define en la presente, una
"proteína heteróloga" es un producto genético proteínico o
polipeptídico que no es nativo de la célula huésped, o es una
proteína nativa donde se han hecho modificaciones para alterar la
secuencia nativa, o es una proteína nativa cuya expresión es
alterada de forma cuantitativa como resultado de una manipulación
de una secuencia reguladora nativa requerida para la expresión de
la proteína nativa, tal como un promotor, un centro de unión al
ribosoma, etc., u otra manipulación de la célula huésped por
técnicas de ADN recombinante.
En una forma de realización más específica, el
producto es un péptido o proteína terapéuticamente activo, tal como
una hormona, en particular insulina, hormona del crecimiento,
glucagón, o somatostatina; una interleuquina, en particular
interferón; un factor de crecimiento hematopoyético, en particular
PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas), EPO
(eritropoyetina), o TPO (trombopoyetina); una proteasa, en
particular el factor VII, factor VIII, uroquinasa, quimosina, o
activador del t-plasminógeno; o albúmina de
suero.
En otra forma de realización preferida, el
producto es una enzima de origen fúngico o bacteriano.
La enzima es preferiblemente una enzima
glicosidasa, p. ej. una amilasa, en particular una
\alpha-amilasa (EC 3.2.1.1) o una
\beta-amilasa (EC 3.2.1.2); una glucan
1,4-\alpha-glucosidasa (EC
3.2.1.3), una celulasa, en particular una
endo-1,4-\beta-glucanasa
(EC 3.2.1.4) o una
endo-1,3(4)-\beta-glucanasa
(EC 3.2.1.6); una xilanasa, en particular una
endo-1,4-\beta-xilanasa
(EC 3.2.1.8) o una
xilan-endo-1,3-\beta-xilosidasa
(EC 3.2.1.32); una poligalacturonasa (EC 3.2.1.15); una
glucosidasa, en particular una \alpha-glucosidasa
(EC 3.2.1.20) o una \beta-glucosidasa (EC
3.2.1.21); una galactosidasa, en particular una
\alpha-galactosidasa (EC 3.2.1.22) o una
\beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23); una
endoglucanasa, en particular una
endo-1,3-\beta-glucanasa
(EC 3.2.1.39), una
endo-1,3-\alpha-glucanasa
(EC 3.2.1.59), una
endo-1,2-\beta-glucanasa
(EC 3.2.1.71), o una
endo-1,6-\beta-glucanasa
(EC 3.2.1.75); y una
celulosa-1,4-\beta-celobiosidasa
(EC 3.2.1.91).
En otra forma de realización preferida la enzima
es una enzima lipolítica, en particular una lipasa, una esterasa,
una fosfolipasa, o una liso-fosfolipasa.
En otra forma de realización preferida la enzima
es una fitasa, en particular una 3-fitasa (EC
3.1.3.8) o una 6-fitasa (EC 3.1.3.26).
En otra forma de realización preferida la enzima
es una enzima proteolítica.
En otra forma de realización preferida la enzima
es una lacasa, una pectinasa, o una cutinasa, o una
oxidorreductasa, tal como una peroxidasa.
En otra forma de realización preferida el
producto es un polipéptido híbrido, preferiblemente proquimosina y
proteasas del tipo pro-tripsina.
Debido a la ausencia de actividades
metaloproteasa y proteasa alcalina, la proteína heteróloga
expresada por la célula huésped puede también ser una proteína
precursora tal como un zimógeno, una proteína híbrida, una proteína
obtenida como una secuencia pro o secuencia pre-pro,
o cualquier otra forma inmadura.
La invención está posteriormente ilustrada con
referencia a los ejemplos siguientes que no deberían de ninguna
manera ser construidos limitando el objetivo de la invención tal y
como se define en las reivindicaciones anexas.
- IFO 4177 de Aspergillus oryzae:
- disponible por el Institute for Fermention, Osaka; 17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawaku, Osaka, Japan.
- DSM 2672 de Fusarium oxysporum:
- depositada según el Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para fines de procedimientos en materia de patentes en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh (DSM), Mascheroder Weg 1b, DE-3300 Braunschweig, Alemania, el 6 Junio 1983.
- HowB101:
- la construcción de esta cepa está descrita en el ejemplo 1.
- JaL125:
- la construcción de esta cepa está descrita en el ejemplo 1.
- JaL151:
- la construcción de esta cepa está descrita en el ejemplo 1.
- JaL228:
- la construcción de esta cepa está descrita en el ejemplo 1.
- alp:
- Este gen codifica para la proteasa alcalina mostrada en la SEC. ID. N°. 3.
- NpI:
- Este gen codifica para la metaloproteasa I neutra mostrada en la SEC. ID. N°. 2.
- pyrG:
- Este gen codifica para orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa, una enzima implicada en la biosíntesis de la uridina.
- p45:
- Este gen codifica para la metaloproteasa I neutra mostrada en la SEC. ID. N°. 1.
- pSO2:
- la preparación está descrita en el ejemplo 1.
- p5O5:
- la preparación está descrita en el ejemplo 1.
- pSRe403:
- La preparación está descrita en el ejemplo 1.
- PSRe403_SacII:
- la preparación está descrita en el ejemplo 1.
- pJaL173:
- la preparación está descrita en el ejemplo 1.
- pJaL212:
- la preparación está descrita en el ejemplo 1.
- pJaI335:
- la preparación está descrita en el ejemplo 1.
- pJaL389:
- la preparación está descrita en el ejemplo 1.
- pJaL399:
- la preparación está descrita en el ejemplo 1.
- pToC65:
- la construcción está descrita en EP 531 372 b.
- pToC68:
- la construcción está descrita en WO 91/17243.
- pToC90:
- un subclón de p3SR2 (Corrick et al., 1987. GENE 53:63- 71), conteniendo el gen amdS de Aspergillus nidulans como un fragmento XbaI de 2.7 kb , en un vector pUC19 (Yannisch-Perron et al., 1985.GENE 33:103-119), este plásmido fue preparado como se describe en WO 91/17243.
- pDM115:
- la preparación está descrita en el ejemplo 1.
- pMT1303:
- la preparación está descrita en el ejemplo 2.
- pMT1305:
- La preparación está descrita en el ejemplo 2.
- pMT1329:
- La preparación está descrita en el ejemplo 2.
- pMT1330:
- la preparación está descrita en el ejemplo 2.
- pMT1332:
- La preparación está descrita en el ejemplo 2.
- pMT1335:
- la preparación está descrita en el ejemplo 2.
La actividad metaloproteasa se mide como la
actividad tripsina liberada después de una
pre-incubación de 30-60 min a 25°C
en 0.1 M de Tris, 2 mM de CaCl_{2}, pH 7 (en la gama de pH
inferior se usa un tampón de 100 mM de borato, 10 mM de DMG, 2 mM
de CaCl_{2}). La actividad tríptica se mide en placas de
microvaloración; 100 ml de muestras son mezcladas con 100 ml de
sustrato L-BAPNA (una dilución hecha 50 veces en un
tampón de la concentración stock de 87 mg/ml de DMSO, Sigma Aldrich
Corp., St. Louis MO, USA) y la absorción a 405 nm es medida usando
un lector de microplacas Thermomax de Molecular Devices Corp.
(Sunnyvale CA, USA).
La actividad proteasa alcalina se evalúa a 25°C
usando el sustrato sintético,
N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida
(Sigma Aldrich Corp.) a 1 mM en 20 mM de Tris-HCl
(pH 8.0) en un volumen de reacción total de 1 ml. La liberación de
p-nitroanilina se visualiza a 410 nm (Ramesh, MV,
et al. 1994. Infection and Immunity
62:79-85).
Los genes alp y NpI fueron
eliminados cada uno de ellos por el método de sustitución de genes
de una única fase (Miller, B.L., et al., 1985. Mol. and
Cell. Biol. 5:1714-1721, y May, G. in Applied
Molecular Genetics of Filamentous Fungi, pp. 1-25.
J. R. Kinghorn and G. Turner, eds.; Blackie Academic and
Professional, 1992.) en dos ciclos consecutivos en una cepa de
pyrG de A. oryzae, usando el gen pyrG de A.
oryzae como marcador de la selección.
El gen pyrG de A. oryzae fue
clonado por hibridación cruzada con el gen pyrG de A.
Niger (van Hartingsveldt, W., et al., 1987. Mol. Gen.
Genet. 206: 71-75). Una genoteca de fago lambda de
ADN de IFO 4177 de A. oryzae parcialmente digerido con Sau3A
fue evaluada a baja estringencia con un fragmento de ADN de 1 kb
del gen pyrG de A. Niger. El ADN de un clon positivo
fue subclonado en un vector pUC118. El plásmido resultante, pSO2,
demostró que contenía el gen pyrG por complementación a un
mutante pyrG de A. Niger.
Un fragmento de 431 bp localizado 479 nucleótidos
hacia arriba del extremo 5' de la secuencia de codificación de
pyrG de A. oryzae fue amplificada por PCR, usando los
dos cebadores de oligonucleótidos siguientes:
Cebador A:
5'-GGAGGAAGATCTCTCTGGTACTCTTCGATCTC -3', SEC.
ID. N°. 4; y
Cebador B:
5'-GGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGC
-3'; SEC. ID. N°. 5.
Las regiones subrayadas indican secuencias
presentes en la región 5' del gen pyrG de A. oryzae.
Un centro de restricción fue insertado en el extremo 5' de cada
cebador para facilitar la clonación; el cebador A contiene un sitio
BglII y el cebador B contiene un sitio EcoRI adyacente a un sitio de
restricción HindIII.
El plásmido pSO2 fue usado como molde en la
reacción PCR. La reacción fue realizada en un volumen de 100 \mul
que contenía 2.5 unidades de Taq polimerasa, 100 ng de pSO2, 250 nm
de cada dNTP, y 10 pmol de cada uno de los dos cebadores
anteriormente descritos en un tampón de reacción de 50 mM de KCl,
10 mM de Tris-HCl pH 8.0, 1.5 mM de MgCl_{2}.
La amplificación se efectuó en un
Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480, y consistió en
un ciclo de 3 minutos a 94°C, seguido de 25 ciclos de 1 minuto a
94°C, 30 segundos a 55°C, y 1 minuto a 72°C. La reacción PCR produjo
un único fragmento de ADN de 430 bp de longitud. Este fragmento fue
digerido con BglII y EcoRI y aislado por electroforesis en gel,
purificado, clonado en el sitio correspondiente en el plásmido
pSO2, dando como resultado un plásmido que fue llamado pJaL335. Por
lo tanto, pJaL335 contiene el gen pyrG flanqueado por una
repetición de 431 bp. La Fig. 1 resume las fases de la construcción
de pJaL335.
Un plásmido de supresión de pyrG, pSO5,
fue construido a partir del plásmido pSO2 por digestión con NheI
para eliminar el gen que codifica la secuencia de aproximadamente
1.1 kb, luego se volvió a ligar, con aproximadamente 1 kb cada una
de las secuencias flanqueantes de pyrG 5' y 3'. La
construcción está ilustrada en la Fig. 2.
IFO 4177 de A. oryzae fue transformada con
el fragmento HindIII de 2.2 kb de pSO5 conteniendo la secuencia
flanqueante 5' y 3' del gen pyrG de A. oryzae. Los
transformantes fueron seleccionados por su resistencia al ácido 5-
fluoro-orótico, un fenotipo usado para seleccionar
para mutantes de pyrG. Se demostró mediante el análisis
Southern que un transformante, HowB101, contenía la supresión
esperada en el locus de pyrG. Puesto que HowB101 es
uridina dependiente, éste puede ser transformado con el gen
pyrG de tipo salvaje y transformantes seleccionados por la
capacidad para crecer en ausencia de uridina.
Una genoteca de ADN de IFO 4177 de A.
oryzae fue obtenida por digestión parcial con Sau3A. Los
fragmentos fueron ligados en pUC19 digerido con BamHI. La genoteca
fue seleccionada usando sondas de oligonucleótidos degeneradas
complementarias a fragmentos de secuencias proteínicas conocidas de
proteasa alcalina de A. oryzae. Un plásmido conteniendo un
fragmento Sau3A de 3.9 kb fue obtenido por esta selección y
denominado pSRe403.
pSRe403 fue digerido con SacII, luego se volvió a
ligar, para producir un plásmido en el que un fragmento del gen
alp de aproximadamente 1 kb de longitud fue eliminado. El
plásmido resultante fue denominado PSRe403\DeltaSacII.
pSRe403\DeltaSacII fue parcialmente digerido
con HindIII, se rellenaron las extremidades usando la polimerasa
Klenow, luego se volvió a ligar para eliminar el sitio HindIII en
la secuencia de pUC19, dando como resultado un plásmido que fue
denominado pJaL173.
Un fragmento de 3.8 kb conteniendo el gen
pyrG resultante de la digestión con HindIII de pSO2 fue
insertado en el sitio HindIII en pJaL173 para producir un plásmido
conteniendo el fragmento HindIII del gen pyrG flanqueado por
las secuencias 5' y 3' del gen alp en las posiciones hacia
arriba y hacia abajo, respectivamente. La Fig. 3 resume la
construcción del plásmido, que fue denominado pJaL212.
HowB101 fue transformado con el fragmento
SacI/SphI de 6.8 kb de pJaL212 usando los procedimientos estándar.
Este fragmento consiste en 1.5 kb del promotor de alp, el
gen pyrG y 1.5 kb del terminal 3' del gen alp. Los
transformantes fueron seleccionados por su capacidad para crecer en
ausencia de uridina.
Los transformantes fueron analizados por
transferencia de Southern donde un fragmento PstI/SacII de 599 bp
de pJaL 173 conteniendo parte del gen alp sirvió como una
sonda marcada radioactivamente. Las cepas portadoras de una
supresión del gen alp fueron reconocidas por un
desplazamiento de la banda PstI de tipo salvaje de 1.0 kb a una
banda 1.9 kb. Cuatro transformantes de este tipo fueron
identificados, uno de ellos fue denominado JaL125.
Una genoteca de cósmidos de A. oryzae fue
construida usando el kit SuperCos1 Cosmid Vector siguiente sin
modificar las instrucciones proporcionadas por el proveedor
(Stratagene, Inc., La Jolla, CA, USA).
ADN genómico de IFO 4177 de A. oryzae fue
obtenido a partir de protoplastos aislados por procedimientos
estándar (ver p. ej. Christensen, T., et. al., 1988.
Biotechnology 6:1419-1422). Después del aislamiento,
los protoplastos fueron granulados por centrifugado a 2500 rpm
durante 5 minutos en un Labofuge T (Neto). El granulado fue luego
suspendido en un tampón de 10mM de NaCl, 20 mM de
Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM de EDTA, y tratado con 100
\mug/ml de proteinasa K y 0.5% de SDS. Ésta y todas las fases
posteriores en la preparación de ADN fueron realizadas según el
procedimiento recomendado del kit SuperCos1 Cosmid Vector.
El tamaño del ADN genómico fue analizado por
electroforesis usando el aparato CHEF-gel de BioRad
(Hercules, CA, USA). En resumen, un 1% de gel de agarosa fue puesto
durante 20 horas a 200 voltios con un impulso de
10-50 segundos. El gel fue coloreado con bromuro de
etidio y fotografiado bajo exposición UV, revelando un ADN que
variaba desde 50 hasta más de 100 kb de longitud. El ADN fue luego
parcialmente digerido con Sau3A. El tamaño de los fragmentos de ADN
resultantes variaban de 20 a 50 kb como se ha determinado
anteriormente por el análisis CHEF-gel.
El vector SuperCos1 gradiente en bandas de CsCl
fue preparado, ligado y envasado según los procedimientos provistos
con el kit. Después de una valoración de la genoteca todas las
mezclas del empaquetamiento de una única ligadura y el
empaquetamiento fueron transfectadas en las células huésped
XL1-Blue MR provistas con el kit del vector y
dispuestas en placas de LB conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina.
Aproximadamente 3800 colonias fueron obtenidas. El análisis de la
preparación de los cósmidos de 10 colonias indicó que todas tenían
insertos del tamaño esperado. Las colonias fueron seleccionadas
individualmente e inoculadas en placas de microvaloración de 96
pocillos conteniendo 100 \mul de LB y 100 \mug/ml de ampicilina
por pocillo, luego se incubaron a 37°C durante toda la noche. Cien
microlitros de glicerol al 50% fueron añadidos a cada pocillo, y
toda la genoteca fue congelada a -80°C. Un total de 3822 colonias
fueron almacenadas, representando una amplificación aproximada de
4,4 veces el genoma de A. oryzae.
El gen p45 de metaloproteasa de Fusarium
oxysporum fue clonado como está descrito en la solicitud de
patente WO 95/30757 (Novo Nordisk Biotech, Inc.), publicada el 16
de Noviembre 1995.
Un clon de la genoteca de ADNc anterior fue
seleccionado y designado pDM115. Se obtuvo una sonda a partir de
pDM115 que contenía un fragmento de 1.76 kb del ADNc de Fusarium
oxysporum que codifica una parte del gen p45. Este plásmido fue
digerido con SalI, y los fragmentos fueron separados en un 1% de
gel de agarosa. La banda de interés fue un fragmento de 1.5 kb a
partir del cual se eluyó el ADN. Este fragmento fue marcado con
^{32}P-DATP por cebado aleatorio y usado como
sonda para el análisis de Southern y para visualizar una genoteca
de cósmidos de A. oryzae.
Para visualizar la genoteca de cósmidos de A.
oryzae con la sonda de p45 de Fusarium oxysporum, las
colonias congeladas individualmente en la genoteca fueron
inoculadas en placas de LB conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina
usando un dispositivo multihebra en una configuración de 6 filas de
8 hebras, diseñadas para ajustarse en la mitad de una placa de
microvaloración de 96 pocillos. Las placas, que contienen colonias
de todos los clones en la genoteca, fueron incubadas a 37°C durante
toda la noche. Unos filtros esterilizados Whatman 540 cortados para
ajustar los platos petri fueron colocados sobre las colonias que
fueron luego incubadas durante dos horas más a 37°C. Los filtros
fueron transferidos a placas de LB conteniendo 200 \mug/ml de
cloranfenicol, y las placas fueron incubadas durante toda la noche
a 37°C. AI día siguiente los filtros fueron lavados dos veces en
0.5M de NaOH durante 5 minutos, luego dos veces en 0.5M de
Tris-HCl (pH 7.4) durante 5 minutos y finalmente
dos veces en 2x SSC durante 5 minutos. Los filtros fueron
humedecidos con etanol y se dejaron secar al aire.
Los filtros fueron hibridados con el fragmento de
ADN de 1.5 kb marcado con ^{32}P de pDM115. La hibridación se
efectuó durante 16 horas a 65°C en un tampón de hibridación estándar
de 10x solución de Denhart, 5x SSC, 0.02 M de EDTA, 1% de SDS, 0.15
mg/ml de ARN polyA y 0.05 mg/ml de ARNt de levadura. Después de la
hibridación los filtros fueron lavados en 2x SSC, 0.1% de SDS a
65°C dos veces y expuestos a películas de rayos X. Tres colonias
mostraron hibridación a la sonda, 3E8, 3C1 y 2A5.
El análisis de restricción reveló que dos de los
tres clones de cósmidos, 3E8 y 3C1, contenían insertos derivados de
la misma región del genoma de A. oryzae. Tres microgramos de
cósmidos de ADN fueron digeridos con EcoRI y fraccionados por
electroforesis en gel de agarosa. El ADN fue transferido a filtros
de membrana Immobilan-N (Millipore) e hibridado con
la sonda radiomarcada de pDM115. Los resultados revelaron que la
sonda hibridó a un fragmento EcoRI de 4 kb en ambos clones de
cósmidos. El fragmento EcoRI de 4.0 kb fue sometido a un análisis
adicional.
El plásmido pToC65, descrito en EP 531 372, fue
digerido con SacI, y tratado con fosfatasa alcalina bacteriana
según las instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim) para
eliminar los grupos fosfato en 5', luego se extrajo el fenol y se
precipitó. El fragmento SacI de 5.5 kb del clon cósmido 3E8
conteniendo el gen NpI de A. oryzae fue aislado por
electroforesis en gel y purificado. Los dos fragmentos fueron
mezclados entre sí y ligados. Después de la transformación en E.
coli, las colonias que llevaban el plásmido correcto fueron
identificadas por digestión de la enzima de restricción de las
preparaciones de miniplásmidos; el plásmido recuperado fue llamado
pJaL389. La presencia de la región de codificación del gen
NpI de A. oryzae fue confirmado por el análisis de la
secuencia de ADN de algunas partes de este subclón.
El plásmido pJaL389 fue digerido con BalI para
eliminar un fragmento interno de 1.1 kb del gen NpI. El
fragmento restante de 7.1 kb fue tratado con la polimerasa Klenow
para crear extremos romos, luego se aisló por electroforesis en gel
y se purificó. Este fragmento de ADN fue tratado a continuación con
fosfatasa alcalina bacteriana, se extrajo el fenol y se precipitó.
El plásmido pJaL335 fue digerido con HindIII para obtener un
fragmento de 3.5 kb comprendiendo el gen pyrG de A.
oryzae, luego se trató de forma similar con la polimerasa
Klenow, se aisló por electroforesis en gel, y se purificó. Los dos
fragmentos fueron mezclados entre sí y ligados. Después de la
transformación en E. coli, las colonias que llevaban el
plásmido correcto fueron identificadas por digestión de la enzima
de restricción de preparaciones de miniplásmidos. La construcción
de este plásmido, llamado pJaL399, está resumida en la
Fig. 4.
Fig. 4.
De esta manera, el plásmido pJaL399 contiene un
fragmento del vector de pToC65 conteniendo el gen NpI donde
el fragmento interno BalI de 1.1 kb ha sido sustituido con un
fragmento de ADN de 3.5 kb que codifica el gen pyrG de A.
oryzae.
\newpage
La cepa de alp de A. oryzae,
JaL125, fue seleccionada por su resistencia al ácido
5-flouro-orótico para identificar
mutantes de pyrG espontáneos. Una cepa, denominada JaL151,
fue identificada como alp y pyrG. Como ocurre con
HowB101, JaL151 es uridina dependiente, en consecuencia éste puede
ser transformado con el gen pyrG de tipo salvaje y
transformantes seleccionados por su capacidad para crecer en
ausencia de uridina.
JaL151 fue transformado con el fragmento SacI de
7.9 kb de pJaL399 usando procedimientos estándar. Los
transformantes fueron luego seleccionados por su capacidad para
crecer en ausencia de uridina. Después del reaislamiento, se
preparó ADN cromosómico a partir de 12 transformantes. El ADN de
cada uno de los transformantes fue digerido con BalI y analizado por
transferencia de Southern, usando el fragmento SacI de ADN marcado
con ^{32}P de 5.5 kb de pJaL389 conteniendo el gen NpI
según el modo descrito anteriormente como sonda. La cepas de
interés fueron identificadas por la ausencia del fragmento de
hibridación BalI de 1.1 kb, indicando una interrupción del gen
NpI, así como mostrando una movilidad alterada de las
secuencias 5' y 3' flanqueantes. La cepa resultante de uno de estos
transformantes fue denominada JaL228.
Se preparó una genoteca de Candida
antarctica parcialmente digerida con Sau3A en pBR322 y los
filtros de la réplica fueron seleccionados con dos sondas de
oligonucleótidos designadas de la secuencia de aminoácidos
N-terminal de clb, NOR929 (SEC. ID. N°. 4) y
NOR930 (SEC. ID. N°. 5) (Fig. 5). Se identificaron ocho colonias.
Los análisis de los plásmidos indicaron insertos superpuestos. Uno
de los plásmidos, pMT1303, conteniendo un inserto de 7.8 bp, fue
también analizado. Eliminando del fragmento Sal1 un plásmido,
pMT1305, conteniendo un inserto de 2.1 kb fue construido (Fig. 6).
Usando NOR929 como molde, se secuenció pMT1305 para confirmar que
clb (lipasa B de C. antarctica) era codificado. El
gen entero fue secuenciado en ambas cadenas haciendo una serie de
supresiones en pMT1305 usando el sistema de Promega
Erase-a-Base© (Promega Corp.,
Madison WI, USA. La secuencia de codificación está provista en la
SEC. ID. N°. 6.
Un fragmento SalI-HindIII de 788
bp que codifica la secuencia N-terminal para CLB
fue aislado de pMT1305. De este fragmento dos fragmentos más
pequeños fueron aislados, un HindIII-BanI de 170 bp
y un BanI de 204 bp completado con Sau3A. Estos dos fragmentos
fueron clonados en el plásmido pIC19R, el cual había sido digerido
con EcoRV y HindIII. Esto creó un sitio BclI en el EcoRV y el sitio
de 9 bp completado con Sau3A adyacente al codón ATG para
clb, dando como resultado el plásmido denominado pMT1329
(Fig. 7).
La secuencia de genes que codifica la región
C-terminal de CLB fue aislada como un fragmento
HindIII-Xmn1 de 670 bp de pMT1305 y se insertó en
el plásmido pIC7, el cual había sido digerido con
HindIII-NruI, dando como resultado pMT1330. El gen
completo fue ensamblado del fragmento HindIII-NarI
de 3.0 kb de pMT1329 y el fragmento HindIII-ClaI de
0.7 kb de pMT1330, dando como resultado pMT1332 (Fig. 8).
El gen clb fue expresado en
Aspergillus usando el vector de expresión de pToC68. El
fragmento BclI-BglII de 1 kb de pMT1332 fue
insertado en pToC68, el cual había sido digerido con BamHI, para
dar pMT1335 (Fig. 9). Así, la construcción del plásmido pMT1335
resultó en un plásmido de expresión fúngico para el gen de lipasa B
de C. antarctica.
Las cepas IFO 4177 y JaL228 de A. oryzae
fueron transformadas con pMT1335 por cotransformación con pToC90
(se precisa definir pToC90).
Los transformantes fueron seleccionados por su
crecimiento en un medio mínimo conteniendo 10 mM de acetamida y
seleccionados por la presencia de pMT1335 por la capacidad para
producir CLB. Un transformante de cada cepa IFO 4177 de tipo
salvaje de A. oryzae y de la cepa JaL228 de alp y
NpI, fue seleccionado por su fermentación en tanques
realizada durante 93 horas. Las conidiosporas fueron inoculadas en
fermentadores Keiler de 2 litros a 30°C conteniendo 1.2 litros de
una solución de maltosa al 20% y urea al 8%. Una mezcla de la
solución de maltosa al 20% y urea al 8% fue añadida continuamente;
se añadió ácido fosfórico según fuera necesario para mantener un
pH
de 7.
de 7.
En la tabla 1 a continuación se resume el
rendimiento de la actividad de CLB de JaL228 en comparación con
IFO4177, donde una unidad de lipasa (LU) está definida como la
cantidad de enzima necesaria para liberar 1 \mumol de ácido
butírico por minuto a partir de tributirina a un pH 7.0 y a 30°C. La
tabla indica que la cantidad producida en JaL228 es 1,8 veces mayor
que la producida en IFO 4177, lo cual demuestra que la supresión de
los genes alp y NpI pueden mejorar significativamente
la estabilidad de las proteínas sensibles a la actividad de estas
proteasas.
| Producción de CLB por IFO 4177 y JaL228 después de la fermentación en tanques durante 93 horas | ||
| Horas | IFO4177 LU/g | JaL228 LU/g |
| 93 | 575 | 1041 |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Novo Nordisk NS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +45 4444 8888
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +45 4449 3256
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Células huésped nuevas y métodos de producción de Proteínas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30B (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. N°. 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2052 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Fusarium oxysporum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: DSM 2672
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: p45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 785..2049
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 55..784
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 364..415
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 802..854
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1821..1868
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N°. 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. N°. 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2968 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus oryzae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: IFO 4177
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: NpI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 458..817
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 868..1262
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1320..1870
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1930..2344
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 2404..2587
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N°. 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. N°. 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3922 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus oryzae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: A01560
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: alp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 2310..2634
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 2684..3129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 3188..3276
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 3333..3686
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. N°. 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N°. 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCTCGGGCT CGGACCCCGC CTTCTCGCA GCCCAAG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. N°. 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- descripción de la secuencia: SEC. ID. N°. 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCTCGTTCG TCAGGCCCGC GTCCAGCACC GACTTGGGCT G
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. N°. 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1029 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Candida antarctica
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: clb
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. N°. 6:
Claims (16)
1. Célula de Aspergillus orzyae en la que
se ha introducido una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un
polipéptido heterólogo, donde la célula ha sido modificada mediante
la tecnología del ADN recombinante de tal manera que
a) una metaloproteasa endógena codificada por la
secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO 2, o una secuencia de ADN
que tiene al menos el 70% de identidad con la SEC ID NO: 2, y
b) una actividad proteasa alcalina endógena,
codificada por la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NO 3, o
una secuencia de ADN que tiene al menos el 70% de identidad con la
SEC ID NO: 3,
son funcionalmente inactivas o expresadas a
niveles reducidos en comparación con una célula parental.
2. Célula según la reivindicación 1, donde la
metaloproteasa es una metaloproteasa neutra de Aspergillus
del grupo NpI o NpII.
3. Célula según la reivindicación 2, donde la
metaloproteasa es una metaloproteasa I neutra de Aspergillus
oryzae que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de
la secuencia de nucleótidos presentada como SEC ID NO 2, o una
secuencia de ADN que tiene al menos el 70% de identidad con
ésta.
4. Célula según la reivindicación 1, donde la
proteasa alcalina está codificada por una secuencia de ADNc que
comprende la secuencia de nucleótidos presentada como SEC ID NO 3,
o una secuencia de ADN que tiene al menos el 70% de identidad con
ésta.
5. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que ha sido genéticamente modificada
mediante la tecnología del ADN recombinante dentro de la secuencia
que codifica la metaloproteasa, o una secuencia reguladora de ésta,
y dentro de la secuencia que codifica la proteasa alcalina, o una
secuencia reguladora de ésta.
6. Célula según la reivindicación 5, donde la
tecnología es mutagénesis específica o aleatoria, mutagénesis
generada por PCR, supresión sitio específica de ADN, inserción y/o
sustitución, interrupción génica o técnicas de sustitución de
genes, técnicas sin sentido, o una combinación de éstas.
7. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde el nivel de metaloproteasa es
reducido más de aproximadamente el 50%, preferiblemente más de
aproximadamente el 85%, más preferiblemente más de aproximadamente
el 90%, y más preferiblemente más de aproximadamente el 95%.
8. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde el nivel de actividad proteasa
alcalina se redujo más de aproximadamente el 50%, preferiblemente
más de aproximadamente el 85%, más preferiblemente más de
aproximadamente el 90%, y más preferiblemente más de
aproximadamente el 95%.
9. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde la reducción de la actividad
metaloproteasa y proteasa alcalina es cualquier combinación según
la reivindicación 7 u 8.
10. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, donde la célula está esencialmente libre de
cualquier actividad metaloproteasa y proteasa alcalina.
11. Método para producir un producto proteínico
heterólogo en la célula de cualquiera de las reivindicaciones 1 a
10, donde el método comprende:
(a) introducir en la célula una secuencia de
ácidos nucleicos que codifica el producto proteínico;
(b) cultivar en un medio de crecimiento adecuado
la célula de la fase (a);
y
(c) aislar el producto proteínico.
12. El método según la reivindicación 11, donde
el producto proteínico es un producto genético terapéuticamente
activo, tal como insulina, hormona del crecimiento, glucagón,
somatostatina, interferón, EPO, TPO, PDGF, factor VII, factor VIII,
uroquinasa, quimosina, activador del t-plasminógeno,
o albúmina de suero.
13. Método según la reivindicación 11, donde el
producto proteínico es una proteína de origen fúngico.
14. Método según la reivindicación 13, donde el
producto proteínico es una enzima fúngica, en particular una enzima
amilolítica, tal como una \alpha-amilasa, una
\beta-amilasa, una glucoamilasa, una
\beta-galactosidasa, una enzima celulítica, una
enzima lipolítica, una enzima xilanolítica, una enzima proteolítica,
una oxidorreductasa, tal como una peroxidasa o una lacasa, una
pectinasa, o una cutinasa.
15. Método según la reivindicación 11, donde el
producto proteínico es una proteína de origen bacteriano.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, donde el producto proteínico es una
proteína precursora, es decir un zimógeno, una proteína híbrida,
una proteína obtenida como una secuencia pro o secuencia
pre-pro, o en forma inmadura.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK102496 | 1996-09-19 | ||
| DK102496 | 1996-09-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2256895T3 true ES2256895T3 (es) | 2006-07-16 |
Family
ID=8100132
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97939990T Expired - Lifetime ES2256895T3 (es) | 1996-09-19 | 1997-09-19 | Celulas huesped y metodos de produccion de proteinas. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
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