JP4896013B2 - 改良された分泌によるポリペプチドの製造 - Google Patents

Description

本発明は組換えＤＮＡ技術に関する。具体的には、本発明は、酵母ＳＥＣ６１（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ゲノムデータベース−ＳＧＤ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）について記載されたタンパク質輸送活性を有するＳＥＣ６１ポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸配列、および目的とするポリペプチドの製造に適切な宿主細胞の調製におけるその使用に関する。

タンパク質の培養培地への分泌は、分泌経路を構成するさまざまな膜に囲まれたコンパートメントを通じたタンパク質の移動を含む。最初にタンパク質は小胞体、ＥＲの内腔へ転位される。そこからタンパク質は膜小胞のゴルジ複合体に輸送され、ゴルジから血漿膜に輸送される。分泌過程は、分泌されたタンパク質を含有する小胞がドナー膜から摘み取られ、受容体膜に標的され、これと融合される幾つかのステップを含む。これらのステップの各々で幾つかの異なるタンパク質の機能が必要である。

糸状菌におけるタンパク質分泌を増大させる幾つかの試みが行われている。異種タンパク質の分泌を増大させる一般的な方法が、シグナル配列を使用することである（例えば、ＥＰ０２１５５９４号明細書を参照）。ランダム突然変異誘発および分泌されたタンパク質のスクリーニング（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９８５年、サカイ（Ｓａｋａｉ）ら、１９８８年、シュスター（Ｓｈｕｓｔｅｒ）ら、１９８９年、スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、１９８９年、スリープ（Ｓｌｅｅｐ）ら、１９９１年、ラムサ（Ｌａｍｓａ）およびブレバウム（Ｂｌｏｅｂａｕｍ）、１９９０年、ダン・コールマン（Ｄｕｎｎ−Ｃｏｌｅｍａｎ）ら、１９９１年、および米国特許出願公開第２００２／００６８３２５Ａ１号明細書）または異質のタンパク質の有効に分泌された内因性タンパク質との融合（ワード（Ｗａｒｄ）ら、１９９０年、ハルキ（Ｈａｒｋｋｉ）ら、１９８９年、ニーソネン（Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎ）ら、１９９３年、ニーソネン（Ｎｙｙｓｓｏｅｎｅｎ）ら、１９９２年）は、異種タンパク質の分泌をより効率的にするために酵母および糸状菌の両方に広く使用されている。これらの方法の両方は使用が限定されている。ランダム突然変異誘発およびスクリーニングによって単離される突然変異はほぼ完全に劣性であり、倍数体である工業上の菌株へ移動されえない。しばしば得られた突然変異はスクリーニングに使用されるタンパク質の改良された分泌能のみを有する。融合タンパク質法は、各々異種または異質のタンパク質の融合構成の適合化を別個に必要とする。融合タンパク質はしばしば機能ではなく、したがって最終生成物はタンパク質分解的切断によって放出される必要があり、これは製造手順を複雑にする。

さらに、それらのタンパク質生成因子としての産業上の重要性により、改良された分泌能を有する糸状菌を得る必要がある。

発明の詳細な説明

本明細書で参照されるすべての特許および刊行物は、かかる特許および刊行物内に開示されたすべての配列および方法を含めて、参照によって明示的に援用される。これらの特許および刊行物としては、ＥＰ３５７１２７号明細書、ＥＰ６３５５７４号明細書、国際公開第９７／０６２６１号パンフレット、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットが挙げられる。

ＳＥＣ６１活性を表示するポリペプチド
本発明の第１の態様は新規ＳＥＣ６１ポリペプチドに関する。ＳＥＣ６１ポリペプチドは一般にＥＲ膜にわたってポリペプチドの輸送を介在することが知られている。本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチドは、ＳＥＣ６１ポリペプチドと関連していることが一般に知られている少なくとも１つの活性を表示するポリペプチドと定義されている。本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチドは、ＳＥＣ６１ポリペプチドと関連していることが一般に知られているすべての活性をも表示しうる。

具体的には、本発明は、
（ａ）配列番号３によるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
（ｂ）配列番号３によるアミノ酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドと
からなる群から選択されるＳＥＣ６１ポリペプチドを開示する。

本発明との関連で、「実質的に相同」という語は、ＳＥＣ６１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を表示し、かつ配列番号３に記載されたアミノ酸配列の少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、かつ最も好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有するポリペプチドを包含することが意味される。同一性の程度は、好ましくは、配列番号３の全長にわたって測定される。

本発明のために、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、２つの配列間で同一であるアミノ酸の割合を指す。同一性の程度は、アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁（１９９０年）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して判定される。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムではデフォルトとして１１の語長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２採点マトリックス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）とヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５頁（１９８９年）を参照）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較が使用される。

好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは配列番号３によるアミノ酸配列を有する。

別の実施形態において、配列番号３によるアミノ酸配列と実質的に相同であるポリペプチドのアミノ酸配列は、天然または人工の変異（突然変異誘発）による配列番号３のアミノ酸配列の点で異なりうる。配列番号３によるアミノ酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列番号３の配列と比べ少なくとも１つの修飾を含有しうる。前記修飾はアミノ酸置換、付加、または欠失でありうる。

好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、５個のアミノ酸が、好ましくは４個のアミノ酸が、より好ましくは３個のアミノ酸が、さらにより好ましくは２個のアミノ酸が、かつ最も好ましくは１個のアミノ酸が、配列番号３に記載されたアミノ酸配列と異なり、かつさらに配列番号３に記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと同じＳＥＣ６１活性を有するアミノ酸配列を有する。

別の好ましい実施形態において、配列番号３によるアミノ酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドが、配列番号９によるアミノ酸配列を有する。

本発明の別の好ましい実施形態において、配列番号３によるアミノ酸配列との少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８９％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、かつ最も好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有するＳＥＣ６１ポリペプチドが提供されるが、ここで少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号３の第３７３〜３７９位置に対応する、すなわち配列番号３の第３７３〜３７９位置に存在するアミノ酸配列ＡＬＦＳＫＴＷに対応するコンセンサスモチーフで修飾されている。好ましくは、コンセンサスモチーフで修飾されている少なくとも１個のアミノ酸は、配列番号３の第３７６位置に対応する位置にある。より好ましくは、配列番号３の第３７６位置に対応するアミノ酸は、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、またはヒスチジンによって置換される。最も好ましくは、配列番号３の第３７６位置に対応する位置におけるセリンはトリプトファンによって置換される。かかる修飾ＳＥＣ６１ポリペプチドの例は、配列番号６によるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

コンセンサスモチーフにおけるさらなる変異が、配列番号３の第３７４位置に対応する位置でロイシン、バリン、フェニルアラニン、またはメチノン（ｍｅｔｈｉｎｏｎｅ）の存在、および／または配列番号３の第３７７位置に対応する位置におけるリシン、アラニン、トレオニン、またはアルギニンの存在、および／または配列番号３の第３７８位置に対応する位置におけるトレオニン、またはロイシンの存在でありうる。

ＳＥＣ６１ポリペプチドをコードする単離糸状菌核酸配列
本発明の第２の態様は、第１の態様のＳＥＣ６１ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る単離ポリヌクレオチドに関する。

具体的には、ＳＥＣ６１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列は、
（ａ）配列番号１によるポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号２による核酸配列と、
（ｃ）配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％の同一性の程度を有する核酸配列と、
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列と
からなる群から選択される。

好ましい実施形態において、特徴（ｃ）の核酸配列は、配列番号２に記載された核酸配列と少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を有する。

本発明のために、２つの核酸配列間の同一性の程度は、同一性表、１０のギャップペナルティ、１０のギャップ長ペナルティによるＣｌｕｓｔｒａｌ法（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）、１９８９年、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３頁）によって判定される。

別の好ましい実施形態において、単離核酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはＳＥＣ６１活性を有するその断片をコードする。

別の好ましい実施形態において、単離核酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはＳＥＣ６１活性を有するその断片をコードする。

別の好ましい実施形態において、ＳＥＣ６１ポリペプチドをコードする核酸配列は配列番号２または配列番号８に記載されている核酸配列を有する。

別の好ましい実施形態において、単離核酸配列は、配列番号３によるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性の程度を有するアミノ酸配列を有するＳＥＣ６１ポリペプチドをコードし、ここで少なくとも１個のアミノ酸が配列番号３の第３７３〜３７９位置に対応する、すなわち配列番号３の第３７３〜３７９位置に存在するアミノ酸配列ＡＬＦＳＫＴＷに対応するコンセンサスモチーフで修飾されている。例えば、単離核酸配列は、配列番号６によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、好ましくは配列番号５の核酸配列である。

本明細書で使用される「単離ポリヌクレオチドまたは核酸配列」という語は、アガロース電気泳動によって測定されるように、例えば、少なくとも約２０％純粋、好ましくは少なくとも約４０％純粋、より好ましくは少なくとも約６０％純粋、さらにより好ましくは少なくとも約８０％純粋、最も好ましくは少なくとも約９０％純粋な他の核酸配列を基本的に含んでいないポリヌクレオチドまたは核酸配列を指す。例えば、単離核酸配列が遺伝子工学で使用される標準のクローニング法によって獲得され、核酸配列をその天然位置から再生される異なる部位へ移動させうる。

ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、またはそのいずれかの組合せでありうる。

ＳＥＣ６１ポリペプチドをコードし、かつ配列番号３によるタンパク質と実質的に相同であるアミノ酸配列を有する単離核酸分子が、配列番号２によるコードヌクレオチド配列と比べ、１つもしくはそれ以上のヌクレオチド修飾、すなわち置換、付加、または欠失を含有し、１つもしくはそれ以上のアミノ酸修飾、すなわち置換、欠失、または挿入がコードされたタンパク質に存在するようになりうる。かかる修飾は天然変異によるものであり、または部位特異的突然変異誘発もしくはＰＣＲ介在突然変異誘発など標準の突然変異誘発技術によって導入されうる。

核酸配列によってコードされるポリペプチドにおける異なるアミノ酸残基をもたらさないｓｅｃ６１コード配列へヌクレオチド置換を導入することも可能である。これは、例えば、コドン使用がＳＥＣ６１タンパク質の発現を目的とする宿主生物のコドン使用に対応する核酸配列を引き起こすのに有利でありうる。

コードされたタンパク質のアミノ酸配列の変更をもたらしうるＤＮＡ配列多型が所定の集団内に天然に存在しうることは当業者には明らかであろう。かかる遺伝子多型は、異なる集団からの、または天然対立遺伝子変異による集団内の細胞に存在しうる。

本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチドおよびコードする核酸配列は、真核細胞、好ましくは、真菌、より好ましくは、糸状菌から獲得されうる。

「糸状菌」としては、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の下位分類のすべての糸状形態（ホークスワース（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）ら、１９９５年、上記によって規定）が挙げられる。糸状菌菌株としては、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシディウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティックス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株が挙げられるが、これらに限定されない。

より好ましい実施形態において、本発明のＳＥＣ６１活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、Ａ．アワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）またはＡ．ニズランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）などアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の菌株から得られる。好ましくは、この核酸配列はＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）またはＡ．オリゼー（ｏｒｙｚａｅ）の菌株から得られる。さらにより好ましくは、この核酸配列はＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）の菌株の単離株、例えば、配列番号１または配列番号２に記載の核酸配列から得られる。

別の実施形態において、本発明のＳＥＣ６１活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、Ｆ．オキシスポルム（ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）またはＦ．ヴェネナツム（ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）などフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の菌株、またはＰ．クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）などペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌株、例えば、配列番号７または配列番号８に記載された核酸配列から得られる。

上記の種について、本発明は完全および不完全な状態、および他の分類学的同等物、例えば、それらが知られている種名にかかわらず、アナモルフを包含することが理解されるであろう。当業者は、適切な同等物の同一性を容易に理解するであろう。例えば、ポリペプチドは、それらが知られている種名にかかわらず、レーパー（Ｒａｐｅｒ），Ｋ．Ｄ．およびフェネル（Ｆｅｎｎｅｌ），Ｄ．Ｉ．（１９６５年。Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ウィルキンズ社（Ｔｈｅ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、メリーランド州（ＭＤ））によって規定されたアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の分類学的同等物である微生物から得られうる。

さらに、ＳＥＣ６１活性を有するポリペプチドは、例えば、本発明によるポリヌクレオチドに基づくプローブを使用して自然（例えば、土、堆肥、水等）から単離される微生物を含む、糸状菌以外の供給源から同定され獲得されうる。自然の生息地から微生物を単離するための方法が当業界で公知である。

本発明のＳＥＣ６１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列はハイブリダイゼーションによって得られうる。本発明のｓｅｃ６１ＤＮＡの変異（例えば、天然対立遺伝子多型）および相同体が、標準のハイブリダイゼーション法によるハイブリダイゼーションプローブとして、好ましくはきわめてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にこれらの核酸またはその適切な断片を使用して本明細書に開示された核酸との相同性に基づき単離されうる。

ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に判定される。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの追加の詳細および説明については、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ワイリー・インターサイエンス・パブリッシャーズ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、（１９９５年）を参照。

核酸配列は、例えば、問題となっている微生物のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって単離されうる。ＳＥＣ６１活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列が、例えば、配列番号２由来のプローブで検出されると、配列は当業者に周知である方法を利用して単離またはクローン化されうる（例えば、Ｊ．サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、およびＴ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照）。

かかるゲノムＤＮＡからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または共通の構造的特徴を有するクローン化ＤＮＡ断片を検出する発現ライブラリーの抗体スクリーニングに基づく方法を使用しても達成されうる（例えば、イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、１９９０年、ＰＣＲ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照）。

本明細書で提供される配列情報は、誤って同定された塩基の包含を必要とするほどに狭く考えられてはならない。本明細書に開示された特定の配列は、糸状菌、具体的にはＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）からの完全な遺伝子を単離するために容易に使用され、次いで容易に追加的な配列分析にかけられ、それによって配列決定の誤りを特定することができる。

別段の定めがない限り、本明細書のＤＮＡ分子の配列決定によって決定されるすべてのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシーケンサーを使用して決定され、本明細書で決定されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は上記の通り決定されたＤＮＡ配列の翻訳によって予測された。したがって、この自動的方法によって決定されるＤＮＡ配列について当業界で周知のように、本明細書で決定されるヌクレオチド配列は多少の誤りを含有しうる。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と一般的に少なくとも約９０％同一、より一般的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当業界で公知の手動のＤＮＡ配列決定法を含む他の方法によってより正確に決定されうる。当業界で周知であるように、実際の配列と比較して決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失がヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトをもたらし、決定されたヌクレオチド配列によってコードされた予測アミノ酸配列が、かかる挿入または欠失の点で開始する、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列と完全に異なるようになっている。

当業者は、かかる誤って同定された塩基を同定することが可能であり、かかる誤りを修正する方法を知っている。

核酸構築物
本発明の別の態様は、適切な発現宿主におけるＳＥＣ６１活性を有するポリペプチドの発現を指図する１つもしくはそれ以上の制御配列に操作可能に結合されている、本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る核酸構築物に関する。

発現は、ポリペプチドの製造に関与するステップを含むことが理解され、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、分泌を含みうる。

「核酸構築物」は、天然起源遺伝子から単離され、またはそれ以外には天然に存在しないやり方で結合または並列される核酸の部分を含有するように修飾されている一本または二本鎖のいずれかの核酸分子として本明細書では定義される。核酸構築物という語は、核酸構築物が特定の宿主生物におけるコード配列の発現に必要な制御配列をすべて含有する場合に発現ベクターまたはカセットという語と同義である。

「制御配列」という語は、本明細書では、ポリペプチドの発現に必要または有利であるすべての要素を含むと定義される。各々の制御配列は天然またはポリペプチドをコードする核酸配列とは異なりうる。かかる制御配列としては、プロモーター、リーダー、最適な翻訳開始配列（コザック（Ｋｏｚａｋ）、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０頁）、分泌シグナル配列、プロペプチド配列、ポリアデニル化配列、転写終止が挙げられるが、これらに限定されない。最小限でも、制御配列は、プロモーター、転写および翻訳停止シグナルを含む。

「操作可能に結合」という語は、本明細書では、制御配列がＤＮＡ配列のコード配列に対する位置で適切に配置され、制御配列がポリペプチドの製造を指図するようになっている構成として定義される。

制御配列は、転写制御配列を含有する適切なプロモーター配列でありうる。プロモーターは、突然変異、切断、およびハイブリッドプロモーターを含む細胞における転写調節活性を示す任意の核酸配列であり、かつ細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から獲得されうる。プロモーターは、細胞またはポリペプチドと相同または異種のいずれかでありうる。

糸状菌の好ましいプロモーターは当業界で周知であり、例えば、グルコース−６−リン酸デヒロゲナーゼｇｐｄＡプロモーター、ｐｅｐＡ、ｐｅｐＢ、ｐｅｐＣなどのプロテアーゼプロモーター、グルコアミラーゼｇｌａＡプロモーター、アミラーゼａｍｙＡ、ａｍｙＢプロモーター、カタラーゼｃａｔＲまたはｃａｔＡプロモーター、グルコースオキシダーゼｇｏｘＣプロモーター、ベータ−ガラクトシダーゼｌａｃＡプロモーター、アルファ−グルコシダーゼａｇｌＡプロモーター、翻訳伸長因子ｔｅｆＡプロモーター、ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣ、ｘｌｎＤなどのキシラナーゼプロモーター、ｅｇｌＡ、ｅｇｌＢ、ｃｂｈＡなどのセルラーゼプロモーター、ａｒｅＡ、ｃｒｅＡ、ｘｌｎＲ、ｐａｃＣ、ｐｒｆＴ等などの転写調節因子のプロモーターでありうるとともに、特にＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）で確認されうる。

好ましい実施形態において、プロモーターは、高く発現される（本明細書では総細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）のｍＲＮＡ濃度と定義）遺伝子由来でありうる。別の好ましい実施形態において、プロモーターは、培地発現される（本明細書では総細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．０１％〜０．５％（ｗ／ｗ）のｍＲＮＡ濃度と定義）遺伝子由来でありうる。別の好ましい実施形態において、プロモーターは、低く発現される（本明細書では総細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．０１％（ｗ／ｗ）未満のｍＲＮＡ濃度と定義）遺伝子由来でありうる。

制御配列は適切な転写終止配列、転写を終止する糸状菌細胞によって認識される配列でもありうる。終止配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端と操作可能に結合されている。細胞において機能的であるすべての終止が本発明において使用されうる。

糸状菌細胞の好ましい終止は、Ａ．オリゼー（ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニズランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）アルファ−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子、およびフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。

制御配列は、糸状菌細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域の適切なリーダー配列でもありうる。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端と操作可能に結合されている。細胞において機能的であるすべてのリーダー配列が本発明において使用されうる。

糸状菌細胞の好ましいリーダーは、Ａ．オリゼー（ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、およびＡ．ニズランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ、およびＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡから得られる。

制御配列は、核酸配列の３’末端と操作可能に結合されており、転写されると、転写ｍＲＮＡにポリアデノシン残基を添加するシグナルとしての糸状菌細胞によって認識される配列のポリアデニル化配列でもありうる。細胞において機能的であるすべてのポリアデニル化配列が本発明において使用されうる。

糸状菌細胞の好ましいポリアデニル化配列は、Ａ．オリゼー（ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニズランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、およびＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）アルファ−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。

分泌されるポリペプチドには、制御配列は、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路へ指図しうるポリペプチドのアミノ末端と連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域でもありうる。核酸配列のコード配列の５’末端は、本質的に、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域の部分と翻訳リーディングフレームで自然に連結されたシグナルペプチドコード領域を含有しうる。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列とは異なっているシグナルペプチドコード領域を含有しうる。異質のシグナルペプチドコード領域は、コード配列が通常、シグナルペプチドコード領域を含有しない場合に必要とされうる。あるいは、異質のシグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換しうる。

核酸構築物は発現ベクターでありうる。発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に便利にかけられ、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現をもたらしうる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）でありうる。ベクターの選択は一般的にベクターが導入される細胞とのベクターの適合性に依存する。ベクターは線状または閉環状プラスミドでありうる。

ベクターは自己複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり、その複製が染色体複製と無関係であり、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体でありうる。糸状菌の自己維持クローニングベクターは、ＡＭＡ１−配列を含んで成りうる（例えば、アレクセンコ（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ）とクラッターバック（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ）（１９９７年）、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３−３９７頁を参照）。

あるいは、ベクターは、細胞へ導入されると、ゲノムへ組込まれ、組込まれている染色体といっしょに複製されるものでありうる。組込みクローニングベクターは、ランダムに、または宿主細胞の染色体における所定の標的遺伝子座で組込まれうる。本発明の好ましい実施形態において、組込みクローニングベクターは、クローニングベクターの組込みをこの所定の遺伝子座にターゲティングするための宿主細胞のゲノムにおける所定の標的遺伝子座のＤＮＡ配列と相同であるＤＮＡ断片を含んで成る。標的組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換前に線状化される。線状化は、好ましくは、少なくとも１つであるが、好ましくは、クローニングベクターの端のいずれかが標的遺伝子座と相同の配列によってフランキングされるように行われる。標的遺伝子座をフランキングする相同配列の長さは、好ましくは、少なくとも０．１ｋｂであり、さらに好ましくは、少なくとも０．２ｋｂであり、より好ましくは、少なくとも０．５ｋｂであり、さらにより好ましくは、少なくとも１ｋｂであり、最も好ましくは、少なくとも２ｋｂである。

好ましい実施形態によれば、本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチドをコードする遺伝子を含んで成る発現ベクターの組込みの標的遺伝子座は、ｓｅｃ６１遺伝子座である。

ベクター系は単一ベクターもしくはプラスミド、または２つもしくはそれ以上のベクターまたはプラスミドでありうるが、これらはいっしょに宿主細胞のゲノム、またはトランスポゾンへ導入されるすべてのＤＮＡを含有する。

ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つもしくはそれ以上の選択可能なマーカーを含有する。選択可能なマーカーが、その生成物が殺生物性またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求体に対する原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）などを提供する遺伝子である。糸状菌細胞において使用するための選択可能なマーカーが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）のほか、他の種からの同等物を含むがこれらに限定されない群から選択されうる。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞における使用に好ましいのは、Ａ．ニズランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．オリゼー（ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳ（ＥＰ６３５５７４Ｂ１号明細書、国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）およびｐｙｒＧ遺伝子およびストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子である。より好ましくは、ａｍｄＳ遺伝子が使用され、さらにより好ましくは、Ａ．ニズランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）からのａｍｄＳ遺伝子である。最も好ましい選択マーカー遺伝子が、Ａ．ニズランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡプロモーターと融合されたＡ．ニズランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳコード配列である（ＥＰ６３５５７４号明細書を参照）。他の糸状菌からのＡｍｄＳ遺伝子も使用されうる（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。

宿主細胞
別の態様において、本発明は、目的とするポリペプチドの製造に適切な宿主細胞を提供し、前記宿主細胞はＳＥＣ６１活性を有する発明によるポリペプチドを過剰発現する。前記宿主細胞は、本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチドをコードする核酸構築物または発現ベクターを含んで成る。

意外にも、発明者らは、本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチド、具体的には上記の通りコンセンサスモチーフで修飾された突然変異ＳＥＣ６１ポリペプチドが過剰発現している真菌細胞、具体的には糸状菌細胞が、かかるＳＥＣ６１ポリペプチドを過剰発現することがない真菌細胞と比べ改良されたタンパク質分泌能を有することを見出した。特に、異種タンパク質の分泌が改良されている。場合により、内因性ｓｅｃ６１遺伝子は、内因性ＳＥＣ６１ポリペプチドと比べ修飾されているＳＥＣ６１ポリペプチドを発現する細胞において不活性化されうる。

好ましい実施形態においては、本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチドを過剰発現する宿主細胞が、内因性に発現されるＳＥＣ６１ポリペプチドの量の少なくとも５０％以上、好ましくは、少なくとも１００％以上、より好ましくは、少なくとも２００％以上、最も好ましくは、少なくとも４００％以上である。内因性に発現されるＳＥＣ６１ポリペプチドの量は、本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチドを過剰発現する宿主細胞がそれに由来する親の宿主細胞によって発現されるＳＥＣ６１ポリペプチドの量である。発現ＳＥＣ６１ポリペプチドの量は、例えば、定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、二次元タンパク質電気泳動、またはウェスタンブロット法によって、当業者に周知の方法によって測定されうる。

本発明では、本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチドを過剰発現する宿主細胞のさまざまな実施形態が意図される。

１つの実施形態において、天然のＳＥＣ６１ポリペプチドを過剰発現し、それによって天然のＳＥＣ６１ポリペプチドが前記宿主によって自然に生成されるＳＥＣ６１ポリペプチドと同じポリペプチドである宿主細胞が提供される。

別の実施形態において、前記宿主によって自然に生成されないＳＥＣ６１ポリペプチドを発現する宿主細胞が提供される。かかる宿主細胞は天然ＳＥＣ６１ポリペプチドを発現することがない。天然ＳＥＣ６１ポリペプチドの非発現は、例えば、内因性ｓｅｃ６１遺伝子の不活性化によって達成されうる。好ましくは、内因性ｓｅｃ６１遺伝子の不活性化は、例えば、ＥＰ０３５７１２７号明細書に記載されている遺伝子置換によって達成されうる。より好ましくは、前記遺伝子置換は、本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る核酸構築物（発現ベクター）によって内因性ｓｅｃ６１遺伝子の置換を含んで成る。

本発明の方法における宿主細胞の選択は、目的とするポリペプチドをコードする核酸配列の供給源に大幅に依存する。好ましくは、宿主細胞は真核細胞、より好ましくは、真菌、最も好ましくは、糸状菌である。好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、本発明によるＳＥＣ６１ポリペプチドが獲得されうる種として挙げられている種の細胞である。

好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは、配列番号３または配列番号６または配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する遺伝子を過剰発現する。

得られた宿主細胞は、目的とするポリペプチドを製造するために使用されうる。

したがって、別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、目的とするポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成るポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーをさらに有する。この核酸配列は、ｓｅｃ６１遺伝子の発現について以前に記載された発現ベクターへクローン化されうる。本発明の方法は、目的とするポリペプチドを製造する糸状菌細胞を得るための特定の順序に限定されないことが理解されるであろう。場合により内因性ｓｅｃ６１遺伝子の修飾と組合される、ｓｅｃ６１遺伝子の導入は、目的とするポリペプチドの製造のための細胞の構成における任意のステップで行われうる。

ポリペプチドの製造
本発明の別の態様は、以前の態様の宿主細胞、好ましくは、糸状菌宿主細胞における目的とするポリペプチドの製造のための方法に関し、
（ａ）目的とするポリペプチドの製造のために適切な栄養培地において以前の態様の宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）栄養ブロスから目的とするポリペプチドを回収するステップと
を含んで成る方法に関する。

本発明の宿主細胞は、当業界で周知の方法を使用して目的とするポリペプチドの製造に適切な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、目的とするポリペプチドが発現および／または単離されることを可能にする適切な培地および条件下に行われる、実験的または工業的発酵装置における振盪フラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続発酵、バッチ発酵、流加発酵、または固相発酵を含む）によって培養されうる。培養は、当業界で周知の方法を使用して少なくとも炭素および窒素および無機塩を含んで成る適切な栄養培地で行われる。目的とするポリペプチドは、当業界で周知の方法によって栄養培地から回収されうる。ポリペプチドが栄養培地へ分泌される場合は、ポリペプチドは培地から直接回収されうる。ポリペプチドが分泌されない場合は、これは細胞溶解物から回収されうる。必要に応じて、回収はさらに従来の手段による単離および精製を含んで成りうる。

例えば、ポリペプチドは、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿を含むがこれらに限定されない従来の方法によって単離されうる。次いで、単離ポリペプチドは、さらに、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマト分画、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、予備的等電点電気泳動法）、分画溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、または抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．ヤンソン（Ｊａｎｓｏｎ）とラース ライデン（Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ）編、ＶＣＨパブリッシャーズ（Ｐｕｂｌｉｓｃｈｅｒｓ）、ニューヨーク、１９８９年を参照）を含むがこれらに限定されない当業者に周知のさまざまな方法によって精製されうる。

好都合にも、目的とするポリペプチドは、緩衝剤を含む適切な（固体または液体）担体または希釈剤と混合され、ポリペプチド組成物を生じうる。ポリペプチドは、例えば固体担体上に固定された担体に付着され、またはこれと混合されうる。

目的とするポリペプチドは、ポリペプチドに特異的である当業界で周知の方法を使用して検出されうる。これらの検出方法としては、特異的抗体、酵素生成物の形成、酵素基質の消失、またはＳＤＳ ＰＡＧＥの使用を挙げることができる。例えば、酵素アッセイを使用し、ポリペプチドの活性を測定することができる。酵素活性を測定するための方法が、多くの酵素について当業界で周知である。

本発明の方法において、宿主細胞、好ましくは、糸状菌宿主細胞は、同一の条件下に培養した場合、ＳＥＣ６１発現に対して本発明による修飾されていないその対応する対応細胞より少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約１００％、さらにより好ましくは少なくとも約２００％、かつ最も好ましくは少なくとも約３００％以上の目的とするポリペプチドを産生する。

目的とするポリペプチドは、宿主細胞と相同（天然）または異種のポリペプチドでありうる。「ポリペプチド」という語は、本明細書では、コードされた生成物の特定の長さを指すことはなく、したがってペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を包含する。

異種ポリペプチドは、宿主細胞によって自然に産生されないポリペプチドを包含しうる。目的とするポリペプチドは、核酸配列によってコードされる宿主細胞を原産とするポリペプチドをも包含しうるが、その発現はポリペプチドをコードする核酸配列と異質の１つもしくはそれ以上の制御配列によって制御される。

目的とするポリペプチドを産生するように遺伝子操作されていないが、かかるポリペプチドを自然に産生する菌株において本発明のＳＥＣ６１ポリペプチドの過剰発現を達成することも可能である。

好ましい実施形態において、目的とするポリペプチドは、抗体もしくはその一部分、抗原、凝固因子、酵素、ホルモン、もしくはホルモン変異体、受容体もしくはその一部分、調節タンパク質、構造的タンパク質、リポーター、または輸送タンパク質である。

より好ましい実施形態において、目的とするポリペプチドは酵素であり、最も好ましくは、酵素はオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、またはリガーゼである。

さらにより好ましい実施形態において、酵素はアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシキペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである。

別のさらにより好ましい実施形態において、ポリペプチドはヒトインスリンもしくはその類似体、ヒト成長ホルモン、エリトロポエチン、またはインスリノトロピンである。

目的とするポリペプチドをコードする核酸配列は、原核、真核、または他の供給源から獲得されうる。本発明の目的のために、所定の供給源に関連して本明細書で使用される「から獲得される」という語は、供給源からの遺伝子が挿入されている供給源すなわち細胞によってポリペプチドが製造されることを意味する。

本発明は、本発明の範囲の限定として考えるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。

実験情報
菌株
ＷＴ １：本Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株が野生型菌株として使用される。本菌株は寄託番号ＣＢＳ５１３．８８によりＣＢＳ研究所で寄託されている。

ＷＴ ２：本Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株はグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）をコードする遺伝子の欠失を含んで成るＷＴ １菌株である。ＷＴ ２は、ＣＢＳ ５１３．８８のゲノムにおけるｇｌａＡ特異的ＤＮＡ配列を削除するし方が記載されているＥＰ６３５５７４号明細書に記載されている「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ」法を使用して構成される。この方法は結果として、異種ＤＮＡ配列を有さないＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ ΔｇｌａＡ組換えＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８菌株をもたらす。

ＷＴ ３：本Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株は主要な細胞外アスパラギン酸プロテアーゼｐｅｐＡをコードするｐｅｐＡ遺伝子の欠失を含んで成るＷＴ ２菌株である。ＷＴ ３はＥＰ０６３５５７４号明細書に記載されている「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ」法を使用して構成される。本特許に記載された方法は、ファン・デン・ホンバーグ（ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｂｅｒｇｈ）ら（ファン・デン・ホンバーグ（ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｂｅｒｇｈ）ＪＰ、ソレウィン・ゲルプケ（Ｓｏｌｌｅｗｉｊｎ Ｇｅｌｐｋｅ）ＭＤ、ファン・デ・フォンデルフォルト（Ｖａｎ ｄｅ Ｖｏｎｄｅｒｖｏｏｒｔ）ＰＪ、ブクトン（Ｂｕｘｔｏｎ）ＦＰ、ビセル（Ｖｉｓｓｅｒ）Ｊ．（１９９７年）−アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）における３つの酸プロテアーゼの崩壊−−プロテアーゼスペクトル、細胞内タンパク質溶解、および標的タンパク質の分解に対して作用する（Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ−−ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ， ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ， ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）−Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７（２）６０５−１３頁）によって記載されたＣＢＳ５１３．８８のゲノムにおけるｐｅｐＡ特異的ＤＮＡ配列を削除するために使用される。この方法は結果として、異種ＤＮＡ配列を有さないＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ ΔｐｅｐＡ、ΔｇｌａＡ組換えＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８菌株をもたらす。

ＷＴ ４：本ペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）菌株は野生型菌株として使用される。本菌株は寄託番号ＣＢＳ４５５．９５によりＣＢＳ研究所で寄託されている。

ＥＰＯ １：本Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株は、他の箇所（国際公開第０２／４５５２４号パンフレット）で公開されているプロリン特異的エンドプロテアーゼのＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ｅｐｏ遺伝子の多重コピーを含んで成るＷＴ２菌株である。ＥＰＯ １は、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されているプロリン特異的エンドプロテアーゼの遺伝子コードを含んで成るｐＧＢＡＡＳ−１（ＥＰ０６３５５７４号明細書に記載されている通り構成）およびｐＧＢＴＯＰＥＰＯ−１ベクター（図１）で示されているベクターを含有するａｍｄＳ選択可能なマーカー遺伝子の共形質転換によって構成される。形質転換および対抗選択法は結果としてグルコアミラーゼプロモーターの制御下にプロリン特異的エンドプロテアーゼコード遺伝子の多重コピーを含有するＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ ＥＰＯ １菌株がもたらされる。

ＰＬＡ １：異種ブタホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）タンパク質は、モデルタンパク質として選択される。本タンパク質は高量でＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）において産生するのが困難であることが以前に証明されている（ロベルツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）Ｉ．Ｎ．、ジーンズ（Ｊｅｅｎｅｓ）Ｄ．Ｊ．、マッケンジー（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ）Ｄ．Ａ．、ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）Ａ．Ｐ．、サムナー（Ｓｕｍｎｅｒ）Ｉ．Ｇ．およびアーチャー（Ａｒｃｈｅｒ）Ｄ．Ｂ．（１９９２年）−アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）における異種遺伝子発現（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）。グルコアミラーゼ−ブタ膵ホスホホリパーゼＡ_２融合タンパク質が分泌され加工されて成熟酵素をもたらす。Ｇｅｎｅ １２２：１５５−１６１頁）。ＰＬＡ２の過剰発現の断片は、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）の天然グルコアミラーゼＡ遺伝子とのプロＰＬＡ２の融合として製造され、ロベルツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら（１９９２年）によって記載されているように調製される。融合タンパク質は、ゴルジにおいて加工されるためにｋｅｘ１スプライシング部位を含有する。本ｇｌａＡ−ｐｌａ２融合遺伝子は、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されている同じ方法を使用してＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ｐＧＢＴＯＰ発現ベクターへクローン化され、結果としてｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−１がもたらされる（図２）。

ＰＬＡ １ Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株は、グルコアミラーゼ−ブタ膵ホスホリパーゼＡ_２融合タンパク質コード遺伝子の多重コピーを含んで成るＷＴ ３菌株である。ＰＬＡ １はベクターｐＧＢＡＡＳ−１およびｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−１ベクターを含有するａｍｄＳ選択可能なマーカー遺伝子の共形質転換によって構成される（図２）。形質転換および対抗選択法の結果として、グルコアミラーゼプロモーターの制御下にグルコアミラーゼ−ブタ膵ホスホリパーゼＡ_２融合タンパク質コード遺伝子の多重コピーを含有するＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ ＰＬＡ １菌株がもたらされる。

Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵
Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株を実施例、すなわち、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットの「アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵」の部に記載された前培養培地２０ｍｌ中で前培養する。一夜増殖後、１０ｍｌの本培養液を発酵培地（ＦＭ）に移す。発酵培地（ＦＭ）は１リットル当り以下を含有する。すなわち、グルコース・１Ｈ_２Ｏ ８２．５ｇ、Ｍａｌｄｅｘ １５（ブーム・メッペル（Ｂｏｏｍ Ｍｅｐｐｅｌ）、オランダ）２５ｇ、クエン酸２ｇ、ＮａＨ_２ＰＯ_４・１Ｈ_２Ｏ ４．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ９ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ １５ｇ、ＺｎＣｌ_２ ０．０２ｇ、ＭｎＳＯ_４・１Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．０１５ｇ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．０１５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．３ｇ、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルフォリノ］エタンスルホン酸）３０ｇ、ｐＨ６。

ＦＭにおける発酵は、指示された日数の間、３４℃および１７０ｒｐｍで発酵ブロス１００ｍｌを含む整流装置を備えた５００ｍｌフラスコで実行される。

酵素アッセイ
ＰＬＡ２ホスホリパーゼ活性
アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）培養ブロス中のホスホリパーゼＰＬＡ２活性（ＰＬＡ２）を分光光度的に測定するために、人工基質、すなわち、１，２−ジチオジオクタノイルホスファチジルコリン（ｄｉＣ８、基質）を使用する。ＰＬＡ２はＡ２位置でのスルフィド結合を加水分解し、チオオクタン酸を解離する。チオオクタン酸は４，４ジチオピリジン（呈色試薬、４−ＤＴＤＰ）と反応し、４−チオピリドンを形成する。４−チオピリドンは、３３４ｎｍの波長を有する放射線を吸収する４−メルカプトピリジンと互変異性平衡にある。同波長での吸光度の変化を測定する。一単位は、３７℃およびｐＨ４．０で１，２−ジチオジオクタノイルホスファチジルコリンからチオ−オクタン酸を毎分１ｎｍｏｌ遊離させる酵素の量である。

基質溶液は、エタノール６６ｍｌ当りｄｉＣ８結晶１ｇを溶解し、緩衝酢酸溶液２６４ｍｌを添加することによって調製される。緩衝酢酸溶液は、０．２％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００含有０．１Ｍ緩衝酢酸溶液ｐＨ３．８５を含んで成る。呈色試薬は１１ｍＭ ４，４−ジチオピリジン溶液である。これは２ｍｌエッペンドルフサンプルカップ中に４，４−ジチオピリジン５．０ｍｇを秤量し、エタノール１．００ｍｌ中に溶解することによって調製される。１．００ｍｌのｍｉｌｌｉ−Ｑ水を添加する。

プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性
プロリン特異的エンドプロテアーゼのタンパク質分解活性は、クエン酸／リン酸２ナトリウム緩衝液ｐＨ５中３７℃下ＣＢＺ−Ｇｌｙ（ｃｉｎｅ）−Ｐｒｏ（ｌｉｎｅ）−ｐＮＡを使用して時間内に４１０ｎｍで分光光度分析的に測定される。１Ｕプロリン特異的エンドプロテアーゼを上記の条件下、ｐＨ５および３７℃でＣＢＺ−Ｇｌｙ（ｃｉｎｅ）−Ｐｒｏ（ｌｉｎｅ）−ｐＮＡを毎分１μｍｏｌ（マイクロモル）を変換する酵素の量と定義する。

グルコアミラーゼ活性アッセイ
グルコアミラーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニル α−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を使用して国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載されている通りに測定される。

実施例１：発現ベクターにおけるｓｅｃ６１遺伝子のクローニング、Ｓｅｃ６１転位チャンネルのコード
アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）菌株ＷＴ １およびペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＷＴ ４のゲノムＤＮＡを配列決定し、分析する。Ｓｅｃ６１と相同体と注釈付きの翻訳タンパク質を有する１つの遺伝子が同定され、ｓｅｃ６１と命名されている。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（イントロンによる）および約１８０ｂｐの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３２７ｂｐの３’ＵＴＲを含んで成るＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ｓｅｃ６１遺伝子座のゲノム配列は、配列番号１に示されている。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（イントロンによる）および約１２ｂｐの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および６６ｂｐの３’ＵＴＲを含んで成るペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ｓｅｃ６１遺伝子座のゲノム配列は、配列番号７に示されている。

ＷＴ １からのゲノムＤＮＡは、配列番号１３および配列番号１４のプライマーを使用し、野生型ｓｅｃ６１遺伝子を増幅させ、適切な制限部位を付着させるＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用される。同時に、同じ実験をｃＤＮＡをテンプレートとして使用して実行する。すなわち、ＰＣＲ反応は配列番号１４および１５のプライマーを使用して行われ、野生型ｓｅｃ６１ｃＤＮＡを増幅させる。すべてのＰＣＲ反応、ｃＤＮＡ合成、ライゲーション、および形質転換は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年に記載されている通りに実行される。さまざまに独立して増幅されたＰＣＲ断片の配列は配列分析によって決定される。配列番号１は、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ｓｅｃ６１ゲノム配列を含んで成る。Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）のＳｅｃ６１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列のＯＲＦは配列番号２として提供されている。配列番号２の翻訳アミノ酸配列は配列番号３で指定され、これはＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ＷＴ １のＳｅｃ６１タンパク質を表す。

ＷＴ ４からのゲノムＤＮＡは、配列番号１０および配列番号１１のプライマーを使用し、野生型ＳＥＣ６１遺伝子を増幅させ、適切な制限部位を付着させるＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用される。同時に、同じ実験をｃＤＮＡをテンプレートとして使用して実行する。すなわち、ＰＣＲ反応は配列番号１１および１２のプライマーを使用して行われ、野生型ｓｅｃ６１ｃＤＮＡを増幅させる。さまざまに独立して増幅されたＰＣＲ断片の配列は配列分析によって決定される。配列番号７は、ペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ｓｅｃ６１ゲノム配列を含んで成る。Ｐ．クリゾゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＳｅｃ６１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列のＯＲＦは配列番号８として提供されている。配列番号８の翻訳アミノ酸配列は配列番号９で指定され、これはＰ．クリゾゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＷＴ ４のＳｅｃ６１タンパク質を表す。

Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ｓｅｃ６１ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列を含んで成る結果として生じるＰＣＲ断片は、メーカーの指示に従ってＰａｃｌおよびＡｓｃｌで切断され、Ｐａｃｌ、Ａｓｃｌ線状化ｐＧＢＦＩＮ−１８Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）発現ベクターでライゲートされる（図３）。ｐＧＢＦＩＮ−１８ベクターのプラスミドおよび構成は国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されている。これは結果として、Ｓｅｃ６１がｇｌａＡプロモーターの制御下に配置されているｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−１およびｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−２の構築物をもたらした（ｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−１のマップについて図４を参照）。

アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）の構成的ｇｐｄＡプロモーターの制御下、およびｐＧＢＦＩＮ−１８ベースのＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）発現ベクターにも存在するａｍｄＳ遺伝子は、選択マーカーとして使用され、唯一のＮ源としてアセトアミドでの増殖が誘発されうる（ケリー（Ｋｅｌｌｙ），Ｊ．Ｍ．およびハインズ（Ｈｙｎｅｓ），Ｍ．Ｊ．（１９８５年）。アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｍｄＳ遺伝子によるアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の形質転換。ＥＭＢＯ Ｊ．４、４７５−４７９頁に記載）。

実施例２：遺伝子置換および過剰発現ベクターにおける修飾Ｓｅｃ６１転位チャンネルをコードする、ｓｅｃ６１^＊の構成
古典的な分子生物学法をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年に記載されている通り使用する。Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）欠失ベクターの一般的な設計はＥＰ６３５５７４号明細書および国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載されている。

修飾ｓｅｃ６１遺伝子は、セリン３７６がトリプトファンによって置換されているＳｅｃ６１^＊タンパク質をコードするｓｅｃ６１^＊と呼ばれ、配列オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ、Ｇｅｎｅ．１９８９年４月１５、７７（１）：５１−９頁、ホ（Ｈｏ）ＳＮ、ハント（Ｈｕｎｔ）ＨＤ、ホルトン（Ｈｏｒｔｏｎ）ＲＭ、プレン（Ｐｕｌｌｅｎ）ＪＫ、ピース（Ｐｅａｓｅ）ＬＲ、「ポリメラーゼ連鎖反応を使用するオーバーラップ伸長による部位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」に記載）によって構成される。配列番号１８および配列番号１７で識別されたオリゴヌクレオチド、およびＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ＷＴ １のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用することにより、断片Ａで識別された１．４ｋｂのｓｅｃ６１遺伝子の５’領域がＰＣＲによって増幅される。また、Ａｓｃｌ制限部位が断片Ａの５’末端に付着されている。配列番号１６および配列番号１９で識別されたオリゴヌクレオチドおよびＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ＷＴ １のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用することにより、断片Ｂで識別された３’−ＵＴＲを含む０．６ｋｂのｓｅｃ６１遺伝子の３’領域がＰＣＲによって増幅される。また、ＮｏｔｌおよびＥｃｏＲｌ制限部位が断片Ｂの３’末端に付着されている。結果として生じる断片ＡおよびＢは、ＳＯＥ−ＰＣＲ、配列番号１８および配列番号１９で識別されるオリゴヌクレオチド、および断片ＡおよびＢによって融合され、２ｋｂ断片Ｃを生成する。本断片ＣはｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でクローン化され、ｐＣＲ＿Ｓｅｃ６１^＊を生成する。ｐＣＲ＿Ｓｅｃ６１^＊のＰＣＲ生成断片の配列は確認され、配列番号４で提供されている。修飾Ｓｅｃ６１^＊タンパク質のコード配列は配列番号５で提供されている。配列番号５の翻訳アミノ酸配列は配列番号６で指定され、これは修飾Ｓｅｃ６１^＊タンパク質を表す。

ベクターｐＣＲ＿Ｓｅｃ６１^＊はＡｓｃｌおよびＥｃｏＲｌで消化され、ｓｅｃ６１^＊断片はＡｓｃｌおよびＥｃｏＲｌ消化ベクターｐＧＢＤＥＬへ導入され、ｐＧＢＤＥＬ−１（データは示さず）を生成する。その後、ベクターｐＣＲ＿Ｓｅｃ６１^＊はＥｃｏＲＶおよびＮｏｔｌで消化され、３’ｓｅｃ６１^＊断片はＳｍａｌおよびＮｏｔｌ消化ベクターｐＧＢＤＥＬ−１へ導入され、ｐＧＢＤＥＬ−ＳＥＣ６１^＊を生成する（図５）。

ベクターｐＣＲ＿Ｓｅｃ６１^＊は配列番号１３および配列番号１４のプライマーを使用し、修飾ｓｅｃ６１遺伝子を増幅させ、適切な制限部位を付着させるＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用される。修飾ｓｅｃ６１^＊配列を含んで成る結果として生じるＰＣＲ断片は、メーカーの指示に従ってＰａｃｌおよびＡｓｃｌで切断され、Ｐａｃｌ、Ａｓｃｌ線状化ｐＧＢＦＩＮ−１８Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）発現ベクターでライゲートされるが、ここでＰｇｌａＡプロモーターは、ｐｅｐＣプロモーター（フレデリック（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）ＧＤ、ロンブーツ（Ｒｏｍｂｏｕｔｓ）Ｐ、ブクストン（Ｂｕｘｔｏｎ）ＦＰ（１９９３年）−アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）からのセリンプロテアーゼをコードする遺伝子、ｐｅｐＣのクローニングおよび特徴づけ（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐＣ， ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ．）−Ｇｅｎｅ １２５（１）：５７−６４頁）によって置換される。これは結果としてｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−３構築物をもたらしたが、ここで修飾Ｓｅｃ６１^＊遺伝子はｐｅｐＣプロモーターの制御下に配置される（図６）。

実施例３．野生型ｓｅｃ６１および修飾ｓｅｃ６１^＊遺伝子を過剰発現し、修飾ｓｅｃ６１^＊転位チャンネルを発現する真菌宿主細胞
構成的ｇｐｄＡプロモーターの制御下に配置されるアスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｍｄＳ遺伝子は、ＥＰ６３５５７４号明細書に記載されている通り選択マーカーとして使用される。原則的には、ｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−１、ｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−２、ｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−３、およびｐＧＢＤＥＬ−ＳＥＣ６１^＊の線状ＤＮＡが指示された制限酵素での消化後に単離される。アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＰＬＡ１およびＥＰＯ １菌株は形質転換され、その後のアセトアミドでの形質転換体選択は国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、ＥＰ６３５５７４号明細書、および国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されている通りに行われる。その後、コロニーが標準の方法に従って精製される。

ＰＬＡ１ およびＥＰＯ １菌株の増殖コロニーは、それぞれ、形質転換ＳＥＣプラスミドのコピー数およびｐｌａ２およびｅｐｏ遺伝子コピーの非喪失について診断される。同様に推定されたコピー数、およびｐｌａ２およびｅｐｏ遺伝子コピーの非喪失のｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−１、ｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−２、ｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−３の形質転換体が選択される。単一コピー（＿Ａ、＿Ｂ、＿Ｃ、＿．．．）による数個の形質転換体が選択される。これは結果として、野生型のゲノムｓｅｃ６１（ｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−１）、ｃＤＮＡｓｅｃ６１（ｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−２）および修飾ｓｅｃ６１^＊遺伝子（ｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−３）がもたらした。ＰＬＡ １およびＥＰＯ １菌株の形質転換体は、それぞれ、ＰＬＡ＿ＳＥＣ１、ＰＬＡ＿ＳＥＣ２、ＰＬＡ＿ＳＥＣ３、およびＥＰＯ＿ＳＥＣ１、ＥＰＯ＿ＳＥＣ２、ＥＰＯ＿ＳＥＣ３で指示されている。

ｓｅｃ６１遺伝子座でゲノムへ組込まれたｐＧＢＤＥＬ−ＳＥＣ６１^＊断片の形質転換体は、図７に示されている通り、ｓｅｃ６１^＊遺伝子およびａｍｄＳ遺伝子で野生型ｓｅｃ６１遺伝子を置換した。標的のために使用された断片および方法により、相同組換え時の置換は１００％ではない。したがって、精製ｐＧＢＤＥＬ−ＳＥＣ６１^＊形質転換体は、ｓｅｃ６１遺伝子座での相同組込みに対する２つのＰＣＲ反応およびｓｅｃ６１^＊遺伝子配列に対するｓｅｃ６１遺伝子の置換によって診断される。ｓｅｃ６１^＊遺伝子によるｓｅｃ６１の本置換は、テンプレートとしてｐＧＢＤＥＬ−ＳＥＣ６１^＊形質転換体のゲノムＤＮＡを使用し、かつ配列番号２０および配列番号２２のプライマーを使用し、ｓｅｃ６１遺伝子座で修飾ｓｅｃ６１^＊遺伝子を増幅するバンドの第１のＰＣＲ増幅によって検出可能である。ｓｅｃ６１^＊遺伝子によるｓｅｃ６１の本置換は、テンプレートとしてｐＧＢＤＥＬ−ＳＥＣ６１^＊形質転換体のゲノムＤＮＡを使用し、かつ配列番号２０および配列番号２１のプライマーを使用し、障害をチェックして野生型ｓｅｃ６１遺伝子を増幅させる第２のＰＣＲによって確認される。また、ｐｌａ２およびｅｐｏ遺伝子コピーの非喪失が、それぞれ、試験される。その後、胞子がフルオロアセトアミド培地にプレーティングされ、ａｍｄＳマーカーを喪失する菌株を選択する。さらに、増殖コロニーが、上記の通り、ｓｅｃ６１^＊遺伝子配列およびｐｌａ２またはｅｐｏ遺伝子コピーの非喪失に対するｓｅｃ６１遺伝子の置換についてＰＣＲによって診断され、候補の菌株が、ａｍｄＳマーカーを喪失する形質転換体および誘導菌株を含有するａｍｄＳのサザン分析によって試験される。ｓｅｃ６１^＊遺伝子に対するｓｅｃ６１遺伝子の置換は、両方の菌株のｓｅｃ６１プローブへのハイブリダイゼーション、形質転換体を含有するａｍｄＳにおける全遺伝子座をカバーするＤＮＡ断片の約２．２ｋｂサイズの増大、およびａｍｄＳマーカーを喪失する誘導菌株における野生型断片によって検出可能である。約４０％の菌株は、ｐＧＢＤＥＬ−ＳＥＣ６１^＊の相同組込みを示したが、そのうち約７０％でｓｅｃ６１^＊遺伝子に対するｓｅｃ６１遺伝子の置換が検出可能である。菌株ＰＬＡ＿ＳＥＣ６１^＊およびＥＰＯ＿ＳＥＣ６１^＊は、修飾ｓｅｃ６１^＊遺伝子によって置換されるｓｅｃ６１遺伝子を有する代表的な菌株として選択される。

また、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＰＬＡ＿ＳＥＣ６１^＊およびＥＰＯ＿ＳＥＣ６１^＊は、ｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−３の線状ＤＮＡで形質転換され、その後のアセトアミドでの形質転換体選択およびコロニー単離が上記の通り行われる。菌株ＰＬＡ＿ＳＥＣ６１^＊＿２およびＥＰＯ＿ＳＥＣ６１^＊＿２は、修飾Ｓｅｃ６１^＊の過剰発現に対する代表的な菌株として選択され、内因性ｓｅｃ６１遺伝子が修飾ｓｅｃ６１^＊遺伝子によって置換され、強いｇｌａＡプロモーターの制御下に修飾Ｓｅｃ６１^＊遺伝子の追加のコピーを有し、かつｐｌａ２またはｅｐｏ遺伝子のコピーが非喪失である。

実施例４．得られたアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）菌株によるタンパク質の分泌の改良
ｐＧＢＴＯＰＥＰＯ−１構築物の同等のコピーを有する一部のＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ２およびＥＰＯ＿ＳＥＣ１、ＥＰＯ＿ＳＥＣ２、およびＥＰＯ＿ＳＥＣ３、ＥＰＯ＿ＳＥＣ６１^＊およびＥＰＯ＿ＳＥＣ６１^＊＿２形質転換体を選択して振盪フラスコ実験を行う。また、ｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−１構築物の同等のコピーを有する一部のＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ３およびＰＬＡ＿ＳＥＣ１、ＰＬＡ＿ＳＥＣ２、およびＰＬＡ＿ＳＥＣ３、ＰＬＡ＿ＳＥＣ６１^＊、およびＰＬＡ＿ＳＥＣ６１^＊ ＿２形質転換体を選択し、振盪フラスコ実験を行う。振盪フラスコ実験は、実験方法−「Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵（Ａ． ｎｉｇｅｒ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ）」に記載されている通り１００ｍｌの発酵培地（ＦＭ）中で行われる。培養ブロスは７日間の培養中に採集し、エンドプロテアーゼおよびＰＬＡ２活性を上記の通り測定する。

図８は、同じコピー数のＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ＥＰＯ菌株の形質転換体における相対的プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を示す。発明者らは、Ｓｅｃ６１および修飾Ｓｅｃ６１^＊タンパク質の過剰発現が結果としてエンドプロテアーゼ酵素の生産の増大をもたらすと結論づける。過剰発現はグルコアミラーゼｇｌａＡおよびプロテアーゼｐｅｐＣプロモーターを使用して実行されている。また、ゲノムまたはｃＤＮＡ構築物によるＳｅｃ６１の過剰発現、またはゲノムに依然として存在する内因性ｓｅｃ６１遺伝子による修飾Ｓｅｃ６１^＊の過剰発現は結果として、エンドプロテアーゼ酵素の生産の増大をもたらす。

これらの結果は、ｓｅｃ６１^＊およびｓｅｃ６１が、真菌宿主細胞におけるポリペプチドの改良された生産を得る優れた手段であることを示す。図９および１０は、それぞれ、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ２、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＣ６１^＊、およびＳＥＣ６１^＊＿２において、およびＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ＷＴ ２ｐＧＢＦＩＮ−ＰＬＡ２形質転換において測定される際の、ＰＬＡ２およびグルコアミラーゼ活性を示す。欠失野生型ｓｅｃ６１遺伝子を有する菌株において、無傷のＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ＰＬＡ １およびＰＬＡ＿ＳＥＣ１、ＰＬＡ＿ＳＥＣ３、およびＰＬＡ＿ＳＥＣ６１^＊を有し、同等のコピー数を有する菌株と比べＰＬＡ２活性の明らかな増大が確認されることは明らかである。発明者らは、修飾Ｓｅｃ６１^＊タンパク質の発現が結果として、異種ホスホリパーゼＡ２および相同グルコアミラーゼ酵素の両方の生産の増大をもたらすと結論づける。過剰発現はグルコアミラーゼｇｌａＡおよびプロテアーゼｐｅｐＣプロモーターを使用して実行されている。ＰＬＡ２および／またはグルコアミラーゼ活性が増大していない菌株は発酵中にコピーを喪失したことが証明されている。したがって、コピー当りの発現は依然としてＳｅｃ６１の過剰発現とともに増大する。これらの結果は、ｓｅｃ６１^＊およびｓｅｃ６１の発現の操作が結果として真菌宿主細胞におけるポリペプチドの生産の改良をもたらすことを示す。

プロリン特異的エンドプロテアーゼ発現ベクターｐＧＢＴＯＰＥＰＯ−１のプラスミドマップを示す図である。ｇｌａＡプロモーターおよびプロリン特異的エンドプロテアーゼｅｐｏ遺伝子に対するｇｌａＡフランキング領域が示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株への形質転換前に、制限酵素ＨｉｎＤＩＩＩによる消化によって除去されうる。 ＰＬＡ２発現ベクターｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２のプラスミドマップを示す図である。ｇｌａＡプロモーター、切断ｇｌａＡ遺伝子、およびプロ−ｐｌａ２コード配列に対するｇｌａＡフランキング領域が示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株への形質転換前に、制限酵素Ｎｏｔｌによる消化によって除去されうる。 発現ベクターｐＧＢＦＩＮ−１８のプラスミドマップを示す図である。グルコアミラーゼプロモーターにおける独自のＳｆｉｌおよびＥｃｏＲｌクローニング部位の後、ＰａｃｌおよびＡｓｃｌクローニング部位によるｇｌａＡプロモーターに対するｇｌａＡフランキング領域が示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株への形質転換前に、制限酵素Ｎｏｔｌによる消化によって除去されうる。 発現ベクターｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−１のプラスミドマップを示す図である。ｇｌａＡプロモーターおよびＡ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）ゲノムｓｅｃ６１遺伝子に対するｇｌａＡフランキング領域が示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株への形質転換前に、制限酵素Ｎｏｔｌによる消化によって除去されうる。 置換ベクターｐＧＢＤＥＬ−Ｓｅｃ６１^＊のプラスミドマップを示す図である。ａｍｄＳマーカーに対するＳｅｃ６１^＊突然変異遺伝子および３’Ｓｅｃ６１^＊突然変異遺伝子断片が示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株への形質転換前に、制限酵素ＡｓｃｌおよびＮｏｔｌによる消化によって除去されうる。 発現ベクターｐＧＢＦＩＮＳＥＣ−３のプラスミドマップを示す図である。ｇｌａＡｐｅｐＣプロモーターおよび修飾ｓｅｃ６１^＊遺伝子に対するｇｌａＡフランキング領域が示されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、Ａ．ニゲル（ｎｉｇｅｒ）菌株への形質転換前に、制限酵素Ｎｏｔｌによる消化によって除去されうる。 ｓｅｃ６１遺伝子置換を示す概略図である。ｓｅｃ６１遺伝子（１）の相同領域によってフランキングされたａｍｄＳ選択マーカーを含んで成るｐＧＢＤＥＬ−Ｓｅｃ６１^＊の線状ＤＮＡ構築物は、ゲノムｓｅｃ６１遺伝子座（２）で二重相同組換え（Ｘ）により結合し、修飾ｓｅｃ６１^＊遺伝子によってゲノムｓｅｃ６１遺伝子コピー（３）を置換する。その後、（修飾）ｓｅｃ６１配列（Ｕ）の直接の繰返しに及ぶ組換えがａｍｄＳマーカーを除去し、結果として修飾ｓｅｃ６１^＊遺伝子（４）によるｓｅｃ６１遺伝子の遺伝子置換イベントが生じる。ａｍｄＳマーカーが有る場合（３）および無い場合（４）の両方の菌株は機能的修飾ｓｅｃ６１^＊遺伝子を有する。 さまざまなｓｅｃ６１構築物で形質転換されたＥＰＯ １菌株の相対細胞外プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を示す図である。試料を発酵の数日間に採取する。３日目のＥＰＯ １の発現は１００％で設定されている。 さまざまなｓｅｃ６１構築物で形質転換されたＰＬＡ １菌株の細胞外ＰＬＡ２活性を示す図である。試料を発酵の数日間に採取する。 さまざまなｓｅｃ６１構築物で形質転換されたＰＬＡ １菌株の細胞外グルコアミラーゼ活性を示す図である。菌株および試料は図１１と同一である。試料を発酵の数日間に採取する。

Claims (16)

1. 配列番号３によるアミノ酸配列との少なくとも９５％の、配列番号３によるアミノ酸配列の全長にわたって測定される同一性の程度を有し、ここで配列番号３の第３７６位置にあるコンセンサスモチーフＡＬＦＳＫＴＷ中のアミノ酸が修飾され、配列番号３の第３７６位置にあるアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン又はヒスチジンによって置換されている、ＳＥＣ６１変異ポリペプチド。
2. 配列番号３の第３７６位置にある前記アミノ酸が、トリプトファンによって置換される、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 修飾されている前記アミノ酸がセリンである、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
4. 配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る単離ポリヌクレオチド。
6. 前記ポリヌクレオチドまたは核酸配列が、配列番号２の核酸配列と少なくとも９０％の同一性の程度を有する核酸配列である、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
7. ＳＥＣ６１ポリペプチドをコードする請求項５または６の核酸配列を含んで成り、前記核酸配列が、適切な宿主におけるポリペプチドの発現を指図する１つもしくはそれ以上の制御配列に操作可能に結合されている、核酸構築物または発現ベクター。
8. 前記制御配列が、プロモーターのほか、転写および翻訳停止シグナルを含んで成る、請求項７に記載の核酸構築物または発現ベクター。
9. 請求項５〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、核酸構築物、または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
10. 内因性ｓｅｃ６１遺伝子が不活性化されている、請求項９に記載の宿主細胞。
11. 糸状菌細胞である請求項９または１０に記載の宿主細胞。
12. 前記糸状菌細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種からなる群から選択される種に属する、請求項１１に記載の宿主細胞。
13. 前記糸状菌細胞が、アスペルギウス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の種に属する、請求項１２に記載の宿主細胞。
14. 前記宿主細胞が、目的とするポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成るポリヌクレオチドまたは発現ベクターをさらに含んで成る、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
15. 目的とするポリペプチドの発現をもたらす条件下に請求項１４に記載の宿主細胞を培養するステップを含んで成る、目的とするポリペプチドを製造するための方法。
16. さらに、培養ブロスから目的とする前記ポリペプチドを回収するステップを含む、請求項１５に記載の方法。

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