JPH0398595A - ペプチド類の遺伝子工学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はペプチド類の遺伝子工学的製造法に関する。更
に詳細には枯草菌もしくは大ＦＩＡ菌を宿主とし、黄色
ブドウ球菌由来のスタフイ口キナーぜ遺伝子中のシグナ
ル・ペプチドを］一ドする領域を利用した遺伝子操作に
よりソマトメジンＣなどのベブヂド類を菌体外に生産さ
せる事によりペブチド類の製造をこれまでの方法よりも
効率良く且つ容易に行うことを可能にしたペプチド類の
遺伝子工学的製造法である。

（従来の技術） 近年においては、遺伝子操作技術が発達し、医桑品、農
薬等に有用な各種のペプチドを大腸菌、枯草菌、動物細
胞等において大囚に生産することが可能となっている。

例えば、血清中に存在する成長因子の１つでありｆＪｌ
傷治療薬として則侍されているソマトメジンＣを、大腸
菌において融合蛋白として生産する方法が報告されてい
ろく特開昭６２−９１１９９号公報〉。このように大腸
菌において遺伝子操作により有用なペプチドを生産する
場合には、目的とするペプチドは通常菌体内に産生きれ
る。従ってペプチドを回収するためには菌体内より抽出
精製する工程が必要である。

これに対して、枯草菌を宿主として遺伝子操作によりペ
ブチドを生産する場合には、枯草菌は大腸菌に比べ単純
な細胞表層構造を有するため、産生されるペプチドは通
常細胞股を通過し直接培地中へ放出される。従ってペプ
チドの回収工程が容易であるため、最近では枯草菌が遺
伝子操作の宿主菌として広く使用されつつある。

他方、ペプチドを菌体外に分泌させる働きを有するもの
としてシグナル・ペプチドが知られている。シグナル・
ペプチドは分泌されるペブチドのアジノ末端に連結して
前駆体ペプチドを構成し、細胞膜を通過する機構に関連
している。そして前駆体ペプチドが菌体外に分泌される
際に、シグナル・ペプチドが切断されて成熟型のペプチ
ドとなる。そこで、シグナル・ペプチドをコードする遺
伝子と目的とするペプチドをコードする遺伝子とを連結
して、ペブチドを前駆体ペプチドとして発現させて目的
とするペプチドを菌体外に分泌させる試みが報告されテ
イる［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ．Ｓｃｉ．　Ｕ
．Ｓ．Ａ．　　７　７、３９８８　（１　９８０）；Ｅ
ｕｒＪ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　，　９　６、４９　（１
９７９）：蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、“遺伝子操
作″　２６巻、４弓、３８６−３９４　（１　９８１　
）］。

特開昭６１−１３５５９０ｇ公報には、黄色ブドウ球菌
（Ｓｔａ　ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）に
由来するスタフイ口キナーぜ遺伝子中のシグナル・ペプ
チドをフードする領域を含んだ大腸菌用の複合プラスミ
ドであって、目的とする蛋白を菌体外に分泌させるのに
使用し得るブラスミドが報告されている。

しかしながら、スタフイロキナーゼ遺伝了中のシグナル
・ペプチドをコードする領域を利用して、スタフイロキ
ナーゼ以外の異種蛋白を実際に菌体外へ分泌した例は未
だ報告されていない。

（発明が解決しようとする課題〉 本発明者は、黄色ブドウ球菌に由来するスタフイロキナ
ーゼ遺伝子中に存在するシグナル・ペプチドをコードす
る領域を利用して、目的とする有用なペプチドとしてソ
マトメジンＣを用いて、このペプチドを菌体外に分泌さ
せることを試みた所、宿主菌として特に枯草菌を用い、
ソマトメジンＣを特にスタフイロキナーゼとの融合蛋白
として発現せしめることにより、発現されるソマｉ−メ
ジンＣの大部分が菌体外に極めて効率良く分泌されるこ
とを見出した。そしてかかる方法は、ソマトメジンＣ以
外の他のペプチドの場合にも広く適用可能であり、また
大ｍ菌にも適用可能であることを知見し本発明を完成し
た。

しかして、本発明の目的は、宿主菌として枯草菌又は大
腸菌を用いて、黄色ブドウ球菌由来のスタフイロキナー
ゼ遺伝子中のシグナル・ペプチドをコ一ドする領域を利
用したペプチド類の遺伝子工学的製造法を提供すること
にある。

（課題を解決するための手段） 本発明は、 枯草菌もしくは大腸菌において作動し得るプロモーター
、該プロモーターの下流に位置する枯草菌もしくは大ｉ
！菌において作動し冑るシヤイン・ダルガーノ配列、該
配列の下流に位置する黄色ブドウ球菌由来のスタフイロ
キナーゼ遺伝子中のシグナル・ペプヂドをコードする領
域、及び該領域の下流に位叙するペプチド類をコードす
る構造遺伝子を含む組換えＤＮＡを有する発現用ベクタ
ーをｌＩ築し； 該発現用ベクターを用いて枯草菌もしくは大腸菌を形質
転換し；次いで 得られる形質転換体を培養してペプチド類を発現せしめ
、菌体外に分泌されるペプチド類を回収する： ことを特徴とするペプチド類の遺伝子工学的製造法であ
る。

本発明では、シグナル・ペプチドをコードする遺伝子と
して、黄色ブドウ球菌由来のスタフイロキナーゼ遺伝子
中に存在するシグナル・ペプチドをコードする領域を使
用する。

ここで言う黄色ブドウ球菌由来のスタフイロキナーゼ遺
伝子は、スタフイロキナーゼ（以下ＳＡＫと古う）生産
能を有するｓｔａｐｈｙ＋ｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ
の溶原ファージであって溶原変換能を有するファージの
ＤＮＡからＬ’？ることができる。このようなファージ
の例としては、Ｐφ２，Ｐφ１，Ｔφ−４２Ｄ．Ｐφ−
４　０　ｂ　［　Ｋｏｎｄｏ，　Ｉ．　ａｎｄＦｕｊｉ
ｓｅ．，κ．．　ｘｎｒｅｃｔ．　Ｉｌｌｌｕｎ．上旦
、２６６−２７２（１９７７）］などが挙げられる。こ
れらのファージを増殖させて、塩化セシウム平衡密度勾
配遠心法により精製したファージ粒子からＤＮＡを得る
ことができる。このＤＮＡ，即ちスタフイロキナーゼ遺
伝子はそのＤＮＡ配列が既に決定されており［Ｎｕｃ．
　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，エユ、７６７９（１９８３）
］、その構造を第３図に示した。第３図から明らかなよ
うにＳＡＫ遺伝子のシグナル・ペプチドをコードする領
域は、３１３−３９３ヌクレオチドに相当する。従って
この１１１が含まれるように適当な制限酵素で切り出す
ことによってＳＡＫ遺伝子中のシグナル・ペプチドをコ
ードする領域を得ることができる。例えば口ｉｎｄＩＩ
ｒで１７ｉｌ’ＡＪして４．８ｋｂの口ｉｎｄＩ［Ｉ断
片あるいはＡｃｃｌ及びＡＶａＩＩで同裂して約１．４
ｋｂのＡｃｃＩ／Ａｖａｆｆ所片として得ることができ
る〈第１Ａ及びＢ図参照）。この場合には、ＩＩ　ｉ　
ｎ　ｄ　ｍ断片あるいはＡＣＣＩ／ＡＶａＩＩ断片には
、シグナル・ペプチドをコードする領域とともにプロモ
ーター、シヤイン・ダルガーノ配列及びＳＡＫ構造遺伝
子も含まれており、これらをそのまま本発明の枯草菌ま
たは大ｇ菌での発現用ベクターの構築に使用できる。Ｓ
ＡＫ遺伝子のシグナル・ペプチドをコードする領域は、
そのＤＮＡ配列が既知であるため、化学的に合成しても
よい。

本発明では、シグナル・ペプチドをコードするｆｔ４域
の上流に、プロモーター及びシヤイン・ダルガーノ配列
を設ける。またその下流には目的とするペプチドをコー
ドする構造遺伝子を設ける。

枯草菌において作動し得るプロモーターとしては、いず
れでもよいが、例えばＳＡＫ、α−アミラーゼ、中性プ
ロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ及びベニシリナー
ぜ遺伝子中のプロモーターなどが挙げられる。大喝菌に
おいて作動し冑るプロモーターとしては、例えばＳＡＫ
遺伝子中のプロモーター　ｔａｃブ０モーター　ｔｒｐ
プロモーター　ＤｈＯＡプロモーター　ｊｌａｃプロモ
ーターなどが挙げられる。

枯草菌において作動し得るシヤイン・ダルガーノ配列と
しては、例えばＳＡＫ、アルカリ性プロテアーゼ、中性
プロテアーぜ、α−アミラーぜ及びベニシリナーゼ遺伝
子中のシ１７イン・ダルガーノ配列などがあり、大１ｌ
菌において作動し得るシヤイン・ダルガーノ配列として
は、例えばＳＡＫ，β−ガラクトシダーゼ及びアルカリ
性フオスファターゼ遺伝子中のシヤイン・ダルガーノ配
列などがある。

ペプチド類をコードする構造遺伝子としては、例えば、
ソマトメジンＣ，ＩＧＦ−ＩＩ、上皮細胞成長因子（Ｅ
ＧＦ）　、γ−インターフェロンなどをコードする構造
遺伝子が挙げられる。これらの構造遺伝子は既に公知で
ありそれぞれ、Ｙ．Ｓａｉｔｏ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，　１　０　１、１２３−１３４（１　９８７）
　；Ｊａｎｓｅｎ，　Ｈ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，
　　ｌ　７９、２４３−２４６　（１９８５）　：Ｂｅ
ｌｌ，　Ｇ．　ｔ．Ｎｕｃｌ．＾ｃｉｄ　ＲＯＳ．，　
１　４、８４２７−８４４６　（１９　８　６　）　：
　｝ｌｏｒｙ，　Ｙ．，　ＤＮＡ，互、１８１−１９３
（１９８６）に報告ざれている。

これらのプロモーター、シＶイン・ダルガーノ配列、シ
グナル・ペプチドをコードする領域等は、これらのそれ
ぞれのＤＮＡ配列またはこれらをそれぞれ含むＤＮＡ断
片を用いて適当なｔ，ＩＩ限酵素部位を利用してＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結することができる。あるいは、
これらのＤＮＡ配列もしくはＤＮＡＩＮ片の末端をＤＮ
Ａポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチド−３リン酸
によって平滑化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結
することができる。また、各連結部位に適宜ポリヌクレ
オチドリン力一を用いる事ができる。プロモーター、シ
ヤイン・ダルガーノ配列、黄色ブドウ球菌由来のスタフ
イロキナーゼ遺伝子のシグナル・ペプチドをコードする
領域及び目的とするペブチド類をコードする構造遺伝子
をこの順序で３′末端側に向って位置するように連結し
、３′末端側に翻訳終止コドンを設けることにより、本
発明で用いる組換えＤＮＡを作成することができる。第
４図に本発明の組換えＤＮＡの塩基配列の例を示した。

前記したＳＡＫ遺伝子を含むファージＤＮＡから得られ
る４，８ｋｂの口ｉｎｄ［［断片あるいＵ約１．４ｋｂ
のＡＣＣＩ／ＡｖａＩＩ断后ニは、ブＯｆーター、シャ
イン・ダルガ一ノ配列等の本発明で必要とするＤＮＡ配
列が意図する順序で含まれており、従ってこれらの断片
には本発明で用いる組換えＤＮＡが含有されており、こ
れらの断片をそのまま本発明の枯草菌あるいは大ｍ菌で
の発現用ベクターの構築に用いることができる。

本発明においては、目的とするペプチド類はＳＡＫ蛋白
との融合蛋白として発現せしめるのが好ましい。従って
、ＳＡＫ３ｍ１伝子中のシグナル・ペプチドをコードす
る領域及びその下流に位置するＳＡＫ４１１造遺伝子を
含むＤＮＡ断片を前記一の７７−ジＤＮＡから得、即ち
、例えば前記のｔ−｛　ｉ　ｎ　ｄ　ｌ　ｌｌｉ片又は
ＡｃｃＩ／ＡＶａＩＩ断片として得、このＤＮＡ断片中
のＳＡＫ構造遺伝子内に目的とするペプチド類をコード
する構造遺伝子を挿入するのが好ましい。かかる構造遺
伝子は、ＳＡＫ構造道伝子内のａ．ｌＪ限酵索部位であ
って、そこに挿入した時にペブチド類をコードする構造
遺伝子のアミノ酸１ｆｔ訳フレームが適合し且つ転写さ
れて得られるｍＲＮＡが安定に産生されるようなυ１限
酵函部位を選択し、この制限酵素部位に挿入するのが好
ましい。このようなｔｉｌｌ限酵素部位としては、例え
ばＥＣＯＲＩＩ部位、ＸｈＯ■部位、Ｘｍｎ１部位など
が好ましい。ＳＡＫ遺伝子中のＳＡＫ構造遺伝子内のこ
のような部位に目的とするペプチド類をコードする遺伝
子を挿入することにより、ペプチド類を融合蛋白として
発現する発現用ベクター構築用の組換えＤＮＡが作成さ
れる。

このような組換えＤＮＡを意図する枯草菌または大腸菌
内に導入するためには、枯草菌または大ｍ菌において自
己？Ｉ￥Ｊ可能なプラスミドベクターを用いる。枯草菌
用のプラスミドベクターとしては、例えばｐＵＢ１１０
［κｅｇｇｉｎｓ，κ，Ｈ．Ｌｏｖｅｔｔ　　Ｐ．Ｓ．
　＆　Ｄｕｖａｌｌ，　Ｅ．　Ｊ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｔ．　ＵＳＡ，　　７　５、
１４２３　（１９７８）］、ｐＣ１９４　［Ｂｙｅｏｎ
，　Ｈ．，　Ｊ．　８ａｃ．，　　１　５８、５４３−
５５０　（１９８４）］、ｐＥ１９４［１１ｏｒｉｎｏ
ｕｃｈｉ，　Ｓ．，　Ｈｏｔ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ
．，　　１　８　２、３４　１−３４８　（１　９８　
１　）　　；Ｉｌｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，　ＳＪ．　Ｂａ
ｃ．．１　５　０、８０４−８　１　４　（１　９８　
２）　］、Ｏ　Ｕ　Ｃ　１　９　［　Ｍｅｓｓｉｎｇ，
　Ｊ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｓｏｌｏＯＶ
，　　１　０１　、２０−７８　（１　９８３）　］な
どが挙げられる。大ｉ菌用のプラスミドベクターとしテ
ハ、例えば、ｐＢＲ３　２　２　［ＢｏｌｉｖａｒＦ．
　Ｇｅｎｅ，２、９５　（１９７７）］、ＤＵＣ８［Ｖ
ｉｅｒｉｒａ，　Ｊ．　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ，　Ｊ
．，　Ｇｅｎｅエユ、２５９　（１９８２）］　，ＤＫ
Ｋ２２３−３　［ｄｃＢｏｅｒ，　　Ｈ．　　Ａ．，　
　Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔｌ．　　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ
．　　ＵＳ＾．７旦、２１　（１９８３）］などが挙げ
られる。これらのプラスミドベクターに前記の組換えＤ
ＮＡが含有されるようにして、本発明の目的とするペプ
チド類を発現するための発現用ベクターが構築される。

発現用ベクターを枯草菌に導入する方法としては、枯草
菌が本来有するＤＮＡ取り込み能を利用するコンビテン
トセル法［Ｊ．　Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，　Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　４　４、１
０７２　（１９５８）Ｊ、あるいはリゾチーム処理によ
ってプロトプラストを１１７し、ポリエチレングリ］一
ル存在下にベクターを導入させる７ａトプラスト法［３
．Ｃｈａｎｇ，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｃｎｅｔ．，
　１　６　８、１１１（１９７９〉１などが採用される
。大腸菌内に発現用ベクターを導入する場合もこれらの
方法を同様に採用することができる。

かくして得られる形質転換体を適当な培地中で適当な培
養条件下で培養することにより、目的とするペプチド類
を発現せしめ、菌体外へペプチド類またはその融合蛋白
を分泌させることができる。

培養の際には発現誘導物質を添加してまたは発現が誘導
されるような条件下で培養することができる。菌体外へ
分泌されたペプチド類を回収することにより目的とする
ペプチド類を得ることができる．！１合蛋白として分泌
された場合には、得られる融合蛋白を臭化シアンで処理
することにより目的とするペプチド類を得ることができ
る。

以下に、ソマトメジンＣを融合蛋白として回収する本発
明の遺伝子工学的［ｉ法の１例の概略を示す。

ＳＡＫ３１伝子を含むＤＮＡＩｌｉ片を、黄色ブドウ球
菌のファージでありＳＡＫｉ伝子をその遺伝子中に持っ
ているＰφ２のＤＮＡより、先ずＨ　ｉ　ｎｄｆｆｌＤ
ＮＡ断片として取得し、ブラスミドｐＢＲ３２２のＤＮ
Ａにクローニングしたく第１Ａ図〉。この断片を更にＡ
ＣＣＩとＡｖａＩＩで切断しＳＡＫ遺伝子を含む約１，
４ｋｂの断片を得、クレナウ・フラグメントとデオキシ
リボヌクレオチド−３リン酸を加え、反応させる事によ
り平滑末端にした後、プラスミドｏｕｃｓのＤＮＡのＳ
ｍａ　Ｉ部位に挿入しブラスミドｏ（ＪＣＳＡＫ（第１
Ｂ図）を作製した。以上の組換えＤＮＡｌ＃！作は大腸
菌Ｃ６００を宿主として行った。

ｐＵＣＳＡＫを更にＢａｎ口■とＥＣＯＲＩで切断しＳ
ＡＫＩＩ伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を得、こ
れをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断した枯草菌のベクタ
ーＤＮＡであるブラスミドｐＵＢ１１０のＤＮＡと結合
させ、ブラスミドｐＬＩ８ｓＡＫを枯草菌を宿主として
作製したく第ＩＣ図）。ｐＵＢＳＡＫを持つ枯草菌形質
転換株はＳＡＫを培地中に産生じた。

ソマトメジンＣ（ＳＭＣ）遺伝子は既に知られている７
０ｇのアミノ酸からなるＳＭＣのアミノ酸配列をコード
する塩基配列を持つＤＮＡを、両端にＢａｍ口■切断部
位を持つようにリンカーボリヌクレオチドを、またＳＭ
Ｃをコードする塩基配列の下流に翻訳停止コドンを付加
した形で化学合威したものを使川したく第２図〉。これ
によりＳＭＣをコードするＤＮＡ断片をプラスミドρＤ
Ｒ７２０のＤＩ’ＪＡ　（ファルマシア社製）のＢａｍ
ｆ−１１Ｉ位に挿入できるようにした。このようにして
ＳＭＣをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＮｓ
Ｔを大腸菌を宿主として作製し、このＤＮＡを大＠調製
し、３ａｍ日■で切断した後ＳＡＫ−ＳＭＣの融合遺伝
子を作製するために使用した。

ＳＡＫ−ＳＭＣの融合遺伝子は以下のように作製した。

プラスミドｐＬＪＢＳＡＫのＤＮＡはＥＣＯＲＩ［によ
る切断を可能にするためＤＮＡメチル化酵素マイナスの
枯草菌株を宿主として用い調製した。プラスミドｐ　ｊ
Ｊ　Ｂ　Ｓ　Ａ　ＫのＤＮＡをＥ　ｃ　ｏ　Ｒ　Ｉｔに
より部分的に切断し３個ある切断部位のうち１個のみが
切断されたＤＮＡｌｌｉ片を分離しクレナウ・フラグメ
ントとデオキシリボヌクレオチド−３リン酸を加え、反
応させる事により、ＤＮＡ末端を平滑末端とした。一方
、プラスミド１）ＮＳＴのＤＮＡよりＢａｍ口■断片と
して得た、ＳＭＣをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ
断片も同様に、ＤＮＡ末端を平滑末端とした。これらの
両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させ発現
用ベクターｐＬＩＳ１６１を得、枯草菌に導入したく第
１Ｄ図〉。この時、ＳＡＫとＳＭＣのアミノ酸コーディ
ングフレームは同一フレーム内で接続しＳＡＫ−ＳＭＣ
融合蛋白質として翻訳される様に設計した。′Ｒ現用ベ
クターｐＬＩＳ１６１で形質転換された枯草菌は、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されており受託番号
として微工研菌寄第１０７４２弓（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１
０７４２）が付与されている。この形質転換された枯草
菌形質転換株が培地中に産生ずるＳＭＣ融合蛋白の凸を
ラジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）により縛定した。こう
して得られた、ＳＭＣｍ合蛋白を産生ずる枯草菌形質転
換株はＳＡＫ−ＳＭＯ融合遺伝子を含む組換えＤＮＡを
保持していた。この融合遺伝子のＷ基配列を第４図に示
した。また、この形質転換株の培地中、及び菌体中に産
生ずるＳＭＣ融合蛋白の量を測定したところ、ＳＭＣＩ
１合蛋白は殆ど培地中に分泌されている事が分かった。

大腸菌にてＳＭＣをＳＡＫとの融合蛋白として得る方法
の例は以下の通りである。

大腸菌での発現用ベクターとしてＯＫＫ２２３−３（第
ＩＥ図の０）を用いた。このプラスミドベクターは、ｔ
ａｃプロモーター及びリボゾームＲＮＡオベ０ンｒｒｎ
ｌ３の転写終止領域を持っている。

前記した枯草菌での発現用ベクターとしてＩ築したｐＵ
Ｓ１６１のＤＮＡを制限酵素ＳＳＤＩで開裂してＳｓｐ
Ｉｌｉ片を得た。この断片中には、ＳＡＫ遺伝子中のシ
ヤイン・ダルガーノ配列、シグナル・ペプチドをコード
する領域、Ｓ　Ａ　Ｋ　ｊＡ　造遺伝子及びＳＡＫｍ造
遺伝子中のＥｃｏＲＩＩ部位に挿入されたＳＭＣＭ造遺
伝子が含まれている。

このＳｓｐｌ断片をｐＫＫ２２３−３のＳｍａＩ部位に
挿入することによって、ＳＡＫ−ＳＭＣ融合蛋白の大！
ｌ！菌での発現用ベクターＤＫＳＯＯ２（第１Ｅ図の（
ｉ）〉を構築した。このベクターで大腸菌を形質転換し
、得られる形質転換体を培養タることによって、ＳＡＫ
−ＳＭＣ融合蛋白の殆どが菌体外に分Ｍ！Ｐされた。

（発明の効果） 以上に詳述した所から明らかなように、ＳＡＫ遺伝子中
に存在するシグナル・ペプチドをコードする領域を利用
して、目的とするペブチド類を枯草菌または大腸菌にて
発現することにより、目的とするペプチド類の大部分が
菌体外へ分泌産生される。

特に、ＳＡＫＩＩ伝子中のシグナル・ペプチドをコード
する領域を用いて、目的とするペプチド類、例えばＳＭ
ＣをＳＡＫ蛋白との融合蛋白として枯草菌にて発現させ
ることにより、融合蛋白を発現効率が高く発現させるこ
とができ、その大部分を菌体外へ分泌産土させることが
可能である。したがって、本発明の方法によって、ＳＶ
Ｃなどの有用なペプチド類を極めて効率良く大陸に生産
することが可能である。

（実施例） 以下に本発明を実施例により更に詳細に説明する。

実蒲例１ Ｐφ２を軟寒天法［Ｊ．　Ｅ．　Ｂｌａｉｒ，　Ｂｕｌ
ｌ．　Ｈｉｄ１１ｉｔｈ　Ｏｒｇ．，　　２　４、７７
１−７８４　（１９６１）；ａｖＡ学実習提要、ｐ５１
７、医和学研究所学友編］で増殖して得られたファージ
液１００−に対して５Ｍ−塩化ナトリウム水溶液を１０
ｍ加え、更に１０％（＊／Ｗ）ポリエチレングリコ〜ル
６０００、３０ＩＩ１を加えてよく混和し、Ｏ℃で数時
間放置後１０．ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心した。沈澱
を生理食塩水５ＩＲｌに懸濁して１０ｍＨのマグネシウ
ムイオン存在下で１０μｇ／ｄのＤＮａｓｅ■とＲＮａ
Ｓｅを加え、３７℃１時間処理してＭＩｌ１のＤＮＡと
ＲＮＡを分解した。次に１０．０００ｒｐｍ　、１　０
分間遠心し、その上消に塩化セシウムを加え２５．ＯＯ
ＯｒｐＩ、２０時間遠心し、ファ一ジ液を得た。これを
生理食塩水に透析し６００μｌのファージ液を得た。こ
れに０．５Ｍ−ＥＤＴＡ水溶液（１１１１８．０）をＲ
終濃度２０ｍＨ、プロテネースＫを５０μｇ／ＩＩ１、
２０％ＳＤＳを０．５％になる様に加え６５℃１時間処
理した後、フェノール、エーテル処理を行いＴＥ緩衝液
（１０ｌｌ＋Ｈ−トリス塩酸Ｍ衝液（ｐＨ７．５）　、
ｉｌｌＥＤＴＡ）に透析して、３８０μグのＰφ２（４
２ｋｂ）ＤＮＡを１ｑた。このＤＮＡは訓限酵素口ｉｎ
ｄＩｌ［による切断テ４．８ｋｌ）のＤＮＡ断片（第１
Ａ図の＠）が生じ、Ｐφ２について既に報告されている
事実と一致した［　ＴｈｅＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ
，　Ｚｂｌ．　Ｂａｋｔ．　Ｓｕｐｐｌ．，工Ａ１１１
−２９、Ｇｕｓｔａｖ　Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｖｅｒｌｕｇ
　：　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　　（　
１　９　８　５　）　］。

２．プラスミドＤ［３Ｒ３２２のＤＮＡの開裂２μグの
ｐ８Ｒ３２２に、５単位のＨｉｎｄｌ［［、２μＪ（７
）１　０Ｘ！１［Ｉ　（１　０ｒＡＨ−トＩ）ス塩ａｌ
２衝液（ｐＨ７．５）、１０１Ｍ−塩化マグネシウム、
１一一ジチオスレイトール、５０ｓＨ−塩化ナトリウム
水溶液）を加え、３７℃で２時間反応させフェノール、
エーテル処理を行い、減圧乾燥したＤＮＡを２０μｌの
ＴＥ（１０ｍＨ−トリス塩酸緩衝液（１１７．５）　、
１ｉＨ−ＥＤＴＡ）に溶解した。

３．ＤＮＡ断　の結Ａ反応 上記２のＤＮＡｆｆｉ液２．５μｌにＰφ２ＤＮＡを｝
ｌｉｎｄｌｌで消化して得られた４．８ｋｄＤＮ八断片
溶液５μｌ、１０×ライグーションＭＩｌｉ液１μｌ１
及びＴ４ＤＮＡリガーゼ２単伶を加えてよく混和し、１
５℃で一晩反応させた。

常法ＥＴ．　Ｈａｎｉａｔｉｓ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ，＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ，　２　５　０　−　２　５　１　　（　１　９　
８　２　）　　］により作製した大腸菌Ｃ６００のコン
ビテント細胞、０．１７ｍに、上記３の組換えＤＮＡを
６μ！混合して氷水浴中３０分間静置した後、４２℃で
２分間インキユベートした。次にこれに１１７！のしプ
ａスを加え、３７℃１詩間静置した後、３，０００ｒｐ
ｍ５分間室温で遠心し、上清０．９−を捨て、残りを良
く混和し、各０．　１ｊＩ１！をアンビシリンーフイブ
リン寒天平板にまいて３７℃、１晩培養してアンビシリ
ン耐性、ＳＡＫ産生（＋）の形質転換株を得た。得られ
た形質転換株についてアルカリ法によりＤＮＡを抽出し
、Ｈｉ　ｎｄＩＩＩで切断して０．８％アガＯ−スゲル
電気泳動により４．８ｋｂの口ｉｎｄＩＩＩｆｒ片が組
み込まれている事を確認した。このＤＮＡ断片を含有す
るブラスミドをｌ）ＳＡＫ１４８と命名したく第１Ａ図
の０〉。

この形質転換株からの組換えＤＮＡの大縫調製は、エチ
ジウムブロマイド／塩化セシウム超遠心法による常法に
従った。

上記４でｖＡ￥ＪしたブラスミドｐｓＡＫ１４８のＤＮ
Ａ１　７１１９を口ｉｎｄ［［で切断して、４．８ｋｂ
ＨｉｎｄｌｌｌＤＮＡ断片を電気泳動により分離し、常
法により溶出・調製した。このＤＮＡ断片に制限醇索Δ
ｃｃＩ１０単位、ＡＶａｌ［１０単位、１／１０用量の
１０×緩ｉＩ液を加え、良く混和し、３７℃で３時間反
応させ、０．８％アガ０−スゲル電気泳動を行い、エチ
ジウムブロマイドでＤＮＡを染色して目的とする約１，
４ｋｂのＡｃｃＩ／ＡｖａＴＩＤＮＡ断片のみを切り出
し、細切して試験管に入れ、−７０℃１０分間置き氷結
させ、次いで３７℃１０分間置き溶解する。この操作を
２回行った後、１　５．　ＯＯＯｒｐｌ　１　０分間遠
心して上滑をフェノール、エーテル処理をしエタノール
沈澱を行い、減圧乾燥して約１．４ｋｂの精製Ａｃｃ工
／ＡｖａＴＩＤＮＡ断片を得た。

６．ρＬＩ８ＳＡＫの作成 １）プラスミドｐＵｃ８のＤＮＡのＦｄ裂上記２と同様
に１μタのｐｕｃｓのＤＮＡに５単位のＳｍａ■を加え
て開裂させ、結合反応用ブラスミドとした。

２》　約１．４ｋｂＡｃｃＩ／ＡｖａｌｒＤＮＡ断片の
平滑化 上記５で得られた約１．４ｋｂの粘！ｊＡｃｃＩ／ＡＶ
ａｍＤＮＡ断片の両末端をクレナウ・フラグメントとデ
オキシリボヌクレオチド−３リン酸によって平滑化した
。

３》　結合反応 １），２）で得られた開裂したＤＮＡと平滑化ＡｃｃＩ
／ＡｖａｌＩＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て結合し、Ｉ）ＵＣ８ＤＮＡの３ｍａ：［部位に挿入し
た。得られたブラスミドをＤＬＩＣＳＡＫとした（第Ｉ
Ｂ図のＯ）。

４）ＳＡＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片の分離ｐＬＪｃｓＡ
ＫＤＮＡをＢａｍ｝ＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染
色して目的のＳＡＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片のみを切り
出し、上記５と同様に処理して約１．４ｋｂの粘’ＮＤ
ＮＡ断片を得た。

５》　ブラスミドｐＵＢｓＡＫの構築 枯草菌用のプラスミドＤＬＩＢＩＩＯのＤＮＡを３ａｍ
ＨＩ及びＥＣＯＲＩで切断し、約０．８ｋｂの断片を除
き、この部位にＳＡＫ遺伝子を含む上記ＤＮＡ断片（約
１，４ｋｂ）を挿入した組換えＤＮＡを有するブラスミ
ドを枯草菌マーバーグ１６８を宿主として用いて作製し
、ｐＵＢＳＡＫとした（第１Ｃ図０〉。組換えＤＮＡに
よる枯草菌の形質転換は以下の様にした。一晩培養した
宿主菌液０．２５ａｄ！をアンチバイオテイツクメデイ
ウム３《デイフコ社製）５−に接種しＬ字管で、３７℃
３時間振とうし、７．００Ｏｒｐｍ４℃１０分間遠心し
て得られた菌休を５１！ｉ！のりゾチーム［１０ＲＥ／
ＳＭＭＰ　（安藤忠彦、遺伝子工学、１６８−２１５、
微生物学基礎講座８）］に懸濁し、３７℃で５０分間ゆ
っくり振とうしプロトブラストを作製した。顕微鏡下で
９０％のプロトプラスト化を確認し、３，ＯＯＯｒｐｍ
　４℃２０分遠心し５一のＳＭＭＰで洗い、遠心して３
ＩｄのＳＭＭＰに懸濁した。あらかじめ導入に用いるＤ
ＮＡに等吊の２ＸＳＭＭＰを加えて良く混和しておき、
これに上記のプロトブラスト懸濁液０．５７を加え混和
し、１．５ｄの４０％ポリエチレングリコール６０００
を加えたボルテツクスで激しく混和した。

これに５１ｄのＳＭＭＰを加えて混和し、３．００Ｏｒ
ｐｍ１０分間遠心して沈渣に１１ｄのＳＭＭＰを加えた
。これをＬ字管に移して３０℃３時間ゆっくり振とうし
、プロトブラストにＤＮＡを取り込ませた。この溶液０
．１ｍｌ！ずつをＤＨ３プレート【安藤忠彦、遺伝子工
学、１６８−２１５、微生物学基礎講座８］上に置き、
３ｅのＤ　Ｉ−１３軟寒天溶液を加えて良く混和し、固
まった後に３７℃３日間培養して８４個のカナマイシン
耐性形質転換株を得た。これらの枯草菌形質転換株につ
いて力ゼイン平板［Ｄｅｔｌｅｒ　Ｂｅｈｎｋｅ，Ｍｏ
ｌ．　Ｇｃｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，２１０、５２８−５３
４　（１　９８７）］によりＳＡＫ産生を検討したとこ
ろＳＡＫ　（＋）は８／８４で７６株はＳＡＫ　（−）
であった。ＳＡＫ（＋）形質転換株のＤＮＡを制限酵素
を用いて解析し意図した組換えＤＮＡを持っていること
を確認した。この形質転換株からのブラスミドｐＵＢｓ
ＡＫのＤＮＡの大量５Ｉ製は以下の７の方法に従った。

７．プラスミドｐ　Ｌ）　８　Ｓ　Ａ　ＫのＤＮＡの　
量暫 ｐＵＢＳＡＫ枯草菌形質転換株の一晩培養液５０Ｉｄを
１１のしブロスに接種して、３７℃、４時間振とう培養
し、ＯＤ６６ｏ−０．４〜０．５で遠心、集菌した。Ｔ
ＥＮ！！ｌ衝液（５０１−トリス塩Ｓａ衝液（１１１１
８　．　０　）　、１　０　０ｍｌ４−塩化ナトリウム
水溶液、５ｍＮ−ナトリウムＥＤＴＡ水溶液）で２回室
温で洗浄し、４５Ｍ１になる様にＴＮＳ緩衝液（５０憎
Ｈ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．　０＞　、１ＱＯＩＩ
Ｈ−塩化ナトリウム水溶液、２５％（ｗ／ｖ）蔗糖溶液
）に懸濁した。１５ａｅＸａ本に分け、リゾチーム溶液
（２０ｊ１９／ｄＴＮｓ）０．４ｙｄを加え、３７℃２
０分間穏やかに振とうした．３．６一の５Ｍ−塩化ナト
リウム水溶液を室温にて加え、更に０．９−の０．５Ｍ
ナトリウムＥＯ丁八水溶液（５０＋ｇＨ−ｔ−リスｊｌ
３ａｌ！ｌ衝液（ｐＨ８．　０）　、５ＱｍＨ−ナトリ
ウムＥＤＴＡ水溶液）等の通常のプラスミド単離に用い
られる試薬を加えて順次処理した［８．　Ｎｉａｖｄｅ
ｔ，　Ｐｌａｓｌｉｄ，　　２、４８（１９７９　〉　
；　丁．　　ＩＮＡＮＡκＡ，　　Ｂｉｏｉｎｄｕｓｔ
ｒｙ，４．、　１　　７−２９（１９８７）］。かくし
て得られる溶液に塩化セシウムとエチジウムブロマイド
を添加してから５０．ＯＯＯｒｐｍで２０時間超遠心に
かけた後、ＤＮＡ溶液を取り、ｎ−ブタノールでエチジ
ウムブロマイドを除去し、ＤＮＡ溶液をＴＥ（１０ｍＨ
ートリスｍ酸緩衝液（１１１１７　．　５　）　、１　
ｍＨ−ＥＤＴＡ）で透析することによりｖｉ製ブラスミ
ドｐＵＢＳＡＫのＤＮＡを得た。

した。この直鎖ＤＮＡを上記６−２》の方法により末端
を平滑化した。

−−−−ＡＡＡＣＣＴＧＧ　　　　−−−−ＡＡＣＣＣ
ＴＧＧ−−−−ＴＴＴＧＧＡＣＣ　　　　−−−−ＴＴ
ＧＧＧＡＣＣｖ１限ＷＩ素ＥＣＯＲＩ［の切断部位Ｇ．
ｔｄｃｍ（デオキシシチジンメチラーゼ）によりメチル
化されていると切断されないため、メチル化能を欠損し
た枯草菌にｐＵＢｓＡＫ−ＤＮＡを上記６−５）の方法
により導入して得られた形質転換株より、該組換えＤＮ
Ａを上記７の方法により調製した。このＤＮＡはＥＣＯ
ＲＩ［により、ＳＡＫｉｌ伝子中２Ｂ所あるＥＣＯＲＩ
Ｉ部位で切断され、２１６ｂｐのＤＮＡ断片が生じる事
をｉｖ認した。調製したＤＮＡ、２μ９に対し２０単位
のＥＣＯＲＩ［を加え、！ｌ衝液（５０ｌＨ一トリスｍ
酸緩衝液（１）Ｈ８．　Ｏ）　，　５１ｍＭ−塩化マグ
ネシウム、ＩＩＮ−ジチオスレイトール）、２０μｌ中
で３７℃にて１時間反応させることによりＥｃｏＲｌで
部分切断し、アガＯ−ス電気泳動で直鎖のＤＮＡを精製
ＳＭＣ遺伝子を含むブラスミドＤＮＡの調製は、ＤＮＡ
合成機により合成されたＳＭＧをコードリーるＤＮＡ　
（第２図）を含むブラスミドｐＮｓＴ〈第ＩＤ図の（ｅ
〉〉を保持する大腸菌形質転換株より、エチジウムブロ
マイド／塩化セシウムの超遠心法の常法によって行った
。このＤＮＡ、４０ｕ９に対し８０単位のＢａｍ口エ、
１／１０ｆｊの１０Ｘ緩衝液を加え、３７℃にて反応さ
せ、ＳＭＣをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を生
ぜしめ、このｉｌｌＤＮＡを上記６−２）の方法により
末端を平滑化し２　４　８　ｂｐのＤＮＡＩｇｉ片を得
た。

ＧＡＴＣＣＧＴ・・・・・ＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＣＡ
・・・・・ＴＣＣＴＡＧ２　４　８　ｂｐの平滑化ＤＮ
Ａ断片の両平滑化末端上記のブラスミドｐＮＳＴは、第
２図に示した５′末端にリンカーを有するＳＭＧ構造遺
伝子をＤＮＡ合成機により合成し、この合成ＤＮＡをプ
ラスミドＯ　Ｄ　Ｒ　７　２　０　［　Ｒｕｓｓｅｌｌ
，　Ｄ．　Ｒ．　ａｎｄＢｅｎｎｅｔ，　Ｇ．　Ｎ．，
　Ｇｅｎｅ，　２　０、２３１　（１９８２）］の３ａ
ｍ口１部位へ挿入して構築した。

１）　　ＩＩ換えＤＮＡの枯草菌への導入上記８、及び
９で得た２つの平滑化末端ＤＮＡ断片を混合し、Ｅ記３
と同様の方法によって結合し、上記６−５）の方法によ
って枯草菌ＭＢ１６８株に導入し、カナマイシン耐性形
質転換株を得た。

これらの形質転換株についてカビイン平板によりＳＡＫ
産生を検討したところ得られた形質転換体８４株中ＳＡ
Ｋ　（＋）株は８株で７６株はＳＡＫ（一）であった。

又、これらの形質転換株のＳＭＣ産生量は上記１０−　
２）に示す方法で測定した。

２）ＳＭＣＩＩ度の測定 ＳＭＣの測定にはＲＩＡアツセイキットである、ソマト
メジンＣ“栄研キット″　（旧ｃｈａｔｓＩｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ　ＤｉａＱｎＯＳｔｉＣＳ，　Ｃａｌ．，Ｕ．　
ｓ．＾．〉を使用し、同時に作製した標準曲線から、培
養土清中、及び菌休中のＳＭＣの濃度（ミリ単位／ｄ）
を求め、更にＳＭＣＩ■＝４，０００単位としてＪ！！
！具してＳＭＣ蛋白を含む融合蛋白の産生重量を算出し
た。

３）形質転換株のＳＭＣ産生酷の測定 ２ＸＬプロス（１１当り、バクトトリプトン２０ｇ、イ
ーストエキストラクト１０ｇ、塩化ナトリウム１（ｌ含
有）１０ｄにカナマイシン５μク／ＩＩＩｌ１グルコー
ス１％、消泡剤１０μｌを加え、し字管に入れ、前記の
形質転換株８４株の前培養液０．５−を各々接種して１
６時間振とう培養し、得られた上清について上記１０−
　２）の方法に従いＲＩＡアツセイを行ったところ、Ｓ
ＡＫ　（十）の株は全＜ＳＭＣ蛋白を含む融合蛋白を産
土していなかった。又、ＳＡＫ　（−）の株では０．０
５１Ｐｇ〜５．２■のＳＭＣ蛋白を含む融合蛋白を産生
じていた。これら形質転換株のＤＮＡを上記７の方法に
より精製し、制限酵素で切断して制限酵素地図を作製し
たところ、ＳＡＫ遺伝子中、２箇所あるＥＣＯＲＩＩの
うち、５′上流側にあるＥＣＯＲＩＩ部位にＳＭＣ遺伝
子が挿入された組換えＤＮＡを含むプラスミドｐｔＪｓ
１６１’　　（第１Ｄ図の（ｇ）〉と、２つのＥＣＯＲ
Ｉ［の間が除去されこの間にＳＭＧ遺伝子が挿入された
組換えＤＮＡを含むプラスミドｐＬＪｓ１６１（第１Ｄ
図の（ｆ）　）　、の２種類が得られ、ＤＬＩＳ　１　
６　１を保持する形質転換株の方がｐｌＪｓ１６１’を
保持する形質転換株よりもＳＭＧ蛋白を含む融合蛋白の
産生ほが高かった。この理由としてｐＬＩｓ１６１’は
ＳＭＣ３１１伝子から３′側の非翻訳部分が長くなって
おり、そのためにＲＮＡが不安定となり産生斑が徂くな
ったことが考えられる。これらの中で最も高いＳＭＣ蛋
白を含む融合蛋白の産生はを示したｐｔＪｓ１６１を保
持する形質転換株ｐＵＳ　１６１／マーバーグ株につい
て、培養後４．６．８，２０，２４．４０時間目のＳＭ
Ｃ蛋白を含む融合蛋白の産゛生徴を測定したところ、１
６時間目が最も高＜５．２２Ｉ／Ｊ！のＳＭＣ蛋白を含
む融合蛋白の産生塑を示した。又、超音波により菌体を
破砕（破砕率＝８０〜８５％）して菌体内のＳＭＣ蛋白
を含む融合蛋白の黴を測定した所、菌体内には微潰しか
なく、ほとんど１００％のＳＡＫ−ＳＭＣ融合蛋白が菌
体外に分泌されていることが、明かとなった。

ｐＵＳ１６１を保持する形質転換株ｐＵＳ１６１／マー
バーグ株を工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し、
受託番号として微工研菌寄第１０７４２号（ＦＥＲＭ　
　Ｐ−１０７４２）が付与ざれた。

４）ＳＡＫ−ＳＭＧ融合蛋白質の調製と臭化シアンによ
る分解、及びＳＭＣの精製 ＳＡＫ−ＳＭＧ融合蛋白質を分泌生産する形質転換株ｐ
ＬＪｓ１６１／マーバーグ１６８を２ＸＬブロス培地で
１６時間培養した１８！ｌ上清を濃縮後、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行
い、ＣＢＢ染色により分子量１３ＫのＳＡＫ−ＳＭＣｆ
ｉ合蛋白質を同定した。この試料をセフアクリル３３０
０カラムクａマトグラフイーにより精製し、凍結乾燥を
行った。この試料１００ａｙを６０％ぎ酸１６ｄ＆−溶
解し、臭化シアン１６■を加え、混合物を撹拌しながら
２５℃以下で３時間反応させた。次に蒸留水１００ｊＥ
ｌ！を加えた後、ぎ酸及び臭化シアンを凍結乾燥により
除去した。これをカチオン交換樹脂ＣＭ２５のカラムに
より８Ｍ！！素／５０ｍＨ２−メルカブトエタノールで
０．０１Ｍから０．２ＭＩ１度勾配の酢酸アンモニウム
（ｐｌ＋４．６）で溶出し、更にＨＰＬＣ逆相クロマト
グラフイーにより還元型ＳＭＣをＶ４Ｍした。これを通
常のりフォールデイング法により酸化型ＳＭＣに転化し
た。ＳＯＳ−ＰＡＧＥ及びアミノ酸分析により上記によ
って得られたものがＳＭＧ蛋白質である事を同定した。

実施例２ 菌でのＳＭＣ融Ａ　　の　泌生 １．７ラスミドｐＫＫ２２３−３のＳｍａ工による切断 ブラスミドｐＫＫ２２３−３　（５０（ｌｇ／ｄ）４１
１１に、ｉ　ＯＸ！ｌ衝液（２０＋ｇＨ一塩化カリウム
、ｉＱＩＮ−トリス塩ｉｔ！ｌｍ液（＋）８８．　０）
　、１　０ｎＨ一塩化マグネシウム、１　ａＭ−ジチオ
スレイトール）を１μｉｕｌ限醇素ＳｍａＩ　（６ＬＪ
／μ１）１μｌを加え３７℃、２時間反応させ、完全に
明断されたことをアガロース電気泳動により確認した。

ついでフェノール、エーテル処理し、減辻乾燥して得た
ＤＮＡを１０μ尤のＴＥに溶解した。

２．１ラスミドｐＵｓ１６１よりＳＡＫ−ＳＭＣｒｌ１
合遺伝子を含むＳＳＩ）ＩＤＮＡ断片のＥｌ製 ブラスミドｐＬＪＳ１６１　（１００μｇ／ｄ）３０μ
ｌに、１０×緩衝液（１００ｍＮ−塩化ナトリウム、１
０ｍ｝ｌ−｝−リス塩酸ｍｔ液（ｐｌ１７．５＞、１Ｑ
ｓＨ−マグネシウム、１０ｎ＋Ｈ−２メルカブトエタノ
ール）を５μｌ１υ１限酵素ＳｓｐＩ　（３Ｕ／μ１）
２．５μｌを加え３７℃、１６時間反応させ、完全に切
断されたことを７ガロースグル電気泳動により確認した
。これよりＳＡＫ−ＳＭＣ融合遺伝子を含むＳＳｐＩＤ
ＮＡ断片を調製用アガ口−スゲル電気泳動により精製し
、フェノール、エーテル処理を行い、減圧乾燥して得た
ＤＮＡを８μｌのＴＥに溶解した。

３．ＤＮＡ断片の結合と大ｍｔｚへの導入上記１．２の
ＤＮＡ溶液を２μｌずつと１０×ライゲーション緩衝液
１μｌ、及びＴ４リガーゼ２単位を加えてよく混和し、
１５℃で一晩放置した。Ｌブロス培地で３７℃、一晩振
盪培養した大膓菌ＪＭ１　０９培養液０．２ｍを１０−
のしブａス培地に植え、２．５時Ｆ＋培養し、遠心によ
り集菌し、氷冷した１０１１Ｈ−トリス！！街液（１）
１１８　．　０　）　，　５　０ｎＨ一塩化カルシウム
溶液で洗浄し、１ＩＩｌの同溶液に懸濁して氷中３０分
置いてＤＮＡ受容菌とし、上記、結合反応させたＤＮＡ
溶液を加え氷中３０分間置いた後Ｌブ０ス、１ｍを加え
３７℃、１時間放置後０．１ｄを（アンビシリン）５０
η／ｄを含有するし寒天培地に播種し３７℃一晩インキ
ユベーションし、生育してきたコロニーを培養しブラス
ミドＤＮＡを調製した。

４．形質転換株のプラス．ミドＤＮＡの解析上記３で得
られた大Ｉｌｌ菌形質転換株をＬブロスで３７℃一晩培
養し集菌した後アルカリ法でＤＮＡを抽出し、制限Ｍ素
切断地図を作威し、第１Ｅ図の（＋）にしめずプラスミ
ドｐＫＳＯＯ２を得た。

５．７ラスミドＩ）ＫＳＯＯ２を保持した大ｉ！菌のＳ
ＭＣ−ＳＡＫＭ合蛋白質の分泌生産大Ｉ！菌宿主として
ＪＭ１０９、及び０６００８Ｓ株を用い、上記４で作或
したブラスミドｐＫＳ００２ＤＮＡを上記３の方法で宿
主菌に導入し形質転換株を得た。これら形質転換株を、
ｔａｃプロモーターのインデューサーであるＩＰＴＧ（
イソプロビルチオガラクトシド、ｌｍＨ）を加えたしブ
ロス培地で３７℃一晩＠養しその培養上清中のＳＭＧ濃
度を実施例１０−２の方法により測定した。その結果、
表１に示すように、３．５ＭＩ／１（７）ＳＭＣを含む
ＳＡＫ−ＳＭＣａ！ＩＪ白質産生量が得られた。又、培
養した菌を遠心により集め超音波処理を行い、破砕した
国体の遠心上澄中のＳＭＣｌｆｆを測定することにより
菌体内産生慰を測定したところ、産生したＳＡＫ−ＳＭ
Ｃ蛋白は殆ど全て菌体外に分泌した。

表１　人膓菌形質転換株のＳＭＣ産生１！ｉ（ＩＩＩ／
１）チドをコードするｆ！４域及びＳＡＫ構造遺伝子を
含むＳＡＫ遺伝子の塩基配列を示す。

第４Ａ図及び第４Ｂ図は、ＳＡＫ−ＳＭＣ融合遺伝子の
塩基配列を示す。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）枯草菌もしくは大腸菌において作動し得るプロモ
   ーター、該プロモーターの下流に位置する枯草菌もしく
   は大腸菌において作動し得るシヤイン・ダルガーノ配列
   、該配列の下流に位置する黄色ブドウ球菌由来のスタフ
   イロキナーゼ遺伝子中のシグナル・ペプチドをコードす
   る領域、及び該領域の下流に位置するペプチド類をコー
   ドする構造遺伝子を含む組換えＤＮＡを有する発現用ベ
   クターを構築し： 該発現用ベクターを用いて枯草菌もしくは大腸菌を形質
   転換し：次いで 得られる形質転換体を培養して菌体外に分泌されるペプ
   チド類を回収する： ことを特徴とするペプチド類の遺伝子工学的製造法。
2. （２）枯草菌において作動し得るプロモーター及びシヤ
   イン・ダルガーノ配列を用いて発現用ベクターを構築し
   、該発現用ベクターで枯草菌を形質転換し、次いで得ら
   れる形質転換体を培養して菌体外に分泌されるペプチド
   類を得る請求項１記載のペプチド類の遺伝子工学的製造
   法。
3. （３）黄色ブドウ球菌由来のスタフイロキナーゼ遺伝子
   中のシグナル・ペプチドをコードする領域及びその下流
   に連結したスタフイロキナーゼ構造遺伝子を用い、該ス
   タフイロキナーゼ構造遺伝子内の制限酵素部位にペプチ
   ド類をコードする構造遺伝子を挿入して、発現用ベクタ
   ーを構築し、ペプチド類をスタフイロキナーゼとの融合
   蛋白として発現せしめる、請求項１又は２記載のペプチ
   ド類の遺伝子工学的製造法。
4. （４）スタフイロキナーゼ構造遺伝子内の ＥｃｏＲII部位、ＸｈｏII部位又はＸｍｎ I 部位に、
   ペプチド類をコードする構造遺伝子を挿入する請求項３
   記載のポリペプチド類の遺伝子工学的製造法。
5. （５）ペプチド類がソマトメジンＣである請求項１〜４
   のいずれか１項記載のペプチド類の遺伝子工学的製造法
   。
6. （６）発現用ベクターがプラスミドベクターｐＵＳ１６
   １である請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド
   類の遺伝子工学的製造法。