KR0171161B1 - 인체 칼시토닌 전구체의 분비 생산용 발현벡터 및 이를 이용한 인체 칼시토닌 전구체의 제조방법 - Google Patents

인체 칼시토닌 전구체의 분비 생산용 발현벡터 및 이를 이용한 인체 칼시토닌 전구체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인체 칼시토닌 전구체(hCT-Gly)의 생간 및 분비를 위한 발현벡터 및 이를 이용한 hCT-Gly의 제조방법에 관한 것으로, ppL 또는 이누리나제 분비 시그날 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 hCT-Gly 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 효모를 배양하는 방법에 의하면 hCT-Gly를 높은 효율로 분비시킬 수 있다.

Description

인체 칼시토닌 전구체의 분비 생산용 발현벡터 및 이를 이용한 인체 칼시토닌 전구체의 제조방법
제1도는 플라스미드 pYHCAL1의 제작과정을 나타낸 것이고,
제2도는 플라스미드 pYHCAL2의 제작과정을 나타낸 것이고,
제3도는 본 발명의 형질전환된 효모세포의 세포질 단백질과 배양액 단백질의 우레아 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동 분석 결과를 나타낸 것이고,
제4도는 본 발명의 형질전환된 효모세포의 세포질 단백질과 배양액 단백질의 웨스턴 블롯팅 분석(Western blotting analysis) 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 효모로부터 인체 칼시토닌 전구체(이하, 'hCT-Gly'로 약칭함)를 생산 및 분비시키기 위한 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, ppL 또는 이누리나제 분비 시그날 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 hCT-Gly 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 벡터로 형질전환된 효모 및 상기 효모를 배양하여 hCT-Gly를 생산 및 분비시키는 방법에 관한 것이다.
칼시토닌은 체내 칼슘 대사를 조절하는 펩타이드 호르몬으로서 C세포로 불리우는 체내 분비 세포로부터 분비된다. 칼시토닌은 뼈로 부터 칼슘이 소실되는 것을 억제하고, 신장으로부터 배출되는 칼슘을 재흡수하는 기능을 가지고 있으며, 사람, 돼지, 소, 양, 래트(rat), 연어, 뱀장어, 닭 등 8종류의 동물로부터 11종류의 칼시토닌이 분리정제되어 1차 구조가 결정되어 있다(연어에는 3종류, 뱀장어에는 2종류의 칼시토닌이 존재한다)(일본, BIO INDUSTRY., 3, 3(1993)). 이들 칼시토닌은 모두 32개의 아미노산으로 이루어진 단쇄의 폴리펩티드로서, N-말단과 7번째의 시스테인(cystein)이 이황하 결합으로 연결된 환상구조이며, C-말단은 글루카곤이나 세크레틴의 C-말단과 같이 산 아미드(프롤린 아미드)로 되어 있다.
한편, 재조합 단백질을 대량 생산하기 위한 숙주세포로서 주로 사용되는 대장균이나 효모는 알파-아미드화(α-amidating) 효소를 갖고 있지 않으므로 유전자 재조합 미생물을 이용하여 C-말단이 아미드화되어 있는 성숙 칼시토닌을 직접 생산하는 것을 불가능하다.
따라서, 타지마 등은 C-말단에 글리신(glycine)이 결합된 상태의 인체 칼시토닌 전구체를 재조합 대장균에서 생산한 다음 알파-아미드화효소를 이용하여 성숙 칼시토닌으로 전환시킨 바 있으나(Tajim et al., J. Ferment. Bioeng., 72, 362(1991)), 이 방법은 발현된 인체 칼시토닌 전구체가 대장균내에 축적되므로 분리정제 공정이 어려운 단점이 있다.
한편, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 현재 숙주-벡터(host-vector)계가 가장 잘 확립되어 있는 효모이고, 생리학적 및 분자생물학적으로 많은 연구가 진행되어 있으며, 인체에 병원성이 없고(non-pathogenic) 내독소를 생산하지 않는, 미국 식품의약국(FDA)에 의해 안전한 것으로 승인된(generally recognized as safe, GRAS) 미생물이다. 따라서 유전자 재조합 기술을 이용한 이종 단백질 생산용 숙주세포로서 그 중요성이 커지고 있으며, 효모용 분비 시그날을 사용할 경우 발현된 이종 단백질을 균체외로 분비시킬 수 있으므로 분리정제 비용을 절감할 수 있다는 장점이 있다.
효모로부터 이종 단백질을 분비시키기 위해 현재 사용되고 있는 분비 시그날 서열로는 인버타제 시그날 서염, 산 포스파타제 시그날 서열, 교배인자 α의 프리프로리더 서열(preproleader sequence: 이하 ppL로 약함: 미합중국 특허 제4,588,684호)등이 있고, 이중 ppL이 가장 보편적으로 사용되고 있다. 또한, 클루이베로마이세스 마르시아누스의 이누리아제(Laloux et al., FEBS Lett. 289, 64(1991))의 분비 시그날 서열도 역시 효모로부터 이종 단백질을 분비시키기 위한 목적으로 사용되고 있다.
이에, 본 발명자들은 효모로부터 hCT-Gly를 생산, 분비시키는 방법을 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, 효모의 분비 시그날 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 hCT-Gly 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후, 상기 벡터로 형질전환된 효모를 배양하여 높은 효율로 hCT-Gly를 생산, 분비시킴으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 효모로부터 높은 효율로 hCT-Gly를 생산 및 분비시킬 수 있는 발현 분비벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현 분비벡터로 형질전환된 재조합 효모를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 효모를 배양하여 hCT-Gly를 생산 및 분부시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 효모의 교배인자 α의 프리프로리더 서열(ppL) 또는 이누리나제 분비 시그날 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 인체 칼시토닌 전구체 유전자를 포함하는 발현벡터가 제공된다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 발현 벡터로 형질전환된 재조합 효모세포가 제공된다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 재 조합 표모세포를 배양하고, 배양 배지로부터 hCT-Gly를 회수함을 포함하는, 효모세포에서 hCT-Gly를 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
효모로부터 hCT-Gly를 생산 및 분비시키기 위해 사용되는 본 발명의 발현벡터는 효모의 분비 시그날 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드; 상기 분비 시그날-코딩 서열의 상류에 위치한, 효모에서 전사를 촉진할 수 있는 DNA 서열; 상기 분비 시그날-코딩 서열의 하류에 위치하며 이와 함께 오픈 리딩 프레임이 되도록 삽입된 hCT-Gly 유전자; 및 hCT-Gly 유전자의 하류에 있는 전사 종결서열을 포함한다.
효모의 분비 시그날 서열로서는 ppL, 이누리아제 INU1, 인버타제 시그날 서열, 산 포스파타제 시그날 서열 등을 사용할 수 있고, ppL 및 INU1을 사용하는 것이 바람직하며, ppL을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
이러한 벡터의 예로는 ppL과 hCT-Gly 유전자를 플라스미드 YEGα-HIR525(KCTC 8518P)내에 삽입하여 제작된 플라스미드 pYHCAL1(KCTC 0169BP), 및 INU1과 hCT-Gly 유전자를 플라스미드 YEGα-HIR525 내에 삽입하여 제작된 플라스미드 pYHCAL2(KCTC0170BP) 등이 포함된다. 상기 벡터들 외에도 사용된 프로모터 및 전사종결서열의 종류에 따라 다양한 재조합 발현벡터가 존재할 수 있다.
상기 재조합 발현벡터를 이용하여 통상의 방법, 예를 들어, 문헌(Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, ed, F. Sherman, G. R. Fink, and J. B. Hicks, Cold Spring Harbor Laboratory,(1986)에 기술된 방법에 따라 효모세포를 형질전환시킬 수 있다. 숙주세포로서는 사카로마이세스속(Saccharomyces), 시조사카로마이세스속(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스속(kluyveromyces), 한세눌라속(Hansenula), 야로위아속(Yarrowia) 및 피치아속(Pichia)에 속하는 다양한 효모세포들을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애를 사용할 수 있다. 특히 사카로마이세스 세레비지애SEY2102(MAT α, ura3-5, leu2-3, -112, his4-519; Carlson Botstein, Cell, 28, 145(1982))를 사용하는 것이 가장 바람직하다.
형질전환된 효모세포를 숙주세포 및 사용된 발현 시스템에 따라 선택된, hCT-Gly 단백질의 생산에 적당한 배지상에서 적당한 조건하에 배양하고, 배양배지로 분비된 단백질을 정제함으로써 효모로부터 hCT-Gly를 생산할 수 있다.
hCT-Gly의 생산 및 분비 여부는 SDS-폴리아크릴아미드 젤전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 확인할 수 있다. 즉, 단백질 발현이 유도된 형질전환된 효모의 배양액 단백질 분획에서는 hCT-Gly가 발견되고, 균체 단백질 분획에는 hCT-Gly가 발견되지 않는 결과로부터, 생산된 hCT-Gly가 모두 균체외로 분비되었음을 확인할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 발명의 범위를 이들만으로 제한하는 것은 아니다.
[실시예 1]
ppL을 이용한 효모용 hCT-Gly 발현 분비벡터의 제작
[단계 1]
hCT-Gly을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해, 하기 서열을 갖는 6개의 올리고뉴클레오티드 C1, C2, C3, A1, A2 및 A3를 DNA 합성기(Applied Biosystems사(미국), Model 391)로 합성하였다:
상기 올리고뉴클레오티드 C1, C2, C3, A1, A2 및 A3 각각 1㎕(100pmoles)를 혼합하여 폴리뉴클레오티드 인산화 효소(T4 polynucleotide kinase, 베링거 만하임사)로 인산화시킨 다음 회합(annealing) 반응으로 이중쇄를 형성시켰다. 리가아제(T4 DNA ligase, 베링거 만하임사)로 각각의 이중쇄 올리고뉴클레오티드를 연결한 다음 아가로오즈 젤 전기영동하여, 젤로부터 hCT-Gly를 코드하는 약 100염기쌍의 단편 1을 분리하였다.
[단계 2]
플라스미드 YEGα-HIR525(KCTC 8518P)를 BamHI 및 XbaI으로 절단하여 GAL10 프로모터 및 ppL을 포함하는 약 700염기쌍의 단편 2를 분리하였다. 또한, YEGα-HIR525를 BamHI 및 Sall으로 절단하여 약 5,700 염기쌍의 단편 3을 분리하였다. 단편 1의 hCT-Gly유전자와 단편 2의 ppL을 단편 3의 효모 벡터에 연결하여 플라스미드 pYHCAL1을 제작하였다(제 1도 참조).
플라스미드 pYHCAL1은 GAL10 프로모터::ppL::hCT-Gly유전자::GAL7 터미네이터를 상기 순서로 포함하고 있다. ATG 개시코돈으로 시작되는 ppL은 총 85개의 아미노산으로 구성되며, C-말단의 84, 85번 아미노산을 각각 라이신 및 아르기닌이다. 이 라이신-아르기니서열 다음에는 hCT-Gly의 N-말단 Cys 코돈인 TGT로부터 시작되는 완전한 hCT-Gly 유전자가 연결되어 있다. 라이신-아르기닌 배열을 인식하는 단백 분해효소 ysc F(KEX2 유전자의 발현물)는 효모의 트랜스 골지체에 존재하며, 합성된 ppL::hCT-Gly의 폴리펩타이드는 트랜스골지체에서 프로세싱되어 분비 시그날 부분이 떨어져 나가게 된다. 그러므로 배지로 분비되는 hCT-Gly는 N-말단이 Cys으로 시작되는 완전한 형태의 hCT-Gly이다.
[실시예 2]
이누리나제 INU1 분비 시그날을 이용한 효모용 hCT-Gly 분비벡터의 제작
[단계 1]
하기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 C4 및 A4를 DNA 합성기(Applied Biosystems사(미국), Model 391)로 합성하였다.
상기 올리고뉴클레오티드 C2, C3, C4, A2, A3 및 A4 각각 1㎕(100pmoles)를 혼합하여 폴리뉴클레오티드 인산화 효소로 인산화시킨 다음 회합 반응으로 이중쇄를 형성시켰다. 리가아제로 각각의 이중쇄 올리고뉴클레오티드를 연결한 다음 아가로오즈 젤 전기영동하여, 젤로부터 hCT-Gly을 코드하는 약 100염기쌍의 단편 4를 분리하였다.
[단계 2]
이누리나제 INU1 분비 시그날을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 하기 서열을 갖는 6개의 올리고뉴클레오티드 C5, C6, C7, A5, A6 및 A7을 DNA합성기(Applied Biosystems사(미국), Model 391)로 합성하였다:
상기 올리고뉴클레오티드 C5, C6, C7, A5, A6 및 A7 각각 1㎕(100pmoles)를 혼합하여 폴리뉴클레오티드 인산화 효소로 인산화시킨 다음 회합 반응으로 이중쇄를 형성시켰다. 리가아제로 각각의 이중쇄 올리고뉴클레오티드를 연결한 다음 아가로오즈 젤 전기영동하여, 젤로부터 이누리나제 INU1 분비 시그날을 코드하는 약 60염기쌍의 단편 5를 분리하였다.
[단계 3)]
플라스미드 YEGα-HIR525를 EcoRII 및 Sall으로 절단하여 GAL10 프로모터를 포함하는 약 6,300 염기쌍의 단편 6을 분리하였다. 단편 4의 hCT-Gly유전자와 단편 5의 INU1 분비 시그날을 단편 6의 효모 벡터에 연결하여 플라스미드 pYHCAL2을 제작하였다(제 2도 참조).
플라스미드 pYHCAL2은 GAL10 프로모터::INU1분비시그날::hCT-Gly 유전자::GAL7 터미네이터를 상기 순서로 포함하고 있다. ATG 개시코돈으로 시작되는 INU1분비 시그날은 총 23개의 아미노산으로 구성되며, C-말단의 22,23번 아미노산은 각각 라이신 및 아르기닌이다. 이 라이신-아르기닌서열 다음에는 hCT-Gly의 N-말단 Cys 코돈인 TGT로부터 시작되는 완전한 hCT-Gly 유전자가 연결되어 있다. 라이신-아르기닌 배열을 인식하는 단백 분해효소 ysc F(KEX2 유전자의 발현물)는 효모의 트랜스 골지체에 존재하며, 합성된 INU1 분비 시그날::hCT-Gly의 폴리펩타이드는 트랜스 골지체에서 프로세싱되어 분비 시그날 부분이 떨어져 나가게 된다. 그러므로 배지로 분비되는 hCT-Gly는 N-말단이 Cys으로 시작되는 완전한 형태의 hCT-Gly이다.
[실시예 3]
사카로마이세스 세레비지애 SEY2102의 형질전환
이토 등의 방법(Ito et al., J. Bacteriol., 153, 163(1983))에 따라, 실시예 1 및 2에서 제작된 플라스미드를 각각 사용하여 사카로마이세스 세레비지애 (MAT α, ura3-5, leu2-3, -112, his4-519; Carlson Botstein, Cell, 28, 145(1982))를 형질전환시켰다.
YPD 배지(효모 엑기스 1%, 박토 펩톤 2%, 포도당 2%) 10㎖서 30℃로 하룻밤 진탕하여 얻은 사카로마이세스 세레비지애 SEY2102 배양액 50㎕를 다시 YPD 배지 10㎖에 접종하여 O.D.600=1.0이 될 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 배양액을 2,000rpm에서 5분간 원심분리하여 배지를 제거한 후, TE완충액(10mM Tris-Cl, pH 8.0, 1mM EDTA) 5㎖로 균체를 세척하였다. 0.5㎖의 TE 완충액과 0.2M 염화리튬(Sigma사)0.5㎖을 넣어 잘 현탁한 후, 30℃에서 1시간 동안 진탕하고, 진탕액 100㎕를 에펜도르프 튜브에 옮겼다. 각 튜브에 실시예 1 및 2에서 얻은 플라스미드 용액 20㎕을 각각 첨가하여 30℃에서 30분간 진탕하고, 70% 폴리에틸렌글리콜 4,000용액 150㎕를 첨가하고 30℃에서 1시간 동안 진탕한 후, 48℃에서 10분간 열충격을 가하였다.
15,000rpm에서 1분간 원심 분리하여 상층액을 버리고, 0.8% 식염수로 침전물을 세척하였다. 100㎕의 식염수에 현탁시킨 현탁액을 최소 선택배지(아미노산 부재의 효모 질소 기질 0.67%, 포도당 2%, Leu 0.003%, His 0.002%)상에서 30℃로 4일간 배양하여, 두 종류의 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 SEY2102 균주, 즉, 사카로마이세스 세레비지애 pYHCAL1/SEY2102 및 pYHCAL2/SEY2102를 각각 얻었다.
사카로마이세스 pYHCAL1/SEY2102 및 pYHCAL2/SEY2102는 1995년 6월 9일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자 은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0169BP 및 KCTC 017BP 호로서 각각 기탁되었다.
[비교실시예 1]
플라스미드를 갖지 않는 사카로마이세스 세레비지애 SEY2102(숙주세포)를 10㎖의 YPD 배지에 각각 접종하고, 30℃에서 72시간 동안 진탕 배양하였다.
[실시예 4 및 5]
형질전환된 효모세포의 배양
실시예 3에서 얻은 pYHCAL1/SEY2102 및 pYHCAL2/SEY2102를 비교 실시예 1에서와 같은 조건하에 배양하였다.
[비교실시예 2]
사카로마이세스 세레비지애 SEY2102(숙주세포)를 10㎖의 YPDG 배지(효모 엑기스 1%, 박토 펩톤 2%, 포도당 0.4%, 갈락토스 2%)에 각각 접종하고, 30℃에서 72시간 동안 진탕 배양하였다.
[실시예 6 및 7]
형질전환된 효모세포의 배양
실시예 3에서 얻은 사카로마이세스 세레비지애 pYHCAL1/SEY2102와 pYHCAL2/SEY2102를 비교 실시예 2에서와 같은 조건하에 배양하였다.
[실시예 8]
비교 실시예 1, 2 및 4, 5, 6, 7에서 얻은 배양액 각각 1㎖를 4,000rpm에서 5분간 원심분리하여, 배양 상층액과 균체를 각각 회수하였다. 배양 상층액을 동결건조하여 우레아 용해 완충액(urea lysis buffer; 50mM Tris-Cl, pH 6.8, 100mM 디티오트레이톨, 2% SDS, 5% 머켑도에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루) 10㎕에 녹이고, 100℃에서 2분간 가열하여 생성된 용액을 배양액 단백질 분획으로 명명하였다.
한편, 호프만과 윈스턴의 방법(Hoffman Winston, Gene, 57, 267(1987))에 따라, 회수된 균체를 폐쇄 완충액(2% Triton X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM Tris-Cl, pH 8.0, 1mM EDTA) 2㎖에 현탁시키고, 직경 0.4 내지 0.5㎜의 글래스비드로 파쇄한 후, 여기에 5배 농축된 우레아 용해 완충액 0.5㎖을 첨가하고, 100℃에서 5분간 가열하였다. 생성된 용액을 균체 단백질 분획으로 명명하였다.
각 10㎕의 배양액 단백질 분획과 균체 단백질 분획을 1㎜ 두께의 10%분리 젤(separating gel, pH 8.8, 가로 20㎝, 세로 10㎝)위에 1㎜ 두께의 5% 저장 젤(stocking gel, pH 6.8, 가로 20㎝, 세로 3.0㎝)을 덮은 우레아 폴리아크릴아미드 젤에 로딩한 후 100-200볼트, 30㎃로 6시간동안 전기영동하고 쿠마시 염색액으로 염색하였다. 그 결과는 제3도와 같다.
제 3도에서, 제 1열은 표준 분자량 표시 단백질(위로부터 각 80, 50, 33 및 27 kDa)이고, 제 2열은 표준 분자량 표시 단백질(위로부터 각각 16.9, 14.4, 10.6, 8.1, 6.2, 3.4 및 2.5 kDa)이고, 제 3 및 제4열은 각각 비교 실시예 1 및 2의 균체 단백질 분획이고, 제 5, 6, 7 및 8열은 각각 실시예 4, 6, 5 및 7의 균체 단백질 분획이고, 제 9 및 10열은 각각 비교 실시예 1 및 2의 배양액 단백질 분획이고, 제 11, 12, 13 및 14열은 각각 실시예 4, 6, 5 및 7의 배양액 단백질 분획이고, 제 15열은 정제된 칼시토닌이다.
비교 실시예 1, 2의 숙주세포의 균체 단백질 분획과 배양액 단백질 분획에서는 어느 쪽에서도 hCT-Gly 밴드가 보이지 않았다(제3, 4, 9 및 10열).
실시예 4의 YPD배지에서 배양된 사카로마이세스 세레비지애 pYHCAL1/SEY2102의 경우에는 균체 및 배양액 단백질 분획 모두에서 hCT-Gly밴드가 발견되지 않았다(제 5열 및 11열). YPDG배지에서 갈락토스로 단백질 발현을 유도한 실시예 6의 사카로마이세스 세레비지애 pYHCAL1/SEY2102의 경우, 균체 단백질 분획에서는 hCT-Gly 밴드가 보이지 않으나(제 6열), 배양액 단백질 분획에서는 hCT-Gly 밴드가 4kDa부근에서 검출되었다(제 12열). 이 결과는 ppL 시그날을 사용하였을 때, 발현된 hCT-Gly이 완전히 배지로 분비되었음을 의미한다.
또한, 사카로마이세스 세레비지애 pYHCAL2/SEY2102의 경우 YPD배지에서 배양하였을 때(실시예 5)에는 균체 단백질 분획과 배양액 단백질 분획의 어느 쪽에서도 hCT-Gly 밴드가 보이지 않았다(제 7열 및 제 13열). 그러나, YPDG배지에서 갈락토스에 의해 단백질 발현이 유도된 경우(실시예 7), 균체 단백질 분획에는 hCT-Gly 밴드가 보이지 않으나(제 8열), 배양액 단백질 분획에서는 hCT-Gly 밴드가 발견되었다(제 14열). 이 결과는 세포내에서 발현된 hCT-Gly이 대부분 균체외로 분비되었음을 의미한다.
[실시예 9]
번틀의 방법(Burnetle, Anal. Biochhm., 112, 195(1981))에 따라, 실시예 8에서와 같이 SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질들을 쿠마시 염색하지 않은 채, 전기영동 전사장치(Hoefer사, Tank Transfer unit, 모델 TR-22)를 이용하여 150㎃, 80V로 1시간 동안 니트로셀룰로즈 막에 전사하였다. 막에 전사된 단백질들을 5,000배로 희석한 토끼의 항-칼시토닌-폴리클로날 항체(Sigma사)와 30분간 반응시키고, 칼시토닌 밴드를 웨스턴 블롯팅 AP 시스템(2차 항체: 염소의 항 토끼 IgGH+L or Fc-알칼리 포스페이트 결합체, 프로메가사, 미국)으로 확인하였으며, 그 결과는 제4도와 같다.
제 4도에서, 제 1열 내지 제 15열은 각각 제 3도의 시료와 동일한 시료를 나타내는데, 제 4도는 제 3도의 결과를 더욱 명백히 보여준다.
상기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, hCT-Gly 유전자를 ppL 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스의 이누리나제 분비 시그날에 연결하여 효모에서 발현시키면, 생산된 hCT-Gly를 높은 효율로 세포외로 분비시킬 수 있다. 또한, 클로이베로마이세스 마루시아누스의 이누리나제 분비 시그날이 hCT-Gly를 비롯하여 분자량이 작은 이종 단백질들을 높은 효율로 분비시킬 수 있음을 확인하였다.

Claims (5)

  1. 이누리나제 분비 시그날 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 인체 칼시토닌 전구체 유전자를 포함하는 발현벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 플라스미드 pYHCAL2.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 벡터로 형질전환된 재조합 효모세포.
  4. 제 3항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애 pYHCAL2/SEY2102(KCTC 0170BP)인 재조합 효모세포.
  5. 제 3항의 재조합 효모세포를 배양하고 배양배지로부터 인체 칼시토닌 전구체(hCT-Gly)를 회수함을 포함하는, hCT-Gly의 제조방법.
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