CN112210576B - 一种高纯度蔗果三糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯度蔗果三糖及其制备方法，涉及生物化工技术领域。本发明所述高纯度蔗果三糖的制备方法包括如下步骤：(1)制备果糖基转移酶；(2)活化用于固定化的载体；(3)将酶液注入树脂柱中进行酶的分级固定化；(4)将分级固定化酶加入白砂糖溶液中进行转化，得到低聚果糖溶液；(5)对低聚果糖溶液进行色谱提纯，得到所述高纯度蔗果三糖。本发明通过对酶的固定化方式进行简单的改进，得到了蔗果三糖质量分数高达85％的高纯度蔗果三糖，并且制备所用的固定化酶可循环使用，降低了酶的使用成本。

Description

一种高纯度蔗果三糖及其制备方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，尤其涉及一种高纯度蔗果三糖的制备方法。

背景技术

低聚果糖(Fructooligosaccharides，简称FOS)广泛存在于人们经常食用的天然植物中，如香蕉、大蒜、小麦、洋葱、雪莲果、菊芋等都含有一定含量的低聚果糖，是一类天然的低聚糖。其分子结构一般是蔗糖分子以β-(1→2)糖苷键与1-6个果糖分子组成，聚合度一般在2-7，平均聚合度约2.7。低聚果糖已被证实是同时具有超强双歧因子和水溶性膳食纤维的双生理学特性的全天然配料，在世界范围内被200多个国家和地区政府所认可。在中国市场，低聚果糖被批准为“食品配料”、“化妆品原料”以及“营养强化剂”并被广泛应用于食品、保健、医药、化妆品以及饲料领域。

常用低聚果糖的主要组分为蔗果三糖(1-kestose)，蔗果四糖(nystose)和蔗果五糖，不同工艺生产的低聚果糖组分会存在一定的差异。低聚果糖的难消化性和对双歧杆菌的滋养作用，主要是由于小分子量的果糖低聚物承担的，蔗果三糖，与其他短链低聚果糖相比具有更甜的口感，且蔗果三糖含量越高，低聚果糖增殖双歧杆菌的保健功效越高，在酸性和加热的条件下的稳定性也就越高。

由于低聚果糖中各组分分子结构类似，理化性质相近，将蔗果三糖与蔗果四糖等其他组分分离存在较大的难度。目前主要的途径有：1)菌种进行基因工程改造使其产生的酶在低聚果糖生产过程中主要产生蔗果三糖。如专利CN104781414A，由于法规及市场原因，一般不能用于婴幼儿食品及有机食品加工。2)转化过程控制：在蔗糖反应体系中加入缓冲液，加入果糖进行反应抑制，减少蔗果四糖、五糖的产生。如专利CN 110669808 A，其在转化过程中带入了离子及果糖等组分，会增加后续分离提纯的负荷，增加了能耗。3)提纯方法如A结晶提纯法：利用蔗果三糖在甲醇溶液中与其他组分间的结晶性差异进行分离提纯。如专利WO9721718A1，其分离过程中使用了高危险的化学物，对操作人员人身安全有较大的危险，且如果溶剂不能完全去除，对使用者也有较大的安全隐患。聚丙烯酰胺凝胶分离也能达到较好的蔗果三糖分离效果，如专利CN 106632526 A，其使用的凝胶原料单价较高，投入大生产时物料通过胶体时阻力较大，且分离速度较慢，产量不高，只适合实验室小规模生产。因此亟需开发一种简单、安全、高效，适合于工业化生产含量85％(占干基质量，后文简称占干基)以上的高纯度蔗果三糖的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种简单的、基于分级固定化酶生产工艺的高纯度蔗果三糖及其制备方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种高纯度蔗果三糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将霉菌菌丝加入磷酸缓冲液中进行分散，然后研磨、离心，弃去滤渣，得到果糖基转移酶酶液；

(2)将用于固定化的载体进行活化，所述载体包括强碱阴离子树脂、弱碱阴离子树脂、酚醛树脂；

(3)将步骤(2)活化的载体装于串联连接的树脂柱中，所述树脂柱的个数不少于2；

(4)使步骤(1)得到的果糖基转移酶酶液依次经过步骤(3)的树脂柱，树脂柱对酶液进行不循环吸附，得到分级固定化果糖基转移酶

(5)将固定化果糖基转移酶加入白砂糖溶液中，在pH值为5.5-7.5的条件下转化，得到含蔗果三糖的低聚果糖溶液；

(6)将步骤(5)得到的低聚果糖溶液灭菌、脱盐脱色后，经色谱提纯，得到所述高纯度蔗果三糖。

本发明主要原理为：果糖基转移酶为一个酶系，具有水解蔗糖的酶活性，也有转糖苷的酶活性，不同菌种来源的果糖基转移酶系中各水解活性及转糖苷活性存在差异，采用树脂固定化时，不同的酶蛋白与树脂进行物理吸附或离子交换吸附时会有一定的差异，这里引入分级固定的模式正是利用这种差异性吸附对酶液中的酶进行差异化固定，达到改变原有酶系中水解酶与转糖苷酶间的比例的目的，进而在转化生产低聚果糖的过程中达到改变低聚果糖组分的效果。

优选地，所述步骤(1)中的霉菌包含米曲霉、黑曲霉、日本曲霉、斐济曲霉中的至少一种。

优选地，所述步骤(1)中，磷酸缓冲液的pH值为5.7-6.5。

优选地，所述步骤(4)中，固定化果糖基转移酶从左至右顺次被酶柱系统中的吸附柱吸附。

优选地，所述步骤(5)中，固定化果糖基转移酶的用量为2-5U/g白砂糖(每分钟产生1umol蔗果三糖为1个酶活单位U)。

优选地，所述步骤(5)中，白砂糖溶液中，白砂糖的质量分数为30-60％。

优选地，所述步骤(5)中，转化的条件为：温度为45-55℃，时间为：4-24h，pH值为6.0-6.5。

优选地，所述步骤(6)中，色谱提纯的条件为：进料蔗果三糖含量占低聚果糖的质量分数为90％以上，干物质质量分数为30-60％，pH值为7-10，色谱柱温为40-65℃。

同时，本发明还公开了一种由所述制备方法制备得到的高纯度蔗果三糖。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)使用现有法规规定的非基因工程菌种所产的果糖基转移酶，采用树脂对酶系中的酶进行分离，实现后续转化过程中蔗果三糖占总低聚果糖(FOS)的质量分数达90％以上，且所制得的酶为固定化酶，可以实现多次使用，降低了酶的使用成本。

(2)提纯工艺采用现行的色谱提纯工艺，不需进行设备的升级改造即可生产出蔗果三糖质量分数为85％(占干基)以上的高纯低聚果糖产品，再结合专利CN 104878056 B的二次色谱对提取液进行回收，提高了低聚果糖的收率，降低了工业生产成本。

附图说明

图1为本发明所述固定化酶柱系统；

图2为不同固定方式对转化结果的影响图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

以下对本发明的几个概念进行说明：根据GB23528的检测条件，每分钟产生1umol蔗果三糖为1个酶活单位U，记作U_t。

现定义每分钟产生1umol果糖为一个水解酶活单位，记作U_h。

实施例1

本发明所述高纯度蔗果三糖的制备方法的一种实施例，本实施例所述制备方法包括如下步骤：

(1)往4m³搅拌罐中加入250kg米曲霉菌丝，再加磷酸盐的浓度为0.1mol/L、pH为6.0的磷酸盐缓冲液1750kg，将菌丝分散在缓冲液中，搅拌转速为100rpm，用研磨机将菌丝分散液进行研磨，离心去除滤渣，得到酶活为18.17U/mL的果糖基转移酶酶液1670kg。

(2)选用漂莱特A500P阴离子树脂，活化时先用5％的氢氧化钠溶液浸泡16h，用水清洗至中性，然后用5％的盐酸溶液浸泡2h，再水洗至pH值为6即完成活化。

(3)往图1所示的固定化酶柱系统的4个酶柱中分别加入80kg活化好的固定化酶树脂。

(4)将步骤(1)得到的果糖基转移酶酶液以0.4m/h的流量输送至步骤(3)中装填好树脂的树脂柱中，酶液吸附完毕后加工艺水1m³，将柱中剩余酶液顶出，完成酶的分级固定化；

(5)取出4个区中的固定化酶，检测酶柱1～4酶活分别为：62.35U/g、45.72U/g、27.48U/g和18.26U/g。固定化酶按5U/g白砂糖的量添加至180g蔗糖质量分数为55％的蔗糖溶液中，酶柱1～4的固定化酶分别加入8g、10.9g、18.2g和27.4g，调节转化糖液pH值为6.0，于50℃水浴，以100rpm转速进行摇瓶转化反应，摇瓶转化12h后用高效液相色谱检测各转化液组分含量，测试结果如表1所示。

(6)调节步骤(5)3号柱转化完成的糖液pH值为7，物料经灭菌、脱气后经过改良型顺序式模拟移动床色谱系统提纯。提纯条件为：以钾型强酸性阳离子交换树脂为固定相，去离子水(洗提水)为流动相，物料温度为50℃，洗提水的pH值为8.5。经色谱提纯后残液相即为所述高纯度蔗果三糖。

所述高纯度蔗果三糖中，蔗果三糖的质量分数为87.12％，FOS含量为94.71％。提取液按专利CN 104878056 B的方法回收后经浓缩，二次转化后可再进色谱分离生产普通型(蔗果三糖含量50％)的低聚果糖产品，整个过程低聚果糖收率为98.36％，减少了物料单耗，节约了生产成本。

表1转化液中不同组分的质量分数(％)

从表1中可知，经过分级固定后，即使按同样的酶活、同样的转化条件进行摇瓶转化，以不同酶柱中的酶转化的糖液中不同组分的含量也会产生明显差异。其中，3号、4号柱中固定化酶摇瓶结果为：蔗果三糖的质量分数占FOS的90％以上。

实施例2

本发明所述高纯度蔗果三糖的制备方法的一种实施例，本实施例所述高纯度蔗果三糖的制备方法除了转化pH为5.5外，其余条件均与实施例1相同。经色谱提纯后对残液相中低聚果糖的含量进行检测，结果显示，3号柱固定化酶的蔗果三糖的含量最高，为80.34％，1、2、4号柱固定化酶转化并提纯后蔗果三糖的含量分别为：53.69％、55.83％、78.36％。

实施例3

对不同菌种来源的果糖基转移酶进行分级固定化处理：将实施例1中的菌丝分别换为黑曲霉、日本曲霉和斐济曲霉，采用实施例1分级固定化方法对不同来源的果糖基转移酶进行分级固定，然后以相同方法对糖液进行转化，测试转化后糖液中各组分含量，测试结果如表2所示。

表2转化液中不同组分的质量分数(％)

从表2中可知，以不同菌种制备的果糖基转移酶采用本发明所述制备方法均可以在3号柱中得到蔗果三糖占低聚果糖含量高达90％的糖液，说明本发明所述高纯度蔗果三糖的制备方法具有普适性。

实施例4

对分级固定化方式进行探究。取实施例1中的酶活为18.17U/ml的米曲霉酶液627ml平均分装在三个500ml烧杯中，在实验室里安装三组酶柱系统，编号为A、B、C，每组4个吸附柱。每条柱子体积20mL，分别装填10g按实施例1的方法活化好的树脂(漂莱特A500P)，其中A组采取并联吸附；B组采取串联循环吸附(即第四条吸附柱出口酶液循环至进料烧杯进行重复吸附)；C组采取串联不循环吸附。进料流量为：A4mL/min，B、C 1mL/min。吸附完成后分别检测各组酶柱中各单柱的酶活，并计算出Ut/Uh比值。酶的添加量按5U/g蔗糖加入，转化的条件为：pH值为6.0，摇床转速为100rpm、温度为50℃，转化12h后检测蔗果三糖及FOS含量并计算蔗果三糖/FOS的比值。图2为不同固定方式对转化结果的影响图，从图2中可以明显看出，C组(串联不循环的模式进行酶的分级固定，即本发明公开的方法)各吸附柱固定化酶转糖苷酶活与水解酶活的比例发生了明显的变化；摇瓶转化结果中蔗果三糖/FOS的比值在C组中也出现了与较明显的变化，A组各柱间几乎无变化，B组各柱有一定变化，但变化不明显。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但并不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种高纯度蔗果三糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将霉菌菌丝加入磷酸缓冲液中进行分散，然后研磨、离心，弃去滤渣，得到酶液；

（2）将用于固定化的载体进行活化，所述载体为漂莱特A500P阴离子树脂；

（3）将步骤（2）活化的载体装于串联不循环连接的树脂柱中，所述树脂柱的个数为4；所述树脂柱的体积为20mL，所述活化的载体的质量为10g；

（4）使步骤（1）得到的酶液依次经过步骤（3）的树脂柱进行分级固定，得到分级固定化酶；所述酶液的用量为209mL，所述酶液的酶活为18.17U/mL，每分钟产生1μmol蔗果三糖所需的酶量为1个酶活力单位U；

（5）取出第3个树脂柱中的固定化酶，将所述固定化酶加入白砂糖溶液中，在pH值为6.0-6.5、温度为45-55℃的条件下转化4-24h，得到含蔗果三糖的低聚果糖溶液；

（6）将步骤（5）得到的低聚果糖溶液进行色谱提纯，得到所述高纯度蔗果三糖；所述步骤（1）中的霉菌为米曲霉、黑曲霉、日本曲霉、斐济曲霉中的一种。

2.如权利要求1所述的高纯度蔗果三糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，磷酸缓冲液的pH值为5.7-6.5。

3.如权利要求1所述的高纯度蔗果三糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，固定化酶的用量为2-5U/g白砂糖。

4.如权利要求1所述的高纯度蔗果三糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，白砂糖溶液中白砂糖的质量百分含量为30-60%。

5.如权利要求1所述的高纯度蔗果三糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中，色谱提纯的条件为：进料蔗果三糖含量占低聚果糖的质量分数为90%以上，干物质质量分数为30-60%，pH值为7-10，色谱柱温为40-65℃。

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