CN113461751A - 一种高蔗果三糖含量低聚果糖及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种高蔗果三糖含量低聚果糖及其应用。本发明高蔗果三糖含量低聚果糖中，蔗果三糖占干物质的质量百分比大于80％，蔗果三糖占低聚果糖的质量百分比大于90％。本发明的高蔗果三糖含量低聚果糖可以增加啮齿类动物粪便及盲肠内容物的嗜粘蛋白阿克曼氏菌、双歧杆菌、乳酸杆菌及其代谢产物短链脂肪酸，并且还可以增加大鼠粪便含水量达到润肠通便的效果，还可以增强人外周血淋巴细胞及其传代细胞γ‑干扰素分泌，抑制EHEC诱导的肠上皮细胞的炎症响应。此外，本发明的高蔗果三糖含量低聚果糖有助于预防、改善或治疗肥胖症、2型糖尿病、克罗恩病、特应性皮炎、呼吸系统感染等病症。

Description

一种高蔗果三糖含量低聚果糖及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种高蔗果三糖含量低聚果糖及其应用。
背景技术
益生元是被微生物选择性利用从而赋予宿主健康效益的一类物质，包括低聚果糖、低聚半乳糖、母乳低聚糖等。随着技术进步，益生元精准化逐渐成为重要发展方向。精准益生元是通过对益生元的理化性质、结构成分、生理作用机制的研究和深刻理解，以现代精准营养的规律和要求为指导，针对不同人群或个体的菌群、代谢、营养特征和需求，以独立或协同作用的方式，实现益生元在微生态健康产品、生物医药研发、医疗服务上的精准化定制和科学配方。要实现上述精准益生元的科学应用，至少必须在以下几个层面上对各种特定的益生元进行深入研究：(1)在分子生物学、细胞生物学的层面上，研究、阐明特定益生元的直接生理功能机制，为进一步指导和应用该益生元提供坚实的科学基础；(2)分离、纯化单一化学组分的益生元，在此基础上进行单一组分益生元的功效研究，建立该组分益生元“结构-菌群-功能”方面的对应关系，为单组分益生元向药物研究和临床应用提供精准的依据。
低聚果糖(Fructooligosaccharides，FOS)广泛存在于人们经常食用的天然植物中，如香蕉、大蒜、小麦、洋葱、雪莲果、菊芋等都含有低聚果糖，是一类天然的低聚糖。其分子结构一般是蔗糖分子以β-(1→2)糖苷键与1-6个果糖分子组成，聚合度在2-7，平均聚合度约2.7。低聚果糖已被证实是同时具有超强双歧因子和水溶性膳食纤维的双生理学特性的全天然配料，在世界范围内被200多个国家和地区政府所认可。在中国市场，低聚果糖被批准为“食品配料”、“化妆品原料”以及“营养强化剂”并被广泛应用于食品、保健、医药、化妆品以及饲料领域。
常规低聚果糖为一种混合物，主要组分为蔗果三糖(kestose,GF2)，蔗果四糖(nystose,GF3)和蔗果五糖(1-β-fructofuranosyl-nystose,GF4)，不同工艺生产的低聚果糖组分存在一定的差异。蔗果三糖可以有效地增殖双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)与普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)并缓解婴幼儿特应性皮炎。
目前，高蔗果三糖含量低聚果糖在肠道菌群与免疫功能的应用上还未有报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有调节肠道菌群与免疫功能的高蔗果三糖含量低聚果糖，克服了现有益生元应用层面的混杂模糊性、随意性等局限，为益生元在精准营养与微生态医疗等生物医药领域的应用提供科学依据与典型示范。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种高蔗果三糖含量低聚果糖，蔗果三糖占干物质的质量百分比大于80％，蔗果三糖占低聚果糖的质量百分比大于90％。
作为本发明所述高蔗果三糖含量低聚果糖的优选实施方式，当动物给药时，高蔗果三糖含量低聚果糖每天给药量为4.5g/kg-28.6g/kg。
更为优选地，当动物给药时，高蔗果三糖含量低聚果糖每天给药量为4.5g/kg、14.3g/kg或28.6g/kg。
第二方面，本发明提供了上述高蔗果三糖含量低聚果糖在调节肠道菌群中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述肠道菌群包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)和乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)中的一种或多种。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述调节肠道菌群为增加啮齿类动物粪便及盲肠内容物的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)、乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)及其代谢产物短链脂肪酸。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述调节肠道菌群为通过增加大鼠粪便含水量从而润肠通便。
第三方面，本发明提供了上述高蔗果三糖含量低聚果糖在调节免疫功能中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述调节免疫功能包括增强人外周血淋巴细胞及其传代细胞γ-干扰素分泌和抑制EHEC诱导的肠上皮细胞的炎症响应。
第四方面，本发明提供了上述高蔗果三糖含量低聚果糖在制备治疗和/或预防肥胖症、2型糖尿病、克罗恩病、特应性皮炎或呼吸系统感染药物中的应用。
第五方面，本发明提供了一种复合饲料，包括以下重量百分比的原料：70％低纤维饲料AIN-93M和30％高蔗果三糖含量低聚果糖。
根据实施例2-5的实验数据证明了本发明的高蔗果三糖含量低聚果糖可以增加啮齿类动物粪便及盲肠内容物的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)、乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)及其代谢产物短链脂肪酸，并且可以增加大鼠粪便含水量从而达到润肠通便的效果，还增强了人外周血淋巴细胞及其传代细胞γ-干扰素分泌，抑制EHEC诱导的肠上皮细胞的炎症响应。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明精准评价高蔗果三糖含量低聚果糖的生理功能和作用，克服现有益生元应用层面的不可重复性、模糊性、随意性等局限，为益生元在精准营养与微生态医疗等生物医药领域的应用提供科学依据与典型示范。
附图说明
图1是高蔗果三糖含量低聚果糖增加大鼠盲肠内容物的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)结果示意图；
图2是高蔗果三糖含量低聚果糖增加小鼠盲肠内容物的短链脂肪酸结果示意图；
图3是高蔗果三糖含量低聚果糖增加大鼠粪便含水量的结果示意图；
图4是高蔗果三糖含量低聚果糖增强人外周血淋巴细胞及其传代细胞γ-干扰素分泌的结果示意图；
图5是高蔗果三糖含量低聚果糖抑制EHEC诱导肠上皮细胞炎症响应的结果示意图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本发明提供的高蔗果三糖含量低聚果糖(GF2)，蔗果三糖占干物质的质量百分比大于80％，蔗果三糖占低聚果糖的质量百分比大于90％。
按照专利申请CN202011039079.0的技术方法制备可以得到本发明的高蔗果三糖含量低聚果糖，将高蔗果三糖含量低聚果糖根据GB/T 23528-2009《低聚果糖》、GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》、Q/QHB0003S-2021《低聚果糖》等依据进行测试。
表1测试结果
Figure BDA0003163606680000041
Figure BDA0003163606680000051
实施例2、高蔗果三糖含量低聚果糖增加大鼠盲肠内容物的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)及大鼠粪便含水量
实验：大鼠为7-8周龄的雄性SD大鼠，适应性饲养至少7天；40只大鼠随机分为5组，每组8只，单笼饲养，每天每千克大鼠体重灌胃10ml，每组的干预为(1)每天两次纯水；(2)每天两次盐酸洛哌丁胺(每天每千克大鼠体重灌胃4mg)；(3)每天一次纯水；(4)上午盐酸洛哌丁胺(每天每千克大鼠体重灌胃8mg)，下午纯水；(5)上午盐酸洛哌丁胺(每天每千克大鼠体重灌胃8mg)下午高蔗果三糖含量低聚果糖(每天每千克大鼠体重灌胃4.5g)；大鼠于第10天下午禁食16小时(17:00-9:00)后，每千克大鼠体重灌胃10ml的10％活性碳与5％阿拉伯胶混悬液，30分钟后将动物安乐死，剖腹剥离胃肠道；每天记录粪便数量、粪便湿重、粪便干重、粪便含水量，第0天、第10天粪便取样以及第11天盲肠取样用于肠道菌群的检测。
参考图1，高蔗果三糖含量低聚果糖可以增加大鼠盲肠内容物的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)，同样高蔗果三糖含量低聚果糖也可以增加粪便及盲肠内容物的双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)及乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)。
参考图3，比较不同浓度的盐酸洛哌丁胺及不同给药方式对大鼠便秘的诱导效果，尝试使用高蔗果三糖含量低聚果糖改善大鼠便秘症状。高蔗果三糖含量低聚果糖可以增加大鼠粪便含水量，从而使得大鼠润肠通便，改善了大鼠便秘症状。
实施例3、高蔗果三糖含量低聚果糖增加小鼠盲肠内容物的短链脂肪酸
实验：小鼠为同窝4周龄雌性BALB/c小鼠，低纤维饲料AIN-93M适应性喂养2周；40只小鼠随机分为5组，每组8只，分别饲喂(1)低纤维饲料AIN-93M+30％纤维素；(2)低纤维饲料AIN-93M+30％低聚果糖；(3)低纤维饲料AIN-93M+15％纤维素+15％低聚果糖；(4)低纤维饲料AIN-93M+30％高蔗果三糖含量低聚果糖；(5)低纤维饲料AIN-93M+15％纤维素+15％高蔗果三糖含量低聚果糖；饲喂6周，每两周收集粪便样本以及第6周结束后取盲肠内容物用于肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸(Total-SCFA、acetic-acid、butyric-acid、isobutyric-acid、lactic-acid、propionate-acid、valerate-acid)的检测。
参考图2，高蔗果三糖含量低聚果糖可以增加小鼠盲肠内容物的短链脂肪酸，本实施例通过设置低纤维饲料作为基础背景从而更好地凸显高蔗果三糖含量低聚果糖的作用，并且设置两个浓度梯度从而明确高蔗果三糖含量低聚果糖的剂量效应。
实施例4、高蔗果三糖含量低聚果糖增强人外周血淋巴细胞及其传代细胞γ-干扰素分泌
本实施例中，免疫细胞来源于人外周血单个核细胞PBMC的T细胞；每孔5×106个人外周血单个核细胞PBMC接种在24孔板并孵育2小时，非贴壁细胞为淋巴细胞；每孔2-5×105个淋巴细胞接种于提前一天以5ug/mL的anti-CD3和anti-CD28包被的96孔板，加入10ng/mL的IL-2并培养72小时即为T细胞；在T细胞培养基中加入5mg/mL的低聚果糖、高蔗果三糖含量低聚果糖并设置无添加的空白对照，通过流式细胞术与酶联免疫吸附测定法检测IFN-γ+T细胞的相对比例以及细胞培养液上清中IFN-γ的质量浓度。
本实施例中，构建人外周血淋巴细胞分化模型，尝试使用高蔗果三糖含量低聚果糖调节T细胞分化及其分泌细胞因子的能力。
参考图4，高蔗果三糖含量低聚果糖可以增强人外周血淋巴细胞及其传代细胞γ-干扰素分泌。其中，IFN-γ+T细胞相对比例显著增加50％-90％，IFN-γ+T细胞培养液上清中IFN-γ的质量浓度显著增加80％-120％。
实施例5、高蔗果三糖含量低聚果糖抑制EHEC诱导的肠上皮细胞的炎症响应
本实施例中，将肠上皮细胞HCT-8、HCT-116及HT-29以25％-30％的愈合度接种于24孔板，同时加入25mg/mL高蔗果三糖含量低聚果糖并设置无添加的空白对照，培养48小时，再加入感染复数(MOI)为100:1的大肠杆菌EHEC处理，以加入大肠杆菌为起点，分别收集第0、15、30、45、60、90分钟的细胞裂解液进行Western blot检测，检测指标为炎症相关细胞信号分子NF-κB/p65、phospho-NF-κB/p65与IκB-α。
本实施例中构建肠上皮细胞炎症模型，尝试使用高蔗果三糖含量低聚果糖抑制炎症反应。
参考图5，与对照组相比，加入高蔗果三糖含量低聚果糖(GF2)可以抑制EHEC诱导的肠上皮细胞HCT-8、HCT-116及HT-29的炎症响应。其中，炎症指标分子phospho-NF-κB/p65在Western blot凝胶电泳图中的灰度显著下降45％-65％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种高蔗果三糖含量低聚果糖，其特征在于，蔗果三糖占干物质的质量百分比大于80％，蔗果三糖占低聚果糖的质量百分比大于90％。
2.如权利要求1所述的高蔗果三糖含量低聚果糖，其特征在于，当动物给药时，高蔗果三糖含量低聚果糖每天给药量为4.5-28.6g/kg。
3.如权利要求1所述的高蔗果三糖含量低聚果糖在调节肠道菌群中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肠道菌群包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)和乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)中的一种或多种。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调节肠道菌群为增加啮齿类动物粪便及盲肠内容物的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)、乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)及其代谢产物短链脂肪酸。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调节肠道菌群为通过增加大鼠粪便含水量从而润肠通便。
7.如权利要求1所述的高蔗果三糖含量低聚果糖在调节免疫功能中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述调节免疫功能包括增强人外周血淋巴细胞及其传代细胞γ-干扰素分泌和抑制EHEC诱导的肠上皮细胞的炎症响应。
9.如权利要求1所述的高蔗果三糖含量低聚果糖在制备治疗和/或预防肥胖症、2型糖尿病、克罗恩病、特应性皮炎或呼吸系统感染药物中的应用。
10.一种复合饲料，其特征在于，包括以下重量百分比的原料：70％低纤维饲料AIN-93M和30％高蔗果三糖含量低聚果糖。
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