EA028094B1

EA028094B1 - Способ получения 1-кестозы

Info

Publication number: EA028094B1
Application number: EA201590599A
Authority: EA
Inventors: Энрике Росендо Перес Крус; Ласаро Эрнандес Гарсия; Дуньески Мартинес Гарсия; Луис Энрике Трухильо Толедо; Кармен Менендес Родригес; Алина Собрино Легон; Рикардо Рамирес Ибаньес; Гумерсиндо Фейхоо Коста; Хуан Мануэль Лема Родисио
Original assignee: Сентро Де Инхеньерия Хенетика И Биотекнолохия
Priority date: 2012-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2017-10-31
Also published as: MX363716B; AU2017221776A1; KR20150056795A; AR092588A1; CU24158B1; ZA201501833B; JP6994449B2; EA201590599A1; BR112015005852A2; US20190085364A1; WO2014044230A1; IN2015DN02234A; EP2899282A1; AU2013317358B2; CU20120138A7; CA2885116C; CA2885116A1; AU2017221776B2; JP2019047797A; US10131927B2

Abstract

Изобретение относится к способу получения 1-кестозы в промышленном масштабе с использованием рекомбинантной фруктозилтрансферазы (FTF), выделенной из овсяницы тростниковой, конститутивно экспрессированной в несахаролитическом дрожжевом хозяине. По изобретению рекомбинантную FTF типа сахароза:сахароза-1-фруктозилтрансфераза (1-SSTrec) получают на конститутивной и стабильной основе и с высокими выходами как в супернатанте, так и в клеточном осадке культуры штамма Pichia pastoris. Изобретение также относится к способу получения 1-SST в промышленном масштабе. Полученный рекомбинантный фермент используется для серийного ферментативного производства фруктоолигосахаридов (ФОС), в частности 1-кестозы, из сахарозы. Способ по изобретению позволяет получить процентное превращение ФОС на уровне более чем 55%, содержащем более чем 90% 1-кестозы.

Description

Настоящее изобретение относится к пищевой и сахарной промышленности, в частности к синтезу фруктоолигосахаридов (ФОС) из сахарного тростника/сахарной свеклы или другого содержащего сахарозу сырья, такого как мед, патока, растительные экстракты, сиропы и т.д.

Уровень техники

ФОС состоят из линейных цепей с 1-9 остатками фруктозы, связанными с молекулами сахарозы посредством β(2^1) связей (Уип, 1996, Еп/уте М1сгоЬ. Теейпо1. 19:107-117). Значение этих соединений заключается в их применении в качестве неусваиваемых в организме человека и животных компонентов пищи, имеющих пребиотический эффект, поскольку они оказывают благоприятное воздействие на здоровье избирательным стимулированием роста или активности одной или нескольких групп полезных микроорганизмов в толстой кишке. К таким микроорганизмам относятся виды родов Ьас1оЬасШи8 и ВтйбоЬас!егшш (ОФкоп апб ВоЬегГгснб.. 1995, I. ΝιιΙγ. 125 (6):1401-1412). В естественных условиях ФОС продуцируются растениями, грибами, бактериями и некоторыми дрожжами под действием ферментов, называемых фруктозилтрансферазами (РТР, ЕС 2.4.1.9) и β-фруктофуранозидазами (ЕС 3.2.1.26) (Ошо е! а1., 2009; Кесеп! Ра!еп!к оп Рооб, №!гйюп&АдгФи1!иге, 1 (3):221-30).

В настоящее время промышленное получение ФОС осуществляется по следующим двум технологиям: частичное расщепление инулинов (Уип., 1996; Еп/уте МюгоЬ. ТесЬпо1. 19:107-117; Ргапск., 2002; ВгФкЬ 1опгпа1 оГ ШйФоп 87 (2): §287-8291) или ферментативный синтез из сахарозы с использованием β-фруктофуранозидазы с высокой активностью трансфруктозилазы или РТР, продуцируемой в основном грибами (АкрегдШик шдег А..)аройсик, А.огу/ае, А.аси1еа!ик апб АигеоЬакФшт ри11и1ап5) (Уип., 1996; Еп/уте МюгоЬ. ТесЬпо1. 19:107-117; Уапкоуа е! а1., 2008; СЬетюа1 Рарегк 62 (4):375-381). Согласно обеим технологиям получают смесь ФОС, которые имеют разную степень полимеризации (СП) от 2 до 10, основными компонентами которой являются: 1-кестоза (ОР₂), нистоза (ОР₃), фруктозилнистоза (ОР₄), бифуркоза (ОР₃), инулобиоза (Р₂), инулотриоза (Р₃) и инулотетроза (Р₄). С коммерческой точки зрения трисахарид 1-кестоза является наиболее ценным ФОС за счет его двойной функции в качестве природного пребиотика и низкокалорийного подсластителя, пригодного в качестве заменителя сахара для больных сахарным диабетом (Уеда апб /ишда-Напкеп., 2011; ВФгекоигсе ТесЬпо1оду, 102 (22), 10180-10186).

Технологии и патентные документы, касающиеся получения ФОС из сахарозы, основываются на использовании клеток и ферментов (свободных или иммобилизованных), выделенных из различных микроорганизмов дикого типа, таких как грибы АигеоЬакФшш ри11и1ап5 (δηιίΐΐι и Ьиепкег, 1980, патент США № 4309505), АкрегдШик рЬоейсй (Уап Ооогеп е! а1., 1988, патент США № 4849356), АкрегдШик йдег (НФака е! а1., 1988, Адпс. Вю1. СЬет. 1181), АкрегдШик аси1еа!ик (Регпапбе/-Аггоф е! а1., 2009, международная заявка \УО 2010/103150 А1), дрожжи Р1юбоЮги1а кр. (Адшаг бе ОЬуейа е! а1., 2007, заявка ВКР10705359 на патент А2-2) и бактерии МюгоЬас!егшш 1аеуашГогшапк (На!сЬег е! а1., 1988, патент США № 4927757), КаЬпе11а ациа!Ш8 (ОЬ!кика, К. е! а1. Вюксг Вю!есЬ. ВюСЬеш. 56 (9), 1373-1377, 1992), /утотопак тоЬШк (На!сЬег е! а1., 1988, патент США № 4797360). Такие производственные процессы осуществляются в реакторах различного типа, в основном с механическим перемешиванием и с неподвижным слоем, периодического или непрерывного действия. В периодических процессах накопление выделенной глюкозы может ингибировать реакцию синтеза ФОС. С другой стороны, непрерывные процессы, в которых используются клетки или ферменты, иммобилизованные на различных носителях, позволяют повторно использовать биокатализатор, но они не могут осуществляться при высоких скоростях потока из-за внутренних диффузионных ограничений для субстрата, чтобы получить доступ иммобилизованного фермента.

Продолжительность реакции необходимо регулировать для предотвращения гидролиза синтезированных фруктанов. Период инкубации зависит от исходного уровня ферментативной активности в расчете на 1 г субстрата, который изменяется в течение от 8 до 24 ч, когда синтезируется смесь 1-кестозы, нистозы и фруктозилнистозы.

Получение чистых кристаллов 1-кестозы или препаратов 1-кестозы с чистотой более 90% (Те!киЫго е! а1., 1995, патент США № 5463038; КоюЫго е! а1., 2010, заявка на патент Японии 1Р2010273580-А) является чрезвычайно сложным процессом, если он начинается с наиболее распространенных реакционных смесей, состоящих из 20-25% глюкозы, 10-15% сахарозы, 5% фруктозы и 55-60% общего объема ФОС, и с ФОС, имеющих от 40 до 60% 1-кестозы. Процесс может быть экономически нецелесообразным для его применения для пищевых продуктов. Хроматографическое разделение 1-кестозы экономически рентабельно только, если ее содержание составляет более 80% от общего объема фракции ФОС (№кЫ/а\\а е! а1., 1996, патент США 6479657).

Реакционные смеси, в которых состав ФОС в основном представлен 1-кестозой (более 80% сахаров в смеси), являются редкими. Высокие уровни 1-кестозы были синтезированы ферментами РТР из грибов, таких как АкрегдШик аси1еа!ик (Напд апб ^ообашк, 1995, Вю!есЬпо1оду Ьейегк, 17:295-298) и АкрегдШик .(аройсик АТСС 20236, при концентрации сахарозы ниже чем 227 г/л (Миккайо е! а1., 2009, 1опгпа1 оГ Мо1еси1аг Са1а1ук1к В: Еп/утаОс 59:76-81). В обеих ссылках содержание 1-кестозы составляло примерно 71% от общего объема фракции ФОС, присутствующей в смеси, но при испытании концентраций саха- 1 028094 розы более 500 г/л процент 1-кестозы снижался до значений, близких или более низких чем 60% (СЬа/ί е! а1., 2005, 1оигпа1 оГ Мо1еси1аг Са1а1у818 В: Еп/утаОс. 35:19-27). β-Фруктофуранозидазы из АзрегдШиз шдег АТСС 20611, РетсШшт госщеГогЦ и §сори1аг1ор818 Ъгеу1саиЙ8 способны продуцировать до 76,7, 86,7 и 91,3% 1-кестозы соответственно при концентрации сахарозы 500 г/л (Νί8ΐιίζ;·ι\ν;·ι е! а1., 2002, патент США 6479657 В1). Хотя эти проценты показывают, что ферменты из Р.госщеГогО и §.Ъгеу1саиЙ8 являются более активными в отношении выхода 1-кестозы, чем ферменты из А.шдег, ситуация меняется с точки зрения производительности и стабильности. Кроме того, ни один из этих организмов не признан в качестве безопасного (ОКА.8 или ОР8; Общепризнан безопасным или Квалифицированная презумпция безопасности) для использования в пищевых продуктах (Научная комиссия ЕР8А по биологическим угрозам, 2009; ЕР8А 1оита1 7 (12): 1431; Сиепса-Е81ге11а е! а1., 2003, Апйт1сгоЪ ЛдеШ8 СЬето!Ьег, 47 (7):23392341).

Рост мицелиальных грибов является еще одним существенным производственным ограничением при промышленных ферментациях, поскольку их мицелиальные нити наматываются на лопасти винта и также часто закупоривают вентиляционные отверстия ферментера (АЬтаб е! а1., 2010, Вюргосе88 Епд. Вю8у8!. 33, 599-606).

Мутированный вариант β-фруктофуранозидазы А.шдег был получен с использованием генной инженерии белков. Мутированный ген был экспрессирован в β-фруктофуранозидаза-дефицитном штамме этого гриба. Фермент катализировал синтез 1-кестозы, обеспечивая ее содержание 93,5% от общего объема ФОС при реакции с сахарозой при концентрации 550 г/л (Ыакатига е! а1., 2010, патент США 7655449).

Однако отсутствуют технологически приемлемые системы получения РТР, которые обеспечивают возможность получения таких ферментов в больших количествах для промышленного получения ФОС (Уеда апб 2ишда-Наи8еп, 2011; Вюге8оигсе ТесЬпо1оду, 102 (22):10180-10186). Культивирование грибов и последующая экстракция и/или очистка их эндогенных РТР являются основными ограничивающими факторами. Необходимо исследовать применение других природных или рекомбинантных хозяев, более подходящих для крупномасштабного получения и выделения отдельных РТР ферментов.

По результатам проведенных фундаментальных исследований в основном раскрывается механизм синтеза фруктанов в растениях, в различных документах описано выделение генов, кодирующих ферменты РТР, способные действовать на сахарозу в качестве субстрата. Такие гены были выделены из различных видов, таких как цикорий обыкновенный (бе На11еих апб уап Си18ет, 1997, Р1ап1 РЬу8ю1. 113:1003), ячмень обыкновенный (Н СЙ81га88ег е! а1., 1998, РЕВ8 Ьейег8 440: 356-360), подсолнечник клубненосный (Уап бег Меег е! а1., 1998, Р1ап! 1. 15:489-500), овсяница тростниковая (ЬшсЬег е! а1., 2000, Р1ап! РЬу8ю1оду, 124 (3):1217-1227), агава текильная (Ауба-Регпапбе/ е! а1., 2007, Р1ап! §с1епсе, 173:478486), лук репчатый (Ууп е! а1., 1998, Р1ап! РЬу8ю1оду, 117:1507-1513), плевел многолетний (Ьа88еиг е! а1., 2009, 1оигпа1 оГ Е.хрептеШа1 Во!апу, 57 (11):2719-2734) и пшеница мягкая (8сЬгоеуеп е! а1., 2008, Ые\у РЬу!о1од18!, 180:822-831). Некоторые из этих генов были экспрессированы в Рю1йа ра8Юп8 для проведения фундаментальных исследований, в основном направленных на определение субстратной специфичности, механизма действия ферментов и состава полученных продуктов в экспериментах ш уйго, проведенных в лабораторных условиях (А1!епЪасЬ е! а1., 2004, РЕВ8 Ьейег8, 567:214-218). Во всех вышеуказанных ссылках был использован промотор алкогольоксидазы I (рАОХ1) для индукции экспрессии трансгена в Р.ра81оп8. Выбор этого индуцируемого метанолом промотора является нежелательным для процессов промышленного масштаба из-за очень большого количества метанола, необходимого во время дрожжевого брожения. Метанол является легковоспламеняющимся и высокотоксичным, поэтому его использование запрещено в производстве пищевых продуктов и пищевых ингредиентов. В этих экспериментах изучали только способность фермента сахароза:сахароза-1-фруктозилтрансферазы (1-88Т) катализировать синтез 1-кестозы при сравнительно низких концентрациях сахарозы в диапазоне от 0,1 до 0,15 М (от 34,2 до 51,3 г/л). Также было установлено, что данный фермент способен гидролизовать или дополнительно полимеризовать 1-кестозу (Ьи8сЬег е! а1., 2000; Р1ап! РЬу8ю1оду, 124 (3):1217-1227; Ауба-Регпапбе/ е! а1.; 2007, Р1ап! 8аепсе 173:478-486). Очень низкие выходы ферментов 1-88Т, продуцированных РюЫа, были получены за счет проблем, связанных с деградацией и нестабильностью.

До настоящего времени отсутствуют сообщения, касающиеся применения ферментов растительного происхождения, или природных, или рекомбинантных, для получения 1-кестозы из сахарозы в промышленных масштабах.

В промышленных масштабах был использован только сок растений цикория обыкновенного и полимнии остролистной, состоящий из смеси ФОС различной СП, где 1-кестоза не является основным компонентом (Ошо е! а1., 2009, Кесеп! Ра!еп!8 оп Рооб, Хи!гЙ1оп&Адг1си1!иге, Уо1. 1, Ыо. 3). Такие факторы, как низкий выход, низкий уровень выделения во внеклеточную среду и деградация под действием протеаз во время его экспрессии с использованием технологии рекомбинантной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в сочетании с нестабильностью фермента, способствовали применению грибов или ферментов РТР, продуцируемых из них, в промышленном получении ФОС.

- 2 028094

Применение конститутивных промоторов для получения РТР растительного происхождения из ИсЫа ра51оп5 не описано. Это наиболее подходящий вариант для получения в промышленных масштабах рекомбинантных ферментов с применением в пищевой промышленности.

Мембранные биореакторы (МБР) широко используются для оборотного водоснабжения предприятий, очистки сточных вод для небольших комплексов, обработки промышленных отходов, обработки сточных вод свалок и т.п. Пибб 8., 2008, Тгепб5 ίη Вю!есйпо1о§у, 25 (2):109-116). Только в двух сообщениях приводится описание непосредственного применения МБР для получения ФОС (БапсНе/ е! а1., 2008; Рооб апб Ъюртобис!5 ртосе55ш§, 86, 109-115). В одном из них мембраны используются для выделения микроорганизмов из реакционной смеси, содержащей ФОС, в которой 1-кестоза не является основным продуктом. Аналогичный биореактор использовался для удаления через нанофильтрационную мембрану выделенной глюкозы (которая ингибирует синтез ФОС) неиммобилизованной β-фруктофуранозидазой А.шдет АТСС 20611 в серийной реакции, где начальная концентрация сахарозы составляла 300 г/л и продукт 1-кестоза доходил до обеспечения 38,7% от общего объема фракции ФОС (Νί5ΐιίζ;·ι\ν;·ι е! а1., 2001; Рооб 8с ТесН ге5. 7.1, 39-44). В этих условиях промышленное получение 1-кестозы не является рентабельным. Отсутствуют документы или патенты, указывающие на применение МБР для непрерывного получения 1-кестозы из сахарозы с повторным использованием растворимой фруктозилтрансферазы любого происхождения.

Остается большой интерес к разработке способов и технологий для рентабельного получения 1-кестозы в промышленных масштабах.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение решает вышеуказанную проблему разработкой способа получения 1-кестозы из сахарозы в промышленном масштабе простой, дешевой, эффективной и промышленно масштабируемой технологией. Способ по изобретению отличается превращением сахарозы в 1-кестозу в биореакторе, где рекомбинантный фермент РТР выделяли из Р.атипбтасеа и конститутивно экспрессировали в несахаролитических дрожжах, используемых в качестве рекомбинантного хозяина.

Способ, впервые описанный в настоящем изобретении, комплексно направлен на решение основных технологических ограничений, существующих в процессе получения ФОС из сахарозы, в частности ограничений, связанных с получением 1-кестозы. Описанный метод охватывает две основные стадии способа: 1) получение фермента или биокатализатора и 2) получение 1-кестозы.

Для целей настоящего изобретения промышленный масштаб определяется как масштаб получения 1-кестозы, при котором полный или частичный объем полученного продукта используется в промышленном масштабе. Для этих целей можно использовать современное подходящее оборудование, имеющееся на рынке.

В контексте настоящего изобретения несахаролитические дрожжи определяются как дрожжи дикого типа или мутированные дрожжи, не обладающие эндогенной активностью, посредством которой гидролизуется или полимеризуется сахароза. Примерами таких дрожжей являются метилотрофные дрожжи Р.ра51от15, Нап5епи1а ро1утогрНа и мутантный штамм дрожжей 8ассНаготусе5 сетеу151ае Υ8Η 2.64-1А (Кейт е! а1., 1998, 1оитпа1 о! Вас!етю1о§у, 180 (5):1305-1310).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения РТР представляет собой сахароза:сахароза-1-фруктозилтрансферазу (1-88Т). В изобретении 1-88Т, полученная технологией рекомбинантной ДНК, называется 1-88Тгес. Для оптимизации стадии получения фермента данное изобретение начинали с отбора и идентификации растительных РТР, типа 1-88Т, выделенных из овсяницы тростниковой (Р.атипФпасеа), лука (А.сера) и голубой агавы (АДес.|ш1апа) соответственно. Такой подход отсутствовал в литературе предшествующего уровня, связанной с промышленным получением ФОС. Гены, кодирующие каждый из указанных ферментов, клонировали в экспрессионную кассету для генетической модификации дрожжей Р.ра51оп5. Несмотря на возможные производственные ограничения этих дрожжей для применения в качестве хозяина для промышленного производства, например ограничение в отношении содержания растворенного кислорода в процессе их роста, эти дрожжи отвечают требованиям отсутствия эндогенных ферментов, обладающих способностью взаимодействовать с сахарозой или фруктанами, и они считаются подходящими в качестве хозяина для биотехнологических целей. Р.ра51оп5 могут достигать высоких выходов биомассы при культивировании в контролируемых условиях в ферментерах, и известна их способность к продуцированию и секреции гетерологичных белков на высоком уровне в культуральную среду. Дрожжи имеют статус СКА8 с точки зрения требований по биологической безопасности в пищевой промышленности. Следовательно, вышеуказанный способ получения 1-кестозы, в котором несахаролитические дрожжи представляют собой штамм Р.ра51оп5. является частью настоящего изобретения.

На первой стадии данного исследования был успешно использован промотор алкогольоксидазы I (рАОХ1) для индукции экспрессии трансгена 1-88Тгес. Однако использование такого индуцируемого метанолом промотора недопустимо для процессов промышленного масштаба за счет очень большого количества метанола, необходимого во время дрожжевого брожения. Метанол также является легковоспламеняющимся и летучим. С другой стороны, его использование запрещено в производстве пищевых продуктов и пищевых ингредиентов. Неожиданно было установлено, что экспрессия гена 1-88Т

- 3 028094

Р.агипЫпасеа под транскрипционным контролем промотора глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (рСАР) не вызывала токсичность для клеток и обеспечивала получение больших количеств биомассы и высоких уровней экспрессии фермента, секретируемого во внеклеточную среду, чем две других РТР, тестированных в данном изобретении. Это первое сообщение в отношении использования такого конститутивного промотора для экспрессии растительного гена РТР.

Три трансформанты Р.ра81оп8 каждой из вышеуказанных конструкций оценивали на получение биомассы и активность фруктозилтрансферазы в периодических ферментациях с добавлением субстрата. После культивирования дрожжей в 5-литровых ферментерах в течение 72 ч культуральные бульоны центрифугировали и получали две фракции: одна фракция интактных клеток или биомассы и другая фракции культурального супернатанта. Определяли ферментативную активность обеих фракций инкубацией с 0,87 М раствором сахарозы (300 г/л) в 0,02 М натрий-ацетатном буфере с рН 5,5 при 30°С в течение 30 мин. В указанных условиях три трансгенных клона дрожжей, несущих ген 1-88Т Р.агипЬшасеа, демонстрировали самые высокие уровни активности в обеих, внутриклеточной и внеклеточной, фракциях, проявляя более высокую активность по сравнению с наблюдаемой для остальных анализированных ферментов. Неожиданно было установлено, что 1-88Тгес, выделенная из Р.агипЫпасеа, была более стабильной, чем ее гомологи, выделенные из лука и агавы, что обеспечивает получение 1-кестозы в большом масштабе.

С целью повышения выхода 1-88Тгес многочисленные копии экспрессионной кассеты 1-δδΤ Р.агипЫиасеа вставляли посредством двойной или одиночной гомологичной рекомбинации в геном дрожжевого хозяина, после последовательной серии стадий повторной трансформации и обширного скрининга клонов на активность РТР. Постепенное увеличение дозы трансгена оказывало дополнительное влияние на выход 1-88Тгес без ингибирования роста клеток. Отобранный клон, названный СЮВ 308, содержит не менее девяти копий гена, стабильно интегрированных в геном, что было определено саузерн-блоттингом с использованием гена, кодирующего 1-88Т, и 5'-области резидентного локуса АОХ1 в качестве гибридизационных зондов. Установленные паттерны гибридизации обеспечивают точную идентификацию мультикопийных штаммов Р.ра81оп8, в том числе отобранного клона СЮВ 308. Следовательно, способ получения 1-кестозы в промышленном масштабе, в котором штамм Р.ра81оп8 содержит многочисленные копии гена, кодирующего 1-88Т, интегрированные в геном, также является объектом настоящего изобретения.

При культивировании штамма Р.ра8Юп8 СЮВ 308 в ферментере получают фермент 1-§§Тгес. При этом применяют ферментер с периодическим, непрерывным или подпитываемым режимом работы с использованием культуральной среды с добавлением дрожжевого экстракта, микроэлементов и витаминов, а также используя в качестве источника углерода глицерин или глюкозу. Однако предпочтительным является использование сахарозы или содержащего ее сырья, так как более высокие производственные выходы получают с указанным субстратом.

Таким образом, в одном аспекте изобретения РТР, использованную в получении 1-кестозы в промышленном масштабе, получают из культурального супернатанта и/или клеточного осадка Р.ра81оп8. В варианте осуществления изобретения РТР получают культивированием рекомбинантного дрожжевого хозяина в ферментере с использованием периодического, непрерывного или подпитываемого режима работы. В конкретном варианте осуществления источник углерода, используемый для дрожжевой культуры, представляет собой соединение, выбранное из глицерина, глюкозы и сахарозы любой степени чистоты.

Активность внеклеточной 1-§§Тгес, достигнутая в настоящем изобретении (~100,0 ед./мл бесклеточного культурального супернатанта), предпочтительно является аналогичной среднему уровню, описанному для ферментов плесневых грибов (Эпоисй е! а1., 2010, Арр1. МюгоЪюй Вю!есйпо1. 87:2011-2024), и это намного выше, чем значения, описанные для РТР другого происхождения, экспрессируемой в дрожжах (Тгир11о е! а1., 2002; Айшйу, 59 (500):365-370; Кейт е! а1., 1998, 1оита1 о£ Вас!ег1о1о§у, 180 (5):1305-1310). Относительно активности внутриклеточной фракции сочетание высокой активности с высокой плотностью клеток обеспечивает выходы биомассы, которые превосходят 38000 ед./л культуры, что в 6 или 7 раз выше самых высоких значений, описанных в литературе для ферментов плесневых грибов (Эойа е! а1., 2006; 1оигпа1 о£ 1пЬи81па1 МюгоЪю1о§у апЬ Вю!есйпо1о§у. 33 (12):1003-1009).

Несмотря на уже перечисленные ограничения для получения Р.ра8!ог18, посредством выбора Р.ра8!ог18 в качестве хозяина для экспрессии рекомбинантной 1-§§Тгес преодолеваются технические вышеописанные ограничения, касающиеся использования грибов, как природных источников РТР. С другой стороны, с точки зрения требований биологической безопасности Р.ра81оп8 имеет статус ОКА§ организма для пищевой промышленности.

В одном варианте осуществления изобретения превращение сахарозы в 1-кестозу в промышленном масштабе проводят с использованием концентрации субстрата более чем 400 г/л. В конкретном варианте осуществления изобретения превращение сахарозы в 1-кестозу осуществляется с использованием свободной или иммобилизованной 1-88Т.

В другом аспекте изобретения превращение сахарозы в 1-кестозу проводится в мембранном, с неподвижным слоем или с механическим перемешиванием биореакторе. В конкретном варианте осуществ- 4 028094 ления мембранный биореактор работает в непрерывном или полунепрерывном режиме.

Кроме того, целью настоящего изобретения является ферментный препарат для промышленного превращения сахарозы в 1-кестозу, содержащий 1-88Т, выделенную из Р.агипйшасеа, конститутивно экспрессированную в несахаролитических дрожжах.

Для целей настоящего изобретения ферментный препарат определяется как жидкий или твердый препарат с ферментативной активностью и обладающий способностью взаимодействовать с определенным субстратом, превращая его в продукт.

В одном варианте осуществления изобретения сахаролитические дрожжи, используемые для получения 1-88Тгес, представляют штамм собой Р.раЧопе. В конкретном варианте осуществления указанный штамм Р.раеЮпе содержит многочисленные копии гена, кодирующего 1-88Т, интегрированные в его геном. Из этой культуры дрожжей 1-ЗЗТгес получают в культуральном супернатанте и/или в клеточном осадке. Согласно цели настоящего изобретения 1-88Т можно использовать в жидком или твердом состоянии в виде свободного или иммобилизованного фермента. В одном варианте осуществления изобретения концентрация сахарозы, которая применяется в способе промышленного получения 1-кестозы с использованием ферментных препаратов, содержащих 1-88Т, составляет более чем 400 г/л.

Как показано в примерах применения, препараты 1-88Тгес в жидком или твердом состоянии в свободной или иммобилизованной форме, полученные из культурального супернатанта или биомассы клеток штамма Р.раеЮпе СЮВ 308 с использованием общепринятых методов очистки, сублимационной сушки и иммобилизации белков, проявляют достаточную термостабильность при хранении и продаже без необходимости охлаждения. Наконец, за счет этой особенности такие препараты можно использовать в качестве биокатализаторов для промышленного получения ФОС, обеспечивая вторую стадию способа получения 1-кестозы по изобретению. Ферментные препараты по изобретению в своих различных формах имеют общее преимущество, заключающееся в том, что в присутствии сахарозы в качестве субстрата они способны продуцировать ФОС со скоростью превращения выше 55%, когда 1-кестоза, в частности, составляет более 90% от общего объема фракции ФОС.

В одном варианте осуществления изобретения реакция синтеза 1-кестозы происходит при следующих условиях: 200-800 г/л сахарозы, предпочтительно 600 г/л; рН от 4,0 до 7,0, оптимальный 5,5; температура 30-50°С, предпочтительно 40°С; расход фермента/субстрата 2-40 ед./г в течение времени реакции от 1 до 24 ч, предпочтительно от 15 ед./г в течение 3-часовой реакции. Данные условия применимы к жидким или твердым препаратам 1-88Тгес, независимо от типа биореактора и режима работы, которые используются для получения ФОС.

С помощью способа по настоящему изобретению преодолеваются ограничения, которые отражают уровень техники в отношении способа промышленного получения ФОС, в частности 1-кестозы. Рекомбинантный растительный фермент используется вместо применения грибов или грибковой РТР, и неожиданно было установлено, что указанный фермент в отличие от других растений, продуцирующих РТР, стабильно секретируется на высоком уровне Р.раеЮпе и эффективно продуцирует 1-кестозу в результате его воздействие на сахарозу. До настоящего изобретения рекомбинантные растительные ферменты не использовались для промышленного получения ФОС. С другой стороны, в технологиях применения реактора с механическим перемешиванием, обычно используемых для промышленных ферментативных реакций, фермент используется только один раз, что приводит к низкой производительности, колебаниям показателей качества продукта (за счет отсутствия стабильности от партии к партии) и тому подобному. В варианте осуществления изобретения применение мембранного биореактора, работающего как в периодическом, так и в непрерывном или последовательном режимах (предпочтительно последнее), позволяет повысить производительность, поскольку за меньший период времени достигаются превращения, аналогичные полученным в реакторе с механическим перемешиванием, и где более чем 55% сахарозы превращается в ФОС, при содержании 1-кестозы, составляющем 90% от состава ФОС. Полученные результаты превосходят предшествующие сообщения и решают недостатки существующих технологий для промышленного получения ФОС, все они основаны на использовании мицелиальных грибов. С другой стороны, для способа по изобретению требуется более низкая инвестиционная стоимость, более низкое потребление энергии, сниженный расход фермента на количество продуцируемой 1-кестозы и сокращается количество операций при очистке готового продукта.

Как указано выше, с помощью применения способа по изобретению преодолеваются ограничения, существующие в описанных способах получения ФОС, для любого микроорганизма и любого типа реактора.

Впервые 1-88Т Р.агипйшасеа используется для промышленного получения 1-кестозы. Отсутствуют сообщения о промышленном получении ФОС с использованием рекомбинантной растительной РТР. Неожиданно было обнаружено, и в отличие от тестированных РТР из других растений, что данный фермент стабильно продуцируется на высоком уровне, и он выделяется в культуральную среду дрожжевого хозяина Р.раЧопе. В дополнение к этим технологическим преимуществам рекомбинантный фермент по изобретению в основном продуцирует 1-кестозу в результате его воздействия на сахарозу при концентрации более чем 400 г/л.

- 5 028094

Ферменты плесневых грибов также катализируют синтез этого трисахарида, но его используют практически с начала реакции в качестве субстрата для получения 1-нистозы и фруктозилнистозы, что проверяется по отношению к конечному выходу 1-кестозы.

С другой стороны, в настоящее время отсутствуют поставщики РТР для серийного производства ФОС на международном рынке. Способ по изобретению создает новую технологию с низкой стоимостью для промышленного получения рекомбинантного растения, которое продуцирует очень большое количество 1-кестозы, способствуя коммерческой доступности данного типа ферментов. Неожиданно было установлено, что использование рекомбинантной РТР Р.агииФиасеа имеет в качестве дополнительного преимущество, которое удешевляет процесс получения ФОС, в частности 1-кестозы, по сравнению с описанным ранее применением других технологий получения ФОС.

Таким образом, изобретение относится к способу получения 1-δδΤ в промышленном масштабе, отличающемуся тем, что микроорганизм, культивированный в ферментере, представляет собой несахаролитические дрожжи, содержащие многочисленные копии гена, кодирующего 1-δδΤ Р.агииФиасеа, интегрированные в геном. Рекомбинантные дрожжи конститутивно экспрессируют ген, кодирующий 1-δδΤ. В одном варианте осуществления изобретения несахаролитические дрожжи, конститутивно экспрессирующие ген, кодирующий 1-δδΤ, представляют собой штамм Р.раЛопх. Для целей настоящего изобретения рекомбинантную 1-δδΤ получают из супернатанта и/или клеточного осадка культуры Рра8Юп8.

Для целей настоящего изобретения промышленный масштаб получения 1-δδΤ представляет масштаб, который включает культивирование в ферментерах рекомбинантного штамма, продуцирующего 1-δδΤ, полный или частичный объем которого превышает 10000 ед. фермента.

В отличие от сообщений, обнаруженных в специальной литературе, в одном варианте осуществления изобретения впервые применение указанного растительного ΡΤΡ комбинируется с использованием мембранного биореактора. Такая комбинация позволяет оптимизировать процесс для получения высоких выходов ФОС и 1-кестозы. Результаты, полученные с указанной комбинацией, оказались неожиданными, т.е. с более высокими значениями выхода, чем теоретически рассчитанные с помощью математических моделей. Кроме того, с помощью данного способа устраняются установленные отсутствие стабильности от партии к партии и вариабельность продукта при использовании других типов реакторов. Это позволяет повторно использовать растворимую ΡΤΡ и тем самым обеспечить подходящие с техникоэкономической точки зрения соотношения фермент-субстрат, которые в 10 раз выше, чем при применении реакторов с механическим перемешиванием. Два этих преимущества приводят к сокращению времени реакции до 3 ч, повышению производительности за день по меньшей мере в 5 раз по сравнению с применением реактора с механическим перемешиванием, следовательно, снижению затрат на производство. Кроме того, сокращаются операционные стадии и требуется меньше физической площади для производственного процесса.

Другим аспектом настоящего изобретения является продукт питания для человека или животного, который содержит 1-кестозу, полученный способом по изобретению, который отличается превращением сахарозы в 1-кестозу в биореакторе с использованием рекомбинантной ΡΤΡ, выделенной из Р.агииФиасеа, конститутивно экспрессированной в несахаролитическом дрожжевом хозяине. В конкретном варианте осуществления такой продукт питания для человека или животного с пробиотиком вносится в рецептуру симбиотических препаратов, которые используются в качестве нутрицевтика.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Графическое представление экспрессионных кассет, полученных в результате вставки генов, кодирующих соответствующий фермент 1-δδΤ, из овсяницы тростниковой (1-88ίί), лука (1-881с) и голубой агавы (1-881а). в вектор ρΟΑΡΖα.Λ.Β.ί'.'. Соответствующие плазмиды были обозначены как ρ1-δδΤΡ (1-δδΤ овсяницы тростниковой), ρ1-δδΤ0 (1-δδΤ лука) и ρ1-δδΤΑ (1-δδΤ голубой агавы) соответственно. Р_САР: промотор САР, δΡ: сигнальный пептид α-фактора δ;κΗι;·ιΐΌΐη\^8 сегеу!81ае, Ηΐ86: полигистидиновая метка, ТТ: терминатор транскрипции АОХ1 РюЫа ρ;·ΐ8ΐοπ8.

Фиг. 2. Методы, использованные при конструировании плазмиды ρ1δδΤΡ6χ+6 дополнительных копий экспрессионной кассеты для конститутивной экспрессии гена 1-88ίί на высоком уровне в штамме РюЫа ρ;·ΐ8ΐοπ8 Сδ115. А - Конструкция с одной копией гена. В. Конструкция с шестью копиями гена, отбор комплементацией гена гистидин4. С - Конструкция с девятью копиями гена и резистентностью к гигромицину. Р_САР: промотор САР, 5'АОХ1: промотор алкогольоксидазы, δΡ: сигнальный пептид α-фактора δассΗа^οтусе8 сегеу!81ае, Ηΐ86: полигистидиновая метка, ТТ: терминатор транскрипции АОХ1, Ηΐ84: немутированный ген гистидин 4.

Фиг. 3. Динамика синтеза ФОС ферментом 1-δδΤι^ в реакторе с механическим перемешиванием при периодическом режиме работы. Условия реакции: 1-δδΤι^: 9000 ед./л, сахароза 600 г/л в 0,1 М натрий-ацетатном буфере (рН 5,5); температура 40°С, скорость перемешивания 250 об/мин, время реакции 6 ч. Условные обозначения: 1-кестоза (СР₂), нистоза (СР₃), общее содержание ФОС (ФОС = сумма СР₂ и СР₃); сахароза (СР); глюкоза (С); фруктоза (Р).

Фиг. 4. Хроматограммы ВЭЖХ, показывающие состав полученных продуктов в пробах, отобранных в разное время реакции (ΐ_Γ): А - Смесь стандартных образцов нистозы (СР₃), 1-кестозы (СР₂), сахаро- 6 028094 зы (СР), глюкозы (С) и фруктозы (Р). В - Синтез ФОС 1-88Ттес на время реакции ΐ_Γ=0. С - 1,= 180 мин. Ό - ΐ_Γ=360 мин.

Фиг. 5. Схематическое изображение системы, предназначенной для получения ФОС в мембранном биореакторе.

Фиг. 6. Динамика синтеза 1-кестозы ферментом 1-§§Ттес в мембранном биореакторе в течение 3 последовательных циклов полунепрерывного режима работы. Условия реакции: 1-§§Ттес 9000 ед./л, сахароза 600 г/л в 0,1 М натрий-ацетатном буфере (рН 5,5); температура 40°С, скорость перемешивания 250 об/мин. Последовательность операций: цикл № 1 - реакция непрерывного синтеза в течение 3 ч и выделения (Ό) в течение 30 мин; циклы № 2, 3 - реакции непрерывного синтеза в течение 2,5 ч и выделения (Ό) в течение 30 мин.

Фиг. 7. Хроматограммы ВЭЖХ, показывающие состав полученных продуктов в пробах, отобранных после каждого последовательного цикла синтеза ФОС в мембранном биореакторе при полунепрерывном режиме работы: А - Цикл № 1. В - Цикл № 2. С - Цикл № 3. Условные обозначения: нистоза (СР₃), кестоза (СР₂), сахароза (СР), глюкоза (С), фруктоза (Р).

Примеры

Пример 1.

Сравнительное определение уровней активности фруктозилтрансферазы (РТР), проявляемых тремя сахароза:сахароза-1-фруктозилтрансферазами (1-88Т) из растений, полученных в РюЫа раЯогй

Для сравнения уровней активности РТР трех вышеуказанных ферментов кДНК, кодирующие фермент 1-δδΤ из овсяницы тростниковой (Редиса атипбшасеа), лука (АШит сера) и голубой агавы (Адате Текилана), выделяли из их естественных хозяев полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием праймеров, описанных ранее в литературе [Ууп е! а1. 1998, Тйе Р1ап! .Гоигпаф 11:387-398; Ьиксйег е! а1. 2000, Р1ап! РЬу8ю1оду, 124:1217-1227; АуПа-Регпапбе/ е! а1. 2007, Р1ап! 8с1епсе, 173:478-486].

Амплифицированные ПЦР-продукты, соответствующие ДНК, кодирующим зрелый фермент (размеры: 1-88Т овсяницы: 1668 п.н., 1-88Т лука: 1668 п.н. и 1-88Т агавы: 2026 п.н.), сливали на их 5'-конце, в правильной рамке считывания, с сигнальным пептидом α-фактора §.сетеу181ае, и на 3'-конце с последовательностями, кодирующими тус-эпитоп и метку из шести остатков гистидина, находящихся в промышленно доступном векторе рСАР2аС (1пуйтодеп, лук-порей, Голландия). Этот промышленно доступный вектор позволяет провести отбор полученных трансформантов по резистентности к антибиотику зеоцину.

В трех полученных конструкциях, обозначенных р1-§§ТР (1-88Т овсяницы), р1-1§§ТС (1-88Т лука) и р1-§§ТА (1-88Т агавы), химерные гены, кодирующие три фермента 1-88Т, помещали под транскрипционный контроль промотора САР и терминатора транскрипции алкогольоксидазы 1 (АОХ1ТТ), как показано на фиг. 1.

Три конструкции расщепляли в одном сайте рестрикции ΑντΙΙ в промоторе САР и вставляли электропорацией в геном штамма дрожжевого хозяина Х-3 3. В результате получали примерно 20 трансформантов для каждой конструкции после культивирования на среде УР с добавлением 2% глицерина и зеоцина 100 мг/мл. Для сравнительного исследования 3 клона, резистентных к зеоцину, каждого из трех вариантов культивировали в 5-литровом (рабочий объем) ферментере до достижения клетками стационарной фазы. В каждый ферментер засевали по 200 мл инокулята каждого клона, предварительно культивированных в шейкере.

Для поддержания содержания растворенного кислорода выше 20% на первой стадии ферментации перемешивание автоматически увеличивали от 500 до 900 об/мин и аэрацию поддерживали на уровне 1 ууш (объем воздуха/объем среды/мин). После повышения содержания растворенного кислорода, показателем которого было истощение глицерина, начинали вторую стадию подпитки.

Для начала второй стадии поток воздуха увеличивали до 2 об./об./мин и культуру подпитывали 1,5 л добавочного раствора (с тем же исходным источником углерода) со скоростью потока от 5 до 7 мл/л/ч, что контролировали по изменению содержания растворенного кислорода. Не наблюдали какихлибо токсических эффектов в течение 72 ч культивирования для рекомбинантных штаммов или штаммов дикого типа, культивированных в аналогичных условиях.

Затем конечную культуру разделяли центрифугированием с получением двух фракций, клеточного осадка (или биомассы) и культурального супернатанта. Пробы по 0,2 мл обеих фракций подвергали взаимодействию в течение 30 мин с раствором сахарозы с концентрацией до 300 г/л (0,87 М). Концентрацию глюкозы, выделенной в результате реакции трансфруктозилирования сахарозы, использовали в качестве показателя уровня активности рекомбинантных клонов РТР.

Интенсивность реакции трансфруктозилирования была определена по калибровочной кривой, которая устанавливает зависимость изменения в окраске проб от определенного количества глюкозы. Относительно высокая активность (пробы становились красными с интенсивностью, эквивалентной концентрации глюкозы выше 5,5 мМ) наблюдалась после 30-минутных реакций интактных клеток и проб культурального супернатанта из трех клонов, экспрессирующих ген 1-88Т овсяницы тростниковой. В противоположность, ни один из клонов, несущих или ген 1-88Т лука, или ген 1-88Т голубой агавы, не показал

- 7 028094 детектируемой активности после 30-минутных реакций. Незначительная активность детектировалась (изменение цвета пробы до светло-розового, эквивалентного концентрации глюкозы в диапазоне 0,5-5,5 мМ) только после более длинной инкубации в течение 3 и 5 ч.

Пример 2.

Средние значения анализированных параметров во время проведения ферментации трех клонов с одной копией гена 1-δδΐί с высокой РТР активностью.

Три клона, несущие одну копию 1-δδΐί, вставленную в свой геном, сравнивали на уровне ферментера с использованием тех же экспериментальных условий, которые описаны в примере 1.

Таблица 1

Сравнение анализированных параметров, полученных во время ферментации трех клонов с высокой активностью 1-88Тгес

Параметр	Значение
Выход биомассы (г/л культуры)	3 6 6+4
внутриклеточная активность 1-ЗЗТгес (Ед/г влажной биомассы)	4,3+0,2
внеклеточная активность 1-ЗЗТгес (Ед/л культурального супернатанта)	3,7+0,1
Время культивирования (ч)	69
Общая активность 1-ЗЗТгес (Ед/л культуры)	3955+211
Общая активность 1-ЗЗТгес в биомассе (Ед/л культуры)	1573, 8+25, 6
Продуктивность биомассы по активности (Ед/л/ч)	22,8

Одна единица 1-88Тгес (ед.) представляет собой количество фермента, которое выделяет 1 мкмоль глюкозы в минуту при взаимодействии с 50% (1,46 М) раствором сахарозы в 0,1 М натрий-ацетатного буфере (рН 5,5) в течение 30 мин при 30°С. Данные, приведенные в табл. 1, представляют собой средние значения анализированных параметров, полученных в трех ферментациях, соответствующих каждому исследуемому клону ± стандартное отклонение.

Продуктивность этих трех клонов была в 2 раза выше при использовании конститутивной экспрессионной системы по сравнению с полученной с метанол-индуцируемой системой за счет того, что была достигнута более высокая концентрация клеток (366 г/л) в течение более короткого периода времени культивирования (69 ч).

Пример 3.

Повышение активности 1-88Тгес интеграцией многочисленных копий экспрессионной кассеты гена 1-δδΐί в локус АОХ1 Р1еЫа ραδΐοπδ.

Для разработки рентабельной технологии промышленного производства для получения ФОС требуются высокие уровни активности 1-88Тгес, следовательно, возникает потребность в увеличении дозы гена в дрожжевом хозяине.

Для получения многочисленных копий в тандеме экспрессионной кассеты плазмиду р1-88ТР, которая содержит только одну копию экспрессионной кассеты, содержащей ген 1 -δδΐί в своем геноме, расщепляли с использованием рестриктаз ВатН1 и Вд111. Из агарозного геля вырезали полученную полосу, соответствующую 2,82 т.п.н., содержащую экспрессионную кассету, и повторно лигировали с использованием Т4-лигазы.

Лигирование с помощью Т4-лигазы сайтов рестрикции ВатН1 (С-САТСС) и Вд111 (А-САТСТ) генерирует гибридную область с последовательностью ССАТСТ, которая не распознается ни одним из этих двух ферментов. Во время реакции лигирования два эти фермента, ВатН1 и Вд111, добавляли для облегчения соединение разных концов. Вырезали полосу, соответствующую 5,64 т.п.н., содержащую две копии экспрессионной кассеты, и вновь обрабатывали ферментами ВатН1 и Вд111, чтобы гарантировать соединение экспрессионных кассет в том же направлении транскрипции.

Данную последовательность вставляли в ту же плазмиду р1-88ТР, расщепленную ВатН1 и дефосфорилированную щелочной фосфатазой. Новая полученная конструкция (р1-88ТР3х) несет три копии в тандеме экспрессионной кассеты. Р1-88ТР3х расщепляли с использованием рестриктаз ВатН1 и Вд111, вырезали полосу, соответствующую 8,46 т.п.н., и повторно лигировали, как описано на предыдущей стадии. Последовательность, соответствующую 16,92 т.п.н., вставляли в вектор рАО815, расщепленный ВатН1 и дефосфорилированный щелочной фосфатазой.

Данный вектор позволяет отбирать трансформанты Р.ρаδΐοπδ 08115 комплементацией по ауксотрофии Ηϊδ4. Полученная плазмида (р1-88ТР6х) содержит шесть копий экспрессионной кассеты, расположенных в тандеме и том же направлении транскрипции, вставленных между промотором АОХ1 и

- 8 028094

3'-фрагментом локуса АОХ1 области терминатора (фиг. 2).

Данную плазмиду расщепляли Вд111 для трансформации электропорацией штамма Р.ра§1ог1§ 08115. Посредством такого расщепления два фрагмента, один, дающий полосу 22,23 т.п.н., несущий в центре шесть экспрессионных кассет в тандеме и ген, комплементирующий ауксотрофию по Ы§4, на 5'-конце представляет промотор АОХ1 и на З'-конце З'-фрагмент локуса АОХ1 области терминатора.

При использовании такой методики двойная гомологичная рекомбинация, которая заменяет локус АОХ1, является предпочтительной. Колонии штамма 08115, трансформированные плазмидой р1-88ТР6х, отбирали на минимальной среде ΥΝΒ с добавлением 2% глюкозы. Для оценки способности трансформантов использовать сахарозу в качестве источника углерода 93 колонии Ηΐ§4+ культивировали отдельно в 100-луночном планшете с агаром ΥΡ (рН 5,5) с добавлением 5% сахарозы и индикатора рН, бромтимолового синего 0,025%.

Клон О8115/р1-88ТР с одной копией гена 1-88Т (РР1х) использовали в качестве положительного контроля в этом эксперименте. Два клона, обозначенных РР6ХЬ, РР6Ха, меняли цвет среды от исходного зеленого (рН 5,5) до желтого (рН<6,0) в результате реакции трансфруктозилирования сахарозы при участии 1-88Тгес, в которой образовывалась молочная кислота за счет потребления микроорганизмами выделенной глюкозы из сахарозы. Такое изменение цвета среды происходило быстрее в мультикопийных штаммах, чем в штамме, несущем один ген. Данный факт свидетельствует о том, что мультикопийные клоны обладают большей ферментативной активностью, чем те, которые несут одну копию гена.

Для подтверждения этого результата мультикопийные клоны РР6ХЬ, РР6Ха и однокопийный клон РР1х культивировали в 10 мл жидкой среды ΥΡ с добавлением 2% глицерина в орбитальном шейкере в течение 24 ч при 28°С. Глюкозу, выделенную за счет активности РТР рекомбинантных ферментов во фракциях, соответствующих и осадку (биомассы или клеток), и культуральному супернатанту мультикопийных клоны и однокопийного клона, также определяли с использованием набора глюкоза-Триндер (8щша) на основе колориметрической реакции хромогенного ферментного комплекса оксидазы/пероксидазы/глюкозы аналогично тому, как описано в примере 1.

Два мультикопийных клона демонстрировали более высокую активность фермента, чем показанная однокопийным клоном (табл. 2), демонстрируя, что увеличение копий гена 1-88ί£, интегрированных в геном Р.ра§1ог1§, повышает активность 1-88Тгес в этих двух рекомбинантных штаммах. Клон РР6ХЬ демонстрировал активность 1-88Тгес в культуральном супернатанте на 31,4% выше, чем клон РР6Ха, и на 64,2% выше, чем однокопийный клон. В биомассе клон РР6ХЬ имел активность фермента на 18% выше, чем клон РР6Ха, и на 36% выше, чем однокопийный клон.

В табл. 2 показано влияние числа копий гена 1-88ί£ на ферментативную активность мультикопийных клонов Р.ра81ог18. В качестве контроля использовали штамм 08115 и однокопийный клон. Различные буквы справа от данных указывают на статистически достоверные различия, определенные простой классификации АNОVА с использованием статистического пакета 81а10гарН3. Средние значения активности фермента (п=3) сравнивали с использованием критерия Тьюки Η8Ό (р<0,01).

Таблица 2

Сравнение активности 1-88Тгес в одно- и мультикопийных клонах

	Удельная ферментативная активность (х10 ³ иАЕ/Р.0₆оо)
Штамм	Биомасса (В)	Культуральный супернатант (5)
65115	0,1081+0,0015^ά	0,1523+0,0017^ά
РР1Х	2,5813+0,0012^е	4,7830+0,0015^е
РРбХа	4,9717+0,0020^ь	9,1545+0,0021^ь
РРбХЬ	7,3548+0,0014^а	13,3512+0,001б^а

Единицы активности фермента/оптическая плотность, определенная при длине волны 600 нм (иАЕ/О.О600). Различные буквы обозначают статистически достоверные различия между активностями ферментов по сравнению друг с другом с использованием критерия Тьюки Η8Ό (р<0,01).

Согласно полученным результатам, представленным выше, мультикопийный клон РР6ХЬ продемонстрировал наиболее высокую активность 1-88Тгес и в биомассе, и в культуральном супернатанте, и в результате он был отобран для дальнейших экспериментов по экспрессии. С этого момента данный отобранный клон был переименован в РР6Х.

Пример 4.

Повышение активности 1-88Т повторной трансформацией мультикопийного клона РР6Х введением шести дополнительных копий экспрессионной кассеты в локус АОХ1.

Для повышения ферментативной активности клона 1-88Т РР6Х была сконструирована новая плазмида, обозначенная рАЕ8223. Для получения этой новой конструкции последовательность размером 16,92 т.п.н., содержащую шесть копий экспрессионной кассеты в тандеме и в том же направлении транскрипции, которые использовались для конструирования плазмиды Р1-88ТР6х, вставляли в вектор

- 9 028094 рР1СНаС ΑΟΧΙ-линкер, предварительно расщепленный ВатН1, и дефосфорилировали щелочной фосфатазой.

Этот вектор обеспечивает одну гомологичную рекомбинацию в ΑΟX1 промоторе Р.раПогЕ и дальнейший отбор трансформантов с антибиотиком гигромицином. После проверки этой генетической конструкции рестрикционным анализом и секвенированием ДНК проводили линеаризацию этой новой плазмиды с использованием фермента Нра I и повторно трансформировали клон РР6Х данной новой конструкцией с помощью электропорации клеток РР6Х. Этот фермент разрезает в определенном сайте ΑΟΧ1 промотор, что способствует интеграции в геном дрожжей одной гомологичной рекомбинацией в локусе ΑΟΧ1.

Трансформанты, содержащие более 6 копий экспрессионной кассеты, вставленные в геном дрожжевого хозяина, отбирали на твердой среде ΥΡ с добавлением гигромицина 2%, глицерина 0,2 г/л. Ферментативную активность в биомассе и в культуральном супернатанте для более чем 60 резистентных к гигромицину (Ηί§Κ) колоний определяли с использованием набора глюкоза-Триндер на основе колориметрической реакции хромогенного ферментного комплекса оксидазы/пероксидазы/глюкозы. В этот анализ также были включены штаммы РР6х и РР1х в качестве контроля.

Один клон резистентный к гигромицину, обозначенный СЮВ 308, демонстрировал наиболее высокую активность фермента 1-ЗЗТгес и в клеточном осадке, и в культуральном супернатанте. Этот новый клон проявлял более высокую ферментную активность в супернатанте (в 1,87 раз) и биомассе (в 1,76 раз), чем штамм РР6Х.

По сравнению с однокопийным штаммом активность 1-ЗЗТ клона СЮВ 308 была в 3,58 раза выше в супернатанте и в 2,41 раз выше в биомассе, подтверждая, что увеличение числа копий гена 1-551Г. стабильно интегрированных в хозяин, также увеличивает активность 1-ЗЗТ в дрожжевом хозяине. Результаты саузерн блоттинга показали, что в клоне СЮВ 308 было стабильно интегрировано 9 копий экспрессионной кассеты. Данные результаты свидетельствуют, что в случае повторной трансформации вставке подвергалось только три копии экспрессионной кассеты вместо ожидаемых 6 копий.

Пример 5.

Штамм Р.раПогЕ ОЮВ 308 обладает более высокой ферментативной активностью 1-ЗЗТ и показывает более высокую продуктивность, чем его предшественники РР1Х и РР6Х в масштабе ферментеров.

Клон Р.раПогЕ СЮВ 308 и его предшественники, с одной и шестью геномными интегрированными копиями экспрессионной кассеты (РР1Х, РР6Х) соответственно, культивировали в 7,5-литровых ферментерах с рабочим объемом 5 л, при 28°С, рН 5,5, 500-900 об/мин, с аэрацией 1,2 об./об./мин и контролировали содержание растворенного кислорода на уровне выше 20%. Независимо от различного числа интегрированных копий экспрессионной кассеты три рекомбинантных штамма демонстрировали аналогичные показатели роста.

После 19 и 20 ч культивирования исходное содержание глицерина уменьшилось, в то время как давление растворенного кислорода в пределах 20% контролировали постепенным увеличением скорости перемешивания от 500 до 900 об/мин. При уменьшении глицерина наблюдалось быстрое повышение содержания растворенного кислорода, и затем начали подпитку культуры 50% глицерином (об./об.) в течение 72 ч процесса ферментации.

В этих условиях культивирования общая биомасса, полученная от трех сравниваемых клонов, составляла 358±8 г/л сырой массы, так что можно предположить, что доза ген, а также производство и накопление рекомбинантного фермента не оказывали влияния на рост дрожжевого хозяина и не были токсичными для них.

Сразу же через 70-72 ч культивирования клон ОЮВ 308 демонстрировал самые высокие вне- и внутриклеточные активности 1-88Т, достигая максимальных значений соответственно 29,7±0,2 ед./мл культуры и 12,4±0,2 ед./мл культуры (34 ед./г сырой массы) соответственно. От общей активности 42,1±0,2 ед./мл, установленной после культивирования С1ОВ 308, 70,6% активности РТР было на основании полученных в этом сравнительном исследовании результатов решено отобрать клон С1ОВ 308 для массового получения 1-ЗЗТгее.

На момент появления настоящего изобретения в литературе отсутствовали сообщения, описывающие технологию ферментации для получения растительной 1-ЗЗТгес, конститутивно экспрессируемой из мультикопийного клона Р.раПогЕ.

Пример 6.

Технология культивирования с подпиткой для штамма РюЫа раПогЕ С1ОВ 308 с использованием сахарозы в качестве источника углерода.

Стоимость ферментации штамма Р.раПогЕ С1ОВ 308 снижается при использовании дешевого источника углерода иного, чем глицерин, такого как сахароза или глюкоза. Штамм Р.раПогЕ ОЗ115, используемый в качестве хозяина, не обладает инвертазной активностью, поэтому он не может использовать сахарозу в качестве источника углерода. Однако за счет новой активности РТР, полученной от дрожжевого хозяина, глюкоза выделяется в результате реакции трансфруктозилирования сахарозы, катализируемой 1-ЗЗТгес, и затем глюкоза метаболизируется непосредственно для роста рекомбинантного

- 10 028094 дрожжевого хозяина. Такая способность рекомбинантного штамма дрожжей позволяет снизить стоимость ферментации в процессе производства.

Ферментация сахарозы в партии с увеличенным содержанием культуры проводили в 75-литровом ферментере с рабочим объемом 50 л. Установленные параметры представляли: температура 28°С, рН 5,5, перемешивание 600 об/мин, аэрация 1,0 об./об./мин, рабочее давление 0,2 атм. Использованным источником углерода была сахароза в концентрации 50 г/л, содержащаяся в сахаре-рафинаде, или сахаресырце, или меде.

При истощении источника углерода (что детектировалось по повышению рН или повышению давления кислорода) приблизительно через 20 ч после начала ферментации добавляли раствор для подпитки (раствор того же источника углерода, используемого первоначально, но с концентрацией 500 г/л) со скоростью подпитки 8 мл/л/ч от первоначального объема культуры. Затем параметры ферментации повторно устанавливали на следующих значениях: перемешивание 800 об/мин, аэрация 1,5 об./об./мин, давление кислорода 0,4 атм. Ферментацию проводили в течение 72 ч.

При таких условиях культивирования полученные выходы биомассы были аналогичны, полученным с тем же клоном, но который культивировали на глицериновой среде. С другой стороны, общая ферментативная активность (после 72 ч культивирования) была значительно выше по сравнению с культивированием на сахарозосодержащей среде независимо от используемого исходного сахарозосодержащего материала.

Результаты культивирования штамма Р.раз1опз 308 СЮВ с использованием различных источников углерода приведены в табл. 3.

Таблица 3

Обобщенные результаты, полученные после культивирования штамма Р.раз1опз СЮВ 308 в ферментерах с использованием глицерина или сахарозы в качестве источника углерода

Источник углерода	Внеклеточный активность (Ед/мл бесклеточного супернатанта)	Внутриклеточная активность (Ед/мл культуры)	Общее количество Ед/мл культуры	Сырая масса (г/л)
Глицерин	29,7±0,2 (70,6%)	12,4±0,3 (29,4%)	42,1±0,4	361±4
Сахар- рафинад	101,6±9,5 (62,02%)	38,9±5,4 (37,98%)	102,4±11,3	375±9
Сахар- сырец	53,9±3,3 (46,3 %)	39,9±2,9 (53,7%)	74,2±3,1	363±4
Мед В	110,7±0,2 (58,5%)	49,6±5,1 (41,5%)	119,6±6,3	368±14

Значения в скобках представляют процент внутриклеточной и внеклеточной ферментативной активности штамма Р.раз1опз СЮВ 308 после 72 ч культивирования. Ферментная единица (Ед) представляет собой количество 1-88Тгес, которое выделяет 1 микромоль глюкозы в минуту с начальной скоростью реакции в растворе сахарозы 1,75 М, в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 5,5, при 30°С. Данные представляют собой среднее значение ферментации, проведенных с каждым источником углерода ± стандартное отклонение.

На основе этих результатов было сделано заключение, что и сахароза, и мед являются подходящими субстратами для осуществления промышленного получения этой рекомбинантной РТЕ. Пример 7

Получение фермента 1-88Тгес непрерывным культивированием.

В литературе отсутствуют какие-либо сообщения, в которых описано непрерывное получение рекомбинантных РТЕ, экспрессируемых на высоких уровнях в Р.раз1опз. Непрерывное получение 1-88Тгес проводили в 7,5-литровом ферментере ΙΝΕΟΚδ НТ с общим рабочим объемом 5 л. Установили и регистрировали следующие параметры в течение всего процесса культивирования с использованием программного обеспечения 1пз V 5.0: температуру поддерживали на уровне 28°С, в то время как значение рН 5,5 контролировали автоматическим добавлением ΝΗ₃ΟΗ (28% (об./об.)) и Н₃РО₄ (40% (об./об.)). Содержание растворенного кислорода поддерживали в течение всего процесса культивирования на уровне выше 20% автоматическим изменением скорости перемешивания (от 500 до 900 об/мин), потока воздуха (1-2 об./об./мин) и давления (0-0,7 атм).

Исходный объем составлял 3 л ферментационной среды, содержащей 22 г/л ΝΗ₄δΟ₄, 18,2 г/л К₂НРО₄, 7,5 г/л Μ§δΟ₄·7Η₂Ο, 0,5 г/л СаС1₂-2Н₂О, дрожжевого экстракта 5 г/л, следовые количества солей и витамины в достаточных количествах плюс сахарозу 50 г/л. Для стадии полунепрерывной подпитки использовали 1,5 л раствора сахарозы с концентрацией 500 г/л. На стадии непрерывного культивирования использовали среду, содержащую 200 г/л сахарозы, 2,5 г/л дрожжевого экстракта, 11 г/л ΝΗ₄δΟ₄, 9,1 г/л К₂11РО), 3,75 г/л Μ§δΟ₄ 7Η₂Ο, 0,25 г/л СаС1₂·2Η₂Ο; следовые количества солей и витамины.

Ферментер засевали 200 мл инокулята, предварительно культивированного в шейкере. После истощения источника углерода начинали стадию полунепрерывной подпитки и культуру подпитывали со

- 11 028094 скоростью потока в диапазоне от 7 до 30 мл/л/ч. При истощении подпитки непрерывное культивирование начинали подпиткой биореактора со скоростью 1 день-1 разведение (Ό). После достижения устойчивого состояния культивирование продолжали в течение 45 суток со средним выходом активности 70±5 ед./мл и концентрацией клеток 352± 11 г/л сырой массы.

Пример 8.

Определение оптимальных параметров реакции 1-ЗЗТгес для синтеза 1-кестозы.

Ферментный препарат, полученный в ферментере супернатант, подвергали фильтрации с использованием фильтра Загйсоп ЗНсе 200 (производства ЗаЧопиз) с мембраной Нубгозаг! (0,2 мкм), следуя инструкциям производителя. Затем фильтрат концентрировали в 10 раз диафильтрованием с использованием аналогичного оборудования, но с ультрафильтрационной мембраной Нубгозаг! (10 кДа) против 0,1 М натрий-ацетатного буфера с получением конечного препарата с активностью 1000 ед./мл. Необязательно фильтрат подвергали лиофилизации с получением твердого ферментного препарата с активностью более чем 8500 ед./г.

a) Определение оптимального рН для активности 1-ЗЗТгес.

Активность 1-ЗЗТгес определяли в диапазоне значений рН от 4 до 8. Реакцию проводили в течение 1 ч при 30°С в 0,87 М растворе сахарозы и 10 ед. фермента в конечном объеме 0,5 мл. Для диапазона значений рН от 4,0 до 5,5 использовали 0,1 М натрий-ацетатный буфер, а для рН в диапазоне от 6,0 до 8,0 0,1 М фосфатный буфер. Максимальные значения ферментативной активности 1-ЗЗТгес установили при значениях рН от 5,5 до 6,0.

b) Температура и оптимальная концентрация субстрата для синтеза ФОС.

Для определения этих параметров 60 Ед 1-ЗЗТгес подвергли взаимодействию в 0,1 М натрийацетатном буфере, рН 5,5 при концентрациях субстрата в диапазоне от 200 до 600 г/л, при 30°С, 40°С и 50°С соответственно, в конечном объеме реакционной смеси 10 мл при 250 об/мин. После 1-часовой реакции определяли состав сахаров в реакционной смеси с помощью ВЭЖХ. Для проведения хроматографии 20 мкл пробы наносили на колонку Аштех НРХ 42-С (производства ВюКаб, Шсйшопб) при скорости потока 0,6 мл/мин, давлении примерно 52 бар и рабочей температуре 81°С. В качестве подвижной фазы использовали воду и в качестве рефрактометрического детектора использовали дифференциальный рефрактометр Кпаиег. Сахар количественно определяли с использованием программного пакета ВюСгош версия 3.0, 1ОВС, 1996-1997.

В табл. 4 приведены состав и результаты количественного определения сахаров (%), установленные при различных условиях реакции, скорости синтеза 1-кестозы и соотношение трансфруктозилирования и гидролитической активности.

Максимальная скорость синтеза 1-кестозы с отсутствием гидролитической активности была достигнута при 40°С и концентрации сахарозы 600 г/л

Таблица 4

Влияние температуры и концентрации субстрата на синтез ФОС

	200 г/л
Температура	С	Г	СГ	СГ₂	СКз	Г(СЕ₂)	Нт/н
30°С	16, 0	0,5	39, 6	45, 8	0, 8	1,0	88
40°С	13,1	0,9	41,2	43,7	1,1	1,0	50
50°С	1,5	0, 0	91,2	6,7	0, 0	0,1	-
	400 г/л
Температура	С	Г	СГ	СГ₂	СКз	г(СЕ₂)	Нт/н
30°С	11,8	0,1	58,0	29, 9	0,3	1,3	585
40°С	11,0	0,4	48, 6	39, 3	0, 8	1,8	111
50°С	2,4	0, 0	86, 3	11,1	0, 0	0,5	-
	600 г/л
Температура	С	Г	СГ	сг₂	СКз	^Г(СЕ₂)	Н_т/н
30°С	6,9	0, 0	67,5	25,5	0, 0	1,8	-
40°С	9,9	0, 0	54,7	34,7	0, 8	2,4	-
50°С	7,3	0, 0	64,8	27,9	0, 0	1,9	-

Состав реакционной смеси после проведения 1-часовой реакции: глюкоза (О), фруктоза (Р), сахароза (ОТ), 1-кестоза (ОР2), нистоза (ОР3). Параметры реакции: (Г(_ОР2)) скорость синтеза 1-кестозы, указанная в г/мин, соотношение трансфруктозилирования и гидролитической активности (К_Т/_Н), выраженное отношением количества 1-кестозы и фруктозы.

- 12 028094

с) Период полураспада свободной и иммобилизованной 1-ЗЗТгес.

Оценивали термостабильность свободного и иммобилизованного на Еирегдй фермента и клеток Р.ра51оп5 СЮВ 308, иммобилизованных на альгинате кальция. Обе, свободную или иммобилизованную, формы инкубировали в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 5,5, при 30, 35 и 40°С. Для оценки остаточной активности пробы отбирали из каждой реакционной смеси с интервалами 24 ч при 30°С, 1 ч при 35°С и 20 мин при 40°С соответственно. Затем определяли период полураспада. Результаты, представленные в табл. 5, показывают, что ферментные препараты, содержащие свободную 1-ЗЗТгес, являются значительно более стабильными, чем клетки с активностью 1-ЗЗТ, иммобилизованные на альгинате кальция.

Кроме того, неожиданно было установлено, что период полураспада неочищенного экстракта в растворе 1-ЗЗТгес при 30°С, т.е. в нереакционных условиях, составляет 1432 ч. Такое время превышает более чем в 100 раз период полураспада, зарегистрированный на данный момент для растительных ферментов типа 1-ЗЗТ.

Таблица 5

Период полураспада различных препаратов 1-ЗЗТгес в нереакционных условиях

Ферментный препарат	Период полураспада (ч)
30°С	35°С	40°С
Свободный 1-ЗЗТгес (неочищенный экстракт)	1432,0	6, 1	0,7
клетки Р. разЁогаз С16В 308, иммобилизованные на альгинате кальция	36, 0	4,2	0,3
Иммобилизованный на ЕирегдИ; 1- ЗЗТгес	1856,0	12, 9	1, 6

Испытание термостабильности проводили с лиофилизированным ферментным препаратом. Результаты свидетельствовали о том, что твердый препарат имеет период полураспада более трех лет при 30°С.

Пример 9.

Превращение сахарозы в ФОС, катализируемое 1-ЗЗТгес, в периодической реакции с использованием реактора с механическим перемешиванием.

Динамику синтеза ФОС, катализируемого 1-ЗЗТгес, определяли при концентрации сахарозы 600 г/л с добавлением фермента-субстрата в массовом соотношении 15 ед./г в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 5,5; при 40°С, в течение 6 ч в 1-литровом реакторе при 250 об/мин. Количественное определение и состав полученных сахаров определяли в пробах, которые отбирали каждые 20 мин, с использованием ВЭЖХ аналогично тому, как описано в примере 8.

Максимальное полученное количество 1-кестозы составляло 320,8 г/л, что соответствовало 53,4% от всех углеводов в смеси и 90,4% от общего объема ФОС. На фиг. 3 показано, что максимальное полученное количество 1-кестозы достигалось в период между 2,7 и 3 ч реакции, когда было израсходовано более чем 70% исходной сахарозы. В этот момент максимальная концентрация 1-кестозы совпадает с началом появления тетрасахарида нистозы.

Данный факт является преимущественным для применения 1-ЗЗТгес в серийном производстве 1-кестозы, поскольку нистоза, образовавшаяся в реакции превращения сахарозы, не появляется до тех пор, пока не израсходовано 50% исходной сахарозы, как показано на фиг. 4. В противоположность, грибковые РТР накапливают нистозу от начала реакции уже при синтезе первых молекул 1-кестозы, а также катализируют синтез пентасахарида фруктозилнистозы.

Аналогичные значения и динамика в процессе превращения сахарозы в 1-кестозу были получены с использованием клеток с периплазматической активностью 1-ЗЗТгес, свободной или иммобилизованной на альгинате кальция, или 1-ЗЗТгес, ковалентно иммобилизованной на Еирегдй (производства Зщта) в аналогичных условиях реакции. В табл. 6 приведены концентрации ФОС, полученные с различными ферментными препаратами.

- 13 028094

Таблица 6

Концентрация синтезированных ФОС после 3-часовой реакции с использованием различных 1-ЗЗТгес ферментных препаратов

			Клетки,
Синтезированные	Свободный 1 —	Свободная 1 —	иммобилизованные
ФОС	ЗЗТгес	ЗЗТгес	на альгинате
			кальция
Общий объем ФОС	354,7 г/л	330,5 г/л	342,2 г/л
1-кестоза	320,8 г/л (90,5%)	322,1 г/л (97,4%)	318,3 г/л (93,0%)
нистоза	33,9 г/л (9,5%)	8,4 г/л (2,6%)	23,9 г/л (7,0%)

Реакционную смесь при трансфруктозилировании, полученную после 3-часового синтеза, подвергали пастеризации для инактивации фермента. Затем сироп подвергали доочистке, которая началась фильтрацией с последующей деминерализацией, обесцвечиванием, и заканчивалась хроматографическим разделением с псевдодвижущимся слоем (ЗМВ), так что после элюирования получали богатый ФОС поток, содержащий более чем 90% 1-кестозы. Данный факт свидетельствует о технической применимости этого способа получения богатого 1-кестозой сиропа, ФОС с наиболее высоким пребиотическим действием и так далее, приобретая большое промышленное значение.

Техническая применимость этого способа в промышленном масштабе была подтверждена масштабированием реакции превращения сахарозы в 1-кестозу в реакторе объемом 30 и 100 л соответственно. Масштабирование этого способа было выполнено методом, основанным на принципе подобия, согласно информации, полученной в ходе испытания, проведенного в 1-литровом опытном реакторе. Концентрация 1-кестозы, полученная в двух новых масштабах, в среднем составляла 322±7 г/л. Данный результат не показывает статистически достоверной разницы с результатами, полученными в опытном реакторе. Данный факт также показал, что реакция превращения сахарозы в 1-кестозу, катализируемая 1-ЗЗТгес, воспроизводится в реакторах с механическим перемешиванием при более высоких масштабах.

Пример 10.

Синтез 1-кестозы из сахарозы в мембранном биореакторе, работающем в полунепрерывном режиме.

Технологический процесс, описанный в примере 9, для синтеза 1-кестозы из сахарозы проводили с использованием свободной 1-ЗЗТгес в биореакторе с механическим перемешиванием. Для этой цели 1-литровый (рабочий объем) биореактор с механическим перемешиванием соединяли на его выходе с ультрафильтрационной мембраной патронного типа (Ргер/Зса1е ТРР-1 30 кДа, МПНроге, с номинальной площадью фильтра 0,09 м²), позволяя разделение продуктов реакции и фермента, как показано на фиг. 5.

Используемые параметры представляли: начальная концентрация фермента 9000 ед./л, начальная концентрация сахарозы 600 г/л в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,5, температура 40°С, скорость перемешивания 250 об/мин, поток питательной среды на выходе мембранного биореактора 40 мл/мин.

Во время стадии синтеза оба, ретентатный и пермеатный, потока на выходе мембраны возвращали в ферментативный биореактор. Каждые 30 мин пробы пермеатного потока анализировали методом ВЭЖХ для определения степени превращения сахарозы в 1-кестозу, как описано в примерах 8 и 9.

После 3-часовой реакции клапан рециркуляции пермеатного потока в биореактор закрывали, а ранее закрытый клапан резервуара для сбора ФОС открывали. Клапан, соответствующий ретентатному потоку, устанавливали для обеспечения пермеатного потока 30 мл/мин.

Через 30 мин 90% от общего объема реакционной смеси сливали и поэтому выпускной клапан резервуара для сбора пермеатного потока закрывали. Затем возвратный клапан биореактора открывали и зафиксированный клапан регулировали таким образом, чтобы скорость возвращения пермеатного потока в биореактор составляла до 5 мл/мин. В этот момент в биореактор загружали 900 мл сахарозы 600 г/л в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,5. Кроме того, добавляли 180 ед. 1-ЗЗТгес для поддержания того же времени реакции и той же степень превращения 1-кестозы, таким образом начиная второй цикл синтеза.

Через 2 ч 30 мин после начала реакции проводили выгрузку продуктов реакции, как это выполнялось в первом цикле. После полной выгрузки 90% от объема реакционной смеси, соответствующего второму циклу, биореактор снова загружали таким же образом, как это делали во втором цикле. Эти стадии выгрузки реакционной смеси последовательно повторяли до завершения 10 операционных циклов, а затем проводили стадию очистки ВКМ. На фиг. 6 показана динамика в течение первых 3 циклов, а на фиг. 7 показан состав полученных продуктов в конце каждого последовательного цикла.

Использование последовательно работающего ВКМ имеет производительность, аналогичную биореактору с механическим перемешиванием, при той же мощности, но при уменьшенном в 8 раз потреблении фермента количеством полученной 1-кестозы.

Аналогичные концентрации 1-кестозы получали при других рабочих условиях ВКМ в полунепрерывном режиме. К рабочим условиям, которые можно изменять без отрицательного влияния на состав полученных продуктов, относятся соотношение фермент-субстрат (2-40 ед./г сахарозы), концентрация сахарозы 400-800 г/л, температура (30-50°С), рН (5,0-6,5), с учетом того, что время загрузки всегда со- 14 028094 ставляет от 10 до 20% времени, за которое достигается максимальное получение 1-кестозы.

Время загрузки в указанном диапазоне подходит для синтеза нистозы и получения фруктозы из

1-кестозы. До настоящего изобретения в литературе отсутствовали сообщения, в которых было описано получение 1-кестозы в ВКМ.

Claims

1. Способ получения сахароза:сахароза-1-фруктозилтрансферазы (1-δδΤ), включающий ферментацию несахаролитическими дрожжами, которые конститутивно экспрессируют множественные копии гена, кодирующего 1-δδΤ, выделенного из РезЫса агипбтасеа, интегрированные в геном дрожжей под контролем промотора, который не индуцируется метанолом.

2. Способ по п.1, где несахаролитические дрожжи представляют собой штамм РюЫа раз!опз.

3. Способ по п.2, где 1-δδΤ выделяют из супернатанта и/или клеточного осадка культуры РюЫа разίθΓ13.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферментация дрожжей осуществляется с прерыванием, непрерывно или с подпиткой.

5. Способ по п.4, в котором источник углерода, используемый для ферментации дрожжей, выбран из глицерина, глюкозы и сахарозы любой степени чистоты.

6. Способ получения 1-кестозы, заключающийся в превращении сахарозы в 1-кестозу в биореакторе с помощью фермента сахароза:сахароза-1-фруктозилтрансферазы (1-δδΤ), полученного в соответствии со способом по п.1.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что концентрация сахарозы в биореакторе составляет более 400 г/л.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что превращение сахарозы в 1-кестозу проводится в биореакторе с механическим перемешиванием, с неподвижным слоем или мембранного типа.

9. Способ по п.8, в котором биореактор мембранного типа работает в непрерывном или полунепрерывном режиме.

10. Способ по п.6, отличающийся тем, что превращение сахарозы в 1-кестозу осуществляется свободной или иммобилизованной 1-δδΤ.

11. Неочищенный ферментный препарат для превращения сахарозы в 1-кестозу в промышленном масштабе, содержащий сахароза:сахароза-1-фруктозилтрансферазу (1-δδΤ), полученную в соответствии со способом по п.1.

12. Неочищенный ферментный препарат по п.11, где 1-δδΤ находится в твердом или жидком состоянии и в свободной или в иммобилизованной форме.