ES2348990B1 - Biocatalizador inmovilizado basado en alginato para la biotransformacion de carbohidratos. - Google Patents
Biocatalizador inmovilizado basado en alginato para la biotransformacion de carbohidratos. Download PDFInfo
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Abstract
Biocatalizador inmovilizado basado en alginato
para la biotransformación de carbohidratos.
Procedimiento de obtención de un biocatalizador,
que
comprende: inmovilizar una enzima fúngica por inclusión en un gel de alginato cálcico; y el secado posterior el biocatalizador inmovilizado obtenido en el paso (a). La invención también se refiere al biocatalizador obtenido por el procedimiento de la invención y que comprende enzimas fúngicas, preferiblemente fructosiltransferasa o \beta-fructofuranosidasa, inmovilizadas en alginato. Además la invención se refiere al uso de dicho biocatalizador para la biotransformación en las que el sustrato es una disolución concentrada de un carbohidrato y se puede llevar a cabo en un reactor continuo.
comprende: inmovilizar una enzima fúngica por inclusión en un gel de alginato cálcico; y el secado posterior el biocatalizador inmovilizado obtenido en el paso (a). La invención también se refiere al biocatalizador obtenido por el procedimiento de la invención y que comprende enzimas fúngicas, preferiblemente fructosiltransferasa o \beta-fructofuranosidasa, inmovilizadas en alginato. Además la invención se refiere al uso de dicho biocatalizador para la biotransformación en las que el sustrato es una disolución concentrada de un carbohidrato y se puede llevar a cabo en un reactor continuo.
Description
Biocatalizador inmovilizado basado en alginato
para la biotransformación de carbohidratos.
La presente invención se refiere a
biocatalizadores que comprenden enzimas inmovilizadas en alginato y
a su procedimiento de obtención. Además, mediante el secado de dicho
biocatalizador, la invención también se refiere al uso de dicho
biocatalizador para la biotransformación en las que el sustrato es
una disolución concentrada de un carbohidrato y se puede llevar a
cabo en un reactor continuo. Por tanto, la presente invención se
puede encuadrar dentro del campo de la industria biotecnológica.
Los carbohidratos son el material biológico muy
abundante en la naturaleza, se pueden utilizar como materia prima
para una gran variedad de procesos industriales, dando lugar a otros
productos con mucho interés industrial y tecnológico. Para ello, las
enzimas implicadas en su transformación tienen un enorme
interés.
El campo de los oligosacáridos prebióticos, como
ingredientes funcionales en alimentación y nutracéuticos, se ha
desarrollado de manera espectacular en los últimos años, estos
compuestos se obtienen mediante transformaciones enzimáticas de
carbohidratos.
El término prebiótico fue introducido por Gibson
y Roberfroid, quienes definieron a los prebióticos como ingredientes
no digeribles de los alimentos que afectan beneficiosamente al
huésped por una estimulación selectiva del crecimiento y/o actividad
de un limitado grupo de bacterias en el colon. Los prebióticos
resisten la digestión en la parte superior del tracto intestinal, y
se metabolizan por las bacterias endógenas del colon.
Las moléculas prebióticas líderes en el mercado
son los fructooligosacáridos (FOS) (cfr. P.T. Sangeetha, M.N. Armes,
S.G. Prapulla, Trends Food Sci. Technol., 2005, vol. 16, pp.
442-457; A.V. Rao, J. Nutr., 1998, vol. 80,
pp.1442S-1445S). Los FOS pueden ejercer una serie de
efectos sobre la persona que los consume: control del estreñimiento
por aumento de la masa fecal, reducción de los episodios de diarreas
causadas por rotavirus, mejora de los síntomas de intolerancia a la
lactosa, aumento de la absorción de calcio, disminución de la
capacidad mutagénica de ciertas enzimas microbianas como la
nitro-reductasa (asociadas con el cáncer de colon),
posible reducción de enfermedades relacionadas con dislipemias,
etc.
Los FOS que se comercializan actualmente están
formados por moléculas de fructosa unidas por enlaces glicosídicos
\beta-(2-1), con una molécula de glucosa terminal
(cfr. J.W. Yun, Enzyme Microb. Technol., 1996, vol. 19, pp.
107-117), abreviándose como GF_{n}, estando
n típicamente comprendido entre 2 y 4
(1-kestosa, nistosa y
^{1}F-fructosilnistosa). Estudios recientes
muestran que el mayor efecto prebiótico es ejercido por el
trisacárido 1-kestosa, en comparación con compuestos
de mayor peso molecular de la serie (cfr. O. Bañuelos et al.,
Anaerobe, 2008, vol. 14, pp. 184-
189).
189).
Los FOS se obtienen por síntesis enzimática a
partir de sacarosa, utilizando sacarosa
1-fructosiltransferasas (EC 2.4.1.9),
beta-fructofuranosidasas -invertasas- (EC 3.2.1.26)
o incluso levansacarasas (EC 2.4.1.10) (cfr. L.E. Trujillo et
al., Enzyme Microb. Technol. 2001, vol. 28, pp.
139-144). Empleando
beta-fructofuranosidasas el rendimiento de productos
de síntesis que se alcanza es muy bajo, representando éstos menos
del 4% (p/p) del total de carbohidratos de la mezcla. Sin embargo,
con fructosiltransferasas el rendimiento que se puede alcanzar es
mucho mayor, alcanzando valores próximos al 55-60%
(p/p) de FOS referido al peso total de azúcares (cfr. M. Antosova,
M. Polakovic, Chem. Pap. 2001, vol. 55, pp.
350-358). En la actualidad, los FOS se producen
industrialmente utilizando fructosiltransferasas del género
Aspergillus (p. ej. A. oryzae, A. japonicus,
A. niger, A. aculeatus, etc.) o Aureobasidium
(p. ej. A. pullulans) para generar oligosacáridos de cadena
corta, de 3 a 5 unidades (cfr. C. Vannieeuwenburgh et al.,
Bioprocess Biosyst. Eng., 2002, vol. 25, pp.
13-20; C.S. Chien et al., Enzyme Microb.
Technol., 2001, vol. 29, pp. 252-
257).
257).
La producción a gran escala de oligosacáridos
prebióticos sintetizados por vía enzimática puede verse favorecida
si se inmoviliza la enzima en un soporte sólido. Este proceso
facilita la separación del biocatalizador del medio con la
consiguiente parada de la reacción, su reutilización y, en algunos
casos, un aumento de su estabilidad operacional. Además, permite
diseñar reactores continuos de diferente configuración (lecho fijo,
lecho fluidizado, tanque agitado, etc.). Se han estudiado distintos
métodos de inmovilización para enzimas que actúan sobre
carbohidratos: adsorción, unión covalente, entrecruzamiento,
granulación, atrapamiento, encapsulación, etc. En cuanto a los
métodos de inmovilización por adsorción y granulación, éstos suelen
ser inadecuados debido a que las reacciones tienen lugar en un medio
acuoso y la enzima se desprende progresivamente del soporte
(lixiviación).
Uno de los métodos de inmovilización más
estudiados para enzimas glicosídicas es el atrapamiento en geles de
alginato cálcico, debido a la facilidad para llevarlo a cabo, la
ausencia de cambios conformacionales en la estructura de la enzima,
el bajo precio de los materiales empleados y la elevada actividad
recuperada. No obstante, esta metodología presenta todavía ciertos
inconvenientes (cfr. U. Jahnz et al., Engineering and
Manufacturing for Biotechnology, 2001, vol. 4, pp.
293-307). Por un lado, la estabilidad mecánica del
gel es limitada en reactores que presenten una alta tensión
tangencial. Además, si se utilizan tampones fosfato o citrato, tiene
lugar la pérdida de calcio, lo que origina un deterioro del
biocatalizador. Por otro lado, el alginato puede ser biodegradado en
el propio reactor o durante el almacenamiento cuando se trabaja en
condiciones no estériles. Un hecho muy notorio es que la actividad
específica (más concretamente, la actividad por unidad de volumen)
de los catalizadores basados en alginato no es muy alta, inferior a
10 U/ml gel (cfr. K.D. Reh et al., Enzyme Microb.
Tech., 1996, vol. 19, pp. 518-524). Pero sin
lugar a dudas el mayor inconveniente de los biocatalizadores basados
en alginato consiste en la lixiviación de la enzima durante el
transcurso de la biotransformación, ya que los poros de la red de
alginato son excesivamente grandes para la mayor parte de las
enzimas, siendo, por tanto, un método muy adecuado para la
inmovilización de células enteras (viables o no). En algunos casos
se ha descrito la eliminación del agua contenida en las esferas de
alginato cálcico mediante un proceso de liofilización, sin embargo,
en estos biocatalizadores tampoco se ha observado una reducción en
el lixiviado de la enzima (cfr. S.S. Betigeri et al.,
Biomaterials, 2002, vol. 23, pp. 3627-
3636).
3636).
Dada la importancia industrial de los
oligosacáridos prebióticos, es deseable proporcionar enzimas y
procedimientos para su obtención, que sean viables
industrialmente.
La presente invención proporciona
biocatalizadores inmovilizados y un procedimiento para la obtención
de dichos biocatalizadores, donde una de sus aplicaciones es la
producción de oligosacáridos prebióticos, principalmente
1-kestosa (GF2), nistosa (GF3),
1F-fructosilnistosa (GF4) y
1F-fructosil-fructosilnistosa (GF5).
Estos oligosacáridos prebióticos pueden ser utilizados como
ingredientes funcionales en productos alimenticios, alimentos
infantiles y/o alimentación animal.
También, pueden tener otras aplicaciones, como
puede ser la obtención de jarabes de fructosa como edulcorantes a
partir de sacarosa.
Por tanto, un primer aspecto de la presente
invención se refiere a un procedimiento de obtención de un
biocatalizador (a partir de ahora procedimiento de la invención),
que comprende:
- a.
- inmovilizar una enzima fúngica por inclusión en un gel de alginato cálcico.
- b.
- secar el biocatalizador inmovilizado obtenido en el paso (a).
En una realización preferida del procedimiento
de invención, el secado se lleva a cabo a una temperatura de entre
30 y 50ºC, esta temperatura dependerá de la termoestabilidad de la
enzima inmovilizada.
El término "enzima fúngica" se refiere en
la presente invención a un enzima obtenida a partir de un
microorganismo, más concretamente mediante hongos, mediante técnicas
conocidas por cualquier experto en la materia.
Estas enzimas pueden tener diferente actividad
dependiendo del tipo de transformación en la que actúen, por
ejemplo, pero sin limitarse pueden tener actividad
fructosiltransferasa, \beta-fructofuranosidasa,
\beta-galactosidasa,
\alpha-amilasa o glucosa isomerasa.
En una realización preferida del procedimiento
de la invención, la enzima es fructosiltransferasa o
\beta-fructofuranosidasa.
Cuando la enzima es una fructosiltransferasa,
preferiblemente procede de un hongo de género Aspergillus o
Aureobasidium. Y más preferiblemente de la especie
Aspergillus aculeatus.
Cuando la enzima es una
\beta-fructofuranosidasa, preferiblemente procede
de un hongo de género Rhodotorula, Schwanniomyces,
Xanthophyllomyces o Saccharomyces. Y más preferiblemente
de la especie Rhodotorula gracilis.
Un aspecto positivo del biocatalizador de la
invención es que presenta una alta actividad volumétrica,
comparándolo con el biocatalizador-gel obtenido en
el paso (a) del procedimiento descrito, convirtiéndolo en candidato
idóneo para producir oligosacáridos prebióticos en reactores de un
volumen reducido. Otro aspecto importante, a nivel industrial, es la
alta estabilidad operacional del biocatalizador: mantiene su
actividad catalítica en el reactor de lecho fijo durante largos
tiempos de funcionamiento (> 700 h), trabajando a temperaturas
próximas a 35ºC y empleando como corriente de alimentación una
disolución de sacarosa de 600 g/l. Por otro lado, el biocatalizador
de la invención no recupera su volumen inicial (previo al secado)
cuando por él circula una solución concentrada de sacarosa (o de
otro azúcar). Otra ventaja importante del biocatalizador seco frente
al biocatalizador húmedo, es que las condiciones de almacenamiento
son mucho menos exigentes, por su bajo contenido en agua, lo que lo
hace más resistente a la biodegradación o contaminación microbiana.
Además, el biocatalizador de la invención es también muy estable en
presencia de disolventes orgánicos, incluyendo los de alta polaridad
como el metanol. Este hecho podría conferir a los biocatalizadores
de la invención excelente aplicabilidad en reacciones sintéticas en
disolventes orgánicos. Por otro lado, la metodología desarrollada es
aplicable a enzimas fuertemente glicosiladas, para las que los
métodos de inmovilización covalente suelen dar lugar a valores muy
bajos de actividad recuperada y actividad
volumétrica.
volumétrica.
\newpage
Por tanto, y debido a las características que
confiere el procedimiento de obtención al biocatalizador, un segundo
aspecto de la presente invención se refiere a un biocatalizador
inmovilizado obtenible por el procedimiento de la invención y que
comprende (a partir de ahora biocatalizador de la invención o de
tipo DALGEE ("Dried alginate-entrapped
enzyme")):
- una enzima fúngica inmovilizada en un gel de
alginato cálcico.
El biocatalizador de la invención puede ser
utilizado industrialmente para la obtención de oligosacáridos sin
requerir etapas de separación o purificación posteriores. Dicho
biocatalizador, tanto en su estado de gel
("biocatalizador-gel"), previo al secado, como
en su variante desecada, puede ser empaquetado en un reactor de
lecho fijo para la producción en continuo de fructooligosacáridos.
Para ello se puede emplear como corriente de entrada al reactor, una
disolución concentrada de carbohidrato, por ejemplo de sacarosa. En
una realización particular, los productos resultantes de la
actividad fructosiltransferasa son fructooligosacáridos de la serie
^{1}F (1-kestosa, nistosa,
^{1}F-fructosilnistosa y
^{1}F-fructosil-fructosilnistosa),
y su relación molar puede controlarse variando el caudal en el
reactor.
La presente invención conlleva un procedimiento
de obtención de fructooligosacáridos viable industrialmente. Además,
la composición del producto de reacción (en particular, su contenido
en tri-, tetra-, penta- y hexasacáridos) puede ser regulada en
función del tiempo de residencia del reactor.
La metodología presentada no sólo es aplicable a
fructosiltransferasas, sino que puede extenderse a otras enzimas que
actúan sobre carbohidratos. En particular, la
beta-fructofuranosidasa de Rhodotorula
gracilis, ATCC1416, fue inmovilizada siguiendo los pasos
anteriormente descritos (ver ejemplos). Aunque esta enzima es capaz
de formar fructooligosacáridos bajo condiciones específicas, su
reacción principal es la hidrólisis de sacarosa. Este proceso es
interesante para la obtención de jarabes de fructosa como
edulcorantes a partir de sacarosa.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
se refiere al uso del biocatalizador de la invención, para la
hidrólisis de carbohidratos.
El término "carbohidratos" se refiere en la
presente invención a azúcares capaces de transformarse a otros
compuestos como fructooligosacaridos, jarabe de fructosa, entre
otros. Estos azúcares pueden ser, pero sin limitarse sacarosa,
lactosa, maltosa, glucosa o almidón.
En una realización preferida, el biocatalizador
de la invención se utiliza para la obtención de fructooligosacaridos
o de jarabe de fructosa.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento de hidrólisis de carbohidratos, que
comprende:
- a.
- empaquetar el biocatalizador de la invención en un reactor continuo de lecho fijo;
- b.
- alimentar el reactor continuo de lecho fijo del paso (a) con una disolución de carbohidrato en una concentración de entre 500 g/l y 700 g/l.
En una realización preferida del procedimiento
de hidrólisis, la temperatura del reactor está entre 30ºC y
40ºC.
En otra realización preferida, cuando el
carbohidrato es sacarosa y el biocatalizador es una
fructosiltransferasa inmovilizada, en la reacción se obtienen
fructooligosacáridos, que más preferiblemente se seleccionan de la
lista que comprende trisacáridos, tetrasacáridos, pentasacáridos,
hexasacáridos o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización preferida, cuando el
carbohidrato es sacarosa y el biocatalizador es una
\beta-fructofuranosidasa inmovilizada, en la
hidrólisis se obtiene jarabe de fructosa.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. La
siguiente descripción detallada, ejemplos y dibujos se proporcionan
a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la
presente invención.
La Fig. 1 representa el proceso de
inmovilización utilizado para obtener el
biocatalizador-gel que se describe en esta
invención.
La Fig. 2 representa el diagrama de flujo de
nuestro sistema de producción de FOS, tanto con el
biocatalizador-gel (2A) como con el tipo DALGEE
(2B).
La Fig. 3 muestra la composición de azúcares (en
% p/p) de la corriente de salida del reactor con el
biocatalizador-gel de la fructosiltransferasa de
Aspergillus aculeatus durante 750 h. Las condiciones de
reacción fueron: alimentación, 600 g/ de sacarosa; temperatura del
reactor, 35ºC; caudal de las corrientes de entrada y salida del
sistema, 0.84 ml/h; volumen de biocatalizador-gel
empleado, 25 ml.
La Fig. 4 muestra el efecto del caudal de
trabajo en la composición de la mezcla de FOS a la salida del
reactor (4A) y en la productividad volumétrica, expresada en gramos
de FOS por litro de reactor y día (4B).
La Fig. 5 muestra el aspecto del
biocatalizador-gel (imagen superior) y después de
someterse al proceso de secado (DALGEE, imagen inferior).
Las Fig. 6 (6A y 6B) muestran las micrografías
de microscopía electrónica de barrido (SEM) del biocatalizador tipo
DALGEE.
La Fig. 7 muestra un cromatograma de una muestra
obtenida de la corriente de salida del reactor con el biocatalizador
DALGEE de la fructosiltransferasa de Aspergillus aculeatus.
Concretamente, corresponde a la muestra tomada a las 622 horas de
funcionamiento continuo del reactor.
La Fig. 8 muestra la composición de azúcares (en
% p/p) de la corriente de salida del reactor con el biocatalizador
DALGEE de la fructosiltransferasa de Aspergillus aculeatus
durante 750 h. Las condiciones de reacción fueron: alimentación, 600
g/ de sacarosa; temperatura del reactor, 35ºC; caudal de las
corrientes de entrada y salida del sistema, 0.6 ml/h; volumen de
biocatalizador-gel empleado, 1 ml.
La Fig. 9 muestra las productividades
volumétricas, expresadas en gramos de FOS por litro de reactor y
día, para las dos formas de biocatalizador de la
fructosiltransferasa de Aspergillus aculeatus:
biocatalizador-gel y DALGEE. Las condiciones de
operación son las mismas que las descritas en la figura 6 para el
biocatalizador-gel y en la figura 9 para el tipo
DALGEE.
La Fig. 10 muestra el estudio de la lixiviación
tanto del biocatalizador-gel como del tipo DALGEE de
la fructosiltransferasa de Aspergillus aculeatus. En la parte
superior se representa el protocolo de trabajo seguido y en la parte
inferior la actividad enzimática en el sobrenadante tras los
sucesivos ciclos de lavado.
La Fig. 11 muestra un cromatograma de una
muestra obtenida de la corriente de salida del reactor con el
biocatalizador tipo DALGEE de la
beta-fructofuranosidasa de Rhodotorula
gracilis ATCC1416. Concretamente, corresponde a la muestra
tomada a las 48 horas de funcionamiento continuo del reactor.
Ejemplo
1
Se prepararon 30 ml de una disolución de
alginato sódico SG-300® al 4% (p/v) en agua. Para
conseguir una solución homogénea, se sometió la mezcla a agitación
vigorosa a temperatura ambiente. A continuación, se pesaron 25 g de
la disolución de alginato y se le añadieron 25 ml de una disolución
enzimática, previamente concentrada por ultrafiltración, que
contiene una fructosiltransferasa de Aspergillus aculeatus
(la disolución enzimatica de partida es comercial, Pectinex
Ultra-SPL®, procedente de Novozymes A/S, Dinamarca).
La actividad final de la mezcla fue de aproximadamente 135 U/ml.
Tras conseguir una mezcla homogénea (mediante agitación suave 100
rpm durante 40 mn.), la mezcla se dejó reposar 1 hora para eliminar
las burbujas de aire y porsteriormente, se goteó con ayuda de una
bomba peristáltica LKB-Pump P-1
(Pfizer-Pharmacia, Canadá) sobre 250 ml de una
disolución 0.2 M de CaCl_{2} en tampón acetato sódico 50 mM (pH
5.6), manteniendo esta disolución bajo agitación magnética
(200
rpm).
rpm).
La Fig. 1 muestra un esquema del proceso de
inmovilización utilizado. El diámetro de las esferas obtenidas fue
de 3 mm (a este biocatalizador se le denomina
"biocatalizador-gel"). Los factores que
determinaron el tamaño del biocatalizador fueron la velocidad de
goteo controlada por la bomba peristáltica y el diámetro del extremo
final del tubo por el que goteaba la disolución. Una vez formadas
las esferas de alginato cálcico, se mantuvieron durante al menos 20
min en la disolución de CaCl_{2} para asegurar la resistencia
mecánica del inmovilizado. Posteriormente el inmovilizado se sometió
a dos ciclos de lavado (incubando las esferas durante 40 min en
tampón acetato sódico 0.01 M pH 5.6, a temperatura ambiente y con
agitación magnética suave) con el fin de eliminar enzima que no
hubiera quedado convenientemente atrapada en el gel de alginato. Las
esferas de alginato con la enzima inmovilizada se almacenaron a
4ºC.
La pérdida de actividad en el proceso de
gelificación se midió a partir de la determinación de la actividad
del sobrenadante y los lavados, estimándose en un 50%. No obstante,
esta actividad puede recuperarse y utilizarse para un posterior
proceso de inmovilización. La actividad volumétrica del
biocatalizador obtenido en este ejemplo de realización fue de 10
U/ml.
Para la determinación de la actividad
fructosiltransferasa de la enzima soluble se valoró la liberación de
azúcares reductores mediante el método del ácido dinitrosalicílico
(DNS). El ensayo se realizó empleando una disolución de sacarosa de
100 mg/ml, en placas de 96 pocillos de fondo plano y volumen de 200
\mul. En cada pocillo se depositaron 45 \mul de solución de
sacarosa 100 g/l (preparada en tampón acetato sódico 0.02 M, pH 5.6)
y 5 \mul de la disolución con enzima. La placa se incubó durante
20 minutos, a 35ºC y 200 rpm en un incubador con agitación orbital
(Vortemp 56, Labnet). Para la curva de calibrado se prepararon
pocillos con distintas concentraciones de glucosa (de 0 a 2 g/l).
Tras los 20 minutos, se añadieron 50 \mul de DNS 10 g/l y se
incubó la placa durante 30 minutos a 80ºC. Se llevaron a cabo dos
controles: el primero en ausencia de enzima y el segundo en ausencia
de sacarosa. Una vez que la microplaca se enfrió a temperatura
ambiente, se añadieron 150 \mul de agua Milli-Q y
se midió la absorbancia a 540 nm en un lector de microplacas. Todas
las muestras se prepararon por triplicado para minimizar errores.
Una unidad de actividad enzimática (U) se definió como aquella capaz
de formar un \mumol de azúcar reductor por minuto bajo las
condiciones de reacción anteriormente descritas. Para determinar la
actividad de la enzima inmovilizada se incubaron a 35ºC, en un tubo
eppendorf, 5 esferas de biocatalizador con 0.5 ml de disolución de
sacarosa 100 g/l. La mezcla de reacción se mantuvo a 200 rpm durante
20 min. A continuación, se pipetearon 50 \mul del sobrenadante a
un pocillo de la microplaca. Se añadieron 50 \mul de la disolución
de DNS y se incubó la placa durante 30 min a 80ºC. El resto del
procedimiento es el mismo que el descrito anteriormente.
Ejemplo
2
El biocatalizador del Ejemplo 1 se utilizó para
empaquetar 25 ml de una columna de vidrio (Amersham Pharmacia XK
16/20), termostatizada a 35ºC y conectada a una bomba isocrática de
doble pistón (modelo 515, Waters). El biorreactor se dispuso como un
reactor de lecho fijo, con una corriente de entrada y otra de
salida. La solución de alimentación contenía 600 g/l de sacarosa en
tampón 0.02 M acetato sódico (pH 5.6), que se mantuvo con agitación
magnética y termostatización a 35ºC.
La disposición del sistema no incluía ninguna
corriente de recirculación. La Fig. 2 representa los reactores de
lecho fijo desarrollados para estos estudios.
Después del tiempo de estabilización del
sistema, se comenzaron a recoger muestras a la salida de la columna.
Las muestras fueron centrifugadas durante 5 min a 4300 x g usando un
eppendorf con filtro Durapore® de 0.45 \mum (Millipore), y
analizadas por cromatografía líquida de alta resolución. Se empleó
una bomba cuaternaria (Delta 600, Waters) y una columna de
Phenomenex, Luna NH2 5 \mum 100A (250 x 4.6 mm).
La columna se mantuvo termostatizada a 25ºC
gracias a un horno (Timberline Instruments, Inc). La fase móvil
empleada fue una mezcla de acetonitrilo/agua, que fue desgasificada
con un flujo continuo de Helio de 100 ml/min. Se empleó un detector
evaporativo de light-scattering (ELSD, DDL 31
Eurosep) que operó a una temperatura de 85ºC y con N_{2} como gas
nebulizador. El análisis de datos se llevó a cabo con el Software
Millenium 32 de Waters. Los análisis se realizaron operando en modo
gradiente según el siguiente programa de la Tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 3 muestra resultados obtenidos para el
reactor empaquetado con el biocatalizador-gel
durante 750 horas. Concretamente se representa el porcentaje en peso
referido al total de azúcares en la mezcla, a lo largo de 750 horas
de funcionamiento continuo del reactor. Esta gráfica muestra la alta
estabilidad operacional del biocatalizador. La Tabla 2 muestra la
composición media, en gramos por litro, de la corriente de salida
del reactor a un caudal de 0,84 ml/h, una vez alcanzado el estado
estacionario.
La Fig. 4 muestra cómo la composición de la
salida del reactor puede regularse variando el tiempo de residencia,
que en definitiva se controla a través del caudal. Como se aprecia
en la figura de la parte superior, un mayor caudal representa un
menor tiempo de residencia y en consecuencia una mayor proporción de
los productos de bajo grado de polimerización (en particular,
1-kestosa) en la mezcla de la salida. Por el
contrario, un menor caudal implica un mayor tiempo de residencia y
por ende una mayor proporción de los FOS con grado de polimerización
más elevado: tri-, tetra-, penta- y hexasacáridos. Asimismo, un
mayor caudal supone un menor porcentaje de sacarosa convertida en
productos. Por tanto, la productividad volumétrica del reactor
(gramos de FOS totales por día y por litro de reactor) se vio
alterada por el caudal de trabajo, como se indica gráficamente en la
parte inferior de la Fig. 4.
Ejemplo
3
El biocatalizador del Ejemplo 1 se dejó secar al
aire en un cristalizador de vidrio, a 35ºC, durante 3 días. Tras
este tiempo, el diámetro de las esferas obtenidas fue de 1 mm, lo
cual supone una reducción del volumen del biocatalizador del 96%
(suponiendo las partículas esféricas). La pérdida de actividad en el
proceso de secado, por partícula de biocatalizador, se estimó en un
50%. Sin embargo, la actividad volumétrica del biocatalizador seco
fue de 140 U/ml, por lo que se produjo un aumento de aproximadamente
13 o 14 veces en la actividad volumétrica con respecto al
biocatalizador-gel.
La Fig. 5 muestra el aspecto de las esferas de
biocatalizador, antes y después del proceso de secado. Para realizar
un estudio morfológico de los soportes, se empleó un microscopio
electrónico de barrido (SEM) HITACHI TM1000 con un potencial
acelerador de electrones de 15 kV, y un detector semiconductor BSE
de alta sensibilidad. La Fig. 6 muestra la morfología de las
partículas de biocatalizador seco. En la Tabla 1 se recogen los
aspectos más sobresalientes del biocatalizador tipo DALGEE. Las
propiedades texturales fueron estudiadas mediante porosimetría de
mercurio, usando un porosímetro Fisons Instruments Pascal 140/240.
Las muestras fueron incubadas a 60ºC durante 24 h antes del
análisis. El valor del ángulo de contacto de Hg (141º) y la tensión
superficial (484 mN/m) fueron seleccionados para evaluar los datos
Presión/volumen por la ecuación Washburn, asumiendo un modelo de
poro cilíndrico. La distribución del tamaño de partícula fue
determinada por análisis de la curva de intrusión. A partir de la
porosidad del material y asumiendo partículas esféricas, el factor
de empaquetamiento y la distribución del tamaño de partícula se
calcularon de acuerdo con la teoría de Mayer-Stowe.
El contenido en agua se determinó por el método
Karl-Fischer. Se observa que los DALGEEs presentan
un volumen de poro muy pequeño (0.072 cm^{3}/g), con un máximo en
la distribución de tamaños de poro de 8.3 nm. Este dato explica la
baja lixiviación de los biocatalizadores tipo DALGEE, ya que la
mayor parte de las enzimas no van a poder escapar a través de los
poros.
Ejemplo
4
El biocatalizador del Ejemplo 3 se utilizó para
empaquetar una columna de 1 ml (0.7 x 2.5 cm), termostatizada a 35ºC
y conectada a una bomba isocrática de doble pistón. La solución de
alimentación contenía 600 g/l de sacarosa en tampón 0.02 M acetato
sódico (pH 5.6), que se mantuvo con agitación magnética y
termostatización a 35ºC. La disposición del sistema no incluía
ninguna corriente de recirculación. La Fig. 2 representa los
reactores de lecho fijo desarrollados para estos ensayos. Después
del tiempo de estabilización del sistema, se comenzó a recoger
muestras a la salida de la columna. Las muestras fueron
centrifugadas durante 5 min a 4300 x g usando un tubo Eppendorf con
filtro Durapore® de 0.45 \mum (Millipore), y analizadas por
cromatografía líquida de alta resolución como se describe en el
Ejemplo 2. La Fig. 7 muestra un cromatograma típico de la mezcla de
reacción a la salida del reactor que contiene el biocatalizador
DALGEE.
La Fig. 4 muestra cómo la composición de la
salida del reactor puede regularse variando el tiempo de residencia,
que en definitiva se controla a través del caudal. Como se aprecia
en la figura de la parte superior, un mayor caudal representa un
menor tiempo de residencia y en consecuencia una mayor proporción de
los productos de bajo grado de polimerización (en particular,
1-kestosa) en la mezcla de la salida. Por el
contrario, un menor caudal implica un mayor tiempo de residencia y
por ende una mayor proporción de los FOS con grado de polimerización
más elevado: tri-, tetra-, penta- y hexasacáridos. Asimismo, un
mayor caudal supone un menor porcentaje de sacarosa convertida en
productos. Por tanto, la productividad volumétrica del reactor
(gramos de FOS totales por día y por litro de reactor) se vio
alterada por el caudal de trabajo, como se indica gráficamente en la
parte inferior de la Fig. 4.
En la parte inferior de la Fig. 8, se muestra la
composición de la corriente de salida en %(p/p), referido al peso
total de azúcares en la mezcla, a lo largo de 700 horas de
funcionamiento continuo del reactor empaquetado con el
biocatalizador DALGEE. Esta gráfica muestra la alta estabilidad
operacional del biocatalizador, ya se observa cómo la actividad
catalítica del reactor permanece prácticamente invariable a lo largo
de casi todo el ensayo. En la Tabla 4 se recogen las concentraciones
medias de los distintos carbohidratos a la salida del reactor, una
vez alcanzado el estado estacionario, utilizando un caudal de 0.6
ml/h. El reactor resultó ser estable durante al menos 750 h de
trabajo. La productividad obtenida se estimó en 3680 g FOS por día y
litro de reactor, tal como se puede apreciar en la Fig. 9.
De esta forma, la Fig. 9 muestra las
productividades volumétricas, expresada en gramos de FOS por litro
de reactor y día, para las dos formas de biocatalizador,
biocatalizador-gel y DALGEE, utilizando un caudal de
0.84 ml/h para el biocatalizador-gel y 0.60 ml/h
para el DALGEE, durante las 750 horas de operación del biorreactor.
Se aprecia que en el caso del biocatalizador-gel, la
productividad es próxima a 100 g de FOS por litro de reactor y día,
mientras que con el tipo DALGEE, alcanza un valor en torno a los
4000 g FOS por litro de reactor y día.
Ejemplo
5
Se sometió a los biocatalizadores inmovilizados
de la fructosiltransferasa de Aspergillus aculeatus a
sucesivos ciclos de lavado con solución tampón (acetato sódico 0.02
M pH 5.6). En cada ciclo se incubaban 10 partículas de
biocatalizador durante 1 h, a 600 rpm y 35ºC, con 500 \mul de
tampón. Tras cada lavado se extraían los 500 \mul de solución,
para evaluar la enzima liberada, y se sustituían por solución tampón
fresca para el siguiente ciclo. El porcentaje de lixiviación tras el
primer ciclo fue del 7.5% para el biocatalizador-gel
y del 5% para el DALGEE. A partir del tercer ciclo, la lixiviación
puede considerarse despreciable, como se representa en la Fig.
10.
Ejemplo
6
Sobre 30 g de la disolución de alginato,
preparada según se describe en el Ejemplo 1, se añadieron 30 ml de
una disolución enzimática, de una
beta-fructofuranosidasa extracelular de
Rhodotorula gracilis ATCC1416. La producción de esta
beta-fructofuranosidasa se llevó a cabo en cultivos
de Rhodotorula gracilis ATCC1416 crecidos en medio mínimo
para levaduras suplementado con maltosa. Los cultivos se realizaron
en matraces de vidrio incubados a una temperatura comprendida entre
28-30ºC y con agitación orbital constante de
180-235 rpm. Las condiciones óptimas de crecimiento
fueron 30ºC y 235 rpm. Se obtuvo la fracción libre de células por
centrifugación, y se concentró utilizando un sistema de filtración
tangencial (filtro de 30 kDa). Finalmente, el concentrado se sometió
a diálisis frente a HCI-Tris 20 mM pH 7 durante 2
horas a una temperatura de 4ºC.
La actividad final de la mezcla fue de
aproximadamente 12 U/ml. La preparación del
biocatalizador-gel se realizó tal como se describe
en el Ejemplo 1. La pérdida de actividad en el proceso de
gelificación se midió a partir de la determinación de la actividad
del sobrenadante y los lavados, estimándose en un 60%. La actividad
volumétrica del biocatalizador obtenido en este ejemplo de
realización fue de 0.8 U/ml. El biocatalizador obtenido se sometió a
un proceso de secado como se describe en el Ejemplo 3 dando lugar a
un biocatalizador tipo DALGEE. La pérdida de actividad en el proceso
de secado, por partícula de biocatalizador, se estimó en un 45%. La
actividad volumétrica del biocatalizador seco fue de 15 U/ml, por lo
que se produjo un aumento de aproximadamente 18 veces en la
actividad volumétrica con respecto al
biocatalizador-gel.
Ejemplo
7
El biocatalizador del Ejemplo 6 se utilizó para
empaquetar una columna de 1.5 ml (0.6 x 5.3 cm), termostatizada a
35ºC y conectada a una bomba isocrática de doble pistón. La solución
de alimentación contenía 600 g/l de sacarosa en tampón 0.02 M
acetato sódico (pH 5.6), que se mantuvo con agitación magnética y
termostatización a 35ºC. Después del tiempo de estabilización del
sistema, se comenzó a recoger muestras a la salida de la columna.
Las muestras fueron analizadas como se describe en el Ejemplo 2.
Utilizando un caudal de 0.6 ml/h, la composición media a la salida
del reactor fue de: 124 g/l fructosa, 147 g/l glucosa, 317 g/l
sacarosa, 12 g/l 6-kestosa. La Fig. 12 muestra un
cromatograma típico de la mezcla de reacción a la salida del reactor
que contiene el biocatalizador DALGEE. El reactor empaquetado con el
biocatalizador DALGEE beta-fructofuranosidasa de
R. gracilis ATCC1416 mantuvo su actividad inicial durante al
menos 48 horas. La productividad obtenida se estimó en 2600 g de
azúcares reductores por día y litro de reactor.
Claims (19)
1. Procedimiento de obtención de un
biocatalizador, que comprende:
- a.
- inmovilizar una enzima fúngica por inclusión en un gel de alginato cálcico.
- b.
- secar el biocatalizador inmovilizado obtenido en el paso (a).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
donde el secado se lleva a cabo a una temperatura de entre 30 y
50ºC.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 o 2, donde la enzima es fructosiltransferasa o
\beta-fructofuranosidasa.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
donde la fructosiltransferasa se obtiene de un hongo de género
Aspergillus.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
donde el hongo es de la especie Aspergillus aculeatus.
6. Procedimiento según la reivindicación 3,
donde la \beta-fructofuranosidasa obtiene de un
hongo de género Rhodotorula.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
donde el hongo es de la especie Rhodotorula gracilis.
8. Biocatalizador inmovilizado obtenible por el
procedimiento descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y
que comprende:
- -
- una enzima fúngica inmovilizada en un gel de alginato cálcico.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Uso del biocatalizador según la
reivindicación 8, para la hidrólisis de carbohidratos.
10. Uso del biocatalizador según la
reivindicación 9, donde los carbohidratos son sacarosa, lactosa,
maltosa, glucosa o almidón.
11. Uso del biocatalizador según cualquiera de
las reivindicaciones 9 o 10, para la obtención de
fructooligosacáridos.
12. Uso del biocatalizador según cualquiera de
las reivindicaciones 9 o 10, para la obtención de jarabe de
fructosa.
13. Procedimiento de hidrólisis de
carbohidratos, que comprende:
- a.
- empaquetar un biocatalizador inmovilizado, descrito en la reivindicación 8, en un reactor de lecho fijo;
- b.
- alimentar el reactor continuo de lecho fijo del paso (a) con una disolución de carbohidrato en una concentración de entre 500 g/l y 700 g/l.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
donde la temperatura del reactor está entre 30ºC y 40ºC.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 13 o 14, donde el carbohidrato es sacarosa.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
donde el biocatalizador es una fructosiltransferasa
inmovilizada.
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
donde en la hidrólisis se obtiene fructooligosacáridos que se
seleccionan de la lista que comprende trisacáridos, tetrasacáridos,
pentasacáridos, hexasacáridos o cualquiera de sus combinaciones.
18. Procedimiento según la reivindicación 15,
donde el biocatalizador es una
\beta-fructofuranosidasa inmovilizada.
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
donde en la hidrólisis se obtiene jarabe de fructosa.
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