KR900003710B1 - 고정화 프럭토실트랜스퍼라제의 제조법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

고정화 프럭토실트랜스퍼라제의 제조법

본 발명은 프럭토실트랜스퍼라제의 제조법에 관한 것이며, 그 목적은 공업적으로 설탕을 프럭토 올리고당으로 전환시키는데 있어서 연속적으로 행하는 경우에 적합하도록 컬럼 조작이 용이한 활성이 높고 안정한 고정화 프럭토실트랜스터라제를 얻기 위한 것이다.

프럭토실트랜스퍼라제는 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 푸사리움(Fusarium)속, 글레오스포륨(Gloeosporium)속 등의 미생물이 분비하는 효소로서 슈크로스에 작용하여 슈크로스에 프럭토스가 2 내지 4개 정도 결합한 감미료를 생성하는 효소로 알려져 있다. 프럭토 올리고당을 제조하기 위해 프럭토실트랜스퍼라제를 회분식으로 반응시킬 경우 효소의 사용량이 많아지고 반응 후 정제비가 높다는 등의 문제점이 있다.

본 발명은 프럭토실트랜스퍼라제를 고정화시켜서 반응을 연속화시키면 위의 문제점을 해결할 수 있을 것으로 생각되어 고정화 프럭토실트랜스퍼라제의 제조방법에 대해서 연구를 실시하였다. 일반적으로 효소단백질을 고정화하는 방법에는 1) 수불용성 담체에 효소단백질을 물리적, 전기적으로 흡착, 2) 수불용성 담체에 효소단백질을 공유결합, 3) 관능기를 2개 이상 갖고 있는 화합물에 가교, 4) 겔 격자내 또는 반투막에 집어넣는 방법 등이 있으며, 미생물 균체 자체를 고정화하는 방법은 물리적, 화학적 처리에 의한 균체내에 고정화하는 방법이 있다. 프럭토실트랜스퍼라제의 경우 일반적으로 가장 많이 쓰이는 방법은 효소를 함유하고있는 균체를 폴리아크릴아마이드(PolyacryIamide), 카라기난(Carrageenan), 알지네이트(Alginate) 등에 포괄시키는 것이다. 이 방법은 단점으로서는, 1) 세포의 효소의 포괄이 곤란, 2) 물질전달 저항이 비교적큼, 3) 기계적 강도가 약하고 미생물에 의해 분해가능성이 있음 등을 들 수 있다. 또한 균체를 고정화시키기 위해서는 균체 분리조작을 거쳐야 하는데 균체 함유액의 밀도가 높을 경우에는 분리효율이 떨어진다. 한편 세포의 효소를 고정화시키는 방법에는 상기한 효소단백질의 고정화 방법 2),3),4)에 예시한 이들 방법은 고정화 과정중 활성의 감소가 크고, 메트릭스의 가격이 비싸서, 식품 제조용으로는 부적합하다는 등의 문제가 있다. 또한 1)의 방법도 흡착용 담체의 물리화학적 성질, 효소의 전하 흡착조건에 따라서 흡착율이 달라지며, 기질중의 이온성분의 농도가 높아지면 흡착된 효소의 용리가 일어나 운전 안정성이 떨어지게 된다.

본 발명은 이러한 종래의 방법의 결점과 프럭토 올리고당 제조시스템을 검토한 결과 음이온 교환수지 중에서 특정의 물리적 성질을 갖는 수지를 담체로 사용하면 안정성이 증대하며, 효소 활성이 현저하게 나타나고, 대형 컬럼 조작에도 적합하다는 것을 알아냈다. 또한 본 발명의 또 하나의 특징은 세포내의 효소를 전부 이용할 수 있다는 것이다.

본 발명에 있어서 프럭토실트랜스퍼라제의 흡착용 담체로서 사용되는 수지에 대해 설명하면 시판되고 있는 각종 이온교환수지를 검토한 결과 다공성 또는 거대망목형 약염기 음이온교환수지, 다공성 또는 거대망목형 강염기 음이온 교환수지가 흡착능력이 우수하다는 사실을 발견했다. 다공성 이온교환수지는 수천 Å정도의 공경을 갖는 거대망목형의 세공을 갖는 수지로서 큰 내부 표면적과 세공용량을 갖고 있다는 점에서통상의 이온교환수지와 구별된다. 이러한 수지로서는 MSA1, PA412, IRA900, IRA904, IR93, WA30 등이 있다.

본 발명은 이러한 수지에 효소를 흡착시켜 제조한 고정화 프럭토실트랜스퍼라제를 사용하여 연속반응을 행하는 경우 pH5-6의 40-70% 슈크로스 용액일 때 흡착효소의 용출이 적고 안정되게 트럭토올리고당을 생산할 수 있음을 발견하였다.

본 발명은 이러한 발견을 기초로하여 다공성 약염기음이온 교환수지, 다공성 강염기 음이온교환수지에 프럭토실트랜스퍼라제를 함유한 액을 접촉시켜 제조한 고정화 효소에 pH 5-6으로 조절한 40-70% 슈크로스를 연속적으로 반응시켜 슈크로스를 올리고당으로 전이시키는 것을 특징으로 하는 프럭토올리고당 전이효소의 고정화 제조방법이다. 본 발명에서 사용되는 프럭토실트랜스퍼라제는 아스퍼질러스속, 푸사리움속, 글래스포륨속 등과 같은 미생물 균체로부터 자기소화, 음파 처리 등의 방법에 의한 프럭토실트랜스퍼라제 추출후 균사 자체를 포함한 상태, 또는 균체 잔사를 제거한 효소 용액 또는 황산 암노늄 분별정제 결정화한 결정상태의 효소를 사용한다. 프럭토실트랜스퍼라제의 활성은 60℃에서 pH 5.5의 60% 슈크로스를 분당 1μmol 글루코스로 전이시키는 능력을 1단위로 한다.

상기한 음이온 교환수지에 프럭토실트랜스퍼라제를 흡착하는 방법은 효소를 pH 5-6으로 조절한 0.0lM-0.lM 아세테이트 완충용액에 녹인다. 이온교환수지를 적당한 크기의 칼럼에 충진하고 같은 농도의 아세테이트 완충용액을 1-3SV의 유속으로 5-10시간 순환시켜 수지를 평형화한다. 여기에서 SV란 1시간에 컬럼에 충전한 수지와 같은 액량으로 흐르는 유속을 말한다.

다음에는 효소용액 평형화한 습윤수지 1g당 100-300단위 정도의 양을 1-3SV의 유속으로 2-12시간이상 순환시켜 수지에 효소를 흡착시킨다. 효소용액의 흡착이 끝난 후 흡착시키는 경우와 같은 유속으로 물을 컬럼에 흐르게하여 미흡착효소를 완전히 씻어낸다. 이어서 이온교환수지를 컬럼으로부터 꺼내어 수지의 효소 활성을 측정한다.

다음은 실시예를 들어 본 발명에 사용하는 다공성 또는 거대망목형 약염기음이은 교환수지, 다공성 또는 거대망목형 강염기 음이은 교환수지가 다른 이온교환수지에 비해서 프럭토실트랜스퍼러제의 고정화에 우수하다는 것을 설명하고자 한다.

[실시예 1]

시판하는 각종 이온교환수지 3g을 킬럼에 충진하고, pH 5.8의 0.lM 아세테이트 완충액으로 충분히 평형화시킨 후 완충액에 용해한 200단위의 프럭토실트랜스퍼라제를 컬럼에 SV-3의 유속으로 12시간 순화시켜 효소를 수지에 흡착시킨다.

그런 후 물로 효소 흡착과 같은 유속으로 미흡착 효소를 씻어낸다. 수지를 컬럼으로부터 꺼내어 활성을 측정한다. 결과는 표 1에 표시되어 있다.

[표 1]

[실시예 2]

실시예 1에서 사용한 각종 수지중에서 거대망목헝 염기성 음이은 교환수지에 프럭토실트랜스퍼라제를 흡착시켜 제조한 고정화 효소 1Og을 컬럼에 층전하여 고정화 효소의 안정성을 조사하였다.

[실시예 3]

다공성 강염기 음이온교환수지 다우엑스 MSA1 100g(습윤)을 3×30cm의 컬럼에 충전하고, pH 5.5, 0.lM 아세테이트 완충액으로 수지를 평형화시킨다. 다음에 위의 완충액과 같은 용액에 용해한 부분 정제 프럭토실트랜스퍼라제500ml(20,000 단위)을 SV1의 유속으로 컬럼에 순환시켜 흡착시킨다. 흡착이 완료되면 물2,000ml로 수세하여 미흡착 효소를 씻어낸다. 그런 후, 이온 교환수지를 꺼내어 프럭토실트랜스퍼라제의 활성을 측정하면 1g 습윤 수지당 55 단위의 활성이 측정된다.

[표 2]

[실시예 4]

위 실시예 3과 같은 방법으로 PA412를 갖고 실험한 결과 1g 습윤 수지당 48 단위 활성이 측정.

[실시예 5]

위 실시예 3과 같은 방법으로 IRA93을 갖고 실험한 결과 1g 습윤 수지당 53 단위 활성이 측정.

Claims (1)

1. 다공성 강염기 음이온교환수지, 또는 다공성 약염기 음이온 교환수지로서 그 표면적이 1.0m²/g 이상이고,전세공용적이 0.1ml/g 이상이고, 공반경의 범위가 20-2,000Å인 수지에 프럭토실트랜스퍼라제(EC2.4.1.25) 함유액을 접촉시켜 이 효소를 흡착시키는 것을 특징으로 하는 고정화 프럭토실트랜스퍼라제 제조방법.